DE1214831B - Verfahren zur Herstellung von Thymusextrakten - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

A61k

Deutsche KL: 30 h-2/10

Nummer: '1214831
Aktenzeichen:' R 38987IV a/30 h
Anmeldetag: ' 12. Oktober 1964
Auslegetag: 21. April 1966

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von zellfreien Thymusextrakten, welche eine wertvolle Aktivität für die Anregung der immunologischen Kapazität im tierischen Organismus zeigen.

Es ist bekannt, daß die Entfernung der Thymusdrüse in der frühen Jugend, zu einer Zeit, wenn die immunologische Potenz noch nicht voll entwickelt ist, von schweren Störungen in den Immunfunktionen begleitet ist, die sich vor allem durch eine ausgeprägte Verarmung an Lymphocyten und das Auftreten eines fatalen Verfallssyndroms zeigt.

Der Mechanismus, durch welchen die Thymusdrüse befähigt ist, die immunologische Fähigkeit zu begründen oder sie wiederherzustellen, nachdem sie zerstört wurde, ist jedoch nicht bekannt.

Es wurde vermutet, daß ein Humoralfaktor, der in der Thymusdrüse seinen Ursprung hat, die Ursache der Wiederherstellung der immunologischen Fähigkeit von endogenen lymphoiden Zellen ist, die diese Fähigkeit in der Abwesenheit von Thymus nicht auszuüben vermögen.

Wenn auch gewisse Ergebnisse durch Implantation von Thymusgewebe erzielt wurden, waren bisher doch keine isolierten Thymusextrakte bekannt, die für die Anregung immunologischer Fähigkeiten in anderen Lebewesen brauchbar wären.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß unter Verwendung von Gewebskulturmedien dieser Humoralfaktor aus isolierten Thymusdrüsen junger Tiere extrahiert werden kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von Thymusextrakten, die zur Induzierung immunologischer Kapazität in lebenden Organismen wertvoll sind, insbesondere in anderen Organismen als denjenigen, aus welchen der Thymus isoliert wurde, wobei dieses Verfahren die Isolierung des Thymus von jungen Tieren, beispielsweise Kälbern,.... die Inkubation des Thymus in einem Gewebskulturmedium, beispielsweise gepufferte Hanks-Lösung, deren Zusammensetzung im Beispiel 1 beschrieben ist, unter üblichen bekannten Arbeitsbedingungen, d. h. bei einer Temperatur von etwa 37° C für etwa 24 Stunden und das Sammeln der überstehenden Flüssigkeit umfaßt.

Eine erfindungsgemäß hergestellte Präparation wurde mit Erfolg in Organismen eingebracht (Mäuse), die von denjenigen verschieden waren, aus denen sie entnommen war (Kälber), um das immunologische System der ersteren Organismen (Mäuse) wieder in Ordnung zu bringen. Das Gelingen dieses Versuchs zeigte, daß man den Humoralfaktor aus der Thymusdrüse eines Tieres extrahieren und mit Erfolg einem Verfahren zur Herstellung von Thymusextrakten

Anmelder:

Recherche et Industrie Therapeutiques R. I. T.,
Genval (Belgien)

Vertreter:

Dipl.-Ing. F. Weickmann,

Dr.-Ing. A. Weickmann,

Dipl.-Ing. H. Weickmann

und Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke, Patentanwälte,

München 27, Möhlstr. 22

Als Erfinder benannt:

Dr. med. Pierre de Somer, Louvain;

Dr. med. Pierre Denys,

Roger Leyten, Herverlee (Belgien)

Beanspruchte Priorität:

Großbritannien vom 11. Oktober 1963 (40 288)

anderen Organismus übertragen kann. Der Erfindungsvorschlag ist also ganz allgemein wertvoll, wenn es gilt, das Nichtfunktionieren oder ungenügende Funktionieren der Thymusdrüse zu heilen. Beispiele für Erkrankungen, die mit ungenügendem Funktionieren, der Thymusdrüse zu erklären sind, sind y-Globuh'narmut und Strahlenerkrankungen.

Weiter wurde gefunden, daß das Thymusgewebe neugeborener Tiere diesen Humoralfaktor nicht in nachweisbarer Menge enthält. In der Praxis wird daher die Extraktion an Thymus durchgeführt, der aus relativ älteren Tieren, beispielsweise Kälbern mit einem Alter von etwa 12 bis 15 Wochen, isoliert wird, wie sie in Schlachthöfen vorkommen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel

Herstellung von Thymusextrakt
Kleine Fragmente von Kalbsthymus, der aseptisch nach dem Schlachten eines 15 Wochen alten Tieres entfernt wurde, werden in gepufferter Hanks-Lösung suspendiert und schwach bei 37° C während 48 Stunden geschüttelt. Die geerntete Flüssigkeit wird zweimal bei 3000UpM für 30 Minuten zentrifugiert, um cellulare Reste zu entfernen, und die endgültige überstehende Flüssigkeit wird als Thymusextrakt (KTE) in den folgenden Versuchen verwendet.

609 559/383

I 214831

Die obenerwähnte gepufferte Hanks-Lösung wird wie folgt hergestellt (die angegebenen Mengen ergeben 101 Endlösung):

50 g enzymatisches Lactalbuminhydrolysat werden in 21 Wasser gegeben. Das Gemisch wird gerührt, auf 56° C erwärmt und ¹Z₂ Stunde bei dieser Temperatur gehalten.

Dann wird in einem anderen Gefäß eine Lösung hergestellt, die folgende Bestandteile enthält:

Natriumchlorid 80 g

Kaliumchlorid 4 g

Calciumchlorid, wasserfrei 1,4 g

Magnesiumsulfat-heptahydrat 1,0 g

Magnesiumchlorid-hexahydrat

(2molare wäßrige Lösung) 2,5 ml

Natriumphosphat, zweibasisch,

wasserfrei 0,6 g

Kaliumphosphat, einbasisch,

wasserfrei 0,6 g

Phenolrot (0,5°/₀ige Lösung) 40 ml

Glucose 10 g

Wasser ad 21

Diese Lösung wird mit der oben erhaltenen Lactalbuminhydrolysatlösung gemischt, und unter Rühren werden die folgenden Bestandteile zugegeben:

Natriumbicarbonat (7,5°/_oige . "

wäßrige Lösung) 100 ml

Natriumpenicillin G 2-10⁶LE.

Streptomycinsulfat Ig (Base)

Das Gesamtvolumen wird mit Wasser auf 101 eingestellt, und die Lösung wird filtriert.

Aktivität von KTE bei normalen Mäusen
Eine Gruppe von dreißig normalen 5 Wochen alten

ίο Mäusen (NMRI-Stamm) wird intraperitoneal mit einer Dosis von 0,5 ml Kalbsthymusextrakt (KTE) geimpft. Gesamtzählungen und Differentialzählungen der peripheren weißen Blutkörperchen werden in regelmäßigen Zeitabständen aus Punktionen vorgenommen. Blutabstriche werden mit May-Grünwald-Giemsa gefärbt; Als Kontrollmaterial wird Kalbsmilzextrakt, der nach der gleichen Arbeitsweise hergestellt wird, wie sie oben für KTE beschrieben ist, entsprechend an eine andere Gruppe von dreißig normalen 5 Wochen alten Mäusen (NMRI-Stamm) verabreicht. Wie in Tabelle I angegeben, folgt auf die Verabreichung von KTE schnell ein temporärer Anstieg der Durchschnittszahl der weißen Blutkörperchen, der proportional mehr die Lymphocyten betrifft und einen

as Maximalspiegel etwa 3 bis 4 Tage nach der Impfung erreicht, während die Verabreichung von Milzextrakt das periphere Blutbild nicht beeinflußt.

Tabelle I

Gesamtzahl und Differentialzahl der weißen Blutkörperchen (W. B. Z.) im peripheren Blut nach einer einzigen Dosis an Extrakt

	Vorbehandlung (5 Wochen alt)	2 Tage	KTE 4 Tage	6 Tage	2 Tage	Milzextrakt 4 Tage	6 Tage
Gesamt- W. B. Z. L P M	7 800 6 500 1100 200	11 000 9 500 1100 400	13 100 11500 1400 200	8 000	8 000 6 700 1100 200		7 700 6 500 1000 200

L = Lymphocyten. P = Polynucleare. M = Monocyten.

Für die Untersuchung, ob wiederholte Impfungen in der Lage wären, ein lymphocytisches Leukämiesyndrom zu erzeugen, werden Gruppen von dreißig normalen 5 Wochen alten Mäusen täglich für einen Zeitraum von 5 Tagen entweder mit 0,5 ml KTE oder mit Milzextrakt als Kontrolle geimpft. Tabelle II zeigt, daß nach einer solchen KTE-Behandlung zuerst ein ausgeprägter Abfall an Lymphocyten erfolgt, wonach man eine erhöhte Anzahl von weißen Blutkörperchen feststellt, die ihr Maximum 7 Tage nach der letzten Impfung erreicht. 1 Woche später ist die Anzahl der weißen Blutkörperchen wieder normal.

Tabelle II

Gesamtzahl und Differentialzahl der weißen Blutkörperchen (W. B. Z.) im peripheren Blut nach fünf Dosen an Extrakt

	Vorbehandlung	ITag	KTE 3 Tage	7 Tage	ITag	Milzextrakt 3 Tage	7 Tage
Gesamt- W. B. Z. L P M	7 600 6 400 1000 200	5 000 3 600 1150 250	10 400 8 400 1600 400	13 200 10 700 2 100 ■" 400	7 800	—	8 000 6 600 1200 200

L = Lymphocyten. P = Polynucleare. M = Monocyten.
Aktivität von KTE bei thymektomierten Mäusen
a) Arbeitsweise der Thymektomie

Die Entfernung des Thymus wird regelmäßig innerhalb der zwölf ersten Stunden nach der Geburt vorgenommen. Neugeborene Mäuse werden zuerst für 30 Minuten im Kühlschrank so gekühlt, daß ihre Körpertemperatur auf etwa 5° C gebracht wird. Diese Kühlphase verhindert übermäßiges Bluten und Bewegungen während der Operation. Der Thymus

erscheint als zweilappiges Organ, das hinter dem Oberteil des manubrium sterni sitzt. Nach dem Einschnitt in die Haut und das sternum zwischen dem ersten und zweiten Intercostalraum wird der Thymus mit einer Pasteurpipette, die mit einer Saugpumpe verbunden ist, entfernt. Diese Operation wird unter einem stereoskopischen Zeiss-Mikroskop durchgeführt. Die Operationswunde wird mit Kollodium geschlossen, und die Tiere werden wieder unter einer Infrarotlampe erwärmt. Die Mortalität nach der Operation übersteigt niemals 10%·

b) Prüfung und Ergebnisse

Die neonatale Thymektomie ist von einer progressiven Lymphoidverarmung vom Zeitpunkt der Thymektomie bis zum Tod begleitet. Im Alter von etwa 5 Wochen bildet sich bei den Mäusen ein tödliches Verfallssyndrom aus. Der Tod erfolgt etwa in der 10. Woche. Die Aktivität von KTE bei neonatal thymektomierten Tieren wird entweder mit einer einzigen Dosis oder mit wiederholten Dosen geprüft, die an Gruppen von zwanzig Tieren im Alter von 3 Wochen verabreicht werden.

Wie in Tabelle III gezeigt, stellt die intraperitonale Verabreichung einer einzigen Dosis von 0,5'ml KTE an 3 Wochen alte neonatal thymektomierte Mäuse eine normale Zahl an weißen Blutkörperchen innerhalb 3 Tagen her. Im Alter von 7 Wochen werden die Tiere für die histologische Untersuchung getötet. Zu diesem Zeitpunkt ist, wie in Tabelle III gezeigt, ein ausgeprägter Unterschied im peripheren Blutbild zwischen behandelten und unbehandelten thymektomierten Tieren zu beobachten. Die behandelten Tiere haben eine normale Zahl an weißen Blutkörperchen, unbehandelte Tiere zeigen eine schwere periphere Lymphocytenverarmung. Gleichzeitig ist bei den behandelten Tieren kein Anzeichen eines Verfallssyndroms zu beobachten, und das Gesamtbild ihrer Milz ist normal, während die unbehandelten Tiere sich in einem schweren Zustand des Verfalls befinden und die Involution ihrer Milz durch eine Verminderung der Größe und des Gewichtes erkennbar ist.

Tabelle III

Gesamtzahl und Differentialzahl der weißen Blutkörperchen (W. B. Z.) im peripheren Blut von thymektomierten Mäusen nach einer einzigen Dosis an Extrakt

Vorbehandlung
(3 Wochen alt)

Gesamt-W. B. Z.

L
P

2 800

1030

1570

200

KTE-behandelt 3 Tage J 30 Tage

7150

4 500

1950

700

8 600

6100

1700

800

Kontrolle

unbehandelt

3 Tage I 30 Tage

2 400

960

1290

150

1800

1080

thymektomierten Tiere ein normales Durchschnittsgewicht und ein normales Blutbild zeigen. Die unbehandelten thymektomierten Tiere zeigen eine ausgeprägte Verminderung des Gewichtes und der Lymphocyten.

Tabelle IV

Mittlere Zahl der peripheren weißen Blutkörperchen (W. B. Z.) und Durchschnittsgewicht von behandelten ίο und unbehandelten thymektomierten Mäusen

	Gesamt-	Normale unbehandelte	Thymekto mierte unbehandelte	Thymekto mierte behandelte
15	W. B. Z.	Maus	Maus	Maus*)
L
20 P	7100	2 600	6 300
M	5 500	1100	4 600
Durchschnitts	1200	1300	1300
gewicht, g	400	200	400
22,2	11,9	22,6

L = Lymphocyten. P = Polynucleare. M = Monocyten.

In einem folgenden Versuch wird eine Gruppe von dreißig Mäusen, die bei der Geburt thymektomiert worden waren, intraperitoneal alle 3 Tage mit KTE geimpft, wobei unmittelbar nach der Operation begonnen wird. Kontrollgruppen an unbehandelten thymektomierten Tieren und an normalen Tieren sind ebenfalls in den Versuch einbezogen. Tabelle IV zeigt, daß 5 Wochen später, nachdem sie acht Injektionen von KTE erhalten hatten, die behandelten ₂„ *) Acht Injektionen an KTE.

L = Lymphocyten. P = Polynucleare. M = Monocyten.

c) Aktivität von KTE bei thymektomierten Mäusen, die mit Adenovirus, Typ 4, infiziert sind

Eine Gruppe von zweiundzwanzig neugeborenen Mäusen wird sofort nach der Geburt thymektomiert und mit Adenovirus infiziert und mit 0,2 ml KTE behandelt, die zweimal wöchentlich intraperitoneal verabreicht werden. Eine Gruppe von vierundzwanzig unbehandelten thymektomierten infizierten Mäusen wird als Kontrolle benutzt.

3 Wochen später beträgt die durchschnittliche Zahl der weißen Blutkörperchen bei der behandelten Gruppe 4 400 (mit 75% Lymphocyten und 20% Neutrophilen), während die unbehandelte Gruppe nur 2 500 weiße Blutkörperchen je Kubikmillimeter mit 36% Lymphocyten und 60% Neutrophilen aufweist.

Nach 5 Wochen leben noch einundzwanzig der

zweiundzwanzig behandelten Tiere, während nur elf der vierundzwanzig unbehandelten Tiere überleben. In dieser letzten Gruppe erfolgt der Tod unter Symptomen des Verfalls, die ähnlich dem Verfallssyndrom sind, das gewöhnlich bei unbehandelten thymektomierten Mäusen beobachtet wird.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Thymusextrakten, die zur Induzierung immunologischer Fähigkeit in lebenden Organismen wertvoll sind, dadurch gekennzeichnet, daß man Thymus von jungen Tieren isoliert, den Thymus in einem Gewebskulturmedium inkubiert und die überstehende Flüssigkeit sammelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubationszeit zumindest 24 Stunden beträgt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als junge Tiere Kälber mit einem Alter von 12 bis 15 Wochen verwendet werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Gewebskulturmedium gepufferte Hanks-Lösung verwendet wird.

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