Verfahren zur Herstellung von Ferrichrysin und Desferrychrysin Aus Materialien biologischen Ursprungs, insbe- sondere Mikroorganismen, ist bereits eine grössere Anzahl eisenhaltiger Wuchsstoffe isoliert worden, beispielsweise die Ferrichrome, das Coprogen,
die Ferrioxamine.
Es wurde nun gefunden, dass man aus einem neuen Stamm von Aspergillus melleus, nämlich Aspergillus melleus M 2853, einen neuen eisen- haltigen Wuchsstoff, das Ferrichryshn, und die ent sprechende eisenfreie Verbindung, das Desferrichry- sin, gewinnen kann.
Gegenstand des vorliegenden Patents ist daher ein Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von Fenichrysin und Desferrichrysin.
Der Stamm Aspergillus mellvus M 2853 wurde in Zürich aus der Luft isoliert. Er wird in unseren Laboratorien und in der Eidgenössischen Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich,
unter der angegebenen Bezeichnung aufbewahrt. Bei der Züchtung auf Malzextrakt-Agar zeichnet sich der Stamm aus durch ein vegetatives Mycel aus sep- tierten und verzweigten Hyphen, aus deren Fusszellen Konidienträger in Form von rundlich angeschwol lenen Köpfchen herauswachsen.
Die Köpfchen tragen in dichter Anordnung fertile Zellen, Sterigmen, aus denen in unverzweigten Ketten die Konidiien durch Querwandbildung abgeschnürt werden.
Dadurch ist der Stamm eindeutig als zur Gattung Aspergillus Micheli 1729 (vgl. Thom et Church, The Aspergilli , Baltimore 1926) gehörend' gekennzeichnet. Die wei tere Klassifizierung erfolgte nach Thom and Raper, A Manual of the Aspergilli , Baltimore, 1945.
Die Feststellung der Gruppenzugehörigkeit kann ent weder anhand' von Farbmerkmalen oder anhand morphologischer Kriterien vorgenommen werden. Beide Wege ergeben die Zugehörigkeit von Stamm M 2853 zur Aspergillus ochraceus-Gruppe. Innerhalb der A.
ochraceus-Gruppe erfolgt die Zuordnung vor allem auf Grund der Farbe des sporulierenden Mycels, der Ausbildung der Sklerotien und der Konidien- form. Durch die gelbliche Farbe der Konidien- köpfchen, das spärliche Auftreten von Sklerotien und die glatten,
rundlichen Konidhen ist der Stamm M 2853 all Aspergillus melleus charakterisiert.
Ferrichrysin ist eine rotbraune, kristalline Sub stanz, die in Wasser und Methanol, auch in der Kälte, gut löslich und schwer löslich ist in absolutem Äthanol. Die Verbindung hat die: Elementarzusam mensetzung C = 43,37 %; H = 6,08 %; N = 16,72 %; Fe = 7,09 %; O = 26,74 % (her.). Das UV-Spektrum in Wasser zeigt ein Maximum bei. 415 mu (10 g E i @m gleich 1,48).
Das IR-Spcktrum in Kaliumbromid weist u. a. Banden auf bei 725, 783, 975, 1060, 1140, 1200 (Schulter), 1218 (Schulter), 1237, 1275 (Schulter), 1340 (Schulter), 1368, 1430 (Schulter), 1445 (Schulter), 1465, 1495 (Schulter), 1517, 1585, 1652, 2930, 3070 (Schulter). 3420 cm-1, vgl. Fig. 1.
Die Kristalle zersetzen sich bei etwa 270 C unter Schwarzfärbung, ohne zu schmelzen. Im Papier- chromatogramm werden folgende Rf-Werte erhalten: 0,26 im System I (n-Butanol-EisessigWasser, 4 : 1 : 1) und 0,34 hm System II (tart.-Butanol-0,004-n. Salz- säure-gesättigte wässrige Natriumchloridlösung 2:1:1;
Papier imprägniert mit Aceton-Wasser-ge- sättigte wässrige Natriumchlbridlösung 6:3: 1).
Bei der sauren Hydrolyse des Ferrnchrysins ent stehen 3 Mol Essigsäure; Bernsteinsäure: und 1 Amino-5-hydroxyl-amino-pentan, die wesentliche Be= standheile der Ferrioxamine darstellen, sind im Hy- drolysegemisch des Ferrichrysins nicht nachweisbar.
Bei der Behandlung des Ferrichrysins mit Basen oder Säuren oder mit Eisenkomplex bildenden Stof fen, wie 8-Hydroxy-chinolin, wird das Eisen aus dem Mölekül entfernt, wobei ein farbloses Pulver, das Desfernehrysin, gebildet wird.
Es ist gut löslich in Wasser, Methanol, Äthanol, schwerer in Butanol, fast unlöslich in Aceton, Chloroform und llipophiIen Lösungsmitteln. Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C 46,36 %; H 6,98 %; N 15,65 %; O 31,01 (bei.), was einer Summenformel C29H49N9014 ent spricht.
Das UV-Spektrum ist nicht besonders cha- rakteristisch und zeigt lediglich Endabsorption bei 214 mu. Im IR-Spektrum (aufgenommen in Kaläum- bromid.)sind Banden u. a.
bei 2,94 l#"3,43 ,u, 6,10,u, 6,537,04,u, <I>7,32</I> ,u, 8,10 u, 8,30,u, 8,62 ,u, 9,60,u und 10,14 ,
u erkennbar. Wenn man Desfer- richrysin mit 6n Salzsäure hydrolysiert und die Hydrolyseprodukte (zwecks Reduktion gegebenen falls vorhandener Hydroxylaminogruppen) katalytisch hydriert, erhält man drei ninhyd\nin-positive Pro- dukte, die mit Phenol-Wasser (4:
1) als Fliessmittel im Papierchromatogramm folgende Rf Werte auf weisen: 0,21; 0,30 und 0,38. Die Untersuchung nach der Methode von Moore und Stein zeigt, dass es sich um Ornithin, Serin und Glycin im molekularen Ver- hältnis <B>3:</B> 2: 1 handelt. Wird das saure Hydrolyse- prod'ukt ohne, nachfolgende katalytische Hydrierung direkt untersucht, so ist kein Ornithin nachweisbar.
Im Ferrichrysin sind allem nach die Amino- säuren Glycin (1 Mol), Serin (2 Mol) und d-Hydroxy- ornithin (3 Mol) zu einem cyclischen Peptid ver bunden.
Das Hydroxyornithin äst N(b)-aoetyüert; an die so gebildeten 3 Hydroxamsäurereste ist das Eisen komplex gebunden. Die Gesarntformel des eisenfreien Ferri'chrysüns ist demnach Tri-(N acetyl)-cyclo-[gly- cyl-(seryll)2-(d-hydroxyornit@hyl)3].
Aus Desferrichryssn wird bei Zusatz von Eisen- chloiid bei neutralem pH das Ferrichrysin zurück- erhalten.
Ferrichrysin ist ein Wuchsstoff für verschiedene Mikroorganismen und kann daher gegebenenfalls bei der Kultur solcher Organismen verwendet werden.
Die folgende Tabelle zeigt das relative Wachstum von Mikrobaeterium lacticum Stamm ATCC 8181, gemessen an der Extinktion der Kultur, bei Zusatz verschiedener Mengen von Ferrichrysin zum Kultur medium:
EMI0002.0109
Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Ferrichrysin <SEP> in <SEP> y/Liter
<tb> 0 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 31,6 <SEP> 100
<tb> 22 <SEP> 0,177 <SEP> 0,230 <SEP> 0,362 <SEP> 0,459 <SEP> 0,319
<tb> 25 <SEP> 0,222 <SEP> 0,280 <SEP> 0,512 <SEP> 0,802 <SEP> 0,644
<tb> 28 <SEP> 0,244 <SEP> 0,330 <SEP> 0,598 <SEP> 0,941 <SEP> 0,974
<tb> 31 <SEP> 0,249 <SEP> 0,342 <SEP> 0,645 <SEP> 1,040 <SEP> 1,115
<tb> 46 <SEP> 0,257 <SEP> 0,359 <SEP> 0,788 <SEP> 1,346 <SEP> 1,503 Ferrichrysin besitzt antianämische Eigenschaften und kann dementsprechend als Heilmittel in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden.
Auch Desferrichrysin hat wertvolle pharmakologische Eigenschaften. So verhindert es die Ablagerung eisen- haltigar Pigmente im Gewebe bzw. bewirkt in Fällen von pathologischer Eisenablagerung im Organismus eine Ausscheidung des Eisens, z.
B. bei Hämochro- matose und Hämosiderose. Es kann. dementsprechend in der Human- und Veterinär-Heilkunde verwendet werden.
Wie andere Sideramine ist auch Ferrichrysin imstande, die antibakterielle Wirkung von Anti biotika, die der Gruppe der Sideromycine angehören, gegenüber grampositiven Erregern kompetitiv auf zuheben (Antisideromycin-Wirkung).
Hinsichtlich der genannten biologischen Wirkun gen zeigt das Ferrichrysin gewisse Ähnlichkeiten mit anderen Sideraminen, wie z.
B. den Ferrioxaminen, den Ferrichromen und: dem Copro.gen. Hingegen unterscheidet es sich in seinen physikalisch-chemi- schen Eigenschaften von dieser Substanz in, charak teristischer Weise, was im folgenden illustriert wird.
1. Von den Ferrioxaminen, die von Actinomy- e ztenstämmen produziert werden, unterscheidet sich das Ferrichrysin nicht nur an den Hydrolyseproduk- ten, wie oben erwähnt,
sondern auch in seinen spek- troskopischen Eigenschaften. So ist sein IR-Spektrum von dem der Ferrioxamine in wesentlichen Punkten verschieden und das Maximum des UV-Spektrums liegt beim Ferrichrysin kurzwelliger (etwa 415 bis 420 mu) als beiden Ferrioxaminen (etwa 430 mrc).
2. Feerichrom, das durch Züchtung von Usti1!ago sphaerogena hergestellt werden kann, unterscheidet sich spektroskopisch nur wenig vom Ferrichrysin. Im. IR-Spektrum zeigt Ferrichrom ein mittelstarkes Maximum bei 1275 cm-1, das beim Ferrichrysin nur als schwache Schulter erscheint.
Anstelle einer breiten Bande bei 1060 cm-1 beim Ferrichrysin sind bei Fernchrom zwei gut getrennte Maxima bei 1025 und 1068 cm-1 vorhanden.
Im NMR-Spektrum weist das. Desferrichrysin ein breites Maximum bei 4,00 ppm und eine breite Anhäufung von Banden im Bereich von 4,2-5,1 ppm mit Maxima bei 4,33; 4,83 und 5,00 ppm auf, während das. eisenfreie Ferrichrom in diesem Gebiet Maxima bei 4,33; 4,52 (Schulter) und 4,74 ppm zeigt.
In der Lös lichkeit unterscheiden sich Ferrichrysin und Ferri- chrom hingegen deutlich: Ferrichrom ist im Gegen satz zum Ferrichrysin in kaltem Methanol fast un- RTI ID="0002.0228" WI="11" HE="4"LX="1130" LY="2514"> 4bsläch, es löst sich erst beim längeren Kochen in der etwa 1000fachen Menge Methanol.
Auch die Hydrolyseprodukte sind verschieden. Eisenfreies Ferrichrom, mit 6 n Salzsäure hydrolysiert und katalytisch hydriert, liefert nicht drei, sondern nur zwei ninhyd:rin-positive Produkte, nämlich Glycin und Ornithin. Auch im Papierchromatogramm sind Unterschiede vorhanden: Fernichrom hat in den Systemen I und II die Rf-Werte 0,19 bzw. 0,25.
3. Fernchrom A, ein Begleiter des Ferrichroms, weist im Gegensatz zu Ferrichrysin keine nennens werte antagonistisch-, Wirkung gegenüber Ferrimycin auf. Bei der Hydrolyse liefert es nicht 3 Mol Essig- säure, sondern 3 Mal f-Methyl-gl'utaconsäure. Im Papierchromatogramm in den Systemen I und II zeigt Ferrichrom A R f-Werte von 0,12 bzw.
0,18, und wandert demnach etwa halb so weit wie Ferri- chrysin. Schliesslich verhält sich Ferrichrom A bei der Craig-Verteilung anders als Ferrichrysin: Im System Benzylalkohol-n-Butanol-gesättigte wüssrige Natriumchlorid'lö,sung-0,001-n wässrige Saltzsäure 9 :9 :<B><I>5:
</I></B> 15 über 95 Stufen reichert es sich in den Stufen 3-15 an, während Ferrichrysin in den Frak tionen 36-60 erscheint.
4. Von Coprogen sind weder das IR-Spektrum noch Hydrolyseprodukte bekannt. Die Elementar- zusammensetzung ist jedoch deutlich von derjenigen des Ferrichrysäns verschieden; für Coprogen ist an gegeben: C = 50,9 %; H = 6,9 %; N = 10,2 %; Fe = 6,7 %. Coprogen zersetzt sich bereits bei 205 C. Im Papierchromatogramm zeigt Coprogen die Rf-Werte 0,43 (System 1) und 0,55 (System 1I).
Das Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von Ferrichrysin und Desferrächrysän ist dadurch gekenn zeichnet, d'ass man einen die Eigenschaften von Asper- gillus melleus M 2853 aufweisenden Aspergillus- Stamm züchtet. Die Züchtung erfolgt z.
B. in wäss riger, eine Kohlenstoffquelle, stickstoffhaltige Verbin dungen sowie anorganische Salze enthaltender Nähr lösung, aerob, also beispielsweise in ruhender Ober flächenkultur, oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40 C, vorzugsweise 27 C.
Eine wesentliche Sider- amin-Wärkung zeigt die Nährlösung dabei im all gemeinen nach 4-8 Tagen.
Die Nährlösung enthält als Kohlenstoffquelle z. B. Kohlenhydrate, wie Glukose, Saccharose, Lak- tose, Stärke, Alkohole, wie Mannit oder Glycerin. A% stickstoffhaltige Nährstoffe seien genannt Amino- säuren, z.
B. Ornithin, Peptide, Proteine und deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton, Fleisch extrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais oder Weizen, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Hefe, Samen, insbesondere der Raps- und Sojapflanze, der Baumwollpflanze, Am- moniumsalze und Nitrate.
Von anderen anorgani schen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate, Nitrate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Zink oder Mangan sowie Spuren von Eisensalzen ( < 10-7 MolVLiter) enthalten.
Die Ferrichrysin-Aktivität kann mikrobiologisch rm ttdls des abgewandelten Bonifas-Testes (vgl. Zähner et a1., Arch. Mikrobiol. <I>36,</I> 325 ff [1960]) bestimmt werden.
Als Testlösung verwendet man .eine Ferri- mycinlösung von 0,01 mg/ml Gehalt, als Teststamm Staphylococcus aureus.
Man kann auch optisch die Ferrichrysin-Konzen- tration der Kulturlösung feststellen. Zu diesem Zweck werden 5 ml Kulturflüssigkeit mit 1,5g Natrium- chlorid, 1 ml 0,1 % iger Ferrvsulfatlösung und 5 ml Benzylalkohol 5 Minuten geschüttelt, abzentrifugiert,
die organische Phase filtriert und die Extinktion der organischen Phase bei 410 m,u bestimmt.
Als Vergleichsprobe dient ein auf gleiche Weise hergestekter Extrakt aus unbeimpfter Nährlösung. Nach 4-8 Tagen erreichen die Kulturen eine Aktivität, die 300-400 mg reinem Ferrichrysin ent spricht.
Zur Kultur gibt man nach Beendigung der Züch tung pro Liter 1 g Ferrichlorid, wenn Ferrichrysin isoliert werden soll, nicht aber wenn das eisenfreie Desferrichrysin gewonnen werden, soll. Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab; wonach die Haupt menge des Sideramins im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen davon am Mycell haften. Es ist daher vorteilhaft, dieses gut auszuwaschen.
Dazu eignen sich beispielsweise Was ser oder wässrige Alkohole, wie wässriges Methanol.
Für die Isolierung von Ferrichrysin aus dem Kulturfiltrat kann man nach an sich bekannten Me thoden vorgehen und z. B. eine der nachfolgend' an gegebenen Arbeitsweisen oder Kombinationen davon anwenden.
1. Man kann Adsorption@smättel verwenden, z. B. Aktivkohlen, wie Norit , aktivierte Erden, wie Frankonit , Fullererde oder Floridin , oder Harz adsorber, wie Asmit . Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmässig mit Gemischen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln m'it Wasser, z.
B. mit Wasser-Methanol-, Wasser-Pyridin-, ver dünnte Essigsäure-Methanol- oder Wasser-Methanol- Eisessig-Butanol-Gemischen. Als besonders vorteil haft für die El'ution eines Frankonit - oder Norit - Adsorbates hat sich das Gemisch von Wasser (4 Vo- llumteile) und Pyridin (1 Volumteil erwiesen.
2. Weiter kann das Ferrichrysin einer wässrigen Lösung mittels organischen Lösungsmitteln entzogen werden. Für diese Extraktionsverfahren haben sich höhere organische Alkohole, z. B. Benzylalkohol oder Isopropylalkohol, besonders bewährt. Zweckmässiger weise wird dabei der wässrigen Phase ein anorgani sches Salz, z. B. Ammoniumsulfat oder Natrium- chlofüd, zugesetzt.
Aus den erhaltenen organischen Extrakten kann das Ferrichrysin entweder durch RTI ID="0003.0219" WI="18" HE="4" LX="1058" LY="2364"> Abdampfen des- Lösungsmittels oder durch Ausfällung mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels, z. B. Äther, Petraläther oder Äthylacetat, in ange- reicherter Form erhalten werden.
3. Eine weitere Methode der Anreicherung des Ferrichrysins besteht darin, dass man es zwischen einer wässrigen Lösung und einer Lösung von Phenol in Chloroform verteilt, wobei der Phenolgehalt der Chloroformlösung variiert werden kann.
4. Eine andere Methode zur Anreicherung und/ oder Auftrennung des Ferrichrysins stellt die Chro- matographie dar, wie Adsorptionschromatographie an verschiedenen Materialien, z.
B. an Norit , Alu miniumoxyd, Magnesiumsilikaten, Silncageln>, Cal ciumsulfat sowie Verteilungschromatographie mit Cellulose, Stärke, Silicagel , Celite und der gleichen als Trägersubstanzen, oder aber Chromato- graphie an Ionenaustauscherharzen, z. B. an Dowex- 50 , Amberhte IRC-50 und dergleichen.
5. Weiter kann Ferrichrysin durch Gegenstrom- verteilung nach Craig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmittelphasen angereichert werden. Folgendes Lösungsmittelsystem hat sich dabei, besonders be währt: n-Butanol-Benzylalkohol-0,001-n. Salzsäure- wässrige, bei 19 gesättigte Natriumchlorndlösung (9:9:15:5).
Desferrichrysin wird neben Ferrichrysin von Aspergillus melTeüs M 2853 gebin!det und\ kann daher auch direkt aus dem Kulturfiltrat isoliert werden. Vorteilhaft entfernt man bei der Isolierung im Kultur- filtrat vorhandenes Eisen, beispielsweise durch Zu satz Eisenkomplex bildender Stoffe, z.
B. 8-Oxy- chinoa oder Äthylendiamin tetraessigsäure.
Man kann die Eisenkomplex bildenden Stoffe direkt nach Beendigung der Fermentation der Kultur- brühe zusetzen. Vorteilhaft erfolgt der Zusatz in einem späteren Stadium der Aufarbeitung, um all- fällige durch die benützten Agenzien eingeschleppte Eisen (III)-ionen ebenfalls zu entfernen.
Die Isolierung des Desferrichrysins aus der Kul turlösung erfolgt z. B. nach den für die Isolierung von Ferrichrysin erwähnten Methoden.
Die Temperaturen sind in den folgenden Bei spielen in. Celsiusgraden angegeben. <I>Beispiel 1</I> Der Stamm Aspergillus melleus M 2853 wird in gut belüfteter Submerskultur bei 27 gezüchtet. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungs wasser 20 g Glucose, 5 g L-Asparagiu, 1 g sek.
Kalumphosphat, 1 g krist. Magnesiumphosphat (M9S04; 7H20) und 0,5 g Calciumchlbrid enthält. Der Gehalt des Leitungswassers an Eisen beträgt 20-30 y/Liter. Die Nährlösung wird 20 Minuten bei 120 sterilisiert. Geimpft wird mit einer Sporen suspension, die 150-180 Millionen Sporen pro Liter enthält.
Nach 4-8 Tagen wird den Kulturen 1 g Ferri- chlorid pro Liter zugesetzt und unter Zusatz von 2 Celit fifriert. Dem Kulturfiltrat werden nun pro Liter 300g Natriumchlomd zugefügt und die bare Lösung dreimal mit 1/10 Volumen Benzylalkohol extrahiert. Die organische Phase wird mit Natrium sulfat getrocknet und mit 3 Volumen Äther versetzt.
Das Benzylalkohol-Äthergemisch extrahiert man mit einer klicinen Menge destilliertem Wasser, bis die wässrige Phase nur noch bloss rot gefäbt ist. Der wässrige Auszug wird lyophilisiert, wobei ein rotes Pulver anfällt, in einer Ausbeute von 300-4.00 mg/ Liter, enthaltend<B>80%</B> der Aktivität des Ausgangs- materials.
18,9 g rohes Ferrichrysin-Gemisch werden einer Craig Verteilung über 95 Stufen unterzogen, wobei die Substanz in die ersten 7 Gläser einer automati schen Verteilungsapparatur (Glasinhalt 25 ml pro Phase) eingefüllt wird.
Als Verteilungs-System dient ein Gemisch aus Benzylalkohol, n-Butylalkohal, ge sättigte wässriger Natriumchloridlösung und 0,001 n wässrige Salzsäure im Volumenverhältnis 9 : 9 : 5 : 15.
Der rotbraune Farbstoff wird im wesentlichen in eine Haupt- und -eine Nebenkomponente aufgetrennt, die in den Fraktionen 46 bzw. 75 ihre Verteilungs maxima haben. Dies entspricht ungefähren Ver teilungskoeffizienten von K1 = 0,9 bzw. K2 = 3,8.
Die Fraktionen 36-60 werden zusammengefasst, mit dem doppelten Volumen Äther versetzt und die wässrvge Phase abgetrennt. Die organische Schicht wird noch dreimal mit etwas Wasser ausgeschüttelt, die vereinigten wässrigen Auszüge mit Natrium.- chlorid etwa halb gesättigt und mehrmals mit Phenol- Chloroform (1 kg Phenol auf 1 Liter Chloroform) ausgeschüttelt.
Die Extrakte werden mit halbgesättig- ter Natriumchloridlösung gewaschen. Die zunächst trübe Lösung wird an einer kurzen Celit -Säule geklärt, dann mit dem doppelfiten Volumen Äther verdünnt und mehrmals mit wenig Wasser ausgeschüt telt, wobei der braunrote Farbstoff wieder in die wässrige Phase geht.
Die mehrmals mit Äther gewaschenen wässrigen Auszüge werden im Vakuum eingedampft und der Rückstand getrocknet. Man erhält 8,2 g gereinigtes Ferrichrysin. Für die Kristallisation werden 16 g eines solchen Eindampfrückstandes in etwa 200 ml heissem absolutem Äthylalkohol (über Natrium de stilliert) gelöst.
Die Kristallisation setzt rasch ein, und es fallen 11,6 g kristallines Ferrichrysin in Form rot brauner Stäbchen aus. Die Mutterlaugen werden zur Trockene eingedampft und wieder in absolutem Alkohol gelöst. Man erhält so nochmals 0,9g Kri stalle.
Zur Analyse wird eine Probe nochmals aus absolutem Alkohl umkristallisiert. Die rotbraunen Stäbchen werden bei 270 schwarz ohne zu schmelzen.
Analyse: Gef. C 43,37, H 6,08, Fe 7,09, N<B>16,72.</B> Absorptionsspektrum in Wasser: Am"" = 415 mu; 10 g Ei öm = 1,48.
Wenn der Alkohol für die Kristallisation nicht völlig trocken ist, fallen teils amorphe, teils in unregel mässigen Brocken kristallisierende Hydrate aus.
Ferrichrysin ist sowohl in Wasser wie inRTI ID="0004.0221" WI="10" HE="4" LX="1874" LY="2390"> kaltem Methanol gut löslich. Auch in absolutem Äthyl- alkohol lässt sich amorphes Ferrichrysn noch recht gut aufnehmen (bis etwa 5 %). Aus einer solchen Lö sung scheidet sich das Ferrichrysin aber rasch in rotbraunen kurzen Stärbchen ab, die auf der Nutsche kaum verfilzen. Diese Kristalle lösen sich nur noch schwer und nach längerem Erhitzen in absolutem Alkohol auf.
Das IR-Spektrum zeigt u. a. Banden beÄ 725, 783, 975, 1060, 1140, 1200 (Schulter),<B>1218</B> (Schul ter), 1237, 1275 (Schulter), 1340 (Schulter), 1368, 1430 (Schulter), 1445 (Schulter), 1465, 1495 (Schul ter), 1517, 1585, 1652, 2930, 3070 (Schulter), 3420 cm-r, vgl. Fig. 1.
Das Papierchromatogramm ergibt im System I (n-Butanol-Eisessig-Wasser, 4:1:1) den Rf-Wert 0,26, im System II (tert.-Butanol-0,04-n Salzsäure gesättigte wässrige Natriumchloridlösung, 2:1:1, Papier imprägniert mit wässrige Natriumchloridlösung 6: 3: 1) den Rf-Wert 0,34.
25 mg eisenfreies Ferrichrysin werden mit je 1 ml konzentrierter Salzsäure und Wasser 20 Stunden auf 110 erhitzt. Der Eindampfrückstand der Hydro- lyselösung wird in wenig Wasser gelöst und mit 20 ml Feinsprit verdünnt.
Diese Lösung wird in Gegenwart von 20 mg vorhydriertem Pt02 hydriert, um Hy droxylamin- zu Aminogruppen zu reduzieren. Das Hydrierungsprodukt wird nach Moore und Stein untersucht. Es ergibt sich die Anwesenheit der Anfino- säuren Ornithin, Serin und Glycin im molekularen Verhältnis 3:2:1.
<I>Beispiel 2</I> 4 g kristallisiertes Ferrichrysin werden in 100 ml Wasser gelöst, 3 g 8-Hydroxy-chdnolin in 36 nfl Methanol zugefügt und 24 Stunden bei Zimmer temperatur gerührt. Dann wird vom ,schwarzen Nie derschlag abfiltriert und das bloss gelbe Filtrat drei mal mit Chloroform ausgeschüttelt,
um überschüssiges Reagens zu entfernen. Die wässrige Phase wird im Vakuum eingedampft. Man erhält 3,3 g Desferri- chrysin in Form eines fast farblosen Rückstandes.
Das NMR-Spektrum dieser Verbindung in Tri- fluoressigsäure zeigt folgende Signale: 2,07 ppm; breites Maximum entsprechen 4 n Pro tonen; CH2-Gruppen, 2,54 ppm; Sing'ktt entsprechen 3 n Protonen;
Methyl in Acethydroxamsäure-Gruppierungen, 4,00 ppm; breites Maximum entsprechen 2 n Pro tonen, 4,2-5,1 ppm; breite Anhäufung von Banden mit erkennbaren Maxima bei 4,33; 4,83 und 5,00 ppm; total etwa 3 n Protonen, 8,02 ppm; entsprechen etwa 3 n Protonen; pepti- di,sches NH.
Die Zahl n in den obigen Angaben bedeutet wahr- scheinlich 3, entsprechend den wahrscheinlich iden tischen drei Grundeinheiten, aus denen die Molekel aufgebaut ist.
<I>Beispiel 3</I> Aspergillus melleus M 2853 wird nach dem Sub- mersverfahren in einer Nährlösung gezüchtet, die pro Liter Leitungswasser 20 g Glucose, 5 g L-Aspara- gin, 1 g sek. Kaliumphosphat, 1 g krist. Magnesium- phosphat (M9SO4, 7H20) und 0,5g Calciumchlorid enthält.
Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder Fermentern 20-30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Dann beimpft man mit einer Sporensuspension wie in Beispiel 1. Man irrkubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 27 , wobei die Kulturen in den Fer- mentern mit etwa 2 Volumen Luft je Volumen Lösung pro Minute belüftet werden.
Nach etwa 96 Stunden Bebrütung hat die Kulturlösung den höchsten Gehalt an Desferri-Sid eramin M 2853 erreicht. Dieser wird mittels des Antisideromycin-Testes bestimmt. Da die Nährlösung kleine Mengen Eisen enthält, liegt das gebildete Desferrichrysin teilweise in Form seines Eisen-Komplexes vor.
340 Liter aktive Kulturbrühe von Aspergillus melleus M 2853 werden mit 85 g 8-Oxy-chinolin, gelöst in 1,6 Liter Methanol, versetzt.
Nach einer Stunde wird unter Zusatz von 2 % Hyflo-Supercel als Filterhilfsmittel das Mycel abf11triert. Das Filtrat wird zur Entfernug von überschüssigem 8-Oxy-chi- nolin durch eine Säure mit 5 Liter Amberlite IR-45, OH-Form,
perkoliert. Das pH des Perkolates wird durch Zusatz von Salzsäure auf 7,5 gestellt. Die so erhaltene aktive Kulturlösung wird anschlie ssend mit Natriumchlorid gesättigt und mit Benzyl- alkohol extrahiert. Nach dem Eindampfen der Ex trakte erhält man das Desferrichrysin in Form eines gelblichen Pulvers.
70 mg Desferrichrysin werden in 2 ml Methyl- alkohol, gelöst und mit 40 ml kristallisiertem Eisen- chlorid in 2 ml Methylalkohol vermischt. Es entsteht sofort eine tief schwarzviolette Färbung, die auf Zu satz von etwas kristallisiertem Natriumacetat nach orangerot umschlägt.
Diese Lösung wird im Vakuum zur Trockene eingedampft, der Rückstand mit heissem absolutem Alkohol ausgezogen und vom Natrium chlorid abfätriert. Das Filtrat wiM eingedampft, in etwa 0,5 nfl absolutem Alkohol gelöst, filtriert und bei 0 kristallisieren gelassen.
Man erhält 53 mg kristalfsierbes Ferrichrysin, das im Papierchromato- gramm in zwei Lösungsmittelsystemen einheitlich und mit dem ursprünglichen Ferrichrysin identisch ist.
20 mg Ferrichrysin werden in 3 ml 1,2 n Salz säure gelöst und 5 Minuten im kochenden Wasser bad erwärmt. Die anfänglich rotbraune Lösung wird dabei fast farblos. Sie wird im Vakuum zur Trockene eingedampft. Im Rückstand lä,sst sich weder Bern- steinsäure noch 1-Amino-5-hyd'roxylaminopentan nachweisen.
20 mg Ferrichrysin werdenRTI ID="0005.0230" WI="5" HE="4" LX="1570" LY="2157"> mit 20%iger Schwe- felsäure am Rückfluss erhitzt. Die Hydrolyselösung wird unter reduziertem Druck destilliert, wobei man einige Male mit Wasser verdünnt. Das unter guter Kühlung aufgefangene Filtrat,
das die flüchtigen Säuren enthält, wird mittels Natronlauge auf Phenol- phthalain neutralisiert und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Durch Umsetzung des Rückstandes mit p-Phenylphenacylbromid erhält man die p Phenyl- phenacylacetat-Mengen,
die drei Mol Essigsäure ent sprechen.
20 mg Desferrichrysin werden 3 Stunden mit 1 ml 6 n Salzsäure erhitzt und der Eindampfrück- stand, gelöst in 96 % igem Äthanol, in Gegenwart von Platinoxyd-Katalysator (Adams) hydriert. Im Reaktionsprodukt kann man 3 ninhyd'rin-positive Produkte nachweisen,
die im Papiercbromatogramm mit Phenol-Wasser (4: 1) als Fliessmittel folgende Rf- Werte zeigen: 0,21; 0,30 und 0,38.