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Verfahren zur Herstellung einer Vaccine
Die Erfindung betrifft Vaccine gegen Erkrankungen, welche durch Nematoden verursacht werden, die für Wirbeltiere pathogen sind.
Es wurden bereits in beträchtlichem Umfang Arbeiten über eine Helminthes-Immunität in der Literatur zumindest der letzten drei Dekaden veröffentlicht.
Diese Arbeit umfasst Untersuchungen über natürlich erworbene Immunität (das ist jene Immunität, welche einer natürlich erworbenen Infektion folgt), Selbstheilung und künstliche Immunität. Ein Grossteil der Arbeit konzentrierte sich um Haemonchus contortus, Trichinella spirals und Nippostrongylus muris (ein Parasit von geringerer wirtschaftlicher Bedeutung). Das zur Erzielung der künstlichen Immunität verwendete injizierte Material bestand weitaus zur Gänze aus Zubereitungen ausgewachsener Würmer oder fraktionierten Extrakten derselben. Infektiöse Larven des dritten Stadiums, deren Exkrete und Sekrete sowie Oesophagusextrakte von Larven des dritten Stadiums wurden untersucht ; keine dieser Untersuchungen ergab eine zufriedenstellende Vaccine.
Es wird angenommen, dass die einzige kommerziell hergestellte Vaccine gegen pathogene Nematoden, jene gegen Dictyocaulus viviparus ist, welche nach der Methode hergestellt wird, wie sie von For- schern an der Universität Glasgow durch Bestrahlen von Larven mit einer ionisierenden Strahlung entwickelt wurde.
Die vorliegende Erfindung schafft eine Vaccine, welche Antigene enthält, die die Produktion von Antikörpern im Wirt stimulieren und welche bei Verabreichung durch Injektion einen Schutz gegen Erkrankungen durch für Wirbeltiere pathogene Nematoden bewirkt.
Die Herstellung dieser Vaccine wurde ermöglicht durch die Entwicklung eines zufriedenstellenden Verfahrens für eine in vitro-Kultur der Parasiten während ihrer Antigen-erzeugenden Stadien.
Die Arbeit, deren Ergebnis die vorliegende Erfindung bildet, zeigt, dass es zumindest zweierlei Antigene gibt, die an einer Erzeugung von Immunität in den vorliegenden Fällen beteiligt sind, nämlich :
1. Antigene, welche während der Entwicklung der histotrophen Stadien der Larven erzeugt werden, d. h. Exkrete, Sekrete und metabolische Produkte.
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Vorzugsweise soll indessen die Vaccine auch jene Antigene umfassen, welche entweder während der Häutung (Entkapselung) von Larven des dritten Stadiums oder während jenes Stadiums des Lebenszyklus das dem Durchdringen des Wirtgewebes durch Larven des dritten Stadiums entspricht, erzeugt werden.
Die Antigenwirkung dieser Bestandteile wurde mittels Hautreaktionstests abgeschätzt, welche auf der Erscheinung basieren, dass ein immunes oder infiziertes Tier auf ein intradermal injiziertes Antigen eine erythematöse Reaktion und/oder ein lokalisiertes Ödem zeigt. Diese Art von Reaktion ist messbar und spezifisch. Wie aus den Folgenden ersichtlich, wurde in gewissen Fällen diese Antigenwirkung durch Immunitätsstudien an empfänglichen Laboratoriums- oder andern Tieren bestätigt.
Im Falle der vollständig untersuchten Parasiten steht fest, dass eine Zubereitung, enthaltend die Stoffwechselprodukte der Parasithäutung und somatische Antigene der histotrophen Formen des Parasiten, ein Mass an Immunität im natürlichen Wirt bewirkt.
Demgemäss betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Vaccine, welche, wenn sie injiziert wird, die Abwehr gegen Erkrankungen durch für Wirbeltiere pathogene Nematoden stimuliert und dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Entwicklung von infektiösen Nematodenlarven zu den
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histotrophen Stadien durch Ausbrüten in einem sterilen wässerigen Kulturmedium verursacht wird und die- ses die Larven enthaltende Medium als Vaccine verwendet oder indem man das genannte Kulturmedium und die darin enthaltenen Larven trocknet und das getrocknete Material in einem sterilen wässerigen Trä- ger zur Herstellung einer Vaccine suspendiert.
Vorzugsweise erfolgt ein Zusatz der Sekrete, welche während der Häutung von Larven des dritten Sta- diums oder dem dem Durchdringen desWirtgewebes durch Larven des dritten Stadiums entsprechenden Sta- dium des Lebenszyklus erzeugt werden, entweder vor oder nach dem Trocknen des Kulturmediums, in wel- chem die histotrophen Larvenstadien erzeugt werden oder aber zur fertigen Vaccine.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung wie folgt ausgeführt :
Infektiöse Larven des dritten Stadiums werden aus den Faeces infizierter Tiere gesammelt, wobei die
Faeces unter geeigneten Bedingungen zur Entwicklung von Larven des dritten Stadiums ausgebrütet wurden.
Die gereinigten Larven werden dann in ein Medium eingetaucht, um die Häutung (Entkapselung) herbei- zuführen. Wenn die Häutung stattgefunden hat, werden die Larven von der Lösung abgetrennt und letzte- re aufbewahrt. Die Larven werden dann in einem geringen Volumen einer wässerigen Lösung eines geeig- neten antimikrobiellen Agens oder einer Mischung derartiger Stoffe suspendiert, um die Möglichkeit einer bakteriellen oder anderweitigen Ansteckung zu vermindern. Die bekannten Antibiotika sind für diesen
Zweck geeignet, z. B. Penicillin und Streptomycin. Die Larven werden dann abgetrennt und in eine ste- rile gepufferte Salzlösung eingebracht, welche Nährstoffe enthält, um ihre Entwicklung zu den histotro- phen Stadien zu gestatten.
Das Ausbrüten wird bei ungefähr 370C durchgeführt, wenn notwendig unter
Sauerstoffzufuhr und Rühren, bis Testproben den geeigneten Grad der Larvenentwicklung anzeigen. Das
Kulturmedium mit den darin enthaltenen Larven wird dann gefroren und mittels Gefriertrocknung getrock- net. Die aufbewahrte Lösung des Häutungsprozesses kann, nachdem sie zunächst einer Behandlung zur Ent- fernung irgendwelcher unerwünschter anorganischer Ionen unterzogen wurde, vor dem Trocknen hinzuge- fügt werden. Das so erhaltene getrocknete Antigenmaterial wird vor der Injizierung in einem sterilen wässerigen Träger suspendiert. Geeignete bekannte Adjuvantien, wie Aluminiumhydroxyd, können mit dem Antigenmaterial Verwendung finden.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern, ohne dass diese jedoch hier- auf beschränkt werden soll.
Beispiel l : Herstellung einer Vaccine gegen Dictyocaulus viviparus. Aus den Faeces von vorher mit dem Parasiten infizierten Kälbern wurde eine reine wässerige Suspension von Larven des infektiösen dritten Stadiums von Dictyocaulus viviparus hergestellt. Die Suspension wurde während 12 Tagen bei 15 C gelagert, dann während 2 min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit durch eine gastrische Pepsinlösung ersetzt. Die Suspension wurde bei 370C ausgebrütet bis Kontrollzählungen anzeigten, dass mehr als 90% der Larven die Häutung vollzogen hatten. In diesem Stadium wurde die Suspension abermals zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit entfernt, mit Natriumkarbonatlösung neutralisiert, in 2 ml Volumina aufgeteilt und gefroren.
Die gehäuteten Larven wurden dann in eine Lösung, welche 1000 E/ml Penicillin und Streptomycin und 250 E/ml Nystatin enthielt, eingebracht und während 1 h darin belassen. Dann wurden die Larven mit sterilem Wasser gewaschen und in Flaschen übergeführt, welche ein aus Tyrode'scher Lösung mit einem Zusatz von Leberextrakt bestehendes Kulturmedium enthielten. Anschliessend folgte ein Ausbrüten bei 37 C, bis nicht weniger als 60% der Larven sich zum vierten Stadium entwickelt hatten. Das Kulturmedium und die Larven wurden dann in den geforderten Volumina in geeig- neteBehälter übergefUhrt und der Gefriertrocknung unterworfen. Zum Gebrauch wurden die gefriergetrockneten Antigene pulverisiert und in sterilem Wasser suspendiert und das erforderliche Volumen des Häutungsmediums hinzugefügt.
Beispiel 2 : Herstellung einer Vaccine gegen Haemonchus contortus. Aus den ausgebrüteten Faeces von vorher mit dem Parasiten infizierten Schafen wurde eine reine wässerige Suspension von Larven des infektiösen dritten Stadiums von Haemonchus contortus hergestellt. Diese Suspension wurde während 2 min zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit entfernt und durch eine Lösung, enthaltend 0, OS" Natriumhypochlorit und 0, 5% Natriumchlorid, ersetzt. Die Suspension wurde bei 370C ausgebrütet, bis kontrollzählungen anzeigten, dass mehr als 90% der Larven die Häutung vollzogen hatten. In diesem Stadium wurde die Suspension abermals zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit entfernt und gegen destilliertes Wasser dialysiert, dann in Volumina zu 2 ml aufgeteilt und gefroren.
Die gehäuteten Larven wurden dann in eine Lösung, enthaltend 1000 E/ml Penicillin und Streptomycin sowie 250 E/ml Nystatin, eingebracht und während 1 h bei Raumtemperatur darin belassen. Dann wurden die Larven mit sterilem Wasser gewaschen und in Flaschen gegeben, welche das Kulturmedium enthielten, welches aus einer Earle'schen Lösung mit Hydrolyseprodukten von Leber und Kasein bestand.
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Anschliessend folgte ein Ausbrüten bei 37 C, bis nicht weniger als 60% der Larven sich zum vierten
Stadium entwickelt hatten. Das Kulturmedium und die Larven wurden dann in den geforderten Volumina in geeignete Behälter übergeführt und der Gefriertrocknung unterworfen. Zum Gebrauch wurden die ge- friergetrockneten Antigene pulverisiert und in sterilem Wasser suspendiert und das erforderliche Volumen des Häutungsmediums hinzugefügt.
Beispiel 3 : Herstellung einer Vaccine gegen Ostertagia ostertagi. Aus den bebrüteten Faeces von vorher mit dem Parasiten infizierten Schafen wurde eine reine wässerige Suspension von Larven des infek- tiösen dritten Stadiums von Ostertagia ostertagi hergestellt. Diese Suspension wurde absitzen gelassen, die überstehende Flüssigkeit entfernt und durch eine Lösung, enthaltend 0, 075% Natriumhypochlorit und 1, 50/0
Natriumchlorid, ersetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur stehen gelassen, bis Kontrollzählungen anzeigten, dass mehr als 90% der Larven die Häutung vollzogen hatten. In diesem Stadium wurde die Suspension zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit entfernt, gegen destilliertes Wasser dialysiert, in geeignete Volumina geteilt und gefroren.
Die gehäuteten Larven wurden mit sterilem Wasser gewaschen, zentrifugiert und in eine Lösung, enthaltend 1000 E/ml Penicillin und Streptomycin sowie 250 E/ml Nystatin, gegeben und während 1 h bei Raumtemperatur darin belassen. Die Larven wurden dann abermals mit sterilem Wasser gewaschen und in Flaschen übergeführt, welche das Kulturmedium, bestehend aus Earle'scher Lösung mit Hydrolyseprodukten der Leber, enthielten. Die Kulturflaschen wurden dann auf einer Schüttelmaschine bei 370C bebrütet, bis nicht weniger als 60% der Larven sich zum vierten Stadium entwickelt hatten. Das Kulturmedium und die Larven wurden dann in den geforderten Volumina in Behälter eingebracht und gefroren. Zum Gebrauch wurden die gefriergetrockneten Antigene pulverisiert, in sterilem Wasser suspendiert und das erforderliche Volumen der Häutungsflüssigkeit hinzugefügt.
Beispiel 4 : Herstellung einer Vaccine gegen Strongylus vulgaris. Aus den bebrüteten Faeces von vorher mit dem Parasiten infizierten Pferden wurde eine reine Suspension von Larven des infektiösen dritten Stadiums von Strongylus vulgaris hergestellt. Diese Suspension wurde absitzen gelassen, die überstehende Flüssigkeit entfernt und durch eine Lösung von 0, 075%igem Natriumhypochlorit und l, 5% gem Natriumchlorid ersetzt. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur stehen gelassen, bis Kontrollzählungen anzeigten, dass mehr als 90% der Larven die Häutung vollzogen hatten.
In diesem Stadium wurde die Suspension zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit entfernt und gegen destilliertes Wasser dialysiert, dann in handliche Volumina geteilt und gefroren. Die gehäuteten Larven wurden mit sterilem Wasser gewaschen, zentrifugiert und in- eine Lösung, enthaltend 1000 E/ml Pa- nicillin und Streptomycin sowie 250 E/ml Nystatin, gegeben und während 1 h bei Raumtemperatur darin belassen. Die Larven wurden dann abermals mit sterilem Wasser gewaschen und in Flaschen übergeführt, welche das Kulturmedium, bestehend aus Earle'scher Lösung mit Hydrolyseprodukten der Leber, enthielten.
Die Kulturflaschen wurden dann auf einer Maschine mit einer rotierenden Trommel (roller tube machine) bei 370C bebrütet, bis nicht weniger als 60ego der Larven sich zum vierten Stadium entwickelt hatten. Das Kulturmedium und die Larven wurden dann in den geforderten Volumina in Behälter übergeführt
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Beispiel 5: Herstellung einer Vaccine gegen Trichostrongylus axei. Aus den bebrüteten Faeces von vorher mit dem Parasiten infizierten Schafen wurde eine reine wässerige Suspension von Larven des infektiösen dritten Stadiums von Trichostrongylus axei hergestellt. Diese Suspension wurde absitzen gelassen, die überstehende Flüssigkeit entfernt und durch eine Lösung von 0, 075%igem Natriurnhypochlorit
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In diesem Stadium wurde die Suspension zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit entfernt, gegen destilliertes Wasser dialysiert, dann in handliche Volumina geteilt und gefroren. Die gehäuteten Larven wurden mit sterilem Wasser gewaschen, zentrifugiert und in eine Lösung, enthaltend 1000 E/ml Penicillin und Streptomycin und 250 E/ml Nystatin, gegeben und während 1 h bei Raumtemperatur darin belassen. Die Larven wurden dann abermals mit sterilem Wasser gewaschen und in Flaschen übergeführt, welche das' Kulturmedium enthielten, welches aus Gewebskulturlösung Nr. 199 bestand.
Die Kulturflaschen wurden dann in einer Schüttelmaschine bei 370C bebrütet, bis nicht weniger als 60% der Larven sich zu Larven des vierten Stadiums entwickelt hatten. Das Kulturmedium und die Larven wurden dann in den erforderlichen Volumina in Behälter übergeführt und der Gefriertrocknung unterworfen. Zum Gebrauch wurden die gefriergetrockneten Antigene pulverisiert, in sterilem Wasser suspendiert und das erforderliche Volumen an Häutungsflüssigkeit hinzugefügt.
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Beispiel 6 : Herstellung einer Vaccine gegen Strongyloides papillosus. Aus den bebrüteten Faeces von vorher mit dem Parasiten infizierten Schafen wurde eine reine wässerige Suspension von Larven des infektiösen dritten Stadiums von Strongyloides papillosus hergestellt. Die Suspension wurde absitzen ge- lassen, die überstehende Flüssigkeit entfernt und die Larven in eine Lösung, enthaltend 1000 E/ml Peni- cillin und Streptomycin und 250 E/ml Nystatin. eingebracht und während 1 h bei Raumtemperatur darin belassen. Die Suspension wurde dann zentrifugiert, die Larven mit sterilem Wasser gewaschen und in Fla- schen übergeführt, welche das Kulturmedium, bestehend aus Tyrode'scher Lösung, modifiziert durch Weg- lassung der Glukose und aus Hydrolyseprodukten der Leber enthielten.
Die Flaschen wurden dann auf einer Schüttelmaschine bei 370C bebrütet, bis nicht weniger als 60% der Larven sich zum vierten Stadium entwickelt hatten. Das Kulturmedium und die Larven wurden dann in den erforderlichen Volumina in Behälter übergeführt und der Gefriertrocknung unterworfen. Zum Ge- brauch wurden die gefriergetrockneten Antigene pulverisiert und in sterilem Wasser suspendiert.
Beispiel 7 : Herstellung einer Vaccine gegen Ostertagia circumcincta. Aus den bebrüteten Faeces von vorher mit dem Parasiten infizierten Schafen wurde eine reine wässerige Suspension von Larven des infektiösen dritten Stadiums von Ostertagia circumcincta hergestellt. Die Suspension wurde absitzen gelassen, die überstehende Flüssigkeit entfernt und gegen eine Lösung, enthaltend 0, 075% Natriumhypo- chlorit und 1, 5% Natriumchlorid, ersetzt. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur stehen gelassen, bis
Kontrollzählungen anzeigten, dass mehr als 90% der Larven die Häutung vollzogen hatten.
In diesem Stadium wurde die Suspension zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit entfernt und gegen destilliertes Wasser dialysiert, dann in handliche Volumina aufgeteilt und gefroren. Die gehäuteten
Larven wurden mit sterilem Wasser gewaschen, zentrifugiert und in eine Lösung gebracht, welche
1000 E/ml Penicillin und Streptomycin und 250 E/ml Nystatin enthielt, und darin 1 h bei Raumtemperatur belassen. Die Larven wurden dann abermals mit sterilem Wasser gewaschen und in Flaschen, welche das Kulturmedium, bestehend aus Earl'scher Lösung mit Hydrolyseprodukten der Leber, enthielt, übergeführt.
Die Kulturflaschen wurden dann in einer Maschine mit einer rotierenden Trommel bei 370C bebrütet, bis nicht weniger als 60% der Larven sich zum vierten Stadium entwickelt hatten. Das Kulturmedium und die Larven wurden dann in den geforderten Volumina in Gefässe übergeführt und der Gefriertrocknung unterworfen. Zum Gebrauch wurden die gefriergetrockneten Antigene unter Zugabe von sterilem Wasser suspendiert und die erforderliche Menge an Häutungsflüssigkeit hinzugefügt.
Beispiel 8 : Herstellung einer Vaccine gegen Trichostrongylus colubriformis. Aus den bebrüteten Faeces von vorher mit dem Parasiten infizierten Schafen wurde eine reine wässerige Suspension des infektiösen dritten Stadiums von Trichostrongylus colubriformis hergestellt. Diese Suspension wurde absitzen gelassen, die überstehende Flüssigkeit entfernt und durch eine Lösung, enthaltend 0, 075% Natriumhypochlorit und 1, 5% Natriumchlorid, ersetzt. Die Suspension wurde dann bei Raumtemperatur belassen, bis Kontrollzählungen anzeigten, dass mehr als 90% der Larven die Häutung vollzogen hatten.
In diesem Stadium wurde die Suspension zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit entfernt, gegen destilliertes Wasser dialysiert, in handliche Volumina geteilt und gefroren. Die gehäuteten Larven wurden mit sterilem Wasser gewaschen, zentrifugiert und in eine Lösung gegeben, welche 1000 E/ml Penicillin und Streptomycin und 250 E/ml Nystatin enthielt und darin während 1 h bei Raumtemperatur belassen.
Die Larven wurden dann abermals mit sterilem Wasser gewaschen und in Flaschen übergeführt, welche das Kulturmedium, bestehend aus Hank'scher Lösung und Hydrolyseprodukten der Leber, enthielten.
Die Kulturflaschen wurden dann auf einer Schüttelmaschine bei 370C bebrütet, bis nicht weniger als 60% der Larven sich zum vierten Stadium entwickelt hatten. Das Kulturmedium und die Larven wurden dann in den erforderlichen Volumina in geeignete Gefässe übergeführt und der Gefriertrocknung unterworfen.
. Zum Gebrauch wurden die gefriergetrockneten Antigene pulverisiert, in sterilem, destilliertem Wasser suspendiert und die erforderliche Menge an Häutungsflüssigkeit hinzugefügt.
Kälber, welche auf natürliche Weise mit Dictyocaulus viviparus oder Ostertagia ostertagi infiziert worden waren, Schafe, welche auf natürliche Weise mit Haemonchus contortus, Strongyloides papillosus, Trichostrongylus colubntormis oder Trichostrongylus axei und Pferde, welche aut natürliche Weise mit Strongylus vulgaris infiziert worden waren, wurden kontrollierten Empfindlichkeitstests durch intradermale Injektion der geeigneten Vaccine unterworfen. In allen Fällen erfolgte bei den infizierten Tieren eine typische entzündliche Pustelreaktion (flare and wheal reaction), wogegen eine solche Reaktion bei den nicht infizierten Kontrolltieren ausblieb. Diese Experimente zeigten, dass die in den verschiedenen Vaccinen enthaltenen Antigene homolog mit den bei den verschiedenen Infektionen erzeugten waren.
Die gemäss Beispiel 1 hergestellte Vaccine wurde wie folgt geprüft :
A) Einer Gruppe von Meerschweinchen wurden zwei intraperitoneale Injektionen der Vaccine bei
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einem Intervall von 21 Tagen zwischen den Injektionen verabreicht. Jede Injektion entsprach 3 000-5 000 Dictyocaulus viviparus Larven. 10 Tage nach der zweiten Injektion wurden die geimpften Meerschwein- chen und eine gleiche Gruppe unbehandelter Schweinchen mit 5 000 normalen infektiösen Larven per os infiziert (challenged). 9 Tage nach dieser Kontrollinfektion wurden alle Tiere getötet und ihre Lungen untersucht. Die geimpften Meerschweinchen erwiesen sich, verglichen mit der Kontrollgruppe, als zu 90plu immun.
B) An 5 Kälber wurde in Intervallen von 1 Woche je vier intradermale Injektionen der Vaccine ver- abreicht. Jede Injektion entsprach ungefähr 5000 Dictyocaulus viviparus Larven. 3 Wochen nach der letzten Injektion wurden diese Kälber sowie 5 unbehandelte Kontrollkälber mit 4000 normalen infektiösen Larven infiziert. Die klinischen Beobachtungen einschliesslich der Untersuchung von Art und Geschwindigkeit der Atmung wurden täglich ausgeführt. 30 Tage nach der Kontrollinfektion wurden alle Tiere getötet und die Lungen hinsichtlich ihrer pathologischen Schäden untersucht.
Die Atmungsgeschwindigkeit der Kontrolltiere verdoppelte sich nach der Kontrollinfektion, und sie zeigten die klinischen Symptome einer durch Dictyocaulus viviparus verursachten parasitären Bronchitis.
Nach dem Tod zeigten ihre Lungen weite Bereiche von Kollaps und Verhärtung.
Im Gegensatz hiezu zeigten die geimpften Tiere nur eine geringfügige Steigerung der Atmung, und der nach dem Tod festgestellte Lungenschaden war beträchtlich geringer als jener, wie er bei den Kontrolltieren beobachtet wurde.
Die gemäss Beispiel 2 hergestellte Vaccine wurde bei Lämmern geprüft. 5 Lämmer wurden mit einem Intervall von 21 Tagen zwischen den Injektionen subkutane Injektionen der Vaccine verabreicht. Jede Injektion war äquivalent ungefähr 5000 Haemonchus contortus Larven. 10 Tage nach der zweiten Injektion wurden die Lämmer zusammen mit 5 unbehandelten Kontrollämmern mit je 5 000 infektiösen Larven infiziert. Die Messungen der Blutwerte erfolgten wöchentlich während eines Zeitraumes von 4 Wochen nach der Infektion. Am Ende dieser Periode wurden alle Tiere getötet und die im Labmagen (abomasum) jedes Tieres enthaltenen Würmer gezählt.
Die Kontrolltiere litten an schwerer Anämie, wobei die Zahl der rotenBlutkörperchen, das Blutkörperchenvolumen (packed cell volume) und der Haemoglobinspiegel auf ungefähr die Hälfte der Originalwerte vermindert waren, wogegen die geimpften Tiere eine wesentlich kleinere Verminderung dieser Werte zeigten. Die in den Kontrolltieren vorgefundene Zahl an Würmern war dreimal so hoch wie bei den geimpften Tieren.
Die gemäss Beispiel 4 hergestellte Vaccine wurde bei Fohlen wie folgt getestet :
An 8 Fohlen wurden zwei subkutane Injektionen der Vaccine in einem Intervall von 21 Tagen verab- reicht und eine weitere intradermale Injektion 3 Monate später. Jede Injektion entsprach ungefähr 9000 Larven von Strongylus vulgans. Diese geimpften Tiere und 6 unbehandelte Kontrollfohlen wurden auf einer bekanntermassen mit Strongylus vulgaris verseuchten Pferdekoppel weiden gelassen. 5 Monate nach der letzten Injektion wurde ein geimpftes und ein Kontrolltier getötet und die post-mortem Untersuchungen durchgeführt.
Strongylus vulgaris dringt in das Arteriensystem des Pferdes ein und verursacht dort Arteriitis ; seine Wirkung auf das Tier kann am besten durch Untersuchung der verursachten arteriellen Pathologie beurteilt werden.
Bei den in diesem Test getöteten Tieren wurde beim Kontrolltier ein echtes Aorta-Aneurysma gefunden, wogegen beim geimpften Tier diese Läsion nicht gefunden wurde.
Die gemäss Beispiel 6 hergestellte Vaccine wurde wie folgt getestet :
An 5 Kaninchen wurden mit einem Intervall von 21 Tagen je zwei intra-peritoneale Injektionen der Vaccine verabreicht. Jede Injektion entsprach ungefähr 3 000 Larven von Strongyloides papillosus. 4 Monate nach der zweiten Injektion wurden die Kaninchen und eine gleiche Anzahl unbehandelter Kaninchen
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In der Kontrollgruppe hatten sich 112411 Parasiten festgesetzt, wogegen in der geimpften Gruppe die Gesamtzahl nur 5 528 betrug. Das Ausmass an Immunität bei den geimpften Tieren betrug bei diesem Versuch 95"/0.
Die gemäss Beispiel 8 hergestellte Vaccine wurde wie folgt getestet :
An 8 Meerschweinchen wurde im Intervall von 21 Tagen zwischen den Injektionen je zwei intra-peritoneale Injektionen der Vaccine verabreicht. Die verabreichte Vaccindosis entsprach von ungefähr 250 bis zu 2000 Larven von Trichostrongylus colubriformis. 10 Tage nach der zweiten Injektion wurden die Testtiere und die Kontrollmeerschweinchen mit 5000 infektiösen Larven infiziert. 8 Tage nach der Infektion wurden die Tiere getötet. Die mittlere Zahl der post-mortem aus den Kontrolltieren gewonnenen
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Würmer betrug 2 035, wogegen das Mittel bei den geimpften Tieren nur 1"9 betrug.
Der bei diesem Ex- periment durch die Vaccine herbeigeführte Schutz betrug daher mehr als 90il.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung einer Vaccine, die bei Verabreichung durch Injektion den Schutz gegen
Erkrankungen, die durch für Wirbeltiere pathogene Nematoden verursacht werden, stimuliert, dadurch ge- kennzeichnet, dass infektiöse Nematodenlarven des dritten Stadiums durch Bebrüten in einem sterilen wässerigen Kulturmedium zur Entwicklung in die histotrophen Stadien gebracht werden und das die Larven enthaltende Medium als Vaccine verwendet wird, oder dass das genannte Kulturmedium und die darin enthaltenen Larven getrocknet werden und das getrocknete Material in einem sterilen wässerigen Träger suspendiert wird, um so die Vaccine zu ergeben.