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Verfahren zur Herstellung von Nogalamycin Nogalamycin ist ein biosynthetisches
Produkt, das bei der Aufarbeitung eines Nogalamycin produzierenden Actinomycets
erhalten wird. Es hat die Eigenschaft, das Wachstum von gram-positiven Bakterien,
z. B. Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalia und Bacillus subtilis, nachteilig
zu beeinflussen. Außerdem ist es wirksam gegenüber gram-negativen Bakterien, z.
B. Klebsiella pneumoniae. Daher kann man Nogalamycin allein oder in Verbindung mit
anderen antibakteriellen Mitteln zur Verhinderung des Wachstums oder Herabsetzung
der Anzahl der in verschiedenen Umgebungen anwesenden Organismen verwenden.
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Das erfindungsgemäß verwendete Actinomycet wurde als Streptomyces
nogalater, var. nogalater bezeichnet. Eines seiner Stammeigenschaften ist die Bildung
von Nogalamycin. Eine Unterkultur dieser Art läßt sich aus der ständigen Sammlung
der Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service,
U. S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA., beziehen.
Ihre Zugangsnummer in diesem Lager ist NRRL 3035.
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Selbstverständlich beschränkt sich die Erfindung nicht auf die Verwendung
des hier beschriebenen besonderen Organismus, sondern schließt unter anderen auch
Mutanten ein, die aus den beschriebenen Organismen durch Mutationsmittel, z. B.
Röntgenstrahlen, UV-Strahlung und »Stickstoffsenf« (nitrogen mustards), hergestellt
wurden. Makroskopische und mikroskopische Beobachtungen bei Streptomyces nogalater,
var. nogalater sind in den folgenden Tabellen angegeben-.
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Tabelle I: Aussehen auf Ektachrom; Tabelle II: Assimilation von Kohlenstoffverbindungen
in einem synthetischenMedium; Tabelle III: Kultureigenschaften.
| Tabelle I |
| Aussehen von S. nogalater, var. nogalater auf Ekta- |
| chrom |
| Agar Medium Oberfläche Rückseite |
| Bennetts Medium Grau Hellorangerotbraun |
| Czapeks Rohr- Grau Grau |
| zucker |
| Malzzucker Grau Hellorangerotbraun |
| Trypton |
| Peptoneisen Farblos Rotbraun |
| 0,10/0 Tyrosin Grau Grau |
| Kaseinstärke Grau Stumpforange- |
| rotbraun |
| 2 |
| Tabelle II |
| Assimilation von Kohlenstoffverbindungen in syn- |
| thetischem Medium von S. nogalater, var. nogalater |
| (J. Bact., 56, 107 bis 114, 1948) |
| Kontrolle |
| 1. D-Xylose + |
| 2. j--Arabinose + |
| 3. Rhamnose + |
| 4. D-Fruchtzucker + |
| 5. D-Galactose + |
| 6. D-Glucose + |
| 7. D-Mannose + |
| 8. Malzzucker + |
| 9. Rohrzucker |
| 10. Milchzucker + |
| 11. Cellobiose + |
| 12. Raffinose (+) |
| 13. Dextrin + |
| 14. Inulin |
| 15. Lösliche Stärke + |
| 16. Glycerin + |
| 17. Dulcitol (+) |
| 18. D-Mannitol + |
| 19. D-Sorbitol (+) |
| Tabelle II (Fortsetzung) |
| 20. Inositol 28. Na-Acetat |
| 21. Salicin 29. Na-Citrat |
| 22. Phenol 30. Na-Succinat |
| 23. Cresol + Positive Assimilation. |
| 24. Na-Formiat |
| 25. Na-Oxalat Kein Wachstum. |
| 26. Na-Tartrat Geringes Wachstum - keine Assimilation. |
| 27. Na-Salicylat Positive Assimilation - nur
geringes Wachstum. |
| Tabelle III |
| Kultureigenschaften von S. nogalater, var. nogalater |
| Medium Oberfläche Rückseite Sonstiges |
| Peptoneisen-Agar Pfirsich bis Orange- Orange bis Gelbes bis
orangerotbraunes |
| rotbraun Orangerotbraun Pigment, kein H,S-Nach- |
| dunkeln |
| Calciummalat-Agar Graugrün Graurosa Dunkelrosafarbenes Pigment, |
| Malat nach 7 Tagen löslich |
| gemacht |
| Glucose-Asparagin- Grauweiß Cremegelb Leicht rotbraunes Pigment |
| Agar |
| Magermilch-Agar Pfirsichweiß bis Weiß Orangerotbraun Orangerotbraunes
Pigment, |
| Kasein nach 7 Tagen löslich |
| gemacht |
| Tyrosin-Agar Pfirsich bis Rosa Orange Gelb bis rosaoranges
Pigment, |
| Tyrosin während des Wachs- |
| tums löslich gemacht |
| Xanthin-Agar Pfirsich bis Rosa Cremeorange Gelb bis blaßrosa
Pigment, |
| Xanthin während des Wachs- |
| tums löslich gemacht |
| Kaseinstärke-Agar Pfirsich bis Rosa Rotbraunrosen- Blaßrosa
Pigment |
| farbig |
| Bennetts-Agar Pfirsich bis Rosagrau Orange Gelb bis orangerotbraunes |
| Pigment, gutes Wachstum bei |
| 18 bis 37'C |
| Czapeks Rohrzucker- Pfirsich bis Grauweiß Pfirsich bis Keines
bis blaßrosa Pigment, |
| Agar Grauweiß geringes Wachstum von 18 bis |
| 370C |
| Malmucker-Trypton- Graucremeweiß Orange Orangerotbraunes Pigment,
gutes |
| Agar Wachstum von 18 bis 37'C |
| Nitratnährbrühe Weiß Unbestimmtes vegetatives Wachs- |
| tum an der Grundfläche, |
| orangerotbraunes Pigment, |
| keine Reduktion |
| Synthetische Nitrat- Farblos Vegetatives Wachstum in der |
| brühe gesamten Brühe, keine Reduk- |
| tion |
| Lackmus-Milch Dunkelrotbraune Farbe, |
| drei Viertel peptonisiert, |
| pH 7,5 |
| Einfache Gelatine Spur Pfirsich Obere Hälfte rotbraunes Pigment, |
| untere Hälfte orangerotbraunes |
| Pigment, Verflüssigung ein |
| Drittel |
| Nährgelatine Spur Pfirsich Obere Hälfte rotbraunes Pigment, |
| untere Hälfte orangerotbraunes |
| Pigment, obere Hälfte verflüssigt |
Farbbeschreibung Die Farben der Kultur wurden nach 14 Tagen Inkubation
bei 28'C auf Bennetts Czapeks Rohrzucker und Malzzucker-Trypton mit den Streifen
im Color Harmony Manua,
3.8.1948, verglichen. Die Farbbezeichnungen wurden
dann nach dem ISC-CNBS-Verfahren zur Bezeichnung von Farben und einem Dictionary
of Color Names, N.B.S. Circular
553,
1955, erneut bestimmt. Man erhielt
die folgenden Farbbezeichnungen:
| Agar-Medium Oberfläche Rückseite Pigment |
| Bennetts Hellgelblichrosa, Stark Orange, Dunkelorange, |
| Blaßgelbrosa Dunkelorange Bräunlichorange |
| Czapeks Rohrzucker Sand Sand Graurosa, Blaßgelbrosa |
| Malzzucker-Trypton Rosaweiß Stark Orange, Mäßig Orange |
| Dunkelorange |
Streptomyces nogalater var. nogalater NRRL
3035
weicht von allen anderen beschriebenen
Streptomycesarten ab. Außer den obengenannten Eigenschaften hat dieser Mikroorganismus
bei der Betrachtung durch das Lichtmikroskop Sporophoren, welche gerade bis leicht
gebogen erscheinen. Kohlepausen der Sporen erscheinen bei der Betrachtung durch
das Elektronenmikroskop mehr oder weniger kugelförmig und haben eine glatte Oberfläche
mit leichten Wülsten. Die Sporen scheinen außerdem ziemlich leicht zu zerbrechen.
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Eine wichtige Eigenschaft der Kultur auf den meisten Medien ist die
Erzeugung eines Geruchs, welcher dem von schwarzen Walnüssen ähnelt.
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Die erfindungsgemäße Verbindung läßt sich dann herstellen, wenn man
den produzierenden Organismus in einem wäßrigen Nährinedium unter aerobischen Submersbedingun,-en
züchtet. Selbstverständlich könneu zur Herstellung begrenzter Mengen Oberflächenkulturen
in Flaschen verwendet werden. Der Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet,
welches eine Kohlenstoffquelle enthält, z. B. ein assimilierbares Kohlehydrat und
eine Stickstoffquelle, z. B. eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder ein eiweißhaltiges
Material. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Traubenzucker, brauner Zucker, Rohrzucker,
Glycerol, Stärke, Maisstärke, Milchzucker, Dextrin, Melasse und ähnliche Kohlehydratquellen.
Bevorzugte Stickstoffquellen sind Getreideweiche, Hefe, autolysierte Brauereihefe
mit Milchfeststoffen, Verdauungskasein der Bauchspeicheldrüse, lösliche Stoffe aus
der Destillation, tierische Peptonflüssigkeiten, Fleisch und Knochenabfälle und
ähnliche Stickstoffquellen. Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen
lassen sich vorteilhaft verwenden. Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan,
Kobalt, Eisen u. dgl., brauchen den Gärmedien nicht zugesetzt zu werden, da Leitungswasser
und ungereinigte Bestandteile als Bestandteile der Medien Verwendung finden.
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Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung läßt sich bei jeder
Temperatur erreichen, die zum befriedigenden Wachstum des Mikroorganismus führt,
z. B. zwischen etwa 18 und 40'C, vorzugsweise zwischen etwa 26 und
30'C. Gewöhnlich erhält man die optimale Produktion der Verbindung innerhalb
von etwa 2 bis 10 Tagen. Das Medium bleibt normalerweise ziemlich nahe dem
neutralen Wert oder alkalisch während der Gärung. Der pH-Endwert ist zum Teil von
den anwesenden Puffersubstanzen abhängig und zum Teil vom Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums,
welches vorzugsweise vor der Sterilisation auf einen pH-Wert von etwa
6 bis 8 gebracht wird.
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Findet das Wachstum in großen Gefäßen und Tanks statt, so sollte vorzugsweise
die vegetative Form an Stelle der Sporenform des Mikroorganismus für die Impfung
verwendet werden, um eine deutliche Verzögerung in der Herstellung der neuen Verbindung
und der damit verbundenen Beanspruchung der Anlage ohne Leistung zu vermeiden. Daher
sollte ein vegetativer Impfstoff in einer Nährbrühenkultur hergestellt werden, wobei
man die Brühenkultur mit einem Teil aus einer Erd- oder Schrägbodenkultur impft.
Sobald auf diese Weise ein aktiver vegetativer Impfstoff hergestellt ist, wird er
aseptisch in große Gefäße oderTanks eingeführt. Als Medium, in welchem der vegetative
Impfstoff hergestellt wird, kann man das gleiche verwenden, das für die Herstellung
der neuen Verbindung verwendet wurde, solange sich damit ein gutes Wachstum des
Mikroorganismus erzielen läßt. Auch andere Medien können verwendet werden.
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Die erfindungsgemäße Verbindung, Nogalamycin, ist eine basische Substanz,
deren Eleinentaranalyse die empirische Formel C,H"NO", zeigt. Sie ist in Methylenehlorid,
Aceton, Äthylacetat und Chloroform löslich. Nogalamycin ist in Wasser, Methanol
und Äthanol verhältnismäßig unlöslich.
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Nach einem bevorzugten Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäßen
neuen Verbindung wird die gesamte Brühe, falls erforderlich, auf einen fast neutralen
pH-Wert oder darunter gebracht, zweckmäßigerweise zwischen einem pH-Wert von
5 und 7,
und filtriert. Hierbei kann ein Filtermittel, z.B. Diatomit,
verwendet werden. Das Filtrat wird dann mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel
extrahiert, und die Verbindung wird aus der Lösungsmittelphase gewonnen. Gegebenenfalls
kann man die Lösungsmittelphase ansäuern und die Verbindung in einer protonaktiven
Form gewinnen. Dies kann man dadurch erreichen, daß man die Verbindung als unlösliches
Salz ausfällt oder den Lösungsmittelextrakt mit einer wäßrigen Lösung einer Säure
auszieht, welche ein wasserlösliches Salz bildet, z. B. Salzsäure, Schwefelsäure,
Phosphorsäure und Essigsäure. Vorzugsweise erreicht man dies dadurch, daß man den
pH-Wert auf weniger als 7,5, vorzugsweise unter 6,
hält. Das Salz wird
dann durch Verdampfung gewonnen.
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Gegebenenfalls kann man das obengenannte Extraktionsverfahren wiederholen,
um den Reinigungseffekt
zu verstärken. M der weiteren Reinigung
kann außerdem das mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel gegen ein anderes ausgetauscht
werden. Zum Beispiel kann man das Methylenehlorid dazu verwenden, Verunreinigungen
aus den wäßrigen Lösungen der Salzforrn auszuwaschen oder die freie Base aus den
wäßrigen Lösungen der nichtprotonaktiven Verbindung zu extrahieren.
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Die erfindungsgemäße Verbindung läßt sich auch durch Adsorption auf
Kationenaustauschharzen aus der filtrierten Brühe gewinnen. Sowohl die Carboxylals
auch S#Ifonsäurearten sind verwendbar. Geeignete Carbonsäureharze sind die Polyacrylsäureharze,
welche sich durch #die Mischpolymerisation von Acrylsäure und Divinylbenzol.nach
dem auf S. 87 von Kunin, Ion Exchange"Resins, 2. Auflage (1958), John
Wiley and Sons, Inc., beschriebenen Verfahren herstellen lassen. Geeignete Sulfonsäureharze
sind kernsulfonierte Polystyrolharze, welche mit Divinylbenzol vernetzt sind und
sich durch das auf S. 84 von Kunin, siehe oben, angegebene Verfahren herstellen
lassen.
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Das protonaktive Antibiotikum wird mit Wasser bei einem sauren pH-Wert
aus dem Harz ausgewaschen" der vorzugsweise niedriger als der pKa des verwendeten
Kationenaustauschharzes ist. Befriedigende Ergebnisse lassen sich mit einem pH-Wert
von etwa 1 bis 6 erzielen. Der Säureüberschuß in dem Eluat wird mit
einer Base, z. B. Natriumhydroxyd, oder ei #Vtark basischen Anionaustauschharz neutralisiert,
und das Antibiotikum wird mit einem mit Wässer nicht mischbaren Lösungsmittel nach
dem oben beschriebenen Verfahren extrahiert. (Geeignete Anionenaustauschharze für
diesen Zweck lassen sich dadurch herstellen, daß man gegebenenfalls vernetztes Polystyrol
nach dein auf S. 88 und 97 von K u n i n, siehe oben, angegebenen
Verfahren mit dem nach dem Verfahren auf S. 84 von K u n i n, siehe oben,
hergestellten Divinylbenzol chlormethyliert und mit Trimethylamin oder Dimethyläthanolamin
durch das auf S. 97 von Kunin, siehe oben, angegebene Verfahren quaternisiert.
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Die erfindungsgemäße Verbindung läßt sich außerdem aus den Brühen
und anderen wäßrigen Lösungen durch Adserption auf einem oberflächenaktiven Adsorbenten,
z. B. Silikaten, Entfärbungskohle oder Entfärbungsharzen, gewinnen, wobei das adsorbierte
Material mit einem Lösungsmittel ausgewaschen wird. Hierbei kann jedes der obenerwähnten
Lösungsmittel verwendet werden.
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Die erfindungsgemäße Verbindung läßt sich durch aufeinanderfolgende
Überführung von protonaktiven in nichtprotonaktive Formen und umgekehrt reinigen,
wobei andere Behandlungsarten eingeschoben werden können, z. B. Extraktionen mit
Lösungsmitteln und Waschungen, Chromatographie und fraktionierte Flüssigkeits-Flüssigkeits-Extraktionen.
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Die erfindungsgemäße Verbindung läßt sich außerdem durch Umwandlung
der protonaktiven oder nichtprotonaktiven Formen in weniger lösliche Formen,
7- B. durch Reaktion mit Picrinsäure, reinigen.
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Salze von Nogalamycin lassen sich für die gleichen biologischen Zwecke
wie die freie Base verwenden, oder sie können zurÜck in die freie Base und dann
in andere Salze, wie z. B. das Nitrat, Oxalat, Hydro-Chlorid oder Sulfat, umgewandelt
werden.
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Die Salze lassen sich dadurch in die freie Base umwandeln, daß man
sie mit einem Alkali neutralisiert oder mit einem anionischen Harz, vorzugsweise
bei einem pH-Wert von 7,5 bis 8,5, in Kontakt bringt. Spezifische
Salze lassen sich durch Neutralisieren der freien Base mit der entsprechenden Säure
auf einen pH-Wert unter 7,5 und vorzugsweise auf einen pH-Wert von etwa 2
bis 6 herstellen. Für diesen Zweck geeignete Säuren sind Salz-, Schwefel-,
Phosphor-, Essig-, Bernstein-, Zitronen-, Milch-, Malein-, Fumar-, Pamoin-, Cholin-,
Palmitin-, Schleim-, Campher-, Glutar-, Glycol-, Phthal-, Weinstein-, Laurin-, Stearin-,
Salieyl-, 3-Phenylsalicyl-, 5-Phenylsalicyl-, 3-Methyl-glutar-, ortho-Sulfobenzoe-,
Cyclohexansulfamin-, Cyclopentanpropion-, 1,2-Cyclohexandicarbon-,4-Cyclohexencarbon-,
Octadecenylbernstein-, Octenylbernstein-, Methansulfon-, Benzolsulfon-, Helianthin-,
Reinecke-, Azobenzolsulfon-, Octadecylschwefel-, Pierinsäure und ähnliche Säuren.
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Nogalamycin hat einen LD,-Wert von 0,0054 mcg/ ccm gegenüber KB-Zellen
in Gewebekultur.
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Die erfindungsgemäße Verbindung, Nogalamycin, hat einen weiten antibakteriellen
Wirksamkeitsbereich. Ein Rohrverdünnungsspektrum, bei dem als Brühenmedium BHI (Brain
Heart Infusion broth, Difco, Detroit, Michigan) verwendet wurde, wurde von Nogalamycin
aufgestellt. Auf die übliche, in Snell
E. E.,
Vitamin Methode, Bd.
1, Academie Press Inc., New York
1950, S. 327, beschriebene Weise
wurden Reagenzgläser
(18 - 150 mm) präpariert. Testorganismen, welche
18 Stunden bei 37'C gezüchtet wurden, verwendete man zum Impfen des Testmediums
bei einer Verdünnung von
1 bis 40000. Das antibakterielle Spektrum von Nogalamycin
wird in der folgenden Tabelle IV gezeigt.
| Tabelle IV |
| Antibakterielles Spektrum von Nogalamycin |
| Verhinderungs- |
| Testorganismus Mindest- |
| konzentration |
| (mcg/CCM) |
| Diplococcus pneumoniae ...... 0,1 |
| Staphylococcus aureus ........ 0,8 |
| Staphylococcus albus ......... 0,8 |
| Streptococcus fäcalis ......... 0,4 |
| Streptococcus hämolytieus ..... 0,4 |
| Streptococcus viridans ........ 0,4 |
| Bacillus subtilis .............. 50 |
Die erfindungsgemäße Verbindung, Nogalamycin, ist wirksam gegenüber Baeillus subtilis
und kann zur Behandlung von Brutplätzen für Seidenwürmer verwendet werden, um die
durch diesen Organismus verursachten Infektionen zu verhindern oder auf ein Minimum
zu beschränken. Außerdem kann man sie zur Herabsetzung oder Verhinderung des Fischgeruchs
bei Fischen oder Fischkisten verwenden, der durch diesen Organismus hervorgerufen
wird. Die Verbindung läßt sich als Desinfektionsmittel bei verschiedenen mit Staphylococcus
albus oder Staphylococcus aureus verunreinigten Anlagen der zahnärztlichen oder
ärztlichen Praxis verwenden, außerdem kann es als Desinfektionsmittel für gewaschenes
und gestapeltes Eßgeschirr verwendet werden, welches mit Staphylococcus aureus verunreinigt
ist. Schließlich kann Nogalamycin noch als Vernichtungsmittel für Nagetiere verwendet
werden.
In den folgenden Beispielen sind alle Prozente Gewichtsprozente
und alle Lösungsgemische in Volumenverhältnissen angegeben, falls nicht anders erwähnt.
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Beispiel 1
A. Gärung Ein Bodenmaterial von Streptomyces
nogalater, var. nogalater NRRL 3035 wurde dazu verwendet, einen
500 ccm fassenden Erlenmeyerkolben zu impfen, welcher 100 ccm eines
Impfmediums enthielt, das die folgenden Bestandteile enthielt: Glucosemonohydrat
.................. 25 g
Pharmamedia* ...................... 25 g
Leitungswasser
bis zur Auffüllung auf 11.
Pharmamedia ist ein industrielles Baumwollsamenmehl.
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Der pH-Wert des Mediums vor der Sterilisation betrug 7,2. Der
Impfstoff wurde 2 Tage bei 28'C auf einer mit 250 UpM arbeitenden drehbaren
Gump-Schüttelvorrichtung gezüchtet.
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Der oben beschriebene Impfstoff (100 cem) wurde zum Impfen
eines 20-1-Impftanks verwendet, welcher 15 1 des folgenden sterilen
Impfmediums enthielt: Glucosemonohydrat ............... 10 g/1
Getreideweiche
................... 10 g/1
Pharmamedia .................... 2
g/1
Wilsons Peptone Liquor Nr.195* .. 10 g/1
Specköl .........................
2 ccm/1 Leitungswasser ................... Rest Wilsons Peptone Liquor Nr.
159 ist ein Präparat von enzymatisch hydrolysierten Proteinen tierischen
Ursprungs. Der pH-Wert des Impftankmediums vor der Sterilisation betrug
7,2. Man ließ den Inhalt des Impftanks 24 Stunden bei einer Temperatur von
28'C einer Belüftung von 10 I/Min. wachsen und rührte das Ganze mit einer
Geschwindigkeit von 400 UpM.
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Der oben beschriebene Impftank wurde dann dazu verwendet, ein
380 1 fassendes Gärgefäß zu impfen, welches 250 1 des folgenden sterilen
Mediums enthielt-.
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Glucosemonohydrat ............... 20 g/1
Stärke
........................... 20 g/1
Hefe ............................
25 g/1
CaCO" .......................... 5 g/1
Specköl ..........................
5 ccm/1 Leitungswasser ................... Rest Der pH-Wert wurde mit
Natriumhydroxyd vor der Sterilisation auf 6,8 gebracht. Die Kultur wurde
4 Tage bei einer Temperatur von 28'C, einer Belüftung von 100 I/Min.
gezüchtet und mit einer Geschwindigkeit von 280 UpM gerührt.
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B. Extraktion Die gesamte Brühe (212 kg, 36 BU/g) aus dem obengenannten
Gärgefäß wurde mit Hilfe von 10 kg
Diatomit in einer Presse filtriert. Der
Filterkuchen wurde mit 120 1 Äthylacetat gewaschen. Danach wurde die Äthylacetatwaschflüssigkeit
für die erste Extraktion des Filtrats verwendet. Das Filtrat (190 1)
wurde
dreimal mit je 120 1 Äthylacetat bei einem pH-Wert von 6,7
(Ernte-pH) extrahiert, und das extrahierte Filtrat wurde abgezogen. Die vereinigten
Äthylacetatextrakte (260 1) wurden dreimal mit je 130 1
0,1
n-Salzsäure extrahiert. Der vereinigte Salzsäureextrakt wurde mit 6,5 1 von
500/,igem Natriumhydroxyd auf den pH-Wert 7 gebracht, und die-neutrale Lösung
(435 1) wurde dreimal mit je 220 1
Äthylacetat extrahiert. Die
extrahierte wäßrige Lösung, welche keine Wirksamkeit gegenüber B. subtilis besitzt,
wurde abgezogen. Der vereinigte Äthylacetatextrakt (660 1) wurde im Vakuum
zu einem Öl
konzentriert. Das Öl wurde in 400 cem 800/"igem t-Butylalkohol
gelöst, und die erhaltene Lösung wurde lyophilisiert, so daß man rohes Nogalamycin
erzielt, welches ein rötlichbrauner Feststoff mit einem Gewicht von 51,5 g
und einer Wirksamkeit von 102 BU/mg war. (Das angewandte Prüfverfahren untersuchte
die Wechselwirkung unter Verwendung von Bacillus subtilis im Scheiben-Agar-Verfahren.)
Die Wirksamkeit ist in Bioeinheiten/mg = BU/mg angegeben._ C. Reinigung
Das oben beschriebene Nogalamycin (40 g) wurde in einem Gemisch aus
300 ccm ln-Salzsäure und 200 ccm Äthylacetat gelöst. Nach gutem Mischen wurde
die untere Phase abgetrennt und zweimal mit je 150 ccm Äthylacetat extrahiert.
Die Äthylacetatextrakte wurden zweimal mit je 100 ccm 0,1n-Salzsäure extrahiert.
Die vereinigten wäßrigen Extrakte wurden filtriert, und das Filtrat wurde mit
300/,
Natriumhydroxyd auf den pH-Wert 7 gebracht und viermal mit
je 300 ccm Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt,
über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum verdampft. Bei der Kristallisation aus
400 ccm Methanol ergab der Rückstand 19 g kristallines Nogalamycin.
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Kristallines Nogalamycin hatte die folgenden physikalischen und chemischen
Eigenschaften. Schmelzpunkt: 199'C.
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Elementaranalyse -
C = 58,35 0/" H = 6,49 0/0,
N # 1,97 0/"
0 = 32,83 0/,.
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Empirische Formel: C"I-I4,NO51 Spezifische optische Drehung:
Löslichkeit: Löslich Unlöslich Methylenchlorid Wasser Aceton Methanol Äthylacetat
Äthanoi Chloroform Ultraviolettspektrum: Die in F i
g. 2 reproduzierten Ultraviolett-Absorptionsmaxima
von kristallinem Nogalamycin sind folgende: Neutraler und saurer Äthylalkohol
236 mp., a
= 65,76;
259 mp., a =
31,27;
290 m#t,
a
= 11,89;
alkalischer Äthylalkohol 240 m#t, a
= 58,96,
288 (sh)
mp., a = 10,45;
322 m#t, a
= 6,03.
Sioktbares Spektrum:
Die sichtbarirn Absorptionsmaxima von kristallinem Nozalamyc;i,n sind die folgendem:
| Neutrale und saurer Äthylalkohol |
| 480 m#t, a = j 9,54; |
| alkaliszber Ätbylalkghol |
| 553 mp, a = 18,10. |
Infrarotspizlctrum: Das Idmmt-Absorptionsspektrum des in Mineralöl suspendierten
Nogalamycin ist in F i
g. 1 der Zeichnung dazgesteUt. Nogalamycin zeigt Spitzen
bei den folgenden WellenUngen, ausgedrückt in reziproken Zentimetern:
| 3540 cm-' 1575 cm-' 110,5 cm-i |
| 3460 1250 1050 |
| 3400 1220 1000 |
| 1745 1205 770 |
| 1670 1160 760 |
| 1620 1148 |
Molekulargewicht: 721,e