AT392480B - Lebendvakzine gegen die svc (fruehjahrsviraemie der karpfen) und ihre herstellung - Google Patents

Lebendvakzine gegen die svc (fruehjahrsviraemie der karpfen) und ihre herstellung Download PDF

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Description

AT 392 480 B
Die Erfindung bezieht sich auf die Adaption von SVC-Virusstämmen (Rhabdovirus carpio) an Warmblöteizellkulturen, im besonderen auf primäre Hühnerfibroblastenzellkulturen, die Adaption dieser Stämme an eine Temperatur von 30 °C, die Passagierung dies«1 Stämme bis zu deren Avirulenz und die Anwendung dieser Stämme zum Zwecke der Impfung gegen die SVC bei Karpfen. A Adaption und Attenuierung des SVC-Vinis.
Nach Anzüchtung des SVC-Virus auf Kaltblüterzellen wie EPC- und FHM-Zellen wird das Virus sofort oder erst nach Passagen in diesen Zellen auf Warmblüterzellen, vornehmlich auf primäre Hühnerfibroblastenzellkulturen, übertragen. Nach 6 bis 10 Passagen kommt es zum Auftreten eines cytopathischen Effektes (CPE). Ausgehend von 20 °C wird durch stufenweise Erhöhung der Temperatur eine Züchtungstemperatur von 30 °C erreicht Die Anzüchtbarkeit dieser so adaptierten Virusstämme auf Kaltblüterzellen ist gegeben. Die S VC-Stämme erwerben durch die Pasagierung folgende Eigenschaften: CPE auf Warmblüterzellen; die Überlebensrate bei höheren Temperaturen (30 °C bis 37 °C) ist wesentlich erhöht; das Wachstum auf anderen Warmblüterzellen, wie z. B. BHK-21-, Vero-, MDBK-, IBRS-, A 72-Zellen, ist mit CPE bei 20 °C - 30 °C gegeben; die krankmachenden Eigenschaften nehmen bis zur Avirulenz ab, die immunisierenden Eigenschaften bleiben erhalten. B Prüfung des attenuierten SVC-Virus auf Virulenz und immunisierende Eigenschaften.
Die Virulenzprüfung wird vorgenommen durch Verabreichung des attenuierten SVC-Virus an spezifisch pathogenfireie (SPF-)Karpfen. Diese Karpfen werden in einem Wasser, das 10^ KID^q Virus pro ml enthält, 2 Stunden lang gebadet Die Wassertemperatur während des gesamten Versuchszeitraumes von 2 Monaten liegt unter 15 °C, am besten bei 10 °C. Alle Fische überleben bei avirulenten Virusstämmen.
Die Immunität wird durch Infektion von geimpften Karpfen mit virulentem Virus geprüft Infektionsdosis und Infektionsart sowie Haltung sind gleich wie bei der Virulenzprüfung. Infizierte nicht geimpfte Kontrollfische sterben alle. Geimpfte überleben. C Herstellung eines Impfstoffes
Die Impfstoffherstellung kann mit dem attenuierten Virus per se oder mit Klonen des attenuierten Virus erfolgen. Klone mit großer Plaquebildung haben eine bessere immunisierende Eigenschaft Die Virusvermehrung kann vorgenommen werden in Kaltblüterzellen wie z. B. EPC- oder FHM-Zellen oder aber in Warmblüterzellen wie z. B. primäre Hühnerfibroblasten. Geeignet sind stationäre Monolayer oder Rollkulturen wie auch Suspensionskulturen, wobei ein Mindesttiter von 10^ KID^q pro ml erreicht wird. Vorzugsweise werden
Rollkulturen mit Hühnerfibroblasten verwendet Ein Virustiter bis zu 10^ KID^q pro ml kann damit erreicht werden.
Als Stabilisatoren geeignet sind vorzugsweise Glutamin, Gelatine, hydrolysierte Gelatine, Phosphat, Saccharose, Sorbit Pepton oder Gemische davon. D Anwendung des Impfstoffes
Der Impfstoff kann verabfolgt werden über das Futter, durch ein Bad oder durch Injektion.
Die Impfung wird vorzugsweise im Sommer durchgeführt Der Impfstoff sollte zweimal im Abstand von mindestens 3 Wochen bis höchstens 3 Monate verabfolgt werden. Ist die Wassertemperatur hoch, kann der Abstand geringer sein, ist sie niedrig, sollte der Abstand zwischen den Impfungen läng» bemessen werden.
Beispiele
Adaption und Attenuierung eines SVC-Stammes.
Zunächst wurden 50x wöchentliche Passagen in EPC-Zellen bei 20 °C, gefolgt von 120 Passagen in primären Hühnerfibroblastenzellkulturen durchgeführt Dann wurde durch schrittweise Erhöhung der Temperatur um 2 bzw. 3 °C eine Anpassung auf 30 °C erreicht, wobei jeder Schritt einer Temperaturerhöhung 5-30 Passagen umfaßte. Gelegentlich waren Zwischenpassagen in EPC- oder FHM-Zellen erforderlich. Schließlich folgten 50 Passagen bei einer Temperatur von 30 °C. Insgesamt wurden 350 Passagen durchgeführt
Herstellung eines Impfstoffes
Primäre Hühnerfibroblasten Zellkulturen wurden mittels Eagle MEM (minimum essential medium) + 5 % Rinderserum in Rollkulturen angezüchtet 3 Tage nach Zelleinsaat wurde das Medium gewechselt und die Zellen mit Eagle MEM und 2 % Rinderserum überschichtet. Das Saatvirus, 5x10^ KID^q pro ml, war dem Medium beigegeben worden. 48 Stunden später zeigte die Hälfte bis 3/4 der Zellen einen CPE und es wurde das Virus geerntet Erreichter Virustiter 5x10** KID^q pro ml. Als Stabilisatoren wurden zugefügt 2 % Glutamat und 0,5 % Gelatine oder aber Pepton.

Claims (6)

  1. AT 392 480 B Impfung von einsömmripen Karpfen (K^) mittels Bad 44 Kj mit einem durchschnittlichen Gewicht von 30 g wurden 2 Stunden bei einer Temperatur von 10 °C in einem Wasser gebadet, das 5x10^ KID^q pro ml Impfvirus enthielt Kein geimpfter Fisch starb bis zum 65. Tag nach Verabreichung des Impfstoffes. Eine nachfolgende Infektion mit einem virulenten SVC-Stamm, in gleicher 5 Weise durchgeführt wie die Impfung, mit einer Virusdosis von 5x10^ KID^q pro ml Wasser, hatte keine t Erkrankungs- oder Todesfälle zur Folge. Von der nichtgeimpften Kontrollgruppe, die zur gleichen Zeit in gleicher Weise infiziert wurden, starben alle. Impfung von Karpfen im 2. Sommer (K1 durch Verabreichung des Virus mit dem Futter. 10 Das Impfvirus wurde mittels Sojaschrot an Karpfen verabfolgt. Die Impfdosis pro Karpfen war 10^ KID^q. Die erste Impfung war Anfang Juli bei einer Wassertemperatur von 20 °C, die zweite Impfung fand Anfang August bei ein»' Wassertemperatur von 25 °C statt. Das Durchschnittsgewicht der Karpfen betrug 18 dag bei der ersten Impfung. Es wurden ca. 50 000 Karpfen in 6 Teichen geimpft Mit diesen Karpfen aus 6 Teichen wurde im Herbst ein großer Teich besetzt. Es gab weder in der Impfphase noch nach Besatz des großen Teiches in der 15 Winterung und danach im Frühjahr Verluste. Um zu prüfen, ob die Immunisierung erfolgreich war, wurden von 3 Teichen jeweils 15 Fische im Herbst entnommen und einer Infektion im Aquarium mit einem virulenten Stamm unterzogen. Die Karpfen wurden über das Wasser mit einer Virusdosis von 5xl05 KID^q pro ml Wasser infiziert. Die Wassertemperatur betrug 6 °C. Nach 10 Wochen wurde die Temperatur schrittweise innerhalb von 8 Tagen auf 14 °C erhöht. 4 Wochen danach 20 wurde der Versuch beendet. Von den 15 Karpfen des 1. Teiches starb einer an SVC. Von den 15 Karpfen des 2. Teiches starben zwei. Die 15 Karpfen des 3. Teiches blieben alle gesund. 25 PATENTANSPRÜCHE 30 1. Verfahren zur Herstellung eines avirulenten, einen cytopathischen Effekt (CPE) erzeugenden SVC-Virus, dadurch gekennzeichnet, daß sofort nach Isolierung oder nach Passagen des Virus in Kaltblüterzellen dieses 35 durch Passagen bei stufenweiser Temperaturerhöhung auf 30 °C an Warmblüterzellen, vornehmlich Hühnerfibroblasten, adaptiert wird.
  2. 2. Vakzine gegen die SVC, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Virus nach Anspruch 1 enthält.
  3. 3. Vakzine nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Stabilisator enthält.
  4. 4. Vakzine nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Stabilisator Phosphat, Glutamat, Gelatine, hydrolysierte Gelatine, Pepton, Saccharose, Sorbit oder ein Gemisch von diesen ist.
  5. 5. Vakzine nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie in gefrorenem Zustand vorliegt.
  6. 6. Vakzine nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie in lyophilisiertem Zustand vorliegt. -3-
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