Verfahren zur Darstellung von Nueleosiden. Gegenstand der Erfindung ist ein Ver fahren zur Darstellung von Nucleosiden durch Abspaltung von Phosphorsäure aus Nucleinsäuren mittels hydrolysierenderDl ittel.
Die Isolierung von Nucleosiden aus Nucleinsäure mit Hilfe von Ammoniak bei Temperaturen von 175 bis<B>180'</B> im Auto klaven; ist bereits versucht worden, doch wa ren die hierbei erzielten Ausbeuten an den )einzelnen Nucleosiden nur gering. Insbeson dere war die Aufarbeitung der bei diesem Verfahren gewonnenen Lösung recht lang wierig und umständlich.
Versuche bei Tem peraturen, die unter<B>175</B> bis<B>180'</B> liegen, c Nucleinsäuren durch Alkali aufzuspalten, führten stets zur Gewinnung der Nucleotide, aber nicht zur Herstellung von Nucleosiden. Auf ehemischem Wege ist also die Darstel lung von Nucleosiden in befriedigender Weise bisher nicht gelungen.
Es ist anderseits auch bekannt, mit Hilfe einer fermentativen Hydrolyse Nueleoside aus Nucleinsäuren in verhältnismässig guter Ausbeute zu gewinnen. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht in erster Linie in der Schwierigkeit der Darstellung des zur Spal tung geeigneten Fermentes. Ausserdem muss das verwendete Ferment nach beendeter Spal tung durch Aufkochen aus der Lösung wie der entfernt werden.
Es wurde nun gefunden, dass Nucleoside auf einfachem Wege und mit guter Ausbeute gewonnen werden können durch Behandlung der Nueleinsäuren mit organischen Basen als Hydrolysierungsmittel bei erhöhter Tempe ratur bis zur Abspaltung der Phosphorsäure.
Kocht oder erhitzt man Nucleinsäure längere Zeit mit Lösungen anorganischer Basen, so tritt zwar eine Aufspaltung bis zu ,den Nucleosilden ein; die Abtrennung der Nucleoside bietet aber insofern Schwierig keiten, als die verhältnismässig grossen Mien- gen Alkali und das bei der Hydrolyse ent stehende Alkaliphosphat die glatte Kristalli sation des Nucleosides, zum Beispiel des Guanosins,
verhindern oder zum Beispiel,die Fällung des Adenosinpikrates durch die gleichzeitige Mtfä-llung von Alkalipikraten verunreinigen.
Es hat sich demgegenüber als äusserst vor teilhaft herausgestellt, als Spaltungsmittel organische Basen, wie Pyrndin, Picolin, Chino- lin, Anilin usw. zu verwenden.
An Stelle der cyklischen Verbindungen und deren Homo logen oder Derivaten können auch alipha- tische Basen Verwendung finden, wie zum Beispiel Diäthylamin, Trimethylamin und deren Homologe oder Derivate.
Kocht man Nucleinsäuren zum Beispiel in wässrigem Pyridin längere Zeit am Rückflusskühler, so erreicht man eine glatte Aufspaltung zu den Nucleosiden. Die gleiche glatte Aufspaltung lässt sich in kürzerer Zeit natürlich auch im Autoklaven bei höherer Temperatur erzielen. Die Zeitdauer der Aufspaltung ist durch den Grad der Abspaltung von Phosphorsäure, der sich analytisch bestimmen lässt, gegeben.
Im Gegensatz zu Alkalien lässt sich Pyridin durch Abdestillieren entfernen; bei Verwen- dung dieser Base lässt sich zum Beispiel Guanosin leicht in kristallisiertem Zustand isolieren, so da, eine Reinigung über das Bleisalz nach dem von Levene und. Jacobs benutzten Verfahren überflüssig ist.
Ferner kann man zum Beispiel bei der Verwendung von Pyridin zur Aufspaltung von Poly- nuGleosiden bei der Abtrennung von Guano- sin anfallende Filtrate, welche Adenosin ent halten, ohne weiteres mit Pikrinsäure verset zen,
so dass das Adenosinpikrat in recht reinem Zustand ausfällt. Die Zerlegung des Adeno- sinpikrates gemäss der -deutschenPatentschrift N-.650847 verläuft darauf vollkommen glatt. Darüber hinaus ist es, wie Versuche ergaben, so möglich geworden, aus dem Filtrat des Guanosins nach Beseitigung der Phosphor säure und etwaiger Verunreinigungen Adeno- sin unmittelbar als solches kristallisiert zu erhalten.
Das vorliegende Verfahren bietet gegen über der bisher bekannten chemischen Auf- spaltungsmethode, wie Versuche ergaben, den grossen Vorteil einer entscheidenden Verbes serung der Ausbeute: Insbesondere können zum Beispiel darnach Guanosin und Adenosin (als Pikrat) aus Hefenucleinsäure annähernd quantitativ erhalten werden.
Dieses Ergebnis liegt darin begründet, dass man bei wesent lich tieferer Temperatur ohne Verwendung eines Autoklaven hydrolysieren kann, wo durch eine Zerstörung des Umsetzungsgutes vermieden wird. Weiterhin kann durch Ver wendung organischer Basen als Spaltungs mittel das bisherige umständliche Aufarbei- tungsverfahren umgangen werden, da man hierbei das Spaltungsmittel durch einfache Destillation entfernen kann.
Bei der Spalturig mittels Ammoniiak verhindert zum Beispiel das entstehende Ammonphophat die Kristal lisation des Guanosins und macht die be schriebene Reinigung der in gallertartiger Form anfallenden Masse notwendig; weiter hin muss das Ammoniumphosphat entfernt werden, da andernfalls zusammen mit dem Adenosinpikrat Idas schwer lösliche Am moniumpikrat ausfallen würde.
Die neue Arbeitsweise hat gegenüber dem fermentati- ven Aufspaltungsverfahren den Vorteil, dass man -die Verwendung und somit Darstellung des Fermentes umgeht, was auch eine Verein fachung in der Aufarbeitung mit sich bringt, da das Ferment nicht durch Aufkochen ent fernt zu werden braucht.
Gleichzeitig ist bei -der neuen Arbeitsweise im Vergleich zur fermentativen Hydrolyse die Hydrolysenzeit, wie sich zeigte, wesentlich kürzer.
Ein wei- terer Vorteil liegt darin, dass man bei Ver wendung einer organischen Base als Spal tungsmittel dieses Abspaltungsmittel durch Abdea¯tillieren aus dem Ansatz leicht zurück- gewinnen und somit jeweils für den nächsten Spaltungsansatz wieder verwenden kann. Dadurch ergibt sich eine nicht unerhebliche Verbilligung und Vereinfachung des ganzen Verfahrens. Die Ausbeuten liegen, wie sich zeigte, etwas über den bei Fermentspaltung erhaltenen Ausbeuten.
Insbesondere ist zum Beispiel das erhaltene Adenosinpikrat in der Regel noch etwas reiner als das durch Fer- mentspaltung erhaltene. Pikrat. Dadurch er höht sich die gesamte Adenosinausheute etwas. Vor allem ermöglicht es das neue Ver- fahren, Adenosin unmittelbar als solches kristallisiert zu erhalten.
Dadurch verein facht sich gegebenenfalls wiederum die Ge winnung .des Cytidins und Uridins, zumal nicht erst wieder die Pikrinsäure aus dem Filtrat des Adenosinpikrates entfernt zu wer den braucht.
<I>Beispiel:</I> 50g Hefenucleinsäure werden in 300 cm' wässrigem Pyridin bis zur völligen Abspal- tung der Phosphorsäure (das heisst etwa 96 Stunden) am Rückflusskühler gekocht. Nach Klären mit Tierkohle wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Wasser aufgenommen und wiederum ein gedampft. Das nach Zugabe von Wasser un lösliche Guanosin wird nach Abkühlen im Eisschrank abgesaugt.
Ausbeute : etwa. 10 g, Das Filtrat wird zur Beseitigung der letzten Reste Pyridin mit etwas: NaOH versetzt und eingedampft. Der Rückstand wird mit Was ser aufgenommen, die wässrige Lösung etwas erwärmt urld mit 25 g Pikrinsäure versetzt. Nach dem Abkühlen im Eisschrank wird vom Ausgeschiedenen Adenosinpikrat abgesaugt. Ausbeute: 18 bis 22 g.
Durch Aufarbeitung des Filtrates lassen sich in bekannter Weise die Pyrimidinnucleoside, Cytidin und Uridin gewinnen. Zur unmittelbaren Gewinnung .des freien Adenos.ins wird das. Filtrat des Guano- sins mit Barytlauge von Phosphorsäure, so dann von etwaigen Verunreinigungen durch Bleiacetat oder mit Wasser mischbare or ganische Lösungsmittel befreit.
Aus dem Fil trat kristallisiert, gegebenenfalls nach Ein engen, das Adenos.in aus. Das Filtrat kann ohne weiteres auf Cytidin und Uridin ver arbeitet werden.
Die nach dem vorliegenden Verfahren er haütenen Produkte können als kreislauf fördernde Mittel Verwendung finden. Das darnach gewonnene Adenosin dient auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von Mus- keladenylsäure.