CH205162A - Verfahren zur Gewinnung eines Gemisches von Nucleosiden aus Hefenucleinsäure durch fermentative Spaltung. - Google Patents

Description

  Verfahren zur Gewinnung eines Gemisches von     Nucleosiden    aus     ITefenucleinsäure     durch     fermentative    Spaltung.    Gegenstand der Erfindung ist ein Ver  fahren zur Gewinnung     eines    Gemisches von       Nucleosiden    aus     Hefenucleinsäure    durch     fer-          mentative    Spaltung, welches dadurch aus  gezeichnet ist, dass     Emulsin    bei einer Tem  peratur von 30 bis 40   C und einem     pH-          Wert    von 4,0 bis 5,

  5 auf die     Ilefenuclein-          säure    zur     Einwirkung    gebracht wird. Es  wird so ein: Gemisch der in der     Nucleinsäure     vorgebildeten     Nucleoside        (Guanosin,        Adeno-          sin,        Uridin    und     Cyti        din)    erhalten.  



  Die Isolierung von     Nucleosiden    aus       Nucleinsäuren    auf     fermentativem    Wege ist  bereits mehrfach gelungen. Dabei verwen  dete man     Fermentpräparate    pflanzlichen,  meist jedoch tierischen Ursprungs.

   Diese Prä  parate     besitzen    jedoch neben der     polynueleo-          tidatischen    und     nueleotidatischen    Wirkung,  durch die allein aus     Nucleinsäuren    die. dort  vorgebildeten     Nucleoside    freigelegt werden,  gleichzeitig     nucleosidatische        bezw.    desami-         nierende    Eigenschaften.

   Trotz umständlicher  und zeitraubender Arbeitsweise erhält man  daher bei der im Rahmen wissenschaftlicher  Untersuchungen beschriebenen     Einwirkung     von zum Beispiel     Presssaft    von Spinat oder       Cortinellus        edodes    oder     Nucleotidase    aus  Leber     bezw.    Darmschleimhaut auf Hefe  nucleinsäure nur     äusserst    geringe     Ausbeuten     an     Nueleosiden    neben weiteren Spaltproduk  ten, wie     Inosin,        Hy        poganthin    und     dergl.,

       so dass solche Verfahren für eine technische       Anwendung    nicht in Betracht kommen.  



  Es war überraschend zu finden, dass       Emulsin    (Helferich, Ergebnisse der Enzym  forschung,     Bd.    7, S.84;     Bredereck,    ebenda  S. 117), welchem -man bisher lediglich     gly-          kosidatisehe    Wirkung zuschrieb,     polynucleo-          tidatische    und     nucleotidatisehe,    aber keine       nucleosidatische    und     desaminierende    Wir  kung besitzt, so dass es     Hefenucleinsäure    bei  einem     pH-Wert    von 4,0 bis 5,

  5 lediglich bis      zu den in der     Nucleinsäure    vorgebildeten       Nucleosiden    aufspaltet.  



  Zwecks Erzielung guter Ausbeuten er  folgt die Einwirkung des     Emulsins    zweck  mässig bei etwas erhöhter Temperatur (etwa  30 bis 40' C) und während mehrerer Tage;  die Einwirkung wird vorzugsweise bis  zum Stillstand der     Phosphorsäureabspaltung     durchgeführt. Je nach der Reinheit des ver  wendeten     Emulsins    wird dieser Stillstand  nach etwa 8 bis 14 oder mehr Tagen er  reicht. Eine     Phosphorsäureabspaltung    ist an  sich bereits nach wenigen Stunden feststell  bar; eine derart kurze Einwirkung ist jedoch  für die technische Gewinnung der     Nucleoside     ungeeignet.  



  Bei Einwirkung von Mandel -     Emulsin     auf     Hefenucleinsäure    bei einer Temperatur  von 30 bis 40' C und einem     pH    von 4,0 bis  5,5 kann man insbesondere das     Guanosin    und  das     Adenosin    im Gemisch in hervorragender       Ausbeute    gewinnen.

   Aus 100 g     Hefenuclein-          säure    können so etwa erhalten werden: 18 g       Guanosin,    10-12 g     Adenosin,    5 g     Uridin     und eine geringere Menge     Cytidin.    Dem  gegenüber sind die nach den bisherigen Me  thoden erhaltenen Ausbeuter, verschwindend  gering.  



  Wie aus den vorstehenden Ausbeute  zahlen ersichtlich, wird es durch die Verwen  dung des     Emulsins    gemäss dem vorliegenden  Verfahren - weil     Emulsin    keine     desami-          rierenden    und     nucleosidspaltenden    Eigen  schaften besitzt und die Aufarbeitung des  Reaktionsproduktes gegenüber sämtlichen  bisher untersuchten Spaltungsverfahren we  sentlich erleichtert ist - ermöglicht,     Guano-          sin    und das     Adenosin,    welches besondere  therapeutische Bedeutung besitzt, in fast  quantitativer Ausbeute zu erhalten.  



  <I>Beispiel:</I>  30 g     Hefenucleinsäure    in 100 cm' Wasser  werden mit Natronlauge (2 n) gegen     Lakmus     neutralisiert. Zur klaren Lösung werden  250 cm'     wässrige        Emulsin-Lösung        (Mandel-          Emulsin    vom     ss-Glucosidasewert    1; 1,00792 g  in 1 cm') zugegeben, mit     Acetatpuffer            (pH    - 4,92) auf 1000 cm' aufgefüllt. Die  mit etwas     Toluol    versetzte Lösung wird im  Brutschrank (37   C) aufbewahrt. Nach  etwa 8 Tagen werden weitere 250 cm'     Emul-          sin-Lösung    zugegeben.

   Nach insgesamt etwa  14 Tagen ist die Hauptmenge der     Nucle-          oside    in freier Form vorhanden, und es be  ginnt die Ausscheidung des kristallinen       Guanosins,    die nach einigen Tagen beendet  ist. Ausbeute: 5,5 g.  



  Das Filtrat kann mit Ammoniak neutrali  siert, durch Aufkochen von Eiweiss befreit,  dann im Vakuum bei<B>50'</B> C auf etwa 200     ein'     eingeengt werden. Aus der Lösung kann mit       Barytwasser    die Phosphorsäure entfernt wer  den; nachdem man wiederum auf etwa  200 cm' eingeengt hat, fällt man mit Schwe  felsäure das Barium aus.  



  Aus der Lösung kann mit wässeriger       Pikrinsäurelö        sung        Adenosin    als     Pikrat    ge  fällt werden. Ausbeute: 13 bis 15 g Roh  produkt. Die Freilegung des     Adenosins    aus  seinem     Pikrat    sowie die Abtrennung des     Cy-          tidins    (als Sulfat) und     Uridins    kann in an  sich bekannter Weise erfolgen. Ausbeute an       Cytidinsulfat:    1,5 g; Ausbeute an     Uridin:     1,5 g.  



  Das im vorstehenden Beispiel beschrie  bene Eindampfen der Lösung vor der Fäl  lung des     Adenosins    mit     wässeriger        Pikrio-          säurelösung    kann, wie sich zeigte, dadurch  erspart werden, dass der erwärmten, von Phos  phorsäure und überschüssigem Barium be  freiten und gegebenenfalls mit etwas Schwe  felsäure versetzten Lösung feste     Pikrinsäure     zugesetzt wird.  



  Die oben erwähnte Einwirkungsdauer des       Emulsins    von 14 Tagen kann durch eine  vorhergehende Behandlung der     Hefenuclein-          säure    mit Alkali herabgesetzt werden.  



  Die nach dem beschriebenen Verfahren  hergestellten     Nucleoside    werden als Zwi  schenprodukt zur Herstellung von Arznei  mitteln verwendet.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Gewinnung eines Ge misches von Nucleosiden aus Hefenuclein- säure durch fermentative Spaltung, dadurch gekennzeichnet, dass Emulsin bei einer Tem peratur von 30 bis 40 C und einem pH- Wert von 4,0 bis 5,5 auf die Hefenuclein- säure zur Einwirkung zebracht wird. UNTERANSPRÜCHE: 1.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Emulsin während mehrerer Tage zur Einwirkung gebracht wird. 2. Verfahren nach Patentanspruch und Un teranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Emulsin bis zum Stillstand der Phosphorsäureabspaltung zur Einwirkung gebracht wird.