DE1620084A1

DE1620084A1 - Verfahren zur Herstellung von Nucleotiden durch Abbau von Nucleinsaeuren

Info

Publication number: DE1620084A1
Application number: DE19661620084
Authority: DE
Inventors: Kenichi Kataya; Hiroshi Kawada; Kenichi Nishimoto; Toshiro Takei
Original assignee: Nihon Kagaku Shiryo K K
Current assignee: Nihon Kagaku Shiryo K K
Priority date: 1966-03-18
Filing date: 1966-03-18
Publication date: 1970-02-05
Also published as: GB1247233A; CH529218A; BE727431A; DE1692008A1; FR1598511A; NL6900093A; BE529218A; US3627684A; AT294282B; DE1620084C2

Description

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ffihon Kagaku Shiryo Kabushiki Kaisha, Hokkaido/Japan

Verfahren, stur Herstellung von nucleotiden durch Abbau von nucleinsäuren

Pie Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von nucleotiden durch Abbau von Huoleinsäuren mit hoher Ausbeute· DatBi wird der Hucleinsäure oder einer Nuoleineäure enthaltenden Substanz eine Phosphodiesterase enthaltende Substanz zugegeben, die von den. Saimlingen aus einer oder mehreren ausgewählten Arten von Pflansensamen stammen. Dar Abbau kann auf eine der folgenden drei Arten erfelgsn» 1) 3>sr Abbau erfolgt getrennt im sauren oder alkalisehen_Β©5?©1ο&_e 2), Der Abbau erfolgt in beiden Bereichen gemelasa»-nafi uixä ein«- oder aehraale abwechselnd wiederholt* 3} Di« Ph)08phoii@stersa» enthaltende Substanz wird nicht einmalig, sondern in ein oder nehreren getrennten Anteilen zugegeben, und zwar immer dann» wenn der Abbau vom sauren in den alkalischen Bereich oder umgkehrt verschoben wird.

Die bisher zum Abbau von Nucleinsäuren dienenden Enzyae sind bekanntlich in hohem Made in Lebewesen, Pflan*en und Hi%oorganismen zu finden« Die bekannten industriellen Verfahren zur Herstellung von Nucleotiden durch den Abbau von Nucleinsäuren haben, was die Bohstoffe» die Behandlungsweise* dit Kosten und die Art der 3raau|paia·· anbetrifft, Vor« und Nachteil«, Di« Brfindun« beiiert hauptBaohlioh auf 4er Ver-

■■■■"' BAD

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wendung von Enzymen aus den Keinäingen τοη Pflanzensamen, iie nach den folgenden Gesichtspunkten ausgewählt werden ι 1) Die !Rohmaterialien für die Enzyme Bussen leicht zugänglich sein.

2) Das ausgewählte Enzym auß Jederzeit reproduzierbar sein.

3) Daβ Enzym muß leicht herstellbar und hyirοIyeierbar sein.

4) Die Ausbeute der erzeugten luoleotide maß grofl und die dabei anfallenden Kosten müssen gering sein.

DJs Gründe dafür, daß erfindungsgemäß Pflanzenkeimlinge anstatt der Samen oder anderen Teilen der Pflanzen verwendet werden, sind die folgendem 1) Wenn Pflanzensamen oder andere Teile der Pflanzen keimen, dann steigt die Erzeugung von üucleinsäuren schrittweise an· Di« erzeugte Vucleinsäure wird anschliessend mit dem Wachsen der Keimlinge abgebaut, tsren Stoffwechsel durch Phosphodiesteras« gelenkt wird, die eine starke Aktivität hat und in großen Kengen im Vergleich zu den Mengen des gleichen Enzyms in unversehrten Pflanzensamen oder anderen feilen der Pflanzen vorliegt« 2) Die Phosphediesterase, die ohne Stoffwechsel außer Atmung aus Pflanzensamen extrahiert wird, unterscheidet sich chemisch, vom gleichen Enzym «us den mit starkem Stoffwechsel wachsenden Keimlingen·

Die Erfindung wird nun auoh anhand der beiliegenden Abbildungen ausführlich beschrieben, wobei alle aus der Beschreibung und den Abbildungen hervorgehenden Einzelheiten oder Merkmale zur Lösung der Aufgabe im Sinne 4er Erfindung beitragen können und mit dem Willen *ur Patentierung in die Anmeldung aufgenommen werden.

Die Tig. 1 zeigt die optimalen pH-Wert· beim RIA-Abbau iuieh BohenzymlSsungen, die aus den Keimlingen *«r Mungo be hne, de β Koggen· und der italienischen Hirse hervorgehen.

BAD

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-3-

Die ?ig. 2 zeigt den Abbau von rohem SNA gemäß des im folgenden beschriebenen Versuche 2.

Zunächst wird auf die folgende Art vorgegangen· Saman von Getreide, Erbsen und anderen Pflanzen werden zum Keimen gebracht, indem »an sie 5 bis ? lage lang bei 25 - 3o°C an einem feuchten Ort aufbewahrt; Anschliessend wird jeder Keimling in eine seinem Yolumen entsprechende Menge kaltes Wasser geiseben und daraufhin mit sauberem Sand gemahlen. Die Mischung wird zentrifugiert, um eine abstehende Flüssigkeit su erhalten, die bei den folgenden Versuchen als BohenzymlSsung verwendet wird.

1 ml jeder Rohensymlusung wird mit einer Mischung von o,3 ml einer 5J*ig*n RIA-LUsung und ο,7 ml eines o,l m Acetatpuffers (pH β 4,5) versetzt und das ganze dann 2 Stunden lang bei 60 -. 65°C erwärmt· Die erhaltene Mischung wird nach Zugabe von o,4 ml Mo fadyen-Reagenz zentrifugiert und mit Eis gekühlt. Danach wird die optische Dichte (A) der abstehenden und im Verhältnis 1 : Ioο mit Wasser verdünnten Lösung bei einer Wellenlänge von 260 mn gemessen. Andererseits wird auf bekannte !feie« die BIA abgebaut, indem zunächst o,3 η EOH hinzugefügt werden, um eine Konzentration von o,75 1» zu erhalten, und dann 18 Stunden lang bei 37⁰C erwärmt wird. Die optische Dichte (S) der wie oben behandelten ReaktionsluBung wird dann ebenfalls mit 260 mn gemessen. Als Ergebnis dieser Messungen ergibt sich anhand der folgenden formel der scheinbare Abbaukoeffizientt (£) «= A/B "loo.

Die erhaltenen Koeffizienten sind zusammen mit den freien •anorganischen Phoephorgehalten der genannten Lösungen, die nach dem Fisk-Subbarow-Verfahren berechnet wurden, in der Te belle I zusammengestellt'·

SC3S8 6/16 4& BAD OB5G5NAL

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Tabelle I

-Abbau durch eine Phosphodiesterase enthaltende Substanz, die aus den Keimlingen verschiedener Pflanzensamen »ta,ent.

Scheinbarer Abbaukoefficient

Befreiung von anorganische* Phosphor (Jl)

Korn

Reis

Weizen

Boggen

Gerste

Hirse

Waldhirse

MiIomaie

82,3 85,4 97,6 64,6 80,2 84,8 92,1 18,5

9,4 12,o 15 ,"ο

6,o 13,8 35,6

Bote Bohnen Mungfcohnen Bohnen Grüne Erbsen Saubohne .

86,6 91,5 79,9 75,7 lo,5 8,4

25,4 3,7

Bettig

Gemüse Mohrrübe u. Spinat Blumen Winde

91,® 84,5 85,2 81,4 57,5 lo,5 13,9 16,7

o,3H KOH-Abbau(Kontrolle) Ιοο,ο

2,0

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BAD On&lNAL

Aus der tabelle I ergibt sieh, daß die Bohenzymlöeungen aus den Keimlingen Ton Getreide, Bohnen, Erbsen und anderen Pf la ns en eine stark* Phosphodiesterase-Aktivität besitzen. Gleichzeitig .wurde naoh einem ähnlichen Verfahren die Abbauaktivität von Phosphodiesterase gegenüber SIA beobachtet und die enzymchemische Iatür dieser fiohenzymlösungeii untersucht· Ss ergibt sich dabei, da 3 diese Lösungen durch Zugabe von Salzen yon Metallen wie Mg aktiviert werden und sehr hitzebeständig sind. Der optimale pH-Wert liegt in der Sähe von 4,5 oder von 7.5, wie sich aus der Pig, 1 ergibt, in der die erzeugten Mengen an säurelSslicher Substanz in Abhängigkeit rom pH-Wert durch, die optische Dichte bei 260 ψ. angegeben sind. Dabei handelt es sich, jeweils um !lösungen, die aus o,3 ml einer Sojiigen lösung der fi&A-Probe, ο,7 ml eines o,l m Acetatpuffere oder ο ,2 m Trispuffers und 1 ml der HohenaymlÖBung bestehen und 3© Minuten lang bei 37⁰O erwärmt wurden, Die Tateaehe, daß die Phoepkodiestera»β τοη Pflanzenkeialingen sowohl la teuren ale auch im aBcalißohen Bereich einen optimalen pH-Wert t.-ieitat, seugt von der Mannigfaltigktit ihrer Zusammensetzung. ,

Es wird daher bei den folgenden Verauchei. aua Abbau von luoleinaäuren von den oben erwähnten apeaifisohea 2ig©aaohaften der Pflansenkeimlinge Gebrauch gemacht. Itebei ««igt eich die Überlegenheit der beiden Verfahren, nach d«ien die Abbaureaktionen durchgeführt werten, nämiioh 4es getrennten Abbaus beim optimalen sauren oder beim optimalen alkalischen pH-Wert oder des gtmeinsaaen Abbaue beim optimalen pH-Wert auf beiden Seiten* ' , *

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Versuoh 1

Keimlinge von Mungo bohnen, tie aus Semen hervorgehen» welche 7 Sage lang im Dunklen bei 3O⁰O gehalten worden sind, werden in eine ihrem Volumen entsprechende Menge Wasser gegeben, mit sauberem Sand gemahlen und durch ein Tuch gefiltert· laohdem das Pil trat 3o min lang einer Wärmebehandlung bei 55 - 6O⁰C unterworfen ist, kann es als Bohensymlusung für weitere Versuche verwendet werden. 1000 g der Rohenzymlösung werden mit 1500 g einer wässrigen Lösung, die 100 g rohes BVA enthält, vermengt, wobei da β BHi. durch Bohrung der Mischung bei 60 - 65⁰C und bei einem pH-Wert von 5,ο 15 Stunden lang abgebaut wird. Der Abbaukoeffieient betrag in dienes XiHe 80 ji. Venn des RSA unter den* gleichen Bedingungen abgebaut wird, der pH-Wert der Löeung jedoch auf 7,5 anstatt auf 5,o eingestellt wird, dann beträgt ier Abbaukoeffienet 69 %* Vachdem der primäre Abbau 3 Stunden lang stattgefunden hat, wobei der pH-Wert 5,0 oder 7t5 beträgt unA Ate Bohentymlösung V su 2/3 (660 g) de* oben genannten Gewichts hinzugegeben wird, ; wird der sekundäre Abbau durohgiuhrt, indem Aer pE-Wairf von ; 5,0 auf 7,5 bsw. von 7,5 auf 5,ο verändert wird. AIq Erfebnia erhält man ainaii Abbauketffisie&ttii von erst IeI, 5 £ und ! dann von Io5,6 %. Die Ergebnieee 8ind in Aar Tabelle Z geeeigt. '

Tabelle II j EIA-Abbau duroa ihosphoAiaBtares« von Keimlingen der Mungobohnen

Beaktion pH-Wtrt RIA-LÖ— Beheneym- Abbau»«it Abiko I Bxeag (g) löeirni C«) M At# HäA

X -	5,o	1	,5οο	XfOOo
2	7,5	χ	#5οο	I₉OOO
3	5,0-7,5	1	.5οο	66ο
4	7,5-5,o	1	·5οο	66ο

15 θο,ο ' '

15 69,©

Io 1ο1,5

Xo Io5,6

909888/1648 . a^^-^'r '

Verauoh 2

15o al einer Hohenzymlösung, die auf die gleiche Weise wie bei» Versuch 1 hergestellt worden ist) werden mit 22 g rohem EHA rermengt. Haehdem die Mischung durch Hinzugeben von Wasser aufgelöst ist, wird ihr pH-Wert durch konzentrierte Salzsäure oder konzentrierte Natronlauge auf 5»o bzw. 7,5 eingestellt, •o dall man zwei Eeaktionslösungen von 51o al und einem pH-Wert τοη 7,5 bzw« 5,ο erhält* Beide Mischungen werden unter Rührung 2 1/2 Stunden lang bei 55 - 6O⁰G erwärmt (primärer Abbau). Anschliessend werden sie in je drei Teile geteilt,wobei der erste beim ursprünglichen pH-Wert gehalten wirdc der »weite auf einem pH-Wert gehalten wird, der von einem auf den anderen verändert worden ist, und der dritte mit 5© ml der oben erwähnten Bohenzymlösung versetzt und dann auf einem pH-Wert gehalten wird, der vom einen zum anderen verschoben werden ist. Die auf diese Weise erhaltenen ■eohe ReaktionslSsungen werden für den sekundären Abbau verwendet, wobei die Mischungen 3 1/2 h lang ;uhter den gleichen Bedingungen wie beim primären Abbau gehalten werden« Die Konzentration der Lösungen ohne Rohenzymlösung wirt durch Zugabe einer gleichen Menge Wasser eingestellt. Während des Erwärmens wird jeder Lösung in Abständen jeweils 1 ml entnommen und das Fortschreiten des Abbaue zusammen mit dem Abbaukoeffizienten des BHA untersucht, indem bei einer Wellenlänge von 260 bui die. optische Sichte der erzeugten säurelöBlichen Substanz gemessen wird. Sie Ergebisäe finden eich in der Tabelle III und der Fig. 2.

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BAD ORIGINAL

gabelle III

RHA-Abbau durch Ehosphodiesterase von Keimlingen der Mungo bohnen

Reaktion ph-Wert

prim-r sek« Reaktion Reaktion

optische Sichte Abbaukoefi- Bewerbungen bei 260 ψ. zient des RFA
(nach Endfe der
Reaktion)

1	5,o	5,o	l_#34o	8o,o
2	5,o	7,5	l,45o	86,o
3	5,o	7,5	l,49o	92,o
4	7,5	7,5	Ι,οοο	6o,o
5	7,5	5,ο	1.16o	7o,o
6	7,5	5.0	1.515	98,0

Enzymlösung

erneut zugegeben

Enzymlösung erneut zugegeben *

Sie Abbaukoeffizienten der Nucleinsäuren aus den Tabellen 2 und 3 werden durch den Prozentsatz des erzeugten Mononucleotids angegeben. Biese Erozentzahlen weichen vom scheinbaren Abbaukoeffizienten ab, welcher über die optische Dichte bei 260 m^a. der säurelöslichen Substanz nach der Behandlung der Reaktionslösung mit KeSadyen-Reagenz gemessen wird, und werden nach dem Verfahren von Bergkvist und anderen Berechnet, die die optischen Sichten derjenigen lösungen der absorbierten Substanzen bei 250, 260 und 280 ap messen, welche sich aus den Reaktionslösungen mit Säulen (Iyρ Ameisensäure) (!,ex 6_ro cm) eines basischen, Anionen austäuschenden Harzes (Sowex- 4oo - 12oo Maschen je Zoll) ergeben und mit nach dem Waschen mit Wasser in einer Mischung von Ameisensäure und Hatriumforaiat gelöst werden. Sie Nucleotide, die bei den Versuchen

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BAD

—ΟΙ \ind 2 entstehen, sind vom 5'-3JyP. Man stellt dies fest, indem man sie auf verschiedene Weise ₉ z.B. in Ionen austauschenden Öhromatorgrafiesäulen, durch die Carbazol-Reaktion, durch die Rf-Werte der Papierchromatografie oder mit Hilfe des Heppel-Yer fahr ens, untersucht und die Gewinnung des "befreiten Phosphors unter der Wirkung von §'-iTueleotidase untersucht, die in den Spermien von Bullen enthalten ist.

Die Ergebnisse der Versuche 1 und 2 zeigen, daß man die Abbaukoeffizienten der Nucleinsäure groß und die für diese .Reaktion benötigte Zeit klein machen kann, und daß die Menge des benötigten Enzyms geringer ist, wenn man im sauren und alkalischen Bereich gemeinsam und abwechselnd anstatt getrennt im sauren oder alkalischen Bereich abbaut.

Dacher '. wurde versucht, die Phosphodiesterase von der Rohenzymlösung, die in den oben beschriebenen Versuchen verwendet wird, mittels der Chromatografie mit Zellulose-Ionenaustauschern zu trennen. Dabei ergeben sich drei Arten der Phosphodiesterase, die einen optimalen pH-Wert bezüglich RNA bei 4,5 .5,ο bzw. 8,ο haben^äich auch gegenüber verschiedenen Substraten in spezifischer Weise verhalten. Daraus geht hervor, daß-jeder Keimling, der erfindungsgemäß verwendet wird, mehrere Arten saurer und alkalischer Phosphodiesterasen enthält.

Das Verfahren nach der Erfindung bezweckt daher, auf sehr einfache Weise eine hohe Ausbeute an Nucleotiden zu erhalten, was durch den Abbau aufgrund der einzelnen oder mehrfachen Wirkung der sauren und alkalischen Phosphodiesterasen in den Keimlingen erzielt wird. Eine maximale Wirksamkeit erhält man, wenn man die pH-Werte der Lösungen auf saure oder alkalische

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Zustände einstellt oder zusätzlich die pH-Werte vom sauren in den alkalischen oder vom alkalischen in den sauren Bereich verschiebt. Der Abbau im sauren oder alkalischen Bereich wird zum Beispiel erhalten, indem der Nucleineäure enthaltenden lösung ein oder mehrere Arten von Substanzen, die Phosphodiesterasen von Kei»- lingen enthalten, hinzugefügt werden oder indem man den pH-Wert der Lösung ins Alkalische verschiebt, um die Wirksamkeit des im gleichen Material enthaltenden alkalischen Enzyms zu beschleunigen, nachdem der Abbau unter der Wirkung des sauren Enzyms eine Zeitlang fortgeschritten ist. Entsprechend kann man auch den pH-Wert in den sauren Bereich Verschieben, um die Wirksamkeit des im gleichen Material enthaltenen sauren Enzyms zu fördern, nachdem eine Zeit lang unter der Wirkung des alkalischen Enzyms abgebaut wurde. Mit anderen Worten wird hydrolysiert, indem der Abbauprozeß getrennt in sauren und alkalischen Reaktionen oder gemeinsam mit einmaliger oder mehrmaliger Wiederholung abwechselnd abläuft. Bei gemeinsamer Hydrolyse kann der pH-Wert zwar entweder vom sauren in den alkalischen oder vom alkalischen in den sauren Bereich verschoben werden, doeh.ist das erstere vorzuziehen. Manchmal ist jedoch auch eine gemeinsame Hydrolyse mit pH-Wert-Yersehiebung vom sauren in den alkalisehen Bereich und wieder zurück in den sauren Bereich vorteilhaft. Der gemeinsame Abbau kann wesentlich dadurch gefördert werden, daß man einen Teil der notwendigen Menge an Phosphodiesterase enthaltender Substanz immer dann zugibt, wenn der pH-Wert von der einen Seite auf die andere Seite verschoben i^Tst, nachdem für eine festgesetzte Zeit bei einem bestimmten pH-Wert abgebaut wurde. In diesem Fall kann die zugegebene Enzymlösung die gleiche Phosphodiesterase ,· enthaltende Substanz, eine ähnliche Substanz von dem Keimling einer anderen Pflanze oder einer Mischung ähnlicher Substanzen von ein oder mehreren verschiedenen Pflanzenkeimlingen sein.

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BoinaterialiezL werden gemäß der Erfindung die Hucleinsäure, ihre Derivate» ilire partiellen Hydrolysate oder auch, die in diesen enthaltenes Substanzen -verwendet. Mit BKA und SIiA werden Hucleinsäuren Bezeichnet» die in allen Organismen vorhanden sind. Unter Derivaten werden Kucleinaäuren verstanden, deren basieischer Teil umgewandelt ist· Partielle Hydrolysate der nucleinsäuren sind Substanzen, die man von der Hucleinsäure hoher Polymerisate enthält» Index uaa. letztere der Wirkung von Alkali oder Enzymen, z.B. Qligonucleotid, losliche EHA usw. unterwirft.

Sie genannten lohmaterialien brauchen keinen hohen Reinheitsgrad su haben und können auch verwendet werden, wenn sie Verunreinigungen wie Brot eine, Aminosäuren, Zucker, anorganische Salze, Pigmente und geringe Hengen Säuren oder Basen enthalten.

lach der Erfindung kann die Phosphodiesterase enthaltende Substanz» die *w& verschiedenen Pflanzenkeimlingen erhalten wird,-in einer der folgenden formen verwendet werden;

a) als lüivemarelirteir Keimling, der auf natürliche Weise gewachsen

ist
Ib) als geschnittener und pulverisiert er Keimling

e) als EeiaiaLingextafskt» der mit Wasser, verdünnter Zuckerlösung oder eimear geeigneten Pufferlösung hergestellt ist.

Bie Extraldfe käniteii in einen Zustand hoher Aktivität oder leichter Konservierung geöracfet werden, indem man sie nach verschiedenen Verfahren!» ss.B· des Einsalzen oder Vergüten behandelt, indem man sie mit eiaeiE ©rgsaiseheii lösungsmittel ausfällt, adsorbiert oder chrou^togESfiert· Obwohl der wirksame pH-Bereich der

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Phosphodiesterase enthaltenden Substanz im sauren Bereich zwischen 3 und 7 und im alkalischen Bereich zwischen 7 und * liegt, sind die zwischen 4 und 6,5 bzw. 7 und 8,5 liegenden Bereiche vorzuziehen. Außerdem ist diese Substanz in einem Temperaturbereich zwischen 3o und 85⁰C wirksam, wobei der optimale Bereich zwischen 55 und 65⁰C liegt. Beim kombinierten Abbau wird eine Zeitspanne von 1-5 Stunden für das Verschieben des pH-Wertes als zweckmäßig angesehen, während der Abbau im allgemeinen in höchstens Io Stunden vollendet werden kann. Größere Abbauzeiten bringen jedoch noch bessere Ergebnisse, Zu Beginn des Abbaus der Nucleinsäuren sollte die Phosphodiesterase enthaltende Substanz in Form von Pflanzenkeimlingen in einer Menge zugegeben werden, die dem 3- bis lo-fachen Gewicht der Nucleinsäure entspricht.

Unter Berücksichtigung der aufgeführten Bedingungen besteht das Verfahren nach der Erfindung im wesentlichen darin, daß der Abbau der Nucleinsäure dadurch fortschreitet, daß eine Phospho-

diesterase enthaltende Substanz zugegeben wird, die aus Pflanzenkeimlingen hergestellt wird, welche aus Samen entstehen, und daß man getrennt in sauren oder alkalischen Bereich abbaut oder den Abbau in beiden Bereichen gemeinsam stattfinden läßf, wobei das Abwechseln der Bereiche ein- oder mehrmals wiederholt und die Phosphodiesterase enthaltende Substanz nicht in einem, sondern in zwei oder mehreren Anteilen getrennt zugegeben wird. Beim kombinierten Abbau wird die Ausbeute der Nucleotide durch eine wesentlich größere Reaktionsgeschwindigkeit unter vereinfachten Betriebsbedingungen und bei geringeren Kosten vergrößert.

Im folgenden werden einige Ausführungsbeispiele angegeben.

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Beispiel 1

80 g Keimlinge aus dem Samen italienischer Hirse (Panic grase), die aufgegangen sind, nachdem man sie 24 Stunden lang gewässert und dann bei gelegentlicher Berieselung mit Wasser 5 lage lang auf 25⁰C gehalten hat, werden im doppelten Volumen einer■Acetatpufferlösung (pH =4,5) getränkt und in einem Mörser völlig mit sauberem Sand verrieben* Der so hergestellte Stoff wird mit 5oo ml einer 2$igen RHA-Lösung versetzt. Diese Mischung wird nach Zusatz von o,ol $> 3J₃I¹ unter gelegentlichem Rühren 2 Stunden lang bei 65⁰C und einem pH-Wert von 4,5 erwärmt."Die Zusammensetzung der Mononucleotide im FiItrat wird durch Analyse mit einem Ionenaustauscher-Chromatographen nachgewiesen. Es ergeben sieh 580 mg 5'-Cytidylsäure, (5'-0MP), 64o mg 5'-Adenylsäure, (5'-AMP), 600 mg 5'-nridylsäure (5'-UMP) und 680 mg 5*-Guanylsäure (5'-GMP).

Beispiel 2

Aus 15o g Roggenmalz werden-3oo ml Rohenzymlösung hergestellt. Das Malz, welches nach 24-stä'.ndigem Wässern und nach einem 4-tägigen Halten auf- 28°G entstanden ist, wird in dem doppelten Volumen einer Acetatpufferlösung geträfct, zerrieben und durch ein Baumwolltuch filtriert. Die gesamte derart hergestellte Rohenzymlösung wird mit 3oo ml einer Lösung versetzt, die 6 g DUA (hergestellt aus Heringspermien) enthält. Diese Mischung wird denn unter gelegentlichem Rühren 3 Stunden lang bei einem pH-Wert von 5 auf 65°C gehalten. Man erhält eine lösung mit 390 mg S^-Desoxycytidylsaure, 37o mg 5'-Desoxyadenylsäure, 42o mg 5^t-Desoxythymidylsäure und 36o mg 5^!-Desoxyguanylsäure.

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Beispiel 3

loo g Weizenmalz, welches nach, dem Aufgehen "bei 28 C 5 Tage alt ist, wird im doppelten Volumen kalten Wassers getränkt, drei Minuten lang in einem Mixer zerrieben und durch ein Baumwolltuch filtriert. Das erhaltene Mltrat wird gekühlt, "bei 0 Ms I⁰C gehalten und anschließend mit dem doppelten Volumen kalten Äthanols versetzt, welches unter Bohrung tropfenweise zugegeben wird. Die Mischung wird bei der genannten Temperatur über ITaent stehen gelassen und der gebildete Niederschlag durch Zentrifugieren gesammelt. Der Niederschlag wird nach dem Waschen und Entwässern mit kaltem Äthanol im Vakuum gatrocknet, wobei sich o,5 g eines grauen Pulvers ergeben. Eine Probe des pulverförmigen Enzyms wird analysiert. Es ergeben sich eine starke Aktivität an 5^!-Phosphodiesterase und ein Reinheitsgrad, der dreimal größer als der des anfänglichen Extraktes ist. Das gesamte Volumen des pulverförmigen Enzyms wird mit loo g einer wässrigen lösung versetzt, die 31 g RNA enthält, und Io Stunden lang bei einem pH-Wert von 7,5 und bei 40⁰C erwärmt. Man erhält eine Lösung, die o,4o g 5'-CMP, o,45 g 5'-AMP, o,51 g 5^f-ÜMP und o,59 g 5^f-CMP enthält.

Beispiel 4

8 kg eines Extrakts, das durch Filtern von zerriebenem Malz der Mungobohnen hergestellt wird, welches sich a us 6 Tage lang bei 25⁰C gehaltenen Samen ergibt, werden mit einer 260 g INA enthaltenden Lösung versetzt, die im schwach alkalischen Bereich bei 90⁰C aus vier kg trockener Hefe extrahiert wird, die im achtfachen Volumen einer verdünnten wässrigen Tafelsalzlösung gelöst ist. Die Enzymlösung wird jedoch im sauren Bereich (pH = 4,5) vor dem Versetzen einer 3o-minütigen Wärme-

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behandlung bei 6O⁰O unterworfen, um die Aktivität der gleichfalls vorhandenen Phosphatese zu hemmen.

Die Abbaufähigkeit des Hefeextrakte, das 6 Stunden lang bei einem pH-Wert von 4,5 auf 60 - 65°C gehalten wird, zeugt von einer nahezu vollständigen Hydrolysierung des EHA. Die erzeugte Reaktionslösung enthält an Nucleotiden 52 g 5'-OMP, 62,4 g 5^f-AMP, 66,5 g 5'-UMP und 56,7 g 5^f-GMP. Dieser Lösung werden 5o S Tabakdiastase, ein Pulver, zugeführt, und die Mischung wird 5 Stunden lang bei einem pH-Wert von 6 und 45⁰O erwärmt. Als Ergebnis erhält man eine fast vollständige Endamisierung des 5'-AMP und dessen Verwandlung in 56,2 g 5'-Inosinsäure (5'-IMP). Es ergibt sich eine Lösung, die 5'-0MP, 5*-UMP und 5'-GMP in nahezu den gleichen Mengen wie oben angeg&en enthält.

Beispiel 5

5oo g MungobohnenmaIz, das aus 7 !Tage lang bei 25⁰C gehaltenen Samen entsteht, werden in dem gleichen Volumen kalten Wasser getränkt und dann zermahlen. Durch Filtern des zerriebenen Materials erhält man ein Extrakt, aus dem durch. Zentriflgierung 900 g Rohenzymlösung entstehen. Die Rohenzymlösung wird bei 1 - 3⁰C gehalten und unter Rührung mit einer tropfenweise zugegebenen gesättigten Amaoniumaulfatlösung versetzt, bis sich ein Sättigungsgrad von o,5 ergibt. Anschliessend wird die Mischung über Nacht bei o- I⁰C gehalten. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugierung gesammelt und in loo g kalten Wassers aufegelöst.,Die entstehende Lösung wird in ein Zelluloserohr gegeben und 24 Stunden lang mit fließendem Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wird auf 0 - I⁰O gehalten und unter Rührung mit tropfenweise zugegebenem Äthanol vom gleichen Volumen versetzt. Diese Mischung wird dann über Nacht bei der erwähnten Temperatur stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wird erneut

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dureh Zentrifugierung gesammelt, Nach dem Waschen und Entwässern mit kaltem Äthanol wird er dann im Vakuum getrocknet, worauf man 35 g eines grauen Pulvers erhält. Die hier e*:3ärte Vergütung ergibt sich auch aus der folgenden Tabelle 4.

« Tabelle IV

Reinigung einer Phosphodiesterase aus Mungobohnen

Reinigung

Protein-Stickstoff

Gesamt

Spezifische Aktivität

Reinigung

Rohes
Extrakt

l,8oo

4,590

2,5

(HH₄)₂SO₄
Niederschlag

Ι,οΐο

3₁94o

3,9

1,5

Äthylalkohol
Niederschlag o,2oo

2_t86o

14,3

5,7

Das gesamte Volumen des Enzympulvers wird einer 1,25 g schweren wässrigen Lösung zugegeben, die 38 g rohes RNA (Reinheitsgrad 65 %) enthält. Die Mischung wird vier Stunden lang bei'einem pH-Wert von 4,5 und einer Temperatur von 65⁰C erwärmt und man erhält eine Lösung, die 3 g 5'-CMP, 4,8 g 5¹^-AMP,. 5,4 g 5' 4,4 g 5'-9MP und'2,4 g Nucleosid (berechnet zu Adenosin). Der Abbaukoeffizient beträgt 80 #.

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Baispiel 6

KäuflicJies Mungobohnenmalz wird im gleichen Volumen Wasser getränkt und mit einem Mixer zerriebene Durch filtern durch ein Tuch enthält man aus dem zerriebenen Material ein Extrakt, das 3o min lang bei 55 bis 60⁰O erwärmt und dann als Rohenzymlösung verwendet wird. 300 g davon werden einer wässrigen Lösung von rohem RNA zugegeben, die dadurch hergestellt wird, daß man 2o g in einer geeigneten Menge Wasser auflöst. Der pH-Wert der Lösung·wird mit Salzsäure auf 5,o eingestellt. Auf diese Weise entsteht eine Reaktionslösung, mit 2 fo SUA. Sach dem Abbau im sauren Bereich, der unter Rührung zwei Stunden lang bei 60 - 5⁰O vorgenommen wird, wird die Reaktionslösung mit loⁿNaöH auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, worauf 4 Stunden lang bei der gleichen Temperatur im alkalischen Bereich abi-fgebaut wird. Die Reaktionslösung enthält dann 12,2 g 5^!-Mononucleotide, z.B. 5'-OMP, 5'-AMP, 5'-UMP und 5¹ GMP. Gleichzeitig damit baut man 6 Stunden lang bei einem pH-Wert von 5,ο bei sonst gleichen Bedingungen ab und erhält dabei lo,5 g 5¹-Mononucleotideo Schließlich beträgt die Ausbeute an 5'-Mononucleiotiden 9,4 g, wenn der Abbau zunächst 2 Stunden lang bei einem pH-Wert von 7,5 und anschliessend 4 Stunden lang bei einem pH-Wert von 5,ο fortgesetzt wird, während sie nur 7,9 g beträgt, wenn der Abbau 6 Stunden lang bei einem pH-Wert von 7_t5 stattfindet.

Beispiel 7 ■ * ' "

Bs wird eine Rohenzymlösung extrahiert, indem gemahlenes Roggemalz filtriert wird, das aus Samen gewäechsen ist, die 6 Tage lang unter gelegentlichem Besprühen mit Wasser bei 25⁰C gehalten werden. Anschliessend wird die Lösung bei 55 - 60⁰O 3o min lang einer Wärmebehandlung unterzogen, um die Aktivität der ebenfalls vorhandenen Phosphatase zu dämpfen« Zwei Kilogramm der Rohenzymlösung werden einer 65 g RNA enthaltenden Lösung zugegeben, die

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im schwachalkalischen Bereich "bei 9O⁰C aus 1 kg getrockneter Hefe extrahiert worden ist, welche in #m achtfachen Volumen einer l#igen Tafelsalz-Lösung vorliegt. Nach dem primären Abbau von ENA, der etwa 3 Stunden lang bei einem pH-Wert von 5 - 5»6 und bei 55 - 60⁰C stattfindet, wird der pH-Wert der Lösung mit konzentrierter NaOH auf 7|6 verändert. Die erhaltene Lösung wird in zwei Teile geteilt. Die sekundäre Zersetzung wird dann 5 Stunden lang bei 60⁰C durchgeführt, wobei einem der beiden Teile erneut 500 g der oben genannten Eohenzymlösung, dem anderen der beiden Teile jedoch nichts hinzugefügt wird. Es ergibt sich, daß der Abbaukoeffizient des ENA im ersteren Beispiel bei 77 i° und im zweiten bei 62 $ liegt.

Beispiel 8

1,8 kg einer Eohenzymlösung, die wie im Beispiel 6 aus dem Malz der Mungobohne gewonnen wird, werden auf 1 - 3⁰C abgekühlt und dann bis zu einem Sättigungsgrad von o,5 mit festem Ammonium-Sulfat versetzt. Die Mischung wird zum Absetzen bei o- I⁰C über Nacht stehen gelassen. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt und in 15o g kaltem Wasser gelöst. Anschließend wird die Lösung 24 Stunden mit fließendem Wasser diallysiert. Nachdem der pH-Wert der dialysierten Lösung auf 4,ο eingestellt ist, werden 3oo g Kalziumphosphatgel hinzugefügt. Nach heftigem Eühren wird zentrifugiert und das Abstehende entfernt. Das zurückbleibende &el wird mit Wasser gewaschen und viermal nacheinander mit einer o,l m Na₂HPO.-Lösung extrahiert, so daß man 2oo g Extrakt erhält, das 24 Stunden lang mit fließendem Wasser dialysiert wird. Der dialysierten Lösung, die bei 0 - I⁰C gehalten wird, wird bis zu einer Konzentration von 50 # kaltes reines Äthanol zugefüfegt. Die Mischung wird über Nacht bei 0 - I⁰C stehen gelassen. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt und im Vakuum getrocknet. Man erhält o,3 g eines grauen

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Pulvers. 1780 g einer wässrigen Lösung,, die 76 g rones RNA enthält, werden o,15 g dieses Enzympulvers beigefügt und die Mischung wird 1,5 Stunden lang bei einem pH Wert von 4,5 und bei 55 - 6O⁰C erwärmt. Kac&dem der pH-Wert der lösung auf 8,0 geändert ist, werden nochmals o.l5 & des Enzympulvers in die Mischung gegeben, die dann 4,5 Stunden erwärmt wird. Die Analyse ergibt, daß die ReaktioBslösung 38,6 g 5^f-Mononucleotide und die gleiche Menge Nucleoside "und Oligonucleotide enthält.

Beispiel 9

15o g einer Rohenzymlösung, die wie in Beispiel. 2 aus dem MpIz von Roggen gewonnen wird, werden mit 35° g einer wässrigen Lösung, die 21,5 g der RohenzymlSsung enthält, versetzt und die Mischung wird 2,5 Stunden lang bei einem pH-Wert von 5,5 und bei 60 - 65⁰C erwärmt(primärer Abbau). Anschliessend wird der pH-Wert der Lösung auf 8,5 geändert und der alkalische Abbau vollzogen (sekundärer Abbau). Die sich ergebendes Reaktionslösung wird mit 90 g einer "Röhenzymlösung, die wie im Beispiel 6 aus dem Malz der Mungobohne hergestellt wird, versetzt. Die Mischung wird 4 Stunden lang bei einem pH-Wert von 4,5 im sauren Bereich abgebaut (tertiärer Abbau). Dabei werden 75 # der RIiA zu 5'-Mononucleotiden zersetzt.

Bejg)iel Io

Das Malz von italienischer Hirse, das aus einem Samen entsteht, der 24 Stunden lang mit Wasser berieselt und 5 Tage lang bei 25⁰C gehalten wird, wird'nacii dem Tränken in dem doppelten Volumen kalten Wassers zerrieben. Eine Suspension, die 5oo g trockene Hefe enthalt, wird-mit 1,2 kg des zerriebenen Materials zersetzt, und anschliessend wird die Mischung unter Rührung 4 Stunden lang bei einem pH-Wert von 5,ο und bei 50 - 55⁰C erwärmt. Der Reaktionslösung werden 1 kg einer loixenzymlosung von Weizenmalz hinzugegeben,

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die am 6. fag nach, dem Aufgeben, in der gleichen Weise behandelt worden ist, wie das Roggenmalz in Beispiel 2. Nachdem der pH- ; Wert der Mischung auf 7»5 geändert ist, wird die Mischung 5 Stunden lang bei der genannten Temperatur erwärmt. Mf erhaltene Reaktionslösung enthält 9»2 g S'-Mononueleotide, 5,8 g 3*~Μοηο-Nucleotide und 2,5 g Nucleoside.

Beispiel 11

Es wird eine Rohenzymlösung hergestellt; indem die gleichen Volumina zweier Extrakte, die wie im Beispiel 2 aus dem Malz von ungeschältem Reis und von Roggen hergestellt sind, gemischt werden, wobei beide aus Samen entstanden sind, die 5 Tage lang bei 30⁰C gehalten wurden. 700 g der Rohenzymlösung werden mit 1,3 kg einer wässrigen Lösung, die 72ο g rohes RNA enthält, versetzt, und der pH-Wert der Mischung wird auf 8,0 eingestellt· Die Reaktionslösung wird erst 4 Stunden lang bei 45 - 50⁰C und anschließend 3 Stunden lang im sauren Bereich abgebaut, nachdes der pH-Wert auf 4,5 geändert worden ist.Der Reaktionslösung werden 300 g der Rohenzymlösung von MungobohnenmaIz hinzugefügt, die man wie im Beispiel 6 herstellt, und nachdem die Lösung eine Stunden lang bei 60⁰C und einem pH-Wert von 7,2 abgebaut ist, wird der pH-Wert a£ 5,ο verschoben und dann 4 Stunden lang im sauren Bereich abgebaut. Nach diesen vier aufeinanderfolgenden Abbauvorgängen enthält die Reaktionslösung 40,2 g 5'-Mononucleotide 4 g Nucleoside, etwas 3'-Mononucleotid und etwas Oligonucleotid.

Beispiel 12

12o "kg einer Rohenzymlösung oder die Hälfte einer'Lösung, die wie im Beeispiel 6 aus dem Malz der Mungobohne hergestellt ist,

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werden 3oo kg einer wässrigen Lösung, die 2o kg rohes ENA (handelsübliches, Reinheitsgrad 5S₅, 4 S) enthält, hinzugegeben. Die Mischung v/irfi bei einem pH-Wert von 7,5 und "bei 60 - 65°C 5 Stunden lang unter Rührung erwärmt,, Haehdem die restliche Hälfte von 12g kg der Reakt ions 18 sung augegeben ist ₉ wird der pH-¥ert der Lösung auf 5₉o verändert und anschließend etwa Io Stunden lang bei der gleichen Temperatur erwärmt.

Die Analyse der abgebauten Lösung ergibt, daß die erzeugten Mononucleotide 19,1 $ 5'-OMP im Verhältnis zur reinen Bucleinsäure in der rohen Nucleinsäureprobe, 25, 0 # 5'-βΜΡ, 28, 1 $ 5'-AMP, 28, 7 $> 5'-SMP und 4,7 $ nucleoside (berechnet als Adenosin) oder insgesamt Io5,6 fo enthält. Die liucleinsäurs ist also vollständig abgebaut worden.

Beispiel 13

Einem Extrakt aus Grerstenmalz, dessen Samen 6 lage lang bei 30⁰O gehalten wird und das wie das Roggenmalzextrakt im Beispiel 2 entsteht, werden o,ol fo ETatriumfluorid zugefügt» Die Mischung wird unter völliger Hemmung der Aktivität der ebenfalls vorhandenen STucleotidase 3o min lang bei einem pH-Wert von 5,6 und bei 55⁰C erwärmt. 100 ml der Rohenzyinlösung werden mit 200 ml einer wässrigen Lösung vasetzt, die 2o g aus Fisehpermien hergestelltes DHA enthält. Nachdem die Lösung 3 Stunden lang unter Rührung bei einem pH-Wert von 7,5 und bei 60⁰O hydrolysiert worden ist, werden 100 ml der gleichen Rohenzymlösung hinzugegeben. Die Mischung wird dann 15 Stunden lang bei einem pH-Wert γοη 5,ο und bei 60⁰G erwärmt. Die Analyse der hydrolysierten Lösung zeigt, daß diese o,42 g 5'-DeSOXyDMP, o,4o g 5'-DesoxyAMP, o,45 g 5*-DesoxyTMP und o,43 g 5'-DeSOXyGpMP oder _?1,70 g 5'-Desoxynueleotide insgesamt enthält. Wenn die Mischung jedoch nach der zweiten Zugabe der Rohenzymlösung 15 Stunden lang bei einem pH-Wert von 7,5 , das · heißt ohne Änderung des pH-Wertes, erwärmt wird, dann enthält die hydrolysierte Lösung nur o,81 g 5^t-Desoxynucleotide.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Nucleotiden durch Abbau von Nucleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure oder eine Nueleinsäure enthaltende Substanz, der eine Phosphodiesterase enthaltende Substanz zugefügt wird, die aus den Keimlingen einer oder mehrerer ausgewählter Pflanzensamen hergestellt ist , im sauren oder alkalischen Bereich abgebaut wird.

2. Verfahren zur Herstellung von Nucleotiden durch Abbau

von Nucleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure oder eine Nucleinsäure enthaltende Substanz, der eine Phosphodiaster.ase enthaltende Substanz zugefügt wird, die aus den Keimlingen einer oder mehrerer ausgewählter Pflanzensamen hergestellt ist, im sauren und im alkalischen Bereich abgebaut wird, wobei der Abbau nacheinander oder mehrmals abwechselnd nacheinander vorgenommen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet, daß die. Phosphodieeterase enthaltende Substanz ein-oder mehrmals in getrennten Mengen dann hinzugegeben wird, wenn der Abbau vom sauren Bereich in den alkalisehen Bereich oder umgekehrt verschoben wird.

SÜS83S/1SÄ8

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