Zusatzpatent zum Hauptpatent Nr. 423 099 Verfahren zur Herstellung von Ferrichrysin und Desferrichrysin Im Hauptpatent Nr. 423 099 ist ein Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung der neuen Wuchsstoffe Ferri- chrysin und Desferrichrysin beschrieben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Aspergillus-Stamm, nämlich Aspergillus melleus M 2853, züchtet.
Es wurde nun gefunden, dass man die genannten Wuchsstoffe auch erhält, wenn man den Stamm Asper- gillus M 4785 züchtet. Gegenstand des vorliegenden Zu satzpatentes ist daher ein Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von Ferrichrysin und Desferrichrysin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Stamm Asper- gillus M 4785 züchtet.
Der Stamm Aspergillus M 4785 wurde in Zürich aus der Erde isoliert. Er wird in unseren Laboratorien und in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spe zielle Botanik, Zürich, unter der angegebenen Bezeich nung aufbewahrt. Bei der Züchtung auf Malzextrakt Agar zeichnet sich der Stamm aus durch ein vegetatives Mycel aus septierten und verzweigten Hyphen, aus deren Fusszellen Konidienträger in Form von rundlich ange schwollenen Köpfchen herauswachsen.
Die Köpfchen tragen in dichter Anordnung fertile Zellen, Sterigmen, aus denen in unverzweigten Ketten die Konidien durch Querwandbildung abgeschnürt werden. Dadurch ist der Stamm eindeutig als zur Gattung Aspergillus Michel! 1729 (vgl. Thom et Church, The Aspergillib, Baltimore 1926) gehörend gekennzeichnet.
Die Züchtung erfolgt z. B. in wässriger, eine Koh- lenstoffquelle, stickstoffhaltige Verbindungen sowie an organische Salze enthaltender Nährlösung, aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur, oder vor zugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwi schen 18 und 40 C, vorzugsweise 27 C. Eine wesent liche Sideramin-Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 4 bis 8 Tagen.
Die Nährlösung enthält als Kohlenstoffquelle z. B. Kohlenhydrate, wie Glukose, Saccharose, Laktose, Stärke, Alkohole, wie Mannit oder Glycerin. Als stick- stoffhaltige Nährstoffe seien genannt Aminosäuren, z. B.
Ornithin, Peptide, Proteine und deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais oder Weizen, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Hefe, Samen, insbesondere der Raps- und Sojapflanze, der Baumwollpflanze, Ammoniumsalze und Nitrate.
Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung bei spielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate, Nitrate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Zink oder Mangan sowie Spuren von Eisensalzen ( < 10-7 Mol/Liter) ent halten.
Die Ferrichrysin-Aktivität kann mikrobiologisch mit tels des abgewandelten Bonifas-Testes (vgl. Zähner et a1., Arch. Mikrobio. 36, 325 ff [1960]) bestimmt wer den. Als Testlösung verwendet man eine Ferrimycin- lösung von 0,01 mg/ml Gehalt, als Teststamm Staphy- lococcus aureus.
Man kann auch optisch die Ferrichrysin-Konzentra- tion der Kulturlösung feststellen. Zu diesem Zweck wer den 5 ml Kulturflüssigkeit mit 1,5g Natriumchlorid, 1 ml 0,1o/oiger Ferrisulfatlösung und 5 ml Benzylalkohol 5 Minuten geschüttelt, abzentrifugiert, die organische Phase filtriert und die Extinktion der organischen Phase bei 410 mg bestimmt.
Als Vergleichsprobe dient ein auf gleiche Weise her gestellter Extrakt aus unbeimpfter Nährlösung.
Nach 4 bis 8 Tagen erreichen die Kulturen eine Aktivität, die 300-400 mg reinem Ferrichrysin ent spricht.
Zur Kultur gibt man nach Beendigung der Züchtung pro Liter 1 g Ferrichlorid, wenn Ferrichrysin isoliert werden soll, nicht aber wenn das eisenfreie Desferri- chrysin gewonnen werden soll. Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Ferri- chrysins im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen davon am Mycel haften. Es ist daher vorteilhaft, dieses gut auszuwaschen. Dazu eignen sich beispielsweise Wasser oder wässrige Alko hole, wie wässriges Methanol.
Für die Isolierung von Ferrichrysin aus dem Kultur filtrat kann man nach an sich bekannten Methoden vor gehen, insbesondere nach dem im Hauptpatent 423 099 angegebenen Methoden.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen be schrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden an gegeben.
<I>Beispiel 1</I> Der Stamm Aspergillus M 4785 wird in gut belüf teter Submerskultur bei 27 C gezüchtet. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Glucose, 5 g L-Asparagin, 1 g sek.-Kaliumphosphat, 1 g kristallisiertes Magnesiumphosphat (MgS04, 7 H.0) und 0,5 g Calciumchlorid enthält. Der Gehalt des Leitungs wassers an Eisen beträgt 20-30 ;,/Liter. Die Nährlösung wird 20 Minuten bei l20 sterilisiert.
Geimpft wird mit einer Sporensuspension, die 150-180 Millionen Sporen pro Liter enthält.
Nach 4 bis 8 Tagen wird den Kulturen 1 g Ferri- chlorid pro Liter zugesetzt und unter Zusatz von 2 0/0 Celit filtriert. Dem Kulturfiltrat werden nun pro Liter 300g Natriumchlorid zugefügt und die klare Lösung dreimal mit 1/1o Volumen Benzylalkohol extrahiert. Die organische Phase wird mit Natriumsulfat getrocknet und mit 3 Volumen Äther versetzt. Das Benzylalkohol-Äther- gemisch extrahiert man mit einer kleinen Menge destil liertem Wasser, bis die wässrige Phase nur noch blass rot gefärbt ist.
Der wässrige Auszug wird lyophilisiert, wobei ein rotes Pulver anfällt in einer Ausbeute von 300-400 mg/Liter, enthaltend 80 % der Aktivität des Ausgangsmaterials.
18,9 g rohes Ferrichrysin-Gemisch werden einer Craig-Verteilung über 95 Stufen unterzogen, wobei die Substanz in die ersten 7 Gläser einer automa"ischen Ver teilungsapparatur (Glasinhalt 25 ml pro Phase) einge füllt wird. Als Verteilungs-System dient ein Gemisch aus Benzylalkohol, n-Butylalkohol, gesättigte wässrige Na triumchloridlösung und 0,001-n. wässrige Salzsäure im Volumenverhältnis 9:9:5:15.
Der rotbraune Farbstoff wird im wesentlichen in eine Haupt- und eine Nebenkomponente aufgetrennt, die in den Fraktionen 46 bzw. 75 ihre Verteilungsmaxima haben. Dies entspricht ungefähren Verteilungskoeffizien ten von K1 = 0,9 bzw. K2 = 3,8.
Die Fraktionen 36-60 werden zusammengefasst, mit dem doppelten Volumen Äther versetzt und die wässrige Phase abgetrennt. Die organische Schicht wird noch drei mal mit etwas Wasser ausgeschüttelt, die vereinigten wässrigen Auszüge mit Natriumchlorid etwa halb ge sättigt und mehrmals mit Phenol-Chloroform (1 kg Phenol auf 1 Liter Chloroform) ausgeschüttelt. Die Ex trakte werden mit halbgesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die zunächst trübe Lösung wird an einer kurzen Celit-Säule geklärt, dann mit dem doppelten Vo lumen Äther verdünnt und mehrmals mit wenig Wasser ausgeschüttelt, wobei der braunrote Farbstoff wieder in die wässrige Phase geht.
Die mehrmals mit Äther gewaschenen wässrigen Auszüge werden im Vakuum eingedampft und der Rück stand getrocknet. Man erhält 8,2 g gereinigtes Ferri- chrysin. Für die Kristallisation werden 16 g eines sol chen Eindampfrückstandes in etwa 200 ml heissem ab solutem Äthylalkohol (über Natrium destilliert) gelöst. Die Kristallisation setzt rasch ein und es fallen<B>11,6</B> g kristallines Ferrichrysin in Form rotbrauner Stäbchen aus. Die Mutterlaugen werden zur Trockene eingedampft und wieder in absolutem Alkohol gelöst. Man erhält so nochmals 0,9g Kristalle.
Zur Analyse wird eine Probe nochmals aus absolu tem Alkohol umkristallisiert. Die rotbraunen Stäbchen werden bei 270 schwarz ohne zu schmelzen. Das Pro dukt ist mit dem im Hauptpatent Nr. 423 099 beschrie benen Produkt identisch.
<I>Beispiel 2</I> Aspergillus M 4785 wird nach dem Submersverfah- ren in einer Nährlösung gezüchtet, die pro Liter Lei tungswasser 20 g Glucose, 5 g L-Asparagin, 1 g sekun däres Kaliumphosphat, 1 g kristallines Magnesiumphos- phat (MgSO" 7 H.0) und 0,5 g Calciumchlorid enthält. Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder Fermen- tern 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert.
Dann be- impft man mit einer Sporensuspension wie in Beispiel 1. Man inkubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 27 , wobei die Kulturen in den Fermentern mit etwa 2 Volumen Luft je Volumen Lösung pro Minute be lüftet werden. Nach etwa 96 Stunden Bebrütung hat die Kulturlösung den höchsten Gehalt an Desferrichrysin erreicht. Dieser wird mittels des Antisideromycin-Testes bestimmt. Da die Nährlösung kleine Mengen Eisen ent hält, liegt das gebildete Desferrichrysin teilweise in Form seines Eisen-Komplexes vor.
340 Liter aktive Kulturbrühe von Aspergillus M 4785 werden mit 85 g 8-Oxychinolin, gelöst in 1,6 Liter Me:hanol, versetzt. Nach einer Stunde wird unter Zusatz von 2 % Hyflo-Supercel als Filterhilfsmittel das Mycel abfiltriert. Das Filtrat wird zur Entfernung von über schüssigem 8-Oxychinolin durch eine Säure mit 5 Liter Amberlite I.R.-45, OH--Form,
perkoliert. Das pH des Perkolates wird durch Zusatz von Salzsäure auf 7,5 ge stellt. Die so erhaltene aktive Kulturlösung wird an- schliessend mit Natriumchlorid gesättigt und mit Benzyl- alkohol extrahiert. Nach dem Eindampfen der Extrakte erhält man das Desferrichrysin in Form eines gelblichen Pulvers. Es ist identisch mit dem im Hauptpatent Nr. 423 099 beschriebenen Produkt.