Zusatzpatent zum Hauptpatent Nr. 423 099 Verfahren zur Herstellung von Ferrichrysin und Desferrichrysin Im Hauptpatent Nr. 423 099 ist ein Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung der neuen Wuchsstoffe Ferri- chrysin und Desferrichrysin beschrieben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Aspergillus-Stamm, nämlich Aspergillus melleus M 2853, züchtet.
Es wurde nun gefunden, dass man die genannten Wuchsstoffe auch erhält, wenn man den Stamm Asper- gillus M 4785 züchtet. Gegenstand des vorliegenden Zu satzpatentes ist daher ein Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von Ferrichrysin und Desferrichrysin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Stamm Asper- gillus M 4785 züchtet.
Der Stamm Aspergillus M 4785 wurde in Zürich aus der Erde isoliert. Er wird in unseren Laboratorien und in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spe zielle Botanik, Zürich, unter der angegebenen Bezeich nung aufbewahrt. Bei der Züchtung auf Malzextrakt Agar zeichnet sich der Stamm aus durch ein vegetatives Mycel aus septierten und verzweigten Hyphen, aus deren Fusszellen Konidienträger in Form von rundlich ange schwollenen Köpfchen herauswachsen.
Die Köpfchen tragen in dichter Anordnung fertile Zellen, Sterigmen, aus denen in unverzweigten Ketten die Konidien durch Querwandbildung abgeschnürt werden. Dadurch ist der Stamm eindeutig als zur Gattung Aspergillus Michel! 1729 (vgl. Thom et Church, The Aspergillib, Baltimore 1926) gehörend gekennzeichnet.
Die Züchtung erfolgt z. B. in wässriger, eine Koh- lenstoffquelle, stickstoffhaltige Verbindungen sowie an organische Salze enthaltender Nährlösung, aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur, oder vor zugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwi schen 18 und 40 C, vorzugsweise 27 C. Eine wesent liche Sideramin-Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 4 bis 8 Tagen.
Die Nährlösung enthält als Kohlenstoffquelle z. B. Kohlenhydrate, wie Glukose, Saccharose, Laktose, Stärke, Alkohole, wie Mannit oder Glycerin. Als stick- stoffhaltige Nährstoffe seien genannt Aminosäuren, z. B.
Ornithin, Peptide, Proteine und deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais oder Weizen, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Hefe, Samen, insbesondere der Raps- und Sojapflanze, der Baumwollpflanze, Ammoniumsalze und Nitrate.
Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung bei spielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate, Nitrate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Zink oder Mangan sowie Spuren von Eisensalzen ( < 10-7 Mol/Liter) ent halten.
Die Ferrichrysin-Aktivität kann mikrobiologisch mit tels des abgewandelten Bonifas-Testes (vgl. Zähner et a1., Arch. Mikrobio. 36, 325 ff [1960]) bestimmt wer den. Als Testlösung verwendet man eine Ferrimycin- lösung von 0,01 mg/ml Gehalt, als Teststamm Staphy- lococcus aureus.
Man kann auch optisch die Ferrichrysin-Konzentra- tion der Kulturlösung feststellen. Zu diesem Zweck wer den 5 ml Kulturflüssigkeit mit 1,5g Natriumchlorid, 1 ml 0,1o/oiger Ferrisulfatlösung und 5 ml Benzylalkohol 5 Minuten geschüttelt, abzentrifugiert, die organische Phase filtriert und die Extinktion der organischen Phase bei 410 mg bestimmt.
Als Vergleichsprobe dient ein auf gleiche Weise her gestellter Extrakt aus unbeimpfter Nährlösung.
Nach 4 bis 8 Tagen erreichen die Kulturen eine Aktivität, die 300-400 mg reinem Ferrichrysin ent spricht.
Zur Kultur gibt man nach Beendigung der Züchtung pro Liter 1 g Ferrichlorid, wenn Ferrichrysin isoliert werden soll, nicht aber wenn das eisenfreie Desferri- chrysin gewonnen werden soll. Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Ferri- chrysins im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen davon am Mycel haften. Es ist daher vorteilhaft, dieses gut auszuwaschen. Dazu eignen sich beispielsweise Wasser oder wässrige Alko hole, wie wässriges Methanol.
Für die Isolierung von Ferrichrysin aus dem Kultur filtrat kann man nach an sich bekannten Methoden vor gehen, insbesondere nach dem im Hauptpatent 423 099 angegebenen Methoden.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen be schrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden an gegeben.
<I>Beispiel 1</I> Der Stamm Aspergillus M 4785 wird in gut belüf teter Submerskultur bei 27 C gezüchtet. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Glucose, 5 g L-Asparagin, 1 g sek.-Kaliumphosphat, 1 g kristallisiertes Magnesiumphosphat (MgS04, 7 H.0) und 0,5 g Calciumchlorid enthält. Der Gehalt des Leitungs wassers an Eisen beträgt 20-30 ;,/Liter. Die Nährlösung wird 20 Minuten bei l20 sterilisiert.
Geimpft wird mit einer Sporensuspension, die 150-180 Millionen Sporen pro Liter enthält.
Nach 4 bis 8 Tagen wird den Kulturen 1 g Ferri- chlorid pro Liter zugesetzt und unter Zusatz von 2 0/0 Celit filtriert. Dem Kulturfiltrat werden nun pro Liter 300g Natriumchlorid zugefügt und die klare Lösung dreimal mit 1/1o Volumen Benzylalkohol extrahiert. Die organische Phase wird mit Natriumsulfat getrocknet und mit 3 Volumen Äther versetzt. Das Benzylalkohol-Äther- gemisch extrahiert man mit einer kleinen Menge destil liertem Wasser, bis die wässrige Phase nur noch blass rot gefärbt ist.
Der wässrige Auszug wird lyophilisiert, wobei ein rotes Pulver anfällt in einer Ausbeute von 300-400 mg/Liter, enthaltend 80 % der Aktivität des Ausgangsmaterials.
18,9 g rohes Ferrichrysin-Gemisch werden einer Craig-Verteilung über 95 Stufen unterzogen, wobei die Substanz in die ersten 7 Gläser einer automa"ischen Ver teilungsapparatur (Glasinhalt 25 ml pro Phase) einge füllt wird. Als Verteilungs-System dient ein Gemisch aus Benzylalkohol, n-Butylalkohol, gesättigte wässrige Na triumchloridlösung und 0,001-n. wässrige Salzsäure im Volumenverhältnis 9:9:5:15.
Der rotbraune Farbstoff wird im wesentlichen in eine Haupt- und eine Nebenkomponente aufgetrennt, die in den Fraktionen 46 bzw. 75 ihre Verteilungsmaxima haben. Dies entspricht ungefähren Verteilungskoeffizien ten von K1 = 0,9 bzw. K2 = 3,8.
Die Fraktionen 36-60 werden zusammengefasst, mit dem doppelten Volumen Äther versetzt und die wässrige Phase abgetrennt. Die organische Schicht wird noch drei mal mit etwas Wasser ausgeschüttelt, die vereinigten wässrigen Auszüge mit Natriumchlorid etwa halb ge sättigt und mehrmals mit Phenol-Chloroform (1 kg Phenol auf 1 Liter Chloroform) ausgeschüttelt. Die Ex trakte werden mit halbgesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die zunächst trübe Lösung wird an einer kurzen Celit-Säule geklärt, dann mit dem doppelten Vo lumen Äther verdünnt und mehrmals mit wenig Wasser ausgeschüttelt, wobei der braunrote Farbstoff wieder in die wässrige Phase geht.
Die mehrmals mit Äther gewaschenen wässrigen Auszüge werden im Vakuum eingedampft und der Rück stand getrocknet. Man erhält 8,2 g gereinigtes Ferri- chrysin. Für die Kristallisation werden 16 g eines sol chen Eindampfrückstandes in etwa 200 ml heissem ab solutem Äthylalkohol (über Natrium destilliert) gelöst. Die Kristallisation setzt rasch ein und es fallen<B>11,6</B> g kristallines Ferrichrysin in Form rotbrauner Stäbchen aus. Die Mutterlaugen werden zur Trockene eingedampft und wieder in absolutem Alkohol gelöst. Man erhält so nochmals 0,9g Kristalle.
Zur Analyse wird eine Probe nochmals aus absolu tem Alkohol umkristallisiert. Die rotbraunen Stäbchen werden bei 270 schwarz ohne zu schmelzen. Das Pro dukt ist mit dem im Hauptpatent Nr. 423 099 beschrie benen Produkt identisch.
<I>Beispiel 2</I> Aspergillus M 4785 wird nach dem Submersverfah- ren in einer Nährlösung gezüchtet, die pro Liter Lei tungswasser 20 g Glucose, 5 g L-Asparagin, 1 g sekun däres Kaliumphosphat, 1 g kristallines Magnesiumphos- phat (MgSO" 7 H.0) und 0,5 g Calciumchlorid enthält. Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder Fermen- tern 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert.
Dann be- impft man mit einer Sporensuspension wie in Beispiel 1. Man inkubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 27 , wobei die Kulturen in den Fermentern mit etwa 2 Volumen Luft je Volumen Lösung pro Minute be lüftet werden. Nach etwa 96 Stunden Bebrütung hat die Kulturlösung den höchsten Gehalt an Desferrichrysin erreicht. Dieser wird mittels des Antisideromycin-Testes bestimmt. Da die Nährlösung kleine Mengen Eisen ent hält, liegt das gebildete Desferrichrysin teilweise in Form seines Eisen-Komplexes vor.
340 Liter aktive Kulturbrühe von Aspergillus M 4785 werden mit 85 g 8-Oxychinolin, gelöst in 1,6 Liter Me:hanol, versetzt. Nach einer Stunde wird unter Zusatz von 2 % Hyflo-Supercel als Filterhilfsmittel das Mycel abfiltriert. Das Filtrat wird zur Entfernung von über schüssigem 8-Oxychinolin durch eine Säure mit 5 Liter Amberlite I.R.-45, OH--Form,
perkoliert. Das pH des Perkolates wird durch Zusatz von Salzsäure auf 7,5 ge stellt. Die so erhaltene aktive Kulturlösung wird an- schliessend mit Natriumchlorid gesättigt und mit Benzyl- alkohol extrahiert. Nach dem Eindampfen der Extrakte erhält man das Desferrichrysin in Form eines gelblichen Pulvers. Es ist identisch mit dem im Hauptpatent Nr. 423 099 beschriebenen Produkt.
Additional patent to main patent no. 423 099 Process for the production of ferrichrysin and desferrichrysin Main patent no. 423 099 describes a process for the simultaneous production of the new growth substances ferric chrysin and desferrichrysin, which is characterized in that an Aspergillus strain, namely Aspergillus melleus M 2853, breeds.
It has now been found that the growth substances mentioned are also obtained when the Aspergillus M 4785 strain is bred. The subject of the present additional patent is therefore a process for the simultaneous production of ferrichrysin and desferrichrysin, which is characterized in that the strain Aspergillus M 4785 is grown.
The Aspergillus M 4785 strain was isolated from the earth in Zurich. It is stored in our laboratories and at the Swiss Federal Institute of Technology, Institute for Special Botany, Zurich, under the name given. When cultivated on malt extract agar, the strain is characterized by a vegetative mycelium made up of septate and branched hyphae, from whose foot cells conidiophores grow out of round, swollen heads.
The heads carry fertile cells, sterigms, in a dense arrangement, from which the conidia are tied off in unbranched chains by the formation of transverse walls. As a result, the strain is clearly classified as belonging to the genus Aspergillus Michel! 1729 (cf. Thom et Church, The Aspergillib, Baltimore 1926).
The breeding takes place z. B. in aqueous, a carbon source, nitrogen-containing compounds as well as nutrient solution containing organic salts, aerobically, for example in resting surface culture, or preferably submerged with shaking or stirring with air or oxygen in shaker bottles or the known fermenters. A suitable temperature is between 18 and 40 C, preferably 27 C. The nutrient solution generally shows a substantial sideramine effect after 4 to 8 days.
The nutrient solution contains z. B. carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, starch, alcohols such as mannitol or glycerin. Nitrogen-containing nutrients that may be mentioned are amino acids, e.g. B.
Ornithine, peptides, proteins and their breakdown products such as peptone or tryptone, meat extracts, water-soluble components of cereal grains such as maize or wheat, distillation residues from alcohol production, yeast, seeds, in particular from the rapeseed and soy plants, the cotton plant, ammonium salts and nitrates.
The nutrient solution can contain other inorganic salts, for example chlorides, carbonates, sulfates, nitrates of alkalis, alkaline earths, magnesium, zinc or manganese and traces of iron salts (<10-7 mol / liter).
The ferrichrysin activity can be determined microbiologically by means of the modified Bonifas test (cf. Zahner et al., Arch. Mikrobio. 36, 325 ff [1960]). A ferrimycin solution with a content of 0.01 mg / ml is used as the test solution, and Staphylococcus aureus as the test strain.
The ferric chrysin concentration of the culture solution can also be determined optically. For this purpose, the 5 ml culture liquid with 1.5 g sodium chloride, 1 ml 0.1% ferric sulfate solution and 5 ml benzyl alcohol shaken for 5 minutes, centrifuged, the organic phase filtered and the absorbance of the organic phase determined at 410 mg.
An extract prepared in the same way from uninoculated nutrient solution is used as a comparison sample.
After 4 to 8 days, the cultures reach an activity equivalent to 300-400 mg pure ferrichrysin.
When the cultivation is complete, 1 g of ferric chloride per liter is added to the culture if ferric chrysin is to be isolated, but not if the iron-free desferric chrysin is to be obtained. The mycelium is separated from the culture filtrate, after which the majority of the ferricchrysin is found in the culture filtrate. Nevertheless, significant amounts of it stick to the mycelium. It is therefore advantageous to wash it off well. For example, water or aqueous alcohols, such as aqueous methanol, are suitable for this purpose.
For the isolation of ferrichrysin from the culture filtrate, one can proceed according to methods known per se, in particular according to the methods given in the main patent 423 099.
The invention is described in the following examples. The temperatures are given in degrees Celsius.
<I> Example 1 </I> The Aspergillus M 4785 strain is grown in a well-ventilated submerged culture at 27 ° C. A nutrient solution is used which contains 20 g of glucose, 5 g of L-asparagine, 1 g of secondary potassium phosphate, 1 g of crystallized magnesium phosphate (MgS04, 7H.0) and 0.5 g of calcium chloride per liter of tap water. The iron content of the tap water is 20-30 per liter. The nutrient solution is sterilized at 120 for 20 minutes.
It is vaccinated with a spore suspension containing 150-180 million spores per liter.
After 4 to 8 days, 1 g of ferric chloride per liter is added to the cultures and filtered with the addition of 2% Celite. 300 g of sodium chloride per liter are then added to the culture filtrate and the clear solution is extracted three times with 1/10 volume of benzyl alcohol. The organic phase is dried with sodium sulfate and mixed with 3 volumes of ether. The benzyl alcohol-ether mixture is extracted with a small amount of distilled water until the aqueous phase is only pale red in color.
The aqueous extract is lyophilized, a red powder being obtained in a yield of 300-400 mg / liter, containing 80% of the activity of the starting material.
18.9 g of crude ferrichrysin mixture are subjected to a Craig distribution over 95 levels, the substance being poured into the first 7 glasses of an automatic distribution apparatus (glass content 25 ml per phase). A mixture is used as the distribution system from benzyl alcohol, n-butyl alcohol, saturated aqueous sodium chloride solution and 0.001 normal aqueous hydrochloric acid in a volume ratio of 9: 9: 5: 15.
The red-brown dye is essentially separated into a main and a secondary component, which have their distribution maxima in fractions 46 and 75, respectively. This corresponds to approximate distribution coefficients of K1 = 0.9 and K2 = 3.8.
Fractions 36-60 are pooled, double the volume of ether is added and the aqueous phase is separated off. The organic layer is extracted three times with a little water, the combined aqueous extracts are about half saturated with sodium chloride and extracted several times with phenol-chloroform (1 kg of phenol to 1 liter of chloroform). The extracts are washed with half-saturated sodium chloride solution. The initially cloudy solution is clarified on a short Celite column, then diluted with twice the volume of ether and shaken out several times with a little water, the brownish-red dye going back into the aqueous phase.
The aqueous extracts, washed several times with ether, are evaporated in vacuo and the residue is dried. 8.2 g of purified ferrichrysin are obtained. For the crystallization, 16 g of such a residue from evaporation are dissolved in about 200 ml of hot absolute ethyl alcohol (distilled over sodium). Crystallization sets in quickly and <B> 11.6 </B> g of crystalline ferric chrysin precipitate in the form of red-brown rods. The mother liquors are evaporated to dryness and redissolved in absolute alcohol. This gives another 0.9 g of crystals.
For the analysis, a sample is recrystallized again from absolute alcohol. The red-brown rods turn black at 270 without melting. The product is identical to the product described in main patent no. 423 099.
<I> Example 2 </I> Aspergillus M 4785 is grown according to the submerged method in a nutrient solution which contains 20 g glucose, 5 g L-asparagine, 1 g secondary potassium phosphate, 1 g crystalline magnesium phosphate per liter of tap water (MgSO "7 H.0) and 0.5 g calcium chloride. The nutrient solution is sterilized in the inoculation flask or fermenter for 20 to 30 minutes at 1 atm.
A spore suspension is then inoculated as in Example 1. Incubation is carried out at 27 with good shaking or stirring, the cultures in the fermenters being aerated with about 2 volumes of air per volume of solution per minute. After about 96 hours of incubation, the culture solution has reached the highest content of desferrichrysin. This is determined by means of the antisideromycin test. Since the nutrient solution contains small amounts of iron, the desferrichrysin that is formed is partly in the form of its iron complex.
340 liters of active culture broth from Aspergillus M 4785 are mixed with 85 g of 8-oxyquinoline, dissolved in 1.6 liters of methanol. After one hour, the mycelium is filtered off with the addition of 2% Hyflo-Supercel as a filter aid. The filtrate is used to remove excess 8-oxyquinoline with an acid with 5 liters of Amberlite I.R.-45, OH - Form,
percolated. The pH of the percolate is adjusted to 7.5 by adding hydrochloric acid. The active culture solution obtained in this way is then saturated with sodium chloride and extracted with benzyl alcohol. After evaporation of the extracts, the desferrichrysin is obtained in the form of a yellowish powder. It is identical to the product described in main patent no. 423 099.