BRPI0817108B1 - composição compreendendo uma proteína de fusão, kit compreendendo a referida composição e uso da mesma. - Google Patents

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L Morrison Sherie
Huang Tzu-Hsuan
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Univ California
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Abstract

composição compreendendo uma proteína de fusão, kit compreendendo a referida composição e uso da mesma esta invenção fornece novas porções quiméricas que mostram eficácia significativa contra cânceres. em certas modalidades, as porções quiméricas compreendem uma porção de direcionamento anexada a um interferon. em certas modalidades, as porções quiméricas compreendem proteínas de fusão, em que um anticorpo que se liga especificamente a um marcador de câncer está fundido ao interferon alfa (ifn-alfa).

Description

(54) Tftulo: COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UMA PROTEÍNA DE FUSÃO, KIT COMPREENDENDO A REFERIDA COMPOSIÇÃO E USO DA MESMA.
(51) Int.CI.: A61K 38/21.
(30) Prioridade Unionista: 21/09/2007 US 60/994,717.
(73) Titular(es): THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA.
(72) Inventor(es): SHERIE L. MORRISON; TZU-HSUAN HUANG; CAIYUN XUAN.
(86) Pedido PCT: PCT US2008077074 de 19/09/2008 (87) Publicação PCT: WO 2009/039409 de 26/03/2009 (85) Data do Início da Fase Nacional: 19/03/2010 (57) Resumo: COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UMA PROTEÍNA DE FUSÃO, KIT COMPREENDENDO A REFERIDA COMPOSIÇÃO E USO DA MESMA Esta invenção fornece novas porções quiméricas que mostram eficácia significativa contra cânceres. Em certas modalidades, as porções quiméricas compreendem uma porção de direcionamento anexada a um interferon. Em certas modalidades, as porções quiméricas compreendem proteínas de fusão, em que um anticorpo que se liga especificamente a um marcador de câncer está fundido ao interferon alfa (IFN-alfa).
1/107
COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UMA PROTEÍNA DE FUSÃO, KIT
COMPREENDENDO A REFERIDA COMPOSIÇÃO E USO DA MESMA
REFERENCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica prioridade e benefícios de USSN 60/994.717, depositado em 21 de setembro de 2007, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todas as finalidades.
DECLARAÇÃO DE APOIO GOVERNAMENTAL
Esta invenção foi feita com apoio governamental sob a Concessão N° CA87990, concedida pelo National Institutes of Health”. O Governo possui direitos sobre esta invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção pertence ao campo da Oncologia. São fornecidas construções quiméricas que possuem atividade anticâncer significativa.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Embora respostas imunológicas espontâneas contra antígenos associados a tumores (TAAs) (Hrouda e cols. (1999) Semin. Oncol. 26: 455-471) possam ser detectadas (Disis e cols. (1997) J. Clin. Oncol. 15: 3.363-3.367), as células malignas que causam a doença não conseguem despertar uma resposta imunológica que leve à rejeição. Muitos estudos demonstraram que é possível intensificar a imunogenicidade de células tumorais por introdução de moléculas imunoestimuladoras como, por exemplo, citocinas e moléculas co-estimuladoras nelas (Dranoff e Mulligan (1995) Adv. Immunol. 58: 417-454; Hrouda e cols. (1999) Semin. Oncol. 26: 455-471; Hurford e cols. (1995) Nat. Genet. 10: 430- 435); no entanto, a transferência gênica eficaz ainda permanece um desafio. Além disso, a erradicação de células
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2/107 cancerosas residuais pode necessitar do direcionamento a depósitos tumorais micrometastáticos amplamente dispersos que não são acessíveis à transferência gênica direta.
Tanto as respostas imunológicas inatas quanto as adaptivas são essenciais para a geração de proteção contra patógenos infecciosos e tumores. A comunicação cruzada entre imunidade inata e adaptativa é regulada por interações entre células e citocinas. As citocinas produzidas por células do sistema imune inato podem, direta ou indiretamente, ativar as células da resposta imunológica adaptativa e podem ter uma participação importante no desenvolvimento de imunidade antitumoral protetora (Belardelli e Ferrantini (2002) Trends Immunol. 23: 201208) . É crucial para a ativação do sistema imune inato a detecção de produtos bacterianos ou sinais de perigo que levem à liberação de citocinas pró-inflamatórias como, por exemplo, IFN-α, TNF-α e IL-1.
O IFN-α é uma citocina pró-inflamatória com potentes atividades antivirais e imunomoduladoras e é um estimulador da diferenciação e atividade de células dendríticas (DCs) (Santini e cols. (2000) J. Exp. Med. 191: 1.777-1.788). Os IFNs do Tipo I (IFN-α e IFN-β) possuem vários efeitos sobre a resposta imunológica (Theofilopoulos e cols. (2005) Annu. Rev. Immunol. 23: 307-336). IFN-α participa da diferenciação de células Th1 (Finkelman e cols. (1991) J. Exp. Med. 174: 1.179-1.188) e da sobrevida de longo prazo de células T CD8+ em resposta a antígenos específicos (Tough e cols. (1996) Science 272: 1.947-1.950).
Vários estudos demonstraram que os IFNs são capazes de exercer efeitos antitumorais tanto em modelos animais
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3/107 (Ferrantini e cols. (1994) J. Immunol. 153: 4.604-4.615) quanto em pacientes com câncer (14. Gutterman e cols. (1980) Ann. Intern. Med. 93: 399-406) . Além de aumentar a resposta imunológica adaptativa antitumoral, IFN-α pode aumentar a expressão do gene supressor de tumor P53 (Takaoka e cols. (2003) Nature 424: 516-523), inibir a angiogênese (Sidky e Borden (1987) Cancer Res. 47: 5.1555.161), e iniciar a apoptose (Rodriguez-Villanueva e McDonnell (1995) Int. J. Cancer 61: 110-11.417) em células tumorais. Embora essas propriedades sugiram que IFN-α deva ser uma substância terapêutica para o tratamento de câncer, sua meia-vida curta e sua toxicidade sistêmica têm limitado sua utilização.
SUMARIO DA INVENÇÃO
Em várias modalidades, esta invenção pertence à descoberta de que a adesão de um interferon a uma porção de direcionamento (por exemplo, uma molécula que se liga específica e/ou preferencialmente a um marcador em uma célula ou associado a uma célula) aumenta substancialmente a eficácia terapêutica do interferon e parece que reduz a toxicidade sistêmica. Consequentemente, em várias modalidades, esta invenção fornece construções que compreendem um interferon anexado a uma porção de direcionamento e usos dessas construções para inibir específica e/ou preferencialmente o crescimento ou a proliferação ou até mesmo matar certas células-alvo (por exemplo, células cancerosas).
Consequentemente, em certas modalidades, é fornecida uma construção quimérica em que a construção compreende um interferon (por exemplo, interferon-alfa, interferon-beta,
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4/107 interferon-gama etc.) anexado a uma porção de direcionamento que se liga a um antígeno associado a tumor (TAA), em que a construção, quando colocada em contato com uma célula tumoral, resulta na morte ou inibição do crescimento ou da proliferação da célula tumoral. Em certas modalidades, é fornecida uma construção quimérica em que a construção compreende um interferon anexado a uma porção de direcionamento que se liga a um marcador da superfície celular ou um marcador associado a uma célula, em que o direcionamento não é anexado ao interferon por um espaçador (Gly4Ser)3 (ID. DE SEQ. N°: 31) . Em várias modalidades, o interferon é um interferon do tipo 1. Em várias modalidades, o interferon é um interferon do tipo 2. Em várias modalidades, o interferon é um interferon alfa, um interferon-beta ou um interferon-gama. Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um anticorpo que se liga a um antígeno associado a tumor. Em certas modalidades, a porção de direcionamento esta acoplada quimicamente ao interferon. Em certas modalidades, a porção de direcionamento está unida ao interferon com um espaçador peptídico. Em certas modalidades, o espaçador peptídico possui menos de 15, menos de 14, menos de 12, menos de 11, menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, menos de 6, menos de 5, menos de 4, menos de 3, ou menos de 2 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades, o espaçador possui 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 aminoácido de comprimento. Em certas modalidades, o espaçador não é (Gly4Ser)3 (ID. DE SEQ. N° : 31) . Em certas modalidades, o espaçador é um espaçador que é resistente ou substancialmente resistente à proteólise. Em
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5/107 certas modalidades, o espaçador peptídico é Gly4Ser (ID. DE SEQ. N°: 32). Em certas modalidades, o espaçador compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos encontrada na Tabela 2. Em certas modalidades, a construção é uma proteína de fusão expressa de forma recombinante. Em certas modalidades, o anticorpo se liga especificamente a um marcador selecionado do grupo que consiste em EGFR, HER4, HER3, HER2/neu, MUC-1, G250, mesotelina, gp100, tirosinase e MAGE. Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um anticorpo que se liga ao CD20. Em certas modalidades, a porção de direcionamento é um anticorpo de cadeia única que compreende as CDRS e/ou as regiões variáveis de um anticorpo selecionado do grupo que consiste em anti-CD20 (Rituximab), Ibritumomab tiuxetan, tositumomab, AME-133v, Ocrelizumab, Ofatumumab, TRU-015, IMMU-106, e semelhantes. Em várias modalidades, a porção de direcionamento é um
anticorpo que se liga a HER2. Em certas modalidades, o
anticorpo é um anticorpo C6. Em certas modalidades, o
anticorpo compreende as CDRs de VH e VL ou domínios de VH e
VL de C6MH3-B1. Em várias modalidades, o anticorpo é uma
IgG (por exemplo, IgG1, IgG3 etc. ), uma IgE, um Fv de
cadeia única (scFv), um FAB, um (Fab' )2, um (ScFv)2, e
semelhantes. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo selecionado do grupo que consiste em Rituxan, IFS, B1, 1H4, CD19, B4, B43, FVS191, hLL2, LL2, RFB4, M195, HuM195, AT13/5, HERCEPTIN®, 4D5, HuCC49, HUCC39ACH2 B72.3,
12C10, IGS, H23, BM-2, BM-7, 12H12, MAM-6 e HMFG-1. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo que se liga a um membro da família do receptor EGF. Em certas modalidades, o anticorpo é selecionado do grupo que
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6/107 consiste em C6.5, C6ML3-9, C6MH3-B1, C6-B1D2, F5, HER3.A5, HER3.F4, HER3.H1, HER3.H3, HER3.E12, HER3.B12, EGFR.E12, EGFR.C10, EGFR.B11, EGFR.E8, HER4.B4, HER4.G4, HER4.F4, HER4.A8, HER4.B6, HER4.D4, HER4.D7, HER4.D11, HER4.D12, HER4.E3, HER4.E7, HER4.F8 e HER4.C7. Em certas modalidades, a construção compreende um anticorpo IgG1 anti-HER2 anexado a um interferon.
Também são fornecidas formulações farmacêuticas. Em várias modalidades, as formulações compreendem uma construção quimérica que compreende um interferon anexado a uma porção de direcionamento. Em certas modalidades, a construção quimérica compreende uma construção como descrito acima (e/ou abaixo) (por exemplo, um interferon anti-CD20 e um interferon anti-HER2 etc.). Em certas modalidades, a formulação é uma formulação de dosagem unitária. Em certas modalidades, a formulação é formulada para administração parenteral. Em certas modalidades, a formulação é formulada para administração por meio de uma via selecionada do grupo que consiste em administração oral, administração intravenosa, administração intramuscular, administração tumoral direta, inalação, administração retal, administração vaginal, administração transdérmica e administração subcutânea de depósito.
Em várias modalidades, são fornecidos métodos para a inibição do crescimento e/ou da proliferação de uma célula cancerosa. Os métodos tipicamente envolvem o contato da célula cancerosa com uma construção quimérica, como aqui descrita. Em certas modalidades, a célula cancerosa é uma célula metastática, e/ou uma célula está em um tumor sólido. Em certas modalidades, a célula cancerosa é uma
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7/107 célula de câncer de mama. Em certas modalidades, a célula cancerosa é um linfoma de célula B. Em certas modalidades, a célula cancerosa é uma célula produzida por um câncer selecionado do grupo que consiste em um linfoma de célula B, câncer de pulmão, um câncer brônquico, um câncer cólonretal, um câncer de próstata, um câncer de mama, um câncer de pâncreas, um câncer de estômago, um câncer de ovário, um câncer da bexiga, um câncer do cérebro ou do sistema nervoso central, um câncer do sistema nervoso periférico, um câncer esofagiano, um câncer cervical, um melanoma, um câncer uterino ou endometrial, um câncer da cavidade oral ou faringe, um câncer hepático, um câncer renal, um câncer do trato biliar, um câncer do intestino delgado ou do apêndice, um câncer da glândula salivar, um câncer da glândula tireóide, um câncer da glândula adrenal, um osteossarcoma, um condrossarcoma, um lipossarcoma, um câncer do testículo e um histiocitoma fibroso maligno. Em várias modalidades, o contato compreende a administração sistêmica da porção quimérica a um mamífero. Em certas modalidades, o contato compreende a administração da porção quimérica diretamente em um local tumoral. Em certas modalidades, o contato compreende a administração intravenosa da porção quimérica. Em certas modalidades, a célula cancerosa é uma célula cancerosa em um ser humano ou em um mamífero não humano.
Em certas modalidades, são fornecidos ácidos nucléicos que codificam as construções quiméricas aqui descritas. Em várias modalidades, o ácido nucléico codifica uma proteína de fusão que compreende um interferon anexado a um anticorpo anti-membro da família EGFR, um anticorpo anti
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HER2, um anticorpo de cadeia única anti-C6, ou um anticorpo de cadeia única anti-CD20. Em várias modalidades, o interferon codificado pelo ácido nucléico é um interferon do tipo I. Em certas modalidades, o interferon é IFN-α ou interferon-β. Em várias modalidades, o ácido nucléico codifica um anticorpo que compreende as CDRs de VH e VL de C6MH3-B1. Em várias modalidades, o ácido nucléico codifica um espaçador peptídico (por exemplo, como aqui descrito) que anexa o anticorpo ao interferon. Em certas modalidades, o ácido nucléico codifica as CDRs e/ou as regiões variáveis para anti-CD20 (Rituximab).
Também é fornecida uma célula que compreende um ácido nucléico como descrito acima, que codifica uma construção quimérica. Em certas modalidades, a célula expressa a construção quimérica.
Em várias modalidades, esta invenção fornece o uso de uma construção quimérica, como aqui descrita, na fabricação de um medicamento para inibir o crescimento e/ou a proliferação de uma célula cancerosa.
Em certas modalidades, os métodos e as construções desta invenção excluem especificamente construções que utilizam qualquer um dos anticorpos revelados na Publicação de Patente U.S. N°: US 2002/0193569 A1. Em certas modalidades, os métodos e as construções desta invenção excluem especificamente construções que incorporam um anticorpo anti-CD20. Em certas modalidades, os métodos e as construções desta invenção excluem especificamente construções que incorporam anticorpos que se ligam a qualquer um dos seguintes: CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, EGF-R, HM1.24, antígeno de fosfatidil serina, HER-2, TAG-72
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9/107 e/ou MUC-1. Em certas modalidades, as construções aqui descritas podem ser usadas no tratamento de patologias como, por exemplo, esclerose múltipla, vasculite mediada pelo HCV, e semelhantes.
DEFINIÇÕES
Os termos polipeptídeo, peptídeo e proteína são aqui usados de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam aos polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são análogos químicos artificiais de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como aos polímeros de aminoácidos de ocorrência natural. O termo também inclui variantes na ligação peptídica tradicional que une os aminoácidos que constituem o polipeptídeo. Peptídeos, polipeptídeos e proteínas preferidos são cadeias de aminoácidos cujos carbonos alfa estão ligados por meio de ligações peptídicas. O aminoácido terminal em uma extremidade da cadeia (terminal amino), portanto, possui um grupo amino livre, enquanto o aminoácido terminal na outra extremidade da cadeia (terminal carbóxi) possui um grupo carboxil livre. Como aqui usado, o termo terminal amino (abreviado terminal N) refere-se ao grupo α-amino livre no aminoácido no terminal amino de um peptídeo ou ao grupo α-amino (grupo imino, quando participa em uma ligação peptídica) de um aminoácido em qualquer outra localização dentro do peptídeo. Similarmente, o termo terminal carbóxi refere-se ao grupo carboxil livre no terminal carbóxi de um peptídeo ou ao grupo carboxil de um aminoácido em qualquer outra localização dentro do peptídeo. Peptídeos também incluem basicamente qualquer
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10/107 poliaminoácido, incluindo, sem limitação, miméticos de peptídeos, tais como aminoácidos unidos por uma ligação éter, e não por uma ligação amida.
Como aqui usado, o termo anticorpo refere-se a uma proteína que consiste em um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por genes de imunoglobulina ou fragmentos de genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes da região constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, bem como diversos genes da região variável de imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, as quais, por sua vez, definem as classes de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Uma unidade estrutural de imunoglobulina típica (anticorpo) sabidamente compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia leve (cerca de 25 kD) e uma cadeia pesada (cerca de 50-70 kD) . O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos, responsável primariamente pelo reconhecimento de antígeno. Os termos cadeia leve variável (Vl) e cadeia pesada variável (Vh) referem-se a essas regiões das cadeias leves e pesadas, respectivamente.
Anticorpos existem como imunoglobulinas intactas ou como vários fragmentos bem caracterizados produzidos por digestão com várias peptidases ou expressos de novo. Dessa forma, por exemplo, a pepsina digere um anticorpo abaixo
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11/107 das ligações dissulfeto na região de dobradiça para produzir F(ab) '2, um dímero de Fab que, ele próprio, é uma cadeia leve unida a VH-CH1 por uma ligação dissulfeto. O F(ab)'2 pode ser reduzido sob condições leves para quebrar a ligação dissulfeto na região de dobradiça, convertendo, dessa forma, o dímero (Fab')2 em um monômero Fab'. O monômero Fab' é basicamente um Fab com parte da região de dobradiça (veja Fundamental Immunology”, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), para uma descrição mais detalhada de outros fragmentos de anticorpo). Embora vários fragmentos de anticorpo sejam definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, aqueles habilitados na técnica observarão que esses fragmentos Fab' podem ser sintetizados de novo quimicamente ou pela utilização de metodologia de DNA recombinante. Dessa forma, o termo anticorpo”, como aqui usado, também inclui fragmentos de anticorpo produzidos pela modificação de anticorpos inteiros ou sintetizados de novo com o uso de metodologias de DNA recombinante, incluindo, sem limitação, Fab'2, IgG, IgM, IgA, IgE, scFv, dAb, nanobodies, unibodies e diabodies. Em várias modalidades, anticorpos preferidos incluem, sem limitação, Fab'2, IgG, IgM, IgA, IgE e anticorpos de cadeia única, mais preferivelmente anticorpos de Fv de cadeia única (scFv) nos quais uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável estão unidas juntas (diretamente ou por meio de um espaçador peptídico) para formar um polipeptídeo contínuo.
Em certas modalidades, os anticorpos e fragmentos usados nas construções da presente invenção podem ser biespecíficos. Anticorpos ou fragmentos biespecíficos podem
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12/107 ser de várias configurações. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem parecer com anticorpos únicos (ou fragmentos de anticorpo), mas possuem dois sítios de ligação de antígeno diferentes (regiões variáveis). Em várias modalidades, anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por técnicas químicas (Kranz e cols. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 5.807), por técnicas de polidoma (veja, por exemplo, Patente U.S. N° 4.474.893), ou por técnicas de DNA recombinante. Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos da presente invenção podem ter especificidades de ligação por pelo menos dois epitopos diferentes, pelo menos um dos quais sendo um antígeno associado a tumor. Em várias modalidades, os anticorpos e fragmentos também podem ser heteroanticorpos. Heteroanticorpos são dois ou mais anticorpos, ou fragmentos de ligação de anticorpo (por exemplo, Fab) ligados juntos, cada anticorpo ou fragmento tendo uma especificidade diferente.
Um sítio de ligação de antígeno ou porção de ligação refere-se à parte de uma molécula de imunoglobulina que participa na ligação de antígeno. O sítio de ligação de antígeno é formado por resíduos de aminoácidos das regiões variáveis (V) do terminal N das cadeias pesadas (H) e leves (L). Três trechos altamente divergentes dentro das regiões V das cadeias pesadas e leves são denominados regiões hipervariáveis, que são interpostas entre trechos de flanqueamento mais conservados conhecidos como regiões framework ou FRs. Dessa forma, o termo FR refere-se às sequências de aminoácidos que são encontradas naturalmente entre e adjacentes às regiões
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13/107 hipervariáveis em imunoglobulinas. Em uma molécula de anticorpo, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada estão dispostas entre elas no espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação de antígeno. Essa superfície medeia o reconhecimento e a ligação do antígenoalvo. As três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesadas e leves são denominadas regiões determinantes de complementaridade ou CDRs, e são caracterizadas, por exemplo, por Kabat e cols. Sequences of proteins of immunological interest, 4a Edição U.S. Dept. Health and Human Services, Public Health Services, Bethesda, MD (1987) .
O termo interferon refere-se a um interferon de comprimento total ou a um fragmento de interferon (interferon truncado) ou a um mutante de interferon, que substancialmente retém a atividade biológica do interferon do tipo selvagem de comprimento total (por exemplo, retém pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, 98% ou 99% do anticorpo de comprimento total). Interferons incluem interferons do tipo I (por exemplo, interferon-alfa e interferon-beta), bem como interferons do tipo II (por exemplo, interferon-gama). O interferon (por exemplo, IFN-α) pode ser basicamente de qualquer espécie mamífera. Em certas modalidades preferidas, o interferon é de uma espécie selecionada do grupo que consiste em humanos, equinos, bovinos, roedores, suínos, lagomorfos, felinos, caninos, murídeos, caprinos, ovinos, um primata não humano, e semelhantes. Em várias modalidades, o interferon mutado compreende uma ou mais
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14/107 substituições, inserções e/ou eliminações de aminoácidos.
Um anticorpo anti-HER2/neu é um anticorpo que se liga especificamente ou preferencialmente a um receptor HER2/ neu.
Como aqui usado, o termo indivíduo refere-se a um ser humano ou a um animal não humano, incluindo, sem limitação, um gato, cachorro, cavalo, porco, vaca, carneiro, cabra, coelho, camundongo, rato ou macaco.
O termo anticorpo C6, como aqui usado, refere-se aos anticorpos derivados de C6.5, cuja sequência é expressamente fornecida, por exemplo, nas Patentes U.S. 6.512.097 e 5;977;322, e na Publicação PCT WO 97/00271. Anticorpos C6 preferivelmente possuem uma afinidade de ligação de cerca de 1,6 x 10-8 ou melhor por HER2/neu. Em certas modalidades, anticorpos C6 são derivados por triagem (por afinidade a c-erbB-2 / HER2/neu) de uma biblioteca de apresentação em fago na qual uma cadeia pesada variável (Vh) de C6 conhecida é expressa em combinação com diversas cadeias leves variáveis (Vl) ou, inversamente, uma cadeia leve variável de C6 conhecida é expressa em combinação com diversas cadeias pesadas variáveis (Vh) . Anticorpos C6 também incluem aqueles anticorpos produzidos pela introdução de mutações nas regiões determinantes de complementaridade pesadas variáveis ou leves variáveis (CDR1, CDR2 ou CDR3), por exemplo, como descrito nas Patentes U.S. 6.512.097 e 5.977.322, e na Publicação PCT WO 97/00271. Além disso, anticorpos C6 incluem aqueles anticorpos produzidos por qualquer combinação desses métodos de modificação aplicados a C6.5 e seus derivados.
Um anticorpo da família anti-EGFR refere-se a um
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15/107 anticorpo que se liga especificamente a um membro da família do receptor do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, um anticorpo que se liga a ErbB-1, também denominado receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), ErbB-2, também denominado HER2 em seres humanos e neu em roedores, ErbB-3, também denominado HER3 e/ou ErbB4, também denominado HER4). Anticorpos da família anti-EGFR ilustrativos incluem, sem limitação, anticorpos como, por exemplo, C6.5, C6ML3-9, C6MH3-B1, C6-B1D2, F5, HER3.A5, HER3.F4, HER3.H1, HER3.H3, HER3.E12, HER3.B12, EGFR.E12, EGFR.C10, EGFR.B11, EGFR.E8, HER4.B4, HER4.G4, HER4.F4, HER4.A8, HER4.B6, HER4.D4, HER4.D7, HER4.D11, HER4.D12, HER4.E3, HER4.E7, HER4.F8 e HER4.C7, e semelhantes (veja, por exemplo, publicações de Patente U.S. US 2006/0099205 A1 e US 2004/0071696 A1, que são aqui incorporadas por referência).
Um polipeptídeo Fv de cadeia única (sFv ou scFv) é um heterodímero VH:VL ligado covalentemente que, em certas modalidades, pode ser expresso por um ácido nucléico, incluindo sequências codificadoras de Vh- e Vl, unidos diretamente ou unidos por um espaçador codificador de peptídeo. Huston, e cols. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5.879-5.883 (1988). Várias estruturas para a conversão das cadeias polipeptídicas leves e pesadas naturalmente agregadas, mas quimicamente separadas de uma região V de anticorpo em uma molécula de sFv, se enovelarão em uma estrutura tridimensional substancialmente similar à estrutura de um sítio de ligação de antígeno. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.091.513 e 5.132.405 e 4.956.778.
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CD20 é uma fosfoproteína não glicosilada expressa na superfície de células B maduras (veja, por exemplo, Cragg e cols. (2005) Curr. Dir. Autoimmun., 8: 140-174) . Ela também é encontrada em linfomas de células B, leucemia de células pilosas, leucemia linfocítica crônica de células B, em células-tronco de câncer de pele/melanoma, e semelhantes.
A frase inibição do crescimento e/ou da proliferação de uma célula cancerosa refere-se à diminuição na taxa de crescimento e/ou na taxa de proliferação de uma célula cancerosa. Em certas modalidades, isso inclui a morte de uma célula cancerosa (por exemplo, por meio de apoptose). Em certas modalidades, esse termo também se refere à inibição do crescimento e/ou da proliferação de um tumor sólido e/ou à indução da redução do tamanho do tumor ou à eliminação do tumor.
O termo marcador de câncer refere-se às biomoléculas como, por exemplo, proteínas, carboidratos, glicoproteínas, e semelhantes, que são exclusivamente ou preferencialmente ou diferencialmente expressas em uma célula cancerosa e/ou são encontradas em associação com uma célula cancerosa e, portanto, fornecem alvos preferenciais ou específicos para o câncer. Em várias modalidades, a expressão preferencial pode ser expressão preferencial quando comparada com qualquer outra célula no organismo, ou expressão preferencial dentro de uma área em particular do organismo (por exemplo, dentro de um órgão ou tecido em particular).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
As Figuras 1A-1O mostram as sequências de ácidos nucléicos e de aminoácidos para várias construções aqui descritas. A Fig1A mostra sequências de aminoácidos para
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17/107 cadeia pesada de IgG3 anti-HER2/neu-IFN-a (ID. DE SEQ. N°: 1) e cadeia leve de IgG3anti-HER2/neu (ID. DE SEQ. N°: 2). O sublinhado simples é o espaçador, o sublinhado duplo é IFN-α murídeo, sem sublinhado é anti-HER2/neu. Fig1B: cadeia leve de aCD20, sequência de ácidos nucléicos (ID. DE SEQ. N°: 3), sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 4); Fig1C: espaçador Gly4Ser de aCD20-IgG3-muIFNa, sequência de ácidos nucléicos (ID. DE SEQ. N°: 5), sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 6); Fig1D: espaçador alfa helicoidal de aCD20-IgG3-muIFNa, sequência de ácidos nucléicos (ID. DE SEQ. N°: 7), sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 8); Fig1E: espaçador Gly4Ser de aCD20IgG3-hu-IFNa, sequência de ácidos nucléicos (ID. DE SEQ. N°: 9), sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 10); Fig1F: espaçador alfa helicoidal de aCD20-IgG3-hu-IFNa, sequência de ácidos nucléicos (ID. DE SEQ. N°: 11), sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 12); Fig1G:
espaçador Gly4Ser de aCD20-IgG1-muIFNa, sequência de ácidos nucléicos (ID. DE SEQ. N°: 13), sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 14); Fig1H: espaçador alfa helicoidal de aCD20-IgG1-muIFNa, sequência de ácidos nucléicos (ID. DE SEQ. N°: 15), sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 16); Fig1I: espaçador Gly4Ser de aCD20-IgG1-hu-IFNa, sequência de ácidos nucléicos (ID. DE SEQ. N°: 17), sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 18); Fig1J: espaçador alfa helicoidal de aCD20-IgG1-hu-IFNa, sequência de ácidos nucléicos (ID. DE SEQ. N°: 19), sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 20); Fig1K: sequência de ácidos nucléicos da cadeia leve de aHer2/neu (ID. DE SEQ.
N°: 21), sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 22);
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FiglL: espaçador glyser de aHer2/neu-IgG1-muIFNa, sequência de ácidos nucléicos (ID. DE SEQ. N°: 23), sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 24); Fig1M:
espaçador alfa helicoidal de aHer2/neu-IgG1-muIFNa, sequência de ácidos nucléicos (ID. DE SEQ. N°: 25), sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 26); Fig1N:
espaçador glyser de aHer2/neu-IgG1-hu-IFNa, sequência de ácidos nucléicos (ID. DE SEQ. N°: 27), sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 28); Fig1O: espaçador alfa helicoidal de aHer2/neu-IgG1-hu-IFNa, sequência de ácidos nucléicos (ID. DE SEQ. N°: 29), sequência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 30). Será observado que, embora as construções nessa figura sejam mostradas com espaçadores particulares, em certas modalidades outros espaçadores podem ser substituídos como aqui descrito.
As Figuras 2A, 2B, 2C e 2D ilustram a construção e caracterização de IgG3-IFN-a anti-HER2/neu. Figura 2A: diagrama esquemático de anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a. Áreas sólidas representam regiões variáveis de anti-HER2/neu. Áreas abertas representam regiões constantes de IgG3 e κ humanas. Regiões com círculo branco representam IFN-α murídeo. Figura 2B: SDS-PAGE de anti-HER2/neu-IgG3 purificada (raias 1 e 4), IgG3-IFN-a (raias 2 e 5) e antiHER2/neu-IgG3-IFN-a (raias 3 e 6) sob condições não redutoras (raias 1-3) ou redutoras (raias 4-6). As proteínas do marcador da massa molecular são mostradas à esquerda de cada gel. Figura 2C: Anti-HER2/neu-IgG3 e antiHER2/neu-IgG3-IFN-a se ligam a HER2/neu. CT26/HER2, uma linhagem de células colônicas murídeas que expressam níveis elevados de HER2/neu humano, foi reagida com anti-HER2/neu
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IgG3, IgG3-IFN-a ou anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a, com ou sem heparina, seguido por anti-IgG humana de coelho marcado com PE. As linhas pontilhadas representam o sinal de células sem adição de proteína recombinante. Figura 2D: a atividade protetora do padrão de IFN-α e diferentes proteínas de fusão de IFN-α contra VSV. Diluições de 1 U de padrão de IFN-α, 0,21 ng (10 pM) de anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a, 0,21 ng (10 pM) de IgG3-IFN-a ou 0,17 ng (10 pM) de antiHER2/neu-IgG3 em 100 μ l foram preparadas e adicionadas às células L-929. Após uma incubação de 24 horas, 4.000 PFU de VSV foram adicionados. Quarenta e oito horas mais tarde, as células viáveis foram coradas com corante violeta cristal, dissolvido por metanol, e o corante solubilizado foi detectado usando uma leitora de ELISA a 570 nm.
As Figuras 3A e 3B mostram atividade antitumoral in vivo de diferentes proteínas de fusão de IFN-α e rIFN-a. Camundongos C3H/HeN foram atacados por via s.c. com 1 x 103 células 38C13/HER2 e tratados por via i.p. com 2,5 μg (Fig. 3A) ou 1 μg (Fig. 3B) das proteínas indicadas nos dias 1, 3 e 5 após ataque do tumor. O volume do tumor de cada camundongo é medido. Os animais foram observados até que o diâmetro do tumor s.c. alcançasse 15 mm.
As Figuras 4A e 4B mostram que a fusão de IgG3 ao IFNα aumentou sua atividade antitumoral e aumentou sua meiavida in vivo. Figura 4A: camundongos foram tratados com 9.600 U de rIFN-α ou 9.600 U (4 gg) de IgG3-IFN^ nos dias 1 e 3 após ataque do tumor. Os animais foram acompanhados quanto à sobrevida e sacrificados quando o diâmetro do tumor s.c. alcançava 15 mm. Figura 4B: grupos de três camundongos C3H/HeN foram injetados i.p. com 6 6 μ Ci de
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20/107 rIFN-α marcado com 125I, IgG3-IFN-a ou anti-HER2/neu-IgG3IFN-α. Em vários intervalos após injeção das proteínas marcadas com 125I, a radioatividade residual foi medida usando um contador de corpo inteiro de camundongo. Os resultados representam a média de três camundongos. Barras, o desvio padrão (DP).
As Figuras 5A, 5B, 5C e 5D mostram que as proteínas de fusão de IFN-α inibiram a proliferação celular e induziram apoptose em células 38C13/HER2 in vitro. As proteínas de fusão de IFN-α inibiram a proliferação da célula tumoral. Após incubação por 48 horas com diferentes doses das diferentes proteínas de fusão, células 38C13/HER2 (Fig. 5A) ou 38C13 (Fig. 5B) viáveis foram medidas usando o ensaio de MTS. Esses experimentos foram realizados três vezes em triplicata; barras de erro, DP das medidas. Figura 5C: proteínas de fusão de IFN-α induzem apoptose em células 38C13/HER2. Resumidamente, 1 x 106 células 38C13/HER2 foram incubadas com 1 nM das proteínas indicadas por 72 horas. As células foram então lavadas, coradas com Alexa Fluor 488, anexina V e PI, e foram analisadas por citometria de fluxo. A percentagem de células localizadas em cada quadrante é indicada no canto. Figura 5D: proteínas de fusão de IFN-α inibiram a proliferação de células 38C13/HER2 sobreviventes. Resumidamente, 1 x 106 células 38C13/HER2 foram marcadas com 2,5 uM de CFSE e imediatamente fixadas (linha pontilhada), ou tratadas com PBS (linha preta fina), ou 1 nM de IgG3 anti-HER2/neu (linha preta fina, superposta com controle de PBS), IgGS-IFN-α (linha preta espessa) ou anti-HER2/neu-IgG3-IFN-α (área preta ) por 48 horas. As células foram então lavadas e analisadas por citometria de
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21/107 fluxo. O histograma foi obtido por isolamento da população de células vivas.
As Figuras 6A, 6B e 6C mostram que as proteínas de fusão de IFN-α induziram ativação de STAT1 em células 38C13/HER2. Resumidamente, 1 x 107 células 38C13/HER2 foram tratadas com 1.000 U/ml de anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a (Fig. 6A) ou IgG3-IFN-a (Fig. 6B) pelos períodos indicados. Os lisados de células foram separados por SDS-PAGE e analisados por Western blot usando um anti-fosfoSTAT1 policlonal de coelho. Para confirmar a carga igual de amostras de proteína, os blots foram sondados com um Ab policlonal coelho de conjugado à HRP contra GAPDH. Figura 6C: a intensidade de anti-fosfoSTAT1 foi normalizada com a intensidade de anti-GAPDH para cada ponto do tempo indicado, e os valores obtidos foram divididos pelo valor no tempo 0 para obter o número de vezes de ativação para STAT1. Esses experimentos foram realizados duas vezes; barras de erro, DP das medidas. *, somente o ponto em que os dois grupos diferem com um p < 0,05.
Figura 7: proteínas de fusão de IFN-α inibem o crescimento de tumor estabelecido. Camundongos C3H/HeN foram injetados s.c. com 1 x 103 células 38C13/HER2. Após 12 dias, os camundongos foram tratados i.p. com 5 tig da proteína indicada por 3 dias consecutivos. O volume do tumor de cada camundongo é medido. Os animais foram sacrificados quando o diâmetro do tumor s.c. alcançou 15 mm.
A Figura 8 mostra a ligação de anticorpos recombinantes com células humanas que expressam CD20. Células de Daudi foram incubadas com IgG3 recombinante ou
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Rituximab, seguido por anti-IgG humana de rato biotinilada e estreptavidina marcada com PE e analisadas por citometria de fluxo. A, células apenas com o anticorpo secundário; B, células com IgG3 recombinante; C, células com Rituximab.
A Figura 9 mostra um diagrama da cadeia pesada da proteína de fusão anticorpo-IFN-α. Em particular, a figura ilustra que o encurtamento do espaçador (Gly4Ser)3 (ID. DE SEQ. N°: 31) para um espaçador Gly4Ser (ID. DE SEQ. N°: 32) permite a produção de aCD20-IgG3-mIFNa de comprimento total.
A Figura 10 mostra a análise de SDS-PAGE de frações eluídas de Sefarose de proteína A. Sobrenadantes de cultura de células que expressam anti-CD-20-IgG3-IFNa com o espaçador (Gly4Ser)3 (ID. DE SEQ. N°: 31) foram passados através da Sefarose de proteína A e a proteína de fusão se ligou antes da eluição. A. As proteínas foram processadas sem redução. Raia 1, IgG3; Raias 2-6, frações eluídas de Sefarose de proteína A. B. As proteínas foram reduzidas antes da análise. Raia 2, IgG3; Raias 3-7, frações eluídas de Sefarose de proteína A.
A Figura 11 mostra a análise de SDS-PAGE de proteínas feitas por expressão transitória em células T HEK293. Raia 1, anti-CD20-IgG3-hu-IFNa com espaçador estendido (Gly4Ser)3 (ID. DE SEQ. N°: 31); Raia 2, anti-CD20-IgG3-huIFNa com espaçador encurtado Gly4Ser (ID. DE SEQ. N°: 32); Raia 3, anti-CD20-IgG3-muIFNa com espaçador estendido (Gly4Ser)3 (ID. DE SEQ. N°: 31); Raia 4, anti-CD20-IgG3muIFNa com espaçador encurtado Gly3Ser; Raia 5, IgG3 antiCD20.
A Figura 12 mostra uma análise da ligação de proteína
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23/107 às células de Daudi usando citometria de fluxo. 1 x 106 células de Daudi foram coradas com 1 μg de proteína de fusão contendo IFN-α humano ou Rituxan.
A Figura 13 mostra uma análise da ligação de proteína ao 38C13/CD20 por citometria de fluxo.
Figura 14. Células de Daudi foram incubadas com várias concentrações de IFN-α, anticorpo ou proteína de fusão por 72 horas. A inibição do crescimento foi avaliada usando o ensaio de proliferação celular CellTiter 96 AQueous.
Figura 15. Células de Daudi foram tratadas com 10 pM das proteínas indicadas por 72 horas. A viabilidade celular e a apoptose foram determinadas após coloração com Anexina
V e PI e análise por citometria de fluxo.
Figura 16. Células 38C13/CD20 foram tratadas com 10 pM das proteínas indicadas por 48 horas. A viabilidade celular e a apoptose foram determinadas após coloração com Anexina
V e PI e análise por citometria de fluxo.
Figura 17. Inibição da proliferação celular após tratamento com diferentes proteínas em concentrações variáveis. Células 38C13-CD20 foram tratadas com as proteínas indicadas em concentrações variáveis por 48 horas. Após o tratamento, a extensão da proliferação foi monitorada usando o ensaio de MTS.
Figura 18. Células 38C13/CD20 foram tratadas com as diferentes concentrações das proteínas indicadas por 48 horas. A viabilidade celular e a apoptose foram determinadas após coloração com Anexina V e PI e análise por citometria de fluxo.
Figura 19. Células de Daudi foram incubadas por 72 horas com diferentes concentrações da proteína de fusão. A
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24/107 viabilidade celular e a apoptose foram determinadas após coloração com Anexina V e PI e análise por citometria de fluxo.
Figura 20. Células de Daudi foram tratadas por 72 horas com várias concentrações de proteínas de fusão. Solução de MTS foi adicionada para quantificar a viabilidade celular.
Figura 21. Células de Daudi foram incubadas com 72 horas com 1 pM de anti-CD20-IgG3-hIFNa com o espaçador Gly4Ser (32) (Espaçador Gly-Ser) ou com 1 pM de anti-CD20IgG3-hIFNa com o espaçador alfa helicoidal (Espaçador Hélice Alfa). A viabilidade celular e a apoptose foram determinadas após coloração com Anexina V e PI e análise por citometria de fluxo.
A Figura 22 mostra a sobrevida de camundongos inoculados com 5.000 células 38C13-CD20 e tratados nos dias 1, 2 e 3 com HBSS ou as quantidades indicadas das proteínas de fusão anti-CD20-IFN-a.
A Figura 23 mostra a sobrevida de camundongos inoculados com 5.000 células 38C13-CD20 e tratados nos dias 5, 6 e 7 com 10 Llg de anti-CD20-IgG1, anti-CD20-IgG3, Rituximab ou anti-CD20-IgG3-mIFNa.
Figura 24. Sobrevida de camundongos inoculados com 5.000 células 38C13-CD20 e tratados nos dias 5, 6 e 7 com 10 Llg de anti-CD20-IgG3, anti-CD20-IgG3 + IFNa, anti-DNSIgG3 ou anti-CD20-IgG3-mIFNa.
Figura 25. Grupos de oito camundongos foram injetados com 5.000 células 38C13-CD20 no dia 0. Nos dias 8, 9 e 10, elas foram tratadas com HBSS ou 100 llg de anti-CD20-IgG3mIFNa. O crescimento tumoral foi monitorado ao longo do
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25/107 tempo.
Figura 26. Grupos de oito camundongos foram injetados com 5.000 células 38C13-CD20 no dia 0. Nos dias 8, 9 e 10, elas foram tratadas com HBSS ou 100 ug de anti-CD20-IgG3mIFNa. A sobrevida foi monitorada ao longo do tempo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O Interferon alfa (IFN-α) é uma citocina importante na iniciação da resposta imunológica inata e também demonstra um amplo espectro de atividades antitumorais. O uso clínico do interferon (por exemplo, IFN-α) como um fármaco anticâncer, no entanto, é impedido por sua meia-vida curta, o que compromete significativamente seu efeito terapêutico. Em certas modalidades, esta invenção pertence à descoberta de que o índice terapêutico do interferon pode ser aumentado por anexação do interferon a uma porção de direcionamento que se liga especificamente/preferencialmente a um marcador na célulaalvo ou associado a ela (por exemplo, uma célula tumoral). Isso permite a liberação de doses maiores de interferon ao local-alvo com menos complicações sistêmicas. Isso foi ilustrado, em uma modalidade, pela construção e uso de uma proteína de fusão que consiste em uma IgG3 anti-HER2/neu e IFN-α (IgG3-IFN-a anti-HER2/neu) e, em outra modalidade, pela construção e uso de uma proteína de fusão anti-CD20IFNa.
A eficácia das construções HER2/neu-IgG3-IFN-a foi testada em um linfoma de célula B murídeo, 38C13, transduzido com HER2/neu humano. A proteína de fusão antiHER2/neuIgG3-IFN-a exibiu um efeito potente na inibição do crescimento tumor de 38C13/HER2 in vivo, e até mesmo a
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26/107 administração de 1 ug de IgG3-IFN-a anti-HER2/neu resultou em 88% de sobreviventes de longo prazo após ataque do tumor.
Significativamente, IgG3-IFN-a anti-HER2/neu demonstrou uma atividade potente contra tumores de 38C13/HER2 estabelecidos, e a remissão completa do tumor foi observada em 88% dos camundongos tratados. Essa atividade antitumoral dramática era mediada por apoptose induzida por IFN-α, e o direcionamento do IFN-α às células tumorais 38C13/HER2 pelo anticorpo IgG3 anti-HER2/neu foi essencial para potencializar esses efeitos.
Resultados similares foram observados para a construção anti-CD20-IgG3-IFN-a (veja, Exemplo 2) . Esses resultados indicam que a adesão (por exemplo, fusão) de um interferon (por exemplo, IFN-α) a uma porção de direcionamento (por exemplo, a um anticorpo tumorespecífico) produz uma substância terapêutica eficaz que pode ser usada para inibir o crescimento e/ou a proliferação ou até mesmo matar célula(s)-alvo. Dessa forma, por exemplo, as construções exemplares aqui descritas podem facilmente ser usadas para o tratamento de linfoma de célula B e de outros cânceres na prática clínica.
Dessa forma, em certas modalidades, esta invenção fornece construções (por exemplo, porções quiméricas) que compreendem um interferon (por exemplo, IFN-α) anexado a uma porção de direcionamento (por exemplo, a um anticorpo que se liga especificamente a um marcador câncer-específico em uma célula cancerosa). As construções incluem conjugados químicos, além de proteínas de fusão. Também são fornecidos
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27/107 ácidos nucléicos que codificam as proteínas de fusão, bem como células transfectadas com os ácidos nucléicos para expressar as proteínas de fusão. Também são fornecidos métodos de inibição do crescimento e da proliferação de células cancerosas, assim como kits que compreendem, por exemplo, as porções quiméricas aqui descritas, para o tratamento de vários cânceres.
I. Construções quiméricas que compreendem uma porção de direcionamento anexada a um interferon.
Foi uma descoberta surpreendente que construções quiméricas que compreendem uma porção de direcionamento (por exemplo, um anticorpo antimarcador tumoral) anexada a um IFN nativo (do tipo selvagem) ou modificado (por exemplo, IFN-α) podem ser usadas eficazmente para inibir o crescimento e/ou a proliferação de células cancerosas-alvo que expressam ou associadas ao marcador ao qual a porção de direcionamento é dirigida. Em certas modalidades, as porções de direcionamento são conjugadas quimicamente ao interferon, enquanto, em outras modalidades, a porção de direcionamento é expressa como uma proteína de fusão com o IFN-α. Quando produzida como uma proteína de fusão, o componente da porção de direcionamento (por exemplo, anticorpo) pode ser fundido diretamente ao IFN-α ou anexado por meio de um espaçador peptídico (por exemplo, um espaçador (Gly4Ser)3 (ID. DE SEQ. N°: 31), um espaçador GlyGlyGlyGlySer (ID. DE SEQ. N°: 32), um espaçador AEAAAKEAAAKA (ID. DE SEQ. N°: 33), e semelhantes.
A) Porções de direcionamento.
Em várias modalidades, a porção de direcionamento é uma molécula que se liga especificamente ou
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28/107 preferencialmente a um marcador expresso por (por exemplo, na superfície de) ou associado à(s) célula(s)-alvo. Embora basicamente qualquer célula possa ser direcionada, certas células preferidas incluem aquelas associadas a uma patologia caracterizada por hiperproliferação de uma célula (ou seja, um distúrbio hiperproliferativo). Distúrbios hiperproliferativos ilustrativos incluem, sem limitação, psoríase, neutrofilia, policitemia, trombocitose e câncer.
Distúrbios hiperproliferativos caracterizados como câncer incluem, sem limitação, tumores sólidos como, por exemplo, cânceres da mama, do trato respiratório, do cérebro, órgãos reprodutores, trato digestivo, trato urinário, olho, fígado, pele, cabeça e pescoço, tireóide, paratireóide e suas metástases distantes. Esses distúrbios também incluem linfomas, sarcomas e leucemias. Exemplos de câncer de mama incluem, sem limitação, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma ductal in situ e carcinoma lobular in situ. Exemplos de cânceres do trato respiratório incluem, sem limitação, carcinoma pulmonar de pequena célula e de célula não pequena, bem como adenoma brônquico e blastoma pleuropulmonar. Exemplos de cânceres do cérebro incluem, sem limitação, glioma tronco cerebral e hipofisário, astrocitoma cerebelar e cerebral, meduloblastoma, ependimoma, bem como tumor neuroectodérmico e da pineal. Tumores dos órgãos reprodutores masculinos incluem, sem limitação, câncer da próstata e testicular. Tumores dos órgãos reprodutores femininos incluem, sem limitação, câncer endometrial, cervical, ovariano, vaginal e vulvar, bem como sarcoma do útero. Tumores do trato digestivo incluem, sem limitação,
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29/107 cânceres anais, do cólon, cólon-retal, esofagiano, da vesícula biliar, gástrico, pancreático, retal, do intestino delgado e da glândula salivar. Tumores do trato urinário incluem, sem limitação, cânceres da bexiga, do pênis, do rim, da pelve renal, do ureter e uretral. Cânceres oculares incluem, sem limitação, melanoma intra-ocular e retinoblastoma. Exemplos de cânceres hepáticos incluem, sem limitação, carcinoma hepatocelular (carcinomas da célula hepática, com ou sem variante fibrolamelar), colangiocarcinoma (carcinoma do ducto biliar intrahepático) e colangiocarcinoma hepatocelular misto. Cânceres cutâneos incluem, sem limitação, carcinoma de célula escamosa, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, câncer cutâneo da célula de Merkel e câncer cutâneo não melanoma. Cânceres da cabeça e pescoço incluem, sem limitação, câncer laríngeo/hipofaríngeo/nasofaríngeo/orofaríngeo, e do lábio e da cavidade oral. Linfomas incluem, sem limitação, linfoma relacionado à AIDS, linfoma não Hodgkin, linfoma cutâneo de célula T, doença de Hodgkin e linfoma do sistema nervoso central. Sarcomas incluem, sem limitação, sarcoma dos tecidos moles, osteossarcoma, histiocitoma fibroso maligno, linfossarcoma e rabdomiossarcoma. Leucemias incluem, sem limitação, leucemia mielóide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica e leucemia de células pilosas.
Esses distúrbios foram bem caracterizados em seres humanos, mas também existem com uma etiologia similar em outros mamíferos, e podem ser tratados por administração das composições farmacêuticas da presente invenção.
Em certas modalidades, a porção de direcionamento é
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30/107 uma porção que se liga a um marcador de câncer (por exemplo, um antígeno associado a tumor). Diversos marcadores de câncer são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Os marcadores não precisam ser exclusivos para as células cancerosas, mas também podem ser eficazes quando a expressão do marcador está elevada em uma célula cancerosa (quando comparado com células saudáveis normais) ou quando o marcador não está presente em níveis comparáveis em tecidos circundantes (especialmente quando a porção quimérica é liberada localmente).
Marcadores de câncer ilustrativos incluem, por exemplo, o marcador tumoral reconhecido pelo anticorpo monoclonal ND4. Esse marcador é encontrado no câncer cólonretal pouco diferenciado, bem como em tumores neuroendócrinos gastrointestinais (veja, por exemplo, Tobi e cols. (1998) Cancer Detection and Prevention, 22(2) : 147152). Outros alvos importantes para a imunoterapia do câncer são a glicoproteína reguladora do complemento ligada à membrana: CD46, CD55 e CD59, que, verificou-se, é expressa na maioria das células tumorais in vivo e in vitro. Mucinas humanas (por exemplo, MUC1) são marcadores tumorais conhecidos, bem como o são gp100, tirosinase e MAGE, que são encontrados no melanoma. O gene do tipo selvagem do tumor de Wilms WT1 é expresso em níveis elevados não apenas na maioria das leucemias mieolocíticas agudas, linfocíticas agudas e mieolocíticas crônicas, mas também em vários tipos de tumores sólidos, incluindo câncer do pulmão.
A leucemia linfocítica aguda foi caracterizada pelos TAAs HLA-Dr, CD1, CD2, CD5, CD7, CD19 e CD20. A leucemia
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31/107 mielógena aguda foi caracterizada pelos TAAs HLA-Dr, CD7, CD13, CD14, CD15, CD33 e CD34. O câncer de mama foi caracterizado pelos marcadores EGFR, HER2, MUC1, Tag-72. Vários carcinomas foram caracterizados pelos marcadores MUC1, TAG-72 e CEA. A leucemia linfocítica crônica foi caracterizada pelos marcadores CD3, CD19, CD20, CD21, CD25 e HLA-DR. A leucemia de células pilosas foi caracterizada pelos marcadores CD19, CD20, CD21, CD25. A doença de Hodgkin foi caracterizada pelo marcador Leu-M1. Vários melanomas foram caracterizados pelo marcador HMB 45. Os linfomas não Hodgkin foram caracterizados pelos marcadores CD20, CD19 e Ia; e vários cânceres da próstata foram caracterizados pelos marcadores PSMA e SE10.
Além disso, muitos tipos de células tumorais exibem antígenos incomuns que são inadequados para o tipo de célula e/ou seu ambiente, ou normalmente estão presentes apenas durante o desenvolvimento dos organismos (por exemplo, antígenos fetais). Exemplos desses antígenos incluem o glicoesfingolipídeo GD2, um dissialogangliosídeo que normalmente só é expresso em um nível significante nas membranas da superfície externa de células neuronais, onde sua exposição ao sistema imunológico é limitada pela barreira hematencefálica. GD2 é expresso nas superfícies de uma ampla gama de células tumorais, incluindo neuroblastoma, meduloblastomas, astrocitomas, melanomas, câncer de pulmão de pequena célula, osteossarcomas e outros sarcomas de tecidos moles. Dessa forma, GD2 é um alvo tumor-específico conveniente para imunoterapias.
Outros tipos de células tumorais exibem receptores da superfície celular que são raros ou ausentes nas
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32/107 superfícies de células saudáveis, e que são responsáveis pela ativação de vias de sinalização celular que causam o crescimento e divisão não regulados da célula tumoral. Exemplos incluem (ErbB2). HER2/neu, um receptor da superfície celular constitutivamente ativo que é produzido em níveis anormalmente elevados na superfície de células de câncer de mama.
Outros alvos úteis incluem, sem limitação, CD20, CD52, CD33, receptor do fator de crescimento epidérmico, e semelhantes.
Uma lista ilustrativa, mas não limitante, de marcadores tumorais adequados é fornecida na Tabela 1. Os anticorpos para esses e outros marcadores de câncer são conhecidos por aqueles habilitados na técnica e podem ser obtidos comercialmente ou facilmente produzidos, por exemplo, com o uso da tecnologia de apresentação em fago.
Tabela 1. Marcadores de câncer ilustrativos e referências associadas, todas aqui incorporadas por referência com a finalidade de identificação dos marcadores tumorais citados.
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Qualquer um dos marcadores citados anteriormente pode ser usado como alvos para as porções de direcionamento que compreendem as construções de interferon-porção de direcionamento desta invenção. Em certas modalidades, os 5 marcadores-alvo incluem, sem limitação, membros da família do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, HER2,
HER3, EGF, HER4), CD1, CD2, CD3, CD5, CD7, CD13, CD14,
CD15, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD33, CD34, CD38, 5E10,
CEA, HLA-DR, HM 1.24, HMB 45, la, Leu-M1, MUC1 , PMSA, TAG-
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72, antígeno de fosfatidil serina, e semelhantes.
Os marcadores citados anteriormente são apenas ilustrativos, e não limitantes. Outros antígenos associados a tumores serão do conhecimento daqueles habilitados na técnica.
Quando o marcador tumoral for um receptor da superfície celular, o espaçador para aquele receptor poderá funcionar como porções de direcionamento. Similarmente, miméticos desses espaçador também podem ser usados como porções de direcionamento.
Anticorpos.
Em certas modalidades, as porções de direcionamento podem compreender anticorpos, unibodies ou affybodies que se ligam específica ou preferencialmente ao marcador tumoral. Anticorpos que se ligam específica ou preferencialmente aos marcadores tumorais são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Dessa forma, por exemplo, anticorpos que se ligam ao antígeno CD22 expresso em células B humanas incluem HD6, RFB4, UV22-2, To15, 4KB128, um anticorpo anti-CD22 humanizado (hLL2) (veja, por exemplo, Li e cols. (1989) Cell. Immunol. 111: 85-99; Mason e cols. (1987) Blood 69: 836-40; Behr e cols. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 3.304s-3.314s; Bonardi e cols. (1993) Cancer Res. 53: 3.015-3.021).
Anticorpos para CD33 incluem, por exemplo, HuM195 (veja, por exemplo, Kossman e cols. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2.748-2.755), CMA-676 (veja, por exemplo, Sievers e cols., (1999) Blood 93: 3.678-3.684.
Anticorpos para CD38 incluem, por exemplo, AT13/5 (veja, por exemplo, Ellis e cols. (1995) J. Immunol. 155:
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925-937), HB7, e semelhantes.
Em certas modalidades, a porção de direcionamento compreende um anticorpo anti-HER2. O gene ergB 2, mais comumente conhecido como (Her-2/neu), é um oncogene que codifica um receptor transmembrana. Vários anticorpos foram desenvolvidos contra Her2/neu, incluindo trastuzumab (por exemplo, HERCEPTIN®; Fornier e cols. (1999) Oncology (Huntingt) 13: 647-58), TAB-250 (Rosenblum e cols. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 865-874), BACH-250 (Id.), TA1 (Maier e cols. (1991) Cancer Res. 51: 5.361-5.369), e os mAbs descritos nas Patentes U.S. Nos 5.772.997, 5.770.195 (mAb 4D5; ATCC CRL 10463); e Patente U.S. N° 5.677.171.
Anticorpos anti-MUC-1 ilustrativos incluem, sem limitação, Mc5 (veja, por exemplo, Peterson e cols. (1997) Cancer Res. 57: 1.103-1.108; Ozzello e cols. (1993) Breast Cancer Res. Treat. 25: 265-276) e hCTMO1 (veja, por exemplo, Van Hof e cols. (1996) Cancer Res. 56: 5.1795.185).
Anticorpos anti-TAG-72 ilustrativos incluem, sem limitação, CC49 (veja, por exemplo, Pavlinkova e cols. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2.613-2.619), B72.3 (veja, por exemplo, Divgi e cols. (1994) Nucl. Med. Biol. 21: 9-15), e aqueles revelados na Patente U.S. N° 5.976.531.
Anticorpos anti-HM1.24 ilustrativos incluem, sem limitação, um anticorpo monoclonal IgG2a/K de camundongo anti-HM1.24 e um anticorpo de camundongo humanizado IgG1/K anti-HM1.24 (veja, por exemplo, Ono e cols. (1999) Mol. Immuno. 36: 387-395).
Foram desenvolvidos vários anticorpos que se ligam especificamente ao HER2 e alguns estão em uso clínico.
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Esses incluem, por exemplo, trastuzumab (por exemplo, HERCEPTIN®, Fornier e cols. (1999) Oncology (Huntingt) 13: 647-658), TAB-250 (Rosenblum e cols.(1999) Clin. Cancer Res. 5: 865-874), BACH-250 (Id.), TA1 (veja, por exemplo, Maier e cols. (1991) Cancer Res. 51: 5.361-5.369), e os anticorpos descritos nas Patentes U.S. Nos: 5.772.997, 5.770.195 e 5.677.171.
Outros anticorpos anti-HER2/neu totalmente humanos são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Esses anticorpos incluem, sem limitação, os anticorpos C6 como, por exemplo, C6.5, DPL5, G98A, C6MH3-B1, B1D2, C6VLB, C6VLD, C6VLE, C6VLF, C6MH3-D7, C6MH3-D6, C6MH3-D5, C6MH3D3, C6MH3-D2, C6MH3-D1, C6MH3-C4, C6MH3-C3, C6MH3-B9, C6MH3-B5, C6MH3-B48, C6MH3-B47, C6MH3-B46, C6MH3-B43, C6MH3-B41, C6MH3-B39, C6MH3-B34, C6MH3-B33, C6MH3-B31, C6MH3-B27, C6MH3-B25, C6MH3-B21, C6MH3-B20, C6MH3-B2, C6MH3-B16, C6MH3-B15, C6MH3-B11, C6MH3-B1, C6MH3-A3, C6MH3A2 e C6ML3-9. Esses e outros anticorpos antiHER2/neu são descritos nas Patentes U.S. Nos 6.512.097 e 5.977.322, na Publicação PCT WO 97/00271, em Schier e cols. (1996) J. Mol. Biol. 255: 28-43, Schier e cols. (1996) J. Mol. Biol. 263: 551-567, e semelhantes.
Mais geralmente, os anticorpos dirigidos a vários membros da família do receptor do fator de crescimento epidérmico são bem adequados para uso como porções de direcionamento nas construções da presente invenção. Esses anticorpos incluem, sem limitação, anticorpos anti-EGF-R, como descrito nas Patentes U.S. Nos: 5.844.093 e 5.558.864, e na Patente Européia N° 706.799 A. Outros anticorpos ilustrativos da família anti-EGFR incluem, sem limitação,
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43/107 anticorpos como, por exemplo, C6.5, C6ML3-9, C6MH3-B1, C6B1D2, F5, HER3.A5, HER3.F4, HER3.H1, HER3.H3, HER3.E12, HER3.B12, EGFR.E12, EGFR.C10, EGFR.B11, EGFR.E8, HER4.B4, HER4.G4, HER4.F4, HER4.A8, HER4.B6, HER4.D4, HER4.D7, HER4.D11, HER4.D12, HER4.E3, HER4.E7, HER4.F8 e HER4.C7, e semelhantes (veja, por exemplo, as publicações de Patente U.S. US 2006/0099205 A1 e US 2004/0071696 A1, que são aqui incorporadas por referência).
Como descrito nas Patentes U.S. 6.512.097 e 5.977.322, outros anticorpos anti-membro da família EGFR podem ser facilmente produzidos por embaralhamento de cadeias leves e/ou pesadas, seguido por uma ou mais rodadas de seleção por afinidade. Dessa forma, em certas modalidades, esta invenção contempla o uso de uma, duas ou três CDRs na região VL e/ou VH que são CDRs descritas nos anticorpos identificados acima e/ou nas publicações identificadas acima.
Em várias modalidades, a porção de direcionamento compreende um anticorpo que se liga específica ou preferencialmente ao CD20. Anticorpos anti-CD20 são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e incluem, sem limitação, rituximab, Ibritumomab tiuxetan, e tositumomab, AME-133v (Applied Molecular Evolution), Ocrelizumab (Roche), Ofatumumab (Genmab), TRU-015 (Trubion) e IMMU-106 (Immunomedics).
A invenção não se limita ao uso dos anticorpos descritos acima, e outros anticorpos desse tipo que são conhecidos por aqueles habilitados na técnica podem ser usados nas composições e métodos aqui descritos.
Embora a discussão acima diga respeito aos anticorpos,
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44/107 será reconhecido que affybodies e/ou unibodies podem ser usados ao invés de anticorpos.
Unibodies.
UniBody é uma tecnologia de anticorpo que produz um formato de anticorpo menor, estável, com uma janela terapêutica antecipada mais longa do que certos formatos pequenos de anticorpo. Em certas modalidades, unibodies são produzidos a partir de anticorpos IgG4 por eliminação da região de dobradiça do anticorpo. Diferentemente do anticorpo IgG4 de tamanho total, o fragmento de metade da molécula é muito estável e é denominado um uniBody. A divisão da metade da molécula de IgG4 deixa apenas uma área no UniBody que pode se ligar a um alvo. Métodos de produção de unibodies são descritos em detalhes na Publicação PCT WO 2007/059782, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade (veja, também, Kolfschoten e cols. (2007) Science 317: 1.554-1.557).
Affibodies.
Moléculas de affibody são uma classe de proteínas de afinidade com base em um domínio de proteína com 58 resíduos de aminoácidos, derivado de um dos domínios de ligação de IgG da proteína estafilocócica A. Esse domínio com feixe de três hélices foi usado como arcabouço para a construção de bibliotecas combinatórias de fagomídeos, da qual as variantes de Affibody que se dirigem às moléculas desejadas podem ser selecionadas com o uso da tecnologia de apresentação em fago (veja, por exemplo, Nord e cols. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 772-777; Ronmark e cols. (2002) Eur. J. Biochem., 269: 2.647-2.655). Detalhes de Affibodies e métodos de produção são conhecidos por aqueles
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45/107 habilitados na técnica (veja, por exemplo, a Patente U.S.
N° 5.831.012 que é aqui incorporada por referência em sua totalidade).
Será reconhecido que os anticorpos descritos acima podem ser fornecidos como anticorpos intactos inteiros (por exemplo, IgG), fragmentos de anticorpo ou anticorpos de cadeia única, com o uso de métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Além disso, embora o anticorpo possa ser basicamente de qualquer espécie mamífera, para reduzir a imunogenicidade, é desejável usar um anticorpo que seja da espécie na qual a construção (por exemplo, quimera anti-HER2/neu-IFN-a) deverá ser usada. Em outras palavras, para uso em um ser humano, é desejável usar um anticorpo humano, humanizado ou humano quimérico.
B) lFN-α e lFN-α modificado
Em várias modalidades, as porções quiméricas desta invenção compreendem um interferon (por exemplo, IFN-α) unido à porção de direcionamento (por exemplo, anticorpo anti-HER2/neu). O interferon pode ser um interferon do tipo selvagem de comprimento total (por exemplo, IFN-α, IFN-β, IFN-γ etc.), um fragmento de interferon (por exemplo, um fragmento de IFN-α) e/ou um interferon mutado. Tipicamente, o fragmento de interferon é aquele que possui a atividade endógena preferivelmente em um nível de pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% ou 95%, mais preferivelmente ainda pelo menos 98%, 99%, 100% ou um nível maior do que o interferon do tipo selvagem.
Meios de identificação dessas moléculas de interferon modificadas são rotineiros para aqueles habilitados na técnica. Em uma abordagem ilustrativa, uma biblioteca de
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IFN-α truncado e/ou mutado é produzida e avaliada quanto à atividade de IFN-α. Métodos de produção de bibliotecas de variantes polipeptídicas são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Dessa forma, por exemplo, PCR error-prone pode ser usada para criar uma biblioteca de IFN-α mutante e/ou truncado (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 6.365.408).
Os membros da biblioteca resultantes podem então ser avaliados de acordo com métodos padronizados conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Dessa forma, por exemplo, a atividade de IFN-α pode ser avaliada por medida da atividade antiviral contra um vírus de teste em particular. Kits para testar a atividade de IFN-α estão disponíveis comercialmente (veja, por exemplo, iLiteTM alfabeta kit por Neutekbio, Irlanda).
Esses métodos são apenas ilustrativos, e não limitantes. Com o uso dos ensinamentos aqui apresentados, outros interferons modificados adequados (por exemplo, IFNα modificado, IFN-β, IFN-γ etc.) podem facilmente ser identificados e produzidos.
C. Adesão do anticorpo (por exemplo, anti-HER2/neu) ao IFN-α.
Em termos gerais, a porção de direcionamento (por exemplo, um anticorpo anti-HER2/neu e um anticorpo antiCD20 etc.) pode ser unida em outra ordem. Dessa forma, por exemplo, o anticorpo pode ser unido ao terminal amino ou carbóxi do interferon. O anticorpo também pode ser unido à região interna do interferon ou, inversamente, o interferon pode ser unido em uma localização interna ou a qualquer terminal do anticorpo, desde que a adesão não interfira com
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47/107 a ligação do anticorpo ao marcador-alvo (por exemplo, o receptor HER2/neu).
O anticorpo (por exemplo, um anti-HER2/neu C6) e o interferon (por exemplo, IFN-α) podem ser anexados por qualquer um entre diversos meios bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Em certas modalidades, o interferon é conjugado, diretamente ou por meio de um espaçador (linker), ao anticorpo. Em certas modalidades, no entanto, é preferível expressar de forma recombinante a porção quimérica como uma proteína de fusão.
i) Conjugação química da porção de direcionamento ao interferon.
Em certas modalidades, a porção de direcionamento (por exemplo, um anticorpo anti-HER2/neu como, por exemplo, C6.5, C6MH3-B1, G98A, ML3-9, H3B1, B1D2 etc.) é conjugada quimicamente à molécula de interferon (por exemplo, IFN-α) . Meios para conjugar quimicamente moléculas são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
O procedimento para a conjugação de duas moléculas varia de acordo com a estrutura química do agente. Polipeptídeos tipicamente contêm vários grupos funcionais; por exemplo, ácido carboxílico (COOH) ou grupos amina livres (-NH2), que estão disponíveis para reação com um grupo funcional adequado no outro peptídeo, ou em um espaçador, para unir as moléculas a ele.
Alternativamente, o anticorpo e/ou o IFN-α pode ser derivatizado para expor ou anexar grupos funcionais reativos adicionais. A derivatização pode envolver a adesão de diversas moléculas espaçadoras como, por exemplo, aquelas disponíveis por Pierce Chemical Company, Rockford
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Illinois .
Um espaçador, como aqui usado, tipicamente refere-se a uma molécula que é usada para unir o anticorpo ao IFN-α. Em várias modalidades, o espaçador é capaz de formar ligações covalentes tanto com o anticorpo quanto com o IFNα. Espaçadores adequados são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e incluem, sem limitação, espaçadores de carbono de cadeia linear ou ramificada, espaçadores heterocíclicos de carbono ou espaçadores peptídicos. Em certas modalidades, o espaçador pode ser unido aos aminoácidos constituintes do anticorpo e/ou do IFN-α por meio de seus grupos laterais (por exemplo, por meio de uma ligação dissulfeto à cisteína). Em certas modalidades preferidas, os espaçadores são unidos aos grupos alfa carbono amino e/ou carboxil dos aminoácidos terminais do anticorpo e/ou do IFN-α.
Um espaçador bifuncional que possui um grupo funcional reativo com um grupo no anticorpo e outro grupo reativo no IFN-α pode ser usado para formar o conjugado desejado. Alternativamente, a derivatização pode envolver o tratamento químico da porção de direcionamento. Procedimentos para a geração de, por exemplo, grupos sulfidrila livres em polipeptídeos, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de anticorpo, são conhecidos (veja a Patente U.S. N° 4.659.839) .
Muitos procedimentos e moléculas espaçadoras para a adesão de vários compostos, incluindo quelatos de metal radionuclídeo, toxinas e fármacos às proteínas, por exemplo, anticorpos, são conhecidos. Veja, por exemplo, Pedido de Patente Européia N° 188.256; Patentes U.S. Nos:
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4.671.958, 4.659.839, 4.414.148, 4.699.784; 4.680.338;
4.569.789 e 4.589,071; e Borlinghaus e cols. (1987) Cancer Res. 47: 4.071-4.075. Em particular, a produção de várias imunotoxinas é bem conhecida na técnica e pode ser encontrada, por exemplo, em Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet”, Thorpe e cols., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine”, Academic Press, pp. 168-190 (1982); Waldmann (1991) Science, 252: 1657; Patentes U.S. Nos: 4.545.985 e 4.894.443, e semelhantes.
ii) Produção de proteínas de fusão.
Em certas modalidades, a proteína de fusão de porção de direcionamento quimérica-interferon é sintetizada com o uso de metodologia de DNA recombinante. Geralmente, isso envolve a criação de uma sequência de DNA que codifica a
proteína de fusão, a colocação do DNA em um cassete de
expressão sob o controle de um promotor em particular, a
expressão da proteína em um hospedeiro, o isolamento da
proteína expressa e, se necessário, a renaturação da
proteína.
O DNA que codifica as proteínas de fusão (por exemplo,
anti-HER2/neu-IFN-a, anti-CD20-IFN-a etc.) desta invenção pode ser preparado por qualquer método adequado, incluindo, por exemplo, clonagem e restrição de sequências apropriadas ou síntese química direta por métodos como, por exemplo, o método de fosfotriéster de Narang e cols. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; o método de fosfodiéster de Brown e cols. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151; o método de dietilfosforamidita de Beaucage e cols. (1981) Tetra. Lett., 22: 1.859-1.862); o método de suporte sólido da
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Patente U.S. N° 4.458.066, e semelhantes.
A síntese química produz um oligonucleotídeo de fita simples. Esse pode ser convertido em DNA de fita dupla por hibridização com uma sequência complementar, ou por polimerização com uma DNA polimerase usando a fita simples como modelo. Aqueles habilitados na técnica reconheceriam que, embora a síntese química de DNA seja limitada às sequências de cerca de 100 bases, sequências mais longas podem ser obtidas pela ligação de sequências mais curtas.
Alternativamente, subsequências podem ser clonadas e as subsequências apropriadas clivadas com o uso das enzimas de restrição adequadas. Os fragmentos podem então ser ligados para produzir a sequência de DNA desejada.
Em certas modalidades, o DNA que codifica as proteínas de fusão da presente invenção pode ser clonado com o uso de métodos de amplificação de DNA como, por exemplo, reação em cadeia de polimerase (PCR). Dessa forma, por exemplo, o gene para IFN-α é amplificado por PCR, usando um iniciador senso contendo o sítio de restrição para, por exemplo, NdeI, e um iniciador anti-senso contendo o sítio de restrição para HindIII. Isso pode produzir um ácido nucléico que codifica a sequência madura de IFN-α e que possui sítios de restrição terminais. Um anticorpo que possui sítios de restrição complementares pode similarmente ser clonado e depois ligado ao IFN-α e/ou a um espaçador anexado ao IFN-α. A ligação das sequências de ácidos nucléicos e a inserção em um vetor produzem um vetor que codifica IFN-α unido ao anticorpo anti-HER2/neu.
Embora as duas moléculas possam ser unidas juntas diretamente, aqueles habilitados na técnica observarão que
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51/107 as moléculas podem ser separadas por um espaçador peptídico que consiste em um ou mais aminoácidos. Geralmente, o espaçador não terá atividade biológica específica além de unir as proteínas ou preservar uma distância mínima ou outro relacionamento espacial entre elas. Em certas modalidades, no entanto, os aminoácidos constituintes do espaçador podem ser selecionados para influenciar alguma propriedade da molécula como, por exemplo, o enovelamento, a carga líquida ou a hidrofobicidade.
Foi uma descoberta surpreendente, no entanto, que certos espaçadores são inadequados à preparação de proteínas de fusão da presente invenção. Dessa forma, por exemplo, o espaçador (Gly4Ser)3 (ID. DE SEQ. N°: 31) não era bem adequado à produção de uma construção anti-CD20-IFN-a. Sem se prender a uma teoria específica, acredita-se que o interferon estava sendo removido da proteína de fusão por proteólise. A análise Western blot usando anti-Fc e antiinterferon confirmou que ambas as bandas superiores eram cadeias pesadas, mas apenas a maior continha interferon.
Consequentemente, em certas modalidades preferidas, é desejável usar um espaçador que seja resistente à proteólise. Certos espaçadores preferidos são espaçadores que não possuem (Gly4Ser)3 (ID. DE SEQ. N°: 31) . Certos espaçadores preferidos são espaçadores mais curtos do que 15 aminoácidos, ou espaçadores mais curtos do que 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 aminoácidos de comprimento. Em certas modalidades, o espaçador é um espaçador alfa helicoidal que varia em termos de comprimento até cerca de 12 ou 13 ou 14 aminoácidos de comprimento.
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Certos espaçadores resistentes à proteólise ilustrativos bem adequados para uso nas construções desta invenção são mostrados na Tabela 2.
Tabela 2. Espaçadores resistentes à proteólise 5 ilustrativos.
Sequência do espaçador ID. DE SEQ. N°
GGGGS 32
AEAAAKEAAAKA 33
A(EAAAK)nA, em que n = 1, 2, 3, 4, ou 5 34
GGGGG 35
GGGGGGGG 36
GGAGG 37
GAGAGAGAGA 38
RPLSYRPPFPFGFPSVRP 39
YPRSIYIRRRHPSPSLTT 40
TPSHLSHILPSFGLPTFN 41
RPVSPFTFPRLSNSWLPA 42
S PAAHFPRSIPRPGPIRT 43
APGPSAPSHRSLPSRAFG 44
PRNSIHFLHPLLVAPLGA 45
MPSLSGVLQVRYLSPPDL 46
SPQYPSPLTLTLPPHPSL 47
NPSLNPPSYLHRAPSRIS 48
LPWRTS LLPS LPLRRRP 49
PPLFAKGPVGLLSRSFPP 50
VPPAPVVSLRSAHARPPY 51
LRPTPPRVRSYTCCPTP 52
PNVAHVLPLLTVPWDNLR 53
CNPLLPLCARSPAVRTFP 54
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As sequências de ácidos nucléicos que codificam as proteínas de fusão podem ser expressas em diversas células hospedeiras, incluindo E. coli, outros hospedeiros bacterianos, leveduras e várias células eucarióticas superiores como, por exemplo, linhagens de células COS, CHO e HeLa e linhagens de células de mieloma. O gene da proteína recombinante é tipicamente ligado operacionalmente a sequências de controle da expressão apropriadas para cada hospedeiro. Para E. coli, isso inclui um promotor como, por exemplo, os promotores T7, trp ou lambda, um sítio de ligação de ribossomo e, preferivelmente, um sinal de terminação da transcrição. Para células eucarióticas, as sequências de controle incluirão um promotor e preferivelmente um intensificador derivado de genes de imunoglobulina, SV40, citomegalovírus etc., e uma sequência de poliadenilação, e podem incluir sequências doadoras e receptoras de splice.
Os plasmídeos da invenção podem ser transferidos na célula hospedeira escolhida por métodos bem conhecidos como, por exemplo, transformação em cloreto de cálcio para E. coli e tratamento com fosfato de cálcio ou eletroporação para células mamíferas. As células transformadas pelos plasmídeos podem ser selecionadas por resistência a antibióticos conferida por genes contidos nos plasmídeos, por exemplo, os genes amp, gpt, neo e hyg.
Uma vez expressas, as proteínas de fusão recombinantes podem ser purificadas de acordo com procedimentos padronizados da técnica, incluindo precipitação com sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia coluna em coluna, eletroforese em gel, e semelhantes (veja,
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54/107 geralmente, R. Scopes (1982) Protein Purification”, Springer-Verlag, N.Y.: Deutscher (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification”, Academic Press, Inc. N.Y., e semelhantes). Composições substancialmente puras de pelo menos cerca de 90 a 95% de homogeneidade são preferidas, e 98 a 99% ou mais de homogeneidade são as mais preferidas para usos farmacêuticos. Uma vez purificados, parcialmente ou até a homogeneidade desejada, os polipeptídeos podem então ser usados terapeuticamente.
Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que, após a síntese química, a expressão biológica, ou purificação, a proteína de fusão (por exemplo, anti-HER2/neu-IFN-a, antiCD20-IFN-a etc.) pode possuir uma conformação substancialmente diferente das conformações nativas dos polipeptídeos constituintes. Nesse caso, pode ser necessário desnaturar e reduzir o polipeptídeo e depois causar o re-enovelamento do polipeptídeo na conformação preferida. Métodos de redução e desnaturação de proteínas e indução de re-enovelamento são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica (veja, por exemplo, Debinski e cols. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14.065-14.070; Kreitman e Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; e Buchner, e cols. (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270) . Debinski e cols., por exemplo, descrevem a desnaturação e redução de proteínas de corpos de inclusão em guanidina-DTE. A proteína é então re-enovelada em um tampão redox contendo glutationa oxidada e L-arginina.
Em certas modalidades, um sistema de expressão transitória pode ser usado para expressar as construções
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55/107 quiméricas aqui descritas. Embora muitas linhagens de células potencialmente possam ser usadas, uma linhagem de células que funciona bem para expressão transitória é 293T. Para expressão transitória de 2 93T no Dia 0, 9 milhões de células em 25 ml são semeadas para cada placa de cultura de tecido de 150 mm. Um mg/ml de PEI (Polietilenimina) é feito usando água estéril. Para a expressão de um anticorpo completo ou de uma proteína de fusão de anticorpo, 25 ug de cada um de H e L (50 ug no total) são usados por placa. Um volume de 5 ml é usado para transfecção de cada placa de 150 mm. O DNA é misturado com DMEM, a PEI é então adicionada e a mistura é incubada em temperatura ambiente por 10 minutos. É usado 1,75 ug de PEI para cada ug de DNA. Para transfecção, o meio antigo é removido, descartado e substituído por 20 ml de meio fresco (Iscoves + soro de bezerro 5%). A mistura de transfecção é adicionada e a placa é girada. No Dia 2, o meio é substituído por 30 ml de meio Iscoves contendo FBS 1% (soro glicobovino) para minimizar a quantidade de Ig bovina presente. Os sobrenadantes são coletados das células nos Dias 4, 6 e 13 por remoção do meio e sua substituição por 30 ml de Iscover fresco contendo FBS 1%.
A clonagem e expressão de uma proteína de fusão antiHER2/neu-IFN-a é aqui ilustrada no Exemplo 1, enquanto a clonagem e expressão de uma proteína de fusão anti-CD20IFN-α é mostrada no Exemplo 2.
Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que esses métodos de expressão são ilustrativos e não limitantes. Podem ser feitas modificações às proteínas de fusão aqui descritas, sem diminuir sua atividade/eficácia. Algumas
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56/107 modificações podem ser feitas para facilitar a clonagem, expressão ou incorporação da molécula de direcionamento em uma proteína de fusão. Essas modificações são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica e incluem, por exemplo, uma metionina adicionada ao terminal amino para fornecer um sítio de iniciação, ou aminoácidos adicionais colocados em um dos terminais para criar sítios de restrição ou códons de terminação localizados convenientemente.
Podem ser feitas outras modificações para aumentar a meia-vida sérica e/ou a biodisponibilidade. Essas modificações incluem, sem limitação, a incorporação de D aminoácidos (especialmente no espaçador), o uso de aminoácidos de ocorrência não natural, a peguilação da proteína de fusão, e semelhantes.
D. Outras porções de direcionamento multivalentes.
Em certas modalidades, esta invenção contempla o uso de porções de direcionamento multivalentes, preferivelmente trivalentes, quadravalentes, pentavalentes ou mais (por exemplo, anticorpos antiHER2/neu, anticorpos anti-CD20 etc.) para direcionar o interferon a uma célula-alvo.
Por exemplo, podem ser produzidas porções antiHER2/neu multivalentes por qualquer um entre diversos métodos. Por exemplo, espaçadores que possuem três, quatro ou mais sítios reativos podem ser reagidos com anticorpos anti-HER2/neu para formar um trímero ou um conjugado maior.
Em certas modalidades, apresentação em fago, apresentação em levedura, apresentação bacteriana, ou outros sistemas de apresentação podem ser usados para expressar e apresentar múltiplas cópias (por exemplo, pelo
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57/107 menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6 cópias etc.) de um anticorpo de direcionamento (por exemplo, antiHER2/neu, anti-CD20 etc.) e, dessa forma, fornecer eficazmente uma porção de direcionamento multivalente.
II. Usos combinados.
As construções quiméricas desta invenção são úteis para inibição do crescimento e/ou da proliferação de células-alvo (por exemplo, células cancerosas). Em várias modalidades, as porções quiméricas podem ser usadas para inibir a progressão da doença, para encolher o tamanho do tumor e/ou para estabilizar a regressão/remissão.
Particularmente no tratamento de câncer, as composições e métodos da invenção podem também incluir agentes terapêuticos adicionais e/ou farmacologicamente aceitáveis. Por exemplo, as composições ou os métodos podem envolver outros agentes para o tratamento de câncer. Esses agentes incluem, sem limitação, agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina (Mustargen), ciclofosfamida (Cytoxan, Neosar), ifosfamida (Ifex), mostarda fenilalanina; melfalen (Alkeran), clorambucol (Leukeran), mostarda uracil, estramustina (Emcyt), tiotepa (Thioplex), bussulfan (Myerlan), lomustina (CeeNU), carmustina (BiCNU, BCNU), estreptozocina (Zanosar), dacarbazina (DTIC-Dome), cisplatina, cisplatina (Platinol, Platinol AQ), carboplatina (Paraplatin), altretamina (Hexalen) etc.), antimetabólitos (por exemplo, metotrexato (Amethopterin, Folex, Mexate, Rheumatrex), 5-fluoruracil (Adrucil, Efudex, Fluoroplex), floxuridina, 5-fluordesoxiuridina (FUDR), capecitabina (Xeloda), fludarabina: (Fludara), citosina arabinosida (Cytaribine, Cytosar, ARA-C), 6-mercaptopurina
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58/107 (Purinethol), 6-tioguanina (Thioguanina), gemcitabina (Gemzar), cladribina (Leustatin), desoxicoformicina; pentostatin (Nipent) etc.), antibióticos (por exemplo, doxorrubicina (Adriamicina, Rubex, Doxil, preparação Daunoxome-lipossômica), daunorrubicina (Daunomicina, Cerubidine), idarrubicina (Idamicina), valrubicina (Valstar), mitoxantrona (Novantrone), dactinomicina (Actinomicina D, Cosmegen), mitramicina, plicamicina (Mithracin), mitomicina C (Mutamicina), bleomicina (Blenoxane), procarbazina (Matulane) etc.), inibidores mitóticos (por exemplo, paclitaxel (Taxol), docetaxel (Taxotere), sulfato de vinblastina (Velban, Velsar, VLB) , sulfato de vincristina (Oncovin, Vincasar PFS, Vincrex), sulfato de vinorrelbina (Navelbine) etc.), inibidores da função de cromatina (por exemplo, topotecan (Camptosar), irinotecan (Hycamtin), etoposida (VP-16, VePesid, Toposar), teniposida (VM-26, Vumon) etc.), hormônios e inibidores hormonais (por exemplo, dietilestilbestrol (Stilbesterol, Stilphostrol), estradiol, estrogênio, estrogênios esterificados (Estratab, Menest), estramustina (Emcyt), tamoxifeno (Nolvadex), toremifeno (Fareston) anastrozol (Arimidax), letrozol (Femara), 17-OH-progesterona, medroxiprogesterona, acetato de megestrol (Megace), goserelina (Zoladex), leuprolida (Leupron), testosterona, metiltestosterona, fluoxmesterona (Android-F, Halotestin), flutamida (Eulexin), bicalutamida (Casodex), nilutamida (Nilandron) etc.), inibidores de síntese (por exemplo, aminoglutetimida (Cytadren), cetoconazol (Nizoral) etc.), imunomoduladores (por exemplo, rituximab (Rituxan), trastuzumab (Herceptin), denileukin diftitox (Ontak),
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59/107 levamisol (Ergamisol), bacilo Calmette-Guerin, BCG (TheraCys, TICE BCG), interferon alfa-2a, alfa 2b (RoferonA, Intron A), interleucina-2, aldesleucina (ProLeukin) etc.) e outros agentes como, por exemplo, 1-aspariginase (Elspar, Kidrolase), pegaspasgase (Oncaspar), hidroxiuréia (Hydrea, Doxia), leucovorin (Wellcovorin), mitotane (Lysodren), porfimer (Photofrin), tretinoína (Veasnoid), e semelhantes.
III. Composições farmacêuticas.
A fim de efetuar os métodos da invenção, um ou mais agentes ativos (porções quiméricas) desta invenção são administrados, por exemplo, a um indivíduo diagnosticado como tendo um câncer. O(s) agente(s) ativo(s) pode ser administrado na forma nativa ou, se desejado, na forma de sais, ésteres, amidas, pró-fármacos, derivados, e semelhantes, desde que o sal, éster, amida, pró-fármaco ou derivado seja adequado farmacologicamente, ou seja, eficaz no presente método. Sais, ésteres, amidas, pró-fármacos e outros derivados dos agentes ativos podem ser preparados com o uso de procedimentos padronizados conhecidos por aqueles habilitados na técnica de química orgânica sintética, e descritos, por exemplo, por March (1992) Advanced Organic Chemistry; Reactions, Mechanisms and Structure, 4a Edição, N.Y. Wiley-Interscience.
Por exemplo, sais de adição ácida são preparados a partir da base livre com o uso de metodologia convencional, que tipicamente envolve reação com um ácido adequado. Geralmente, a forma de base do fármaco é dissolvida em um solvente orgânico polar como, por exemplo, metanol ou etanol, e o ácido é a ele adicionado. O sal resultante se
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60/107 precipita ou pode ser retirado da solução por adição de um solvente menos polar. Ácidos adequados para a preparação de sais de adição ácida incluem tanto ácidos orgânicos, por exemplo, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico, e semelhantes, quanto ácidos inorgânicos, por exemplo, ácido clorídrico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e semelhantes. Um sal de adição ácida pode ser reconvertido na base livre por tratamento com uma base adequada. Sais de adição ácida particularmente preferidos dos agentes ativos aqui apresentados são sais de haleto, que podem ser preparados com o uso de ácido clorídrico ou hidrobrômico. Inversamente, a preparação de sais básicos dos agentes ativos desta invenção é feita de forma similar usando uma base farmaceuticamente aceitável como, por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, hidróxido de cálcio, trimetilamina, ou semelhantes. Sais básicos particularmente preferidos incluem sais de metal alcalino, por exemplo, o sal de sódio, e sais de cobre.
A preparação de ésteres tipicamente envolve a funcionalização de grupos hidroxil e/ou carboxil que podem estar presentes dentro da estrutura molecular do fármaco. Os ésteres são tipicamente derivados acil-substituídos de grupos álcool livres, ou seja, porções que são derivadas de
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61/107 ácidos carboxílicos da fórmula RCOOH, em que R é alquil, e preferivelmente é alquil inferior. Os ésteres podem ser reconvertidos nos ácidos livres, se desejado, pela utilização de procedimentos convencionais de hidrogenólise ou hidrólise.
Amidas e pró-fármacos também podem ser preparados com o uso de metodologias conhecidas por aqueles habilitados na técnica ou descritas na literatura pertinente. Por exemplo, amidas podem ser preparadas a partir de ésteres, usando reagentes de amina adequados, ou elas podem ser preparadas a partir de um anidrido ou de um cloreto ácido por reação com amônia ou uma amina de alquil inferior. Pró-fármacos são tipicamente preparados por adesão covalente de uma porção que resulta em um composto que é terapeuticamente inativo até ser modificado pelo sistema metabólico de um indivíduo.
Os agentes ativos aqui identificados são úteis para administração parenteral, tópica, oral, nasal (ou de algum outro modo inalados), retal ou local, por exemplo, por aerossol ou por via transdérmica, para tratamento profilático e/ou terapêutico de uma ou mais das patologias/indicações aqui descritas (por exemplo, aterosclerose e/ou sintomas desta). As composições farmacêuticas podem ser administradas em diversas formas de dosagem unitária, dependendo do método de administração. Formas de dosagem unitária adequadas incluem, sem limitação, pós, comprimidos, pílulas, cápsulas, losangos, supositórios, emplastros, sprays nasais, injetáveis, formulações implantáveis de liberação sustentada, complexos lipídicos etc.
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Os agentes ativos desta invenção são tipicamente combinados com um veículo (excipiente) farmaceuticamente aceitável para formar uma composição farmacológica. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem conter um ou mais compostos fisiologicamente aceitáveis que atuam, por exemplo, para estabilizar a composição ou para aumentar ou diminuir a absorção do(s) agente(s) ativo(s). Compostos fisiologicamente aceitáveis podem incluir, por exemplo, carboidratos, por exemplo, glicose, sacarose ou dextranas, antioxidantes, por exemplo, ácido ascórbico ou glutationa, agentes quelantes, proteínas de baixo peso molecular, intensificadores da proteção e da captação como, por exemplo, lipídeos, composições que reduzem a depuração ou hidrólise dos agentes ativos, ou excipientes ou outros estabilizantes e/ou tampões.
Outros compostos fisiologicamente aceitáveis incluem agentes umidificantes, agentes emulsificantes, agentes dispersantes ou conservantes que são particularmente úteis para prevenção do crescimento ou ação de microorganismos. Vários conservantes são bem conhecidos e incluem, por exemplo, fenol e ácido ascórbico. Aqueles habilitados na técnica observarão que a escolha de um veiculo farmaceuticamente aceitável, incluindo um composto fisiologicamente aceitável, depende, por exemplo, da via de administração do(s) agente(s) ativo(s) e das características físico-químicas específicas do(s) agente(s) ativo(s).
Os excipientes são preferivelmente estéreis e geralmente livres de material indesejável. Essas composições podem ser esterilizadas por técnicas de
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63/107 esterilização convencionais, bem conhecidas.
Em aplicações terapêuticas, as composições desta invenção são administradas a um paciente que sofre, por exemplo, de um câncer, ou em risco de câncer (por exemplo, após remoção cirúrgica de um tumor primário) em uma quantidade suficiente para evitar e/ou curar e/ou pelo menos evitar ou interromper parcialmente a doença e/ou suas complicações. Uma quantidade adequada para obter esse resultado é definida como uma dose terapeuticamente eficaz”. Quantidades eficazes para esse uso dependerão da gravidade da doença e do estado geral da saúde do paciente. Podem ser feitas administrações únicas ou múltiplas das composições, dependendo da dosagem e da frequência necessárias e toleradas pelo paciente. Em qualquer evento, a composição deve fornecer uma quantidade suficiente dos agentes ativos das formulações desta invenção para tratar eficazmente (melhorar um ou mais sintomas) o paciente.
A concentração de agente(s) ativo(s) pode variar amplamente, e será selecionada primariamente com base nos volumes de líquidos, viscosidades, peso corporal, e semelhantes, de acordo com o modo de administração em particular selecionado e das necessidades do paciente. As concentrações, no entanto, tipicamente serão selecionadas para fornecer dosagens que variam de cerca de 0,1 ou 1 mg/kg/dia a cerca de 50 mg/kg/dia e algumas vezes maiores. Dosagens típicas variam de cerca de 3 mg/kg/dia a cerca de 3,5 mg/kg/dia, preferivelmente de cerca de 3,5 mg/kg/dia a cerca de 7,2 mg/kg/dia, mais preferivelmente de cerca de 7,2 mg/kg/dia a cerca de 11,0 mg/kg/dia e, mais preferivelmente ainda, de cerca de 11,0 mg/kg/dia a cerca
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64/107 de 15,0 mg/kg/dia. Em certas modalidades preferidas, as dosagens variam de cerca de 10 mg/kg/dia a cerca de 50 mg/kg/dia. Em certas modalidades, as dosagens variam de cerca de 20 mg a cerca de 50 mg dados oralmente duas vezes ao dia. Será observado que essas dosagens podem ser variadas para otimizar um regime terapêutico em um indivíduo ou grupo de indivíduos em particular.
Em certas modalidades preferidas, os agentes ativos desta invenção são administrados oralmente (por exemplo, por meio de um comprimido) ou como um injetável de acordo com métodos padronizados bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Em outras modalidades preferidas, os peptídeos também podem ser liberados através da pele com o uso de sistemas convencionais de liberação transdérmica de fármacos, ou seja, emplastros transdérmicos nos quais os agentes ativos estão tipicamente contidos dentro de uma estrutura laminada que serve como um dispositivo de liberação farmacológica a ser afixado na pele. Em uma estrutura desse tipo, a composição farmacológica está tipicamente contida em uma camada, ou reservatório, subjacente a uma cadada de forro superior. Será observado que o termo reservatório nesse contexto refere-se a uma quantidade de ingrediente(s) ativo(s) que, ao final, estará disponível para liberação à superfície da pele. Dessa forma, por exemplo, o reservatório pode incluir o(s) ingrediente(s) ativo(s) em um adesivo em uma camada de forro do emplastro, ou em qualquer uma entre diversas formulações de matriz diferentes conhecidas por aqueles habilitados na técnica. O emplastro pode conter um único reservatório, ou ele pode conter múltiplos reservatórios.
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Em uma modalidade, o reservatório compreende uma matriz polimérica de um material adesivo de contato farmaceuticamente aceitável que serve para afixar o sistema à pele durante a liberação do fármaco. Exemplos de materiais adesivos de contato com a pele adequados incluem, sem limitação, polietilenos, polisiloxanos, poliisobutilenos, poliacrilatos, poliuretanos e semelhantes. Alternativamente, o reservatório que contém fármaco e o adesivo de contato com a pele estão presentes como camadas separadas e distintas, com o adesivo subjacente ao reservatório, o qual, nesse caso, pode ser uma matriz polimérica, como descrito acima, ou pode ser um reservatório de líquido ou hidrogel, ou pode assumir alguma outra forma. A camada de forro nesses laminados, que serve como a superfície superior do dispositivo, preferivelmente funciona como um elemento estrutural primário do emplastro e dá ao dispositivo muita de sua flexibilidade. O material selecionado para a camada de forro é preferivelmente substancialmente impermeável a(s) agente(s) ativo(s) e quaisquer outros materiais que estejam presentes.
Em certas modalidades, a meia-vida sérica elevada pode ser mantida pelo uso de sistemas de empacotamento de proteína de liberação sustentada. Esses sistemas de liberação sustentada são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Em uma modalidade preferida, o sistema de liberação de microesferas biodegradáveis ProLeaseTM para proteínas e peptídeos (veja, por exemplo, Tracy (1998) Biotechnol. Prog. 14: 108; Johnson e cols. (1996), Nature Med. 2: 795; Herbert e cols. (1998),
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Pharmaceut. Res. 15, 357), um pó seco composto por microesferas poliméricas biodegradáveis contendo o agente ativo em uma matriz de polímero que pode ser composto como uma formulação seca, com ou sem outros agentes.
O processo fabricação de microesferas ProLeaseTM foi projetado especificamente para obter uma eficiência de encapsulação elevada, mantendo a integridade do agente ativo. O processo consiste em: (i) preparação de partículas liofilizadas de fármaco a partir de um grande volume por spray de liofilização da solução do fármaco com excipientes estabilizantes, (ii) preparação de uma suspensão de polímero de fármaco seguida por sonificação ou homogeneização para reduzir o tamanho da partícula de fármaco, (iii) produção de microesferas congeladas de fármaco-polímero por atomização em nitrogênio líquido, (iv) extração do solvente do polímero com etanol, e (v) filtração e secagem a vácuo para produzir o produto final em pó seco. O pó resultante contém a forma sólida dos agentes ativos, que é homogeneamente e rigidamente dispersa dentro das partículas porosas de polímero. O polímero mais comumente usado no processo, poli(lactida-co-glicolida) (PLG), é biocompatível e biodegradável.
A encapsulação pode ser obtida em temperaturas baixas (por exemplo, -40°C). Durante a encapsulação, a proteína é mantida no estado sólido na ausência de água, minimizando, dessa forma, a mobilidade conformacional induzida pela água da proteína, evitando reações de degradação de proteína que incluam água como reagente, e evitando interfaces orgânicas-aquosas nas quais as proteínas podem sofrer desnaturação. Um processo preferido usa solventes nos quais
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67/107 a maior parte das proteínas é insolúvel, gerando, desse modo, eficiências de encapsulação elevadas (por exemplo, acima de 95%).
Em outra modalidade, um ou mais componentes da solução podem ser fornecidos como um concentrado, por exemplo, em um recipiente de armazenamento (por exemplo, em um volume pré-medido) pronto para diluição, ou em uma cápsula solúvel pronta para adição a um volume de água.
As formulações e os métodos de administração apresentados anteriormente são apenas ilustrativos, e não limitantes. Será observado que, com a utilização dos ensinamentos aqui fornecidos, outras formulações e modos de administração adequados podem ser facilmente previstos.
IV. Kits.
Em certas modalidades, esta invenção fornece kits para o tratamento de um câncer primário e/ou em uma terapia auxiliar. Os kits tipicamente compreendem um recipiente que contém uma porção quimérica da presente invenção (por exemplo, anti-HER2/neu-IFN-a, anti-CD20-IFN-a etc.). A porção quimérica pode ser apresentada em um excipiente farmacologicamente aceitável.
Além disso, os kits podem opcionalmente incluir materiais instrutivos que revelam meios para o uso da porção quimérica (por exemplo, para tratar um câncer e/ou como uma substância terapêutica auxiliar). Os materiais instrutivos também podem, opcionalmente, ensinar dosagens preferidas, contra-indicações e semelhantes.
Os kits também podem incluir componentes adicionais para facilitar a aplicação específica para a qual o kit é projetado. Dessa forma, por exemplo, e adicionalmente,
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68/107 podem compreender meios para a desinfecção de um ferimento, para redução de dor, para adesão de um curativo, e semelhantes.
Embora os materiais instrutivos tipicamente compreendam materiais escritos ou impressos, eles não se limitam a esses materiais. Qualquer meio capaz de armazenar essas instruções e comunicá-las a um usuário final é contemplado por esta invenção. Esses meios incluem, sem limitação, meios de armazenamento eletrônico (por exemplo, discos magnéticos, fitas, cartuchos, chips), meios ópticos (por exemplo, CD-ROM), e semelhantes. Esses meios incluem indicações de páginas da Internet que fornecem esses materiais instrutivos.
EXEMPLOS
Os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar, mas não limitar, a invenção reivindicada.
Exemplo 1
Proteína de fusão IgG3 anti-Her2/Neu e IFN-alfa demonstra potentes atividades apoptóticas e antitumorais contra linfoma de células B
No presente estudo, construímos uma proteína de fusão que consiste em anti-HER2/neu-IgG3 com a região variável de C6MH3-B1 (20) e IFN-α, e investigamos seu efeito sobre um linfoma de célula B murídeo, 38C13, que expressa HER2/neu humano (38C13/HER2). Escolhemos avaliar IFN-α direcionado ao tumor nesse modelo em função da responsividade desse linfoma de célula B ao IFN-α (21) . A fusão de IFN-α a um Ab aumentou significativamente sua meia-vida in vivo. Verificou-se que anti-HER2/neu-IgG3-IFN-α é eficiente na inibição do crescimento in vivo de tumores de 38C13/HER2
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69/107 tanto pequenos quanto estabelecidos, sem sinais de toxicidade sistêmica observados em doses eficazes. AntiHER2/neu-IgG3-IFN-a inibiu o crescimento e induziu apoptose em células 38C13/HER2. Esses resultados indicam que a fusão de IFN-α a um Ab tumor-específico resulta em um agente eficaz para o tratamento de linfoma de célula B.
Materiais e métodos
Linhagens celulares e condições de cultura
38C13 é um linfoma de célula B murídeo altamente maligno derivado de camundongos C3H/HeN. A construção e a caracterização de 38C13 que expressa HER2/neu humano (38C13/HER2) foram descritas previamente (6). Tanto 38C13 quanto 38C13/HER2 foram cultivadas em IMDM (Irvine Scientific) suplementado com 2 mM de L-glutamina, 10 U/ml de penicilina, 10 de μ/ml de estreptomicina (GPS; SigmaAldrich) e soro de bezerro 10% (Atlanta Biologicals). Mieloma murídeo P3X63Ag8.653 (American Type Culture Collection) e seus derivados que expressam anti-HER2 IgG3IFN-α ou IgG3-IFN-a foram desenvolvidos em IMDM suplementado com soro de bezerro 10% e GPS. Fibroblastos L929 (American Type Culture Collection) foram cultivados em IMDM com soro de bezerro 5% e GPS. A construção e a caracterização de CT26/HER2, uma linhagem de células de adenocarcinoma do cólon murídeo que superexpressam HER2/neu humano, foram descritas previamente (6). CT26/HER2 foi cultivada em IMDM com soro de bezerro 5% e GPS.
Construção de plasmídeo
As regiões variáveis da cadeia H e L de C6MH3-B1, um scFv anti-HER2/neu humano, foram inseridas nos vetores de expressão da cadeia H γ3 humana (pAH4802) e da cadeia L κ
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70/107 (pAG4622), respectivamente (22), e usadas para produzir IgG3 quimérica dessa especificidade. Para construir a proteína de fusão anti-HER2/neu humano-IgG3(C6MH3-B1)-IFNα, primeiro foi utilizada PCR para introduzir um sítio de enzima de restrição BamHI acima e um sítio de enzima de restrição XbaI abaixo do gene de IFN-α maduro murídeo amplificado por PCR do DNA genômico de camundongos BALB/c com o iniciador direto (forward) 5'-CGC GGA TCC TGT GAC CTG CCT CAG ACT C-3 (ID. DE SEQ. N°: 55) e o iniciador reverso 5'-GCT CTA GAT CAT TTC TCT TCT CTC AGT CTT C-3 (ID. DE SEQ. N°: 56). O produto de PCR final foi ligado em um vetor TA. O vetor resultante, após sequenciamento, foi digerido com BamHI e XbaI para liberar o fragmento de DNA que foi inserido no vetor pAH9612 que contém a região constante de IgG3 com a região variável da cadeia H C6MH3-B1 e um espaçador peptídico GGGGSGGGGSGGGGS (ID. DE SEQ. N°: 57) no final de CH3. O produto de PCR final, pAH9616, continha anti-HER2/neu-IgG3 seguido por um espaçador peptídico e GGGGSGGGGSGGGGS (ID. DE SEQ. N°: 57) e IFN-α murídeo.
Produção e purificação de proteínas recombinantes
O plasmídeo que codifica a cadeia H de IgG3 com a região variável C6MH3-B1 fundida ao IFN-α foi transfectado em células P3X63Ag8.653 que expressam a cadeia L com a região variável C6MH3-B1 (23) para produzir anti-HER2/neuIgG3-IFN^ ou uma cadeia L não específica (4D5; Genentech) (6) para produzir IgG3-IFN^ por eletroporação com um pulso de 960 μFd de capacitância e 0,2 V. Os transfectantes que produzem anti-HER2/neu(C6MH3-B1)-IgG3, anti-HER2/neu(C6MH3DD-^OS-IEM-u ou IgG3-IFN^ foram selecionados e caracterizados como descrito previamente (6). Anti
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HER2/neu(C6MH3-B1)-IgG3 foi purificado dos sobrenadantes de cultura usando proteína G imobilizada em fluxo rápido de Sefarose 4B (Sigma-Aldrich), e anti-HER2/neu(C6MH3-B1)IgG3-IFN-a e IgG3-IFN-a foram purificados de sobrenadantes de cultura usando proteína A imobilizada em fluxo rápido de Sefarose 4B (Sigma-Aldrich). A pureza e a integridade foram avaliadas por coloração com azul Coomassie das proteínas separadas por SDS-PAGE. O padrão de referência internacional para IFN-α de camundongo fornecido pelo National Institutes of Health” foi usado para determinar a atividade de IFN das proteínas de fusão. rIFN-α foi obtido de PBL Biomedical Laboratories”.
Análise FPLC da proteína de fusão IgG3-IFN-α
Para determinar se a proteína de fusão existe como monômero e/ou polímeros em solução, 100 ug de IgG3-IFN-g misturados com 400 ug de OVA para fornecer um controle interno foram analisados por filtração em gel em uma coluna de Superose 6 de 30 x 1,5 cm anexada em uma cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) usando PBS e 0,5 ml/min de taxa de fluxo. A filtração em gel na mesma coluna de IgA2m, que existe predominantemente como Ab dímero com uma massa molecular de 350 kDa, e uma mistura de IgG de Miles de massa molecular 150 kDa e OVA de massa molecular 45 kDa, foi usada para fornecer padrões de massa molecular.
Análise por citometria de fluxo da atividade de ligação a HER2/neu
Para detectar a reatividade de várias proteínas de fusão anti-HER2/neu com células CT26/HER2, 1 x 106 células foram incubadas a 4°C por 1 hora com 10 pM da proteína de fusão. Para alguns experimentos, as proteínas de fusão
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72/107 foram pré-incubadas com 900 U de heparina a 4 °C por 17 horas antes da incubação com células CT26/HER2. As células foram então reagidas com anti-IgG humana de rato biotinilada (BD Biosciences) diluída até 1/100. Os Abs biotinilados ligados foram detectados com estreptavidina marcada com PE (BD Biosciences) diluída até 1/1.500 e as células foram analisadas por citometria de fluxo usando um FACScan (BD Biosciences).
Atividade antiviral do IFN-α
A linhagem de células de fibroblastos L-929 sensíveis à infecção pelo vírus da estomatite vesicular (VSV) foi usada para quantificar a atividade biológica de IFN-α. As células L-929 foram plaqueadas em uma placa de cultura de tecido de 96 poços (Falcon; BD Biosciences) em uma densidade de 4 x 104 células/poço e incubadas de um dia para o outro a 37°C em uma atmosfera de CO2 5%. A seguir, diluições seriais de diferentes proteínas de fusão de IFN-α ou IFN-a-padrão (padrão de referência internacional para IFN-α de camundongo; National Institutes of Health”, Bethesda, MD) foram adicionadas, e a placa foi incubada a 37°C por 24 h. Quatro mil PFU de VSV foram então adicionados a cada poço e incubados a 37°C por mais 48 horas. As células aderentes sobreviventes foram coradas com 50 ill de violeta cristal (0,05% em etanol 20%) por 10 minutos. As placas foram lavadas com água e o corante restante foi solubilizado pela adição de 100 ul de metanol 100%. As placas foram lidas usando uma leitora de ELISA a 595 nm.
Ensaio para o efeito antiproliferativo de antiHER2/neu-IgG3-IFN-α
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Resumidamente, células 38C13 ou 38C13/HER2 foram plaqueadas em uma placa de cultura de tecido de 96 poços em uma densidade de 1,25 x 104 células/poço, e diluições seriais de diferentes proteínas de fusão foram adicionadas. As placas foram então incubadas por 48 horas a 37°C em uma atmosfera de CO2 5%. As placas foram desenvolvidas por adição de 20 gl de solução de MTS (Promega) e analisadas a 490 nm usando uma leitora de ELISA. A inibição da proliferação (percentual) foi calculada como:
100 x [(ODexp - ODb ranco ) / (Odmeio ODb ranco )] x 100
Ensaio para apoptose
Resumidamente, 1 x 106 células foram tratadas com diferentes proteínas de fusão por 72 horas. As células foram então lavadas com PBS gelado. O ensaio de anexina V/iodeto de propídio (PI) foi realizado de acordo com os procedimentos sugeridos pelo fabricante usando o Kit de Ensaio de Apoptose Vybrant 2 (Molecular Probes).
Proliferação de células tumorais 38C13/HER2 marcadas com CFSE
Resumidamente, 1 x 106 células foram incubadas com 2,5 μΜ de CFSE (Molecular Probes) por 10 minutos a 37°C. As células foram então tratadas com 1 nM de diferentes proteínas de fusão por 48 horas e analisadas por citometria de fluxo de acordo com os procedimentos sugeridos pelo fabricante usando o Kit de Proliferação Celular CellTrace CFSE (Molecular Probes).
Camundongos
Foram usadas fêmeas de camundongos C3H/HeN de 6-8 semanas de idade obtidas de Taconic Farms. Os animais foram abrigados em uma instalação usando gaiolas de policarbonato
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74/107 submetidas à autoclave contendo leitos de aparas de madeira. Os animais receberam alimento e água ad libitum.
Foi fornecida luz artificial sob um ciclo de claro/escuro de 12/12 horas. A temperatura da instalação foi de 20°C com
10-15 de trocas de ar por hora.
Meia-vida rIFN-α murídeo (PBL Biomedical Laboratories), IgG3IFN-α, e anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a foram iodados até 10 μCi/μg com 125I usando Iodo-Beads (Pierce) de acordo com o protocolo do fabricante. Os camundongos foram injetados i.p. com 6 6 LlCi de proteínas marcadas com 125I. Em vários intervalos após a injeção de rIFN-α, IgG3-IFN-a ou antiHER2/neu-IgG3-IFN-a marcado com 125I, a radioatividade residual foi medida usando um contador de corpo inteiro de camundongo (Wm. B. Johnson e Associates).
Ataque com tumor e terapia com Ab
Camundongos C3H/HeN receberam 1.000 células tumorais 38C13/HER2 s.c. O tratamento foi aplicado por injeção i.p. 1, 3 e 5 dias ou 12, 13 e 14 dias após o ataque do tumor. Os tumores foram medidos em dias alternados, e o volume do tumor (em milímetros cúbicos) foi aproximado usando a seguinte fórmula: [comprimento (mm) x largura (mm) x largura (mm)]/2 (24). Os animais foram observados até que o comprimento do tumor s.c. alcançasse 15 mm ou até que se percebesse que qualquer camundongo estava sofrendo ou parecendo moribundo. Os animais sob essas condições foram submetidos à eutanásia humanamente de acordo com a política da instituição.
Análise Western blot e Ab
Resumidamente, células 38C13/HER2 foram tratadas com
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75/107 diferentes proteínas de fusão pelos períodos indicados, lavadas com PBS gelado e lisadas no gelo por 10 minutos em tampão de lise (Nonidet P-40 0,125%, Brij 97 0,875%, 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM de EDTA, 0,15 M de NaCl, 0,4 mM de Na3VO4, 0,4 mM de NaF, 1 mM de PMSF, 2,5 UM de leupeptina e 2,5 UM de aprotinina). Os lisados celulares foram clarificados a 10.000 x g por 10 minutos a 4°C. As amostras de proteína foram então fervidas em tampão de amostra antes da separação em géis de SDS-PAGE 8%, e transferidas em membranas microporosas de fluoreto de polivinilideno (Millipore). Após bloqueio com BSA 3% em 150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6; TBS) por 1 hora em temperatura ambiente, os blots foram sondados com os Abs primários indicados de um dia para o outro a 4°C. Os blots foram então lavados três vezes em temperatura ambiente com Tween 20 0,05% em TBS, incubados com os Abs secundários apropriados conjugados à HRP, e detectados por um sistema de detecção ECL catalisado por peroxidase (ECL; Pierce). Anti-fosfoSTAT1 policlonal de coelho foi obtido de Cell Signaling Technology. Anti-IgG de coelho policlonal conjugado à HRP de macaco foi obtido de Amersham Biosciences. Anti-GAPDH policlonal de coelho foi obtido de Abcam.
Análise estatística
Foram feitas análises estatísticas usando um teste t de Student bi-caudado para estudos in vitro e análise logrank (Mantel-Cox) para curvas de sobrevida animal.
Resultados
Produção e caracterização de anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a
A construção e a expressão de anti-HER2/neu-IgG3 com a
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76/107 região variável de C6MH3-B1 (20) foram descritas previamente (23) . A extremidade do terminal amino de IFN-α murídeo maduro foi fundida à extremidade do terminal carboxil de anti-HER2/neu-IgG3 separada por um espaçador [(Gly4)Ser]3 (ID. DE SEQ. N°: 31) (Fig. 2A). Uma proteína de fusão idêntica, IgG3-IFN-a, desprovida da especificidade para HER2/neu, foi construída por substituição da cadeia L de C6MH3-B1 pela cadeia L de 4D5 (rhuMab HER2, herceptina; Genentech). As proteínas purificadas de sobrenadantes de cultura usando proteína G foram analisadas por SDS-PAGE sob condições não redutoras e redutoras (Fig. 2B). Na ausência de agentes redutores, anti-HER2/neu-IgG3 (Fig. 2B, raia 1) migra com uma massa molecular de 170 kDa, enquanto antiHER2/neu-IgG3-IFN-a (Fig. 2B, raia 2) e IgG3-IFN-a (Fig. 2B, raia 3) possuem 210 kDa, o tamanho esperado para uma IgG3 completa com duas moléculas de IFN-a murídeo anexadas (Fig. 2A). Após tratamento com o agente redutor, as cadeias L que migram com uma massa molecular de 25 kDa são observadas para essas proteínas (Fig. 2B, raias 4-6). No entanto, o antiHER2/neu-IgG3 possui uma cadeia H com uma massa molecular de 60 kDa (Fig. 2B, raia 4), enquanto IgG3IFN-a (Fig. 2B, raia 5) e anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a (Fig. 2B, raia 6) possuem uma cadeia H com uma massa molecular de 80 kDa, como esperado. A banda menor na raia 1 (Fig. 2B) é IgG bovina, que também se ligou à coluna de proteína G; as cadeias H e L bovinas também são observada na raia 4 (Fig. 2B) e, em um grau menor, nas raias 5 e 6 (Fig. 2B). A análise FPLC mostrou que a proteína de fusão IgG3-IFN-a existia como um monômero em solução (dados não mostrados).
Ligação de Ag e atividade antiviral de anti-HER2/neuPetição 870200006199, de 13/01/2020, pág. 104/282
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IgG3-IFN-a
Tanto anti-HER2/neu-IgG3 quanto anti-HER2/neu-IgG3IFN-a se ligaram às células CT26/HER2, que expressam níveis elevados de HER2/neu humano, enquanto IgG3-IFN-a se ligou a CT26/HER2 fracamente (Fig. 2C). Muitas citocinas, incluindo IL-1, IL-2, IL-6 (25) e IFN-a (26), demonstraram interagir com heparina. Para determinar se a interação fraca entre IgG3-IFN-a e CT26/HER2 é causada pela ligação de heparina, as proteínas foram incubadas com heparina antes da adição ao CT26/HER2. A heparina inibiu a ligação de IgG3-IFN-a às células CT26/HER2, mas não inibiu a ligação de antiHER2/neu-IgG3 e anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a (Fig. 2C).
Esses resultados demonstram que anti-HER2/neu-IgG3IFN-a reteve sua habilidade para se ligar ao Ag, e IgG3IFN-a não reconhece HER2/neu. A linhagem de células de fibroblastos L-929 sensível à infecção pelo VSV foi usada para quantificar a atividade biológica IFN-a das proteínas de fusão em comparação com um padrão de IFN-a. Tanto antiHER2/neu-IgG3-IFN-a quanto IgG3-IFN-a exibiram aproximadamente 2.400 U de atividade de IFN-a/qg de atividade contra citotoxicidade induzida por VSV em células L-929, enquanto anti-HER2/neu-IgG3 não exibiu atividade antiviral (Fig. 2D).
Atividade antitumoral in vivo de proteínas de fusão
Para determinar a atividade antitumoral in vivo de anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a, camundongos singênicos foram inoculados s.c. com 1 x 103 células tumorais 38C13/HER2 e tratados nos dias 1, 3 e 5 após ataque do tumor por administração i.p. de diferentes doses de proteína (Fig. 3A-3B). Os camundongos tratados com 2,5 ug de IgG3-IFN-a
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78/107 mostraram alguma regressão do crescimento tumoral, com um (13%) de oito camundongos vivo após 50 dias (Fig. 3A) . No entanto, o direcionamento in vivo de IFN-α aos tumores usando um Ab tumor-específico aumentou dramaticamente seu efeito antitumoral. Todos os camundongos tratados com 2,5 μg (Fig. 3A) de anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a permaneceram sem tumor 50 dias após o ataque do tumor (p = 0,0048 comparado com controle de PBS), e nenhum dos camundongos tratados mostrou evidências de toxicidade. Dessa forma, o direcionamento de IFN-α à superfície da célula tumoral resultou em uma atividade antitumoral significativa, comparado com IFN-α ligado a um Ab não específico (p = 0,007). Anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a direcionado continuou a mostrar atividade antitumoral potente quando uma dose menor era usada. Sete (88%) de oito camundongos tratados com 1 μg (Fig. 3B) de anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a permaneceram sem tumor após 50 dias. Em um contraste acentuado, nessa dose menor, camundongos tratados com IgG3-IFN-a mostraram um crescimento tumoral similar aos camundongos tratados com PBS (p = 0,183), e apenas um (13%) de oito camundongos sobreviveu. Quando o tratamento era aumentado para três doses de 5 μg, tanto anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a quanto IgG3 IFN-α foram eficazes na prevenção do crescimento tumoral (dados não mostrados), refletindo, sem dúvida, o fato de que células 38C13 são sensíveis ao tratamento com IFN-a (21, 27, 28). O crescimento tumoral em camundongos tratados com 5 μg de Ab anti-HER2/neu-IgG3 foi o mesmo que com o controle de PBS, sugerindo que Ab isoladamente não possui nenhum efeito antitumoral in vivo (dados não mostrados). Esses resultados indicaram que o direcionamento de IFN-a às
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79/107 células tumorais por um Ab tumor-específico pode potencializar dramaticamente sua eficácia, o que era observado mais claramente quando eram administradas doses baixas. Significativamente, essa atividade antitumoral pode ser obtida sem nenhuma toxicidade evidente.
IFN-α fundido a um Ab resulta em aumento da atividade antitumoral, comparado com IFN-α livre.
Como descrito acima, constatamos que IFN-α fundido a um Ab não tumor-específico exibiu atividade antitumoral. Para comparar sua atividade antitumoral com aquela de rIFNα solúvel, os camundongos foram inoculados s.c. com 1 x 103 células tumorais 38C13/HER2 e tratados 1 e 3 dias após ataque do tumor por administração i.p. de 9.600 U (4 gg) de IgG3-IFN-a ou 9.600 U de rIFN-a (Fig. 4A). Todos os camundongos tratados com 9.600 U de IgG3-IFN-a mostraram crescimento tumoral retardado, e 75% dos camundongos permaneciam sem tumor 50 dias após o ataque do tumor (p = 0,027). Em contraste, os camundongos tratados com o mesmo número de unidades de rIFN-α não eram estatisticamente diferentes de controles de PBS em seu padrão de crescimento tumoral.
IFN-α possui uma meia-vida in vivo muito curta (29) . Em um estudo prévio, foi demonstrado que a fusão de Abs às citocinas aumenta sua meia-vida (6). A depuração de rIFN-a, IgG3-IFN-a, ou anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a marcado com 125I, foi examinada em camundongos C3H/HeN. Os camundongos foram injetados i.p. com 6 6 gCi de proteínas marcadas com 125I e a radioatividade residual foi medida usando um contador de corpo inteiro de camundongo. rIFN-a foi depurado rapidamente, com 50% eliminados em aproximadamente 2,5
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80/107 horas (Fig. 4B) . Em contraste, tanto anti-HER2/neu-IgG3IFN-α quanto IgG3-IFN-a exibiram meia-vida in vivo significativamente aumentada, sendo necessárias aproximadamente 8 horas para a eliminação de 50% da radioatividade injetada. Essa meia-vida aumentada pode contribuir para a eficácia antitumoral das proteínas de fusão de IFN-α. Dessa forma, a fusão de um Ab IgG3 ao IFNα pode aumentar significativamente sua atividade antitumoral in vivo. No entanto, essa atividade antitumoral pode ser aumentada ainda mais por direcionamento do IFN-α ao tumor, tornando-o eficaz em doses menores.
Anti-HER2/neu-IgG3-IFN-tt inibiu a proliferação de células tumorais in vitro
IFN-α possui várias atividades, incluindo ativação da resposta imunológica e citotoxicidade direta contra tumores. Para investigar mecanismos potenciais dos efeitos antitumorais observados usando anti-HER2/neu-IgG3-IFN-α ou ^3-^^α, os oito camundongos que permaneceram sem tumor (veja Fig. 3A) foram atacados com 1 x 103 células tumorais 38C13/HER2. Surpreendentemente, todos os camundongos pareceram camundongos não tratados e rapidamente desenvolveram tumores volumosos (dados não mostrados). Esses resultados implicam em que, sob essas condições experimentais de baixa carga tumoral, as proteínas de fusão de IFN-α não iniciavam uma resposta imunológica adaptativa protetora, mas, em vez disso, a potente atividade antitumoral das proteínas de fusão de IFN-α é mediada pelo sistema imune inato ou por um efeito citotóxico direto sobre as células tumorais.
Para determinar se as proteínas de fusão de IFN-α são
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81/107 diretamente citotóxicas para as células tumorais, as células tumorais 38C13/HER2 ou 38C13 parentais foram incubadas com diferentes proteínas por 48 horas, e a proliferação celular foi medida usando o ensaio de MTS. O tratamento com anti-HER2/neu-IgG3 não inibiu significativamente a proliferação de células tumorais 38C13/HER2 ou 38C13 parentais (Fig. 5A e 5B). Embora tanto anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a quanto IgG3-IFN-a tenham inibido a proliferação de células tumorais 38C13/HER2, antiHER2/neuIgG3-IFN-a foi mais eficaz do que IgG3-IFN-a, com valores de IP50 de 10 e 100 pM para anti-HER2/neu-IgG3-IFNα e IgG3-IFN-a, respectivamente (Fig. 5A). Em contraste, antiHER2/neu-IgG3-IFN-a e IgG3-IFN-a exibiram atividade antiproliferativa similar contra células tumorais 38C13 parentais. Esses resultados fornecem evidências de que as proteínas de fusão de IFN-α podem inibir diretamente a proliferação do linfoma de célula B 38C13, e o direcionamento do IFN-α às células tumorais potencializou esse efeito.
Apoptose induzida por anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a em células tumorais in vitro
A sinalização de IFN-α pode induzir apoptose em algumas linhagens de células tumorais. Para determinar se a apoptose contribuía para o efeito antiproliferativo que observamos, células 38C13/HER2 tratadas com diferentes proteínas foram avaliadas quanto à translocalização de fosfatidilserina do folheto interno para o externo da membrana plasmática usando o ensaio de afinidade por anexina V (30). Células mortas foram coradas por PI, que entra nas células que possuem a membrana plasmática rompida
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82/107 e se liga ao DNA. Comparado com o controle de PBS, não houve aumento no número de células mortas (anexina V/PI brilhantes, 2%) ou células apoptóticas iniciais (anexina V brilhantes, 3%) após tratamento com anti-HER2/neu-IgG3 (Fig. 5C). Em contraste, quando as células foram tratadas com IgG3-IFN-a, houve um aumento significativo no número de células mortas (21%) e células apoptóticas iniciais (6%). O tratamento com anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a resultou em um aumento adicional tanto no número de células mortas (33%) quanto no de células apoptóticas iniciais (16%). Esses resultados indicaram que IFN-a pode induzir apoptose em células tumorais 38C13/HER2, e que o direcionamento de IFNa às células tumorais pode aumentar acentuadamente esse efeito.
Além de induzir apoptose, IFN-α pode inibir diretamente a proliferação de células tumorais (31). Para determinar se tanto a inibição de proliferação quanto a apoptose ocorreriam em células tumorais tratadas, células 38C13/HER2 marcadas com CFSE foram tratadas com diferentes proteínas por 48 horas, as células vivas foram isoladas, e o nível de CFSE foi determinado por citometria de fluxo. O sinal de CFSE em células tratadas com anti-HER2/neu-IgG3 (Fig. 5D, linha fina) se sobrepõe ao de células tratadas com PBS, e foi significativamente menor do que o de células fixadas imediatamente após marcação com CFSE (Fig. 5D, linha pontilhada), indicando que anti-HER2/neu-IgG3 não inibiu a proliferação de 38C13/HER2. Em contraste, IgG3IFN-a inibiu significativamente a proliferação das células 38C13/HER2 sobreviventes (Fig. 5D, linha espessa), e o direcionamento de IFN-a às células 38C13/HER2 por anti
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HER2/neu-IgG3-IFN-a potencializou esse efeito (Fig. 5D, área preta). Esses resultados indicaram que, embora o tratamento com anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a não tenha resultado em morte celular completa por volta de 48 horas, as células sobreviventes tinham uma habilidade reduzida para proliferar.
Proteínas de fusão de IFN-α induzem ativação de STAT1 em células tumorais
Embora o engajamento do receptor de IFN-α possa iniciar a ativação de múltiplas proteínas STAT, STAT1 tem uma participação obrigatória na mediação da sinalização dependente de IFN-α (32) . Para investigar se as proteínas de fusão de IFN-α iniciam a sinalização IFN-α em 38C13/HER2 e que o direcionamento de IFN^às células tumorais aumenta seu efeito, foi examinada a fosforilação de STAT1 após tratamento. Como mostrado nas Fig. 6A-6C, tanto anti-HER2/neu-IgG3-IFN-α quanto ^Ο3-^^α iniciaram a fosforilação robusta de STAT1 em 38C13/HER2, com a fosforilação de STAT1 aumentando 8 vezes por volta de 10 minutos. No entanto, a fosforilação de STAT1 induzida por anti-HER2/neu-IgG3-IFN-α persistiu por um período de tempo mais longo e uma fosforilação de STAT1 maior foi observada em 30, 60 e 90 minutos em células tratadas com antiHER2/neu-IgG3-IFN-α. Esses resultados indicaram que as proteínas de fusão de IFN-α podem induzir a sinalização de IFN-α em células de linfoma 38C13 e o direcionamento de
IFN-α às células tumorais aumenta esse efeito.
Anti-HER2/neu-IgG3-IFN-α exibiu atividade potente contra tumores estabelecidos
Como anti-HER2/neu-IgG3-IFN-α exibiu citotoxicidade
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84/107 potente contra células tumorais 38C13/HER2, investigamos se anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a seria eficaz contra tumores de 38C13/HER2 estabelecidos. Camundongos singênicos foram inoculados s.c. com 1 x 103 células tumorais 38C13/HER2 e i.p. tratados com 5 μg (Fig. 7) das proteínas indicadas nos dias 12, 13 e 14 após ataque do tumor. O tamanho do tumor médio no dia 12 é de 100 mm3, e o tratamento com PBS ou 10 μg de anti-HER2/neu-IgG3 (dados não mostrados) não inibiu o crescimento tumoral. O tratamento com 5 μg de IgG3-IFN-a mostrou algum efeito na inibição do crescimento tumoral; no entanto, todos os camundongos desenvolveram tumores volumosos e nenhum deles sobreviveu 32 dias após o ataque do tumor. Em contraste, todos os camundongos tratados com 5 μg de antiHER2/neu-IgG3-IFN-a tiveram crescimento tumoral retardado, e três de oito camundongos tiveram regressão completa do tumor e permaneceram sem tumor 50 dias após o ataque do tumor (anti-HER2/neuIgG3-IFN-a vs PBS, p = 0,0001; anti-HER2/neu-IgG3-IFN-α vs IgG3-IFN-a, p = 0,063) . Dessa forma, tanto IgG3-IFN-a quanto anti-HER2/neuIgG3-IFN-a mostraram atividade antitumoral, mas antiHER2/neu-IgG3-IFN-a foi mais eficaz no retardo do crescimento tumoral, e a remissão completa do tumor foi observada apenas em camundongos tratados com anti-HER2/neuIgG3-IFN-a . Quando a dose do tratamento foi aumentada para 10 μg das proteínas de fusão, quase todos os camundongos tratados com anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a ou IgG3-IFN-a tiveram regressão completa do tumor e permaneceram sem tumor após 50 dias.
Os camundongos que permaneceram sem tumor após tratamento com três doses de 10 μg de proteínas de fusão
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85/107 foram re-atacados com 1 x 103 células tumorais 38C13/HER2 no dia 50. Todos os camundongos permaneceram sem tumor (dados não mostrados). Esses resultados sugerem que é iniciada uma resposta imunológica adaptativa com memória imunológica quando tumores estabelecidos maiores são tratados com IFN-α fundido a um Ab.
Discussão
Embora rIFN-α tenha demonstrado atividade contra linfoma de célula B e mieloma múltiplo, a eficácia inconsistente e a toxicidade sistêmica limitaram sua utilidade (33). O presente trabalho demonstra que a fusão de IFN-α a um Ab aumenta sua eficácia contra tumores, com um aumento adicional sendo observado quando IFN-α é direcionado às células tumorais por um Ab tumor-específico. Essa eficácia antitumoral é observada sem qualquer toxicidade aparente. Esses estudos sugerem que a fusão de IFN-α com um Ab tumor-específico pode gerar um agente biológico eficaz para o tratamento de linfoma de célula B.
Para testar a hipótese de que o direcionamento de IFNα aos locais tumorais com Ab resultaria em uma eficácia aumentada, escolhemos um linfoma de célula B murídeo bem caracterizado projetado para expressar um TAA comum, HER2/neu, ao qual há Abs disponíveis. AntiHER2/neu-IgG3IFN-α parece ser mais eficaz no tratamento do linfoma de célula B 38C13 do que as substâncias imunoterapêuticas descritas previamente, embora no presente estudo um Ag estranho introduzido por transdução gênica fosse o alvo. O tratamento com três doses de 1 μg de anti-HER2/neu-IgG3IFN-α começando 1 dia após o ataque do tumor pareceu ser tão eficaz na inibição do crescimento tumoral quanto o
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86/107 tratamento com 10 ug da proteína de fusão anti-Id IgG1-IL-2 por 5 dias começando 1 dia após o ataque do tumor (34). Além disso, anti-HER2/neuIgG3-IFN-a foi eficaz contra tumores estabelecidos (Fig. 7), enquanto anti-Id IgG1-IL-2 teve pouca atividade antitumoral quando o tratamento era iniciado 3 ou 7 dias após o ataque do tumor (34). A habilidade para a cura de tumores estabelecidos também sugere que IFN-α direcionado por Ab é um agente terapêutico mais poderoso do que GM-CSF (35), CTLA-4 (36) ou ligante CD40 (37) fundido ao Id Ag, na medida em que nenhuma dessas estratégias de vacina foi eficaz contra tumores estabelecidos. Portanto, o direcionamento de IFN-α às células tumorais poderia ser uma abordagem promissora para o tratamento de linfoma de célula B.
O direcionamento do IFN-α às células tumorais com um Ab tumor-específico aumenta a eficácia antitumoral de IFNα. Anti-HER2/neu-IgG3-IFN-a é mais eficaz na inibição da proliferação e na indução de apoptose (Fig. 5A-5D) em 38C13/HER2 do que IgG3-IFN-α, e o tratamento com 2,5 ou 1 ug de anti-HER2/neu-IgG3-IFN-α foi mais eficaz na inibição do crescimento de pequenos tumores in vivo do que as mesmas doses de IgG3-IFN^ (Fig. 3A e 3B) . Esses resultados sugerem que o Ab tumor-específico direciona IFN-α ao tumor, aumentando, dessa forma, seu índice terapêutico com toxicidade sistêmica diminuída.
Significativamente, IgG3-IFN^ exibe uma atividade antitumoral mais potente do que rIFN-α (Fig. 4A) . Embora rIFN-α seja eficaz no tratamento de diversos tumores (3840), é necessário um tratamento prolongado com doses elevadas para se observar atividade antitumoral eficaz, em
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87/107 parte por causa da meia-vida muito curta da citocina. Nesse estudo, demonstramos que a fusão de uma IgG3 Ab ao IFN-α aumentou significativamente sua meia-vida (Fig. 4B), e essa meia-vida aumentada pode contribuir para a atividade antitumoral aumentada in vivo da proteína de fusão (Fig. 4A) . Além disso, a região Fc de IgG3-IFN-a pode ajudar a direcionar IFN-α aos receptores Fc presentes em células B de linfoma e, consequentemente, aumenta a atividade antitumoral. Portanto, a fusão de IFN-α a um Ab IgG3 pode gerar várias vantagens no aumento da eficácia antitumoral de IFN-α.
Embora IFN-α possua várias atividades, incluindo a ativação da resposta imunológica, parece que a citotoxicidade direta tem um papel importante na potente atividade antitumoral de anti-HER2/neu-IgG3-IFN-α. Ambas as proteínas de fusão de IFN-α exibiram atividades apoptóticas e antiproliferativas contra 38C13/HER2, com o direcionamento ao tumor aumentando significativamente esses efeitos (Fig. 5A-5D). Embora as proteínas de fusão de IFN-α fossem muito eficazes no tratamento de tumores pequenos (Fig. 3A e 3B), nenhum dos sobreviventes desenvolveu uma resposta imunológica que protegesse contra um segundo ataque do tumor, sugerindo que a citotoxicidade direta das proteínas de fusão de IFN-α seja muito eficaz na morte das células tumorais e que a imunidade adaptativa não participava quando havia uma pequena carga tumoral. Como 38C13 é uma linhagem de linfoma de células B extremamente maligna e os camundongos injetados com apenas 200 células podem desenvolver tumores volumosos em até 20 dias (36), as proteínas de fusão de IFN-α devem ser muito eficazes na
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88/107 morte da maior parte das células tumorais inoculadas para resultar em sobreviventes de longo prazo. Foi demonstrado que vários mecanismos, incluindo infra-regulação de NF-kB (41) , indução de apoptose por ativação de caspase-3 (42) e supra-regulação de TRAIL e receptores TRAIL (43), estão envolvidos na citotoxicidade mediada por IFN-α contra células tumorais, e seria de se esperar que esses mecanismos contribuíssem para a citotoxicidade direta contra células tumorais observada com proteínas de fusão Ab-IFN-α. Consistente com esse fato, observamos ativação de STAT1 após tratamento de células tumorais com as proteínas de fusão (Fig. 6A-6C).
Embora as proteínas de fusão de IFN-α não tenham iniciado uma resposta imunológica de memória quando os camundongos foram tratados começando 1 dia após a inoculação do tumor, as proteínas de fusão de IFN-α iniciaram uma resposta imunológica que protegia contra um segundo ataque do tumor quando camundongos eram tratados começando 12 dias após a inoculação do tumor. Portanto, as proteínas de fusão de IFN-α podem ativar imunidade adaptativa protetora na presença de uma carga tumoral razoável. Como o IFN-α é capaz de ativar imunidade adaptativa por meio da estimulação da diferenciação e maturação de DC (9), é possível que os tumores estabelecidos forneçam mais TAAs para a ativação de DC na presença de IFN-α. Além disso, o Ag estranho HER2/neu humano pode contribuir para a imunidade antitumoral por aumento da imunogenicidade das células tumorais nesse modelo.
CD20, um Ag expresso por células B, é expresso na
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89/107 maioria dos linfomas de célula B (44), e anti-CD20 (rituximab, Genentech;) é uma das substâncias terapêuticas para o câncer mais bem sucedida, tendo uma eficácia tremenda contra o linfoma, com pouca toxicidade (45). Embora IgG3-IFN-α anti-HER2/neu seja muito eficaz contra 38C13/HER2, HER2/neu não é expresso normalmente em células de linfoma e, portanto, ele provavelmente possui aplicação terapêutica limitada no tratamento de linfoma, mas deve ser eficaz nos tratamentos de cânceres que expressam HER2/neu. Em contraste, espera-se que a fusão de IFN-α ao anti-CD20 gere uma proteína de fusão eficaz contra o linfoma, com atividade antitumoral ainda maior por combinação da atividade antilinfoma de anti-CD20 com a potente atividade imunoestimulante e citotóxica de IFN-α em uma proteína. Adicionalmente, IFN-α pode ainda supra-regular a expressão de CD20, como foi observado em pacientes com linfoma de célula B após tratamento com IFN-α (46). Estamos atualmente estudando os efeitos de proteínas de fusão anti-CD20-IFN-α em modelos murídeos de linfoma de célula B.
Em resumo, construímos e caracterizamos uma nova proteína de fusão na qual IFN-α foi ligado a um anticorpo que reconhece um TAA. Nossos resultados indicam que a fusão de IFN-α a um anticorpo tumor-específico pode aumentar dramaticamente a eficácia de IFN-α, com a atividade antitumoral observada sem qualquer toxicidade aparente. Significativamente, a proteína de fusão Ab-IFN-α foi eficaz contra tumores estabelecidos. Portanto, IFN (por exemplo, IFN-α) fundido a um anticorpo tumor-específico se mostra promissor para o tratamento de linfoma de célula B.
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97/107
Exemplo 2
Proteínas de fusão anti-CD20-IFNa
Introdução
Nossos estudos iniciais indicaram que uma proteína de fusão com anti-HER2/neu unida ao IFN-α seria uma substância terapêutica eficaz para o tratamento de linfomas que expressam HER2/neu. Tentamos estender esses estudos para mostrar que a fusão de IFN-α com anti-CD20 seria uma substância terapêutica eficaz para o tratamento de linfomas que expressam CD20. CD20 está presente praticamente em todos os linfomas. No entanto, deve-se observar que HER2/neu é expresso em muitos cânceres e seria de se esperar que a proteína de fusão anti-HER2/neu seria eficaz no tratamento desses cânceres. Na proteína de fusão antiCD20, esperaríamos que IFN-α na proteína de fusão teria tanto um efeito citotóxico direto contra as células tumorais quanto ajudaria a despertar uma resposta imunológica antitumoral.
Produção de anticorpos recombinantes específicos para CD20.
As regiões variáveis para anti-CD20 (Rituximab) foram amplificadas e clonadas em vetores de expressão para a produção de anticorpos quiméricos com cadeias leves kappa e cadeias pesadas gama 3 humanas. A proteína foi produzida e sua habilidade para reconhecer CD20 examinada usando citometria de fluxo e a linhagem de células B humanas de Daudi. Como mostrado na Figura 8, a proteína recombinante se liga tão bem quanto Rituximab à IgG1 recombinante.
Produção de proteínas de fusão de anticorpo com interferon humano unido aos anticorpos específicos para CD20.
a. Design da proteína de fusão
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Em nossa tentativa inicial de fazer uma proteína de fusão, unimos IFN-α ao terminal carbóxi do gene de IgG3 humana usando um espaçador flexível de glicina-serina que consiste em (Gly4Ser)3 (ID. DE SEQ. N°: 31) . A cadeia pesada é mostrada em forma de diagrama na Figura 9.
Após verificar que o vetor da proteína de fusão tinha a sequência de nucleotídeos correta, ele foi transfectado com a cadeia leve quimérica de anti-CD20 em células NSO. Os transfectantes foram avaliados por ELISA quanto à produção de IgG. O clone que gera o maior sinal foi expandido e, após subclonagem, foi desenvolvido em garrafas giratórias. Os sobrenadantes foram então passados através de colunas de Sefarose de proteína A, e as proteínas ligadas eluídas e analisadas por SDS-PAGE tanto não reduzidas quanto após redução (veja Figura 10) . Embora a proteína isolada fosse montada em moléculas de H2L2, a maior parte da proteína isolada era menor do que o esperado. Após redução, a maior parte das cadeias pesadas era menor do que o esperado, e corriam na mesma posição que uma cadeia pesada gama-3 desprovida de uma proteína de fusão. Parecia que o interferon estava sendo removido da proteína de fusão por proteólise. A análise Western blot usando anti-Fc e antiinterferon confirmou que ambas as bandas superiores eram cadeias pesadas, mas apenas a maior continha interferon.
Espaçadores flexíveis podem ser um alvo da clivagem proteolítica. Portanto, encurtamos o espaçador para apenas uma cópia de Gly4Ser (ID. DE SEQ. N°: 32). Esses vetores e vetores com o espaçador estendido foram transfectados transitoriamente juntamente com a cadeia leve apropriada em células HEK293T. As células foram marcadas de forma
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99/107 radioativa por crescimento em 35S-metionina, as imunoglobulinas foram precipitadas com proteína A e analisadas por SDS-PAGE (Figura 11). Enquanto a clivagem de proteínas de fusão com espaçadores estendidos é facilmente aparente, a clivagem não ocorre quando o espaçador consiste em apenas um Gly4Ser (ID. DE SEQ. N°: 32) . Portanto, o espaçador usado para produzir a proteína de fusão é importante e pode influenciar sua estabilidade.
b. Reconhecimento de CD20 pelas proteínas de fusão
Para determinar se a proteína de fusão reconhece CD20, a linhagem de células de Daudi humanas que expressam CD20 foi incubada com Rituxan, anti-DNS/IgG3-hu-IFN-a ou antiCD20/IgG3-hu-IFN-a. A anti-CD20/IgG3-hu-IFN-a se ligou melhor do que Rituxan (Figura 12). A fusão anti-DNS/IgG3hu-IFN-α também mostrou alguma ligação, embora menos do que a proteína CD20-específica. Formulamos a hipótese de que a ligação da anti-DNS/IgG3-hu-IFN-α e a ligação aumentada de anti-CD20/IgG3-hu-IFN-a comparada com Rituxan ocorrem porque a porção hu-IFN-α se liga aos receptores de IFN expressos nas células de Daudi.
O laboratório Timmerman produziu um transfectante do linfoma murídeo 38C13 que expressa CD20 humano. Tanto Rituxan quanto anti-CD20/IgG3-muIFN-a se ligaram ao transfectante. Anti-DNS/IgG3-muIFN-a não exibiu qualquer ligação (Figura 13).
c. Atividade antiviral das proteínas de fusão
Para avaliar a atividade antiviral das proteínas de fusão hu-IFN-α, células HeLa foram semeadas a 2 x 105 células/ml e tratadas com diluições seriais de duas vezes de proteína de fusão ou Roferon (interferon 2a humano
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100/107 recombinante) por 24 horas. As células foram então infectadas com VSV (vírus da estomatite vesicular) em uma concentração de 4.000 PFU/100 μl. Após 72 horas, as células foram coradas com violeta cristal 0,1%. A proteção contra infecção viral foi determinada por quantificação das células que sobrevivem à infecção por coloração com violeta cristal 0,1% e por determinação da quantidade de corante em cada poço usando um densitômetro de spot por contagem do número de placas. Em ambos os ensaios, a proteína de fusão tinha atividade de IFN-α significativa, mas tinha atividade cerca de 100 vezes reduzida em comparação com Roferon.
Inibição do crescimento e morte de células de linfoma de Daudi com as proteínas de fusão.
Foram usados dois métodos para avaliar a inibição do crescimento/morte de células de linfoma que expressam CD20 pelas proteínas de fusão. Deve-se observar que, para esses experimentos, foi usada uma linhagem de células humanas, de Daudi, que expressam CD20 naturalmente. Na primeira abordagem, as células de Daudi foram incubadas com várias concentrações de IFN-α, anticorpo ou proteína de fusão por 72 horas, e a inibição do crescimento foi avaliada usando o ensaio de proliferação celular CellTiter 96 Aqueous (Figura 14) . Embora mostrando menos atividade de IFN-α no ensaio antiviral, anti-CD20/IgG3-hu-IFN-a e Roferon mostraram uma habilidade similar para inibir o crescimento de linfoma, sugerindo que o direcionamento do IFN-α aumenta seu efeito citotóxico. Anti-CD20/IgG3 + Roferon não mostraram atividade aumentada comparado com Roferon isoladamente. Anti-DNS/IgG3-hIFN-α, Rituxan e anti-CD20/IgG3 mostraram somente alguma inibição do crescimento na maior
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101/107 concentração usada. Deve-se observar que a proteína de fusão foi mais ativa do que Rituxan na prevenção do crescimento celular nesse ensaio.
Em uma segunda abordagem, as células de Daudi foram incubadas com várias concentrações de IFN-α, anticorpo ou proteína de fusão por 72 horas, e depois coradas com Anexina V e iodeto de propídio (PI), analisadas por citometria de fluxo. Na Figura 15 são mostrados os resultados obtidos quando 10 pM das várias proteínas foram usados. As células nas fases iniciais de apoptose são Anexina V+PI-; células nas fases apoptóticas tardias e mortas são Anexina V+PI+.
Esses experimentos demonstram várias coisas. Rituxan e anti-CD20/IgG3 induzem pouca ou nenhuma apoptose, até mesmo nas maiores concentrações testadas. Como seria esperado, IFN-α murídeo é menos eficaz contra a linhagem de células humanas do que o IFN-α humano recombinante (Roferon), e anti-DNS/IgG3-mIFNa, que não seria direcionada às células tumorais, é aproximadamente tão eficaz quanto IFN-α murídeo recombinante. No entanto, o direcionamento do IFN-α murídeo às células tumorais usando anti-CD20/IgG3-mIFNα resulta na indução eficaz da morte celular. Anti-CD20/IgG3-hIFNα é mais eficaz do que anti-DNS/IgG3-hIFNα, o que demonstra novamente a contribuição do direcionamento celular para a morte celular. Nesse ensaio in vitro, Roferon e antiCD20/IgG3-hIFNα exibiram atividade similar, causando morte celular em concentrações de apenas 1 pM (dados não mostrados). No entanto, deve-se ressaltar que, in vivo, CD20/IgG3-hIFNα irá se direcionar e se acumular no local do tumor, enquanto Roferon exibirá sua atividade por todo o
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102/107 corpo.
Inibição do crescimento e morte de células de linfoma 38C13-CD20 com as proteínas de fusão
Como mencionado brevemente acima, o laboratório do Dr.
John Timmerman desenvolveu um linfoma murídeo, 38C13-CD20, que expressa CD20 humano e se desenvolverá em camundongos C3H/HeJ singênicos. A disponibilidade dessa linhagem celular torna possível examinar a eficácia in vivo de nossas proteínas de fusão. Células 38C13-CD20 foram incubadas por 48 horas com vários anticorpos e proteínas de fusão. A morte e a apoptose foram então determinadas por coloração das células com Anexina V e PI, e examinando-as com o uso de citometria de fluxo. Quando as proteínas eram usadas em uma concentração de 100 pM (dados não mostrados), tanto mIFNa recombinante quanto anti-CD20-IgG3-mIFN-a foram muito eficazes para causar apoptose, com anti-CD20IgG3-mIFN-a um pouco mais eficaz do que mIFN-a recombinante. Alguma apoptose foi induzida por tratamento das células 38C13-CD20 com anti-DNS-IgG3-mIFN-a ou Rituxan. O tratamento com anti-CD20/IgG3 nessa concentração não teve nenhum efeito sobre a viabilidade celular. Quando a concentração do tratamento foi reduzida para 10 pM (Fig. 16), mIFN-α recombinante e anti-CD20/IgG3-mIFN-a continuaram a ser eficaz para causar apoptose, com antiCD20/IgG3-mIFN-a mais eficaz do que mIFN-α recombinante. Apenas uma pequena quantidade de apoptose foi observada após tratamento com anti-DNS-IgG3-mIFN-a, indicando que o direcionamento de IFN-α usando anti-CD20-IgG3-mIFN-a resultou em um agente terapêutico mais eficaz. Nessa concentração, Rituxan causou pouca apoptose, indicando a
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103/107 superioridade da proteína de fusão anti-CD20-IgG3/mIFN-a em relação ao anticorpo anti-CD20 não fundido. Novamente, o tratamento com anti-CD20/IgG3 não teve nenhum efeito sobre a viabilidade celular. Em uma dose de tratamento de 1 pM, somente anti-CD20-IgG3-mIFN-a induziu apoptose em células 38C13-CD20 (dados não mostrados) . Em uma dose de 0,1 pM, nenhum dos tratamentos induziu apoptose (dados não mostrados).
Como uma abordagem alternativa, células 38C13-CD20 foram tratadas com as várias proteínas em diferentes concentrações, e a inibição de crescimento foi monitorada usando o ensaio de MTS (Figura 17) . Anti-CD20/IgG3-mIFN-a foi o mais eficaz na inibição do crescimento celular, seguido por mIFN-α recombinante. Foi observada alguma inibição do crescimento com anti-DNS/IgG3-mIFN-a. AntiCD20/IgG3 e Rituxan tiveram pouco efeito sobre o crescimento celular. Dessa forma, os resultados obtidos nesse ensaio espelharam o que foi observado quando a apoptose era monitorada.
Produção e caracterização de proteínas de fusão IgG-IFN-a adicionais
a. Anti-CD20-IgG1-mIFNa e anti-CD20-IgG1-hIFNa
As proteínas iniciais foram feitas com IFN-α fundido a um arcabouço de IgG3 humana. Rituxan é uma IgG1. Para determinar se o arcabouço de imunoglobulina influenciava as propriedades das proteínas de fusão, foram agora produzidas proteínas de fusão com mIFN-α e hu-IFN-α fundidos à IgG1. Elas tiveram o peso molecular esperado.
Anti-CD20/IgG1-mIFNa foi avaliada quanto à sua habilidade para induzir apoptose de 38C13-CD20 (Figura 18).
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Os estudos mostraram que ela é eficaz, possivelmente ainda mais eficaz do que a proteína de fusão de IgG3.
Anti-CD20/IgG1-hIFNa foi avaliada quanto à sua habilidade para induzir apoptose de células de Daudi. Os estudos mostraram que ela exibe atividade similar à antiCD20/IgG3-hIFNa (Fig. 19).
As proteínas de fusão foram avaliadas quanto à sua habilidade para inibir o crescimento de células de Daudi, como mostrado na Figura 20. Fusões de IgG1 com IFNa tanto murídeo quanto e humano eram semelhantes às fusões de IgG3 em sua habilidade para inibir o crescimento de células de Daudi.
b. Proteínas de fusão com IFN-α unido ao arcabouço de IgG com um espaçador alfa helicoidal.
Foram produzidas proteínas de fusão nas quais o espaçador GlySer foi substituído pelo espaçador com a sequência A(EAAAK)2A (ID. DE SEQ. N°: 33). Propõe-se que essa sequência se enovele como uma hélice alfa.
A proteína foi produzida por expressão transitória em células 293T e avaliada por SDS-PAGE. A proteína foi montada e era do peso molecular esperado. Não foi observada clivagem do espaçador.
Verificou-se que a proteína de fusão, anti-CD20-IgG3hIFNa (espaçador α-helicoidal), quando usada na mesma concentração que a proteína de fusão com o espaçador Gly4Ser (ID. DE SEQ. N°: 32), induzia eficazmente a apoptose de células de Daudi (Fig. 21).
Tratamento in vivo de tumores
O linfoma 38C13, que havia sido transduzido pelo laboratório de Timmerman para expressar CD20 humano, foi
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105/107 usado para esses estudos. 38C13 é um linfoma agressivo que cresce em camundongos C3H/HeJ singênicos. O 38C13-CD20, transduzido, exibe as mesmas características de crescimento. Dessa forma, é possível investigar a proteção mediada pela proteína de fusão em animais imunocompetentes.
a. Tratamento de tumores iniciais
Camundongos (grupos de 4) foram injetados por via subcutânea com 5.000 células 38C13-CD20 no dia zero. Nos dias 1, 2 e 3, eles foram tratados por via intravenosa com solução salina tamponada com Hepes (HBSS) ou 0,4 μg, 2 μ g ou 10 μg de anti-CD20-mIFN-a, e o crescimento tumoral foi monitorado. Por volta do dia 20, todos os animais tratados com HBSS tinham tumores grandes, e tiveram que ser sacrificados. Em contraste, nenhum crescimento tumoral foi observado em animais tratados com 10 μg da proteína de fusão; após o dia 20, os tumores começaram a crescer em 3 dos quatro animais tratados com 0,4 μg da proteína de fusão, e em 1 dos camundongos tratados com 2 μg. Os resultados mostraram que as proteínas de fusão antiCD20/IFN-a são muito eficazes na inibição do crescimento tumoral in vivo e no aumento da sobrevida (veja, por exemplo, Figura 22).
b. A proteína de fusão anti-CD20-mIFNa é mais eficaz do que Rituximab ou anti-CD20/IgG3 no tratamento de tumores com tamanho moderado
Camundongos C3H/HeJ foram inoculados com 5.000 células 38C13-CD20 no dia 0. Nos dias 5, 6 e 7, eles foram tratados com HBSS ou 10 μg de anti-CD20-IgG1 (produzida em células 293T), anti-CD20-IgG3, Rituximab ou anti-CD20-IgG3-mIFNa. Eles foram monitorados quanto ao crescimento tumoral e
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106/107 sobrevida (veja, por exemplo, Figura 23) . Anti-CD20/IgG3mIFNa foi bem mais eficaz do que Rituximab, anti-CD20/IgG3 ou anti-CD20/IgG1 na prevenção do crescimento de tumores com tamanho moderado.
A habilidade de direcionamento ao tumor da proteína de fusão aumenta significativamente sua eficácia in vivo.
Camundongos C3H/H3J foram inoculados com 5.000 células 38C13-CD20 no dia 0 e tratados nos dias 5, 6 e 7 com 10 μg de anti-CD20-IgG3, 10 μg de anti-CD20-IgG3 + mIFN-α (dose escolhida para ter os mesmos moles que na proteína de fusão), anti-DNS-IgG3-IFNa, ou anti-CD20-IgG3-mIFNa, e acompanhados quanto ao crescimento tumoral e sobrevida (veja, por exemplo, Figura 24) . Anti-CD20-IgG3-IFNa retardou significativamente o crescimento tumoral e promoveu a sobrevida, indicando que o direcionamento do IFNa ao tumor usando o sítio de combinação do anticorpo o torna uma substância terapêutica mais eficaz do que uma proteína de fusão que não direciona o IFNa fundido (antiDNS-IgG3-IFNa) ou a injeção de anti-CD20 juntamente com IFNa não associado covalentemente (anti-CD20-IgG3 + mIFNα) .
O tratamento com proteína de fusão é eficaz contra tumores estabelecidos
Grupos de oito camundongos C3H/HeJ foram inoculados com 5.000 células 38C13-CD20 e tratados nos dias 8, 9 e 10 com 100 μg de anti-CD20-mIFNa ou HBSS. Os camundongos foram monitorados quanto ao crescimento tumoral (veja a Figura
25) e sobrevida (veja Figura 26). Os camundongos inoculados com anti-CD20-mIFNa mostraram sobrevida aumentada (Figura
26) .
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Deve-se entender que os exemplos e as modalidades aqui descritas têm finalidade apenas ilustrativa, e que várias modificações ou alterações à luz desta especificação serão sugeridas por aqueles habilitados na técnica e devem ser 5 incluídas dentro do espírito e da abrangência deste pedido e do escopo das reivindicações em anexo. Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes aqui citados são aqui incorporados por referência em sua totalidade para todas as finalidades.
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Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composição caracterizada por conter uma proteína de fusão que compreende:
    um anticorpo ligado a um interferon, em que o referido anticorpo é uma imunoglobulina intacta que se liga a CD20 ou a HER2/neu; e o referido interferon é um interferon alfa (ID. DE SEQ. N°: 60); e a cadeia pesada do referido anticorpo está ligada ao referido interferon alfa por um espaçador resistente à proteólise, onde a sequência de aminoácidos do referido espaçador consiste na sequência SGGGGS (ID. DE SEQ. N°: 58) ou AEAAAKEAAAKAGS (ID. DE SEQ. N°:59).
  2. 2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido espaçador consiste ou é a sequência de aminoácidos SGGGGS (ID. DE SEQ. N°:58).
  3. 3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido espaçador consiste ou é a sequência de aminoácidos AEAAAKEAAAKAGS (ID. DE SEQ. N°:59).
  4. 4. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-CD20.
  5. 5. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-CD20.
  6. 6. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma cadeia pesada de IgG compreendendo os
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    2/3 resíduos 1-579 da ID. DE SEQ. N°: 6 e uma cadeia leve de
    IgG compreendendo a sequência de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°: 4.
  7. 7. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma cadeia pesada de IgG compreendendo os resíduos 1-579 da ID. DE SEQ. N°: 6 e uma cadeia leve de
    IgG compreendendo a sequência de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°: 4.
  8. 8. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-HER2/neu.
  9. 9. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-HER2/neu.
  10. 10. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma cadeia pesada de IgG compreendendo os resíduos 1-525 da ID. DE SEQ. N°: 1 e uma cadeia leve de
    IgG compreendendo a sequência de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°: 2.
  11. 11. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma cadeia pesada de IgG compreendendo os resíduos 1-525 da ID. DE SEQ. N°: 1 e uma cadeia leve de
    IgG compreendendo a sequência de aminoácidos da ID. DE SEQ. N°: 2.
  12. 12. Kit caracterizado por compreender a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
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    3/3
  13. 13. uma das preparo
    Uso da composição, conforme definida reivindicações 1 a 11, caracterizado de um medicamento para tratar câncer.
    em qualquer por ser no
    Petição 870200006199, de 13/01/2020, pág. 138/282
    1/41
    Cadeia pesada de IgG3 anti-HER2/neu-IFN-alfa
    MGWSWVMHLSPVSNCGVHSQVQLVQSGAEVKKPGE S L K I S C K G 5 G Y S F T S Y W I A W V R Q Μ P G K GL Ε Y M G L I Y PG D S D T K Y SPS F Q G Q V TIS V D K S V S T A Y L Q W S S L K P S O S A V Y F C A R H D V G Y C T D R T C A K W P Ε Y F Q H W G Q G T L V T V S SA S T K G P S V F P L A P C S R S T S G G T A A L G C L V K DYFPEPVTVSWN S G ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS S V V T V P $ $ S t GTOTYTOHVNH K PSNTK V 0 K RV E LK T PLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRC PE P K S C D T P PPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVOVSHEDPEVQFKWYVD GVEVHNAKTKLREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP P S R E EM T K N Q V S L T C 1 V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E NNYNTTPPMLDSDOSFFLYSKLTVDKSRWQOGNIFS C S V Μ H EA LH NHYTÔKSl SL SPGK SOGG OSGO G G SO G G OS C D L P Q T Η H L R N K R A L TL L V Q M R R L S Pl S C L K D R K 0 F G F P Q B K V D A Ο Ο I K K À O A IR VlS £ LT Q Ο I L N I P T SK&SSAAWNATLLGSFCNDLHQQLHOLaGCLMGQV G V G E F P L T G E 0 A t L A ¥ R K Y F H R 1 T V ¥ L R Ε K K H S P C A W E ¥ V R A £ V W R A L $ S S A N ¥ L G R L R E Ê~K~
    Sequência da cadeia leve de anti-HER2/neu IgG3-IFN~alfa
    Μ E W S C V M L F L L S V T A G V H S D I Q Μ T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D V N T A V A W Y Q Q K P G K A P K L LJ Y S A S F L Y S G V P S R F S G S R S G T 0 F T Ε T I S S L Q P E D F A T Y Y C G QHYTTPPTFGGGTKVEiKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCtLNNFYPREAKVaWKVüNALQSGNSQE SVTEGPSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT H G G L S S P V T K S F N R G E C
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