JP5844395B2 - 植物発育プロセスを遅延させるための生物学に基づく触媒 - Google Patents
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Description
プを含む、植物の発育を遅延させるための方法に関する。植物発育プロセスを遅延させる
ための装置がさらに提供される。
用、嫌気性条件、冷却、熱、渇水および病原体感染を含む、種々の外部要因およびストレ
ス要因によって誘導される。果実または野菜の成熟、種子発芽、落葉、および花の老化を
含む、種々の植物発育プロセス中には、さらなるエチレン産生も観察される。
れる、3つの酵素が関係する酵素スキームとして示され、S−アデノシル−L−メチオニ
ン(SAM)シンターゼは、メチオニンのS−アデノシル−L−メチオニン(AdoMe
t)への変換を触媒し、1−アミノシクロプロパン−1−カルボン酸(ACC)シンター
ゼは、AdoMetのACCへの変換を触媒し、ACCオキシダーゼは、ACCのエチレ
ンおよび副産物の二酸化炭素およびシアン化水素への変換を触媒する。例えば、植物にお
けるエチレン生合成およびエチレンによって調節される植物の発育プロセスの概要につい
ては、Srivastava(2001) Plant Growth and Dev
elopment:Holmons and Environment (Academ
ic Press,New York)を参照されたい。
増加によって、少なくとも部分的に、成熟が誘導されることを証明した。エチレン産生の
突発は、クライマクテリック型果実の果実成熟プロセスに関係づけられているが、特に非
クライマクテリック型果物においては、その厳密な機構は完全には分かっていない。非ク
ライマクテリック型果実にはエチレン産生の突発は存在しないが、非クライマクテリック
型果実はエチレンに反応する。さらに、果実、野菜、および他の植物産生物間で、合成さ
れるエチレンの量、そしてまた、特定の産生物のエチレンに対する感度が異なる。例えば
、リンゴは、高レベルのエチレン産生およびエチレン感度を示すが、チョウセンアザミは
、低レベルのエチレン産生およびエチレン感度を示す。例えば、postharvest
.ucdavis.edu/Produce/Storage/index.shtml
(最終アクセス日、2007年3月6日)の、Cantwell(2001)「Prop
erties and Recommended Conditions for St
orage of Fresh Fruits and Vegitables」を参照
されたく、参照することによりその全体が本願明細書に組み込まれる。果実の成熟は、一
般的に、色の変化、果皮の軟化、果実の糖含量および風味の変化をもたらす。成熟は、最
初のうちは果実をより食用に適した魅力的なものにするが、そのプロセスは、最終的に、
果実品質の劣化および変質をもたらし、消費には向かないものにしてしまい、大幅な商業
の財政的損失につながる。成熟プロセスの制御は、成熟を受ける果実および他の農産物の
保管寿命の改善、および輸送、貯蔵、および販売が可能な時間の延長に望ましい。
変化は、呼吸速度の上昇にも関連する。果実、野菜、および他の植物産生物の呼吸の結果
として熱が産生され、結果的には、これらの商品の保管寿命および必要な貯蔵条件(例え
ば、冷蔵)に影響を与える。呼吸速度が速い植物産生物(例えば、チョウセンアザミ、切
り花、アスパラガス、ブロッコリ、ホウレンソウ等)は、低呼吸速度のもの(例えば、木
の実、ナツメヤシ、リンゴ、柑橘類の果実、ブドウ等)よりも短い保管寿命を呈する。呼
吸は、温度、大気組成、物理的ストレス、光、化学的ストレス、放射線、水ストレス、成
長調節物質、および病原体の攻撃を含む、多数の環境要因によって影響を受ける。特に、
温度は、呼吸速度において重要な役割を果たす。果実、野菜、および他の植物産生物に関
する呼吸代謝および推奨される制御大気条件の概要については、例えば、Kader(2
001) Postharvest Horticulture Series No.
22A:29−70(University of California−Davis
);usna.usda.gov/hb66/019respiration.pdf(
最終アクセス日、2007年3月6日)の、Saltveit(University
of California−Davis)「Respiratory Metabol
ism」、およびpostharvest.ucdavis.edu/Produce/
Storage/index.shtml(最終アクセス日、2007年3月6日)の、
Cantwell(2001) 「Properties and Recommend
ed Conditions for Storage of Fresh Fruit
s and Vegitables」を参照されたく、参照することによりそれらの全体
が本願明細書に組み込まれる。
オ硫酸銀)、2,5−ノルボルナジエン、過マンガン酸カリウム、1−メチルシクロプロ
パン(1−MCP)、シクロプロパン(CP)、およびその誘導体の適用を含む。これら
の化合物には、重金属の存在、悪臭、および圧縮時の爆発性等の、重大な不利な点があり
、該化合物を食品業界では受け入れられないもの、または適用性が限られたものにする。
エチレン産生を制限する核酸配列を導入することによって、特に、ACCシンターゼまた
はACCオキシダーゼ酵素の発現を削減することによって、植物発育プロセス(例えば、
果実の成熟)を遅延させるように、エチレン産生を制御するための遺伝子組み換え手法も
調査中である。しかしながら、遺伝子が組み換えられた農産物に対する大衆の反応は、全
てが好意的なわけではない。
には、重大な必要性が残されたままである。このような方法および装置は、果実の成熟、
野菜の成熟、花の老化、落葉、および種子発芽のより良好な制御を提供すること、ならび
に種々の農産物(例えば、果実、野菜、および切り花)の保管寿命を延ばすことができ、
それによって、冷蔵を必要とせずにこれらの産生物の輸送距離をより長くすることが可能
となり、産生物の消費者に対する望ましさを高め、また、尚早の成熟および老化に起因す
る産生物損失に関連する財政的コストを削減する。
物発育プロセスを遅延させるための方法が提供される。本発明の方法は、概して、植物ま
たは植物部分を、関心の植物発育プロセスを遅延させるのに十分な量の1つ以上のバクテ
リアに露出するステップを含む。本発明の特定の態様において、バクテリアは、ロドコッ
カス種、シュードモナス−クロロラフィス、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、お
よびそれらの混合物から成る群より選択される。本方法の実行時に使用されるバクテリア
は、関心の植物発育プロセスを遅延させるバクテリアの能力を誘導するように、例えば、
アスパラギン、グルタミン、コバルト、尿素、およびそれらの混合物を含む、誘導剤でさ
らに処理することができる。
ロラフィス、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、またはその混合物を含む触媒を備
える、植物発育プロセスを遅延させるための装置を提供する。植物または植物部分の触媒
への露出を可能にし、関心の植物発育プロセスを遅延させる、あらゆる装置が、本発明に
よって包含される。例示的装置は、触媒が、マトリクス内に固定され、あらゆる物理的構
造体内に配置されるか、その上に配置されるか、またはそれに取り付けられるものを含む
。以下に、開示される装置の種々の構成が想定され、より詳細に記述される。植物発育プ
ロセスを遅延させるための本発明の方法および装置は、果実、野菜、および花等の植物産
生物の、保存期間の延長および長距離輸送の円滑化、消費製品の満足度の改善、および尚
早の成熟または老化によって生じる産生物損失を削減するといった、特定の用途を見出す
。
必ずしも原寸に比例して描かれたものではない。
を参照して、本発明をより完全に記述する。実際には、本発明は、多くの異なる形態で具
体化することができ、本願明細書に記載される実施形態に制限されるものと解釈されるべ
きではない。むしろ、これらの実施形態は、適用される法律要件を本開示が満たすように
提供される。本願明細書および添付の請求項で使用する場合、単数形「a」、「an」、
および「the」は、文脈が別途明確に指示していない限り、複数の指示対象を含む。
た要素、整数またはステップ、または要素群、複数の整数またはステップを包含するが、
他のいかなる要素、整数またはステップ、または要素群、複数の整数またはステップの除
外も暗示しないことを理解されるであろう。
植物発育プロセスを遅延させるための方法を提供する。特定の実施形態においては、植物
または植物部分を、ロドコッカス種、シュードモナス−クロロラフィス、ブレビバクテリ
ウム−ケトグルタミカム、およびそれらの混合物から成る群より選択される、1つ以上の
バクテリアに露出させるステップを含む、植物発育プロセスを遅延させる方法が導き出さ
れ、1つ以上のバクテリアが、植物発育プロセスを遅延させるのに十分な量で、植物また
は植物部分に露出される。関心の植物発育プロセスを遅延させるための、および本願明細
書に記述される方法を実行するための装置が、さらに提供される。本発明の方法および装
置は、例えば、果実/野菜の成熟または花の老化を遅延させるように、および果実、野菜
、または花の保存期間を延ばすように使用することができ、それによって、このような植
物産生物の輸送、配達、および販売を容易にする。
野菜、花、種子、葉、木の実、胚、花粉、胚珠、枝、実、穂、穂軸、外皮、茎、根、根端
、葯等を含むが、これらに限定されない、あらゆる植物部分を含むように広く定義される
。特定の実施形態では、植物部分は、果実、野菜、または花である。本発明の特定の態様
において、以下に詳述するように、植物部分は、果実、より具体的にはクライマクテリッ
ク型果実である。
等の、植物発育プロセスを遅延させることを目的とする。「植物発育プロセス」は、果実
の成熟、野菜の成熟、花の老化、落葉、種子発芽等を含むが、これらに限定されない、植
物または植物部分のあらゆる成長または発育プロセスを意味することを意図したものであ
る。特定の実施形態において、関心の植物発育プロセスは、果実または野菜の成熟、花の
老化、または落葉、より特定すると果実または野菜の成熟である。本願明細書に定義され
る「植物発育プロセスを遅延させる」およびその文法的変形は、関心の植物発育プロセス
のあらゆる減速、中断、抑制、または阻害、あるいは、一般的に特定の植物発育プロセス
に関連する植物または植物部分に対する表現型または遺伝子型の変化を指す。例えば、関
心の植物発育プロセスが果実の成熟である時には、果実の成熟の遅延は、概して、成熟プ
ロセス(例えば、上述のように、色の変化、果皮(例えば、子房壁)の軟化、糖含量の増
加、風味の変化、果実の全般的な劣化/変質、および消費者に対する果実の望ましさの減
少)に関連する、変化の阻害を含み得る。当業者は、果実が成熟するのに必要な時間の長
さは、例えば、果実の種類および利用される特定の貯蔵条件(例えば、温度、湿度、空気
流等)に依存して変化することを認識するであろう。したがって、「果実の成熟を遅延さ
せる」ことは、1〜90日、特に1〜30日、より特定すると5〜30日の遅延となる。
果実の成熟、野菜の成熟、花の老化、および落葉等の植物発育プロセスの遅延を評価する
ための方法は、当業者の日常的な能力に十分含まれ、例えば、未処理の植物または植物部
分における植物発育プロセスとの比較に基づき得る。本発明の特定の態様において、本方
法の実行によって生じる植物発育プロセスの遅延は、未処理の植物または植物部分と、ま
たは関心の植物発育プロセスを遅らせることが知られている1つ以上の薬剤で処理した植
物または植物部分とに対して、相対的に評価することができる。例えば、本発明の方法の
実践から生じる果実の成熟の遅延は、未処理の果実、または上述したような抗成熟剤によ
って処理した果実の果実成熟時間と比較し得る。
十分な量で、植物または植物部分に露出される。本発明のバクテリアのうちの1つ以上に
植物または植物部分を「露出する」ステップは、植物または植物部分にバクテリアを提供
するためのあらゆる方法を含む。間接的な露出方法は、例えば、バクテリアまたはバクテ
リアの混合物を、一般的な近さで植物または植物部分に配置する(すなわち、間接的な露
出)ステップを含む。他の実施形態では、バクテリアは、植物または植物部分のより近く
に、または直接的な接触を介して露出され得る。さらに、本願明細書に定義されるように
、本発明の1つ以上のバクテリアの「十分な」量は、本方法で利用される特定のバクテリ
ア、バクテリアが(例えば、上述のように、無傷の細菌細胞、細胞溶解物、または酵素抽
出物として)植物または植物部分に露出される形態、バクテリアが植物または植物部分に
露出される方法、および露出時間の長さを含むが、これに限定されない、種々の要因に依
存する。それは、当業者にとって、関心の植物発育プロセスを遅延させるのに必要な1つ
以上のバクテリアの「十分な」量を判定することは、日常的実験となるであろう。
ナス−クロロラフィス、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、およびそれらの混合物
から成る群より選択されるが、植物または植物部分に露出された時に、植物発育プロセス
を遅延させるあらゆるバクテリアを、本方法および装置に使用することができる。例えば
、ノカルジア属[日本国特許出願第54−129190号を参照されたい]、ロドコッカ
ス[日本国特許出願第2−470号を参照されたい]、リゾビウム[日本国特許出願第5
−236977号を参照されたい]、クレブシエラ[日本国特許出願第5−30982号
]、アエロモナス[日本国特許出願第5−30983号]、アグロバクテリウム[日本国
特許出願第8−154691号]、バチルス[日本国特許出願第8−187092号]、
シュードノカルディア[日本国特許出願第8−56684号]、シュードモナス、および
マイコバクテリウムに属するバクテリアは、本発明に従って使用することができる微生物
の限定的でない例である。所与の属内の全ての種が、同じ特性を呈し得るというわけでは
ない。したがって、所望の活性(例えば、果実の成熟等の特定の植物発育プロセスを遅延
させる能力)を呈することができる株を含むが、概して所望の活性を呈さない1つ以上の
種を有することが一般に知られている、属を有することが可能である。しかしながら、本
願明細書に提供される開示および従来技術の一般知識に照らして、当業者にとって、特定
の種が所望の活性のうちの1つ以上を有するかどうかを判定するアッセイを実行するのは
、日常的実験となるであろう。
これによる処理によって、所望の特徴(例えば、果実の成熟等の植物発育プロセスを遅延
させる能力)を呈するように「誘導される」。誘導剤には、アスパラギン、グルタミン、
コバルト、尿素またはそのあらゆる混合物が挙げられるが、これに限定されない。特定の
実施形態において、バクテリアは、アスパラギンの誘導剤、より具体的には、アスパラギ
ン、コバルト、および尿素を含む誘導剤の混合物に露出されるか、またはこれによって処
理される。誘導剤は、所望の細胞の培養中にいつでも添加することができる。例えば、バ
クテリアに関して、培地は、バクテリアの培養を開始する前に、誘導剤を補充することが
できる。代替として、バクテリアは、バクテリアを成長させるように、所定の期間、媒質
上で培養することができ、誘導剤は、バクテリアに所望の酵素活性を誘導するように、1
回以上の所定の回数添加することができる。さらに、誘導剤は、バクテリアの成長が完了
した後に、バクテリアの所望の活性を誘導するように、成長媒質に(または予め成長させ
たバクテリアを含む別個の混合物に)添加することができる。
テップは、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、および/またはアスパラギナーゼ等の1
つ以上の酵素の産生(または産生の増加)をもたらし得、これらの酵素のうちの1つ以上
の誘導は、関心の植物発育プロセスを遅延させる役割を果たし得る。「ニトリルヒドラタ
ーゼ」「アミダーゼ」、および「アスパラギナーゼ」は、バクテリア、菌類、植物、およ
び動物を含むが、これに限定されない、種々の有機体からの細胞内に存在する一群の酵素
を含む。このような酵素は、当業者によく知られており、各酵素類は、認識された酵素活
性を有する。「酵素活性」は、本願明細書で使用する場合、概して、酵素が、ある化合物
を他の化合物に変換する等の、プロセスにおいて触媒として機能する酵素の能力を指す。
具体的には、ニトリルヒドラターゼは、ニトリル(またはシアノヒドリン)の、対応する
アミド(またはヒドロキシ酸)への加水分解を触媒する。アミダーゼは、アミドの対応す
る酸またはヒドロキシ酸への加水分解を触媒する。同様に、アスパラギナーゼI等のアス
パラギナーゼ酵素は、アスパラギンのアスパラギン酸への加水分解を触媒する。
mg cdwに基づいて)酵素または細胞の質量あたりの「単位」という表現で表すこと
ができる。「単位」は、概して、時間の関数として、指定された一連の条件下で、特定の
量の化合物を、異なる化合物に変換する能力を指す。特定の実施形態において、1「単位
」のニトリルヒドラターゼ活性は、1μmolのアクリロニトリルを、7.0のpHおよ
び30℃の温度で、1分あたり、細胞1ミリグラム(乾燥重量)につき、その対応するア
ミドに変換する能力に関連させることができる。同様に1単位のアミターゼ活性は、1μ
molのアクリルアミドを、7.0のpHおよび30℃の温度で、1分あたり、細胞1ミ
リグラム(乾燥重量)につき、その対応する酸に変換する能力に関連させることができる
。さらに、1単位のアスパラギナーゼ活性は、1μmolのアスパラギンを、pH7.0
および温度30℃で、1分あたり、細胞1ミリグラム(乾燥重量)につき、その対応する
酸に変換する能力に関連させることができる。ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ活性、
またはアスパラギナーゼ活性を測定するためのアッセイは、当技術分野において知られて
おり、例えば、遊離アンモニアの検出を含む。Faecett and Scott(1
960) J.Clin.Pathol.13:156−159を参照されたく、参照す
ることによりその全体が本願明細書に組み込まれる。
はそれらの混合物から成る群より選択される1つ以上の酵素に露出するステップを含む、
植物発育プロセスを遅延させる方法であって、植物発育プロセスを遅延させるのに十分な
量または酵素活性レベルの1つ以上の酵素が、植物または植物部分に露出される方法が、
本発明によってさらに包含される。例えば、上述の酵素(すなわち、ニトリルヒドラター
ゼ、アミダーゼ、および/またはアスパラギナーゼ)のうちの1つ以上を産生する、産生
するように誘導される、または産生するように遺伝子が組み換えられた細胞全体が、植物
発育プロセスを遅延させる方法において使用され得る。代替として、ニトリルヒドラター
ゼ、アミダーゼ、および/またはアスパラギナーゼは、上述の細胞のうちのいずれかから
単離、精製、または半精製されて、より単離された形態で植物または植物部分に露出され
得る。例えば、Goba et al.(2001) J.Biol.Chem.276
:23480−23485;Nagasawa et al.(2000) Eur.J
.Biochem.267:138−144;Soong et al.(2000)
Appl.Environ.Microbiol.66:1947−1952;Kato
et al.(1999) Eur.J.Biochem.263:662−670を
参照されたく、それらの全ては、参照することによりそれらの全体が本願明細書に組み込
まれる。当業者は、単一の細胞型が、本発明の2つ以上の酵素を産生する(または産生す
るように、誘導する、あるいは遺伝子を組み換える)ことができ得ることをさらに認識さ
れるであろう。そのような細胞は、開示された方法および装置での使用に好適である。
パラギナーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、公的に入手可能な配列データベース
に開示されている。当技術分野において知られている代表的なニトリルヒドラターゼおよ
び脂肪族アミダーゼの限定的でないリストを、表1および2、ならびに配列表に記載する
。表1および2に関する「タンパク質スコア」は、質量分光データに基づいた、単離タン
パク質同定における信頼区間のパーセンテージ(信頼区間%)の概要を提供する。
の組み合わせを産生すること、または産生するように誘導することができる、あらゆる細
菌、真菌、または動物細胞が、本発明の実行において使用されて得る。ニトリルヒドラタ
ーゼ、アミダーゼ、および/またはアスパラギナーゼは、特定の有機体(例えば、バクテ
リア、真菌、植物細胞、または動物細胞)から、細胞内で構成的に産生されて得、または
代替として、細胞は、好適な誘導剤による「誘導」を行うだけで、所望の単一または複数
の酵素を産生し得る。「構成的に」とは、本発明の少なくとも1つの酵素が、継続的に産
生される、または特定の細胞型で発現されることを意味することを意図している。しかし
ながら、他の細胞型は、上述のように、関心の植物発育プロセスを遅延させるのに十分な
量または細胞活性レベルで、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、および/またはアスパ
ラギナーゼを発現するように「誘導」される必要があり得る。すなわち、本発明の酵素は
、好適な誘導剤への露出、またはこれによる処理を行なった後にのみ産生され(または十
分なレベルで産生され)得る。このような誘導剤は、当技術分野において知られており、
上記に概説されている。例えば、本発明の特定の態様において、1つ以上のバクテリアは
、アスパラギン、グルタミン、コバルト、尿素、またはそのあらゆる混合物、より具体的
には、アスパラギン、コバルト、および尿素の混合物等の誘導剤によって処理される。さ
らに、2007年1月30日に出願された、係属中の米国特許出願第11/669,01
1号、名称「Induction and Stabilization of Enz
ymatic Activity in Microorganisms」に開示されて
いるように、アスパラギナーゼI活性は、アミノ酸を含有するアミド、またはその誘導体
を補充した媒質において、ロドコッカス−ロドクロウスDAP 96622(グラム陽性
)、またはロドコッカス種DAP 96253(グラム陽性)内に誘導することができる
。他のロドコッカス株も同様に、アミノ酸を含有するアミドまたはその誘導体を利用して
、アスパラギナーゼI酵素活性を呈するように、選択的に誘導することができる。
ュードモナス−クロロラフィス(ATCC寄託番号43051)、および同じくアスパラ
ギナーゼ活性の産生を示したグラム陽性バクテリアである、B.kletoglutam
icum(ATCC寄託番号21533)が、開示された方法で使用される。フザリウム
属、植物細胞、および動物細胞からのもの等の、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、お
よび/またはアスパラギナーゼを発現する真菌細胞もまた、細胞全体として、または上述
の酵素のうちの1つ以上が単離される源として、本願明細書に開示されている方法および
装置において使用され得る。
パラギナーゼを発現するように遺伝子を組み換えた宿主細胞は、植物の発育プロセスを遅
延させるための本方法および装置に従って、植物または植物部分への露出に使用すること
ができる。具体的には、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、またはアスパラギナーゼを
符号化するポリヌクレオチド(または、それぞれが、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ
、またはアスパラギナーゼを符号化する、複合ポリヌクレオチド)を、本発明の酵素のう
ちの1つ以上を発現する遺伝子組み換え細胞を産生するように、標準的な分子生物学技術
によって、宿主細胞内に誘導することができる。「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオ
チド構成体」、「ヌクレオチド」、または「ヌクレオチド構成体」という用語の使用は、
本発明を、DNAを含むポリヌクレオチドまたはヌクレオチドに制限することを意図して
いない。当業者は、ポリヌクレオチドおよびヌクレオチドが、リボヌクレオチド、および
リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの組み合わせを含むことができることを
認識されるであろう。このようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、
天然分子および合成類似体の両者を含む。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖形態、二
本鎖形態等を含むが、これらに限定されない、全ての配列形態も包含する。
ゼ活性)を維持するポリペプチドを符合化するポリヌクレオチドの変異体および断片はま
た、本発明の実行において使用され得る。「断片」は、ポリヌクレオチドの一部分を意図
したものであり、したがって、対応するタンパク質の一部分も符号化する。酵素ヌクレオ
チド配列の断片であるポリヌクレオチドは、概して、少なくとも10、15、20、50
、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、
550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,20
0、1,300、または1,400の連続するヌクレオチド、または最高で完全長までの
酵素ポリヌクレオチド配列内に存在するヌクレオチド数を含む。ポリヌクレオチド断片は
、所望の酵素活性を有するポリペプチドを符合化し、概して、少なくとも15、25、3
0、50、100、150、200、または250の連続するアミノ酸、または最高で本
発明の完全長の酵素アミノ酸内に存在するアミノ酸の総数までを符号化する。「変異体」
とは、実質的に類似した配列を意味することを意図している。概して、本発明の特定の酵
素配列の変異体は、標準的な配列整列プログラムによって決定される、基準酵素配列に対
して、少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%
、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%
、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性を有する。本発明によって包含される変
異体ポリヌクレオチドは、所望の酵素活性を有するポリペプチドを符合化する。
細胞、特に大腸菌等の微生物に、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼおよび/または、ア
スパラギナーゼを符合化するポリヌクレオチドを提供することを意味することを意図する
。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム内へのその潜在的挿
入を含む、配列が宿主細胞の内部を利用するような様態で提供される。本発明の方法は、
配列を宿主細胞内に導入するための特定の方法に依存せず、ポリヌクレオチドが、少なく
とも1つの宿主細胞の内部に接近するに過ぎない。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入す
るための方法は、当技術分野においてよく知られており、安定なトランスフェクション法
、過渡的なトランスフェクション法、およびウイルス媒介性の方法を含むが、これらに限
定されない。「安定なトランスフェクション」とは、宿主細胞内に導入されるポリヌクレ
オチド構成体が、宿主のゲノム内に統合され、その子孫によって継承できることを意味す
ることを意図している。「過渡的なトランスフェクション」または「過渡的な発現」とは
、ポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入されるが、ホストのゲノム内に統合されないこと
を意味することを意図している。
列は、例えば、宿主細胞内へ導入するためのプラスミド上に含有され得る。代表的な関心
のプラスミドは、画定されたクローニング部位、複製開始点、および選択可能な標識を有
するベクターを含む。プラスミドは、転写および翻訳開始配列と、転写および翻訳ターミ
ネータと、をさらに含むことができる。プラスミドはまた、少なくとも1つの独立したタ
ーミネータ配列と、真核生物、原核生物、または両者でのカセットの複製を可能にする配
列と、原核および真核生物系両者の選択標識と、を含有する遺伝子発現カセットも含むこ
とができる。ベクターは、原核生物、真核生物、または最適には両者の複製および統合に
好適である。クローニング、パッケージング、および発現系および方法の概要に関しては
、Giliman and Smith(1979) Gene 8:81−97;Ro
berts et al.(1987) Nature 328:731−734;Be
rger and Kimmel(1989) Guide to Molecular
Cloning Techniques,Methods in Enzymolog
y,Vol.152(Academic Press,Inc.,San Diego,
California);Sambrook et al.(1989) Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual,Vols.1−3
(2d ed;Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss,Plainview,New York);およびAusbel et al.,
eds.(1994) Current Protocols in Molecula
r Biology,Current Protocols(Greene Publi
shing Associates,Inc.,およびJohn Wiley&Sons
,Inc.,Newyork;1994年追補)を参照されたい。本発明の酵素のうちの
1つ以上を発現する遺伝子組み換え宿主細胞は、細胞全体として、または本発明の1つ以
上の酵素を単離することができる生物学的源として、開示された方法および装置において
使用され得る。
形式で提供され得、また、単回使用または複数回使用(例えば、「再充電可能」)に適切
なものであり得る。さらに、本発明の装置は、住居および商業環境の両方での使用を見出
す。例えば、このような装置は、住居または商業用冷蔵庫内に統合すること、果実、野菜
、または花の長距離輸送のために、列車、トラック等の中に含めること、またはこのよう
な植物産生物の貯蔵または輸送のための独立型キャビネットとして使用することができる
。例示的な、本発明の限定的でない装置を、以下および図1〜4に示す。
らゆるプロセスまたはマトリクスは、植物発育プロセスを遅延させる1つ以上のバクテリ
ア(または酵素)の能力が維持される限り、使用され得る。例えば、触媒は、アルギン酸
(例えば、アルギン酸カルシウム)、カラギーン、DEAEセルロース、またはポリアク
リルアミドを含むマトリクス内に固定され得る。他のこのようなマトリクスは、当技術分
野においてよく知られており、さらに、触媒マトリクスの機械的強度を増加させるように
、グルタルアルデヒドまたはポリエチレンイミンを含むが、これに限定されない、あらゆ
る適切な架橋剤で架橋され得る。本発明の一態様において、触媒は、グルタルアルデヒド
架橋DEAEセルロースマトリクス内に固定される。触媒、特に固定化形態の触媒は、さ
らに、「触媒モジュール要素」として提供され得る。触媒モジュール要素は、例えば、触
媒との潜在的な接触を削減する、触媒の交換を容易にする、または触媒全体の空気流を可
能にする、さらなる構造体内に、固定化触媒等の触媒を備える。
異なる配列またはブロック内で互いに共有結合される、それぞれ、(1−4)リンクβ−
D−マンヌロネート(M)のホモポリマーおよびそのC−5エピマーα−L−グルロネー
ト(G)残基との線状コポリマーである。モノマーは、連続するG残基(Gブロック)、
連続するM残基(Mブロック)、交互するMおよびG残基(MGブロック)のホモポリマ
ーブロック、またはランダムに編成されたブロックで見ることができる。一実施形態にお
いて、アルギン酸カルシウムは、強化アルギン酸カルシウム基質を形成するように、基質
として、より具体的には、ポリエチレンイミン等で架橋されたアルギン酸カルシウムとし
て使用される。このような固定化技術の記述は、Bucke(1987)「Cell I
mmobilization in Calcium Alginate」in Met
hods in Enzymology,Vol.135(B)(Academic P
ress,Inc.,San Diego,California;Mosbach,e
d.)に見出すことができ、参照することにより本願明細書に組み込まれる。ポリエチレ
ンイミン架橋アルギン酸カルシウムを使用する、例示的な固定化方法は、下記の実施例5
にも記載されている。別の実施形態において、マトリクスは、アミド含有ポリマーを含む
。1つ以上のアミド基を含むあらゆるポリマーを、本発明に従って使用することができる
。一実施形態において、基質は、ポリアクリルアミドポリマーを含む。
えば、細胞は、細胞の凝集を形成するように、化学的に架橋することができる。一実施形
態において、採取される細胞は、グルタルアルデヒド使用して架橋される。例えば、細胞
は、脱イオン水とグルタルアルデヒドとの混合物中に懸濁し、その後、最大凝集が達成さ
れるまで、ポリエチレンイミンを添加することができる。架橋細胞(一般的に、多数の細
胞で形成される粒子の形態)は、単純な濾過によって採取することができる。このような
技術のさらなる説明は、Lopez−Gallego et al.(2005) J.
Biotechnol.119:70−75に提供されており、参照することによりその
全体が本願明細書に組み込まれる。グルタルアルデヒドで架橋したDEAEセルロースに
おける、細胞、特にロドコッカス種細胞の固定化のための一般プロトコルも、下記の実施
例4に概説される。
物理的構造体」内に配置されるか、その上に配置されるか、またはそれに取り付けられる
。物理的構造体には、1つ以上の触媒モジュール要素を保持することができる、フィルム
、シート、被覆層、箱、ポーチ、バッグ、およびスロット付きチャンバが挙げられるが、
これらに限定されない。特定の実施形態において、物理的構造体は、果実、野菜、または
花の輸送または貯蔵に好適な容器を備える。物理的構造体は、2つ以上の個々の構造体を
さらに備えてもよく、それによって、個々の構造体の全てが、中央の触媒または触媒モジ
ュール要素に接続される。本願明細書において上述した物理的構造体は、随意に、外部手
段によって冷蔵され得、または物理的構造体自体の中に冷蔵ユニットを含み得る。
モジュールをいつ交換すべきかを判断する)ための、または空気流、含水量/湿度、およ
び二酸化炭素レベルを測定または監視するための要素が、随意に、本発明の装置内に含ま
れ得る。植物発育プロセスを遅延させるためのあらゆる装置は、触媒または触媒モジュー
ル要素への、またはこれを通る空気流を可能にするように、1つ以上の要素をさらに備え
ることができる。当業者は、触媒、触媒モジュール要素、または物理的構造体の大気条件
を監視および制御するための、本願明細書に記載された装置に対する他の可能な変形例を
容易に想定するであろう。温度、大気組成(例えば、相対湿度、O2およびCO2レベル
)、物理的応力、光、化学的ストレス、放射線、水ストレス、成長調節物質、および病原
体の攻撃等の条件は、呼吸速度において重要な役割を果たし、果実、野菜、花、および他
の植物関連の産生物の保管寿命に大きな影響を及ぼす。貯蔵のための温度および大気条件
は、関心の果実、野菜、または植物産生物に応じて変動するが、推奨される貯蔵温度は、
一般的に、約0℃〜20℃の範囲であり、O2およびCO2レベルは、それぞれ、約1〜
10%および0〜20%の範囲である。果実、野菜、および関連する植物産生物の貯蔵に
は、概して、約50%〜約100%の相対湿度、特に85%〜95%、より具体的には約
90%〜95%が推奨される。植物産生物の呼吸速度と保管寿命との間の重要な相関を考
慮すると、このような産生物の変質を遅延させるには、上述の要因の制御が重要である。
したがって、二酸化炭素量を削減するように、装置内に二酸化炭素捕捉剤を提供すること
ができる。
している。これらの装置は、複数の層を含み、層のうちの1つ以上は取り外し可能である
。図2Aに示されるように、装置は、通気性の構造層22と、触媒層24と、を含むこと
ができる。取り外し可能な層26および/または28は、構造層22および/または触媒
層24に沿って提供することができ、一般的に、触媒を使用する前、または活性化する前
に取り外されることを意図している。本発明の特定の態様において、取り外し可能な層2
6および28の取り外しによって、触媒構造体の配置または取り付けを容易にする粘着剤
が、別個の物理的構造体に露出する。図2Bは、装置30が、2つの通気性の構造層32
および34と、中間触媒層36と、取り外し可能な層38と、を含む、代替の一実施形態
を示している。図2Cは、装置40が、2つの通気性の構造層42および44と、中間触
媒層46と、2つの取り外し可能な層48および50と、を含む、さらに別の実施形態を
示している。
60を示している。図3Aに示されるように、容器の側面62は、粘着剤層66の使用を
通じてそこに取り付けられる、触媒層64を含む。剥離可能なフィルム68は、触媒層を
環境への露出から保護するように、触媒層64に隣接して提供することができる。剥離可
能なフィルム68は、容器内に提供される植物部分に触媒を露出させ、それによって不要
な植物発育プロセスを遅延させることによって、触媒層64内の触媒を活性化するように
取り外すことができる。
0を示している。触媒構造体70は、触媒層64、粘着剤層66、および剥離可能なフィ
ルム68に加えて、さらなる剥離可能なフィルム72を含む。剥離可能なフィルム72は
、剥離可能なフィルム68と同様に、それが包装、出荷、または貯蔵される時に、触媒構
造体70を保護する。剥離可能なフィルム72は、図3Aに示す様態で、粘着剤層66を
露出させて、触媒構造体70を容器内部に取り付けることができるように、取り外すこと
ができる。
および84を含む、触媒構造体80を示している。触媒カセット86は、通気性があり、
容易にスロット84に挿入すること、またはそこから取り外すことができる。したがって
、触媒カセット86は、触媒構造体80において新しい触媒カセットの使用が所望される
場合に、容易に置き換えることができる。触媒カセット86は、本願明細書に記述されて
いるような触媒を含み、好ましくは、マトリクス内に固定される。触媒構造体80は、触
媒カセット86を通る空気流を可能にするように、メッシュスクリーン等の、向かい合っ
た通気性の表面88および90を含むことができる。触媒構造体80は、代替の実施形態
では、当業者に理解されるように、1つだけの通気性の表面、2つの向かい合っていない
通気性の表面、または3つ以上の通気性の表面を含むことができる。図4は、触媒カセッ
ト(例えば、カセット86)を受容するための2つのスロット82および84を含んでい
るが、当業者は、触媒構造体80が、カセットを受容するための1つ以上のスロットを含
むことができることを理解されるであろう。触媒構造体80は、果実または花等の植物部
分を輸送するのに使用される容器内に提供することによって、または、例えば本願明細書
に論じられているような粘着剤層を使用することによって、容器に取り付けることができ
る。
せるのに使用され得る。特定の実施形態では、本発明の方法および装置は、成熟を遅延さ
せることを目的とし、植物部分は、成熟を受ける果実(クライマクテリック型、または非
クライマクテリック型)、野菜、または他の植物部分である。当業者は、「クライマクテ
リック型果実」は、果実の成熟中に突発のエチレン産生を呈するが、「非クライマクテリ
ック型果実」は、概して、成熟プロセス中に、エチレン生合成の大幅な増加を受けるとは
考えられないことを認識するであろう。例示的な関心の果実、野菜、および他の植物産生
物には、リンゴ、アプリコット、ビリバ、パンノキの実、チェリモヤ、フェイジョア、イ
チジク、グァバ、パラミツ、キーウィ、バナナ、桃、アボカド、リンゴ、カンタロープ、
マンゴー、マスクメロン、ネクタリン、柿、サポーテ、トゲバンレイシ、オリーブ、パパ
イア、パッションフルーツ、梨、プラム、トマト、ピーマン、ブルーベリー、カカオ、カ
シュー、キュウリ、グレープフルーツ、レモン、ライム、トウガラシ、サクランボ、オレ
ンジ、ブドウ、パイナップル、イチゴ、スイカ、タマリロ、および木の実が挙げられるが
、これらに限定されない。
させる方法および装置が導き出される。本発明の実行においては、あらゆる花を使用し得
る。例示的な関心の花には、バラ、カーネーション、ラン、スベリヒユ、ウスベニアオイ
、およびベゴニアが挙げられるが、これらに限定されない。切り花、より具体的にはバラ
およびカーネーション等の商業的に重要な切り花は、特に関心の対象となる。特定の実施
形態において、エチレンに敏感な花が、本発明の実行において使用される。エチレンに敏
感な花には、ユリズイセン属、アネモネ属、アンスリウム属、キンギョソウ属、シナギク
属、アスティルベ属、カトレア属、シンビジウム属、ダリア属、デンドロビウム属、ナデ
シコ属、ユーストマ属、フリージア属、ガーベラ属、カスミソウ属、アイリス属、レンリ
ソウ属、ユリ属、リモニウム属、ネリネ属、ローザ属、ハシドイ属、チューリップ属、お
よびヒャクニチソウ属の花が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なエチレンに
敏感な花には、ヒガンバナ科、ネギ科、スズラン科、キスゲ科、ヒアシンス科、ユリ科、
ラン科、ザクロソウ科、サボテン科、キキョウ科、ナデシコ科、ベンケイソウ科、リンド
ウ科、アオイ科、イソマツ科、スベリヒユ科、ナス科、アガーベ科、アスフォデル科、ク
サスギカズラ科、シュウカイドウ科、スイカズラ科、マツムシソウ科、トウダイグサ科、
マメ科、シソ科、フトモモ科、アカバナ科、ユキノシタ科、およびクマツヅラ科のものも
挙げられる。例えば、Van Doom(2002) Annals of Botan
y 89:375−383;Van Doom(2002) Annals of Bo
tany 89:689−693、およびhortnet.co.nz/pulicat
ions/hortfacts/hf305004.htm(最終アクセス日2007年
3月20日)の、Elgar(1998) 「Cut Flowers and Fol
iage−Cooling Requirements and Temperatur
e Management」を参照されたく、参照することによりそれらの全体が本願明
細書に組み込まれる。落葉を遅延させるための方法および装置も、本発明によって包含さ
れる。植物、果実、野菜、および花産業においては、成熟、老化、および器官離脱等の植
物発育プロセスを調節するための方法および装置に大きな商業的関心が存在している。
プロセス、特に、概してエチレン生合成の増加(例えば、果実/野菜の成熟、花の老化、
および落葉)に関係するプロセスを遅延させるための、他の公知の方法と組み合わせるこ
とができることをさらに認識されるであろう。さらに、上述のように、エチレン産生の増
加は、病原性有機体による植物または植物部分の攻撃中にも観察されている。したがって
、本発明の方法および装置は、病原体に対する応答の改善におけるさらなる用途を見出し
うる。
以下、本発明を、具体的な種々の実施例を参照して説明する。以下の実施例は、本発明
を制限することを目的としたものではなく、むしろ例示的実施形態として提供される。
アスパラギン、アクリロニトリル、またはアセトニトリルによって誘導されるロドコッ
カス種細胞を、DEAEセルロースのグルタルアルデヒド架橋マトリクス内に固定した。
細胞を誘導し、上述のマトリクスを準備する方法を以下に詳述する。
あたり、湿重量約1〜2グラムの細胞で充填)、各バッグには、未成熟のバナナ、桃、ま
たはアボカドを入れた。負の対照として、触媒マトリクスの非存在下で、同じ果実を別個
の紙バッグ内に配置した。紙バッグは、室温に維持し、果実の成熟および劣化の徴候に対
して、産生物を毎日観察した。
具体的には、触媒マトリクスの存在下では、桃の硬度および皮の完全性が、より長く維持
された。同様に、バナナについては、負の対照に対して、褐色斑点の出現が遅延され、硬
度がより長く維持された。
発酵プロセス
他の実験で使用するためのロドコッカス種株のロドコッカス−ロドクロウスDAP 96622、およびロドコッカス種DAP 96253の発酵には、以下の一般プロトコルおよび培地を利用した。
(オフライン)を測定するサンプリングデバイスによって構成した。矯正剤(例えば、酸
、塩基、または消泡剤)、誘導剤、栄養素、および補充物を添加するために、さらなるポ
ートを使用した。予め洗浄した容器は、現場で消毒した。好適な基本培地(1または1.
5倍)R2AまたはR3Aを使用した。これらの培地の特定の成分は後述する。ある実験
において、媒質の内容物に対するある種の置換を行った。例えば、時には、プロテオース
ペプトンおよび/またはカザミノ酸の代わりに、Proflo(登録商標)(Trade
r’s Protein,Menphis,TN)を使用した。さらに、ある実験におい
ては、Proflo(登録商標)(Trader’s Protein,Menphis
,TN)の代わりに、Hy−Cotton 7803(登録商標)(Quest Int
ernational,Hoffman Estates,IL)、Cottensee
d Hydrolysate、Cottonseed Hydrolysate−Ult
rafiltered(Marcor Development Corp.,Cart
stadt,NJ)を使用した。
媒質、すなわち2倍のYEMEAと徐々に置き換えるように設定したが、その成分も以下
に詳述する。他の随意の栄養素補充物は、マルトース50%(w/v)およびデキストロ
ース50%(w/v)を含む。時折、マルトースおよびデキストロースの代わりに、デキ
ストロース同等物(グルコース、マルトース、およびより高多糖類)を含有する商品を使
用した。
0mg/l〜10g/lの尿素を達成するように、t=0時間で、CoCl2−6H2O
および尿素を添加したが、概して、10〜50ppmのCoCl2、および7500mg
/l〜7.5g/lの尿素が好ましい。特定の一実施形態では、発酵中に、尿素および/
またはコバルトを再び添加した。例えば、等容量の尿素および150ppmのCoCl2
を、4〜6時間で、または24〜30時間で添加した。尿素に加えて、最終濃度300〜
500ppmのアクリロニトリル/アセトニトリル、または0.1M〜0.2Mのアスパ
ラギンの添加を、種々の時間で開始し、段階的に、または一定の速度で行った。細胞塊お
よび酵素濃度が許容可能になった時、一般的には24〜96時間後に、発酵作業を終了し
た。
これらに限定されない、あらゆる許容可能な方法によって採取した。採取した細胞は、発
酵プロセス中に使用される誘導剤が補充される、50mMのリン酸緩衝食塩水(PBS)
等の好適な緩衝液中で、20倍に濃縮される容量まで再懸濁した。細胞濃縮物は、次いで
、特に急速冷凍によって冷凍した。冷凍細胞は、後の使用のために、−20℃〜−80℃
で、または液体窒素下で貯蔵した。
ロドコッカス−ロドクロウスDAP 96622、およびロドコッカス種DAP 96253の誘導には、以下の一般プロトコルを利用した。
導剤の濃度に基づいて、濾過殺菌した液体誘導剤として、容量分析的に添加した。固体誘
導剤(例えば、アスパラギン/グルタミン)の場合は、固体の重さを量り、培養物媒質に
直接的に添加した。結果として生じる媒体は、加圧滅菌した。フィルタ殺菌した液体誘導
剤を利用した時には、培地を単独で加圧滅菌し、液体誘導剤を添加する前に40℃まで冷
却した。関心の誘導剤の代表的な濃度は、アクリロニトリル/アセトニトリルが500p
pm、アスパラギン/グルタミンが500ppm、およびスクシノニトリルが50ppm
であった。細胞は、次いで、指定の媒質上で成長させ、特定の酵素活性およびバイオマス
のためにさらに分析した。
ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、およびアスパラギナーゼ活性、ならびにバイオマスを、ロドコッカス種株のロドコッカス−ロドクロウスDAP 96622およびロドコッカス種DAP 96253からのアスパラギン誘導細胞内で評価した。培地の成分、投与方法、速度、および細胞に提供されるアスパラギンの濃度、ならびに細胞源に対する種々の変形例を、上述の酵素の活性、およびバイオマスへのそれらの影響に関して分析した。本実施例のA〜G項は、各組の試験条件の詳細を説明し、各指定条件下で得られた酵素活性およびバイオマスの要約を提供する。
提供するが、活性は、単位/mg cdw(細胞乾燥重量)で与えられる。1単位のニト
リルヒドラターゼ活性は、pH7.0および温度30℃で、1分あたり、細胞1ミリグラ
ム(乾燥重量)につき、1μmolのアクリロニトリルを、その対応するアミドに変換す
る能力に関連する。1単位のアミダーゼ活性は、pH7.0および温度30℃で、1分あ
たり、細胞1ミリグラム(乾燥重量)につき、1μmolのアクリルアミドを、その対応
する酸に変換する能力に関連する。バイオマスは、g/l cww(細胞湿重量)で充填
される細胞として記録される。
胞の固定化
米国特許第4,229,536号、およびLopez−Gallego et al.
(2005) J.Biotechnol.119:70−75に記載されている方法か
ら導出された修正プロセスを、グルタルアルデヒド架橋DEAEセルロースを含むマトリ
クス内にロドコッカス種を固定するのに使用する。
細胞の調製
養物等)内で成長させ、8,000回転で10分間の遠心分離によって採取する。結果と
して生じた細胞ペレットを、100mlの50mMリン酸緩衝液(pH7.2)中で再懸
濁し、8,000回転で10分間、遠心分離する。細胞ペレットを再懸濁し、8,000
回転で10分間、遠心分離するこのプロセスを二回繰り返す。最終細胞試料の充填湿重量
(ww)を記録する。細胞の小試料のニトリルヒドラターゼ活性を行い、細胞全体の酵素
活性を評価する。
採取したロドコッカス種細胞と同量のDEAEセルロースが得られ、細胞およびDEA
Eセルロースは、100mlの脱イオンH2O中で再懸濁される。0.5%の最終濃度を
達成するのに十分なグルタルアルデヒドの25%溶液の容量を、撹拌しながら、細胞/D
EAEセルロースの混合物に添加する。混合物を1時間撹拌し、その後、400mlの脱
イオンH2Oを、さらに撹拌しながら添加する。撹拌している間、50%(溶液重量)の
ポリエチレンイミン(PEI;MW 750,000)を添加する。凝集が完了するまで
撹拌を続ける。凝集させた混合物を濾過し、適切なサイズの注射器で押し出す。固定化細
胞は、小片に分割し、終夜乾燥して、使用前に約2〜3mmの顆粒状に切断する。
カルシウムビーズの硬化
Methods in Enzymology,Vol.135(B)のBucke(
1987)「Cell Immobilization in Calcium Alg
inate」(Academic Press,Inc.,San Diego,Car
ifornia;Mosbach,ed)に記載されている方法から採用したプロセスを
、アルギン酸カルシウム中にロドコッカス種を固定するのに使用する。
ロドコッカス種細胞は、上記の実施例4に述べられているように調製される。
25gの4%ナトリウムアルギン酸溶液を、1gのナトリウムアルギン酸を24mlの
50mMのトリスHCl(pH7.2)中に溶解することによって生成する。25mgの
ナトリウムメタ過ヨウ素酸塩を、アルギン酸溶液に添加し、25℃で1時間、またはアル
ギン酸が完全に溶解するまで撹拌する。上述のように調製した細胞を、50mMのトリス
HCl(pH7.2)中で最終容量が50mlになるまで再懸濁し、次いで、撹拌しなが
ら、ナトリウムアルギン酸溶液に添加する。結果として生じるビーズを、27ゲージ針に
よって、500mlの0.1MのCaCl2溶液中に押し出す。針は、概して、空気がビ
ーズの中に入らないように、また、ビーズに刺さらないように、溶液の約2インチ上に配
置される。ビーズは、CaCl2溶液中で約1時間で硬化し、次いで、ビーズを、水です
すいで、使用前に0.1MのCaCl2溶液中に4℃で貯蔵する。
上記に概説したように調製したアルギン酸カルシウムビーズは、PEIで架橋すること
によってさらに増強し得る。ビーズは、2Lの0.1MのCaCl2溶液(0.1MのC
aCl2溶液中に20gの50%PEI)中の0.5%PEI中で培養する。最終溶液の
pHは、必要に応じて、HClまたはNaOHによって7.0に調整し、ビーズは、24
時間培養する。ビーズは、次いで、水ですすいで、使用前に、0.1MのCaCl2溶液
中に4℃で貯蔵する。
に記載される本発明の多数の変形例および他の実施形態が想起されるであろう。したがっ
て、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、その変形例および
他の実施形態が、添付の特許請求の範囲に含まれることを意図するものであると理解され
たい。特定の用語を本願明細書に用いたが、それらは一般的に使用され、記述を意識した
だけのものであり、制限するためのものではない。
Claims (20)
- 植物または植物部分を1つ以上の単離された酵素に露出させるステップを含む、植物発育プロセスを遅延させるための方法であって、前記1つ以上の単離された酵素は、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、アスパラギナーゼ、およびそれらの混合物から成る群から選択され、前記1つ以上の単離された酵素が、前記植物発育プロセスを遅延させるのに十分な量で、前記植物または植物部分に露出される、方法。
- 前記1つ以上の単離された酵素は、1つ以上のバクテリアにより提供される、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の単離された酵素は、前記1つ以上のバクテリアから精製または半精製される、請求項2に記載の方法。
- 前記1つ以上のバクテリアは、ロドコッカス種、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、シュードモナス−クロロラフィス、およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項2または3に記載の方法。
- 前記1つ以上のバクテリアは、ロドコッカス種を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記1つ以上のバクテリアは、アスパラギン、グルタミン、コバルト、尿素、およびそれらの混合物から成る群より選択される誘導剤への露出によって誘導される、請求項2または3に記載の方法。
- 前記植物または植物部分は、前記1つ以上の酵素に間接的または直接的に露出される、請求項1に記載の方法。
- 前記植物発育プロセスは、果実の成熟、野菜の成熟、または落葉である、請求項1に記載の方法。
- 前記植物部分は、果実、野菜、または花である、請求項1に記載の方法。
- 前記植物部分は、花であり、前記植物発育プロセスは、花の老化、しおれ、落花または花弁の閉鎖である、請求項1に記載の方法。
- 前記植物発育プロセスを遅延させることにより、前記植物または植物部分の保管寿命の増加をもたらすか、または前記植物または植物部分の長距離輸送を容易にする、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の単離された酵素は固定され、物理的構造体内に配置されるか、その上に配置されるか、またはそれに取り付けられる、請求項1に記載の方法。
- 複数の層を備える、植物発育プロセスを遅延させるための装置であって、少なくとも1つの層は、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、アスパラギナーゼ、およびそれらの混合物から成る群から選択される1つ以上の単離された酵素を含む触媒を含み、前記触媒は、物理的構造体内に配置されるか、その上に配置されるか、またはそれに取り付けられ、前記1つ以上の単離された酵素は、前記植物発育プロセスを遅延させるのに十分な量で提供される、装置。
- 前記1つ以上の単離された酵素は、架橋DEAEセルロースを含むマトリクス、アルギン酸を含むマトリクス、カラギーンを含むマトリクス、ポリアクリルアミドを含むマトリクス、またはアルギン酸カルシウムビーズ内に固定される、請求項13に記載の装置。
- 請求項13に記載の植物発育プロセスを遅延させるための装置であって、
前記装置は、植物発育プロセスを遅延させるための通気性触媒装置であり、
第1の層と、
ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、アスパラギナーゼ、およびそれらの混合物から成る群から選択される1つ以上の単離された酵素を含む触媒を含む第2の層であって、前記1つ以上の単離された酵素は、前記植物発育プロセスを遅延させるのに十分な量で提供される、第2の層と、
を備え、前記第1の層は、前記第2の層への空気流を可能にする材料を含む外層である、装置。 - 前記物理的構造体は、フィルム、シート、被覆層、箱、ポーチ、バッグ、またはスロット付きチャンバである、請求項13〜15のいずれかに記載の装置。
- 前記ロドコッカス種は、ロドコッカス種DAP 96253株、ロドコッカス−ロドクロウスDAP 96622株、ロドコッカス−エリスロポリス、またはそれらの混合物を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記果実は、クライマクテリック型果実である、請求項9に記載の方法。
- 前記クライマクテリック型果実は、バナナ、桃、プラム、ネクタリン、リンゴ、トマト、梨、およびアボカドから成る群より選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記花は、カーネーション、バラ、ラン、スベリヒユ、アオイ、またはベゴニアである、請求項10に記載の方法。
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