BRPI0809696A2 - Catalisador de base biológica para retardar processos de desenvolvimento de plantas - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CATALISADOR DE BASE BIOLÓGICA PARA RETARDAR PROCESSOS DE DESENVOLVIMENTO DE PLANTAS".

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos para retardar o desen

volvimento de plantas que compreendem a exposição de uma planta ou parte dela a uma ou mais bactérias ou enzimas. Aparelhos para retardar o processo de desenvolvimento de uma planta são também proporcionados. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A produção do etileno em plantas e em partes de plantas é indu

zida por vários fatores e fatores externos de estresse, incluindo o Iesionamento, a aplicação de hormônios (por exemplo, o hormônio auxina), condições anaeróbicas, resfriamento, calor, aridez e infecção por agente patogênico. O aumento na produção de etileno é também observado durante os 15 vários processos de desenvolvimento de plantas, inclusive no amadurecimento de frutas ou verduras, na germinação de sementes, na perda das folhas e na senescência das flores.

A biossíntese do etileno nas plantas é tipicamente representada como um esquema enzimático envolvendo três enzimas, tradicionalmente 20 referido como o "Ciclo de Yang", no qual a S-adenosil-L-metionina (SAM) sintase catalisa a conversão da metionina em S-adenosil-L-metionina (AdoMet); a ACC (ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico) sintase catalisa a conversão de AdoMet em ACC; e a ACC oxidase catalisa a conversão de ACC em etileno e os subprodutos dióxido de carbono e cianeto de hidrogê25 nio. Vide, por exemplo, Srivastava (2001) Plant Growth and Development: Hormones and Environment (Academic Press, New York) para uma descrição geral da biossíntese do etileno nas plantas e dos processos de desenvolvimento de plantas regulados pelo etileno.

A pesquisa anterior estabeleceu que nas frutas climatéricas, o amadurecimento é provocado, pelo menos em parte, por um aumento súbito e significativo na biossíntese do etileno. Embora um súbito aumento da produção do etileno suponha o processo de amadurecimento de frutas em frutas climatéricas, o mecanismo exato, particularmente em frutas não-climatéricas, não é completamente entendido. Enquanto não há nenhum súbito aumento da produção do etileno nas frutas não-climatéricas, as frutas nãoclimatéricas responderão ao etileno. Além disso, as frutas, verduras e outros 5 produtos vegetais variam na quantidade do etileno sintetizado e, também, na sensibilidade do determinado produto ao etileno. Por exemplo, as maçãs exibem um alto nível de produção e sensibilidade em relação ao etileno, ao passo que as alcachofras exibem um baixo nível de biossíntese do etileno e sensibilidade ao etileno. Vide, por exemplo, Cantwell (2001) "Properties and 10 Recommended Conditions for Storage of Fresh Fruits and Vegetables" em postharvest. ucdavis.edu/Produce/Storaqe/index.shtml (último acesso em 06 de março de 2007), o qual está aqui incluído como referência em sua totalidade. O amadurecimento das frutas resulta normalmente em mudança de cor, amolecimento do pericarpo e mudanças no teor de açúcar e sabor da 15 fruta. Enquanto o amadurecimento inicialmente torna a fruta mais comestível e atraente para o consumo, este leva à degradação e deterioração da qualidade da fruta ao final do processo, tornando-a inapta para o consumo, gerando perdas monetárias comerciais significativas. O controle do processo de amadurecimento é recomendável para aumentar o prazo da validade e 20 estender o tempo disponível para o transporte, armazenamento e venda das frutas e de outros produtos agrícolas sujeitos ao amadurecimento.

Além de um aumento súbito na biossíntese do etileno em frutas climatéricas, as modificações relacionadas com o amadurecimento são também associadas a um aumento na taxa de respiração. O calor é produzido 25 como uma conseqüência da respiração nas frutas, verduras e em outros produtos vegetais e, consequentemente, afeta o prazo da validade e as condições de armazenamento necessárias (por exemplo, refrigeração) para estas mercadorias. Os produtos vegetais com taxas mais altas de respiração (por exemplo, alcachofras, flores de corte, aspargo, brócolis, espinafre, etc.) 30 exibem prazos de validade mais curtos do que aquelas com taxas de respiração mais baixas (por exemplo, nozes, tâmaras, maçãs, frutas cítricas, uvas, etc.). A respiração é afetada por numerosos fatores ambientais tais como temperatura, composição atmosférica, estresse físico, luz, estresse químico, radiação, estresse hídrico, reguladores de crescimento e ataque de agentes patogênicos. Especialmente, a temperatura desempenha um papel significativo na taxa de respiração. Para uma descrição geral do metabolis5 mo respiratório e das condições atmosféricas controladas recomendadas para frutas, verduras e outros produtos vegetais, vide, por exemplo, Postharvest Horticulture Series No. 22A:29-70 (University of Califórnia - Davis); Saltveit (University of Califórnia - Davis) "Respiratory Metabolism" em usna.usda.gov/hb66/019respiration.pdf (último acesso em 06 de março de 10 2007); e Cantwell (2001) "Properties and Recommended Conditions for Storage of Fresh Fruits and Vegetables" em postharvest.ucdavis.edu/Produce/ Storage/index.shtml (último acesso em 06 de março de 2007), todos aqui incorporados como referência em sua totalidade.

Métodos e composições para retardar o processo de amadurecimento de frutas incluem, por exemplo, a aplicação de sais de prata (por exemplo, tiossulfato de prata), 2,5-norbornadieno, permanganato de potássio, 1-metilciclopropeno (1-MCP), ciclopropeno (CP) e derivados destes. Estes compostos possuem desvantagens significativas, tais como a presença de metais pesados, odor desagradável e propriedades explosivas quando comprimidos, que os tornam inaceitáveis ou de aplicabilidade limitada para uso na indústria alimentícia. Abordagens transgênicas para controle da produção do etileno para retardar os processos de desenvolvimento das plantas (por exemplo, o amadurecimento das frutas) pela introdução de seqüências de ácido nucleico que limitam a produção de etileno, em particular pela redução da expressão das enzimas ACC sintase ou ACC oxidase, estão também sob investigação. A resposta do público a produtos agrícolas geneticamente modificados, contudo, não tem sido inteiramente favorável.

Consequentemente,permanece uma necessidade significativa na técnica de métodos e aparelhos seguros para retardar os processos de desenvolvimento das plantas. Tais métodos e aparelhos poderiam propiciar melhor controle do amadurecimento das frutas, do amadurecimento das verduras, da senescência das flores, da perda das folhas e da germinação das sementes e aumentar o prazo de validade de vários produtos agrícolas (por exemplo, frutas, verduras e flores de corte), deste modo permitindo o transporte destes produtos em distâncias mais longas, sem a necessidade de refrigeração, aumentando a adequação do produto para os consumidores e 5 reduzindo os custos financeiros associados à perda do produto devido ao amadurecimento e senescência prematuros.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

São proporcionados métodos para retardar o processo de desenvolvimento das plantas, incluindo, sem limitação, o amadurecimento das frutas, o amadurecimento das verduras, a senescência das flores e a perda das folhas. Os métodos da presente invenção geralmente compreendem a exposição de uma planta ou de parte dela a uma ou mais bactérias em quantidade suficiente para retardar o referido processo de desenvolvimento da planta. Em certos aspectos da invenção, as bactérias são selecionadas do grupo composto de Rhodococcus spp., Pseudomonas chloroaphis, Brevibacterium ketoglutamicum e misturas destas. As bactérias usadas na prática dos presentes métodos podem ser ainda tratadas com um agente de indução, incluindo, por exemplo, asparagina, glutamina, cobalto, ureia e misturas dos mesmos, para induzir a capacidade das bactérias de retardar o referido processo de desenvolvimento da planta.

A presente invenção, ainda, propicia aparelhos para retardar o processo de desenvolvimento da planta, compreendendo um catalisador que consiste em uma ou mais bactérias, particularmente Rhodococcus spp., Pseudomonas chloroaphis, Brevibaeterium ketoglutamicum ou a mistura 25 destas. Qualquer aparelho que permita a exposição de uma planta ou de parte dela ao catalisador e retarde o referido processo de desenvolvimento da planta é contemplado pela presente invenção. Aparelhos exemplares incluem aqueles nos quais o catalisador é imobilizado em uma matriz e colocado em seu interior, sobre a mesma ou de outro modo afixado a qualquer 30 estrutura física. Várias configurações dos aparelhos divulgados são visualizadas e descritas em mais detalhe abaixo. Os métodos e os aparelhos da invenção para retardar o processo de desenvolvimento de uma planta são particularmente úteis no aumento do prazo de validade e na facilitação do transporte por distâncias mais longas dos produtos vegetais tais como frutas, verduras e flores, aumentando a satisfação do consumidor do produto e reduzindo a perda do produto resultante do amadurecimento ou senescência prematuros.

BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS

Após a descrição da invenção em termos gerais, é feita, então, referência aos desenhos acompanhantes, que não são necessariamente desenhados conforme a escala, e nos quais:

A figura 1 mostra uma descrição não-limitadora de um aparelho

de três camadas para retardar o amadurecimento de frutas. As camadas externas (denominadas AeB) propiciam a integridade estrutural ao aparelho. A camada de catalisador, como definida abaixo, compreende uma ou mais enzimas da invenção e está localizada entre as camadas externas.

A figura 2A-C fornece descrições não-limitadoras de vários apa

relhos para retardar o amadurecimento de frutas. Estes aparelhos compreendem uma camada de catalisador, uma ou mais camadas destinadas a propiciar a integridade estrutural e uma ou mais camadas destinadas a serem removidas antes do uso do aparelho. A remoção de uma ou mais destas 20 camadas, poderá, por exemplo, exibir um adesivo para fixação do aparelho à outra estrutura física.

As figuras 3A-3B mostram uma descrição não-limitadora de um aparelho para retardar o amadurecimento de frutas. O aparelho compreende um catalisador imobilizado em uma camada de película e afixado a uma estrutura física (por exemplo, uma caixa adequada para o armazenamento/transporte de frutas).

A figura 4 fornece uma descrição não-limitadora de um aparelho para retardar o amadurecimento de frutas. O aparelho compreende uma estrutura de câmara com fendas que permite a inserção e a substituição de um 30 ou mais elementos do módulo do catalisador, conforme definido abaixo. As camadas externas da estrutura física podem ser compostas de um material que permite que o ar flua para dentro do catalisador. DESCRIÇÃO DETALHADA PA INVENÇÃO

A presente invenção será doravante descrita mais completamente com referência às modalidades específicas da invenção e, em particular, aos vários desenhos aqui proporcionados. De fato, a invenção pode ser in5 corporada em muitas formas diferentes e não deve ser interpretada como limitada às modalidades apresentadas aqui; preferivelmente, estas modalidades são proporcionadas de modo que esta divulgação atenda às exigências legais aplicáveis. Conforme usado na especificação e nas reivindicações apensas, as formas singulares "um", "uma", "o", "a", incluem referên10 cias no plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma.

Em toda a especificação, o termo "compreendendo", ou suas variações gramaticais, será entendido como supondo a inclusão de um elemento, um número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas declarados, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.

A presente invenção fornece métodos para retardar o referido processo de desenvolvimento da planta compreendendo a exposição de uma planta ou parte da planta a uma ou mais bactérias. Em determinadas modalidades, os métodos são concebidos para retardar o processo de de20 senvolvimento de uma planta, compreendendo a exposição de uma planta ou parte da planta a uma ou mais bactérias selecionadas do grupo consistindo em Rhodococcus spp., Pseudomonas ehloroaphis, Brevibaeterium ketoglutamicum e misturas das mesmas, em que uma ou mais bactérias são expostas à planta ou parte dela em uma quantidade suficiente para retardar 25 o processo de desenvolvimento da planta. Aparelhos para retardar o referido processo de desenvolvimento da planta e para a prática dos métodos descritos aqui são também proporcionados. Os métodos e aparelhos criativos da invenção podem ser usados, por exemplo, para retardar o amadurecimento de frutas/verduras ou a senescência das flores e aumentar o prazo da vali30 dade das frutas, verduras ou flores, deste modo facilitando o transporte, a distribuição e a comercialização de tais produtos vegetais.

Conforme usados aqui, os termos "planta" e "parte da planta" são definidos de forma ampla de modo a incluir plantas intactas ou qualquer parte de uma planta, incluindo, sem limitação, frutas, verduras, flores, sementes, folhas, nozes, embriões, pólen, óvulos, ramos, grãos, orelhas, espigas de milho, cascas, talos, raízes, lascas de raízes, anteras e similares. Em 5 determinadas modalidades, a parte da planta é um fruto, verdura ou flor. Em certos aspectos da invenção, a parte da planta é uma fruta, mais particularmente uma fruta climatérica, conforme descrito mais detalhadamente abaixo.

Os métodos e aparelhos da invenção são dirigidos ao retardamento do processo de desenvolvimento de uma planta, tal como o processo de desenvolvimento de uma planta geralmente associado ao aumento da biossíntese do etileno. O "processo de desenvolvimento de uma planta" deverá significar qualquer processo de crescimento ou de desenvolvimento de uma planta ou parte da planta, incluindo, sem limitação, o amadurecimento da fruta, o amadurecimento das verduras, a senescência das flores, a queda das folhas, a germinação das sementes e similares. Em determinadas modalidades, o referido processo de desenvolvimento da planta é o amadurecimento de frutas ou verduras, a senescência das flores ou a queda das folhas, mais particularmente, o amadurecimento das frutas ou verduras. Conforme definido aqui, a expressão "retardando o processo de desenvolvimento de uma planta," e suas variantes gramaticais, referem-se a qualquer redução da velocidade, interrupção, supressão ou inibição do referido processo de desenvolvimento da planta ou às mudanças fenotípicas ou genotípicas da planta ou de parte da planta normalmente associadas com o processo específico de desenvolvimento de plantas. Por exemplo, quando o referido processo de desenvolvimento da planta é o amadurecimento das frutas, um retardo no amadurecimento das frutas poderá incluir a inibição das mudanças geralmente associadas ao processo de amadurecimento (por exemplo, mudança na cor, amolecimento do pericarpo (isto é, da parede ovariana), o aumento no teor de açúcar, mudanças no sabor, degradação/deterioração geral da fruta e eventuais reduções na adequação do fruto para os consumidores, conforme descrito acima). Alguém versado na técnica observará que o tempo necessário para ocorrer o amadurecimento da fruta variará dependendo, por exemplo, do tipo de fruta e das condições de armazenamento específicas utilizadas (por exemplo, temperatura, umidade, fluxo de ar, etc.). Consequentemente, "retardar o amadurecimento da fruta" pode constituir um retardo de 1 a 90 dias, em particular, de 1 a 30 dias, mais particularmente, de 5 a 30 dias. Os métodos para avaliar um retardo no processo de desenvolvimento de uma planta tal como o amadurecimento da fruta, o amadurecimento da verdura, a senescência das flores e a queda das folhas estão bem dentro das capacidades rotineiras daqueles versados na técnica e, podem ser baseados, por exemplo, na comparação com processos de desenvolvimento das plantas não-tratadas ou em parte da planta. Em certos aspectos da invenção, os retardos em um processo de desenvolvimento de plantas que resulta da prática dos presentes métodos podem ser avaliados com relação a plantas ou partes de plantas não-tratadas ou a plantas ou partes de plantas que tenham sido tratadas com um ou mais agentes conhecidos como retardadores do referido processo de desenvolvimento da planta. Por exemplo, um retardo no amadurecimento de frutas resultante do desempenho de um método da invenção pode ser comparado com os tempos de amadurecimento de frutas não-tratadas ou de frutas que tenham sido tratadas com um agente antiamadurecimento, tal como aqueles descritos acima. Os métodos da invenção para retardamento de um processo de

desenvolvimento de plantas tipicamente compreendem a exposição de uma planta ou parte de planta a uma ou mais das seguintes bactérias: Rhodococcus spp., Pseudomonas chloroaphis, Brevibacterium ketoglutamicum ou a uma mistura contendo qualquer combinação destas bactérias. Em certas 25 modalidades, uma ou mais bactérias incluem Rhodococcus spp., mais particularmente a cepa DAP 96253 de Rhodococcus rhodochrous, a cepa DAP 96622 de Rhodococcus sp., Rhodococcus erythropolis ou misturas destas. Conforme usado aqui, a exposição de uma parte ou de uma parte de planta a uma ou mais das bactérias acima inclui, por exemplo, a exposição a célu30 Ias bacterianas intactas, Iisados de células bacterianas e a extratos bacterianos que possuam atividade enzimática (isto é, "extratos enzimáticos"). Os métodos para preparação dos Iisados e dos extratos enzimáticos de células, incluindo células bacterianas, são rotineiros na técnica. Uma ou mais bactérias usadas nos métodos e aparelhos da invenção podem ser eventualmente mais geralmente mencionadas aqui como o "catalisador".

Conforme os métodos da invenção, uma ou mais bactérias são 5 expostas à planta ou parte da planta em uma quantidade suficiente para retardar o processo de desenvolvimento da planta. "Expor" uma planta ou parte de planta a uma ou mais bactérias da invenção inclui qualquer método para apresentar uma bactéria à planta ou parte de planta. Métodos indiretos da exposição incluem, por exemplo, a colocação da bactéria ou da mistura

de bactérias na proximidade geral da planta ou da parte da planta (isto é, exposição indireta). Em outras modalidades, as bactérias podem ser expostas à planta ou parte da planta via contato mais próximo ou direto. Além disso, conforme definido aqui, uma quantidade "suficiente" de uma ou mais bactérias da invenção dependerá de vários fatores, incluindo, sem limitação, 15 as bactérias em particular utilizadas no método, em cuja forma as bactérias são expostas à planta ou à parte da planta (por exemplo, como células bacterianas intactas, Iisados de células ou extratos enzimáticos, conforme descritos acima), os meios pelos quais as bactérias são expostas à planta ou à parte da planta e a duração da exposição. Seria uma questão de experimen20 tação rotineira para o profissional versado determinar a quantidade "suficiente" de uma ou mais bactérias necessárias para retardar o referido processo de desenvolvimento da planta.

Embora em determinadas modalidades da invenção, uma ou mais bactérias sejam selecionadas do grupo composto de Rhodococcus 25 spp., Pseudomonas ehloroaphis, Brevibaeterium ketoglutamicum, qualquer bactéria que retarda um processo de desenvolvimento de plantas quando exposto a uma planta ou parte da planta pode ser usada nos presentes métodos e aparelhos. Por exemplo, as bactérias que pertencem ao gênero Nocardia [vide Pedido de Patente Japonês N°. 54-129190], Rhodococcus [Pedido de 30 Patente Japonês Nc. 2-470], Rhizobium [Pedido de Patente Japonês N°. 5- 236977], Klebsiella [Pedido de Patente Japonês N°. 5-30982], Aeromonas [Pedido de Patente Japonês N0. 5-30983], Agrobactenum [Pedido de Patente Japonês N°. 8-154691], Bacilo [Pedido de Patente Japonês N°. 8-187092], Pseudonocardia [Pedido de Patente Japonês N°. 8-56684], Pseudomonas e Mycobacterium são exemplos não-limitadores de micro-organismos que podem ser usados segundo a invenção. Nem todas as espécies dentro de um 5 gênero dado podem exibir as mesmas propriedades. Assim, é possível ter um gênero geralmente conhecido por incluir cepas capazes de exibir uma atividade desejada (por exemplo, a capacidade de retardar um determinado processo de desenvolvimento de planta tal como, por exemplo, o amadurecimento das frutas), mas ter uma ou mais espécies que geralmente não exibem a ati10 vidade desejada. À Iuz da divulgação proporcionada aqui e do conhecimento geral na técnica, entretanto, seria questão de experimentação rotineira para o profissional versado na técnica realizar um ensaio para determinar se uma determinada espécie possui uma ou mais atividades desejadas.

Além disso, exemplos específicos de bactérias úteis segundo a invenção incluem, sem limitação, Nocardia sp., Rhodoeoceus sp., Rhodoeoecus rhodoehrous, Klebsiella sp., Aeromonas sp., Citrobaeter freundii, Agrobaeterium rhizogenes, Agrobaeterium tumefaeiens, Xanthobaeter flavas, Erwinia nigrifIuens, Enterobaeter sp., Streptomyees sp., Rhizobium sp., Rhizobium loti, Rhizobium legminosarum, Rhizobium merioti, Candida guilliermondii, Pantoea agglomerans, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Agrobaeterium radiobaeter, Bacilo smithii, Pseudonocardia thermophila, Pseudomonas chloroaphis, Pseudomonas erythropolis, Brevibacterium ketoglutamicum, Rhodoeoceus erythropolis, Nocardia fareinica, Pseudomonas aeruginosa e Heliobacter pylori. Em determinadas modalidades, as bactérias do gênero Rhodoeoceus, mais especificamente da cepa DAP 96253 de Rhodoeoceus rhodoehrous (Depósito ATCC N°. 55899; depositado junto ao ATCC em 11 de dezembro de 1996), cepa DAP 96622 de Rhodoeoceus sp. (Depósito ATCC N°. 55898; depositado junto ao ATCC em 11 de dezembro de 1996), Rhodoeoceus erythropolis ou misturas destas, são usadas nos métodos e nos aparelhos da invenção.

Em certos aspectos da invenção, uma ou mais bactérias são "induzidas" a exibir uma característica desejada (por exemplo, a capacidade de retardar um processo de desenvolvimento de planta, tal como amadurecimento da fruta) por exposição a ou tratamento com um agente de indução adequado. Os agentes de indução incluem, sem limitação, asparagina, glutamina, cobalto, ureia ou qualquer mistura destes. Em determinadas modalidades, as 5 bactérias são expostas a ou tratadas com o agente de indução asparagina, mais particularmente uma mistura dos agentes de indução que compreendem asparagina, cobalto e ureia. O agente de indução pode ser acrescentado a qualquer tempo durante o cultivo das células desejadas. Por exemplo, com relação às bactérias, o meio de cultura pode ser complementado com um a10 gente de indução antes do início do cultivo das bactérias. Alternativamente, as bactérias podem ser cultivadas em um meio por um período de tempo predeterminado para o crescimento das bactérias e o agente de indução pode ser acrescentado em uma ou mais ocasiões determinadas para induzir a atividade enzimática desejada nas bactérias. Além disso, o agente de indução pode ser 15 acrescentado ao meio de crescimento (ou a uma mistura separada incluindo as bactérias crescidas anteriormente) para induzir a atividade desejada nas bactérias após o término do crescimento das bactérias.

Enquanto não há a intenção de se limitar a um determinado mecanismo, a "indução" das bactérias da invenção pode resultar na produção (ou produção aumentada) de uma ou mais enzimas, tais como uma nitrila hidratase, amidase e/ou asparaginase e a indução de uma ou mais destas enzimas pode desempenhar um papel no retardamento do referido processo de desenvolvimento da planta. "Nitrila hidratases", "amidases" e "asparaginases" compreendem famílias de enzimas presentes nas células de vários organismos, incluindo, sem limitação, bactérias, fungos, plantas e animais. Tais enzimas são bem conhecidas das pessoas versadas na técnica e cada classe da enzima possui atividades enzimáticas reconhecidas. A expressão "atividade enzimática," conforme utilizada aqui, geralmente se refere à capacidade de uma enzima de atuar como um catalisador em um processo, tal como a conversão de um composto em outro composto. Especialmente, a enzima nitrila hidratase catalisa a hidrólise de nitrila (ou cianohidrina) à amida correspondente (ou hidroxiácido). A amidase catalisa a hidrólise de uma amida para o ácido ou hidroxiácido correspondente. Similarmente, uma enzima de asparaginase, tal como a asparaginase I, catalisa a hidrólise de asparagina para o ácido aspártico.

Em certos aspectos da invenção, a atividade enzimática pode 5 ser referida em termos de "unidades" por massa de enzima ou células (tipicamente com base no peso seco das células, por exemplo, unidades/mg cdw). Uma "unidade" geralmente refere-se à capacidade de converter uma quantidade específica de um composto em um composto diferente sob um conjunto definido de condições como uma função de tempo. Em modalida10 des específicas, uma "unidade" da atividade de nitrila hidratase pode se relacionar à capacidade de converter um pmol de acrilonitrila em sua amida correspondente por minuto, por miligrama de células (peso seco) em um pH de 7,0 e a uma temperatura de 30°C. Similarmente, uma unidade da atividade da enzima amidase pode se relacionar à capacidade de converter um 15 μιηοΙ de acrilamida em seu ácido correspondente por minuto, por miligrama de células (peso seco) em um pH de 7,0 e a uma temperatura de 30°C. Além disso, uma unidade da atividade da enzima asparaginase pode se relacionar à capacidade de converter um pmol de asparagina em seu ácido correspondente por minuto, por miligrama de células (peso seco) em um pH de 7,0 e a 20 uma temperatura de 30°C. Os ensaios para medição da nitrila hidratase, da atividade da amidase ou da atividade da asparaginase são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a detecção de amônia livre. Vide Fawcett e Scott (1960) J. Clin. Pathoi 13:156-159, que é incorporado como referência em sua totalidade ao presente.

Métodos para retardar um processo de desenvolvimento de

planta compreendendo a exposição de uma planta ou parte da planta em uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em nitrila hidratase, amidase, asparaginase ou na mistura destas, em que uma ou mais enzimas são expostas à planta ou parte da planta em uma quantidade ou em 30 um nível de atividade enzimática suficiente para retardar o processo de desenvolvimento da planta são ainda contemplados pela presente invenção. Por exemplo, as células inteiras que produzem, são induzidas a produzir ou são geneticamente modificadas para produzir uma ou mais das enzimas acima (isto é, nitrila hidratase, amidase e/ou asparaginase) podem ser usadas em métodos para retardar um processo de desenvolvimento de uma planta. Alternativamente, as enzimas nitrila hidratase, amidase e/ou asparaginase 5 podem ser isoladas, purificadas ou semipurificadas a partir de qualquer das células acima e expostas à planta ou parte da planta em uma forma mais isolada. Vide, por exemplo, Goda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:23480- 23485; Nagasawa et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267:138-144; Soong et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66:1947-1952; Kato et al. (1999) Eur. J. Bio10 chem. 263:662-670, todos os quais estão aqui incorporados como referência em sua totalidade. Alguém versado na técnica ainda observará que único tipo de célula pode ser capaz de produzir (ou ser induzido a ou geneticamente modificado para produzir) mais de uma das enzimas da invenção. Tais células são adequadas para uso nos métodos e aparelhos divulgados.

As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos para as várias

enzimas nitrila hidratases, amidases e asparaginases de vários organismos são divulgadas em bancos de dados de seqüência publicamente disponíveis. Uma lista não-limitadora de nitrila hidrases e amidases alifáticas conhecida na técnica é apresentada nas Tabelas 1 e 2 e na listagem da seqüência. A 20 "escore de proteínas" referida nas Tabelas 1 e 2 fornece uma visão geral dos intervalos de confiança de percentagem (% do Intervalo de Confiança) da identificação das proteínas isoladas com base em dados de espectroscopia de massa.

Tabela 1: Informações sobre seqüências de aminoácidos para nitrila hidratases representativas

Organismo de fonte Acessâo N Identiricador de seqüência'-.v IBMaB Rhodococcus sp. 806580 ID. SEQ N°.: 1 100% Noeardia sp. 27261874 ID. SEQ N°.:2 100% Rhodoeoceus rhodoehrous 49058 ID. SEQ N°.:3 100% Bactéria sem cultura (BD2); subuni- 27657379 ID. SEQ N°.:4 100% dade-beta de nitrila hidratase Rhodoeoceus sp. 806581 ID. SEQ N°.:5 100% Rhodoeoceus rhodoehrous 581528 ID. SEQ N°.:6 100% Bactéria sem cultura (SP1); subuni- 7657369 ID. SEQ N°.:7 100% dade-alfa de nitrila hidratase Tabela 2: Informações sobre a seqüência de aminoácidos das

amidases alifáticas representativas

:jÊÊÈÈÈÈÈÈÈÊÊ Ί Λ íS ptefnas ■ ~jf... Rhodococcusrhodochrous 62461692 ID. SEQN°.:8 100% Noeardia farcinica IFM10152 54022723 ID. SEQ N°.:9 100% Pseudomonasaeruginosa PA01 15598562 ID.SEQ N°.:10 98,3% Helicobacterpylori J99 15611349 ID. SEQ N0.: 11 99,6% Helieobacter pylori 26695 2313392 ID. SEQ N0.: 12 97,7% Pseudomonasaeruginosa 150980 ID. SEQN°.:13 94% Geralmente, qualquer célula de bactéria, fungo, planta ou animal capaz de produzir ou ser induzida a produzir nitrila hidratase, amidase, asparaginase ou qualquer combinação destas pode ser usada na prática da invenção. Uma enzima nitrila hidratase, amidase e/ou asparaginase pode ser produzida constitutivamente em uma célula de um determinado organismo (por exemplo, de uma bactéria, fungo, célula de planta ou célula de animais) ou, alternativamente, uma célula pode produzir a enzima ou enzimas desejadas somente após a "indução" com um agente de indução adequado. O termo "constitutivamente" significa que pelo menos uma enzima da invenção é continuamente produzida ou expressa em um tipo de célula em particular. Outros tipos de células, entretanto, podem precisar ser "induzidos," conforme descrito acima, para expressar a enzima nitrila hidratase, amidase e/ou asparaginase em uma quantidade suficiente ou o nível de atividade enzimática para retardar o referido processo de desenvolvimento da planta. Isto é, uma enzima da invenção só pode ser produzida (ou produzida em níveis suficientes) após a exposição a ou tratamento com um agente de indução adequado. Tais agentes de induções são conhecidos na técnica e detalhados acima. Por exemplo, em certos aspectos da invenção, uma ou mais bactérias são tratadas com um agente de indução, tal como asparagina, glutamina, cobalto, ureia ou qualquer mistura destes, mais particularmente uma mistura de asparagina, cobalto e ureia. Além disso, conforme divulgado no Pedido Norte-Americano pendente N°. 11/669.011, intitulado "Indução e Estabilização da Atividade Enzimática em Micro-organismos", depositado em de janeiro de 2007, a atividade de asparaginase I pode ser induzida em DAP 96622 Rhodococcus rhodoehrous (Gram-positivo) ou em DAP 96253 Rhodoeoceus sp. (Gram-positivo), em meio complementado com amida que contém aminoácidos ou derivados destes. Outras cepas de Rhodococcus podem também preferencialmente ser similarmente induzidas para exibir 5 atividade enzimática de asparaginase I utilizando amida contendo aminoácidos ou derivados dos mesmos.

Em outros aspectos da invenção, P. chloroaphis (Depósito ATCC N0. 43051), que produz atividade de asparaginase I na presença de asparagina e B. kletoglutamicum (Depósito ATCC N°. 21533), uma bactéria 10 Gram-positiva que também demonstrou produzir a atividade de asparaginase, são usadas nos métodos divulgados. As células de fungos, tais como aquelas do gênero Fusarium, células de plantas e células de animais, que expressam uma nitrila hidratase, amidase e/ou uma asparaginase, também podem ser usadas nos métodos e aparelhos divulgados aqui, quer como 15 células inteiras ou como sua fonte para uma ou mais das enzimas acima isoladas.

Em modalidades adicionais, células hospedeiras que tenham sido geneticamente produzidas para expressar uma nitrila hidratase, amidase e/ou asparaginase podem ser usadas expostas a uma planta ou parte da 20 planta de acordo com os presentes métodos e aparelhos para retardar um processo de desenvolvimento de planta. Especificamente, um polinucleotídeo que codifica uma enzima nitrila hidratase, amidase ou asparaginase (ou múltiplos polinucleotídeos cada qual codifica uma enzima nitrila hidratase, amidase ou asparaginase) pode ser introduzido por técnicas de biologia mo25 Iecular padrão em uma célula hospedeira para produzir uma célula transgênica que expressa uma ou mais enzimas da invenção. O uso dos termos "polinucleotídeo", "construto de polinucleotídeo", "nucleotídeo", ou " construto de nucleotídeo" não é destinado a limitar a presente invenção a polinucleotídeos ou nucleotídeos compreendendo o DNA. Aqueles versados na técni30 ca reconhecerão que os polinucleotídeos e os nucleotídeos podem compreender ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem molécuIas de ocorrência natural e análogas sintéticas. Os polinucleotídeos da invenção também abrangem todas as formas de seqüências, incluindo, sem limitação, formas de fita térmica, formas de fita dupla e similares.

Variantes e fragmentos de polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que retêm a atividade enzimática desejada (isto é, a atividade das enzimas nitrila hidratase, amidase ou asparaginase) também podem ser usados na prática da invenção. Por "fragmento" é definida uma porção de polinucleotídeo e, portanto, também codifica uma porção da proteína correspondente. Os polinucleotídeos que são fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos de enzimas geralmente compreendem pelo menos 10, 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300 ou 1.400 nucleotídeos contíguos ou até o número de nucleotídeos presentes em uma seqüência de polinucleotídeos de enzimas de comprimento total. Um fragmento de polinucleotídeo codificará um polipeptídio com uma atividade enzimática desejada e geralmente codificará pelo menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200 ou 250 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em uma seqüência de aminoácidos de enzimas de comprimento total da invenção. Por "variantes" são definidas seqüências substancialmente similares. Geralmente, variantes de uma determinada seqüência de enzimas da invenção terão pelo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de enzimas de referência, conforme determinado pelos programas-padrão de alinhamento de seqüências. Os polinucleotídeos variantes contemplados pela invenção codificarão os polipeptídeos com a atividade enzimática desejada.

Conforme usado no contexto da produção de células transgênicas, o termo "introdução" significa apresentar a uma célula hospedeira, um micro-organismo em particular, tal como Escherichia coli, com um polinu30 cleotídeo que codifica uma enzima nitrila hidratase, amidase e/ou asparaginase. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo será apresentado de tal maneira que a seqüência ganha o acesso ao interior de uma célula hospedeira, incluindo sua inserção potencial no genoma da célula hospedeira. Os métodos da invenção não dependem de um determinado método para introduzir uma seqüência em uma célula hospedeira, somente que o polinucleotídeo ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula hospedeira. Méto5 dos para a introdução de polinucleotídeos em células hospedeiras são bem conhecidos na técnica incluindo, sem limitação, métodos de transfecção estáveis, métodos de transfecção passageiros e métodos mediados por vírus. Por "transfecção estável" é definido que o construto de polinucleotídeo introduzido em uma célula hospedeira integra-se ao genoma da hospedeira e é 10 capaz de ser herdado pela prole deste. "Transfecção passageira" ou "a expressão passageira" significam que um polinucleotídeo é introduzido na célula hospedeira, mas não se integra no genoma da hospedeira.

Além disso, a seqüência de nucleotídeo de nitrila hidratase, amidase ou asparaginase pode estar contida em, por exemplo, um plasmídeo para introdução na célula hospedeira. Plasmídeos típicos referidos incluem vetores contendo sítios de clonagem definidos, origens da réplica e marcadores selecionáveis. O plasmídeo pode ainda incluir seqüência de iniciação de transcrição e tradução e terminadores de transcrição e tradução. Os plasmídeos também pode incluir cassetes de expressão genéricos contendo pelo menos uma seqüência de terminadores independente, seqüências que permitem a réplica do cassete em eucariotes ou procariotes, ou ambos (por exemplo, vetores propagadores) e marcadores de seleção para ambos os sistemas procarióticos e eucarióticos. Os vetores são adequados para réplica e integração em procariotes, eucariotes ou idealmente em ambos. Para descrições gerais de clonagem, embalagem e sistemas e métodos de expressão, vide Giliman e Smith (1979) Gene 8:81-97; Roberts et al. (1987) Nature 328:731-734; Berger e Kimmel (1989) Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152 (Academic Press, Inc., San Diego1 Califórnia); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3 (2d ed; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, York); e Ausubel et al., eds. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols (Greene Publishing Associates, Inc., e John Wiley & Sons, Inc., New York; 1994 Supplement). Células hospedeiras transgênicas que expressam uma ou mais enzimas da invenção podem ser usadas nos métodos e aparelhos divulgados como células inteiras ou como fonte biológica da qual uma ou mais enzimas da invenção podem ser isoladas.

Aparelhos para retardar um processo de desenvolvimento de

planta e para executar os métodos da invenção são também proporcionados. Em determinadas modalidades, um aparelho para retardar um processo de desenvolvimento de planta, em particular o amadurecimento da fruta, compreendendo um catalisador que compreende uma ou mais bactérias se10 lecionadas do grupo composto de Rhodococcus spp., Pseudomonas chloroaphis, Brevibaeterium ketoglutamieum e misturas destas é contemplado pela presente invenção. A cepa DAP 96253 de Rhodoeoceus rhodoehrous, a cepa DAP de 96622 Rhodococcus sp., Rhodoeoceus erythropolis ou suas misturas podem ser usadas em certos aspectos da invenção. Uma ou mais bac15 térias de um aparelho da invenção são proporcionadas em quantidade suficiente para retardar o referido processo de desenvolvimento da planta, conforme definido acima. Em outros aspectos da invenção, o catalisador compreende uma ou mais enzimas (isto é, nitrila hidratase, amidase e/ou asparaginase) em uma quantidade ou em um nível de atividade enzimática sufici20 ente para retardar um processo de desenvolvimento de planta. As fontes das enzimas desejadas para uso como um catalisador nos aparelhos da invenção também são descritas detalhadamente acima. Por exemplo, o catalisador pode ser usado na forma de células inteiras que produzem (ou são induzidas a ou geneticamente modificadas para produzir) uma ou mais das en25 zimas da invenção ou pode compreender a(s) própria(s) enzima(s) em forma isolada, purificada ou semipurificada.

Aparelhos para retardar um processo de desenvolvimento de planta contemplado pela presente invenção podem ser proporcionados em vários formatos adequados e podem ser apropriados para uso único ou múl30 tiplos usos (por exemplo, "recarregáveis"). Além disso, os aparelhos da invenção encontram utilidade tanto em ambientes residenciais como em comerciais. Por exemplo, tais aparelhos podem estar integrados em refrigeradores residenciais ou comerciais, incluindo em trens, caminhões, etc. para o transporte de longa distância de frutas, verduras ou flores ou usados em compartimentos independentes para armazenagem ou transporte de tais produtos vegetais. Aparelhos exemplares, não-limitadores da invenção são descritos aqui abaixo e ilustrados nas figuras 1-4.

Em determinadas modalidades, o catalisador é proporcionado em um formato imobilizado. Qualquer processo ou matriz para imobilização do catalisador pode ser usado contanto que a capacidade de uma ou mais bactérias (ou enzimas) para retardar um processo de desenvolvimento de 10 planta seja conservada. Por exemplo, o catalisador pode ser imobilizado em uma matriz que compreende alginato (por exemplo, alginato de cálcio), carragenina, DEAE-celulose ou poliacrilamida. Outras tais matrizes são bem conhecidas na técnica e podem ter ainda encadeamento cruzado com qualquer agente de encadeamento cruzado apropriado, incluindo, sem limitação, 15 glutaraldeído ou polietilenimina, para aumentar a força mecânica da matriz de catalisador. Em um aspecto da invenção, o catalisador é imobilizado em uma matriz de DEAE-celulose reticulada por glutaraldeído. O catalisador, em particular, o catalisador em forma imobilizada, pode ser ainda apresentado como "um elemento de módulo de catalisador". Um elemento de módulo de 20 catalisador compreende um catalisador, tal como um catalisador imobilizado, dentro de uma estrutura adicional que, por exemplo, reduz o contato potencial com o catalisador, facilita a substituição do catalisador ou permite o fluxo de ar através do catalisador.

Em uma modalidade, a matriz compreende alginato ou sais des25 te. O alginato é um copolímero linear com blocos homopoliméricos de Dmanuronato (M) (1 -4)-ligado β e os seus resíduos de C-5 epímero a-Lguluronato (G), respectivamente, covalentemente ligados em conjunto em diferentes seqüências ou blocos. Os monômeros podem aparecer em blocos homopoliméricos de resíduos-G consecutivos (blocos-G), resíduos-M conse30 cutivos (blocos-M), resíduos MeG (blocos-MG) alternados ou blocos organizados aleatoriamente. Em uma modalidade, o alginato de cálcio é usado como o substrato, mais particularmente o alginato de cálcio que foi encadeado reticulado, como com polietilenimina, para formar um substrato de alginato de cálcio endurecido. Uma descrição mais detalhada de tais técnicas de imobilização podem ser encontradas em Bucke (1987) "Cell Immobilization in Calcium Alginate" in Methods in Enzymology, Vol. 135(B) (Academic Press, 5 Inc., San Diego, Califórnia; Mosbach, ed.), que está incorporada aqui como referência. Um método exemplar da imobilização usando alginato de cálcio reticulado por polietilenoimina é também descrito no Exemplo 5. Em outra modalidade, a matriz compreende um polimero contendo amida. Qualquer polímero compreendendo um ou vários grupos de amida pode ser usado 10 segundo a invenção. Em uma modalidade, o substrato compreende um polímero de poliacrilamida.

O aumento na força mecânica de uma matriz de catalisador imobilizada pode ser atingido através da reticulação. Por exemplo, as células podem ser quimicamente reticuladas para formar aglutinações de células. 15 Em uma modalidade, as células colhidas são reticuladas usando glutaraldeídeo. Por exemplo, as células podem ser suspensas em uma mistura de água deionizada e glutaraldeído seguido pela adição de polietilenoimina até que a floculação máxima seja atingida. As células reticuladas (tipicamente na forma de partículas formadas por inúmeras células) podem ser colhidas pela 20 filtração simples. Outra descrição de tais técnicas é fornecida em LopezGallego et al. (2005) J. Biotechnol. 119:70-75, que é aqui incorporada como referência em sua totalidade. Um protocolo geral para imobilização de células, em particular células de Rhodococcus spp., em DEAE-celulose reticulada com glutaraldeído também é delineado abaixo no Exemplo 4.

Em certos aspectos da invenção, o catalisador imobilizado ou

um ou mais elementos modulares do catalisador são colocados na parte interna da, colocados sobre a, ou afixados a uma "estrutura física." A estrutura física inclui, sem limitação, uma película, lâmina, camada de revestimento, caixa, bolsa, saco, ou câmara com fendas capaz de reter um ou mais ele30 mentos modulares do catalisador. Em certas modalidades, a estrutura física compreende um recipiente apropriado para transporte ou armazenamento de frutas, verduras ou flores. A estrutura física pode ainda compreender mais de uma estrutura individual, por meio da qual todas as estruturas individuais são unidas a um catalisador central ou a um elemento modular do catalisador. Uma estrutura física descrita aqui acima poderá opcionalmente ser refrigerada por meios externos ou compreender uma unidade de refrigeração dentro da própria estrutura física.

Os elementos para monitoração da eficácia do catalisador para retardar o referido processo de desenvolvimento da planta (por exemplo, para avaliar quando o catalisador ou o módulo de catalisador deve ser substituído) ou para medir ou controlar fluxo de ar, teor de umidade/umidade e 10 níveis de dióxido de carbono podem ser opcionalmente incluídos em um aparelho da invenção. Qualquer aparelho para retardar um processo de desenvolvimento de planta pode compreender ainda um ou mais elementos para permitir o fluxo de ar para ou através catalisador ou do elemento modular do catalisador. O profissional versado prontamente visualizaria outras 15 modificações possíveis aos aparelhos descritos aqui para monitorar e controlar as condições atmosféricas (por exemplo, fluxo de ar, umidade e níveis de dióxido de carbono) do catalisador, o elemento modular do catalisador ou a estrutura física. Condições, tais como temperatura, composição atmosférica (por exemplo, a umidade relativa, níveis de O2 e CO2, estresse físico, luz, 20 estresse químico, radiação, estresse hídrico, reguladores de crescimento e ataque por agente patogênico têm um papel importante nas taxas de respiração e significativamente afetam 0 prazo da validade das frutas, verduras, flores ou outros produtos vegetais relacionados. Embora a temperatura e as condições atmosféricas do armazenamento variem dependendo da fruta, 25 verdura ou outro produto vegetal relacionado, as temperaturas de armazenamento recomendadas residem tipicamente na faixa de aproximadamente 0o a aproximadamente 20°C com níveis de O2 e CO2 nas faixas aproximadas de 1-10% e 0-20%, respectivamente. Uma umidade relativa de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%, em particular 85% a aproximadamen30 te 95%, mais particularmente de aproximadamente 90% a aproximadamente 95% é geralmente recomendada para o armazenamento de frutas, verduras e produtos vegetais relacionados. Considerando a correlação significativa entre a taxa de respiração e o prazo da validade dos produtos vegetais, o controle dos fatores acima citados é importante para o retardo da deterioração de tais produtos. Consequentemente, um sequestrantede dióxido de carbono pode ser proporcionado no aparelho para reduzir o teor de dióxido de carbono.

Em determinadas modalidades da invenção, aparelhos de catalisador permeáveis ao ar para retardar um processo de desenvolvimento de plantas que compreende múltiplas camadas são proporcionados. Por exemplo, conforme mostrado na figura 1, um aparelho de catalisador 10 pode in10 cluir as camadas externas 12 e 14 e uma camada de catalisador intermediária 16 localizada entre as camadas externas 12 e 14. A camada do catalisador 16 compreende uma ou mais bactérias (por exemplo, Rhodococcus spp., Pseudomonas chloroaphis, Brevibaeterium ketoglutamieum e misturas das mesmas) ou enzimas (nitrila hidratase, amidase, asparaginase e misturas 15 das mesmas), em que uma ou mais bactérias ou enzimas são proporcionadas em quantidade suficiente para retardar o processo de desenvolvimento de planta relacionado e uma terceira camada. Nesta modalidade, uma ou mais das camadas externas 12 e 14 fornecem a integridade estrutural ao aparelho de catalisador 10. As camadas externas 12 e 14 tipicamente permi20 tem o fluxo de ar para a camada de catalisador 16 embora, em algumas modalidades, possa ser vantajoso ter uma camada externa que não seja permeável ao ar, por exemplo, se o aparelho formar o lado da caixa e há a recomendação de não permitir que a camada externa da caixa exponha a camada de catalisador ao ambiente. O aparelho de catalisador 10 pode ser 25 proporcionado em bolsas ou sacos reutilizáveis ou não-reutilizáveis conforme a invenção. Em uma modalidade, a camada de catalisador 16 compreende células de Rhodoeoceus spp., em particular a cepa DAP 96253 de Rhodoeoceus rhodoehrous, a cepa DAP 96622 de Rhodococcus sp., Rhodococcus erythropolis ou misturas das mesmas. As células bacterianas utiliza30 das como um catalisador em um aparelho da invenção podem ser induzidas com um ou vários agentes de indução (por exemplo, asparagina, glutamina, cobalto, ureia ou uma mistura das mesmas), conforme descrito detalhadamente acima.

As figuras 2A-2C ilustram aparelhos alternativos em conformidade com a invenção para retardar um processo de desenvolvimento de planta. Estes aparelhos compreendem múltiplas camadas, em que uma ou mais 5 das camadas são removíveis. Conforme mostrado na figura 2A, o aparelho pode incluir uma camada estrutural permeável ao ar 22 e uma camada de catalisador 24. As camadas removíveis 26 e/ou 28 podem ser fornecidas ao longo da camada estrutural 22 e/ou a camada de catalisador 24 e são tipicamente destinadas para ser retiradas antes de utilização ou ativação do 10 catalisador. Em certos aspectos da invenção, a remoção das camadas removíveis 26 e 28 expõe um adesivo que facilita a colocação ou a afixação da estrutura de catalisador a uma estrutura física separada. A figura 2B ilustra uma modalidade alternativa em que o aparelho 30 inclui duas camadas estruturais permeáveis ao ar 32 e 34, uma camada de catalisador intermediária 15 36 e uma camada removível 38. A figura 2C ilustra ainda outra modalidade em que o aparelho 40 inclui duas camadas estruturais permeáveis ao ar 42 e 44, uma camada de catalisador intermediária 46 e duas camadas removíveis 48 e 50.

As figuras 3A-3B ilustram uma modalidade alternativa 60 em que 20 o catalisador é afixado à parte interna de um recipiente, tal como uma caixa de papelão. Conforme mostrado na figura 3A, um lado 62 do recipiente inclui uma camada de catalisador 64 afixada a este pelo uso de uma camada adesiva 66. Uma película destacável 68 pode ser proporcionada adjacente à camada de catalisador 64 para proteger a camada de catalisador da exposi25 ção ao ambiente. A película destacável 68 pode ser removida para ativar o catalisador na camada de catalisador 64 pela exposição do catalisador a uma parte de planta fornecida no recipiente para, por este meio, retardar um processo de desenvolvimento de planta indesejado.

A figura 3B ilustra uma estrutura de catalisador 70 antes de afixar a estrutura de catalisador à parte interna de um recipiente na forma ilustrada na figura 3A. Além da camada de catalisador 64, da camada adesiva 66 e da película destacável 68, a estrutura de catalisador 70 inclui uma pelícuia destacável adicional 72. A película destacável 72, do mesmo modo que a película destacável 68, protege a estrutura de catalisador 70 quando este é embalado, embarcado ou armazenado. A película destacável 72 pode ser retirada para expor a camada adesiva 66 para permitir à estrutura de catali5 sador 70 possa ser afixada ao interior do recipiente na forma ilustrada na figura 3A.

A figura 4 ilustra uma estrutura de catalisador 80 que inclui duas fendas 82 e 84 para receber um cassete de catalisador (por exemplo, cassete 86). Um cassete de catalisador 86 é permeável ao ar e pode ser facilmente inserido em ou retirado da fenda 84. Assim, o cassete de catalisador 86 pode ser prontamente substituído se um novo cassete de catalisador for recomendado para uso na estrutura de catalisador 80. O cassete de catalisador 86 inclui um catalisador tal como descrito aqui e isto é preferivelmente imobilizado em uma; matriz. A estrutura de catalisador 80 pode incluir superfícies permeáveis ao ar opostas 88 e 90, tais como telas de rede para permitir o fluxo de ar através cassete de catalisador 86. A estrutura de catalisador 80, em modalidades alternativas, pode incluir somente uma superfície permeável ao ar, duas superfícies permeáveis ao ar não-opostas ou mais de duas superfícies permeáveis ao ar como seria entendida por alguém versado na técnica. Embora a figura 4 inclua duas fendas 82 e 84 para receber um cassete de catalisador (por exemplo, cassete 86), seria entendido por alguém versado na técnica que a estrutura de catalisador 80 pode incluir uma ou mais fendas para receber um cassete. A estrutura de catalisador 80 pode ser fornecida dentro de um recipiente usado para transportar uma parte da planta, tal como frutas ou flores ou pode ser afixada a um recipiente, por exemplo, pelo uso de uma camada adesiva conforme discutido aqui.

Os presentes métodos e os aparelhos podem ser usados para retardar um processo de desenvolvimento de qualquer planta ou parte da planta relacionada. Em determinadas modalidades, os métodos e os apare30 Ihos da invenção são dirigidos ao retardo do amadurecimento e a parte de planta é uma fruta (climatérica ou não-climatérica), verdura ou outra parte de planta sujeita ao amadurecimento. Alguém versado na técnica reconhecerá que "os frutos climatéricos" exibem um súbito aumento da produção de etileno durante o amadurecimento da fruta, ao passo que não se acredita geralmente que "frutos não-climatéricos" experimentem um aumento significativo na biossíntese do etileno durante o processo de amadurecimento. Os frutos, 5 as verduras e os outros produtos vegetais relacionados incluem, porém não estão limitados a: maçã, damasco, biriba, fruta-pão, cherimólia, goiaba serrana, figo, goiaba, jaca, kiwi, banana, pêssego, abacate, maçã, melão cantaloupe, manga, melão, nectarina, caqui, sapoti, fruta do conde, azeitona, mamão, maracujá, pera, ameixa, tomate, pimentão, amora-preta, cacau, caju, 10 pepino, toranja, limão galego, limão, pimenta, cereja, laranja, uva, abacaxi, morango, melancia, tamarillo e nozes.

Em outros aspectos da invenção, métodos e aparelhos são projetados para retardar a senescência das flores, o estiolamento, a queda de folhas ou o fechamento de pétala. Qualquer flor pode ser usada na prática 15 da invenção. As flores relacionadas incluem, porém não estão limitadas a: rosa, cravo, orquídea, onze-horas, malva e begônia. As flores de corte, mais particularmente, flores de corte comercialmente importantes, tais como rosas e cravos, são particularmente relacionadas. Em certas modalidades, as flores que são sensíveis ao etileno são usadas na prática da invenção. As flo20 res sensíveis ao etileno incluem, sem limitação, flores dos gêneros Alstroemeria, Aneomone, Anthurium, Antirrhinum, Aster, Astilbe, Cattleya, Cymbidium, Dahlia, Dendrobium, Dianthus, Eustoma, Freesia, Gerbera, Gypsophila, Iris, Lathyrus, Lilium, Limonium, Nerine1 Rosa, Syringa, Tulipa e Zinia. Flores sensíveis ao etileno representativas também incluem aquelas das famílias 25 Amarylidaceae, Alliaceae, Convallariaceae1 Hemerocallidaceae, Hyacinthaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Aizoaceae, Cactaceae, Campanulaceae, Caryophyllaceae, Crassulaceae1 Gentianaeeae1 Malvaceae, Plumbaginaceae, Portulacaceae, Solanaceae, Agavacaea, Asphodelaceae, Asparagaceae, Begoniaceae, Caprifoliaceae, Dipsacaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, La30 miaceae, Myrtaceae, Onagraceae, Saxifragaceae e Verbenaceae. Vide, por exemplo, Van Doorn (2002) Annals of Botany 89:689-693; e Elgar (1998) "Cut Flowers and Foliage - Cooling Requirements and Temperature Management" em hortnet.co.nz/publications/hortfacts/hf305004.htm (último acesso em 20 de março de 2007), todos os quais estão aqui incorporados como referência em sua totalidade. Métodos e aparelhos para retardar a queda das folhas também são contemplados pela presente invenção. Existe grande 5 interesse comercial no setor de plantas, frutas, verduras e flores em métodos e aparelhos que regulem os processos de desenvolvimento das plantas tais como o amadurecimento, a senescência e a queda das folhas.

O profissional versado ainda reconhecerá que qualquer dos métodos ou aparelhos divulgados aqui podem ser combinados com outros mé10 todos e aparelhos conhecidos para o retardamento de um processo de desenvolvimento de plantas, particularmente, aqueles processos geralmente associados ao aumento da biossíntese do etileno (por exemplo, o amadurecimento de frutas/verduras, a senescência das flores e a queda das folhas). Além disso, conforme descrito acima, o aumento da produção do etileno 15 também foi observado durante o ataque de plantas ou de partes de plantas por organismos patogênicos. Consequentemente, os métodos e os aparelhos da invenção podem encontrar outra utilidade no aperfeiçoamento da resposta das plantas aos agentes patogênicos.

Os seguintes exemplos são oferecidos como meio de ilustração e não para fins de limitação:

EXPERIMENTOS

A presente invenção será descrita agora com referência específica a vários exemplos. Os seguintes exemplos não são limitadores da invenção e são, na verdade, proporcionados como modalidades exemplares.

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Exemplo 1: Maturação retardada de frutas após a exposição a Rhodococcus soo. induzida

As células de Rhodoeoceus spp. induzidas com asparagina, acriIonitrila ou acetonitrila foram imobilizadas em uma matriz de glutaraldeído de encadeamento cruzado da DEAE-celulose. Os métodos de induzir células e preparar a matriz acima estão descritos aqui abaixo mais detalhadamente.

A matriz de catalisador de DEAE-celulose reticulada cruzado foi colocada em três sacos de papel separados (aproximadamente 1-2 gramas de peso úmido de pacote de células por saco), com cada saco contendo bananas, pêssegos ou abacates verdes. Como controles negativos, as mesmas frutas foram colocadas em sacas de papel separadas sem a presença da 5 matriz de catalisador. Os sacos de papel foram conservados em temperatura ambiente e o produto foi observado diariamente quanto a sinais de amadurecimento e degradação das frutas.

Todos os produtos expostos à matriz do catalisador exibiram retardos significativos no amadurecimento das frutas. Em particular, a firmeza 10 e a integridade de pele dos pêssegos foi mantida por mais tempo na presença da matriz do catalisador. Similarmente, com as bananas, o aparecimento de pontos marrons foi retardado e a firmeza conservada por mais tempo com relação aos controles negativos.

Exemplo 2: Protocolos gerais de fermentação e indução Processo de fermentação

Os seguintes protocolos gerais e os meios de cultura foram utilizados para a fermentação de Rhodococcus spp. e das cepas DAP 96622 de Rhodoeoceus sp. e DAP 96523 de Rhodoeoceus rhodoehrous para uso em outros experimentos:

Os recipientes de fermentação foram configurados com sondas

para medir o oxigênio dissolvido (OD) e o pH, bem como com dispositivos de amostragem para medir a concentração de glicose (inativa). Aberturas adicionais foram usadas para adicionar corretivos (por exemplo, ácido, base, ou antiespumante), indutores, nutrientes e suplementos. Recipientes previamente limpos foram esterilizados no local. Um meio de base adequado (1 ou

1,5X) R2A ou R3A, foi usado. Os componentes específicos destes meios de cultura estão apresentados abaixo. Certas substituições dos conteúdos dos meios foram feitas em certos experimentos. Por exemplo, Proflo® (Trader1S Protein, Memphis, TN) foi eventualmente usada no lugar dos ácidos de pro30 teose peptona e/ou ácido casamino. Além disso, em certos experimentos, Hy-Cotton 7803® (Quest International, Hoffman Estates, IL), hidrolisado de caroço de algodão ultrafiltrado (Marcor Devolpment Corp., Carlstadt, NJ) foram usados em Iugardo Proflo® (Trader's Protein, Memphis, TN).

Um perfil de alimentação para suplementos nutritivos foi estabelecido para gradualmente substituir o meio de base R2A ou R3A por um meio mais rico, a saber, 2X YEMEA, cujos componentes também estão des5 critos em mais detalhe abaixo. Outros suplementos nutritivos opcionais incluíram 50% de maltose (p/v) e dextrose 50% (p/v). Os produtos comerciais que contêm equivalentes de dextrose (glicose, maltose e polissacarídeos superiores) foram ocasionalmente usados no lugar de maltose e dextrose.

Inóculos foram preparados de culturas das cepas DAP 9662 de Rhodococcus sp. e DAP 96523 de Rhodoeoceus rhodoehrous em um meio sólido apropriado e incubado em sua temperatura apropriada (por exemplo, 30°C). Em determinadas modalidades, as células foram cultivadas em chapas de ágar-ágar YEMEA durante 4-14 dias, preferivelmente 07 dias. Alternativamente, os inóculos foram preparados de concentrados de células congeladas de ciclos de fermentação anteriores. Os concentrados de células foram tipicamente preparados em uma concentração de 20X acima daquela presente no fermentador. Além disso, o inóculo foi eventualmente preparado a partir de um meio bifásico adequado (isto é, uma combinação do meio líquido que recobre um meio sólido da mesma composição ou diferente). Quando um meio bifásico foi usado, o meio geralmente continha YEMEA tanto nas camadas líquidas como nas sólidas.

Para a indução de nitrila hidratase, em hora t=0, C0CI26H2O estéril e ureia foram acrescentados para atingir concentrações de 5-200 ppm de CoCI2 e 750 mg/l - 10 g/l de ureia, com 10-50 ppm CoCI2 e 7500 mg/l 25 7,5 g/l de ureia geralmente preferida. Em uma determinada modalidade, ureia e/ou cobalto foram acrescentados novamente durante a fermentação. Por exemplo, um volume equivalente da ureia e 150 ppm de CoCI2 foi acrescentado em 4 - 6 horas ou em 24 - 30 horas. Além da ureia, uma concentração final de 300 - 500 ppm de acrilonitrila/acetonitrila ou 0,1 M- 0,2 M 30 de asparagina foi acrescentada gradualmente ou em uma velocidade constante, com início em vários horários. Os ciclos de fermentação foram concluídos quando a massa celular e as concentrações de enzimas estavam aceitáveis, tipicamente em 24-96 horas.

As células então foram colhidas por qualquer método aceitável, incluindo, sem limitação, centrifugação em lotes ou continua, decantação ou filtração. As células colhidas foram ressuspensas em um volume concentra5 do 20X em um tampão adequado, tal como 50 mM de solução salina tamponada com fosfato (PBS) complementada com o indutor durante o processo de fermentação. Os concentrados de células então foram congelados, em particular pelo congelamento rápido. As células congeladas foram armazenadas a -20°C-80°C ou sob nitrogênio liquido para uso posterior.

Descrição de meios de cultura

Meio R2A (Vide Reasoner e Geldreich (1985) Appl. Environ. Microbioi 49:1-

7.)

Extrato de levedura Proteose peptona N0. 3

0,5 g 0,5 g 0,5 g 0,5 g 0,5 g 0,3 g 0,05 g 0,3 g 1,0 litro

Ácidos de casamino

Glicose Amido solúvel K2HPO4 MgSO4 7H20

Piruvato de sódio Dl ou H2O dest.

Meio de R3A (Vide Reasoner e Geldreich, supra.)

Ácidos de casamino

Piruvato de sódio Dl ou H2O dest.

Glicose Amido solúvel K2HPO4 MgSO4TH2O

Extrato de levedura Proteose peptona N0. 3

1.0 g

1.0 g

1.0 g

1.0 g

1.0 g 0,6 g 0,1 g 0,5 g

1,0 litro Meio de YEMEA

IX 2X Extrato de levedura 4,0 g 8,0 g Extrato de malte 10,0 g 20,0 g Glicose 4,0 g 8,0 g Dl ou H2O dest. 1,0 litro 1,0 litro Indução

O seguinte protocolo geral foi utilizado para a indução das cepas de Rhodococcus spp., DAP 96622 de Rhodoeoceus sp. e DAP 96523 de Rhodococcus rhodoehrous:

Líquidos indutores voláteis (por exemplo, acrilonitrila/acetonitrila) foram acrescentados volumetricamente como indutores líquidos esterilizados em filtro com base na densidade do determinado indutor líquido. Em caso de indutores sólidos (por exemplo, asparagina/glutamina), os sólidos foram pesados e adicionados diretamente ao meio de cultura. Os meios resultantes foram colocados em autoclave. Quando os indutores líquidos esterilizados em filtro foram utilizados, o meio de cultura em separado foi colocado em autoclave e resfriado a 40°C antes que o indutor líquido fosse adicionado. As concentrações típicas para indutores relacionados foram: 500 ppm de acrilonitrila/acetonitrila; 500 ppm de asparagina/glutamina; e 50 ppm de succinonitrila. As células então foram cultivadas em meios especificados e, além disso, analisadas quanto a determinadas atividades enzimáticas e biomassa. Exemplo 3: Análise da atividade de nitrila hidratase. amidase e asparaginase e biomassa em células de Rhodococcus sdd. induzidas por asparagina A atividade de nitrila hidratase, amidase e asparaginase e a bi

omassa foram avaliadas em células induzidas por asparagina das cepas de Rhodoeoceus spp., DAP 96622 de Rhodoeoceus sp. e DAP 96523 de Rhodoeoceus rhodoehrous. Várias modificações em componentes de meios de cultura, métodos de administração, proporções e concentrações de aspara30 gina fornecidos às células e a fonte das células foram analisadas com relação aos seus efeitos sobre as atividades das enzimas mencionadas acima e na biomassa. As seções AaG deste exemplo descrevem as especificações de cada jogo de condições de teste e fornecem um resumo das atividades enzimáticas e biomassas obtidas sob cada uma das condições especificadas.

A. Essencialmente conforme descrito acima no Exemplo 2, um

fermentador de 20 litros inoculado usando células da cepa DAP 96253 de

Rhodococcus rhodoehrous colhidas do meio sólido foi continuamente complementado com asparagina indutora (120 μΙ/minuto de uma solução da 0,2 M). O Hy-Cotton 7803® foi usado no lugar de proteose peptona N0. 3 no meio R3A descrito acima. No fim do ciclo de fermentação, a atividade de nitrila 10 hidratase específica de acrilonitrila, a atividade de amidase e a biomassa foram medidas de acordo com as técnicas-padrão conhecidas na técnica.

Os resultados para a atividade de nitrila hidratase, a atividade de amidase e a biomassa estão ilustrados abaixo na Tabela 3, com atividades fornecidas em unidades/mg cps (célula de peso seco). Uma unidade de ativi15 dade de nitrila hidratase refere-se à capacidade de conversão de 1 Mmol de acrilonitrila em sua amida correspondente por minuto, por miligrama de células (peso seco) a um pH de 7,0 e a uma temperatura de 30°C. Uma unidade da atividade amidase refere-se à capacidade de converter 1 pmol de acrilamida ao seu ácido correspondente por minuto, por miligrama de células (pe20 so seco) a um pH de 7,0 e a uma temperatura de 30°C. A biomassa é informada como células embaladas em g/l cpu (célula de peso úmido).

Tabela 3: Atividades enzimáticas e biomassa de células da cepa DAP 96523 de Rhodococcus rhodoehrous após a indução com asparagina

Atividade de nitrila hidratase Atividade de amidase Biomassa

_(unidades/mg cps) (unidades/mg cps)_(g/l cpu)

168 2 36

B. Essencialmente conforme descrito acima no Exemplo 3A, 25 com modificações ao meio como observado abaixo, as atividades enzimáticas e a biomassa foram avaliadas com células da cepa DAP 96523 de Rhodococcus rhodoehrous. Especialmente, YEMEA, dextrose ou maltose foram acrescentados a um meio R3A modificado, ainda contendo Hy-Cotton 7803® usado em lugar de proteose peptona N0. 3. Uma solução da 0,2 M de asparagina foi acrescentada em uma velocidade continua de 120 pl//minuto com início em t=8 horas. No fim do ciclo de fermentação, a atividade de nitrila hidratase específica de acrilonitrila, a atividade de amidase e a biomassa foram medidas. Os resultados estão sumarizados na Tabela 4. O aumento 5 do rendimento da biomassa foi observado com a adição de YEMEA, dextrose ou maltose ao meio.

Tabela 4: Atividades enzimáticas e biomassa de células da cepa DAP96523 de Rhodococcus rhodoehrous após a indução contínua com asparagina

Atividade de nitrila hidratase Atividade de amidase Biomassa

_(unidades/mg cps)_(unidades/mg cps)_(g/l cpu)_

155 6 52

C. As células da cepa DAP 96622 de Rhodococcus sp. do meio

sólido foram usadas como a fonte do inóculo de um ciclo de fermentação de 20 litros (vide Exemplo 2 para detalhes do processo de fermentação). Uma solução da 0,2 M de asparagina foi acrescentada semicontinuamente a cada

6 horas, com início em t=24, durante 50-70 minutos em uma velocidade de 2 ml/minuto. O Hy-Cotton 7803® foi usado no lugar de proteose peptona N0. 3 em um meio R3A modificado. No fim do ciclo de fermentação, a atividade de nitrila hidratase específica de acrilonitrila, a atividade de amidase e a biomassa foram medidas. Os resultados estão sumarizados na Tabela 5.

Tabela 5: Atividades enzimáticas e biomassa de células da cepa DAP 96622 de Rhodococcus sp. após a indução semicontinua com asparagina

Atividade de nitrila hidratase Atividade de amidase Biomassa

_(unidades/mg cps) (unidades/mg cps)_ (g/l cpu)

172 2 44

D. Células da cepa DAP 96622 de Rhodococcus sp. do meio sólido foram usadas como a fonte do inoculo do ciclo do fermentador de 20 litros. Uma solução da 0,2 M de asparagina foi acrescentada semicontinuamente a cada 6 horas, com início em t=12 horas, durante 12-85 minutos em uma velocidade de 2,5 ml/minuto. O Hidrolisado do Caroço de Algodão foi usado no lugar de proteose peptona N0. 3 em um meio R3A modificado. No fim do ciclo de fermentação, a atividade de nitrila hidratase específica de acrilonitrila, a atividade de amidase e a biomassa foram medidas, e os resultados estão sumarizados na Tabela 6.

Tabela 6: Atividades enzimáticas e biomassa de células da cepa

DAP 96622 de Rhodococcus sp. após a indução semicontínua com asparagina

Atividade de nitrila hidratase Atividade de amidase Biomassa

(unidades/mg cps)_(unidades/mg cps)_(g/l cpu)

165 2 57

E. Células da cepa DAP 96253 de Rhodococcus rhodoehrous congeladas previamente foram usadas como a fonte do inóculo de um ciclo 10 de fermentação de 20 litros. YEMEA, dextrose ou maltose foram acrescentados a um meio R3A modificado que ainda continha o Hy-Cotton 7803® como um substituto para o proteose peptona N0. 3. Uma solução de asparagina a 0,15 M foi acrescentada em uma velocidade contínua de 120 μΙ/minuto com início em t=8 horas. No fim do ciclo de fermentação, a atividade de 15 nitrila hidratase específica de acrilonitrila, a atividade de amidase e a biomassa foram medidas. Os resultados estão sumarizados na Tabela 7.

Tabela 7: Atividades enzimáticas e biomassa de células da cepa DAP 96523 de Rhodococcus rhodoehrous após a indução contínua com asparagina

Atividade de nitrila hidratase Atividade de amidase Biomassa

(unidades/mg cps)_(unidades/mg cps) (g/l cpu)

171 4 74

F. As células da cepa DAP 96253 de Rhodoeoceus rhodoehrous

cultivadas em meio bifásico foram usadas como a fonte de inóculo de um ciclo de fermentação de 20 litros. Um meio R3A modificado foi usado, que foi complementado pela adição de um carboidrato (isto é, YEMEA, dextrose ou maltose), e ainda contendo Hidrolisado de Caroço de Algodão no lugar de 25 proteose peptona N0. 3. Uma solução de asparagina foi a 0,15 M acrescentada em uma velocidade contínua de 1000 μΙ/minuto com início em t=10 horas. No fim do ciclo de fermentação, a atividade de nitrila hidratase específica de acrilonitrila, a atividade de amidase, a atividade de asparaginase I e a biomassa foram medidas. Os resultados estão sumarizados na Tabela 8.

Tabela 8: Atividades enzimáticas e biomassa de células da cepa DAP 96523 de Rhodococcus rhodoehrous após a indução contínua com asparagina

Atividadedenitrilahidra- Atividadedeamidase Atividadedeasparagina- Biomassa tase (unidades/mg cps) (unidades/mg cps) se I (unidades/mg cps) (g/l cpu) 159 22 16 16

G. As células da cepa DAP 96253 de Rhodococcus rhodoehrous cultivadas no meio bifásico foram usadas como fonte de inóculo de um ciclo de fermentação de 20 litros. Um meio R3A modificado foi usado, que conti10 nha maltose (no lugar da dextrose) e Hy-Cotton 7803® como um substituto da proteose peptona N0. 3. Uma solução de asparagina foi a 0,15 M acrescentada em uma velocidade contínua de 476 μΙ/minuto com início em t=8 horas. No fim do ciclo de fermentação, a atividade de nitrila hidratase, a atividade de amidase, e a biomassa foram medidas, e os resultados estão su15 marizados na Tabela 9.

Tabela 9: Atividades enzimáticas e biomassa de células da cepa DAP 96523 de Rhodococcus rhodoehrous após a indução contínua com asparagina

Atividade nitrila hidratase Atividade de amidase Biomassa

(unidades/mg cps) _(unidades/mg cps)_(g/l cpu)

137 6 35

Exemplo 4: Imobilização de células de Rhodococcus spp. em DEAE-celulose reticulada com glutaraldeído

Um processo modificado derivado dos métodos descritos na Patente norte-americana N0. 4.229.536 e em Lopez-Gallego et al. (2005) J. Biotechnol. 119:70-75 é usado para imobilizar as células de Rhodoeoceus spp. em uma matriz compreendendo DEAE-celulose reticulada por glutaraldeído. Preparação de células

As células de Rhodococcus são cultivadas em um meio de cultura apropriado (por exemplo, YEMEA-maltose + indutores, culturas bifásicas, etc.) e colhidas por centrifugação em 8.000 retações por minuto durante 10 minutos. A pélete de células resultante é ressuspenso em 100 ml da solução tampão de fosfato de 50 mm (pH 7,2) e centrifugada em 8.000 rotações por minuto durante 10 minutos. Este processo de resuspender a esfera de célu5 Ias e centrifugar em 8.000 rotações por minuto durante 10 minutos é repetido duas vezes. O peso úmido embalado (pu) da amostra final das células é observado. A atividade de uma pequena amostra de células é executada para avaliar a atividade enzimática das células inteiras.

Imobilização de Células Uma quantidade de DEAE-celulose equivalente àquela das célu

las de Rhodococcus spp. colhidas é obtida e as células e a DEAE-celulose são ressuspensas em 100 ml de H2O deionizada. Um volume de uma solução de 25% de glutaraldeído suficiente para obter uma concentração final de

0,5% é acrescentado com agitação à mistura de células/DEAE-celulose. A 15 mistura é agitada durante 1 hora, após o que 400 ml de H2O deionizada são acrescentados com mais mistura. Durante a agitação, 50% (solução em peso) de polietilenimina (PEI; MW 750.000) são adicionados. A agitação prossegue até que a floculação esteja completa. A mistura floculatada é filtrada e expulsa através de uma seringa de tamanho apropriado. As células imobili20 zadas são partidas em pequenos pedaços, secas durante a noite, e cortadas em grânulos de aproximadamente 2-3 mm antes do uso.

Exemplo 5: Imobilização das células de Rhodococcus sdd. em alginato de cálcio e endurecimento das contas de alginato de cálcio

Um processo adaptado do método descrito em Bucke (1987) "Cell Immobilization in Calcium Alginate" em Methods in Enzymology, Vol. 135(B) (Academic Press, Inc., San Diego, Califórnia; Mosbach1 ed.) é usado para imobilizar as células de Rhodoeoceus spp. no alginato de cálcio. Preparação de células

As células de Rhodococcus spp. são preparadas conforme descrito acima no Exemplo 4.

Imobilização de Células

25 g de solução de 4% de alginato de sódio são produzidos pela dissolução de 1 g de alginato de sódio em 24 ml de 50 mM de Tris-HCI (pH 7,2). 25 mg de metaperiodato de sódio são adicionados à solução de alginato e agitados a 25°C durante 1 hora ou até que o alginato esteja completamente dissolvido. As células preparadas conforme descrito acima são res5 suspensas a um volume final de 50 ml em 50 mM de Tris-HCI (pH 7,2) e então adicionadas à solução de alginato de sódio com agitação. As contas resultantes são extrudadas através de uma agulha de calibre 27 em 500 ml de uma solução de CaCI2 a 0,1 M. A agulha é geralmente colocada aproximadamente 5,08 cm (duas polegadas) acima da solução para impedir a entrada 10 do ar nas pequenas contas e para impedir a aderências das contas. As contas são curadas por 1 hora na solução de CaCI2 e as contas são então enxaguadas com água e armazenadas a 4°C em uma solução de CaCI2 a 0,1 M antes do uso.

Endurecimento das contas de alginato de cálcio compreendendo células de Rhodococcus spp.

As contas de alginato de cálcio preparadas conforme descrito acima poderão ser ainda reforçadas pela reticulação com PEI. As contas são incubadas em 2 L de PEI a 0,5% em uma solução de CaCI2 a 0,1 M (20 g de PEI de 50% em uma solução de CaCI2 da 0,1 M). O pH da solução final é 20 ajustado a 7,0 com HCI ou NaOH, se necessário e as contas são incubadas durante 24 horas. As contas então são enxaguadas com a água e armazenadas a 4°C em uma solução de CaCI2 a 0,1 M antes do uso.

Muitas modificações e outras modalidades das invenções apresentadas aqui virão à mente daquele versado na técnica a qual estas inven25 ções dizem respeito, juntamente com o benefício dos ensinamentos apresentados nas descrições precedentes. Portanto, deve ser entendido que as invenções não se limitam às modalidades específicas divulgadas e que modificações e outras modalidades deverão ser incluídas no escopo das reivindicações apensas. Embora termos específicos sejam empregados aqui, eles 30 são usados em sentido genérico e descritivo somente e não com objetivos da limitação.

Claims (46)

1. Método para retardar um processo de desenvolvimento de planta que compreende exposição de uma planta ou parte da planta a uma ou mais bactérias, em que uma ou mais bactérias são selecionadas do grupo consistindo em Rhodococcus spp., Pseudomonas ehloroaphis, Brevibacterium ketoglutamieum, e misturas das mesmas, e em que uma ou mais bactérias são expostas à planta ou parte da planta em quantidade suficiente para retardar o processo de desenvolvimento de planta.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que uma ou mais bactérias incluem Rhodoeoceus spp.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a Rhodoeoeeus spp. inclui a cepa DAP 96253 de Rhodoeoceus rhodoehrous, a cepa DAP 96622 de Rhodococcus sp., Rhodoeoceus erythropolis ou misturas das mesmas.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que uma ou mais bactérias são induzidas pela exposição a um agente de indução selecionado do grupo consistindo em asparagina, glutamina, cobalto, ureia e misturas das mesmas.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que uma ou mais bactérias são induzidas pela exposição à asparagina.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, em que uma ou mais bactérias são induzidas pela exposição à asparagina, ao cobalto e à ureia.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a planta ou parte da planta é indiretamente exposta a uma ou mais bactérias.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a planta ou parte da planta é diretamente exposta a uma ou mais bactérias.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o processo de desenvolvimento de planta é o amadurecimento da fruta ou da verdura.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a parte da planta é uma fruta.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a fruta é uma fruta climatérica.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a fruta climatérica é selecionada do grupo consistindo em bananas, pêssegos e abacates.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a fruta é uma fruta não-climatérica.

14. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a parte de planta é uma verdura.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a parte de planta é uma flor e o processo de desenvolvimento de planta é a senescência da flor.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a flor é um cravo, rosa, orquídea, onze-horas, malva, ou begônia.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o processo de desenvolvimento de planta é a queda das folhas.

18. Aparelho para retardamento do processo de desenvolvimento de uma planta compreendendo um catalisador que compreende uma ou mais bactérias selecionadas do grupo consistindo em Rhodococcus spp., Pseudomonas ehloroaphis, Brevibaeterium ketoglutamieum e misturas das mesmas, em que uma ou mais bactérias são proporcionadas em quantidade suficiente para retardar o processo de desenvolvimento da planta.

19. Aparelho de acordo com a reivindicação 18, em que uma ou mais bactérias incluem Rhodoeoceus spp.

20. Aparelho de acordo com a reivindicação 19, em que o Rhodococeus spp. inclui a cepa DAP 96253 de Rhodoeoceus rhodoehrous, a cepa DAP 96622 de Rhodoeoceus sp., Rhodoeoceus erythropolis ou misturas das mesmas.

21. Aparelho de acordo com a reivindicação 18, em que uma ou mais bactérias são induzidas pela exposição a um agente de indução selecionado do grupo consistindo em asparagina, glutamina, cobalto, ureia e misturas ddas mesmas.

22. Aparelho de acordo com a reivindicação 18, em que o processo de desenvolvimento de planta é selecionado do grupo consistindo no amadurecimento da fruta ou da verdura, na senescência da flor e na queda das folhas.

23. Aparelho de acordo com a reivindicação 18, em que uma ou mais bactérias são imobilizadas em uma matriz que compreende DEAEcelulose reticulada, uma matriz compreendendo alginato, uma matriz compreendendo carragenina, uma matriz compreendendo alginato reticulado, uma matriz compreendendo carragenina reticulada, uma matriz compreendendo poliacrilamida, ou contas de alginato de cálcio.

24. Aparelho de acordo com a reivindicação 23, em que a matriz compreende DEAE-celulose reticulada, em que a DEAE-celulose é reticulada com glutaraldeído.

25. Aparelho de acordo com a reivindicação 18, em que o catalisador está presente em um módulo de catalisador que é colocado na parte interna da, colocado sobre a, ou afixado a uma estrutura física.

26. Aparelho de acordo com a reivindicação 18, ainda compreendendo um dispositivo de controle para ajustar a exposição do catalisador a uma planta ou parte da planta.

27. Aparelho de acordo com a reivindicação 18, ainda compreendendo um dispositivo de monitoração para controlar a eficácia do catalisador no retardamento do processo de desenvolvimento de uma planta.

28. Aparelho de acordo com a reivindicação 25, emque a estrutura física é selecionada do grupo consistindo em uma película, lâmina, camada de revestimento, uma câmara com fendas, uma caixa, uma bolsa e um saco.

29. Aparelho de acordo com a reivindicação 25, em que o módulo de catalisador pode ser retirado e substituído por um segundo módulo de catalisador.

30. Aparelho de acordo com a reivindicação 25, em que mais de um módulo de catalisador é colocado na parte interna da, colocado sobre a, ou afixado à estrutura física.

31. Aparelho de acordo com a reivindicação 25, em que a estrutura física permite o fluxo de ar para o interior do módulo de catalisador.

32.Aparelho de acordo com a reivindicação 31, ainda compreendendo um elemento para controle do fluxo de ar para o interior do módulo do catalisador.

33. Aparelho de acordo com a reivindicação 25, emque a estrutura física é proporcionada como uma estrutura refrigerada.

34.Aparelho de acordo com a reivindicação 25, ainda compreendendo um elemento para controle do nível de umidade na estrutura física.

35.Aparelho de acordo com a reivindicação 25, ainda compreendendo um elemento para regulação do nível de dióxido de carbono na estrutura física.

36.Aparelho de catalisador permeável ao ar para retardar o processo de desenvolvimento de planta compreendendo: uma primeira camada; uma segunda camada que inclui um catalisador que compreende uma ou mais bactérias selecionadas do grupo consistindo em Rhodococeus spp., Pseudomonas chloroaphis, Brevibacterium ketoglutamicum e misturas da mesmas, em que uma ou mais bactérias são proporcionadas em uma quantidade suficiente para retardar o processo de desenvolvimento de planta; e uma terceira camada; em que a segunda camada está localizada entre a primeira e a terceira camadas e pelo menos uma das ditas primeira e terceira camadas proporciona integridade estrutural ao aparelho.

37. Aparelho de acordo com a reivindicação 36, em que uma ou mais bactérias incluem Rhodococcus spp.

38.Aparelho de acordo com a reivindicação 37, em que a Rhodococeus spp. inclui a cepa DAP 96253 de Rhodoeoceus rhodoehrous, a cepa DAP 96622 de Rhodococcus sp., Rhodoeoceus erythropolis ou misturas das mesmas.

39.Aparelho de acordo com a reivindicação 36, em que uma ou mais bactérias são induzidas pela exposição a um agente de indução selecionado do grupo consistindo em asparagina, glutamina, cobalto, ureia e misturas das mesmas.

40. Aparelho de acordo com a reivindicação 36, em que o processo de desenvolvimento de uma planta é selecionado do grupo consistindo em amadurecimento das frutas ou verduras, senescência das flores e queda das folhas.

41. Aparelho de catalisador da reivindicação 36, em que a dita terceira camada pode ser retirada da dita segunda camada para expor uma camada adesiva que pode ser usada para afixar o aparelho de catalisador a uma estrutura separada.

42. Aparelho de catalisador de acordo com a reivindicação 41, em que a dita segunda camada é a dita camada adesiva.

43. Aparelho de catalisador de acordo com a reivindicação 36, em que ainda compreende uma quarta camada adjacente à dita terceira camada que pode ser removida da dita terceira camada para expor uma camada adesiva que pode estar usada para afixar a estrutura do catalisador a uma estrutura separada.

44. Aparelho de catalisador de acordo com a reivindicação 43, em que a dita terceira camada é a dita camada adesiva.

45. Saco ou bolsa permeável ao ar incluindo o aparelho de catalisador como definido na reivindicação 36.

46. Método para retardar um processo de desenvolvimento de planta compreendendo a exposição de uma planta ou parte da planta a um extrato enzimático de uma ou mais bactérias selecionadas do grupo consistindo em Rhodococcus spp., Pseudomonas ehloroaphis, Brevibaeterium ketoglutamieum e misturas das mesmas, as ditas bactérias sendo induzidas por um agente de indução selecionado do grupo consistindo em asparagina, glutamina, cobalto, ureia, e misturas das mesmas e o dito extrato enzimático sendo exposto à planta ou parte da planta em uma quantidade suficiente para retardar o processo de desenvolvimento da planta.