CN103283512A - 延迟植物发育过程的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及延迟植物发育过程的方法和装置。该方法包括将植物或植物部分暴露于一种或多种酶，所述一种或多种酶选自由腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶及其混合物组成的组。所述延迟植物发育过程的装置包含催化剂，该催化剂包括一种或多种上述酶。

Description

延迟植物发育过程的方法和装置
本申请是于2008年3月26日提交的国际申请号为PCT/US2008/058286、中国国家阶段申请号为200880011249.5、发明名称为“延迟植物发育过程的生物催化剂”的原申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及延迟植物发育的方法，包括将植物或植物部分暴露于一种或多种细菌或酶。进一步提供延迟植物发育过程的装置。
发明背景
植物和植物部分中的乙烯产生被多种外部因素和应激物诱导，包括创伤、施加激素(如生长素)、厌氧条件、寒冷、热、干燥和病原侵染。还在多种植物发育过程（包括果实或蔬菜成熟、种子萌发、叶脱落和花衰老）中观察到乙烯产生增加。
植物中乙烯生物合成通常被描述为牵涉三种酶、习惯上称为"Yang循环"的酶促方案，其中S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)合成酶催化甲硫氨酸转化为S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)；1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶催化AdoMet转化为ACC；且ACC氧化酶催化ACC转化为乙烯和副产品二氧化碳和氰化氢。参见例如，Srivastava(2001)Plant Growth and Development:Hormones and Environment(植物生长和发育：激素和环境)(Academic Press,New York)对植物中乙烯生物合成和受乙烯调节的植物发育过程的总体描述。
此前的研究已确定在呼吸跃变型果实中，成熟至少部分地被乙烯生物合成的突然和显著增加所触发。尽管乙烯产生的突然爆发牵涉在呼吸跃变型果实的果实成熟过程中，但其确切机制尤其是在非呼吸跃变型果实中的确切机制还未完全理解。尽管非呼吸跃变型果实没有乙烯产生的突然爆发，但非呼吸跃变型果实仍将响应于乙烯。而且，果实、蔬菜和其它植物产品合成乙烯的量不同并且具体产品对乙烯的敏感性不同。例如，苹果表现高水平的乙烯产生和乙烯敏感性，而朝鲜蓟表现低水平的乙烯生物合成和乙烯敏感性。参见例如，在postharvest.ucdavis.edu/Produce/Storage/index.shtml(最后一次在2007年3月6日进入)的Cantwell(2001)"Properties and RecommendedConditions for Storage of Fresh Fruits and Vegetables(新鲜水果和蔬菜的性质和推荐的储存条件)"，其通过引用的方式完全并入本文。果实成熟通常导致颜色改变、果皮变软、果实糖含量和香味改变。尽管成熟最初使得果实更可食用和更有食用吸引力，该过程最终导致果实品质降低和劣化，使得其无法食用，导致显著的商业金钱损失。对于提高面临成熟的果实和其他农产品的贮存期限和延长可用于运输、储存和销售的时间，控制成熟过程是期望的。
除了呼吸跃变型果实中乙烯生物合成突然增加，成熟相关的变化还与呼吸率升高有关。在果实、蔬菜和其它植物产品，热作为呼吸的结果而产生，因此影响这些商品的贮存期限和所需的储存条件(如，冷藏)。具有较高呼吸率的植物产品(如，朝鲜蓟、切花、芦笋、椰菜、菠菜等)比具有较低呼吸率的植物产品(如，干果、枣椰子、苹果、柑桔果实、葡萄等)表现更短的贮存期限。呼吸由多种环境因素影响，包括温度、大气组成、物理应激、光、化学应激、辐射、水应激、生长调节素和病原攻击。尤其是，温度在呼吸率中起显著作用。对果实、蔬菜和其它植物产品的呼吸代谢和推荐控制的大气条件的总体描述参见例如，Kader(2001)Postharvest Horticulture Series No.22A:29-70(University of California-Davis)；在usna.usda.gov/hb66/019respiration.pdf(最后一次在2007年3月6日进入)的Saltveit(University of California-Davis)"RespiratoryMetabolism(呼吸代谢)"；和在postharvest.ucdavis.edu/Produce/Storage/index.shtml(最后一次在2007年3月6日进入)的Cantwell(2001)"Properties and RecommendedConditions for Storage of Fresh Fruits and Vegetables(新鲜水果和蔬菜的特性和推荐储存条件)"，都通过引用的方式完全并入本文。
延迟果实成熟过程的方法和组合物包括，例如，施加银盐(如，硫代硫酸银)、2,5-降冰片二烯、高锰酸钾、1-甲基环丙烯(1-MCP)、环丙烯(CP)和其衍生物。这些化合物具有显著缺陷，诸如存在重金属、气味难闻、和压缩时的爆炸性，这些缺陷使得它们不适合用于食品工业或适用性有限。也在研究通过引入限制乙烯产生的核酸序列，尤其是通过减少酶ACC合成酶或ACC氧化酶的表达而控制乙烯产生以延迟植物发育过程(如，果实成熟)的转基因方法。然而，公众对遗传改造的农产品的反应还不是完全赞成。
因此，本领域对于延迟植物发育过程的安全的方法和装置仍有显著需要。这种方法和装置可提供更好地控制果实成熟、蔬菜成熟、花衰老、叶脱落和种子萌发，并延长各种农产品(如果实、蔬菜、和切花)的贮存期限，从而允许更长距离地运输这些产品而不需要冷藏，增加产品对消费者的合意性，并减少因不合时宜地成熟和衰老的产品损失而带来的金钱消耗。
发明概述
提供延迟包括但不限于果实成熟、蔬菜成熟、花衰老和叶脱落的植物发育过程的方法。本发明方法通常包括将植物或植物部分暴露于足以延迟目标植物发育过程的量的一种或多种细菌。在本发明某些方面，细菌选自红球菌属种(Rhodococcus spp.)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chloroaphis)、酮戊二酸短杆菌(Brevibacteriumketoglutamicum)、及其混合物组成的组。用于实践本发明方法的细菌可进一步被包括例如天冬酰胺、谷氨酰胺、钴、尿素、及其混合物的诱导剂处理以诱导细菌延迟目标植物发育过程的能力。
本发明进一步提供包含催化剂的用于延迟植物发育过程的装置，所述催化剂包括一种或多种细菌，尤其是红球菌属种、绿针假单胞菌、酮戊二酸短杆菌、或其混合物。允许植物或植物部分暴露于催化剂并延迟目标植物发育过程的任何装置被本发明所包括。示例装置包括其中催化剂被固定在基质中并放在任何物理结构中、放在其上、或以其它方式附加于其的装置。设想所公开装置的各种构造并在以下更详细描述。本发明用于延迟植物发育过程的方法和装置特别有用于增加植物产品诸如果实、蔬菜和花的贮存期限和促进其长距离运输，提高消费者满意度，并减少不合时宜地成熟或衰老造成的产品损失。
附图简述
已经如此以一般术语描述了本发明，现在参考附图，附图不必按照比例绘图，且其中：
图1显示推迟果实成熟的三-层装置的非限制性描绘。外层(标为A和B)对装置提供结构完整性。如以下定义的催化剂层包含本发明的一种或多种酶且位于各外层之间。
图2A-C提供推迟果实成熟的各种装置的非限制性描绘。这些装置包含催化剂层、预期提供结构完整性的一层或多层、和预期在使用装置之前被除去的一层或多层。除去这些一层或多层可例如暴露粘合剂以将该装置连接于另一物理结构。
图3A-3B显示对推迟果实成熟的装置的非限制性描绘。该装置包含固定在一层膜上并连接于物理结构(如，适于储存/运输果实的盒)的催化剂。
图4提供对推迟果实成熟的装置的非限制性描绘。该装置包括允许插入和替换一种或多种催化剂组件元件的有槽箱结构，如以下定义的。物理结构的外层可由允许空气流入催化剂的材料构成。
发明详述
现在参考本发明的具体实施方案以及特别地参考随之提供的各附图，在下文中对本发明进行更完整的描述。实际上，本发明可以以许多不同的形式实施，而不应当理解为局限于此处所阐述的实施方案；更确切地说，提供这些实施方案使得本公开能满足适用的法律要求。正如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”、“所述”包括了多个指代物。
本说明书中词语"包含"或其语法变体应理解为意为包括所述元件、整数或步骤，或元件、整数或步骤的组，但不排除任何其它元件、整数或步骤或元件、整数或步骤的组。
本发明提供延迟目标植物发育过程的方法，包括将植物或植物部分暴露于一种或多种细菌。在具体实施方案，所述方法引申为延迟植物发育过程，包括将植物或植物部分暴露于选自红球菌属种、绿针假单胞菌、酮戊二酸短杆菌、及其混合物组成的组的一种或多种细菌，其中所述一种或多种细菌以足以延迟植物发育过程的量暴露于植物或植物部分。进一步提供延迟目标植物发育过程和实践本文所述方法的装置。可使用本发明方法和装置来例如，延迟果实/蔬菜成熟或花衰老并增加果实、蔬菜或花的贮存期限，从而便于这种植物产品的运输、分配和销售。
本文所用的"植物"或"植物部分"宽泛地定义为包括完整植物和植物的任何部分，包括但不限于果实、蔬菜、花、种子、叶、干果、胚胎、花粉、胚珠、枝、果仁、穗、穗轴、荚、茎、根、根尖、花药和类似物。在具体实施方案，植物部分是果实、蔬菜或花。在本发明某些方面，植物部分是果实，更具体地是呼吸跃变型果实，如以下更详细描述的。
本发明的方法和装置涉及延迟植物发育过程，诸如通常与乙烯生物合成增加相关的植物发育过程。"植物发育过程"意为植物或植物部分的任何生长或发育过程，包括但不限于果实成熟、蔬菜成熟、花衰老、叶脱落、种子萌发等过程。在具体实施方案，目标植物发育过程是果实或蔬菜成熟、花衰老或叶脱落，尤其是果实或蔬菜成熟。如本文定义的"延迟植物发育过程"和其语法变体是指任何减慢、中断、遏制或抑制目标植物发育过程或通常与具体植物发育过程相关的植物或植物部分的表型或基因型变化。例如，当目标植物发育过程是果实成熟时，果实成熟延迟可包括抑制通常与成熟过程相关的变化(如，如上所述的颜色变化、果皮(即子房壁)软化、糖含量增加、香味变化、果实总体降解/劣化、和果实对消费者的合意性最终减少)。本领域技术人员将理解，发生果实成熟所需的时长将根据例如，果实类型和使用的具体储存条件(如，温度、湿度、气流等)而变化。因此，"延迟果实成熟"可构成延迟1至90天、尤其是1至30天，更尤其是5至30天。评价植物发育过程诸如果实成熟、蔬菜成熟、花衰老和叶脱落延迟的方法在本领域技术人员能力范围内，并可基于例如，与未处理的植物或植物部分中的植物发育过程比较。在本发明某些方面，应用本发明方法造成的植物发育过程延迟可相对于未处理的植物或植物部分或已用已知推迟目标植物发育过程的一种或多种剂处理的植物或植物部分来评价。例如，应用本发明方法造成的果实成熟延迟可与未处理的果实或已用诸如上述抗-成熟剂处理的果实的果实成熟时间比较。
本发明延迟植物发育过程的方法通常包括将植物或植物部分暴露于一种或多种以下细菌：红球菌属种、绿针假单胞菌、酮戊二酸短杆菌、或含有这些细菌的任何组合的混合物。在一些实施方案，该一种或多种细菌包括红球菌属种，更具体地紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DAP96253菌株、红球菌属种(Rhodococcus sp.)DAP96622菌株、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、或其混合物。如本文所用，将植物或植物部分暴露于一种或多种上述细菌包括，例如，暴露于完整细菌细胞、细菌细胞裂解物、和具备酶活性的细菌提取物(即"酶提取物")。从细胞包括细菌细胞制备裂解物和酶提取物的方法是本领域中常规的。用于本发明方法和装置的一种或多种细菌在本文有时可更通常地称为"催化剂"。
根据本发明方法，一种或多种细菌以足以延迟植物发育过程的量暴露于植物或植物部分。将植物或植物部分"暴露于"本发明的一种或多种细菌包括将细菌呈递给植物或植物部分的任何方法。间接暴露方法包括，例如，将细菌或细菌混合物置于大致靠近植物或植物部分(即间接暴露)。在其它实施方案，细菌可经由紧密或直接接触而暴露于植物或植物部分。而且，如本文定义的，"足够"量的本发明的一种或多种细菌将取决于多种因素，包括但不限于，方法中使用的具体细菌、细菌暴露于植物或植物部分的形式(如，以如上所述的完整细菌细胞、细胞裂解物、或酶提取物)、细菌暴露于植物或植物部分的工具、和暴露时长。确定足以延迟目标植物发育过程的一种或多种细菌的"足够"量对本领域技术人员是常规实验事项。
尽管在本发明具体实施方案中一种或多种细菌选自红球菌属种、绿针假单胞菌、酮戊二酸短杆菌组成的组，当暴露于植物或植物部分时延迟植物发育过程的任何细菌可用于本发明方法和装置。例如，属于诺卡氏菌属(Nocardia)[参见日本专利申请号54-129190]、红球菌属[参见日本专利申请号2-470]、根瘤菌属(Rhizobium)[参见日本专利申请号5-236977]、克雷伯氏菌属(Klebsiella)[日本专利申请号5-30982]、气单胞菌属(Aeromonas)[日本专利申请号5-30983]、农杆菌属(Agrobacterium)[日本专利申请号8-154691]、芽孢杆菌(Bacillus)[日本专利申请号8-187092]、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)[日本专利申请号8-56684]、假单胞菌属(Pseudomonas)和分支杆菌属(Mycobacterium)的细菌是可根据本发明使用的微生物的非限制性实例。指定属中不是所有物种都表现相同特征。因此，可能有的属中包括通常知道包括能够表现期望活性(如，延迟具体植物发育过程诸如，例如，果实成熟的能力)的菌株，但有一个或多个种通常不表现期望活性。然而，根据本文提供的公开内容和本领域常识，进行检测以确定具体物种是否具备一种或多种期望活性对本领域技术人员是常规实验事项。
此外，根据本发明有用的细菌的具体例子包括但不限于诺卡氏菌属种、红球菌属种、紫红红球菌、克雷伯氏菌属种、气单胞菌属种、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、黄色杆菌(Xanthobacter flavas)、流黑欧文氏菌(Erwinia nigrifluens)、肠杆菌属种(Enterobacter sp.)、链霉菌属种(Streptomyces sp.)、根瘤菌属种(Rhizobiumsp.)、百脉根瘤菌(Rhizobium loti)、豌豆根杆菌(Rhizobium legminosarum)、merioti根瘤菌（Rhizobium merioti）、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(Klebsiella pneumoniae subsp.Pneumoniae)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)、绿针假单胞菌、红串假单胞菌(Pseudomonaserythropolis)、酮戊二酸短杆菌、红串红球菌、皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、和幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)。在具体实施方案，来自红球菌属的细菌，更具体地紫红红球菌DAP96253菌株(ATCC保藏号55899；1996年12月11日保藏于ATCC)、红球菌属种DAP96622菌株(ATCC保藏号55898；1996年12月11日保藏于ATCC)、红串红球菌或其混合物，用于本发明方法和装置。
在本发明的一些方面，通过暴露于合适的诱导剂或以其处理，一种或多种细菌被"诱导"以展示期望的特征(如，延迟植物发育过程诸如果实成熟的能力)。诱导剂包括但不限于天冬酰胺、谷氨酰胺、钴、尿素、或其任何混合物。在具体实施方案，细菌暴露于诱导剂天冬酰胺或以其处理，更尤其是暴露于包含天冬酰胺、钴和尿素的诱导剂混合物或以其处理。诱导剂可在培养期望的细胞期间的任何时间加入。例如，关于细菌，培养基可在开始培养细菌之前补充诱导剂。或者，细菌可在培养基上培养预先确定的时间量以生长细菌，并可在一种或多种预先确定的时间加入诱导剂以诱导细菌中期望的酶活性。此外，可在细菌完成生长后向生长培养基(或向包含预先生长的细菌的单独混合物)加入诱导剂以诱导细菌中期望的活性。
不是要限制于具体机理，"诱导"本发明的细菌可导致产生(或增加产生)一种或多种酶，诸如腈水合酶、酰胺酶、和/或天冬酰胺酶，并诱导可能在延迟目标植物发育过程中起作用的一种或多种这些酶。"腈水合酶"、"酰胺酶"和"天冬酰胺酶"包括各种生物体包括但不限于细菌、真菌、植物和动物的细胞中存在的酶家族。这种酶是本领域技术人员已知的，且各类酶具备公认的酶活性。本文所用的"酶活性"通常是指酶在诸如将一种化合物转化为另一种化合物的过程中作为催化剂的能力。具体地，腈水合酶催化腈(或氰醇)水解为相应的酰胺(或羟酸)。酰胺酶催化酰胺水解为相应的酸或羟酸。类似地，天冬酰胺酶诸如天冬酰胺酶I催化天冬酰胺水解为天冬氨酸。
在本发明某些方面，酶活性可用每质量的酶或细胞的“单位”来表示（通常基于细胞的干重，例如，单位/mg cdw）。“单位”通常指在限定的一组条件下将特定量的化合物转化为不同的化合物的能力，作为时间的函数。在具体实施方案中，1“单位”的腈水合酶活性可指在pH7.0、30℃的温度下每分钟每毫克细胞（干重）将1μmol的丙烯腈转化为其对应的酰胺的能力。相似地，1单位的酰胺酶活性可指在pH7.0、30℃的温度下每分钟每毫克细胞（干重）将1μmol的丙烯酰胺转化为其对应的酸的能力。此外，1单位的天冬酰胺酶活性可指在pH7.0、30℃的温度下每分钟每毫克细胞（干重）将1μmol的天冬酰胺转化为其对应的酸的能力。测量腈水合酶、酰胺酶活性、或天冬酰胺酶活性的检测是本领域公知的并包括例如检测游离氨。参见Fawcett和Scott(1960)J.Clin.Pathol.13:156-159，以引用的方式全文并入本文。
本发明进一步包括延迟植物发育过程的方法，包括将植物或植物部分暴露于选自腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶、或其混合物的组成的组的一种或多种酶，其中所述一种或多种酶以足以延迟植物发育过程的量或酶活性水平暴露于植物或植物部分。例如，产生、被诱导以产生、或被遗传修饰以产生一种或多种上述酶(即腈水合酶、酰胺酶、和/或天冬酰胺酶)的全细胞可用于延迟植物发育过程的方法。可选地，可从任何上述细胞分离、纯化、或半纯化腈水合酶、酰胺酶、和/或天冬酰胺酶，并以更分离的形式暴露于植物或植物部分。参见例如，Goda等人(2001)J.Biol.Chem.276:23480-23485；Nagasawa等人(2000)Eur.J.Biochem.267:138-144；Soong等人(2000)Appl.Environ.Microbiol.66:1947-1952；Kato等人(1999)Eur.J.Biochem.263:662-670，都以引用的方式整体并入本文。本领域技术人员将进一步理解，单独细胞类型可能能够产生(或被诱导或遗传修饰以产生)多于一种本发明的酶。这种细胞适于用于公开的方法和装置。
来自各种生物体的多种腈水合酶、酰胺酶和天冬酰胺酶的核苷酸和氨基酸序列公开于公众可获得的序列数据库。本领域已知的代表性腈水合酶和脂肪族酰胺酶的非限制性列表列于表1和表2以及序列表中。表1和表2中提到的"蛋白评分"提供基于质谱数据鉴定分离的蛋白的置信区间百分比(%置信区间)的概观。
表1：代表性腈水合酶的氨基酸序列信息
Figure BDA00002941351700081
表2：代表性脂肪族酰胺酶的氨基酸序列信息
Figure BDA00002941351700091
通常，能够产生或被诱导以产生腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶、或其任何组合的任何细菌、真菌、植物或动物细胞可用于实施本发明。腈水合酶、酰胺酶、和/或天冬酰胺酶可在特定生物体的细胞(如，细菌、真菌、植物细胞、或动物细胞)组成型地产生，可选地，仅在以合适的诱导剂"诱导"后细胞可产生期望的酶。"组成型地"意为指本发明的至少一种酶在特定细胞类型中持续地产生或表达。然而，其它细胞类型可能需要如上述地被"诱导"以足以延迟目标植物发育过程的量或酶活性水平表达腈水合酶、酰胺酶、和/或天冬酰胺酶。即，本发明的酶可能仅在暴露于合适的诱导剂或以其处理后产生(或以足够水平产生)。这种诱导剂是本领域已知的并列于上文。例如，在本发明某些方面，一种或多种细菌被诸如天冬酰胺、谷氨酰胺、钴、尿素、或其任何混合物、更尤其是天冬酰胺、钴和尿素的混合物的诱导剂处理。而且，如2007年1月30日提交的题目为"Induction and Stabilization of Enzymatic Activity inMicroorganisms(微生物体中诱导和稳定酶活性)"的待决美国专利第11/669,011号公开的，在补充含有酰胺的氨基酸或其衍生物的培养基中，可诱导紫红红球菌DAP96622(革兰氏阳性)或红球菌属种DAP96253(革兰氏阳性)中的天冬酰胺酶I活性。使用含有酰胺的氨基酸或其衍生物，红球菌属的其它菌株也可优先地被类似诱导以展示天冬酰胺酶I酶活性。
在本发明的其它方面，在天冬酰胺存在时产生天冬酰胺酶I活性的绿针假单胞菌(ATCC保藏号43051)、和也已经显示产生天冬酰胺酶活性的革兰氏阳性细菌酮戊二酸短杆菌(B.kletoglutamicum)(ATCC保藏号21533)用于公开的方法。表达腈水合酶、酰胺酶、和/或天冬酰胺酶的真菌细胞，诸如镰刀菌属(Fusarium)的真菌、植物细胞和动物细胞也可用于本文公开的方法和装置，作为全细胞或作为分离一种或多种上述酶的来源。
在其它实施方案，已被遗传改造以表达腈水合酶、酰胺酶、和/或天冬酰胺酶的宿主细胞可用于根据本发明方法和装置暴露于植物或植物部分以延迟植物发育过程。具体地，编码腈水合酶、酰胺酶、或天冬酰胺酶的多核苷酸(或各编码腈水合酶、酰胺酶、或天冬酰胺酶的多种多核苷酸)可通过标准分子生物学技术引入宿主细胞以产生表达本发明的一种或多种酶的转基因细胞。使用术语"多核苷酸"、"多核苷酸构建体"、"核苷酸"或"核苷酸构建体"不意为将本发明限制为包含DNA的多核苷酸或核苷酸。本领域技术人员将认识到，多核苷酸和核苷酸可包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然产生的分子和合成类似物。本发明的多核苷酸还包括所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式和类似物。
编码保持期望的酶活性(即腈水合酶、酰胺酶、或天冬酰胺酶活性)的多肽的多核苷酸的变体和片段也可用于实现本发明。"片段"意为多核苷酸的部分并因此编码相应蛋白的部分。作为酶核苷酸序列的片段的多核苷酸通常包含至少10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300或1,400个相邻核苷酸，或达全长酶多核苷酸序列中存在的核苷酸数目。多核苷酸片段将编码具有期望的酶活性的多肽并将通常编码至少15、25、30、50、100、150、200或250个相邻氨基酸，或达本发明的全长酶氨基酸序列中存在的氨基酸总数。"变体"意为指大致类似的序列。通常，本发明的具体酶序列的变体将与参考酶序列具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性，如通过标准序列比对程序确定的。本发明包括的变体多核苷酸将编码具有期望的酶活性的多肽。
如在产生转基因的细胞的上下文中使用的，术语"引入"意为指将编码腈水合酶、酰胺酶、和/或天冬酰胺酶的多核苷酸呈递给宿主细胞，尤其是微生物体诸如大肠杆菌(Escherichia coli)。在一些实施方案，多核苷酸将以序列获得进入宿主细胞的内部的方式呈递，包括其可能插入宿主细胞基因组。本发明的方法不取决于将序列引入宿主细胞的具体方法，只取决于多核苷酸获得进入至少一个宿主细胞的内部。将多核苷酸引入宿主细胞的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转染方法、瞬时转染方法、和病毒介导的方法。"稳定转染"意为指引入宿主细胞的多核苷酸构建体整合入宿主基因组并能够被其后代继承。"瞬时转染"或"瞬时表达"意为指多核苷酸被引入宿主细胞但不整合入宿主基因组。
而且，腈水合酶、酰胺酶、或天冬酰胺酶核苷酸序列可被包含于例如，质粒以引入宿主细胞。通常目标质粒包括具有确定的克隆位点、复制原点和选择标记的载体。质粒可进一步包含转录和翻译起始序列以及转录和翻译终止子。质粒还可包括通用表达盒，含有至少一个独立终止子序列、允许在真核细胞、或原核细胞或两者中复制该盒的序列(如，穿梭载体)、和对于原核和真核系统的选择标记。载体适于在原核细胞、真核细胞、或任选地两者中复制和整合。克隆、包被和表达系统和方法的一般描述，参见Giliman和Smith(1979)Gene8:81-97；Roberts等人(1987)Nature328:731-734；Berger和Kimmel(1989)Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods inEnzymology(酶学方法中分子克隆技术导言),第152卷(Academic Press,Inc.,SanDiego,California)；Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册),第1-3卷(第2版;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)；和Ausubel等人编辑(1994)Current Protocols in Molecular Biology,CurrentProtocols(分子生物学最新方案，最新方案)(Greene Publishing Associates,Inc.,和JohnWiley & Sons,Inc.,New York;1994增补)。表达本发明的一种或多种酶的转基因的宿主细胞可用于公开的方法和装置，作为全细胞或作为可从中分离本发明的一种或多种酶的生物来源。
进一步提供延迟植物发育过程并进行本发明的方法的装置。在具体实施方案，本发明包括用于延迟植物发育过程尤其是果实成熟的、包含催化剂的装置，该催化剂包括选自红球菌属种、绿针假单胞菌、酮戊二酸短杆菌、及其混合物组成的组的一种或多种细菌。紫红红球菌DAP96253菌株、红球菌属种DAP96622菌株、红串红球菌、或其混合物可用在本发明的一些方面。本发明的装置的一种或多种细菌以足以延迟如上定义的目标植物发育过程的量提供。在本发明的其它方面，催化剂包含足以延迟植物发育过程的量或酶活性水平的一种或多种酶(即腈水合酶、酰胺酶、和/或天冬酰胺酶)。用作本发明的装置中的催化剂的期望的酶的来源也在上文详细描述。例如，催化剂可以产生(或被诱导或遗传修饰以产生)本发明的一种或多种酶的全细胞形式使用或可以包括分离的、纯化、或半纯化形式的酶本身。
本发明包括的延迟植物发育过程的装置可以多种适合形式提供并可适于单次使用或多次使用(如，"可再充电的")。而且，本发明的装置可用于住宅和商业场所。例如，这种装置可并入住宅或商业冰箱中，包括在用于长距离运输果实、蔬菜或花的火车、卡车等中，或作为单独的柜用来储存或运输这种植物产品。本发明的示例性、非限制性装置在以下描述并示意于图1-4。
在具体实施方案，催化剂以固定形式提供。可使用固定催化剂的任何过程或基质，只要保持一种或多种细菌(或酶)延迟植物发育过程的能力。例如，催化剂可被固定在包含藻酸盐(如，藻酸钙)、角叉菜、DEAE-纤维素或聚丙烯酰胺的基质中。其它这种基质是本领域已知的，并可以用包括但不限于戊二醛或聚乙烯亚胺的任何适合的交联剂进一步交联以增加催化剂基质的机械强度。在本发明的一方面，催化剂固定在戊二醛交联的DEAE-纤维素基质中。催化剂，尤其是固定形式的催化剂，可进一步以"催化剂组件元件"存在。催化剂组件元件在另外的结构中包含催化剂，诸如固定的催化剂，该另外的结构例如，减少与催化剂的可能的接触、便于替换催化剂、或允许空气流经催化剂。
在一个实施方案中，基质包含藻酸盐或其盐。藻酸盐是(1-4)-连接的β-D-甘露糖醛酸盐（M）和其C-5差向异构体α-L-古洛糖醛酸盐（G）残基各自的均聚嵌段以不同序列或嵌段共价地相连在一起的线性共聚物。单体可出现在连续G残基（G嵌段）、连续M残基（M嵌段）、交替M和G残基（MG嵌段）的均聚嵌段中或者无规嵌段中。在一个实施方案中，藻酸钙用作所述基质，尤其是已用例如聚乙烯亚胺交联形成硬化藻酸钙基质的藻酸钙。该固定技术的进一步描述可在Bucke(1987)Methods inEnzymology(酶学方法),第135(B)卷(Academic Press,Inc.,San Diego,California;Mosbacn编辑)的"Cell Immobilization in Calcium Alginate(在藻酸钙中固定细胞)"中找到，在此以引用的方式并入。使用聚乙烯亚胺交联的藻酸钙的固定的示例方法还在以下实施例5中描述。在另一实施方案中，所述基质包含含有酰胺的聚合物。任何包含一个或多个酰胺基团的聚合物可根据本发明而使用。在一个实施方案中，所述基质包括聚丙烯酰胺聚合物。
通过交联可实现固定的催化剂基质的机械强度增加。例如，细胞可化学交联形成细胞凝集体。在一个实施方案中，收集的细胞用戊二醛进行交联。例如，细胞能悬浮在去离子水和戊二醛的混合物中，随后加入聚乙烯亚胺直到完成最大絮凝。所述已交联的细胞（通常为许多细胞形成的颗粒形式）可通过简单的过滤进行收获。该技术的进一步描述在Lopez-Gallego等人.(2005)J.Biotechnol.119:70-75中提供，将其在此以引用的方式整体引入。在以戊二醛交联的DEAE-纤维素中固定细胞尤其是红球菌属种的细胞的一般方案还在以下实施例4中描述。
在本发明某些方面，固定的催化剂或一个或多个催化剂组件元件放在"物理结构"中、放在其上、或附加于其。物理结构包括但不限于能够容纳一个或多个催化剂组件元件的膜、片、包被层、盒、袋、包、或有槽箱。在一些实施方案，物理结构包括适于运输或储存果实、蔬菜或花的容器。物理结构可进一步包含多于一个单独结构，所有单独结构藉以连接于中间的催化剂或催化剂组件元件。上述物理结构可任选地被外部元件冷藏或在物理结构本身内包括冷藏单元。
监测催化剂延迟目标植物发育过程的效力(如，以评估何时应替换催化剂或催化剂组件)、或测量或控制气流、含湿量/湿度、和二氧化碳水平的元件可任选地包括在本发明的装置中。延迟植物发育过程的任何装置可进一步包括允许气流流至或流经催化剂或催化剂组件元件的一个或多个元件。本领域技术人员将易于想到对本文所述装置的其它可能修饰以监测和控制催化剂、催化剂组件元件、或物理结构的大气条件(如，气流、湿度、和二氧化碳水平)。条件诸如温度、大气组成(如，相对湿度、O2和CO2水平、物理应激、光、化学应激、辐射、水应激、生长调节素和病原攻击对呼吸率起重要作用并显著影响果实、蔬菜、花和其它植物-相关产品的贮存期限。尽管储存的温度和大气条件根据果实、蔬菜或其它目标植物产品而变化，推荐的储存温度通常在约0℃至约20℃的范围，O2和CO2水平的大概范围分别为1-10%和0-20%。储存果实、蔬菜和相关植物产品通常推荐的相对湿度为约50%至约100%、尤其是85%至约95%、更具体地约90%至约95%。由于在植物产品的呼吸率和贮存期限之间有显著相关性，控制上述因素对于延迟这种产品劣化是重要的。因此，装置中可设有二氧化碳清除剂以减少二氧化碳含量。
在本发明的具体实施方案，提供延迟植物发育过程的包含多层的可透气的催化剂装置。例如，如图1所示，催化剂装置10可包括外层12和14，和位于外层12和14之间的中间催化剂层16。催化剂层16包含一种或多种细菌(如，红球菌属种、绿针假单胞菌、酮戊二酸短杆菌、及其混合物)或酶(腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶、及其混合物)，其中所述一种或多种细菌或酶以足以延迟目标植物发育过程的量提供，以及第三层。在该实施方案，一个或多个外层12和14为催化剂装置10提供结构完整性。外层12和14通常允许空气流入催化剂层16，然而在一些实施方案，具有不可透气的外层可为有利的，如，如果装置形成盒的侧面且期望不允许盒的最外层将催化剂层暴露于环境。根据本发明，催化剂装置10可设在可重复使用的或一次性的包或袋中。在一个实施方案中，催化剂层16包含红球菌属种的细胞，尤其是紫红红球菌DAP96253菌株、红球菌属种DAP96622菌株、红串红球菌、或其混合物。在本发明的装置中用作催化剂的细菌细胞可被如上所详述的一种或多种诱导剂(如，天冬酰胺、谷氨酰胺、钴、尿素、或其混合物)诱导。
图2A-2C示意根据本发明，延迟植物发育过程的可选装置。这些装置包括多层，其中一层或多层是可除去的。如图2A所示，该装置可包括可透气的结构层22和催化剂层24。可除去的层26和/或28可沿着结构层22和/或催化剂层24设置并通常预期在使用或活化催化剂之前被除去。在本发明某些方面，除去可除去的层26和28暴露便于放置或连接催化剂结构于另一物理结构的粘合剂。图2B示意可选实施方案，其中所述装置30包括两个可透气的结构层32和34、中间催化剂层36和可除去的层38。图2C示意另一实施方案，其中装置40包括两个可透气的结构层42和44、中间催化剂层46和两个可除去的层48和50。
图3A-3B示意可选实施方案60，其中所述催化剂附加于容器诸如纸板盒的内部。如图3A所示，容器的侧面62包括通过使用粘合层66与其连接的催化剂层64。可剥除的膜68可设在毗连催化剂层64以保护催化剂层免于暴露于环境。可剥除的膜68可被除去以活化催化剂层64中的催化剂，通过将催化剂暴露于设在容器中的植物部分从而延迟不期望的植物发育过程。
图3B示意在以图3A所示方式附加催化剂结构于容器内部之前的催化剂结构70。除了催化剂层64、粘合层66和可剥除的膜68，催化剂结构70包括另外的可剥除的膜72。可剥除的膜72象可剥除的膜68一样，当催化剂结构70被包装、运输或储存时保护催化剂结构70。可剥除的膜72可被除去以暴露粘合层66，以允许催化剂结构70以图3A所示方式被附加于容器内部。
图4示意包括用于容纳催化剂盒(如盒86)的两个槽82和84的催化剂结构80。催化剂盒86是可透气的并可易于插入槽84或从中取出。因此，如果期望新的催化剂盒用于催化剂结构80，催化剂盒86可易于替换。催化剂盒86包括诸如本文所述的、并优选地固定在基质中的催化剂。催化剂结构80可包括相对的可透气表面88和90（诸如筛网）以允许空气流经催化剂盒86。在可选实施方案，如本领域技术人员将理解的，催化剂结构80可仅包括一个可透气的表面、两个非相对的可透气表面或多于两个可透气的表面。尽管图4包括用于容纳催化剂盒(如盒86)的两个槽82和84，本领域技术人员将理解的是催化剂结构80可包括用于容纳盒的一个或多个槽。催化剂结构80可设在用于运输植物部分诸如果实或花的容器中或可附加于容器，如，通过使用如上述的粘合层。
本发明方法和装置可用于延迟任何目标植物或植物部分的植物发育过程。在具体实施方案，本发明的方法和装置涉及延迟成熟且该植物部分是果实(呼吸跃变型或非呼吸跃变型)、蔬菜、或经受成熟的其它植物部分。本领域技术人员将认识到"呼吸跃变型果实"在果实成熟期间展示乙烯产生的突然爆发，而通常认为"非呼吸跃变型果实"在果实成熟期间不经历乙烯生物合成的显著增加。示例性果实、蔬菜和其它目标植物产品包括但不限于：苹果、杏、比里巴（biriba）、面包果、番荔枝、费约果、无花果、番石榴、木波罗、猕猴桃、香蕉、桃、鳄梨、苹果、哈蜜瓜、芒果、甜瓜、油桃、柿子、美果榄、刺番荔枝、橄榄、木瓜、西番莲、梨、梅、番茄、甜椒、蓝莓、可可、腰果（caju）、黄瓜、葡萄柚、柠檬、来姆、胡椒、樱桃、柑橘、葡萄、菠萝、草莓、西瓜、新西兰番茄和干果。
在本发明的其它方面，该方法和装置用于延迟花衰老、萎蔫、脱落、或花瓣闭合。任何花可用于实现本发明。示例性目标花包括但不限于玫瑰、康乃馨、兰花、马齿苋、锦葵和秋海棠。切花，尤其是商业上重要的切花诸如玫瑰和康乃馨是尤其关注的。在一些实施方案，对乙烯敏感的花用于实现本发明。对乙烯敏感的花包括但不限于以下属的花：六出花属、银莲花属(Aneomone)、花烛属、金鱼草属、紫菀属、落新妇属、卡特来兰属、兰花属、大丽花属、石斛属、石竹类属、洋桔梗属（Eustoma）、小苍兰属、大丁草属、石头花属、鸢尾属、山黧豆属、百合属、补血草属、尼润属、蔷薇属、紫丁香属、郁金香属和百日草属。代表性的对乙烯敏感的花还包括以下科的花：石蒜科、葱科、铃兰科、萱草科、风信子科、百合科、兰科、番杏科、仙人掌科、桔梗科、石竹科、景天科、龙胆科、锦葵科、蓝雪科、马齿苋科、茄科、龙舌兰科(Agavacaea)、独尾草科、天门冬科、秋海棠科、忍冬科、川续断科、大戟科、豆科、唇形科、桃金娘科、柳叶菜科、虎耳草科和马鞭草科。参见例如，Van Doom(2002)Annals of Botany89:375-383；Van Doom(2002)Annals of Botany89:689-693；和在hortnet.co.nz/publications/hortfacts/hf305004.htm(最后一次在2007年3月20日进入)的Elgar(1998)"Cut Flowers and Foliage-Cooling Requirements and TemperatureManagement(切花和叶-冷却要求和温度控制)"，都通过引用的方式整体并入本文。延迟叶脱落的方法和装置也包括在本发明中。在植物、果实、蔬菜和花产业中对于调节植物发育过程诸如成熟、衰老和脱落的方法和装置存在显著的商业上的关注。
本领域技术人员将进一步认识到，本文公开的任何方法或装置可联合延迟植物发育过程，尤其是通常与乙烯生物合成增加有关的植物发育过程(如，果实/蔬菜成熟、花衰老和叶脱落)的其它已知方法和装置。而且，如上所述，在植物或植物部分被病原生物体攻击期间也观察到乙烯产生增加。因此，本发明的方法和装置可进一步用于提高植物对病原体的响应。
以下实施例作为示例而非限制被提供。
实施例
现在将具体参考多个实施例对本发明进行描述。以下实施例并非旨在限制本发明，而是提供示例性实施方案。
实施例1：暴露于诱导的红球菌属种之后延迟果实成熟
将以天冬酰胺、丙烯腈或乙腈诱导的红球菌属种的细胞固定在戊二醛-交联的DEAE-纤维素基质中。诱导细胞和制备上述基质的方法在以下详细描述。
将交联的DEAE-纤维素催化剂基质放在三个独立的纸包中(每包大约1-2克成团湿重(pack wet weight)的细胞)，每包中包含未成熟的香蕉、桃或鳄梨。作为负对照，将同样的果实置于独立的纸包而没有催化剂基质。将纸包置于室温，每天观察产品的果实成熟和降解迹象。
暴露于催化剂基质的所有产品展示果实成熟的显著延迟。尤其是，催化剂基质存在下桃的坚硬和果皮完整度保持更长时间。类似地，对于香蕉，相对于负对照褐色斑点延迟出现且坚硬保持更长时间。
实施例2：一般发酵和诱导方案
发酵过程
以下一般方案和培养基用于发酵用于其它实验的红球菌属种菌株红球菌属种DAP96622和紫红红球菌DAP96523：
发酵罐配置有测量溶解氧(DO)和pH的探测器、以及测量葡萄糖浓度(线下)的取样设备。另外的口用于加入矫正物(如，酸、碱或防沫剂)、诱导物、营养和补充物。将预先清洁的罐在原处灭菌。使用合适的基础培养基(1或1.5X)R2A或R3A。这些培养基的具体成分列于以下。在一些实验中对培养基的成分进行了某些代替。例如，(Trader's Protein,Memphis,TN)有时用于代替蛋白胨和/或酪蛋白水解物。此外，在某些实验中，使用Hy-Cotton
Figure BDA00002941351700172
(Quest International,Hoffman Estates,IL)、棉籽水解物、超滤的棉籽水解物(Marcor Devolpment Corp.,Carlstadt,NJ)代替
Figure BDA00002941351700173
(Trader's Protein,Memphis,TN)。
设定营养补充的供应方案以逐渐地以更有营养的培养基即2X YEMEA替换R2A或R3A基础培养基，2X YEMEA的成分也在以下详述。其它任选营养补充物包括麦芽糖50%(w/v)和右旋糖50%(w/v)。有时使用含有右旋糖等价物(葡萄糖、麦芽糖、和更高级多糖)的商业产品代替麦芽糖和右旋糖。
从红球菌属种DAP96622和紫红红球菌DAP96523菌株在合适的固体培养基上的培养物制备接种物并以其适当温度(如，30℃)接种。在具体实施方案，细胞生长在YEMEA琼脂平板上4-14天，优选地7天。可选地，从此前发酵运转的冷冻细胞浓缩物制备接种物。通常以发酵罐中存在浓度的20X浓度制备细胞浓缩物。此外，有时从合适的两相培养基(即，液体培养基铺在相同或不同组成的固体培养基上的组合)制备接种物。当使用两相培养基时，培养基通常在液体和固体层包含YEMEA。
对于诱导腈水合酶，在t=0小时，加入无菌的CoCl2·6H2O和尿素以达到5-200ppm的CoCl2和750mg/l-10g/l的尿素的浓度，通常优选10-50ppm的CoCl2和7500mg/l-7.5g/l的尿素。在具体实施方案，在发酵期间再次加入尿素和/或钴。例如，在4-6小时或24-30小时加入等体积的尿素和150ppm的CoCl2。除了尿素，在不同时间开始，逐步或以恒定速率加入终浓度为300-500ppm的丙烯腈/乙腈或0.1M-0.2M的天冬酰胺。当细胞质量和酶浓度可接受时发酵运转终止，通常在24-96小时。
随后以任何可接受的方法收集细胞，包括但不限于分批离心或连续离心、倾析或过滤。收集的细胞重悬于20X浓缩体积的合适的缓冲液，诸如补充有发酵过程中使用的诱导物的50mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)。随后冷冻细胞浓缩物，尤其是通过快速冷冻。冷冻的细胞储存在-20℃-80℃或液氮中备用。
描述培养基
R2A培养基(参见Reasoner和Geldreich(1985)Appl.Environ.Microbiol.49:1-7.)
Figure BDA00002941351700181
R3A培养基(参见Reasoner和Geldreich,同前)
Figure BDA00002941351700182
YEMEA培养基
Figure BDA00002941351700183
诱导
以下一般方案用于诱导红球菌属种菌株红球菌属种DAP96622和紫红红球菌DAP96523：
基于具体液体诱导物的密度，计量体积地加入易挥发的诱导物液体(如，丙烯腈/乙腈)，作为过滤灭菌的液体诱导物。在固体诱导物(如，天冬酰胺/谷氨酰胺)的情况，称重固体并直接加入培养基。将所得培养基高压灭菌。当使用过滤灭菌的液体诱导物时，加入液体诱导物之前将培养基单独高压灭菌并冷却至40℃。目标诱导物的典型浓度为：500ppm丙烯腈/乙腈；500ppm天冬酰胺/谷氨酰胺；和50ppm丁二腈。随后将细胞生长在具体培养基并进一步分析具体酶活性和生物量。
实施例3：分析亚硝酸盐水合酶、酰胺酶和天冬酰胺酶活性和天冬酰胺-诱导的红球菌属种的细胞的生物量
在红球菌属种的菌株红球菌属种DAP96622和紫红红球菌DAP96523的天冬酰胺-诱导的细胞评价腈水合酶、酰胺酶和天冬酰胺酶活性和生物量。分析培养基成分、施加方法、施加速率和向细胞提供的天冬酰胺浓度、和细胞来源的各种改变对于上述酶活性和生物量的影响。本实施例的A至G部分描述每组测试条件的细节并提供在各种具体条件下获得的酶活性和生物量的概述。
A.基本如上实施例2中所述的，使用从固体培养基收集的紫红红球菌DAP96253细胞接种的20-升发酵罐连续补充诱导物天冬酰胺(120μl/分钟的0.2M溶液)。使用Hy-Cotton
Figure BDA00002941351700194
代替上述R3A培养基中的蛋白胨#3。在发酵运转结束时，根据本领域已知的标准技术测量丙烯腈-特异性腈水合酶活性、酰胺酶活性和生物量。
腈水合酶活性、酰胺酶活性和生物量的结果提供在下表3，活性以单位/mg cdw(细胞干重)提供。一单位的腈水合酶活性涉及在每毫克细胞(干重)、7.0的pH、30℃的温度，每分钟转化1μmol的丙烯腈为其相应酰胺的能力。一单位的酰胺酶活性涉及在每毫克细胞(干重)、7.0的pH、30℃的温度，每分钟转化1μmol的丙烯酰胺为其相应酸的能力。生物量以成团细胞g/lcww(细胞湿重)报告。
表3：以天冬酰胺诱导后紫红红球菌DAP96523细胞的酶活性和生物量
Figure BDA00002941351700191
B.基本如上实施例3A中所述的，培养基变化如下指出，以紫红红球菌DAP96523细胞评价酶活性和生物量。具体地，向修改的R3A培养基加入YEMEA、右旋糖或麦芽糖，该培养基进一步含有Hy-Cotton
Figure BDA00002941351700192
代替蛋白胨#3。在t=8小时开始，以120μl/分钟的持续速率加入0.2M天冬酰胺溶液。在发酵运转结束时，测量丙烯腈-特异性腈水合酶活性、酰胺酶活性和生物量。结果概述于表4。随着向培养基加入YEMEA、右旋糖或麦芽糖，观察生物量产量的增加。
表4：以天冬酰胺连续诱导后紫红红球菌DAP96523细胞的酶活性和生物量
Figure BDA00002941351700193
C.来自固体培养基的红球菌属种DAP96622细胞用作20-升发酵运转的接种物来源(发酵过程细节参见实施例2)。在t=24小时开始，每6小时半连续地加入0.2M的天冬酰胺溶液，以2ml/分钟的速率持续50-70分钟。在修改的R3A培养基中使用Hy-Cotton代替蛋白胨#3。在发酵运转结束时，测量丙烯腈-特异性腈水合酶活性、酰胺酶活性和生物量。结果概述于表5。
表5：以天冬酰胺半连续诱导后红球菌属种DAP96622细胞的酶活性和生物量
Figure BDA00002941351700202
D.来自固体培养基的红球菌属种DAP96622细胞用作20-升发酵运转的接种物来源。在t=12小时开始，每6小时半连续地加入0.2M的天冬酰胺溶液，以2.5ml/分钟的速率持续12-85分钟。在修改的R3A培养基中使用棉籽水解物代替蛋白胨#3。在发酵运转结束时，测量丙烯腈-特异性腈水合酶活性、酰胺酶活性和生物量，结果概述于表6。
表6：以天冬酰胺半连续诱导后红球菌属种DAP96622细胞的酶活性和生物量
Figure BDA00002941351700203
E.此前冷冻的紫红红球菌DAP96253细胞用作20-升发酵运转的接种物来源。向修改的R3A培养基加入YEMEA、右旋糖或麦芽糖，该培养基进一步含有Hy-Cotton
Figure BDA00002941351700204
代替蛋白胨#3。在t=8小时开始，以120μl/分钟的持续速率加入0.15M的天冬酰胺溶液。在发酵运转结束时，测量丙烯腈-特异性腈水合酶活性、酰胺酶活性和生物量。结果概述于表7。
表7：以天冬酰胺连续诱导后紫红红球菌DAP96523细胞的酶活性和生物量
Figure BDA00002941351700205
F.生长在两相培养基上的紫红红球菌DAP96253细胞用作20-升发酵运转的接种物来源。使用通过加入糖类(即，YEMEA、右旋糖或麦芽糖)并进一步含有棉籽水解物代替蛋白胨#3而被补充的修改的R3A培养基。在t=10小时开始，以1000μl/分钟的持续速率加入0.15M的天冬酰胺溶液。在发酵运转结束时，测量丙烯腈-特异性腈水合酶活性、酰胺酶活性、天冬酰胺酶I活性和生物量。结果概述于表8。
表8：以天冬酰胺连续诱导后紫红红球菌DAP96523细胞的酶活性和生物量
Figure BDA00002941351700206
G.生长在两相培养基上的紫红红球菌DAP96253细胞用作20-升发酵运转的接种物来源。使用含有麦芽糖(代替右旋糖)和Hy-Cotton
Figure BDA00002941351700212
代替蛋白胨#3的修改的R3A培养基。在t=8小时开始，以476μl/分钟的持续速率加入0.15M的天冬酰胺溶液。在发酵运转结束时，测量丙烯腈-特异性腈水合酶活性、酰胺酶活性和生物量，且结果概述于表9。
表9：以天冬酰胺连续诱导后紫红红球菌DAP96523细胞的酶活性和生物量
Figure BDA00002941351700211
实施例4：在与戊二醛交联的DEAE-纤维素中固定红球菌属种的细胞
源自美国专利第4,229,536号和Lopez-Gallego等人(2005)J.Biotechnol.119:70-75所述方法的修饰方法用于在包含戊二醛交联的DEAE-纤维素的基质中固定红球菌属种的细胞。
制备细胞
将红球菌属细胞生长在适当培养基(如，YEMEA-麦芽糖+诱导物、两相培养、等)并在8,000rpm离心10分钟而收集。将所得的细胞小团重悬在100ml的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)并在8,000rpm离心10分钟。将重悬细胞小团和在8,000rpm离心10分钟的过程重复两次。记录最终细胞样品的成团湿重(ww)。对细胞小样品进行腈水合酶活性以评价全细胞的酶活性。
固定细胞
获得与收集的红球菌属种的细胞等量的DEAE-纤维素，将细胞和DEAE-纤维素重悬于100ml的去离子水。搅拌下将足以实现终浓度为0.5%的体积的25%戊二醛溶液加入细胞/DEAE-纤维素混合物。搅拌混合物1小时，之后加入400ml去离子水并进一步混合。搅拌时加入50%(溶液重量)的聚乙烯亚胺(PEI；MW750,000)。继续搅拌直到完成絮凝。过滤絮凝的混合物并挤压通过适当大小的注射器。固定的细胞破裂成小片、过夜干燥、并在使用前切成大约2-3mm的颗粒。
实施例5：在藻酸钙中固定红球菌属种的细胞并硬化藻酸钙微珠
从Bucke(1987)Methods in Enzymology(酶学方法),第135(B)卷(Academic Press,Inc.,San Diego,California;Mosbacn编辑)的"Cell Immobilization in Calcium Alginate(在藻酸钙中固定细胞)"中所述的方法修改的方法用于在藻酸钙中固定红球菌属种的细胞。
制备细胞
如以上实施例4所述的制备红球菌属种的细胞。
固定细胞
通过在24ml的50mM Tris-HCl(pH7.2)中溶解1g藻酸钠产生25g的4%藻酸钠溶液。向藻酸盐溶液加入25mg的高碘酸钠并在25℃搅拌1小时或直到藻酸盐完全溶解。将如上述制备的细胞重悬于50ml终体积的50mM Tris-HCl(pH7.2)，随后伴随搅拌加入到藻酸钠溶液。将所得的微珠挤压通过27号（gauge）针头到500ml的0.1M CaCl2溶液中。针头通常放置在溶液上方大约两英寸高以防止空气进入微珠并防止微珠粘附。在CaCl2溶液中固化微珠1小时，随后以水润洗微珠并在4℃、0.1MCaCl2溶液中储存备用。
硬化包含红球菌属种的细胞的藻酸钙微珠
如上述制备的藻酸钙微珠通过与PEI交联可被进一步强化。将微珠培养在2L的0.5%PEI的0.1M CaCl2溶液(20g的50%PEI在0.1M CaCl2溶液中)。如果需要，以HCl或NaOH调整最终溶液的pH到7.0，并培养微珠24小时。随后以水润洗微珠并在4℃、0.1M CaCl2溶液中储存备用。
受益于在前文描述中所呈现的教导，本发明所属领域内的技术人员会想到此处所阐述的本发明的许多改进和其他实施方案。因此，应当理解本发明并不局限于所公开的具体实施方案，改进和其他实施方案也意欲包括在所附权利要求的范围内。尽管此处采用了具体的术语，它们也仅是以普遍和描述性的意义进行使用，而并非是为了限制的目的。
Figure IDA00002941352200011
Figure IDA00002941352200021
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Figure IDA00002941352200071
Figure IDA00002941352200081

Claims (16)

1.一种延迟植物发育过程的方法，其包括将植物或植物部分暴露于一种或多种酶，其中所述一种或多种酶选自由腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶及其混合物组成的组，且其中所述一种或多种酶以足以延迟所述植物发育过程的量暴露于所述植物或植物部分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种酶由一种或多种细菌提供。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种酶从所述一种或多种细菌中分离、纯化或半纯化。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述一种或多种细菌选自由红球菌属种(Rhodococcus spp.)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chloroaphis)、酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)及其混合物组成的组。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种细菌包括红球菌属种(Rhodococcus spp.)，可选的是，其中所述红球菌属种包括紫红红球菌DAP96253菌株、红球菌属种DAP96622菌株、红串红球菌、或其混合物。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述一种或多种细菌通过暴露于选自天冬酰胺、谷氨酰胺、钴、尿素及其混合物组成的组的诱导剂而被诱导。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物或植物部分间接或直接暴露于所述一种或多种酶。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物发育过程是果实成熟、蔬菜成熟或叶脱落。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物部分是果实、蔬菜或花；可选的是，其中所述果实是呼吸跃变型果实；可选的是，所述呼吸跃变型果实选自香蕉、桃、梅、油桃、苹果、番茄、梨和鳄梨组成的组。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物部分是花且所述植物发育过程是花衰老、萎蔫、脱落或花瓣闭合，可选的是，其中所述花是康乃馨、玫瑰、兰花、马齿苋、锦葵或秋海棠。
11.根据权利要求1所述的方法，其中延迟所述植物发育过程导致增加的贮存期限或有助于所述植物或植物部分的长距离运输。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种酶被固定并放入物理结构中、放在物理结构上、或附加于物理结构。
13.一种延迟植物发育过程的装置，其包含多层，其中至少一层包含催化剂，所述催化剂包括选自由腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶及其混合物组成的组的一种或多种酶，所述催化剂放入物理结构中、放在物理结构上、或附加于物理结构，其中所述一种或多种酶以足以延迟所述植物发育过程的量提供。
14.根据权利要求13所述的装置，其中所述一种或多种酶固定在包含交联的DEAE-纤维素的基质、包含藻酸盐的基质、包含角叉菜的基质、包含聚丙烯酰胺的基质、或藻酸钙微珠中。
15.根据权利要求13所述的装置，其中所述装置是延迟植物发育过程的可透气的催化剂装置，其包括：
第一层；和
第二层，其包含催化剂，所述催化剂包括选自由腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶及其混合物组成的组的一种或多种酶，其中所述一种或多种酶以足以延迟植物发育过程的量提供；
其中所述第一层为所述装置提供结构完整性。
16.根据权利要求13～15中任一项所述的装置，其中所述物理结构为膜、片、包被层、盒、袋、包、或有槽箱。
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