Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Erizomycin
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Erizomycin, das zur Hemmung des Wachstums verschiedener Mikroorganismen, z. B. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, oder Streptococcus faecalis, verwendet werden kann. Die Herstellung des Antibiotikums erfolgt erfindungsgemäss, indem ein erizomycinproduzierender Mikroorganismus, vorzugsweise Streptomyces griseus var. erizensis in einem wässrigen Nährmedium, das vorzugsweise eine Quelle an assimilierbaren Kohlenhydraten und an assimilierbarem Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, bis das Medium eine beträchtliche antimikrobielle Wirksamkeit erhalten hat und indem Erizomycin aus dem Medium isoliert wird.
Erizomycin ist eine basische Substanz, die im Stande ist, das Wachstum gewisser Organismen, vor allem gram-positiver und gram-negativer Bakterien, insbesondere das Wachstum von Bakterien, z. B. von Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Streptococcus hemolyticus oder Streptococcus viridans zu hemmen, und sie kann allein oder in Kombination mit anderen antibakteriellen Mitteln zur Verhinderung des Wachstums, bzw. zur Verminderung der Zahl solcher Organismen, in verschiedenen Umgebungen dienen. Erizomycin kann beispielsweise als ein bIkonservierungsmittel verwendet werden, beispielsweise als bakteriostatisches Mittel zur Hemmung des Wachstums von Proteus vulgaris, der dafür bekannt ist, dass er das Verderben von Schneidölen verursacht.
Ausserdem ist es in Waschflüssigkeiten für sanitäre Zwecke nützlich, beispielsweise zum Waschen der Hände und zur Reinigung von Geräten, Fussböden oder Möbeln in verunreinigten Räumen oder Laboratorien; es ist ausserdem als industrielles Konservierungsmittel nützlich, z. B. als bakteriostatisches Spülmittel für gereinigte Kleidungsstücke und zur Imprägnierung von Papieren und Geweben; ausserdem ist es nützlich zur Unterdrückung des Wachstums empfindlicher Organismen in Platten-Verfahren und anderen mikrobiologi- schen Medien. Es kann ausserdem als Futterzusatz zur Förderung des Wachstums von Tieren, z. B. von Säugetieren, Vögeln, Fischen und Reptilien, verwendet werden.
Zu der Beschreibung gehören zwei Zeichnungen, von denen Fig. 1 das Infrarotabsorptionsspektrum des Erizomycins bedeutet und Fig. 2 das Papierchromatogramm der antimikrobiellen Wirksamkeit von Erizomycin gegenüber Mycobacterium avium 5 Ä bedeutet.
Mycobacterium avium 5 i ist die Aktivität des bekannten Mycobacterium avium, und die Konzentration ist durch 5 Ä (5 microliter) ausgedrückt.
Chemische und physlkaEsche EigensOaften des Erizomycins
Elementaranalyse für C27Hs2N4o8: Bei.: C 59,99 H 5,96 N 10,37 0 23,68
Gef.: C 59,97 H 6,05 N 10,46 0 22,88
Molekulargewicht: 540 (Masserspektrometer).
Ultraviolettspektrum: Erizomyciln hat das folgende UVAbsorptionsspek- trum:
In Äthanollösung: X max. (in mll) a
221 (sh) 42,01
255 (sh) 9,45
262 8,56 # max. (in m ) a
269 7,52
303 16,38 # 350 0,32 Optische Drehung: [a]D25 = -82 (c = 1,35, in Äthanol) Löslichkeit:
Bei Zimmertemperatur:
Die ungefähren Löslichkeiten (in mg/ml) sind die folgenden:
Wasser: < 1
95 % Äthanol: > 10 Äthylacetat: > 10
Aceton: > 10
Methylenchlorid: > 100
Benzol: # 2 Skellysolve B :
< 1 n-Butanol: # 5 Schmelzpunkt: 2142170 C Infrarotspektrum:
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Erizomycins in Mineralöl ist in Figur 1 der Zeichnungen dargestellt.
Erizomycin zeigt bei den folgenden Wellenlängen (Angaben in cm-1) Absorptionsbanden:
3445 (M) 1572 (M) 1325 (M)
3460 (S) 1540 (M) 1314 (S)
3440 (S) 1522 (S) 1300 (S)
3200 (W) 1505 (M) 1293 (S)
3060 (W) 1472 (M) 1278 (M)
2950 (S) (Öl) 1465 (M) 1272 (W)
2920 (S) (Öl) 1458 (M) (Öl) 1247 (S)
2850 (S) (Öl) 1447 (S) 1225 (S)
2730 (W) 1420 (M) 1195 (M)
2620 (W) 1388 (M) 1191(M)
1725 (S) 1384 (M) 1152 (S)
1655 (S) 1376 (M) (Öl) 1145 (S)
1645(S) 1360(M) 1130(M)
1620 (W) 1355 (M) 1097 (M)
1600 (M) 1338 (S) 1087 (S)
1069 (S) 952 (W) 808 (W)
1062 (S) 932 (W) 802 (M) 1047(W) 911(M) 772(M)
1035 (W) 888 (W) 720 (M)
1024 (W) 885 (W) 706 (M)
1012 (W) 867 (W) 698 (M)
992 (W) 850 (W) 670 (W)
973 (W) 835 (W) 662(M)
960 (W) 822 (W)
In KBr zeigt das Erizomycin <RTI
ID=2.14> Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenlängen (Angaben in cm-1):
3485 (W) 1595 (M) 1248 (S)
3420 (W) 1575 (M) 1224 (S)
3370 (M) 1540 (M) 1190 (M)
3210 (W) 1538 (S) 1150 (S)
3035 (M) 1515 (S) 1132 (S)
2980 (M) 1477 (M) 1085(S)
2940(M) 1465 (M) 1068 (S)
2880 (M) 1458 (S) 1050(M)
2760 (W) 1448 (S) 1025 (M)
2630 (W) 1424 (M) 1015 (W)
1725 (S) 1380(M) 995(W)
1679 (S) 1358 (M) 965 (W) 1655 (S) 1320 (S) 930 (W)
1645 (S) 1290 (S) 907 (W)
890 (W)
876 (W)
835 (W)
810 (M)
780 (M)
755 (M)
717 (M)
660 (M)
Die Bandenintensitäten werden mit S , M , bzw W bezeichnet und werden annähernd in Beziehung zur Hintergrundabsorption in der Nähe der Banden angegeben.
Eine S -Bande ist eine Bande von gleicher Grössenordnung der Intensität wie die stärkste Bande im Spektrum; M -Banden haben eine Intensität zwischen einem Drittel und zwei Dritteln der stärksten Bande und W -Banden haben eine Intensität von weniger als einem Drittel der stärksten Bande. Diese Schätzungen sind auf der Basis einer prozentualen Durchlässigkeitsskala gemacht.
Papierchromatogramm
Erizomycin zeigt ein charakteristisches Papierchromatogramm, das in Fig. 2 der Zeichnungen dargestellt ist, wobei die folgenden Lösungsmittelsysteme verwendet wurden: I. 1-Butanol, Wasser (84:16), 16 h.
II. 1 Butanol, Wasser (84:16) plus 0,25% p-Toluolsul fonsäure, 16 h.
III. 1-Butanol, Essigsäure, Wasser (2:1:1), 16 h.
IV. 20/0 Piperidin (v/v) in 1-Butanol, Wasser (84:16), 16 h.
V. 1-Butanol, Wasser (4:96), 5 h.
VI. 1-Butanol, Wasser (4:96) plus 0,250/0 p-Toluolsulfonsäure, 5 h.
Antitumor-Aktivität des Erizomycins
Erizomycin ist wirksam gegenüber KB-Zellen (menschliche Epidermis.-Krebs-Zellen) in Gewebekulturen. Die ID50 ist 4,4,ag/ml an Erizomycin.
Antibakterielle Wirksamkeit von Erizomycin
Röhrchen-Verdünnungstest Test-Mikroorganismus Minimale Inhibitions
Konzentration in Fg/ml.
Escherichia coli 125 Klebsiella pneumoniae 125 Proteus vulgaris 250 Salmonella paratyphi 250 Salmonella pullorum 62,5 Salmonella typhimurium 125 Streptococous faecalis 125 Str'eptoocuus hemolyticus 250 Streptococcus viridans 250 Staphylococcus aureus 250
Die Röhrchen-Verdünnungstestmethode wurde mit BHI-Medium (Gehirn-Herz-Infusionsbrühe, Difco, Detroit, Michigan, USA) ausgeführt. Die Teströhrchen (13 mm X 100 mm) wurden auf übliche Weise hergestellt, wie bei E. E. Snell, Vitamin Methods, Vol. 1, Academic Press, Inc., New York 1950, Seite 327, beschrieben. Testorganismen, die 18 Stunden bei 370 C bebrütet waren, wurden zur Beimpfung des Testmedi ums verwendet. Die Bestimmungen wurden nach 17 Stunden gemessen.
Der Mikroorganismus
Der vorzugsweise im erfindungsgemässen Verfahren für die Herstellung von Erizomycin verwendete Actinomycetenstamm ist Streptomyces griseus var. erizensis var. nova. Eine seiner Stammeseigenschaften ist die Produktion von Erizomycin. Eine Ablegerkultur des lebenden Organismus kann von der Sammlung der North Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, U. 5. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, bezogen werden. Seine Hinterlegungsnummer ist NRRL 3242.
Strepomyces griseus var. erizensis wurde mit Streptomyces griseus Waksman # 4, 4, ATCC 10 137 verglichen. Beide Mikroorganismus-Kulturen zeigten cremefarbenes bis creme-olivfarbenes Luftwachstum; gewundene Sporophoren; glattwandige Sporen und wuchsen am besten bei 24 bis 280 C. Streptomyces griseus var. erizensis zeichnet sich gegenüber Streptomyces griseus durch die Produktion des Antibiotikums Erizomycin und durch Farbunterschiede, die in den nachfolgenden Tabellen für Ektachrom-, Kultur- und Farbcharakteristika angegeben sind, aus.
Streptomyces griseus var. erizensis und Streptomyces griseus Waksman # 4, ATCC 10 137 werden in den folgenden Tabellen verglichen:
Tabelle 1 - Aussehen auf Ektachrom
Tabelle II - mikroskopische Merkmale
Tabelle III- Kulturmerkmale
Tabelle IV - Wachstum auf Kohlenstoffv & in- dungen in synthetischem Medium
Tabelle V - Farbmerkmale
Tabelle I
Aussehen von S. griseus var. erizensis und S. griseus
ATCC 10137 auf Ektachrome * Agar-Medium S. griseus S. griseus var. erizensis ATCC 10137 Bennett's rötlich-weiss cremerötlich Oberfläche gelb gelbbraun Rückseite Czapek's Saccharose rötlich-weiss röich-weiss Oberfläche farblos farblos Rückseite
Tabelle I (Fortsetzung) Agar-Medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137 Maltose-Trypton rötlich-weiss rötlich Oberfläche braun rötlich-braun Rückseite Pepton-Eisen etwas weiss kein Oberfläche gelbbraun Luftwachstum Rückseite gelbbraun Agar-Medium S. griseus S. griseus var. erizensis ATCC 10137 0,1 % Tyrosin etwas weiss etwas weiss Oberfläche blassgelb blassgelb Rückseite CaseinStärke rötlich-weiss rötlich-weiss Oberfläche rötlich-braun rötlich-braun Rückseite * Dietz, A., < Ektachrome Transparencies as Aids in Actinomycete Classification,7 Annais of the New York Academy of Sciences, 60: 152-154, 1954.
Tabelle II
Mikroskopische Merkmale von S. griseus var. erizensis und S. gnsrrs, ATCC 10137
S. griseus S. griseus var. erizensis ATCC 10137 Licht-Mikroskop Sporophoren lang, gewunden Sporophoren gerade bis gewunden Electronen Mikroskop Direkt Sporen glatt, rechteckig Sporen glatt, wurstähnlich Kohlenstoff abdruck Sporen gefurcht mit grosser Sporen gefurcht mit grosser
Oberflächenzeichnung Oberflächenzeichnung
Einige Sporen mit dunklem, mittlerem Fleck und dunklem mittlerem Fleck
Tabelle 711
Kulturmerkmale von S. grisens var. erizensis und S. griseus, ATCC 10137 Medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137 Pepton-Eisen-Agar Oberfläche weiss etwas weiss Rückseite gelb gelb Sonst Melanin - Melanin- Kalzium-Malat-Agar Oberfläche etwas weiss creme Rückseite cremerötlich weiss Sonst blassrötl. Pigment kein Pigment
Malat aufgelöst Malat aufgelöst Glucose-Asparagin-Agar Oberfläche ziemlich rötl.-weiss creme Rückseite creme gelb Sonst etw. gelbes Pigment gelb es Pigment
Tabelle III (Fortsetzung) Medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137 Magermilch-Agar Oberfläche sehr schwach weiss kein Luftwachstuin Rückseite gelbbraun gelbbraun Sonst gelbbraun gelbbraun
Kasein aufgelöst Casein aufgelöst Tyrosin-Agar Oberfläche creme weiss Rückseite gelbbraun gelbbraun Pigment gelbbraun gelbbraun
Tyrosin aufgelöst Tyrosin aufgelöst Xanthiin-Agar Oberfläche creme etwas weiss Rückseite gelb gelb Sonst blassgelbes Pigment biassgelbes Pigment
Xanthin aufgelöst Xantiia aufgelöst Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar Oberfläche creme creme Rückseite olivebraun gelbbraun Sonst blassgelbes Pigment blassgelbes Pigment Casein-Stärke-Agar Oberfläche olive-creme creme Rückseite rötlich rötlich-braun Sonst etw. rötliches Pigment etw.
rötliches Pigment
Stärke hydrolysiert Stärke hydrolysiert Bennett's 180 C Oberfläche cremeolive cremeweiss
Rückseite gelb olive
Pigment kein Pigment etwas olive 240 Oberfläche cremeolive cremebraun
Rückseite olivebraun gelbbraun
Pigment kein Pigment etwas gelb 28 C Oberfläche cremeolive cremebraun
Rückseite olive gelbbraun
Pigment etwas olive etwas gelb 37 C Oberfläche kein Luftwachstum sehr schwach creme verschwommen
Rückseite gering farblos gelbbraun
Pigment kein Pigment etwas gelb 55 C kein Wachstum kein Wachstum
Tabelle III (Fortsetzung) Medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137 Czapek's Saccharose Agar 18 0 Oberfläche etwas cremeolive etwas cremeolive
Rückseite creme creme 24 C Oberfläche etwas creme verschwommen etwas creme verschwommen
Rückseite weiss creme 2800 Oberfläche creme cremeolive
Rückseite creme cremeolive 370 C Oberfläche kein Luftwachstum kein Luftwachstum
Rückseite farblos farblos 55 C kein Wachstum kein Wachstum Maltose-Trypton-Agar 180 COberfläche creme cremeolive
Rückseite olive olive
Pigment kein etwas olive 240 0 Oberfläche creme creme
Rückseite olivebraun gelbbraun
Pigment kein etwas gelb 2800 Oberfläche cremeolive creme
Rückseite olive gelbbraun
Pigment etwas olive etwas gelb 37 C Oberfläche kein Luftwachstum kein
Luftwachstum
Rückseite farblos gelbbraun
Pigment kein gelbbraun 550 C kein Wachstum kein Wachstum Einfache Gelatine vollständige Verflüssiguug vollständige Verflüssigang Nährgelatine vollständige Verflüssigung volLständige Verflüssigung Synthetische Nitratbrühe etwas farblos farbloses Oberflächenhäutchen und vegetatives Wachstum am Grund flockiges Wachstum am Grunde
Nitrate reduziert zu Nitriten Nitrate nicht zu Nitriten reduziert Nährnitratbrüüe starkes weisses Luftwachstum an der weisses Luftwachstum an der
Oberfläche Häutchen Oberfläche Häutchen Tabelle lll (Fortsetzung) Medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137
Geringes Wachstum am Grunde kompaktes vegetatives Wachstum am Grunde
Nitrate reduziert zu Nitriten Nitrate reduziert zu Nitriten Lackmusmilch weisses Luftwachstum an blauem etwas weisses Luftwachstum
Oberflächenring an blauem Oberflächenring teilweise Peptonisierung pH 7,9 vollständige Peptonisierung pH 7,9
Tabelle IV Wachstum von S. griseus var. erizensis und S. griseus ATCC 10137 auf Kohlenstoffverbindungen in syntheti schem Medium (J. Bact. 56: 107-114, 1948)
S. griseus S. griseus var. erizensis ATCC 10137
Kontrolle (-) (-)
1. D-Xylose + +
2. L-Arabinose + (+)
3. Rhamnose (-)(+)(-)* (-)
4. D-Fructose + + 5. OGalactose + +
6. D-Glucose + +
7. D-Mannose + +
8. Maltose + + 9. Saccharose (-) (-) 10.
Lactose + + 11. Cciioblose + + 12. Raffinose (-) (-) 13. Dextrin + + 14. Inulin (-)- (-) 15. lösliche Stärke + + 16. Glycenn + +
Tabelle IV (Fortsetzung)
S. griseus S. griseus var. erizensis ATCC 10137 17. Dulcit (+) (-) (-) (-) 18. Mannit (-)++ + 19. D-Sorbit +(-)(-) (-) 20. Inosit (-)(-)(+) (-) 21. Salicin (-) - - (-) 22. Phenol (-)-- 23. Kresol - 24. Na-Formiat (-)-- 25. Na-Oxalat (-)-(-) 26. Na-Tartrat (-)-(-) 27. Na-Salicylat (-)-- 28. Na-Acetat + (+) + 29. Na-Citrat + (+) + 30.
Na-Succinat + + + = gutes Wachstum (+) = mässiges Wachstum (-) = geringes Wachstum - = kein Wachstum * Streuung der Ergebnisse bei verschiedenen Versuchen. Tabelle V Farbmerkmale von S. griseus var. erizensis und S.griseus, ATCC 10137 Agar-Medium Color Harmony Manual 3rd Ed., 1948 N.B.S.
Circular 533, 1955 S. griseus S. griseus, S. griseus S. griseus var. erizensis ATCC 10137 var. erizensis ATCC 10137 Bennett's Oberfläche 1-1/2db(g) ledern 2db(g) elfenbein 89 gm blassgelb 89 gm blassgelb, 90 g gräulich-gelb, 121 m blassgelbgrün, Rückseite 2gc(g) bambus chamois 3ng(g) gelb-ahorn 90 gm gräulichgelb 77 m mittel gelblichbraun Czapek's Saccharose Oberfläche 2cb(m) elfenbeinweiss 2cb(m) elfenbeinweiss - Rückseite 2 db(g) elfenbein 2db(g) elfenbein - Maltose Tryptone Oberfläche 2ba(m & g) perlmuschelweiss 2cb(m) elfenbeinweiss 92 gm gelblichweiss 92 m gelblichweiss, 93 gelblichgrau Rückseite 2ie(g) hell senfbraun 3ng(g) gelb-ahorn 91 gm dunkel graugelb, 77 m mittelgelblichbraun 94 g hell oliv-braun, 106 g hell oliv
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
dass ein erizornycinproduzierender Organismus unter aeroben Bedingungen in einem wässerigen Nährmedium gezüchtet wird, bis das Medium eine beträchtliche antimikrobielle Aktivität erhalten hat, und dass das Erizomycin aus dem Nährmedium isoliert wird.
Es versteht sich auch, dass für die Herstellung begrenzter Mengen Oberflächenkulturen in Flaschen verwendet werden können. Der Organismus wird in einem wässrigen Nährmedium, das vor allem eine Kohlenstoffquelle, z. B. ein assimilierbares Kohlenhydrat und gewöhnlich eine Stickstoffquelle, z. B. eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder eiweissartiges Material, enthält, gezüchtet. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind unter anderem Glucose, Sandzucker, Saccharose, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Galactose, Dextrin, Melasse und ähnliche. Bevorzugte Stickstoffquellen sind unter anderem Maisweichwasser, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Soyabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreashydrolysat von Casein, Schlempe, Fischmehl, tierische Eiweissflüssigkeiten, Fleisch und Knochenabfälle und ähnliche.
Eine Kombination dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen kann vorteilhafterweise verwendet werden. Spurenmetalle, z. B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und ähnliche, brauchen der Fermentation nicht zugesetzt zu werden, da Leitungswasser und ungereinigte Ingredienzien als Bestandteile des Mediums verwendet werden.
Die Produktion der erfindungsgemäss erhältlichen Verbindung kann bei jeder beliebigen Temperatur, die zufriedenstellendes Wachstum des Mikroorganismus bewirkt, z. B. zwischen zirka 18 und 400 C und vorzugsweise zwischen zirka 25 und 300 C, durchgeführt werden. Für gewöhnlich wird die beste Produktion der Verbindung innerhalb von zirka zwei bis zehn Tagen erzielt. Normalerweise bleibt das Medium während der Fermentation annähernd neutral oder schwach alkalisch. Der End-pH-Wert hängt teilweise von den eventuell vorhandenen Puffersubstanzen ab und teilweise von dem Ausgangs-pH-Wert des Kulturmediums, welches vor der Sterilisierung vorteilhafterweise auf einen pH-Wert von 6 bis 8 eingestellt wird.
Wenn die Züchtung in grossen Gefässen und Tanks durchgeführt wird, ist es vorteilhaft, die vegetative Form anstelle der Sporenform des Mikroorganismus für die Beimpfung zu verwenden, um eine ausgeprägte Verzögerung in der Produktion der neuen Verbindung und die damit verbundene unrationelle Ausnützung der Apparatur zu verhindern. Dementsprechend ist es wünschenswert, ein vegetatives; Inoculum in einer Nährbni- henkultur herzustellen, indem diese Kultur mit einer aliquoten Menge einer Boden- oder Schrägkultur beimpft wird. Wenn auf diese Weise ein junges, aktives, vegetatives Inoculum bereitet ist, wird es gewöhnlich aseptisch in grosse Gefässe oder Tanks überführt.
Das Medium, in dem das vegetative Inoculum hergestellt wird, kann das gleiche sein, wie es für die Produktion der neuen Verbindung verwendet wird, oder es kann verschieden davon sein, so lange es nur so beschaffen ist, dass ein gutes Wachstum des Mikroorganismus erzielt wird.
Die neue erfindungsgemäss erhältliche Verbindung ist eine basische Verbindung mit der Summenformel C27H32N405. Bei Zimmertemperatur zeigt Erizomycin die folgenden Löslichkeiten: ungefähr weniger als 1 mg/ml in Wasser; > 10 mg/ml in 95 /o Äthanol; > 10 mg/ml in Äthylacetat; > lOmg/ml in Aceton; > 100 mg/ml in Chloroform; ca. 2 mg/ml in Benzol; < 1 mg/ml in Skellysolve B (Petroläther oder n-Hexan); und ca.
5 mg/ml in n-Butanol.
Eine Vielzahl von Verfahren kann zur Isolierung und Reinigung von Erizomycin verwendet werden, beispielsweise Solventextraktion, Flüssig-flüssig-Verteilung in einer Craig-Apparatur, Verwendung von Adsorbentien und Chromatographiesäulen. Solventextraktionsverfahren werden für gewerbliche Produktion bevorzugt, da sie weniger Zeit verbrauchen und weniger teuer sind und höhere Ausbeuten damit erzielt werden können.
In einem bevorzugten Isolierungsverfahren werden zuerst nach herkömmlichen Verfahren, wie z. B. Filtration unter Verwendung einer Filterhilfe (oder durch Zentrifugieren), das Myzel und ungelöste Feststoffe von der Fermentationsbrühe abgetrennt. Die filtrierte (oder zentrifugierte) Brühe kann mit einem Lösungsmittel, vorzugsweise Athylacetat, für Erizomycin extrahiert werden. Der Äthylacetatextrakt, der das Erizomycin enthält, wird gewöhnlich mit einem Zehntel Volumen Wasser gewaschen, dann kann der Äthylacetatextrakt unter vermindertem Druck zu einem trockenen Rohprodukt des Erizomycins eingedampft werden. Dieses Präparat kann in Umgebungen, in denen höhere Reinheit des Antibiotikums nicht erforderlich ist, verwendet werden.
Weitere Reinigung dieses Erizomycinpräparates kann durch Auflösen des Rohprodukts in einer minimalen Menge eines Lösungsmittels für Erizomycin (vorzugsweise Athylacetat) und Zugabe der 10flachen Menge an Cyclohexan erfolgen. Der Niederschlag, der sich bildet, wird in der Regel durch Filtration gesammelt und in Äthylacetat aufgelöst. Das Cyclohexanfiltrat wird üblicherweise verworfen. Das Äthylacetat, das das Erizomycin enthält, kann filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft werden.
Das trockene Erizomycin enthaltende Präparat wird dann gewöhnlich in einem Lösungsmittel für Erizomycin (vorzugsweise in Methylenchlorid) aufgelöst, und die Lösung wird filtriert. Das Filtrat kann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft werden und ergibt ein verhältnismässig reines Erizomycinpräparat.
Kristallines Erizomycin kann erhalten werden, indem dieses verhältnismässig reine Erizomycinpräparat der Verteilungschromatographie an gepuffertem Kieselgur unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Toluol Propylenglycol unterworfen wird. Kristallines Erizomycin, das aus den Chromatographiefraktionen erhalten wurde, kann aus Äthanol umkristallisiert werden und ergibt ein hochreines kristallines Erizomycinpräparat.
Wegen der basischen Natur des Erizomycins kann das aus der Fermentationsbrühe durch Athylacetat-ex- traktion ursprünglich erhaltene Rohprodukt gereinigt werden, indem die aktive Substanz bei einem pH von zirka 2 bis 3 in Wasser extrahiert wird, indem der pH-Wert auf 9 bis 10 eingestellt wird und indem dann Rückextraktion in Äthylacetat oder ein anderes Lösungsmittel, in dem Erizomycin löslich ist, erfolgt.
Nach Entfernung des Lösungsmittels kann der Rückstand durch Kristallisation, Gegenstromverteilung oder Chromatographie, wie oben beschrieben wurde, weiter gereinigt werden.
Wahlweise kann die neue, erfindungsgemäss erhältliche Verbindung auch durch Adsorption an Kationenaustauscherharzen aus der filtrierten Brühe isoliert werden. Es können sowohl Carbonsäure- als auch Sulfonsäureharze verwendet werden. Geeignete Carbonsäure harze sind unter anderem die Polyacrylsäureharze, die durch Copolymerisation von Acrylsäure und Divinylbenzol, beispielsweise nach dem Verfahren, das auf Seite 87 von Kunin, Ion Exchange Resins, 2nd Edition (1958), John Wiley and Sons, Inc. angegeben wird, erhalten werden. Carbonsäurekationenaustauschharze dieses Typs werden unter den Handelsnamen Amberlite IRC-50 und Zeokarb 226 vertrieben. Geeignete Sulfonsäureharze sind unter anderem sulfonierte Polystyrolharze, die mit Divinylbenzol vernetzt sind und die nach dem auf Seite 84 des zitierten Werkes von Kunin beschriebenen Verfahren erhalten wurden.
Sulfonierte Kationaustauschharze dieses Typs werden unter den Handelsnamen Dowex-50 , Amberlite IR-120 , Nalcite HCR , Chempro C-20 , Permutit Q und Zeokarb 225 in den Handel gebracht.
Das Antibiotikum wird gewöhnlich mit einer Säure, vorzugsweise bei einem pH-Wert niedriger als der pKa Wert des verwendeten Kationenaustauschharzes, von dem Harz eluiert. Zufriedenstellende Erg & nisse können bei einem pH-Wert von zirka 1 bis 6 erhalten werden.
Das Eluat wird in der Regel mit einer Base, z. B. Natriumhydroxyd, oder einem stark basischen Anionenaustauschharz, auf einen pH-Wert von zirka 7,5 bis 8,5 eingestellt, und das Antibiotikum kann mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel nach dem oben beschriebenen Verfahren extrahiert werden. [Für diesen Zweck geeignete Anionenaustauschharze werden durch Chiormethylierung nach dem von Kunin (siehe obiges Zitat, Seiten 88 und 89) angegebenen Verfahren von Polystyrol, das gewünschtenfalls mit Divinylbenzol, welches nach dem von Kunin (siehe obiges Zitat, Seite 84) angegebenen Verfahrens hergestellt wurde, vernetzt ist, und Quaternisierung mit Trimethylamin oder Dimethyläthanolamin nach dem von Kunin (vgl. obiges Zitat Seite 97) angegebenen Verfahren hergestellt.
Anionenaustauschharze dieses Typs werden unter den Bezeichnungen Dowex-2 , Dowex-20 , Amberlite IRA 400 , Duolite A-102 und Permutit S-1 in den Handel gebracht.]
Die neue erfindungsgemäss erhältliche Verbindung kann aus den erhaltenen Brühen und anderen wässrigen Lösungen auch durch Adsorption an einem oberflächenaktiven Adsorbens, zum Beispiel Florisil (ein synthetisches Silikat des in US Patentschrift 2 393 625 beschriebenen Typs, verkauft von der Floridin Gesellschaft), Entfärbungskohle oder Entfärbungsharzen, und Elution des adsorbierten Materials mit einem Lösung mittel isoliert werden. Jedes beliebige der oben erwähnten Lösungsmittel kann verwendet werden. Ein geeignetes Entfärbungsharz ist Permutit DR (US Patentschrift 2 702 263).
Die neue erfindungsgemässe Verbindung kann auch durch aufeinanderfolgendeOberführungen aus dem protonisierten in den nicht-protonisierten Zustand und umgekehrt gereinigt werden, insbesondere in Kombination mit anderen Arten von Behandlungen, z. B. Solventextraktionen und Waschungen, Chromatographie und fraktionierte Flüssig-flüssig-Extraktion. Auf diese Weise können Salze des Erizomycins dazu verwendet werden, das Antibiotikum zu isolieren oder zu reinigen. Das Antibiotikum kann beispielsweise in ein unlösliches Salz, z. B. das Picrat, überführt werden, welches dann Reinigungsverfahren unterworfen wird und anschliessend zur Regenerierung der freien Base des Antibiotikums mit Alkali behandelt wird. Oder das Antibiotikum kann in ein wasserlösliches Salz, z.
B. das Hydrochlorid oder Sulfat, umgewandelt werden, und die wässrige Lösung des Salzes kann mit verschiedenen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahiert werden, bevor die freie Base des Antibiotikums durch Behandlung der so extrahierten sauren Lösung mit Alkali regeneriert wird.
Salze des Erizomycins können für die gleichen biologischen Zwecke wie die freie Base verwendet werden, oder sie können zur Reinigung des Antibiotikums wie oben beschrieben verwendet werden.
Spezifische saure Salze können durch Neutralisierung der freien Base mit der geeigneten Säure bis zu einem pH-Wert von weniger als ca. 7,5 und vorzugsweise bis zu einem pH-Wert von ca. 2 bis 6, hergestellt werden. Für diesen Zweck geeignete Säuren sind unter anderen Salz-, Schwefe!-, Phosphor-, Essig-, Bernstein-, Zitronen-, Milch-, Malein-, Fumar-, Pamoe-, Chol-, Palmitin-, Schleim-, Kampfer-, Glutar-, Glykol-, Phthal-, Wein-, Laurin-, Stearin-, Salicyl-, 3-Phenylsalicyl-, 5-Phenylsalicyl-, 3-Methylglutar-, Orthosulfobenzoe-, Cyclohexansulfamin-, Cyclopentanpropion-, 1,2 Cyclohexandicarbon-, 4-Cyclohexancarbon-, Octadecenylbernstein-, Octenylbernstein, Methansulfon-, Benzolsulfon-, Helianth-, Reinecke-, Dimethyldithiocarbamin-, Sorbin-, Monochloressig-, Undecylen-, 4'-Hydroxyazobenzol-4-sulfon-, Octadecylschwefel-, Pikrin-, Benzoe-,
Zimtsäure und ähnliche Säuren.
Erizomycin, die neue erfindungsgernäss erhältliche Verbindung ist gegenüber Escherichin coli wirksam und kann infolge seiner antibakteriellen Wirksamkeit gegenüber diesem Mikroorganismus zur Reduktion, Hemmung und Ausrottung von Schleimprodukten in Papierfabriken verwendet werden. Es kann auch dazu verwendet werden, das Leben von Kulturen von Trichomonas foetus, Trichomonas hominis und Trichomonas vaginalis zu verlängern, indem es diese von Escherichia-coli-Verunreinigung befreit.
In den folgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens beschrieben. Alle Prozentangaben betreffen Gewichtsprozent und alle Lösungsmittelverhältnisse betreffen Volumenangaben, falls nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1
A. Fermentation
Eine Bodenkultur von Streptomyces griseus var.
erizensis, NRRL 3242 wurde dazu verwendet, 500-ml Erlenmeyer-Kolben, die je 100 ml steriles Medium enthielten zu beimpfen; das Keim-Medium enthielt die folgenden Ingredientien: Glucosemonhydrat 25 g Pharmamedia * 25 g
Leitungswasser q. s. ad. 1 Liter * Pharmamedia ist ein technisch reines Baumwollsamenmehl hergestellt von der Trader's Oil Mill Company, Fort Worth, Texas, USA.
Der pH-Wert des Keimmediums betrug vor der Sterilisation 7,2. Das Keiminoculum wurde drei Tage lang bei 28 C auf einer Gump-Schüttelmaschine mit 250 Upm bebrütet.
Das wie oben hergestellte Keiminoculum wurde zur Beimpfung von 500-ml-Erlmeyer-Kolben, die je 100 ml steriles Fermentationsmedium enthielten, ver wendet; das Fermentationsmedium enthielt die folgenden Ingredientien:
Saccharose 20 g Soyabohnenmehl 20 g
Calciumcarbonat 5 g
Leitungswasser q. s. ad. 1 Liter
Die Fermentationskolben wurden mit 5 ml Keiminoculum pro 100 ml Fermentationsmedium beimpft.
Der pH-Wert des Fermentationsmediums betrug vor der Sterilisierung 7,2. Der Fermentationskolben wurden 5 Tage lang bei einer Temperatur von 280 C auf einer Gump-Rotationsschüttelmaschine, die mit 250 Upm arbeitete, bebrütet. Das Maximum der Produktion des Antibiotikums bei einer Kolbenfermentation wird im allgemeinen nach 2 bis 3 Tagen erreicht, danach fällt der Titer des Antibiotikums allmählich ab.
In einer typischen Schüttelflaschenfermentation betrug die Erizomycinkonzentration nach einem Tag 9 Bioeinheiten pro ml; nach 2 Tagen 11 Bioeinheiten pro ml und nach 3 Tagen Fermentationszeit 10 Bioeinheiten Erizomycin pro ml. Die Bestimmung wurde mit einem Agarplattentest gegen den Mikroorganismus Bacillus cereus durchgeführt. Die Bestimmung gegen Bacillus cereus wird auf einem Agar, der mit Phosphatpuffer pH 7,4 auf einen pH-Wert von 7,4 gepuffert wurde, ausgeführt. Ein Einheitsvolumen (0,08 ml) der Lösung, die die zu bestimmende Substanz enthält, wird auf eine 12,7-mm-Papierscheibe gebracht, die dann auf eine Agarplatte gelegt wird, die mit dem Testorganismus beimpft ist. Die Agarplatte wird dann 16 bis 18 Stunden lang bei 320 C bebrütet.
Eine Bioeinheit (BE) wird als die Konzentration des Antibiotikums, die eine 20 mm Inhibierungszone unter Standard-test-bedingungen ergibt, definiert, definiert in der US-Patentschrift Nr. 3 359 165. Wenn z. B. eine Fermentationsbrühe im Verhältnis 1:100 verdünnt werden muss, um eine 20 mm Inhibierungszone zu ergeben, dann ist die Wirksamkeit dieser Brühe 100 BE/ml.
B. Extraktion.
Die gesamte Brühe (3450 ml) einer Erizomycin Fermentation, wie sie oben beschrieben wurde, mit 4,4 Bioeinheiten pro ml Erizomycin, wurde unter Zusatz von Kieselgur filtriert. Der Filterkuchen wurde mit einem Zehntel des Volumens an Wasser gewaschen.
Die filtrierte Brühe wurde mit dem Waschwasser vereinigt (3410 ml) mit 3,8 BE/ml mit einem gleichen Volumen an Äthylacetat extrahiert. Der Athylacetatextrakt wurde mit einem Zehntel des Volumens an Wasser gewaschen. Der gewaschene Athylacetatextrakt wurde dann unter vermindertem Druck eingedampft und ergab ein trockenes Rohprodukt (350 mg) von Erizomycin mit einem Gehalt von 32,8cg/mg Erizomycin bestimmt nach der B.-cereus-Methode.
C. Reinigung
Ein rohes Erizomycinpräparat (704 g mit einem Gehalt von 53,ug/mg nach der B.-cereus-Methode), erhalten nach dem oben beschriebenen Verfahren, wurde in einer möglichst kleinen Menge Äthylacetat gelöst und unter gutem Durchmischen zu dem zehnfachen Volumen Cyclohexan gegeben. Der Niederschlag, der sich bildete, wurde durch Filtration gesammelt und in ungefähr 2100 ml Athylacetat gelöst. Das Cyclohexanfiltrat wurde verworfen. Die Äthylacetatlösung, die das Erizomycin enthielt, wurde filtriert, und die Feststoffe wurden verworfen. Das Filtrat wurde dann unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von weniger als 400 C zur Trockne eingedampft. Der trockene Rückstand des Äthylacetatextraktes wurde in 420 ml Methylenchlorid gelöst, und die Lösung wurde filtriert.
Die Feststoffe wurden verworfen, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft, wobei ein verhältnismässig reines, trockenes Präparat von Erizomycin erhalten wurde, das 146 g wog und einen Gehalt von 200,ug/mg, nach der B.-cereus-Methode bestimmt, aufwies.
Weitere Reinigung des Erizomycinpräparates wurde mit Hilfe einer Verteilungschromatographiesäule durchgeführt, die auf folgende Weise hergestellt wurde: Zu einem rollenden flüssigen Brei von 120 g gepuffertem Kieselgur in halbgesättigtem Toluol wurden 40 ml Propylenglykol gegeben. Das Rühren wurde ca.
10 Minuten fortgesetzt, um ein gutes Durchmischen zu erreichen. Die Mischung wurde in eine Glassäule von 2,54 cm Durchmesser gegossen und bei einem Luftdruck von 0,28 kg/cm2 gepackt. Die gepackte Säule wurde mit einer Schicht von 6 mm Seesand bedeckt.
[Das oben verwendete halbgesättigte Toluol wurde wie folgt hergestellt: unter gutem Vermischen wurden 4 ml Propylenglykol zu 3,79 1 Toluol gegeben. Das ergab eine ungefähr halbgesättigte Lösung, die als bewegliche Phase für die Verteilungschromatographiesäule verwendet wurde. Das in der Verteilungschromatographiesäule verwendete gepufferte Kieselgur wurde wie folgt hergestellt: Zu 100 g Kieselgur, wurden unter gutem Durchmischen 100 ml einer Lösung von KH2PO4 in Wasser (27,2 g/l) und 100 ml einer Lösung von Na2HPO4 in Wasser (28,4 g/l) gegeben. Die Mischung wurde dann bei 120"C sorgfältig getrocknet.]
2,2 g eines Erizomycinpräparates, das nach der oben beschriebenen Methylenchloridextraktionsmethode hergestellt worden war, wurden unter ständigem Rühren und Erhitzen auf dem Dampfbad in 7,3 ml Propylengylcol gelöst.
Diese Lösung wurde mit 15g gepuffertem Kieselgur gemischt und mit einer möglichst kleinen Menge halbgesättigtem Toluol angerieben und auf den Kopf der Verteilungschromatographiesäule gegeben. Eine Schicht von 6 mm Seesand wurde auf den Kopf der Säule gegeben. Die Säule wurde mit halbgesättigtem Toluol bei einer Fliessgeschwindigkeit von ca. 2 ml/min. eluiert. 20-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Fraktionen 26 bis 44 wurden vereinigt, zur Entfernung des Glykols mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft; Ausbeute 698 mg. Dieses Material wurde aus ca. 10 ml Äthanol umkristallisiert; Ausbeute 343 mg kristallines Erizomycin mit einem Gehalt von 420,ug/mg nach der B.-cereus-Methode.
Beispiel 2
Erizomycinhydrochlorid
Ein Gramm Erizomycin, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben wurde, wird in 20 ml Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wird filtriert, und Salzsäuregas wird in die Lösung eingeleitet. Der sich bildende Nieder schlag von Erizomycinhydrochlorid wird abfiltriert und getrocknet.
Erizomycin hat fungizide Wirksamkeit, die durch einen Standard-Agar-Verdünnungs-Platten-Test bestimmt wurde. Es zeigt gute Wirksamkeit gegen Nocardia steroides und geringe Wirksamkeit gegenüber Histoplasma capsulatum. Nocardia asteroides, der Nocardiosis verursacht, wurde aus dem Boden und aus Laboratoriumsluft isoliert. Demzufolge kann Erizomycin dazu verwendet werden, Böden, die mit Nocardia asteroides infiziert sind, zu behandeln. Histoplasma capsulatum, der Histoplasmosis verursacht, wurde aus Lagerkellern und Hühnerställen isoliert. Demzufolge kann Erizomycin zur Behandlung solcher Umgebungen verwendet werden, wenn sie mit Histoplasma capsulatum infiziert sind.
Process for the production of the new antibiotic erizomycin
The invention relates to a process for the production of the new antibiotic erizomycin, which is used to inhibit the growth of various microorganisms, e.g. B. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, or Streptococcus faecalis, can be used. The antibiotic is produced according to the invention by cultivating an erizomycin-producing microorganism, preferably Streptomyces griseus var. Erizensis in an aqueous nutrient medium, which preferably contains a source of assimilable carbohydrates and assimilable nitrogen, under aerobic conditions until the medium has a considerable antimicrobial activity and by isolating erizomycin from the medium.
Erizomycin is a basic substance that is able to stimulate the growth of certain organisms, especially gram-positive and gram-negative bacteria, in particular the growth of bacteria, e.g. B. of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Streptococcus hemolyticus or Streptococcus viridans, and it can be used alone or in combination with other antibacterial agents to prevent growth, or to reduce Number of such organisms, serving in different environments. For example, erizomycin can be used as a bi-preservative, for example a bacteriostatic agent to inhibit the growth of Proteus vulgaris, which is known to cause spoilage in cutting oils.
It is also useful in washing liquids for sanitary purposes, for example for washing hands and cleaning equipment, floors or furniture in contaminated rooms or laboratories; it is also useful as an industrial preservative, e.g. B. as a bacteriostatic detergent for cleaned clothes and for the impregnation of papers and fabrics; It is also useful for suppressing the growth of sensitive organisms in plate processes and other microbiological media. It can also be used as a feed additive to promote the growth of animals, e.g. B. mammals, birds, fish and reptiles can be used.
The description includes two drawings, of which FIG. 1 represents the infrared absorption spectrum of erizomycin and FIG. 2 represents the paper chromatogram of the antimicrobial effectiveness of erizomycin against Mycobacterium avium 5 Å.
Mycobacterium avium 5 i is the activity of the well-known Mycobacterium avium, and the concentration is expressed by 5 Å (5 microliters).
Chemical and physical properties of erizomycin
Elemental analysis for C27Hs2N4o8: At .: C 59.99 H 5.96 N 10.37 O 23.68
Found: C 59.97 H 6.05 N 10.46 0 22.88
Molecular weight: 540 (mass spectrometer).
Ultraviolet spectrum: Erizomyciln has the following UV absorption spectrum:
In ethanol solution: X max. (in garbage) a
221 (sh) 42.01
255 (sh) 9.45
262 8.56 # max. (in m) a
269 7.52
303 16.38 # 350 0.32 Optical rotation: [a] D25 = -82 (c = 1.35, in ethanol) Solubility:
At room temperature:
The approximate solubilities (in mg / ml) are as follows:
Water: <1
95% ethanol:> 10 ethyl acetate:> 10
Acetone:> 10
Methylene chloride:> 100
Benzene: # 2 Skellysolve B:
<1 n-butanol: # 5 Melting point: 2142170 C Infrared spectrum:
The infrared absorption spectrum of the erizomycin in mineral oil is shown in Figure 1 of the drawings.
Erizomycin shows absorption bands at the following wavelengths (values in cm-1):
3445 (M) 1572 (M) 1325 (M)
3460 (S) 1540 (M) 1314 (S)
3440 (S) 1522 (S) 1300 (S)
3200 (W) 1505 (M) 1293 (S)
3060 (W) 1472 (M) 1278 (M)
2950 (S) (oil) 1465 (M) 1272 (W)
2920 (S) (oil) 1458 (M) (oil) 1247 (S)
2850 (S) (oil) 1447 (S) 1225 (S)
2730 (W) 1420 (M) 1195 (M)
2620 (W) 1388 (M) 1191 (M)
1725 (S) 1384 (M) 1152 (S)
1655 (S) 1376 (M) (oil) 1145 (S)
1645 (S) 1360 (M) 1130 (M)
1620 (W) 1355 (M) 1097 (M)
1600 (M) 1338 (S) 1087 (S)
1069 (S) 952 (W) 808 (W)
1062 (S) 932 (W) 802 (M) 1047 (W) 911 (M) 772 (M)
1035 (W) 888 (W) 720 (M)
1024 (W) 885 (W) 706 (M)
1012 (W) 867 (W) 698 (M)
992 (W) 850 (W) 670 (W)
973 (W) 835 (W) 662 (M)
960 (W) 822 (W)
In KBr, the erizomycin shows <RTI
ID = 2.14> absorption bands at the following wavelengths (data in cm-1):
3485 (W) 1595 (M) 1248 (S)
3420 (W) 1575 (M) 1224 (S)
3370 (M) 1540 (M) 1190 (M)
3210 (W) 1538 (S) 1150 (S)
3035 (M) 1515 (S) 1132 (S)
2980 (M) 1477 (M) 1085 (S)
2940 (M) 1465 (M) 1068 (S)
2880 (M) 1458 (S) 1050 (M)
2760 (W) 1448 (S) 1025 (M)
2630 (W) 1424 (M) 1015 (W)
1725 (S) 1380 (M) 995 (W)
1679 (S) 1358 (M) 965 (W) 1655 (S) 1320 (S) 930 (W)
1645 (S) 1290 (S) 907 (W)
890 (W)
876 (W)
835 (W)
810 (M)
780 (M)
755 (M)
717 (M)
660 (M)
The band intensities are denoted by S, M and W and are indicated approximately in relation to the background absorption in the vicinity of the bands.
An S band is a band of the same order of magnitude in intensity as the strongest band in the spectrum; M bands have an intensity between one third and two thirds of the strongest band and W bands have an intensity less than one third of the strongest band. These estimates are made based on a percentage permeability scale.
Paper chromatogram
Erizomycin shows a characteristic paper chromatogram shown in Figure 2 of the drawings using the following solvent systems: I. 1-butanol, water (84:16), 16 hours.
II. 1 butanol, water (84:16) plus 0.25% p-toluenesulfonic acid, 16 h.
III. 1-butanol, acetic acid, water (2: 1: 1), 16 h.
IV. 20/0 piperidine (v / v) in 1-butanol, water (84:16), 16 h.
V. 1-butanol, water (4:96), 5 h.
VI. 1-butanol, water (4:96) plus 0.250/0 p-toluenesulfonic acid, 5 h.
Antitumor activity of erizomycin
Erizomycin is effective against KB cells (human epidermis cancer cells) in tissue cultures. The ID50 is 4.4 ag / ml of erizomycin.
Antibacterial effectiveness of erizomycin
Tube Dilution Test Test Microorganism Minimal Inhibitions
Concentration in μg / ml.
Escherichia coli 125 Klebsiella pneumoniae 125 Proteus vulgaris 250 Salmonella paratyphi 250 Salmonella pullorum 62.5 Salmonella typhimurium 125 Streptococous faecalis 125 Str'eptoocuus hemolyticus 250 Streptococcus viridans 250 Staphylococcus aureus 250
The tube dilution test method was carried out with BHI medium (brain heart infusion broth, Difco, Detroit, Michigan, USA). The test tubes (13 mm X 100 mm) were made in the usual manner as described in E. E. Snell, Vitamin Methods, Vol. 1, Academic Press, Inc., New York 1950, p.327. Test organisms which had been incubated for 18 hours at 370 ° C. were used to inoculate the test medium. The determinations were made after 17 hours.
The microorganism
The actinomycete strain preferably used in the process according to the invention for the production of erizomycin is Streptomyces griseus var. Erizensis var. Nova. One of its tribal characteristics is the production of erizomycin. A specimen culture of the living organism can be obtained from the collection of the North Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, U. 5. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. Its depository number is NRRL 3242.
Strepomyces griseus var. Erizensis was mixed with Streptomyces griseus Waksman # 4, 4, ATCC 10 137 compared. Both microorganism cultures showed cream-colored to cream-olive-colored air growth; convoluted sporophores; Smooth-walled spores and grew best at 24 to 280 C. Streptomyces griseus var. erizensis is distinguished from Streptomyces griseus by the production of the antibiotic erizomycin and by color differences, which are given in the following tables for ektachrome, culture and color characteristics.
Streptomyces griseus var. Erizensis and Streptomyces griseus Waksman # 4, ATCC 10 137 are compared in the following tables:
Table 1 - Appearance on Ektachrom
Table II - Microscopic Features
Table III- Culture Characteristics
Table IV - Growth on carbon compounds in synthetic medium
Table V - Color Characteristics
Table I.
Appearance of S. griseus var. Erizensis and S. griseus
ATCC 10137 on Ektachrome * agar medium S. griseus S. griseus var. Erizensis ATCC 10137 Bennett's reddish-white cream-reddish surface yellow yellow-brown backside Czapek's sucrose reddish-white reddish-white surface colorless colorless backside
Table I (continued) Agar medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137 maltose tryptone reddish-white reddish surface brown reddish-brown reverse side peptone iron somewhat white none surface yellow-brown air growth reverse side yellow-brown agar medium S. griseus S. griseus var. erizensis ATCC 10137 0.1% tyrosine somewhat white somewhat white Surface pale yellow pale yellow backside casein starch reddish-white reddish-white surface reddish-brown reddish-brown backside * Dietz, A., <Ektachrome Transparencies as Aids in Actinomycete Classification, 7 Annais of the New York Academy of Sciences, 60: 152-154, 1954.
Table II
Microscopic features of S. griseus var. Erizensis and S. gnsrrs, ATCC 10137
S. griseus S. griseus var. Erizensis ATCC 10137 Light microscope Sporophores long, twisted Sporophores straight to twisted Electron microscope Direct spores smooth, rectangular Spores smooth, sausage-like Carbon footprint Spores furrowed with larger Spores furrowed with larger
Surface drawing surface drawing
Some spores with dark middle spot and dark middle spot
Table 711
Culture characteristics of S. grisens var. Erizensis and S. griseus, ATCC 10137 Medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137 peptone iron agar surface white somewhat white reverse side yellow yellow otherwise melanin - melanin calcium malate agar surface somewhat white cream reverse side creamy reddish white otherwise pale reddish. Pigment not pigment
Malate dissolved Malate dissolved Glucose-Asparagine-Agar Surface quite reddish-white cream reverse side cream yellow Otherwise somewhat yellow pigment yellow pigment
Table III (continued) Medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137 skimmed milk agar surface very weakly white no air growth back side yellow-brown yellow-brown otherwise yellow-brown yellow-brown
Casein dissolved Casein dissolved Tyrosine agar surface cream white back side yellow-brown yellow-brown pigment yellow-brown yellow-brown
Tyrosine dissolved tyrosine dissolved Xanthiine agar surface cream slightly white reverse side yellow yellow otherwise pale yellow pigment to pale yellow pigment
Xanthine dissolved Xantiia dissolved yeast extract-malt extract agar surface cream cream reverse side olive-brown yellow-brown otherwise pale yellow pigment pale yellow pigment casein starch agar surface olive-cream cream reverse side reddish reddish-brown otherwise somewhat reddish pigment sth.
reddish pigment
Hydrolyzed starch Hydrolyzed starch Bennett's 180 C surface cremeolive cream white
Yellow olive back
Pigment no pigment slightly olive 240 surface cream olive cream brown
Back side olive-brown yellow-brown
Pigment no pigment slightly yellow 28 C surface cream olive cream brown
Backside olive yellow-brown
Pigment a little olive a little yellow 37 C surface no air growth very weak cream blurred
Reverse slightly colorless yellow-brown
Pigment no pigment slightly yellow 55 C no growth no growth
Table III (continued) Medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137 Czapek's sucrose agar 18 0 surface slightly cremeolive slightly cremeolive
Reverse side creme creme 24 C surface slightly creamy blurry slightly creamy blurry
Backside white creme 2800 surface creme olive
Back side creme cremeolive 370 C surface no air growth no air growth
Reverse side colorless colorless 55 C no growth no growth maltose tryptone agar 180 C surface cream olive
Back olive olive
Pigment none slightly olive 240 0 surface cream cream
Back side olive-brown yellow-brown
Pigment none slightly yellow 2800 surface creme olive creme
Backside olive yellow-brown
Pigment a little olive a little yellow 37 C surface no air growth no
Air growth
Colorless yellow-brown reverse side
Pigment no yellow-brown 550 C no growth no growth simple gelatin complete liquefaction complete liquefaction nutrient gelatin complete liquefaction complete liquefaction synthetic nitrate broth somewhat colorless colorless surface membrane and vegetative growth on the base flaky growth on the base
Nitrates reduced to nitrites Nitrates not reduced to nitrites. Nutrient nitrate broth reduced strong white air growth on the white air growth on the
Surface cuticle Surface cuticle Table lll (continued) Medium S. griseus S. griseus var.
erizensis ATCC 10137
Little growth at the bottom, compact vegetative growth at the bottom
Nitrates reduced to nitrites Nitrates reduced to nitrites Litmus milk white air growth on blue somewhat white air growth
Surface ring on the blue surface ring partial peptonization pH 7.9 complete peptonization pH 7.9
Table IV Growth of S. griseus var. Erizensis and S. griseus ATCC 10137 on carbon compounds in synthetic medium (J. Bact. 56: 107-114, 1948)
S. griseus S. griseus var. Erizensis ATCC 10137
Control (-) (-)
1. D-xylose ++
2. L-arabinose + (+)
3. Rhamnose (-) (+) (-) * (-)
4. D-fructose + + 5. OGalactose + +
6. D-glucose ++
7. D-mannose ++
8. Maltose + + 9. Sucrose (-) (-) 10.
Lactose + + 11. Cciioblose + + 12. Raffinose (-) (-) 13. Dextrin + + 14. Inulin (-) - (-) 15. Soluble starch + + 16. Glycenn + +
Table IV (continued)
S. griseus S. griseus var.erizensis ATCC 10137 17. Dulcitol (+) (-) (-) (-) 18. Mannitol (-) ++ + 19. D-sorbitol + (-) (-) (-) 20. Inositol (-) (-) (+) (-) 21. Salicin (-) - - (-) 22. Phenol (-) - 23. Cresol - 24. Na formate (-) - 25. Na oxalate (-) - (-) 26. Na tartrate (-) - (-) 27. Na salicylate (-) - 28. Na acetate + (+) + 29. Na citrate + (+ ) + 30.
Na succinate + + + = good growth (+) = moderate growth (-) = little growth - = no growth * scatter of results in different experiments. Table V Color characteristics of S. griseus var. Erizensis and S. griseus, ATCC 10137 Agar Medium Color Harmony Manual 3rd Ed., 1948 N.B.S.
Circular 533, 1955 S. griseus S. griseus, S. griseus S. griseus var. Erizensis ATCC 10137 var. Erizensis ATCC 10137 Bennett's surface 1-1 / 2db (g) leather 2db (g) ivory 89 gm pale yellow 89 gm pale yellow, 90 g grayish-yellow, 121 m pale yellow-green, reverse side 2gc (g) bamboo chamois 3ng (g) yellow-maple 90 gm greyish yellow 77 m medium yellowish brown Czapek's sucrose surface 2cb (m) ivory white 2cb (m) ivory white - reverse side 2 db (g ) ivory 2db (g) ivory - maltose tryptone surface 2ba (m & g) pearl shell white 2cb (m) ivory white 92 gm yellowish white 92 m yellowish white, 93 yellowish gray backside 2ie (g) light mustard brown 3ng (g) yellow maple 91 gm dark gray yellow , 77 m medium yellowish brown 94 g light olive-brown, 106 g light olive
The method according to the invention is characterized in that
that an erizornycin-producing organism is grown under aerobic conditions in an aqueous nutrient medium until the medium has acquired significant antimicrobial activity, and that the erizomycin is isolated from the nutrient medium.
It should also be understood that bottle surface cultures can be used for the production of limited quantities. The organism is grown in an aqueous nutrient medium, which is primarily a carbon source, e.g. An assimilable carbohydrate and usually a source of nitrogen, e.g. B. an assimilable nitrogen compound or proteinaceous material contains, cultured. Preferred carbon sources include glucose, sand sugar, sucrose, glycerin, starch, corn starch, galactose, dextrin, molasses and the like. Preferred nitrogen sources include corn soft water, yeast, autolyzed brewer's yeast with milk solids, soybean meal, cottonseed meal, corn meal, milk solids, pancreatic hydrolyzate of casein, vinasse, fish meal, animal protein fluids, meat and bone waste and the like.
A combination of these carbon and nitrogen sources can be used to advantage. Trace metals, e.g. Zinc, magnesium, manganese, cobalt, iron and the like do not need to be added to the fermentation, since tap water and unpurified ingredients are used as components of the medium.
The production of the compound obtainable according to the invention can take place at any temperature which causes the microorganism to grow satisfactorily, e.g. B. between about 18 and 400 C and preferably between about 25 and 300 C, can be carried out. Typically, best compound production is achieved in about two to ten days. Usually the medium remains approximately neutral or weakly alkaline during fermentation. The final pH depends partly on the buffer substances that may be present and partly on the starting pH of the culture medium, which is advantageously adjusted to a pH of 6 to 8 before the sterilization.
If the cultivation is carried out in large vessels and tanks, it is advantageous to use the vegetative form instead of the spore form of the microorganism for the inoculation in order to prevent a pronounced delay in the production of the new compound and the associated inefficient use of the equipment. Accordingly, it is desirable to be a vegetative; Prepare inoculum in a nutrient plate culture by inoculating this culture with an aliquot from a soil or slant culture. When a young, active, vegetative inoculum is prepared in this way, it is usually aseptically transferred into large vessels or tanks.
The medium in which the vegetative inoculum is made can be the same as that used for the production of the new compound, or it can be different so long as it is such as to achieve good growth of the microorganism .
The new compound obtainable according to the invention is a basic compound with the empirical formula C27H32N405. At room temperature, erizomycin exhibits the following solubilities: approximately less than 1 mg / ml in water; > 10 mg / ml in 95 / o ethanol; > 10 mg / ml in ethyl acetate; > 10 mg / ml in acetone; > 100 mg / ml in chloroform; about 2 mg / ml in benzene; <1 mg / ml in Skellysolve B (petroleum ether or n-hexane); and approx.
5 mg / ml in n-butanol.
A variety of methods can be used to isolate and purify erizomycin, such as solvent extraction, liquid-liquid partition in a Craig apparatus, use of adsorbents and chromatography columns. Solvent extraction processes are preferred for commercial production because they are less time consuming and less expensive and higher yields can be achieved with them.
In a preferred isolation procedure, conventional methods such as e.g. B. Filtration using filter aid (or by centrifugation), the mycelium and undissolved solids are separated from the fermentation broth. The filtered (or centrifuged) broth can be extracted with a solvent, preferably ethyl acetate, for erizomycin. The ethyl acetate extract containing the erizomycin is usually washed with a tenth volume of water, then the ethyl acetate extract can be evaporated under reduced pressure to a dry crude product of the erizomycin. This preparation can be used in environments where higher purity of the antibiotic is not required.
This erizomycin preparation can be purified further by dissolving the crude product in a minimal amount of a solvent for erizomycin (preferably ethyl acetate) and adding 10 times the amount of cyclohexane. The precipitate that forms is usually collected by filtration and dissolved in ethyl acetate. The cyclohexane filtrate is usually discarded. The ethyl acetate containing the erizomycin can be filtered and the filtrate evaporated to dryness under reduced pressure.
The dry erizomycin-containing preparation is then usually dissolved in a solvent for erizomycin (preferably methylene chloride) and the solution is filtered. The filtrate can be evaporated to dryness under reduced pressure and gives a relatively pure erizomycin preparation.
Crystalline erizomycin can be obtained by subjecting this relatively pure erizomycin preparation to partition chromatography on buffered diatomaceous earth using the solvent system toluene propylene glycol. Crystalline erizomycin, which was obtained from the chromatographic fractions, can be recrystallized from ethanol to give a highly pure crystalline erizomycin preparation.
Because of the basic nature of erizomycin, the crude product originally obtained from the fermentation broth by ethyl acetate extraction can be purified by extracting the active substance at a pH of around 2 to 3 in water by adjusting the pH to 9 to 10 and by then back-extraction in ethyl acetate or another solvent in which erizomycin is soluble.
After removing the solvent, the residue can be further purified by crystallization, countercurrent distribution or chromatography, as described above.
Alternatively, the new compound obtainable according to the invention can also be isolated from the filtered broth by adsorption on cation exchange resins. Both carboxylic acid and sulfonic acid resins can be used. Suitable carboxylic acid resins include the polyacrylic acid resins obtained by copolymerization of acrylic acid and divinylbenzene, for example by the method given on page 87 of Kunin, Ion Exchange Resins, 2nd Edition (1958), John Wiley and Sons, Inc. will. Carboxylic acid cation exchange resins of this type are sold under the tradenames Amberlite IRC-50 and Zeokarb 226. Suitable sulfonic acid resins include sulfonated polystyrene resins which are crosslinked with divinylbenzene and which were obtained by the process described on page 84 of the cited work by Kunin.
Sulfonated cation exchange resins of this type are marketed under the trade names Dowex-50, Amberlite IR-120, Nalcite HCR, Chempro C-20, Permutit Q and Zeokarb 225.
The antibiotic is usually eluted from the resin with an acid, preferably at a pH lower than the pKa of the cation exchange resin used. Satisfactory results can be obtained at a pH of about 1 to 6.
The eluate is usually treated with a base, e.g. B. sodium hydroxide, or a strongly basic anion exchange resin, adjusted to a pH of about 7.5 to 8.5, and the antibiotic can be extracted with a water-immiscible solvent according to the method described above. [Anion exchange resins suitable for this purpose are prepared by chloromethylation by the process given by Kunin (see above reference, pages 88 and 89) of polystyrene, if desired with divinylbenzene, which was prepared by the process given by Kunin (see above reference, page 84) , is crosslinked, and quaternization with trimethylamine or dimethylethanolamine according to the process indicated by Kunin (cf. above quotation page 97).
Anion exchange resins of this type are marketed under the names Dowex-2, Dowex-20, Amberlite IRA 400, Duolite A-102 and Permutit S-1.]
The novel compound obtainable according to the invention can also be prepared from the resulting broths and other aqueous solutions by adsorption on a surface-active adsorbent, for example Florisil (a synthetic silicate of the type described in US Pat. No. 2,393,625, sold by the Floridin Company), decolorizing carbon or decolorizing resins, and eluting the adsorbed material with a solvent. Any of the solvents mentioned above can be used. A suitable decolorizing resin is Permutit DR (US Pat. No. 2,702,263).
The new compound of the invention can also be purified by successive transfers from the protonated to the non-protonated state and vice versa, especially in combination with other types of treatments, e.g. B. Solvent extractions and washes, chromatography and fractionated liquid-liquid extraction. In this way, salts of the erizomycin can be used to isolate or purify the antibiotic. The antibiotic may, for example, be converted into an insoluble salt, e.g. B. the Picrat, are transferred, which is then subjected to purification processes and then treated with alkali to regenerate the free base of the antibiotic. Or the antibiotic can be converted into a water soluble salt, e.g.
B. the hydrochloride or sulfate, and the aqueous solution of the salt can be extracted with various water-immiscible solvents before the free base of the antibiotic is regenerated by treating the so extracted acidic solution with alkali.
Salts of erizomycin can be used for the same biological purposes as the free base, or they can be used to purify the antibiotic as described above.
Specific acidic salts can be prepared by neutralizing the free base with the appropriate acid to a pH of less than about 7.5, and preferably to a pH of about 2 to 6. Acids suitable for this purpose include salt, sulfur!, Phosphorus, vinegar, amber, lemon, milk, maleic, fumaric, pamoe, chol, palmitic, mucous, camphor , Glutaric, glycolic, phthalic, wine, lauric, stearic, salicylic, 3-phenylsalicylic, 5-phenylsalicylic, 3-methylglutaric, orthosulphobenzoe, cyclohexanesulphamine, cyclopentane propionic, 1,2 cyclohexanedicarbon -, 4-cyclohexanecarbon, octadecenyl amber, octenyl amber, methanesulfone, benzenesulfone, helianth, Reinecke, dimethyldithiocarbamine, sorbin, monochloroacetic, undecylene, 4'-hydroxyazobenzene-4-sulfone, octadecylsulfur -, benzoin,
Cinnamic acid and similar acids.
Erizomycin, the new compound obtainable according to the invention, is active against Escherichin coli and, as a result of its antibacterial activity against this microorganism, can be used to reduce, inhibit and eradicate slime products in paper mills. It can also be used to extend the life of cultures of Trichomonas fetus, Trichomonas hominis and Trichomonas vaginalis by clearing them of Escherichia coli contamination.
Preferred embodiments of the process according to the invention are described in the following examples. All percentages relate to percentages by weight and all solvent ratios relate to volumes, unless otherwise stated.
example 1
A. Fermentation
A soil culture of Streptomyces griseus var.
erizensis, NRRL 3242 was used to inoculate 500 ml Erlenmeyer flasks each containing 100 ml of sterile medium; the germination medium contained the following ingredients: glucose monohydrate 25 g Pharmamedia * 25 g
Tap water q. s. ad. 1 liter * Pharmamedia is a technically pure cottonseed meal manufactured by Trader's Oil Mill Company, Fort Worth, Texas, USA.
The pH of the germ medium was 7.2 before sterilization. The germ inoculum was incubated for three days at 28 ° C. on a gump shaker at 250 rpm.
The germ iminoculum prepared as above was used to inoculate 500 ml Erlmeyer flasks, each containing 100 ml of sterile fermentation medium; the fermentation medium contained the following ingredients:
Sucrose 20 g soybean meal 20 g
Calcium carbonate 5 g
Tap water q. s. ad. 1 liter
The fermentation flasks were inoculated with 5 ml of germ iminoculum per 100 ml of fermentation medium.
The pH of the fermentation medium prior to sterilization was 7.2. The fermentation flasks were incubated for 5 days at a temperature of 280 ° C. on a Gump rotary shaker operating at 250 rpm. The maximum production of the antibiotic in a flask fermentation is generally reached after 2 to 3 days, after which the titer of the antibiotic gradually falls.
In a typical shake flask fermentation, the erizomycin concentration after one day was 9 bio units per ml; after 2 days 11 bio units per ml and after 3 days fermentation time 10 bio units erizomycin per ml. The determination was carried out with an agar plate test against the microorganism Bacillus cereus. The determination against Bacillus cereus is carried out on an agar which has been buffered to a pH value of 7.4 with phosphate buffer pH 7.4. A unit volume (0.08 ml) of the solution containing the substance to be determined is placed on a 12.7 mm paper disk, which is then placed on an agar plate inoculated with the test organism. The agar plate is then incubated at 320 ° C. for 16 to 18 hours.
A bio-unit (BU) is defined as the concentration of the antibiotic that gives a 20 mm zone of inhibition under standard test conditions, defined in U.S. Patent No. 3,359,165. For example, if a fermentation broth has to be diluted 1: 100 in order to produce a 20 mm zone of inhibition, then the effectiveness of this broth is 100 BU / ml.
B. Extraction.
The entire broth (3450 ml) of an erizomycin fermentation, as described above, with 4.4 bio units per ml of erizomycin, was filtered with the addition of kieselguhr. The filter cake was washed with one tenth the volume of water.
The filtered broth was combined with the wash water (3410 ml) at 3.8 BE / ml extracted with an equal volume of ethyl acetate. The ethyl acetate extract was washed with one tenth the volume of water. The washed ethyl acetate extract was then evaporated under reduced pressure and gave a dry crude product (350 mg) of erizomycin with a content of 32.8 cg / mg erizomycin determined by the B. cereus method.
C. Purification
A crude erizomycin preparation (704 g with a content of 53 μg / mg according to the B. cereus method), obtained by the method described above, was dissolved in the smallest possible amount of ethyl acetate and added to ten times the volume of cyclohexane with thorough mixing . The precipitate that formed was collected by filtration and dissolved in approximately 2100 ml of ethyl acetate. The cyclohexane filtrate was discarded. The ethyl acetate solution containing the erizomycin was filtered and the solids were discarded. The filtrate was then evaporated to dryness under reduced pressure at a temperature of less than 400 ° C. The dry residue of the ethyl acetate extract was dissolved in 420 ml of methylene chloride and the solution was filtered.
The solids were discarded and the filtrate was evaporated under reduced pressure to give a relatively pure, dry preparation of erizomycin weighing 146 g and found to be 200 .ug / mg, determined by the B. cereus method. exhibited.
Further purification of the erizomycin preparation was carried out with the aid of a partition chromatography column which was prepared as follows: 40 ml of propylene glycol were added to a rolling liquid slurry of 120 g of buffered diatomaceous earth in half-saturated toluene. The stirring was stopped for approx.
Continued for 10 minutes to get good mixing. The mixture was poured into a glass column 2.54 cm in diameter and packed at an air pressure of 0.28 kg / cm 2. The packed column was covered with a layer of 6 mm sea sand.
[The semi-saturated toluene used above was prepared as follows: 4 ml of propylene glycol were added to 3.79 liters of toluene with good mixing. This resulted in an approximately half-saturated solution which was used as the mobile phase for the partition chromatography column. The buffered kieselguhr used in the partition chromatography column was prepared as follows: 100 ml of a solution of KH2PO4 in water (27.2 g / l) and 100 ml of a solution of Na2HPO4 in water (28.4 g / l) were added to 100 g of kieselguhr with thorough mixing g / l). The mixture was then carefully dried at 120 "C.]
2.2 g of an erizomycin preparation, which had been prepared according to the methylene chloride extraction method described above, were dissolved in 7.3 ml of propylene glycol with constant stirring and heating on the steam bath.
This solution was mixed with 15 g of buffered kieselguhr and rubbed with the smallest possible amount of half-saturated toluene and placed on the top of the partition chromatography column. A layer of 6 mm sea sand was placed on top of the column. The column was filled with half-saturated toluene at a flow rate of about 2 ml / min. eluted. 20 ml fractions were collected. Fractions 26 to 44 were combined, washed with water to remove the glycol and evaporated to dryness under reduced pressure; Yield 698 mg. This material was recrystallized from about 10 ml of ethanol; Yield 343 mg of crystalline erizomycin with a content of 420 μg / mg according to the B. cereus method.
Example 2
Erizomycin hydrochloride
One gram of erizomycin, prepared as described in Example 1, is dissolved in 20 ml of methylene chloride. The solution is filtered and hydrochloric acid gas is introduced into the solution. The precipitate of erizomycin hydrochloride that forms is filtered off and dried.
Erizomycin has fungicidal activity as determined by a standard agar dilution plate test. It shows good activity against Nocardia steroides and low activity against Histoplasma capsulatum. Nocardia asteroides, which causes nocardiosis, has been isolated from soil and from laboratory air. Accordingly, erizomycin can be used to treat soils infected with Nocardia asteroides. Histoplasma capsulatum, which causes histoplasmosis, was isolated from storage cellars and chicken coops. Accordingly, erizomycin can be used to treat such environments when infected with Histoplasma capsulatum.