CH449177A - Verfahren zur Herstellung von Ferrichrysin und Desferrichrysin - Google Patents

Description

      Zusatzpatent        zum    Hauptpatent Nr. 423 099    Verfahren     zur    Herstellung von     Ferrichrysin    und     Desferrichrysin       Im Hauptpatent Nr. 423 099 ist ein Verfahren zur  gleichzeitigen Herstellung der neuen     Wuchsstoffe        Ferri-          chrysin    und     Desferrichrysin    beschrieben, das dadurch  gekennzeichnet ist, dass man einen     Aspergillus-Stamm,     nämlich     Aspergillus        melleus    M 2853, züchtet.  



  Es wurde nun     gefunden,    dass man die genannten       Wuchsstoffe    auch erhält, wenn man den Stamm     Asper-          gillus    M 4785 züchtet. Gegenstand des vorliegenden Zu  satzpatentes ist daher ein Verfahren zur gleichzeitigen  Herstellung von     Ferrichrysin    und     Desferrichrysin,    das  dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Stamm     Asper-          gillus    M 4785 züchtet.  



  Der Stamm     Aspergillus    M 4785 wurde in Zürich aus  der Erde isoliert. Er wird     in    unseren Laboratorien und  in der     Eidg.    Technischen Hochschule,     Institut    für spe  zielle Botanik, Zürich, unter der angegebenen Bezeich  nung     aufbewahrt.    Bei der     Züchtung    auf Malzextrakt  Agar zeichnet sich der Stamm aus durch ein vegetatives       Mycel    aus     septierten    und verzweigten     Hyphen,    aus deren  Fusszellen     Konidienträger    in Form von     rundlich    ange  schwollenen Köpfchen herauswachsen.

   Die Köpfchen  tragen in dichter Anordnung fertile Zellen,     Sterigmen,     aus denen in     unverzweigten    Ketten die     Konidien    durch       Querwandbildung    abgeschnürt werden. Dadurch ist der  Stamm eindeutig als zur Gattung     Aspergillus        Michel!     1729 (vgl.     Thom    et     Church,         The        Aspergillib,    Baltimore  1926) gehörend     gekennzeichnet.     



  Die Züchtung erfolgt z. B. in wässriger, eine     Koh-          lenstoffquelle,    stickstoffhaltige Verbindungen sowie an  organische     Salze    enthaltender Nährlösung,     aerob,    also       beispielsweise    in ruhender     Oberflächenkultur,    oder vor  zugsweise     submers    unter Schütteln oder Rühren mit Luft  oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten       Fermentern.    Als Temperatur eignet sich eine solche zwi  schen 18 und 40  C, vorzugsweise 27  C. Eine wesent  liche     Sideramin-Wirkung    zeigt die Nährlösung dabei im  allgemeinen nach 4 bis 8 Tagen.  



  Die Nährlösung enthält als     Kohlenstoffquelle    z. B.  Kohlenhydrate, wie Glukose,     Saccharose,        Laktose,     Stärke, Alkohole, wie     Mannit    oder Glycerin. Als stick-    stoffhaltige Nährstoffe seien genannt     Aminosäuren,    z. B.

         Ornithin,        Peptide,    Proteine und deren Abbauprodukte,  wie     Pepton    oder     Trypton,    Fleischextrakte, wasserlösliche  Anteile von Getreidekörnern, wie Mais oder Weizen,       Destillationsrückstände    der     Alkoholherstellung,    Hefe,  Samen, insbesondere der Raps- und     Sojapflanze,    der  Baumwollpflanze,     Ammoniumsalze    und Nitrate.

   Von  anderen anorganischen     Salzen    kann die Nährlösung bei  spielsweise Chloride,     Carbonate,        Sulfate,    Nitrate von  Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Zink oder Mangan  sowie Spuren von     Eisensalzen    ( <  10-7     Mol/Liter)    ent  halten.  



  Die     Ferrichrysin-Aktivität    kann mikrobiologisch mit  tels des abgewandelten     Bonifas-Testes    (vgl.     Zähner    et       a1.,        Arch.        Mikrobio.    36, 325 ff [1960]) bestimmt wer  den. Als Testlösung     verwendet    man eine     Ferrimycin-          lösung    von 0,01     mg/ml    Gehalt, als Teststamm     Staphy-          lococcus        aureus.     



  Man kann auch optisch die     Ferrichrysin-Konzentra-          tion    der Kulturlösung feststellen. Zu diesem Zweck wer  den 5 ml Kulturflüssigkeit mit 1,5g     Natriumchlorid,     1 ml     0,1o/oiger        Ferrisulfatlösung    und 5 ml     Benzylalkohol     5 Minuten geschüttelt,     abzentrifugiert,    die organische  Phase filtriert und die     Extinktion    der organischen Phase  bei 410 mg bestimmt.  



  Als Vergleichsprobe dient ein auf gleiche Weise her  gestellter Extrakt aus     unbeimpfter    Nährlösung.  



  Nach 4 bis 8 Tagen erreichen die Kulturen eine  Aktivität, die     300-400    mg reinem     Ferrichrysin    ent  spricht.  



  Zur Kultur gibt man nach Beendigung der Züchtung  pro Liter 1 g     Ferrichlorid,    wenn     Ferrichrysin    isoliert  werden soll, nicht aber wenn das eisenfreie     Desferri-          chrysin    gewonnen werden soll. Man trennt das     Mycel     vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des     Ferri-          chrysins    im     Kulturfiltrat    gefunden wird. Es bleiben aber  trotzdem namhafte Mengen davon am     Mycel    haften. Es  ist daher vorteilhaft, dieses gut auszuwaschen. Dazu  eignen sich beispielsweise Wasser oder wässrige Alko  hole, wie wässriges Methanol.

        Für die Isolierung von     Ferrichrysin    aus dem Kultur  filtrat kann man nach an sich bekannten Methoden vor  gehen, insbesondere nach dem im Hauptpatent 423 099  angegebenen Methoden.  



  Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen be  schrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden an  gegeben.  



  <I>Beispiel 1</I>  Der Stamm     Aspergillus    M 4785 wird in gut belüf  teter     Submerskultur    bei 27  C gezüchtet. Man verwendet  eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g  Glucose, 5 g     L-Asparagin,    1 g     sek.-Kaliumphosphat,    1 g       kristallisiertes        Magnesiumphosphat        (MgS04,    7     H.0)    und  0,5 g     Calciumchlorid    enthält. Der Gehalt des Leitungs  wassers an Eisen beträgt 20-30     ;,/Liter.    Die Nährlösung  wird 20 Minuten bei l20  sterilisiert.

   Geimpft wird mit  einer     Sporensuspension,    die 150-180 Millionen Sporen  pro Liter enthält.  



  Nach 4 bis 8 Tagen wird den Kulturen 1 g     Ferri-          chlorid    pro Liter zugesetzt und unter Zusatz von 2 0/0       Celit    filtriert. Dem Kulturfiltrat werden nun pro Liter  300g     Natriumchlorid    zugefügt und die klare Lösung  dreimal mit 1/1o Volumen     Benzylalkohol    extrahiert. Die  organische Phase wird mit Natriumsulfat getrocknet und  mit 3 Volumen Äther versetzt. Das     Benzylalkohol-Äther-          gemisch    extrahiert man mit einer kleinen Menge destil  liertem Wasser, bis die wässrige Phase nur noch blass  rot gefärbt ist.

   Der wässrige Auszug wird     lyophilisiert,     wobei ein rotes Pulver anfällt in einer Ausbeute von       300-400        mg/Liter,        enthaltend        80        %        der        Aktivität        des     Ausgangsmaterials.  



  18,9 g rohes     Ferrichrysin-Gemisch    werden einer       Craig-Verteilung    über 95 Stufen unterzogen, wobei die  Substanz in die ersten 7 Gläser einer     automa"ischen    Ver  teilungsapparatur (Glasinhalt 25 ml pro Phase) einge  füllt wird. Als     Verteilungs-System    dient ein Gemisch aus       Benzylalkohol,        n-Butylalkohol,    gesättigte wässrige Na  triumchloridlösung und 0,001-n. wässrige Salzsäure im  Volumenverhältnis 9:9:5:15.  



  Der rotbraune Farbstoff wird im wesentlichen in  eine Haupt- und eine Nebenkomponente aufgetrennt, die  in den Fraktionen 46 bzw. 75 ihre     Verteilungsmaxima     haben. Dies entspricht ungefähren Verteilungskoeffizien  ten von     K1    = 0,9     bzw.        K2    = 3,8.  



  Die Fraktionen 36-60 werden zusammengefasst, mit  dem doppelten Volumen Äther versetzt und die wässrige  Phase abgetrennt. Die organische Schicht wird noch drei  mal mit etwas Wasser ausgeschüttelt, die vereinigten  wässrigen Auszüge mit     Natriumchlorid    etwa halb ge  sättigt und mehrmals mit     Phenol-Chloroform    (1 kg  Phenol auf 1 Liter Chloroform) ausgeschüttelt. Die Ex  trakte werden mit halbgesättigter     Natriumchloridlösung     gewaschen. Die zunächst trübe Lösung wird an einer  kurzen     Celit-Säule    geklärt, dann mit dem doppelten Vo  lumen Äther verdünnt und mehrmals mit wenig Wasser  ausgeschüttelt, wobei der braunrote Farbstoff wieder in  die wässrige Phase geht.  



  Die mehrmals mit Äther gewaschenen wässrigen  Auszüge werden im Vakuum eingedampft und der Rück  stand getrocknet. Man erhält 8,2 g gereinigtes     Ferri-          chrysin.    Für die Kristallisation werden 16 g eines sol  chen     Eindampfrückstandes    in etwa 200 ml heissem ab  solutem     Äthylalkohol    (über Natrium destilliert) gelöst.  Die Kristallisation setzt rasch ein und es fallen<B>11,6</B> g  kristallines     Ferrichrysin    in Form rotbrauner Stäbchen    aus. Die Mutterlaugen werden zur Trockene eingedampft  und wieder in absolutem Alkohol gelöst. Man erhält so  nochmals 0,9g Kristalle.  



  Zur Analyse wird eine Probe nochmals aus absolu  tem Alkohol     umkristallisiert.    Die rotbraunen Stäbchen  werden bei 270  schwarz ohne zu     schmelzen.    Das Pro  dukt ist mit dem im Hauptpatent Nr. 423 099 beschrie  benen Produkt identisch.  



  <I>Beispiel 2</I>       Aspergillus    M 4785 wird nach dem     Submersverfah-          ren    in einer Nährlösung gezüchtet,     die    pro Liter Lei  tungswasser 20 g     Glucose,    5 g     L-Asparagin,    1 g sekun  däres     Kaliumphosphat,    1 g kristallines     Magnesiumphos-          phat        (MgSO"    7     H.0)    und 0,5 g     Calciumchlorid    enthält.  Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder     Fermen-          tern    20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert.

   Dann     be-          impft    man mit einer     Sporensuspension    wie in Beispiel 1.  Man     inkubiert    unter gutem Schütteln oder Rühren bei  27 , wobei die Kulturen in den     Fermentern    mit etwa  2 Volumen Luft je Volumen Lösung pro Minute be  lüftet werden. Nach etwa 96 Stunden     Bebrütung    hat die  Kulturlösung den höchsten Gehalt an     Desferrichrysin     erreicht. Dieser wird mittels des     Antisideromycin-Testes     bestimmt. Da die Nährlösung kleine Mengen Eisen ent  hält, liegt das gebildete     Desferrichrysin    teilweise in Form  seines Eisen-Komplexes vor.  



  340 Liter aktive Kulturbrühe von     Aspergillus    M  4785 werden mit 85 g     8-Oxychinolin,    gelöst in 1,6 Liter       Me:hanol,    versetzt. Nach einer Stunde wird unter Zusatz       von    2     %        Hyflo-Supercel        als        Filterhilfsmittel        das        Mycel          abfiltriert.    Das Filtrat wird zur Entfernung von über  schüssigem     8-Oxychinolin    durch eine Säure mit 5 Liter       Amberlite        I.R.-45,        OH--Form,

          perkoliert.    Das     pH    des       Perkolates    wird durch     Zusatz    von Salzsäure auf 7,5 ge  stellt. Die so erhaltene aktive Kulturlösung wird     an-          schliessend    mit     Natriumchlorid    gesättigt und mit     Benzyl-          alkohol        extrahiert.    Nach dem Eindampfen der Extrakte  erhält man das     Desferrichrysin    in Form eines gelblichen  Pulvers. Es ist identisch mit dem im Hauptpatent Nr.  423 099 beschriebenen Produkt.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH I Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von Ferri- chrysin und Desferrichrysin, dadurch gekennzeichnet, dass man Aspergillus M 4785 züchtet. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch ge kennzeichnet, dass man nach Beendigung der Züchtung ein Eisensalz zur Kultur gibt und Ferrichrysin isoliert. 2. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteran spruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die aktiven Substanzen mittels Benzylalkohol aus dem Kulturfiltrat extrahiert. 3.

   Verfahren nach Patentanspruch I und Unteran spruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die aktiven Substanzen mittels Phenol-Chloroform extrahiert. 4. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch ge kennzeichnet, dass man nach Beendigung der Züchtung 8-Oxy-chinolin zur Kultur gibt und Desferrichrysin iso liert.

   PATENTANSPRUCH II Die Verwendung von nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch l und Unteranspruch 1 hergestelltem Ferrichrysin zur Herstellung von Desferrichrysin, da durch gekennzeichnet, dass man aus Ferrichrysin mittels Säuren oder Basen oder Eisenkomplex-bildenden Stof fen das Eisen entfernt.

   UNTERANSPRUCH 5. Verwendung gemäss Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass als Eisenkomplex-bildender Stoff 8-Oxy-chinolin verwendet wird. <I>Anmerkung des</I> Eidg. <I>Amtes für geistiges Eigentum:</I> Sollten Teile der Beschreibung mit der im Patent anspruch gegebenen Definition der Erfindung nicht in Einklang stehen, so sei daran erinnert, dass gemäss Art. 51 des Patentgesetzes der Patentanspruch für den sachlichen Geltungsbereich des Patentes massgebend ist.