Verfahren zur HersteHung von Tennecetin Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her stellung eines neuen Antibiotikums,' welches im fol- gendün mit. Tennecc#ti#n bezeichnet wird. Dieses neue Antibiotikum wurde durch Kultivierung einer Art eines bisher unbDkannten, Mikroorganismus er zeugt, welcher aus Erde in Chattanooga, Tennessee, <B>USA,</B> isoliert worden ist.
Die neue Mikroorganisraen- Art gehört zur Gattung der Streptorayces und wird nun mit Streptorayces chattanoogensis bezeichnet. Da,s erfindungsgemässe Verfahren istdadurch gekenn zeichnet, dass eine<B>'</B> Kultur von Streptomyces chatta- noo,gensis kultiviert und das erzeugte Tennecetin. isoliert wird.
Das von diesem Mikroorganismus erhaltene neue Antibiotikum zeigt bei in-vitro-Versuchen fungi- statische und/oder fungizide Wirkung gegen einen weiten Bereich von pathogenen Hefen und Haar pilzen. Es zeigt im allgemeinen geringe Aktivität gegen Bakterien. Tennecetin ist jedoch wirksam gegen Corynebacterium diphteriae und Pseudomonas tabaei (,die Ursache von Wildfeuer [wild-fire] in Tabak).
Es ist wirksam gegen zahlreiche Pillze von Pflanzen krankheiten und ist deshalb nützlich in der Land wirtschaft.
Wie Versuche von intraperitonealen Injektionen an Mäusen ergeben haben, zeigt das neue An,-bbioti- kum relativ geringe Toxizität. Es zeigt nach Inku bation in frisch-cm menschlichem Blut oder frischem menschlichem Blutplasma selbst nach drei Stunden praktisch keine Aktivitätseinbusse. Es ist für die menschlichen Blutzcllen nicht hämolytisch und<U>kann</U> deshalb in der Behandlung von menschlichen und/ odcr tierischen Pilzer-krankungen nützlich sein.
Versuche, das erfindungsgemäss erhaltene Tenne- ectin zu kristalliisierzn, waren erfolglos, und die exakte chemische Zusammensetzung und die Eigen schaften des neuen Antibiotikums sind wegen der Unfähigkeit, das aktive Material in anderer als Rul- verform zu erhalten, nicht vollständig bestimmt wor den. Das neue Material zeigt in wässriger Lösung optische Rechtsdrehung.
Wie weiter unten noch be schrieben wird, weist das neue Antibiotikum die Charakteristiken von Polyenverbindungen auf, und zwar irn besonderen diejenigen von Tetr;aenen, das heisst Verbindungen, welche vier (-CH = CH-)- Gruppen enthalten.
Das neue Antibiotikum ist löslich in Wasser, Methanol, 95 %igem Äthanol, 70,1/oigem Isopro- panol und n-Butanol. Es ist unlöslich in Chloroform, Athylacetat, Amylacetat, Äther und Petroläther. <B>Die</B> Filtration durch Seitzfilter sowohl als auch, das Er hitzen von Tennecetinlösungen (pH <B>7)
</B> auf 10011C führ 20 Minuten bringt keinen erkennbaren Aktivitäts- verlust mit sich. Gekühlte Lösungen bleiben mehr als .einen Monat.aktiv.
Oroshnik, et al. [Science 121, 147<B>(19.55)]</B> hat festgestellt, dass gc##visse Antibiotica zu Gruppen zu- sammengefasst werden können, und zwar auf der Basis ihres Ultraviolettabsorptionsspektrums als Polyene, das heisst als Verbindungen, die mehr als ein Paar von Kohlenstoff-Kohlenstoffdoppelbindun- gen enthalten.
Diese Antiblotica werden hauptsäch lich durch Aet-inomyceten produiiert und zeigen alle Antifungi-Wirkung. Sie können gemäss der durch das Ultraviolettabsorptionsspektrum bestimmten An zahl von solchen ungesättigten Gruppen im Molekül weiter klassifiziert werden. So sind Tetraene, Pentaene, Hexaene und- Heptaene in dieser Gruppe vertreten.
Die Trennung von Antifungi-Anti#biotica auf der Basis ihres Ultraviolettabsorptionsspektrums ist nun allgemein anerkannt [Vini-ng, et al, Antibio-ties Annual (1954-1955), <B>S.</B> 980-987; Waksman, Therapy of Fungus Diseases, Little, Brown, and Co.
<B>(1955), S.</B> 3-121. Tennecetin weist als charakteristisches Glied die Tetraengruppe auf. Sechs andere Stoffe weisen Glie der dieser Gruppe auf, von denen bis jetzt die folgen den bekannt sind: Nystatin (Fungicidin) [Proc. Soc, Exp'tI. Biol. <B> & </B> Med. <B>76, 93 (1951);</B> Britische Patent schrift Nr. <B>714189</B> (1954); Trans.<B>N.</B> Y. Acad. Sei.
<B>19,</B> 447<B>(1957);</B> Rimocidin (Antibiotics <B> & </B> Chemo- therapy <B>1, 287 (1951);</B> Britische Patents.chrift Num mer<B>719878</B> (1954)]; Antimyco-in [Antibiotics <B> & </B> Chemotherapy 2,<B>179</B> (1952)]; Chromin <B>[J.</B> Anti- biotics, Japan, 6B, 247<B>(1953)];
</B> Sistomycosin [Bri tische Patentschrift Nr. <B>712547</B> (1954)]; und Ampho- tericin <B>A</B> [Antibiotics Annual (1955-1956), <B>S.</B> 574 bis<B>578, 579-586</B> und<B>587-591].</B> Neben ihren chaxak- teristischen Ultraviolettabsorptionsspektren haben diese Antibiotica die folgenden gemeinsamen Eigen s ch af ten:
Alle werden durch Arten der Gattung Strepto- myces produziert.
Alle sind wirksam gegen einen weiten Bereich von Pilzen" besitzen jedoch nur geringe oder gar keine Wirkung gegen Bakterien.und Actinomyceten.
Alle sind in nichtpolaren Lösungsmitteln un löslich.
Die Moleküle der genannten Antibiotika enthal ten nur Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und manchmal Stickstoff.
Einige sind lichtempfindlich. Kaliumpermanganat wird entfärbt.
Der FeCI.-Test für Phenolgruppen ist negativ. In konzentrierter Schwefelsäure werden rote bis braune Färbungen erzeugt.
Die WasserlösÜchkeit variiert zwischen den Glie dern der Gruppen.
Anscheinend wird die Löslichkeit in niedrigen Alkoholen gewöhnlich durch die Gegenwart von Wasser erhöht.
Die meisten,scheinen amphoter und optisch aktiv <B>zu</B> sein.
Die einzelnen dieser als Tetraen-Antibiotica bezeichneten Stoffe können auf Grund folgender Merkmale voneinander unterschiedien werden: <B>1.</B> Ultraviolettabsorptionsspektrum. 2. Infrarotabsorptionsspektrum.
<B>3.</B> Biologisches Spektrum. 4. Löslichkeitseigenschaften. <B><I>5.</I></B> Verschiedene, Eigenschaften. <B>6.</B> Papierchromatcqgraph-i#e.
Im folgenden wird jedes der obengenannten Merk male in bezug auf Tennecetin näher betrachtet.
<B><I>1.</I></B> Ultraviolettabsorptionsspektrum Tennecetin zeigt ein AbsoiDptionssprktrum im Ultraviolettbereich mit Maxima bei<B>288, 300-302</B> und<B>315-318</B> Millimikron. Dieses letztere Maximum ist immer scharf, variiert jedoch zwischen<B>315</B> und <B>318</B> mit in den verschiedenen Bestimmungen. Ein solches Absorptionsspektrw-n ist charakteristisch für Polye,nverbindungen im allgemeinen und für Tetraene im besonderen.
Unterhalb<B>288</B> my sind keine Maxima gefunden worden. Nystatin hat ein schwaches,<B>jedoch</B> be <U>stimmtes</U> Maximumbei <B>230</B> mu. Es wird angenom men, dass dies auf ein Diensystem zurückzuführen ist, welches neben dem Tot#raenteil des Moleküls vorhan den ist (Dutcher et al., Therapy of Fungus Diseas#es, loe. ch., <B>S.</B> 168-175)
. Sistomycosin hat ein bestimmtes Maximum in der Nähe von<B>218</B> mit. Rimocidin hat ein Maximum bei<B>279</B> my. Nach veröffentlichten Kur ven jscheintes, dass Antimycoin und Amphoteiricin <B>A</B> beide ein Maximum in Ader Nähe, von<B>230</B> my haben.
Tabelle I zeigt die publizierten UV-Maxima für jedes der bekannten Totraen-A.ntibiotika und für Tennecetin.
EMI0002.0097
<I>Tabelle <SEP> I</I>
<tb> UV-Maxima <SEP> von <SEP> Tetraen-Antifu#ngi-Antibiotica
<tb> Antibiotica <SEP> <U>Maxima <SEP> my</U>
<tb> Nystatin <SEP> 240 <SEP> <B>292 <SEP> 305,5 <SEP> 318</B>
<tb> Pdmocidin <SEP> <B>279 <SEP> 291</B> <SEP> 304 <SEP> <B>318</B>
<tb> Antünycoin <SEP> <B>230 <SEP> (?) <SEP> 291</B> <SEP> 304-305 <SEP> <B>318</B>
<tb> Chromin <SEP> <B>292,5 <SEP> 305 <SEP> 320</B>
<tb> Sistoraycosin <SEP> <B>218 <SEP> 292,5 <SEP> 306 <SEP> 320</B>
<tb> Amphotericin <SEP> <B>A</B> <SEP> 232(s1)
<SEP> <B>291 <SEP> 306 <SEP> 320</B>
<tb> Tennecotin <SEP> keine <SEP> <B>288 <SEP> 300-302 <SEP> 318</B> <I>2.</I> Infrarotabsorptionsspektren Die<U>aufgenommenen</U> Infrarotabsorptionsspektren von Tenncoetin sind mit publizierten Spektren von anderen Tetraen-Antifungi-Antibiotica verglichen worden.
Tennecetin (KBr pellet) zeigt charakteristische Hauptabsorptionsbande,n bei oder in der Nähe von <B>3,0,</B> 3,4,<B>6,0, 6,3, 9,5,</B> 9,9und <B>11,9</B> Mikron. Banden von geringerer Intensität liegen bei oder in der<B>Nähe</B> von<B>6,6, 6,9, 7,2, 7,9, 8,5, 9,05</B> und<B>11,3</B> Mikron. Geringe Maxima oder Schultern auf anderen Maxima erscheinen bei<B>5,85, 7,7</B> und<B>8,9</B> Mikron. Ein typ##sches,
Spekfrum von Tennecetin ist in der beihe- genden Figur dargestellt.
Das Infrarotabsorptlonsspektrum, welches dem jenigen von Tennecetin am meisten gleicht, ist das jenige von Sistomycosin. Von Sistomycosin werden folgende Haupt-Maxima (vgl. Britische Patentschfift Nr. <B>712547)</B> angegeben:
<B>2,96,</B> 6,34 und 9,44 Mikron. Banden von schwacher oder mittlerer Intensität liegen bei ode-r in der<B>Nähe</B> von<B>7,70, 7,86, 8,55, 11,16,</B> <B>11,85</B> und 12,4 Mikron. Andere Maxima erscheinen als Schultern auf den vorhergehenden Bändern, und zwar bei oder in der Nähe von<B>7,08, 7,16, 8,95,</B> <B>9,89, 10,25</B> und<B>10,6</B> Mikron.
Die, Absorptionscharakteristiken von Si#st#omycosin zwischen<B>3,0</B> und<B>6,0</B> Mikron sind unbekannt. Die Banden bei<B>7,8, 9,89, 10,25, 10,6</B> und 12,4 y er scheinen in den Spektren von Tennecetin nicht.
Nähere Prüfung des angeführten IR-Spektrums in der genannten -britischen Patentschrift betreffend Sisto- myr,osin zeigt keinen Hinweis auf ein Maximum bei <B>6,6</B> Mikron; das genannte<U>Diagramm</U> zeigt viehnehr ein ausgesprochenes Maximum. bei<B>6,9</B> Mikron. Dieses wird jedoch dem Mineralölträger zugeschrie ben. Tennecetin als Kaliumbromidpellet präpariert zeigt ein Band von ausgesprochener Absorption bei dieser selben Wellenlänge..
Das Absorptionsspektram von Rünocidin (vgl. britische Patentschrift Nr. <B>719878)</B> zeigt eine Anzahl von Maxima, wie sie, Tenneoet-in nicht aufweist.
Die hauptsächlichsten Maxima liegen bei oder in der Nähe von<B>10,7,</B> 12,2,<B>12,5</B> und<B>12,75</B> Mikron und mehrere Eegen büschelförmig in der<B>Nähe</B> aber nicht bei<B>6,0</B> Mikren. Bande von oder in der Nähe von <B>6,6</B> und #6,9 u, welche für Tennecetin charakteristisch sind, sind in dem in dür genannten britischen Patent schrift angeführten Diagranun betreffend Rimocidin nicht angegeben.
Das Infrarotabsorptionsspektrum von Nystatin ist verschiedentlich publiziert und diskutiert worden [vgl. britische Patentschrift Nr. <B>714189;</B> Dutcher, Therapy of Fungus Diseases; Brown <B> & </B> Hazen, Trans.
<B>N.</B> Y. Acad. Sci. <B>19,</B> 447<B>(1957)].</B> Nystatin hat Ban den von starker Absorption bei oderin der<B>Nähe</B> von <B>3,0, 3,5, 5,87,</B> 6#,37, <B>7,2, 8,55, 8,9, 10,0, 10,6,</B> 11,2,<B>11,8</B> und<B>12,6</B> Mikron. Sowohl diejenigen bei <B>10,6J1,2</B> und <B>12,6</B> y als auch die kleineren Maxima bei<B>7,5, 8,2</B> und 10,4<B>y</B> scheinen im IR-Diagranim von Tennecetin keine Gogenstücke zu haben.
Das starke Absorptio#nsband von Tennecetin bei oder sehr nahe bei<B>6,0</B> Mikron scheint in Nystatin nicht vorhanden zu sein.
Das Infrarotabsorptionsspektrum von Ampho- tericin <B>A</B> [vgl. Anfibioties, Annual (1955-1956), <B>S. 587-591]</B> zeigt wenig Einzelheiten; nichtsdestotrotz sind bestimmte Unterschiede zwischen,diesem Spek trum und demjenigen von Tenneectin erkennbar.
Amphotericin <B>A</B> hat Maxima bei oder in der Nähe von<B>7,5, 8,2, 9,6, 10,05</B> und mehrere, ün Bereich zwischen<B>10,5</B> und 11,4 Mikron, welche Tennecetin nicht aufweist. Tennecetin hat Maxima bei oder in der Nähe von<B>6,0</B> und<B>7,8</B> Mikron, welche Ampho- tericin <B>A</B> nicht zeigt.
<B><I>3.</I></B><I> Biologisches Spektrum</I> Nystatin ist unwirksam gegen Allescheria boydii und Monosporium apiospermum.
Sistomycosin ist unwirksain gegen Cryptococcus neoformans.
Antimycoin ist unwirksam -gegen Aspergillus niger. Tennecetin ist gegen mindestens einen authen tischen Stamm jeder der obengenannten Arten ge testet und jedesmal als hochaktiv befunden worden. <I>4. Löslichkeitseigenschaften</I> Nystatin, RimocIdin und Amphotericin <B>A</B> sind in Wasser nur wenig lösh!ch.
Chromin ist gemässden Angaben der obengenann- ten Autoren in Chloroform löslich.
Tennecetin ist wasserlöslich und unlöslich in Chloroform. <B><I>5.</I></B><I> Verschiedene Eigenschaften</I> Nystatin und Rimocidin werden aus dem Myce- lIum des das Antibiotikum produzierenden Orga nismus extrahiert. Unnecefin befindet sich fast gänz lich in der Kulturflüssigkeit.
Autiimycoi,n wird durch eine, Lösung von<B>0,01</B> a Cysteinh-yidrochlori,d desaktiviert. Tennecetin dagegen wird weder durch diesenoch durch eine andere Kon- zentraftion von, Cysteinhydrochlorid desaktiviert.
Chromin wird im Gegensatz zu Tennecetin an Seitzfiltern absorbiert.
Nystatin und Sistomycosin werden durch Licht desaktiviert. Auf Tennecetin hat Licht keine erkenn bare Wirkung.
Nystatin wird durch Streptomyces noursei, Rimocidin durch S.,rimosus, Antimycoin durch<B>S.</B> aureus, Chromin durch<B>S.</B> anfibiotious, Sistomycosin durch<B>S.</B> viridosporus, Amphotericin <B>A</B> durch Strepto- myce,s,sp. produziert. Tcnnücetin,dagegen# wird durch einen anderen als die genannten Organismen erzeugt.
Von Rimovidin wird angegeben, dass es die, mensch lichen roten Blutkörperchen hämolysiert.
<B>.</B> Tennecetin, verursacht in konzentrierter Schwefe,1- säure eine weinrote Färbung, welche für unbestimmte Zeiten stabil ist-. In konzentrierter Phosphorsäure wird eine wassergrüne Färbung erzeugt. Kaliumperman- ga,nät wird ziemlich rasch entfärbt. Mit Ferrichlorid wird keine Reaktion erhalten. Der Ninhydrin-Test ist nggativ. Der 2,4-Dinit#ro-phenyIhydr-azin-Test ist negativ.
Eine Anzahl von Substanzensind auf ihre<B>Fähig-</B> keit geprüft worden, die, Antifungi-Wirkung von Tennece,tin in vitro aufzuheben. Darunter waren zahlreiche Aminosäuren, einschliesslich Cysteinmono- hydrochlorid (von welchem angegeben wird, dass es ,die Wirksamkeit von Antknycoin aufhebt), Vitamine und anorganische Ionen..
Es ist gefunden worden, dass keine dieser Substanzen die Wirksamkeit von Tenne- cefin in vitro, beeinflusst.
<B><I>6.</I></B> Papierchromatographie Das Papierchromatogramm von Tennecetin, Nystatin, Rknocidiu und der Tennecetin-Nystatin- Rimocidin-Mischungen ist mit wassergesättigtem u-Butanol als Lösungsmittel bewerkstelligt worden, wobei die absteigende eindirnensionale Technik auf Whatman Nr. 1-Papier angewendet wurde.
Streifen wurden mit<B>10</B> Tropfen des Testmaterials betropft und nach-dem sie einer 18stundige#n Einwirkung des a-Butanol-Lösungsimiittols unterworfen waren, an der Luf <B>-</B> t getrocknet und in Schalen gegeben, welche mit Saecharomyces carlsbergensis K-20 geimpft waren. Die Streifen wurden nach<B>15</B> Minuten, entfernt, über Nacht bei Raumtemperatur ausgebrütet und mit TPTZCI in Glucose entwickelt.
Alle drei Verbindun gen wurden nebeneinander auf einen einzigen Strei fen von Whatman Nr. 4-Papier aufgezogen und gleichzeitig während<B>18</B> Stunden mit wassergesättig# tem Butanol als Lösungsmittel chromatographiert. Das Chromatogramm wurdedanngemäss der Technik von Ammann und Gottlieb -(1955) entwickelt.
Die RF-Werte sind: Nystatin 0,22; Rimocidin <B>0,38;</B> Tennecetin <B>0,33.</B>
<I>Der Organismus<B>S.</B></I> chattanoogensis Die Tennecetin produzierende Organismen-Art ist ,ein typisches Glied der Streptomyces-Gattung. Seine Morphologie und Physiologie isind so weitgehend studiert worden, dass es genügt, um ihn von allen Artender genannten Gattung zu unterscheiden, wie sie in Bergeys Manual of Detiermänative Bacteriology, 6th <B>cd.,
</B> Williams and Wilkins Co., Balt. (1948) und in Waksman und Lechevaher's Actinomycetes and their Antibioties, WiRiams and Wilkins Co., Balt. <B>(1953)</B> angegeben sind.
Der beueff ende Organismus ist weiter dem Krite rium der Artbestimmung. für die Gattung der Strepto- myces unterworfen worden, wie es durch Burkholder et al. in den Annals of the <B>N.</B> Y. Acad. of Sci. <B><I>60,</I></B> <B>102-123 (1955)</B> beschrieben worden ist.
Auch die nützlichen Kriterien für die Artdifferünzierung gemäss Hesseltine et aL in den Annals of the <B>N.</B> Y. Acad. Sci <B>*<I>60</I> 136-151 (1955)</B> sowohl als auch die über- Sicht von Waksman in Bact. Rev. 21,<B>1029 (1957)</B> wurden angewendet.
Die Wahrscheinlichkeit, dass noch viele Arten von Streptomyces aus natürlichem Quellen isoliert werden und klassifiziert werden müssen, wird durch die Tat sache veranschaulicht, dass Krassibükov, 1941, mi. sei- neni Führer für die Strahlenpilze nur 47 Arten an führt, wogegen Bergey's- Mannal, 6th ed., 1948,<B>73</B> und Waksman und Lechevalier, <B>1953,
</B> bereits 146 Arten von Streptomyces angeben.
Streptomyces chattanoogensis wurde am<B>10.</B> Ja nuar<B>1959</B> in der American Type Culture Cofiection, <B>1025</B> Connecticut Avenue,<B>N.</B> W. Washington<B>7, D. C.</B> unter der Nr. <B>13358</B> deponiert.
Streptomyces Wie bei anderen Streptomyces-Arten variiert die koloniale Morphologie von<B>S.</B> chattanoogensis bis<B>zu</B> einem .gewissen Grad<B>je</B> nach der Zusammensetzung des gebrauchten Mediums und der Konditionen, unter welchen der Organismus kultiviert wird. Die folgende Beschreibung gilt für Charakteristika, wie sie, auf den meisten Medien erscheinen, auf denen <B>S.</B> chattanoogensis gut wächst, z. B. Glycerinagar, Stärkeagar, Hafermehlagar, Phytonagar, und zwar bei Standardk-ultivierungsbedingungen, das heisst- z. B.
durch aerobe, Kultivierung bei<B>25</B> bis 2811 <B>C.</B>
<B>Die</B> Kolomen sind im allgemeinen nach -einer Be- brütungszeit von 48 Stunden sichtbar. Das vDgetative Mycelium ist gelblichbraun und wächst in das Medium hinein. Isolierte Kolonien sind kreisförmig, am Rande runzlig und bis zu 20<U>mm</U> im Durchmesser. Eines der am meisten heraustretenden Merkmale des Organismus ist seine Fähigkeit, auf den meisten Medienein heEgelbQs, wasserlösliches Pigment<B>zu</B> er zeugen.
Die Spurenbildung erscheint gewöhnlich nach vier bis fünf Tagen bei Raumtemperatur. Das Luft- Mycelium ist zuerst weiss und wird<U>dann</U> im allge meinen etwas gräulich bei längerer Bebrütung.
Mikroskopisch gesehen, setzt sich das Mycellum aus dünnen, sich verzweigenden Fäden zusammen. Die sphärischen Sporen, 1,0-1,2 Mikron im Durch messer, werden an ziemlich eng verwickelten Sporen- trägern erzeugt. In einigen Med#ien kann ein An schwellen der Fäden beobachtet werden.
Die folgenden biochemischen Charakteristika sind beobachtet worden: Gelatine wird verflüssigt; Milch wird koaguliert und peptonisiert; Stärke wird hydrolysiert; Catalase wird produziert; Nitrate werden zu Nitriten reduziert; Wenn der genannte Organismus auf mensch lichem Blut-Agar gezüchtet wird, wird das Blut hämolysiert; .die Tyrosinase-Reaktion ist negativ;
in Medien, die<B>3</B> % Kochsalz enthalten, findet kein Wachstum istatt; Ribonuelein#Säure wird hydrolysiert; der typische Schimmelgeruch von Streptomyceten wird auf festen Medien erzeugt; das Wachstum findet bei 370,C, aber nicht bei 450<B>C</B> statt; der Organismus ist gram-positiv und nicht säure fest.
Das Wachstum in beläfteten, flüssigen Medien findet in Form von Kügelchen oder Flocken statt. Es wird dabei ein charakteristischer, nicht unangeneh-mer flauer und ganz unbeschreibbarer Geruch abgegeben.
In ungeschüttelten Röhren oder Flaschen bildet sich nicht ein Häutehen-, sondern. ein Ring und ein schwer-er Niederschlag.
Diegenannte Organismen-Art ist verglichen wor den mit Kulturen von Streptomyces flaveolus ATCC <B>3319, S.</B> rimosus NRRL B2234,<B>S.</B> aureus NRRL 111274,<B>S.</B> cellulosae ATCC <B>3313</B> und anderen Streptomyceten, welche ein gelbes Pigment bilden. Keine von diesen zeigen morphologische, oder physio logische Charakteristiken, die mit denen des genann ten Mikroorganismus identisch wären.<B>S.</B> flaveolus z.
B. produziert ovale, elliptische Conidia, wogegen die, Corüdia des neu entdeckten Organssmus <B>S.</B> chattanooigensis sphärische Form aufweist.<B>S.</B> cellu- losae bewirkt eine nur geringe Nitrat-Reduktion, wogegen der neu entdeckte Organismus Nitrate schnell[ reduziert.<B>S.</B> aureus 'bildet in Litmus-Müch einen tschwaTzen Ring ohne Koagulation und zweifel hafte Peptonisierung,
wogegen der neu entdeckte Organismus ausg .,eprägte Koagulation und Peptonisie- rung, aber keine Erscheinung des schwarzen Ringes hervorruft.<B>S.</B> rimosus zeigt auf vielen Medien kein Pigment und die Peptonisierung von Milch bleibt aus.
Von diesem Mikroorganismus wird in der Lite ratur auch, festgehalten, dass er zusammengeballte Spiralen bildet, die mässig dicht, kuTz und zylindrisch sind, nämlich<B>0,65</B> X<B>1,0</B> Mikron. Im weiteren redu ziert<B>S.</B> rimosus keine Nitrate.
Bis jetzt sind zwischen demneu entdeckten Orga nismus und Stireptomyces viridosporus kein-, Labora- toriumsvergleichsversuche gemacht worden, aber vom letzteren wird in der Literatur festgehalten, dass er Sporen von dunkelelivgrüner Farbe auf Glucose- Tryptos,e#Agar produziert.
Es ist auch festgestellt worden, dass beim Gebrauch von Lactose als Kohlen- stoffquelle zin Antibiotikum (Sistoraycosin) produziert wird, welches auf CMtococcus neoformans keine Wirkung ausübt.<B>S.</B> virodospürus ist deshalb vom neu entdeckten Organismus gänzlich verschieden.
<I>Medien für die</I> Tennecetin-Produktion <I>Stammkultur:</I> Die genannte Tennecefin produ zierende Streptcymyces-Art ist durch wöchentliche Übertragung auf eine Anzahl von Medien gebracht worden. Die Stammkulturen. sind bei Raumtempe ratur gehalten worden. Erdkulturen haben sich für die AufrechteThaltung des Organismus als nicht be friedigend erwiesen. Die Lyophilisierung ist nicht versucht worden.
Die Sporenbildung erscheint auf Carvajals Hafer- mehl-Agar sehr rasch und dieses ist ein geeignetes Medium für die Aufticchterhaltung der Grundstämme. Der neu entdeckte Organismus zeigt keine Anzeichen dafür, dass ier sich einer spontanen Mutation unter zogen hätte während der 21/2 Tahre, während wel cher er in LaboratoTiums-Kultur gehalten wurde.
Nach Ultraviolett-Bestrählung wurde ein nicht Sporen bildender und nicht Antibiotika produzierender Stamm entdeckt.
Schüttelflaschenmedien: Experimente zur Be stimmung eines optimalen Mediums für die Kulti vierung von Tennecetin in Schüttelflaschhen haben gezeigt, dass nur bestimmte Kohlenhydrat-Que-Ilen für die Produktion geeignet sind. Obschon ein gutes Wachstum in Schüttelflaschen erzielt werden kann, die Nährbrähe, ohne Kohlenhydrat-Zusatz enthalten, findet unter diesem Bedingungen keine Antibiotica- Produktion statt.
Wenn Lactose oder Saccharose als Kohlen,hydrat-Quelle verwendet wird, bildet sich werag oder kein Antibiotikum. Dextrose erlaubt rasches Wachstum des Organismus, verschafft aber keine hohen Ausbeuten an Tennecain. Glycenn, Dextrin, Galactosa und Inosit scheinen die 'besten Kohlen- hydrat-QueRen zu sein und sind fast ausschlizsslich gebraucht worden.
Für das Nährmedium, sind zahlreiche Zusätze geprüft worden zwecks Bestimmung, ob ihre Gegen- wartdie, Ausbeute an TenneceAtin verbessern könnte. Es ist gefunden worden, dass Phyton und Hefe die Bildung von Tennecetin deutlich stimulieren.
Mais- aische (corn steep liquor), Natriumchlorid, Kahum- osphat, Palmitinsäure, Oleinsäure, Sojabohnenöl und Tween-80 hatten keine erkennbare nützliche Wirkung.
Das folgende Medlum wurde für die meisten Produktions-Versuche gebraucht:
EMI0005.0081
Glyce,rin <SEP> 2%
<tb> Phyton <SEP> (BBL) <SEP> <B><I>0,50le</I></B>
<tb> Pepton <SEP> (eDifco ) <SEP> <B><I>0.5010</I></B>
<tb> Ochsenbrühe <SEP> ( Difco ) <SEP> <B>0,311/o</B>
<tb> Hefe-Extrakt <SEP> ( Difco ) <SEP> <B>0,30/9</B>
<tb> Leitungswasser Im folgenden wird dieses Medium GPY-Medium genannt.
Das pH des im Autoklaven behandelten Mediums ist<B>7,0.</B> Während den ersten 48 Stun & n der Fertnentierung findet ein rascher Fall des pH auf ungefähr 4,5 istatt. Dieser Fall kann kontrolliert werden, wann das Medium vor der Sterflisierung auf ein pH von<B>7,6</B> gebracht wird und weiter nach der Sterilisierung<B>0,25</B> 11/o Caliciumcarbonat zugesetzt wer den.
Die Variation des pH scheint jedoch keinen grossen Einfluss auf die Menge des in. diesem Medium produzierten Antibiotikums auszuüben.
Das Weglatssen irgendeines der angegebenen Be, standteile aus dem genannten GPY-Medium. bewirkt geringere Ausbcut-en. Es sind jedoch Anhaltspunkte dafür vorhanden, dass die Konzentration des Hefe- Extraktes bis zu<B>0, 1</B> j0/9 reduziert werden<U>kann,</U> ohne die Fermentation zu beeinflussen.
Im einzelnen wird beispielsweise wie folgt vor gegangen: <I>Oberflächenkultur:</I> Oberflächen<B>-</B> Impfung mit einer Sporen-Suspension der neu entdeckten Tennen cetin produzierenden Streptomyces-Art auf mit Agar verfestigtes GPY-Mediu#m bewirkt ein starkes Wachstum nach einer Bebrütung von drei bis vier Tagen bei<B>25</B> bis<B>280-C.</B> Die Extraktion dieser Kul- turen mit Aceton, Alkohol oder Wasser ergibt ein gelbes Extrakt,
weiches zu einem relativ wirksamen Präparat konzentriert werden<U>kann.</U> Diese Methode ist sehr zuverlässig. Sie ist jedoch mühsam und natürlich unpraktisch, wenn grössere, Quantitäten des aktiven Materids benötigt werden.
<I>Schüttelflaschen:</I> Fünf 100-,cm3-Erlenmeyer- Flaschen, welche<B>100</B> cms GPY-Medium enthalten, werden mit 1-2 cm3 einer 24-48 Stunden geschüttel ten Kultur (gleiches Medium) des Organismus geimpft. Bebrütung unter Zuhilfenahme einer reziproken oder rotierenden Schütteänaschine bei 25-280C ergibt ein gutes Wachstum und eine Anfilbiotica-Produktion nach drei bis vier Tagen.
<I>Gärbottich:<B>5-</B></I> oder 10-Gallonen-Glasäaschen- oder -Gäilbottiche, die<B>10</B> bis<B>15</B> Liter des GPY- Mediums enthalten, werden mit<B>100</B> bis<B>500</B> cm3 einer 24-48 Stunden geschüttelten Kultur (gleiches Medium) des genannten Organismus angeimpft. Die Glasflaschen werden auf reziproken Sohüttelmaschi- nen bewegt, während die<B>'</B> Gärottiche mit mecha nischen Rührern veTsehen werden.
Beide können während der Fermentationsperiode mit filtrierter Luft oder Sauerstoff belüftet werden. Das Wachstum ist unter diesen Bedingungen sehr gut und die Anti- bioticum-Produktion erreicht ihr Maximum nach ungefähr<B>60</B> bis<B>72</B> Stunden bei Temperaturen von <B>25-280 C.</B> Die Schaumbildung war in Schüttelflaschen, Glasflaschen oder Gärbottichen kein wesentliches Problem.
<I>Gewinnungsverfahren</I> Die Gewinnung des Antibiotikums aus stationäxen Kulturen wird wie folgt bewerkstelligt: Drei bis vier Tage alte Agar-Kulturen werden für<B>30</B> Minuten bei Raumtemperatur in Wasser, Aceton oder einem niederen Alkohol vingetaucht. Das Extrakt wird dann abgeschüttelt, durch Filtrieren oder Zentri-fugieren geklärt und im Vakuum eingedampft oder, durch Kochen auf ungefähr 1/,() des ursprünglichen Vol-u- mens eingeengt.
Dies ergibt eine im wesentlichen wässrige Lösung, welche gemäss den Testen für das Antünikroibe,n-Spek,trum, das Ultraviolett- und Infra- rot-Absorptionsspektrum und nach- ihrem Verhalten bei den Papierchr-omatogrammen identisch ist mit den Extrakten aus Brühenkfflturen.
Wenn diese Präparate mehrere Tage im Kühl- schr(ank gehalten werden, scheidet sich ein hellgelber Niederschlag aus. Die gelblichbraune überstehende Flüssigkeit ist der hauptsächliche Träger der anti biotischen Aktivität. Der gelbe Niederschlag- ist prak tisch unlöslich und ohne antibiotische Aktivität.
Die Gewinnung des Antibiotikums aus den Brü hen geht wie, folgt vor sich: Wie in anderen Anti- biotica-Fürinentatione-ii bedingt die Kügelchenbildung des Organismus eine niedrigere Ausbeute des Anti biotikums. Flockiges Wachstum gibt bessere Aus- beut-e,n; <B>im</B> vorliegenden Falle jedoch ist der flockig gewachsene Organismus schwierig von der Brühe zu trennen. Das Mycelium selbst ist Träger einer nur geringen Aktivität. Durch Ansäuren kann die Filtra tion erleichtert werden ohne spürbare Abnahme der Aktivität.
Die Brühe ist ein einziges Mal mit einem gleich grossen Volumen von wassergesättigtem Buta- nol extrahiert worden, Emulsionen'sind durch Filtrie- rung durch aibsorbierende Baumwolle gebrochen wor den.
Die Konzentration des Butancyl-Extraktes wird im Vakuum bewerkstelligt, und zwar- bis zu eihern Zehntel des ursprünglichen Volumens-.
Vier Volumen von wasseifreiern Äther werden dann, dem konzentrierten Butanol-Extrakt zugegeben. Ein feiner gelbe#r- Niederschlag erscheint, welcher durch Filtrieren oder Zentrifugieren gesammelt wer den kann.
Der Niederschlag wird in Wasser oder Meehanol aufgelöst, nachdem der unlösliche Niederschlag durch Fitration entfernt worden ist. Danach wird der Nie derschlag aus Wasser oder Methanol durch Zugabe von<B>10</B> Volumen Aceton wieder- erzeugt. Der- so entstandene gelbe Niederschlag wird getrocknet und im Kühlschrank gelagert. Dieses Material, welcheg das am- besten gereinigte Produkt darstellt, das bis jetzt erhalten worden ist, sollte einen Gehalt von zwischen<B>100</B> und 200 E-üffiei,#ten- Tennecetinn pro- mg aufweisen. Die betreffende Einheit ist zum mindesten gleichwertig wie<B>10</B> Nystatin-Einheiten.
Gehaltsbestimmungsmethode <I>für</I> Tennecetin Eine quantitative mikrobiologische, Gehaltsbe- stimmungsinethode ist für die Messung des Tenne- cetin-Gehaltes in rohen Brühen und Extrakten ent wickelt worden. Es ist dies die bekannte Papier- .Sche#iben-Ag,ardiffusionsnieth,ode, welche als Testorga nismus Saccharomyces carlsbergensis verwendet.
Die Gchaltsbestimmungsmethode gibt über einen zehn fachen Konzentrationsbereich eine gerade Linie niit ,guter Steilheit, wenn sie auf seniflogaritlintisches Pa pier aufgezeichnet wird.
Bei -dieser Methode ist eine willkürliche Einheit von Tennecetin definiert worden, und zwar derart, dass diejenige Menge des Antibiotikums, welche, wenn sie in<B>1,0</B> cm3 Brühe oder Verdünnungsmittel enthalten ist, eine, 20-min-Hemmzc>ne (Durchmesser) gegen den Versuchsstamm<B>S.</B> carlsbergensis bewirkt, und zwar gemäss den vorgeschriebenen Bedingungen für die Standard-Gehaltsbestimmungs-Methode (die gemäss dieser Methode verwendeten Papierscheiben sind Schleicher<B> & </B> Schnell Nr. 740-E , <B>12,7</B> mm Durchmesser).
<B>S.</B> earlsberge-n#sis wird durch tägliche Serien-über- tragung in Wickerhain-Brühe (Glucose<B>1</B> Ilo, Pepton 0,5 1%, Hefe-Extrakt 0,3 1/@, Malz-Extrakt 0,3 "/e) eingebracht.
Gehaltsplatten werden durch über strömen von Standard-Petrischalen mit 20 cm3 2,1/oigem Agar hergestellt, um eine, Basisschicht zu bilden. Wenn die Basisschicht erhärtet ist, werden <B>5</B> cm31 eines überzugs-Agar (Wickerham-Brühe und 1% Agar), welches mit 2% Inoculum geimpft ist,
über die Basisschicht pipettiert und gleichmässig verteilt. Muster werden durch Eintauchen von <B> S & </B> S -Filterpapierscheiben in Lösungen von ver schiedener Verdünnung geprüft. Die Muster werden auf ungefähr 2,0 Einheiten/cm3 verdünnt. Ein Stau- dard-Präparat wird auf jeder Platte geprüft.
<I>Hitzestabilität von</I> Tennecetin Lösungen von erfindungsgemäss erhaltenem rohem Tenneectin haben ihre volle Aktivität nach einer 20minutigen Behandlung bei<B>1000</B> C beib-ehalten. Lösungen, die mehr als einen Monat irn Kühlschrank gehalten wurden, haben ihre Aktivität ebenfalls bei behalten. Die Stabilität nimmt spürbar ab bei einem pH von 4,0 und<B>10,0</B> (vgl. Tabelle<B>11).</B>
Portionen aus einer<B>S.</B> chattanoogensis-Kultur, die<B>72</B> Stunden in einer Schüttelflasche geschüttelt worden ist, werden auf ein pH 4,0,<B>7,0</B> und<B>10,0</B> eingestellt. 2 cm3 von jeder Portion werden in<B>je</B> eine Teströhre pipettiert und wie folgtbehandelt: a) nicht erhitzt, <B><I>b)</I> 5</B> Minuten, in siedendes Wasserbad gestellt, <I>c)</I><B>10</B> Minuten in siedendes Wasserbad gestellt, <B><I>d)</I></B> 20 Minuten, in sIedendes Wasserbad gestellt. <I>e)</I><B>30</B> Minuten bei 121-<B>C</B> im Auteklav behandelt.
EMI0007.0001
<I>Tabelle <SEP> II</I>
<tb> <I>Hitzestabilität <SEP> des <SEP> Antibiotikums</I>
<tb> Antibiotische. <SEP> Aktivität <SEP> (Einheiten)
<tb> Behandlung <SEP> <B><U>pH</U></B><U> <SEP> 4,0 <SEP> <B>1 <SEP> pH <SEP> 7,0 <SEP> 1 <SEP> pH</B></U><B> <SEP> 10,0</B>
<tb> Keine <SEP> (Kontrollversuch) <SEP> <B>8 <SEP> 8 <SEP> 8</B>
<tb> Siedendes <SEP> Wasser <SEP> <B>5</B> <SEP> Minuten <SEP> <B>8 <SEP> 8 <SEP> 5,2</B>
<tb> Siedendes <SEP> Wasser <SEP> <B>1U</B> <SEP> Minuten <SEP> <B>6,6 <SEP> 8 <SEP> 2,7</B>
<tb> Siedendes <SEP> Wasser <SEP> 20 <SEP> Minuten <SEP> <B>3,3 <SEP> 8 <SEP> 0,8</B>
<tb> Autoklav-Behandlung- <SEP> <B>30</B> <SEP> Minuten <SEP> keine <SEP> <B>3,
3</B> <SEP> keine <I> In</I> vitro -Spektrum Unter Verwendung der konventionellen Kreuz- strich-Agar-Diffuisio-ns-tech#nik wurden mehr als<B>80</B> verschiedene Arten von Organismen auf ihre ErnP- findlichkeit gegenüber dieser antibiotischen Substanz getestet. Bis jetzt konnte keine Hefe oder Pilz -gefun den werden, deren Wachstum durch Tennece-tin rucht verhindert worden wäre. In dieser Grupp e sind menschlich pathogene Organismen eingeschlossen, die eine starke Mycose verursachen, wie z.
B. Crypto- coccus neoformans, Blastomyws dermatitidis, Can- dida albicans; und Dermatophyten, wie, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum;
und pflan- zenpathogene Organismen, wieg Fusarium sp. und Monascus purpurea.
Die meisten Bakterien scheinen von Anfang an gegen die Wirkung des erfindungsigemäss -erhaltenen Antibiotikums resistent zu #sein. Zwei bis jetzt beraus- gefundene Ausnahmen bilden Pseudomonas tabaci und C6rynebacte-rium diphthieriae. Die Wirksamkeit von Tennecetin gegen säurefeste Organismein ist bis jetzt nicht gänzlich erforscht worden. Gemäss den vorläufigen Ergebnissen zeigt sich-, dass das neue Anti biotikum wenig oder gar keine Wirkung auf diese Organismen ausübt.
Die Tabolle III gibt diejenigen Arten wieder, deren in-vitro-Empfindlichkeit gegen Tennecetin gepTilft wurde.
<I>Tabelle</I> III <B>A.</B> Organismen, deren Wachstum in vi-tro durch Tennecet,in gehindert wurde: Penicillium sp. AspergillIus sp. AspergiEus niger Absidia spinosa Mucor sp.
Syncephalastrum raoemosum Canninghameüa sp. Thamnidium elegans Cirr,inella tenella Penicillium citrenum A.spergillus candidus Aspergilllus glaucus Aspergillus fumigatus Aspergillus clavatus Asper,
gillus. ochraoeus Paecilomyr-es sp. Scopulari!opsis,sp. Fusarium graminum Fusarium sp. Penicilfium canescens Rhodoto-rula sp.
Saccharomyces verevisae <B>(3</B> Stämme) Sacch,aromy,cQs caTIsibergensis (2 Stämme) Sacch-aromyces fragii Hansenula anomola Blastomyces dermatitidis (Hefe-Phase) Blastomyces derrnatitidis (PilznPhas--)
Sporotrichum schenckh Trichophyton mentagrophytes Microsporum typseum Microsporum aud.ouini Corync-bacte.rium sp. Corynebacterium diphtheriae P.seudomonas tabaci Candida albicans <B>(6</B> Stämme)
Candida krusei Candida parakrasei Candida stelletoidea Ge,otrichum sp.
Cryptococcus neoformans (2 Stämme) Tor-ulopsis sp. <B>(3</B> Stämme) Hansenulamrakii Hansenula silvacola Pichia membranefaciens Schwa-nniomyces sp. Trigonopsis variabilis Myco:
de,rma sp. Debaryorayces globosus Spor..cbc>1"omyces salmonicolor Zygosacch#aromy-ces lactis Candida tropicahs B.
Organismen, deren Wachstum in vitro durch Tennecetin nur gering oder fragwürdig gehindert wurde: Oospera lactis Staphylococcus aureus <B>(3</B> Stämme) Staphylococcus albus Sarcina lutea Corynebacteri,um sp. Mycobaete#d,um sp. (ATCC <B>607)</B> <B>C.</B> Organisinen,
deren Wachstum in vitro durch Tennecetin nichtgehindert wurde: Esche,richia coli Serratia sp. Sahrionella typhosa Paracolobactrum. sp. Pseudomonas fragii Pseudomonas Ihiorescens Alcaligenes viscosus. Pseudomonas aeruginosa <RTI
ID="0008.0035"> Sahnonella enteritidis Bacterium, cadaveris Bacillus cereus Bacilltis subtilis Bacillus graveolus Neisseria catarrhalis, Neisseria perflava Mycobacterium. avium. Streptorayces rinios:
us Streptomyces Iavendulae Streptomyces viridis Streptorayces. coelicolor Streptomyces cellulosae Streptomyces. griseus Streptomyces albus Streptomyce,s cahfornIcus Nocardia sip.
Nocardia astoroides Mieromonospo,ra sp. Toxizität <I>für Tiere</I> Ein 104 Einheiten pro Milfigramm aufweisendes Präparat des erfindungsgemäss erhaltenen neuen Anti#bioti,k-=s wurde in wassergesättigtem. Butanol gelöst und intraperitoneal injiziert in<B>18-20</B> gschwere CFW-w,eisse Mäuse in einer Dosis von 0,2 cm3 pro Maus. Als LD., wurde eine Menge von 134 mg/kg bestimmt.
Das neue Antibiotikum könnte also mit verhältnismässiger Sicherheit als prophylaktisches oder therapeutisches Mittel im Zusammenhang init Pilzer krankungen von Tieren verwendet werden.