Verfahren zur Herstellung eines Illipfstoffes
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, der wirksam ist gegen Krankheiten, welche von Nematoden bei Wirbeltieren verursacht werden.
In den letzten drei Jahrzehnten wurde ein beträchtliches Ausmass an Literaturarbeiten über Immunität veröffentlicht. Die betreffenden Arbeiten schliessen die Forschung über natürlich erworbene Immunität (d. h.
Immunität, welche als Folge einer natürlichen Infektion auftritt), Selbstheilung und künstliche Immunität ein. Ein grosser Teil dieser Arbeiten befasst sich mit Haemonchus contortus, Trichinella spiralis und Nippostrongylus muris (ein Parasit von geringer praktischer Bedeutung).
Die zur Erzeugung künstlicher Immunität hierbei injizierten Materialien waren weitgehend Präparate aus ausgewachsenen Würmern oder fraktionierte Extrakte derselben. Infektive Larven im dritten Stadium, deren Exkrete und Sekrete sowie Ösophagus-Extrakte von Larven im dritten Stadium wurden untersucht. Aus allen diesen Untersuchungen ergaben sich keine befriedigenden Impfstoffe.
Soweit bekannt, ist die einzige kommerziell erzeugte Impfsubstanz gegen pathogene Nematoden diejenige gegen Dictyocaulus viviparus, hergestellt nach der Methode, welche durch die Mitarbeiter der Glasgow University durch Bestrahlung von Larven mit ionisierender Strahlung erzeugt wurden.
Nach der vorliegenden Erfindung werden Impfstoffe erzeugt, welche Antigene enthalten, die im Wirtstier die Produktion von schützenden Antikörpern stimulieren, nachdem sie injiziert worden sind.
Die Herstellung dieser Vaccine wurde ermöglicht durch die Entwicklung eines befriedigenden Verfahrens zur invitro-Züchtung der Parasiten während der Stadien ihrer Antigenerzeugung.
Die Arbeiten welche zur vorliegenden Erfindung führten, haben gezeigt, dass es mindestens zwei Antigene gibt, welche in den betrachteten Fällen Immunität erzeugen, nämlich:
1. Antigene, erzeugt während der Entwicklung der histotrophen Stadien der Larven, d. h. Exkrete, Sekrete und metabolische Produkte.
2. Somatische Antigene, d. h. solche, die in den Larven enthalten sind.
Es ist indessen vorzuziehen, dass die Impfstoffe ebenso diejenigen Antigene enthalten sollten, welche während der Häutung der Larven des dritten Stadiums oder während derjenigen Zeit im Lebenszyklus, in welcher die Durchdringung des Wirtsgewebes durch die Larven im dritten Stadium erfolgt, erzeugt wurden.
Die Antigenwirkung dieser Komponenten wurde bestätigt durch Haut-Sensitivierungsteste, die auf dem Phänomen beruhen, dass ein immunes oder infiziertes Tier auf das intradermal injizierte Antigen mit der Ausbildung einer erythemartigen Erscheinung und/oder eines lokalisierten Ödems reagiert. Dieser Reaktionstyp ist messbar und spezifisch. Wie im nachstehenden auszuführen sein wird, wurde diese Antigenwirkung in gewissen Fällen durch Immunitätsstudien an geeignet empfindlichen Versuchstieren bestätigt.
Im Falle der genauer untersuchten Parasiten wurde nachgewiesen, dass eine Präparation, welche die metabolischen Produkte der parasitären Umwandlung und die somatischen Antigene der histotrophen Formen der Parasiten enthält, Immunität im natürlichen Wirtslebewesen erzeugt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen ist dadurch gekennzeichnet, dass infektive Nematodenlarven im dirtten Stadium durch Inkubation in einem sterilen, wässrigen Kulturmedium in die histotrophen Stadien ihrer Weiterentwicklung übergeführt werden, worauf das die Larven enthaltende Medium direkt als Impfstoff verwendbar ist.
Hierbei wird vorzugsweise so vorgegangen, dass man die Sekrete, welche während der Häutung der Larven im dritten Stadium oder während desjenigen Stadiums ihres Lebenszyklus, der der Durchdringung der Gewebe des Wirtstieres entspricht, produziert werden, zum Kulturmedium, in welchem die histotrophen Lar venstadien erzeugt wurden oder zu dessen Trockenrückstand, hinzugibt.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann. vorzugsweise wie folgt durchgeführt werden:
Aus den Faeces von infizierten Tieren, welche unter geeigneten Bedingungen zur Entwicklung des drift ten Stadiums der Larven inkubiert wurden, werden die letztgenannten Larven gewonnen. Die gereinigten Larven werden hierauf in einem Medium eingetaucht, in welchem eine Häutung angeregt wird. Wenn die Häutung vor sich gegangen ist, werden die Larven aus der Lösung abgetrennt. Die Lösung wird aufbewahrt. Die Larven werden hierauf in einem geringen Volumen einer wässrigen Lösung mit einem geeigneten Antimikroben-Agens oder einer Mischung solcher Agentien suspendiert um die Möglichkeit einer bakteriellen oder anderweitigen Verunreinigung zu vermindern. Zu diesem zweck sind bekannte Antibiotika, wie z. B. Penicillin und Streptomycin verwendbar.
Die Larven werden dann abgetrennt und in eine physiologisch ausgeglichene sterile Salzlösung, welche Nährsubstanzen enthält, eingebracht wobei in dieser Lösung die Entwicklung in die histotrophen Stadien erfolgt. Die Inkubation wird zweckmässig bei ungefähr 37 C unter Sauerstoffeinwirkung und nötigenfalls unter Bewegung durchgeführt bis Testproben zeigen, dass der geeignete Grad der Larvenentwicklung vor sich gegangen ist.
Das Kulturmedium und die darin enthaltenen Larven werden hiernach einer Gefriertrocknung unterzogen.
Die vom Häutungsprozess her aufbewahrte Lösung kann nach Befreiung von allen darin allenfalls enthaltenen unerwünschten anorganischen Ionen vor dem Trocknen zugefügt werden. Die derart erhaltenen getrockneten Antigensubstanzen können in einer sterilen wässrigen Trägerlösung vor der Injektion suspendiert werden. Gegebenenfalls können bekannte Hilfsstoffe, wie Aluminiumhydroxyd zu den Antigensubstanzen zugesetzt werden.
Beispiel 1
Herstellung eines Impfstoffes gegen Dictyocaulus viviparus.
Eine saubere Suspension infektiver Drittstadium Larven von Dictyocaulus viviparus in Wasser wurde aus inkubierten Faeces von Kälbern hergestellt, welch letztere zuvor mit dem Parasiten infiziert worden waren. Die Suspension wurde 12 Tage lang bei 15 C gelagert und hiernach 2 Minuten lang zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit durch eine gastrische Pepsinlösung ersetzt wurde. Anschliessend wurde die Suspension bei 370 C inkubiert, bis Testzählungen ergaben, dass sich mehr als 90 o!o der Larven gehäutet hatten. Nach Erreichung dieses Zustandes wurde die Suspension erneut zentrifugiert und die überstehende Lösung entfernt, mit Natriumcarbonatlösung neutralisiert, in 2 ml Volumina aufgeteilt und ausgefroren.
Die gehäuteten Larven wurden dann in eine Lösung, welche je ml tausend Einheiten Penicillin und Streptomycin und 250 Einheiten Nystatin enthielt, eingetragen und eine Stunde lang bei Zimmertemperatur darin belassen. Hiernach wurden die Larven mit sterilem Was ser gewaschen und in Flaschen übergeführt, welche ein Kulturmedium enthielten, dass aus Trode-Lösung unter Zusatz von Leberextrakt bestand. Anschliessend erfolgte eine Inkubation bei 378 C bis sich mindestens 60 o der Larven in ihr viertes Stadium weiterentwikkelt hatten. Das Kulturmedium und die Larven wurden hierauf in geeignete Volumina unterteilt und in Behälter zur Gefriertrocknung eingefüllt. Zum Gebrauch wurden die trockenen Antigene pulverisiert und in sterilem Wasser suspendiert, wonach das erforderliche Volumen des Enthäutungsmediums zugegeben wurde.
Beispiel 2
Herstellung eines Impfstoffs gegen Haemonchus contortus.
Eine gereinigte Suspension von infektiven Drittstadiums-Larven von Haemonchus contortus in Wasser wurde aus inkubierten Faeces von Schafen hergestellt, welche letztere zuvor mit dem Parasiten infiziert worden waren. Die Suspension wurde 2 Minuten lang zentrifugiert und die überstehende Lösung entfernt und ersetzt durch die Lösung, welche 0,03 O/o Natriumhypochlorit und 0,5 /o Natriumchlorid enthielt. Die Suspension wurde bei 370 inkubiert bis Testzählungen ergaben, dass mehr als 90 O/o der Larven sich gehäutet hatten. Nach Erreichung dieses Statiums wurde die Suspension erneut zentrifugiert und die überstehende Lösung entfernt. Sie wurde dialysiert gegen destilliertes Wasser und in 2 ml Fraktionen aufgeteilt und ausgefroren.
Hiernach wurden die enthäuteten Larven in eine Lösung eingebracht, welche je ml 1000 Einheiten Penicillin und Streptomycin und 250 Einheiten Nystatin enthielt und in dieser Lösung 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur belassen. Jetzt wurden die Larven mit sterilem Wasser gewaschen und in Flaschen übergeführt, welche das Kulturmedium, bestehend aus Earls-Lösung, unter Zusatz der Produkte einer Leberhydrolyse und Casein enthielt.
Anschliessend erfolgte Inkubation bei 370 C bis mindestens 60 O/o der Larven sich in ihr viertes Stadium weiterentwickelt hatten. Das Kulturmedium und die Larven wurden dann in geeignetem Volumen in Behälter übergeführt und einer Gefriertrocknung unterzogen. Zum Gebrauch wurden die getrockneten Antigene pulverisiert, in sterilem Wasser suspendiert und das erforderliche Volumen des Häutungsmediums zugegeben.
Beispiel 3
Herstellung eines Impfstoffs gegen Ostertagia ostertagi.
Eine gereinigte Suspension von infektiven Drittstadiums-Larven von Ostertagia ostertagi in Wasser wurde aus inkubierten Faeces von Kälbern, welche letztere zuvor mit dem Parasiten infiziert worden waren, hergestellt. Diese Suspension wurde absitzen gelassen, die überstehende Flüssigkeit entfernt und ersetzt durch eine Lösung von 0,075 /o Natriumhypochlorit und 1,5 /o Natriumchlorid. Die Suspension wurde bei Zimmertemperatur belassen bis Testzählungen ergaben, dass mehr als 90 O/o der Larven sich gehäutet hatten. Nach Erreichen dieses Stadiums wurde die Suspension zentrifugiert, die überstehende Lösung abgeschöpft, gegen destilliertes Wasser dialysiert und d in geeignete Volumina zur Ausfrierung unterteilt.
Die enthäuteten Larven wurden mit sterilem Wasser gewaschen, zentrifugiert und in einer Lösung eingebracht, welche pro ml 1000 Einheiten Penicillin und Streptomycin und 250 Einheiten Nystatin enthielt, worin die Larven eine Stunde lang bei Zimmertemperatur belassen wurden. Sie wurden hierauf erneut mit sterilem Wasser gewaschen und in Flaschen eingebracht, welche das Kulturmedium enthielten, das seinerseits aus Earls-Lösung bestand, die Leberhydrolyse-Produkte enthielt.
Die Kulturflaschen wurden hiernach bei 370 C auf einer Schaukelmaschine inkubiert, bis sich mindestens 60 O/o der Larven in ihr viertes Stadium weiterentwikkelt hatten. Das Kulturmedium und die Larven wurden hierauf in geeignete Volumina unterteilt und in Behältern einer Gefriertrocknung unterzogen.
Zum Gebrauch wurden die getrockneten Antigene pulverisiert, in sterilem Wasser suspendiert und das erforderliche Volumen der Enthäutungsflüssigkeit zugegeben.
Beispiel 4
Herstellung eines Impfstoffs gegen Strongylus vulga reis.
Eine gereinigte Suspension von infektiven Drittstadium-Larven von Strongylus vulgaris in Wasser wurde aus inkubierten Faeces von Pferden hergestellt, welche letztere zuvor mit dem Parasiten infiziert worden waren. Diese Suspension wurde absitzen gelassen, die überstehende Flüssigkeit entfernt und ersetzt durch eine Lösung von 0,075 0/0 Natriumhypochlorit und 1,5 o/o Natriumchlorid. Die Suspension wurde bei Zimmertemperatur belassen bis Testzählungen ergaben, dass mehr als 90 O/o der Larven sich gehäutet hatten.
Nach Erreichung dieses Stadiums wurde die Suspension zentrifugiert, die überstehende Lösung abgenommen und dialysiert gegen destilliertes Wasser, hiernach in geeignete Volumina unterteilt und gefroren. Die enthäuteten Larven wurden mit sterilem Wasser gewaschen, zentrifugiert und in eine Lösung eingebracht, welche pro ml 1000 Einheiten Penicillin und Streptomycin und 250 Einheiten Nystatin enthielt. In dieser Lösung wurden die Larven eine Stunde lang bei Zimmertemperatur belassen. Hiernach wurden sie erneut mit sterilem Wasser gewaschen und in Flaschen überführt, weiche das Kulturmedium enthielten, dass aus Earls-Lösung bestand, die Leberhydrolyse-Produkte enthielt.
Die Kulturflaschen wurden hiernach bei 370 C auf einem Walzenroller inkubiert, bis mindestens 60 O/o der Larven sich in ihr viertes Stadium weiterentwickelt hatten. Das Kuiturmedimn und die Larven wurden dann in geeignete Volumina unterteilt und in Behältern einer Gefriertrocknung unterzogen. Zum Gebrauch wurden die getrockneten Antigene pulverisiert, in sterilem Wasser suspendiert und die notwendige Menge der Enthäutungslösung zugegeben.
Beispiel 5
Herstellung eines Impfstoffes gegen Trichostrongylus axel.
Eine gereinigte Suspension von infektiven Drittstadiums-Larven vom Trichostrongylus axei in Wasser wurde aus inkubierten Faeces von Schafen hergestellt, welch letztere zuvor mit dem Parasiten infiziert worden waren. Die Suspension wurde absitzen gelassen, die überstehende Flüssigkeit abgenommen und ersetzt durch eine Lösung, welche 0,075 O/o Natriumhypochlo rit und 1,5 O/o Natriumchlorid enthielt. Die Suspension wurde bei Zimmertemperatur belassen bis Testzählungen ergaben, dass mehr als 90 O/o der Larven sich ge häutet hatten.
In diesem Stadium wurde die Suspension zentirifu- giert, die überstehende Lösung abgenommen und gegen destilliertes Wasser dialysiert, in geeignete Volumina unterteilt und ausgefroren. Die gehäuteten Larven wurden mit sterilem Wasser gewaschen, zentrifugiert und in eine Lösung eingebracht, welche pro ml 1000 Einheiten Penicillin und Streptomycin sowie 250 Einheiten Nystatin enthielt. In dieser Lösung wurden sie eine Stunde lang bei Zimmertemperatur belassen. Die Larven wurden hierauf erneut mit sterilem Wasser gewaschen und in Flaschen übergeführt, welche das Kulturmedium enthielt, das seinerseits aus der Gewebe-Kultur-Lösung Nr. 199 bestand.
Die Kulturflaschen wurden hierauf bei 370 C auf einer Schaukelmaschine inkubiert, bis mindestens 60 /o der Larven sich in ihr viertes Stadium weiterentwickelt hatten. Das Kulturmedium und die Larven wurden hierauf in geeignete Volumina unterteilt und in Behältern einer Gefriertrocknung unterzogen. Zum Gebrauch wurde das getrocknete Antigen pulverisiert, in sterilem Wasser suspendiert und die erforderliche Menge der Häutungslösung zugegeben.
Beispiel 6
Herstellung eines Impfstoffs gegen Strongyloides p apillosus.
Eine gereinigte Suspension infektiver Drittstadiums-Larven von Strongyloides papillosus in Wasser wurde hergestellt aus inkubierten Faeces von Schafen, welche zuvor mit dem Parasiten infiziert worden waren. Die Suspension wurde absitzen gelassen, die überstehende Flüssigkeit abgenommen und die Larven in eine Lösung eingebracht, welche Penicillin und Streptomycin in 1000 Einheiten pro ml und Nystatin in 250 Einheiten pro ml enthielt. In dieser Lösung wurden die Larven eine Stunde lang bei Zimmertemperatur belassen. Die Suspension wurde hierauf zentrifugiert, die Larven mit sterilem Wasser gewaschen und in Flaschen übergeführt, welche das Kulturmedium enthielten, das seinerseits aus Tyrode-Lösung bestand, die modifiziert war insofern als Glykose daraus weggelassen war, jedoch Produkte der Leberhydrolyse enthielt.
Die Flaschen wurden bei 37 C auf einer Schaukelmaschine inkubiert, bis mindestens 60 O/o der Larven in ihr viertes Stadium sich weiterentwickelt hatten. Das Kulturmedium und die Larven wurden hierauf in geeignete Volumina unterteilt und in Behältern einer Gefriertrocknung unterworfen. Zum Gebrauch wurden die getrockneten Antigene pulverisiert und in sterilem Wasser suspendiert.
Beispiel 7
Herstellung eines Impfstoffs gegen Ostertagia circumcincta.
Eine gereinigte Suspension infektiver Drittstadium Larven von Ostertagia circumcinta in Wasser wurde hergestellt aus inkubierten Faeces von Schafen, welche zuvor mit dem Parasiten infiziert worden waren. Die Suspension wurde absitzen gelassen, die überstehende Flüssigkeit abgenommen und ersetzt durch eine Lösung, welche 0,075 /o Natriumhypochlorit und 1,5 O/o Natriumchlorid enthielt. Die Suspension wurde bei Zimmertemperatur belasisen, bis Testzählungen ergaben, dass mehr als 90 O/o der Larven sich gehäutet hatten.
In diesem Stadium wurde die Suspension zentrifugiert, die überstehende Lösung abgenommen und dialysiert gegen destilliertes Wasser, in geeignete Volumina unterteilt und ausgefroren. Die gehäuteten Larven wu den mit sterilem Wasser gewaschen, zentrifugiert und in eine Lösung eingebracht, welche pro ml 1000 Einheiten Penicillin und Streptomycin und 250 Einheiten Nystatin enthielt. In dieser Lösung wurden die Larven eine Stunde lang bei Zimmertemperatur belassen. Hiernach wurden sie erneut mit sterilem Wasser gewaschen und in Flaschen übergeführt, welche das Kulturme- dium enthielten, das seinerseits aus Earls-Lösung mit Produkten der Hydrolyse von Leber bestand.
Die Kulturflaschen wurden auf einem Walzenroller bei 37 C inkubiert, bis mindestens 60 o/o der Larven sich in ihr viertes Stadium weiterentwickelt hatten. Das Kulturmedium und die Larven wurden hiernach in geeignete Volumina unterteilt und einer Gefriertrocknung unterzogen. Zum Gebrauch wurde das getrocknete Antigen-Material in Wasser suspendiert und die erforderliche Menge der Häutungslösung zugegeben.
Beispiel 8
Herstellung eines Impfstoffs gegen Trichostrongylus colubriformis.
Eine gereinigte Suspension infektiver Drittstadi ums-Larven von Trichostrongylus colubriformis im Wasser wurde hergestellt aus inkubierten Faeces von Schafen, welche zuvor mit dem Parasiten infiziert worden waren. Die Suspension wurde absitzen gelassen, die überstehende Lösung abgenommen und ersetzt durch eine Löung, welche 0,075 O/o Natriumhypochlorit und 1, 5 fo Natriumchlorid enthielt. Die Suspension wurde bei Zimmertemperatur belassen bis Testzählungen ergaben, dass mehr als 90 O/o der Larven sich ge häutet hatten.
In diesem Stadium wurde die Suspension zentrifugiert, die überstehende Lösung abgenommen, dialysiert gegen destilliertes Wasser, unterteilt in geeignete Volumina und ausgefroren. Die gehäuteten Larven wurden mit sterilem Wasser gewaschen, zentrifugiert und in eine Lösung eingebracht, welche pro ml 1000 Einheiten Penicillin und Streptomycin sowie 250 Einheiten Nystatin enthielt. In dieser Lösung wurden sie eine Stunde lang bei Zimmertemperatur belassen. Hiernach wurden die Larven erneut mit sterilem Wasser gewaschen und in Flaschen übergeführt, welche das Kulturmedium enthielten. Dieses bestand aus Hank's-Lösung mit Produkten der Leberhydrolyse.
Die Kulturflaschen wurden bei 370 C auf einer Schaukelmaschine inkubiert bis mindestens 600/0 der Larven sich in ihr viertes Stadium weiterentwickelt hatten. Die Kulturlösung und die Larven wurden hiernach in geeignete Volumina unterteilt und einer Gefriertrocknung unterzogen.
Zum Gebrauch wurde das getrocknete Antigenmaterial pulverisiert, in sterilem Wasser suspendiert und die erforderliche Menge der Häutungslösung zugegeben.
Kälber, welche auf natürlichem Wege infiziert worden waren mit Dictyocaulus viviparus oder Ostertagia ostertagi, Schafe, welche auf natürlichem Wege infiziert worden waren mit Haemonchus contortus, Strongyloides papillosus, Trichostrongylus colubriformis oder Trichostrongylus axei und Pferde, welche auf natürlichem Wege infiziert worden waren mit Strongylus vulgaris, wurden einem Empfindlichkeitstest unterworfen, vermittels intradermaler Injektion der geeigneten Vaccine. In allen Fällen ergab sich an den infizierten Tieren eine typische Reaktion, während an den nicht infizierten Vergleichtieren eine solche Reaktion nicht auftrat. Diese Experimente bewiesen, dass die in den verschiedenen Impfstoffen enthaltenen Antigene homolog zu denjenigen waren, welche durch die verschiedenen Infektionen erzeugt worden waren.
Der gemäss dem Beispiel 1 hergestellte Impfstoff wurde folgendermassen geprüft:
A. Eine Gruppe von Meerschweinchen wurde intraperitoneal injiziert mit dem Impfstoff in Intervallen von 21 Tagen zwischen den Injektionen. Jede dieser Injektion entsprach einem Äquivalent von 3000 bis 5000 Dictyocaulus viviparus-Larven. 10 Tage nach der zweiten Injektion wurde den geimpften Meerschweinchen und einer gleich grossen Gruppe ungeimpfter Meerschweinchen per os eine Dosis von 5000 normalen infektiven Larven verabreicht. 9 Tage nach dieser Verabfolgung wurden alle Tiere getötet und ihre Lunge untersucht. Die geimpften Meerschweinchen zeigten einen Schutz von 90 O/o im Vergleich zu der Kontrollgruppe.
B. 5 Kälbern wurden vier intradermale Injektionen des Impfstoffes in Intervallen von einer Woche verabreicht. Jede Injektion entsprach einem äquivalent von ungefähr 5000 Dictyocaulus viviparus-Larven. Drei Wochen nach der letzten Injektion wurde den Kälbern sowie einer Gruppe von 5 unbehandelten Vergleichstieren 4000 normale infektive Larven eingegeben. Klinische Beobachtungen, einschliessend Art und Ausmass der Respiration sowie die Kontrolle der Faeces wurde täglich aufgeführt. 30 Tage nach der Verabfolgung der infektiven Larven wurden alle Tiere getötet und die Lungen auf pathologische Veränderungen untersucht.
Die Respirations-Raten der Vergleichstiere waren nach der Verabfolgung der infektiven Larven mehr als verdoppelt und die Tiere zeigten klinische Symptome einer typischen parasitären Bronchitis, verursacht durch Dictyocaulus viviparus. Bei der Sektion ergaben sich grosse stillgelegte und verhärtete Bezirke in den Lungen.
Im Gegensatz dazu zeigten die geimpften Tiere lediglich eine geringe Erhöhung der Respirations Rate, während die Sektion der Lunge beträchtlich geringere Schädigung zu Tage förderte als dies bei den Kontrolltieren beobachtet worden war.
Der gemäss Beispiel 2 hergestellte Impfstoff wurde an Lämmern geprüft. Je 5 Lämmern wurden subcutane Injektionen des Impfstoffes mit einem Intervall von 21 Tagen zwischen den einzelnen Injektionen verabfolgt.
Jede Injektion entsprach einem Äquivalent von ungefähr 5000 Haemonchus contortus Larven. 10 Tage nach der 2. Injektion wurden die Lämmer zusammen mit 5 unbehandelten Vergleichstieren einer Infektion von 5000 Larven ausgesetzt. Nach diesem Befall wurden die Blutwerte der Tiere wöchentlich 4 Wochen lang untersucht. Nach Verlauf dieser Periode wurden alle Tiere getötet und die im Abomasum jedes der Tiere enthaltenen Würmer ausgezählt. Die Vergleichstiere litten an schwerer Anämie. Die Zahl der roten Blutkörperchen, das Volumen des Blutkuchens und der Hämoglobinspiegei waren auf die Hälfte der Originalwerte abgesunken, während die geimpften Tiere viel geringere Reduktionen dieser Werte aufwiesen.
Die mittlere Zahl der Würmer, welche in den Vergleichstieren gefunden wurde, war dlreimal so gross, als diejenige in den geimpften Tieren.
Der gemäss Beispiel 4 hergestellte Impfstoff wurde an Füllen in folgender Weise geprüft:
8 Füllen wurden je zweimal subcutan injiziert mit dem Impfstoff in einem Intervall von 21 Tagen und einer weiteren intradermalen Injektion 3 Monate später. Jede Injektion entsprach einem Äquivalent von ungefähr 9000 Larven Strongylus vulgaris. Die geimpften Tiere und 6 unbehandelte Vergleichsfüllen wurden auf einer Pferdekoppel grasen gelassen, welche mit Strongylus vulgaris infiziert worden war. 5 Monate nach der letzten Injektion wurde eines der geimpften und eines der ungeimpften Kontrolltiere getötet und seziert.
Strongylus vulgaris dringt in das Arteriensystem der Pferde ein, wo es Arteritis verursacht, weswegen seine Wirkung auf das Tier am besten durch eine Prüfung der Arterienerkrankungen beurteilt wird.
Bei den im Versuch getöteten Tieren ergab sich, dass beim Kontrolltier ein echter Aorta-Aneurismus vorlag, während im geimpften Tier diese Schädigung nicht gefunden werden konnte.
Der gemäss Beispiel 6 hergestellte Impfstoff wurde folgendermassen geprüft:
5 Kaninchen wurden je zwei intra-peritoneale Injektionen des Impfstoffes in einem Intervall von 21 Tagen zwischen den Injektionen verabreicht. Jede die ser Injektion entsprach einem Äquivalent von ungefähr 3000 Larven von Strongyloides papillosus. 4 Monate nach der 2. Injektion wurden die Kaninchen und eine ähnliche Anzahl unbehandelter Kontrolltiere infiziert durch Verabreichung von 1500 infektiven Filariform Larven auf die Haut. 10 Tage nach diesem Befall wurden alle Kaninchen getötet und ihre kleinen Eingeweise auf Gegenwart von Parasiten untersucht.
Bei den Vergleichsgruppen hatten sich 112411 Parasiten angesiedelt, während bei der Gruppe der geimpften Tiere das Total lediglich 5528 betrug. Der durch die Impfung erzielte Schutzgrad wird in diesem Experiment zu 95 O/o gefunden.
Der gemäss Beispiel 8 hergestellte Impfstoff wurde folgendermassen geprüft:
8 Meerschweinchen wurden je 2 intraperitoneale Injektionen des Impfstoffs in einem Intervall von 21 Tagen zwischen den Injektionen verabfolgt. Die Dosis des verabreichten Impfstoffs lag zwischen Siquivalent- werten von ungefähr 250 bis 2000 Trichostrongylus colubriformis Larven. 10 Tage nach der 2. Injektion wurden die Testtiere, sowie eine unbehandelte Kon trollgruppe von Meerschweinchen mit 5000 infektiven Larven befallen. 8 Tage nach dem Befall wurden die Tiere getötet. Die Sektion ergab im Mittel bei den Vergleichstieren 2035 Würmer, während der Mittelwert in den geimpften Tieren lediglich 179 betrug. Der durch die Impfung bewirkte Schutzgrad betrug in diesem Experiment über 90 0/0.