BRPI0613674A2 - processo para aumentar o teor de fosfato dos amidos de células vegetais modificadas geneticamente, amido e grão de arroz, composição compreendendo os mesmos e planta de arroz - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA AUMENTAR O TEOR DE FOS- FATO DOS AMIDOS DE CéLULAS VEGETAIS MODIFICADAS GENETICAMENTE, AMIDO E GRãO DE ARROZ, COMPOSIçãO COMPREENDENDO OS MESMOS E PLANTA DE ARROZ. A presente invenção refere-se a um processo para aumentar o teor de fosfato dos amidos de células vegetais modificadas geneticamente em comparação com os amidos de células vegetais do tipo selvagem correspondentes através da introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha que codifica uma amido sintase solúvel II. A presente invenção se refere, além disso, à superexpressão dessa amido sintase solúvel II nas células vegetais modificadas geneticamente. Além disso, a presente invenção se refere ao amido de arroz e à farinha de arroz com melhores características de qualidade, aos grãos de arroz que compreendem este amido de arroz e às plantas de arroz em que estes grãos de arroz crescem.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOPARA AUMENTAR O TEOR DE FOSFATO DOS AMIDOS DE CÉLULASVEGETAIS MODIFICADAS GENETICAMENTE, AMIDO E GRÃO DE AR-ROZ, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO OS MESMOS E PLANTA DEARROZ".

A presente invenção refere-se a um processo para aumentar oteor de fosfato de amidos de células vegetais modificadas geneticamente emcomparação com os amidos de células vegetais do tipo selvagem não-modificadas geneticamente correspondentes, em que uma célula vegetal émodificada geneticamente através da introdução de uma molécula de ácidonucleico estranha que codifica uma amido sintase Il solúvel e esta amidosintase Il é superexpressa.

Além disso, a presente invenção se refere ao amido de arroz e àfarinha de arroz com propriedades com qualidade aumentada, a grãos dearroz que compreendem este amido de arroz e às plantas de arroz nas quaisestes grãos de arroz crescem.

O arroz é o alimento mais importante para mais da metade dapopulação mundial. Em alguns países, o arroz corresponde até aproxima-damente 80% de toda a ingestão alimentar. A produção anual em todo omundo é de 550 milhões de toneladas de arroz.

O grão de arroz consiste em aproximadamente 76% de amido eaproximadamente 7-8% de proteína. Contém apenas 1,3% de gordura e umgrande número de elementos-traço (0,6%) tais como fósforo, ferro e magnésio.

A espécie de arroz mais importante economicamente é Oryzasativa, cujas variedades básicas podem ser divididas em dois grupos: o gru-po "indica", que inclui apenas arroz de grãos longos e o grupo "japonica",que contém arroz com grãos médios e curtos.

O arroz de grãos longos (variades de arroz cujos grãos são se-parados quando cozidos) vem principalmente da índia ou de Java; o arroz degrãos curtos (tal como "arroz doce", isto é, variedades de arroz cujos grãosficam grudentos quando cozidos) vem primariamente do Japão. As varieda-des da China e do Sudeste da Ásia ficam no meio termo entre as anteriores.

Em todas as variedades, por sua vez, há dois tipos principais:grão translúcido ou grão opaco. Estes diferem na composição de seu amido:o amido do arroz translúcido consiste em aproximadamente 20% de amilosee até 80% de amilopectina, enquanto que do arroz opaco, em contraste,consiste virtualmente apenas em amilopectina.

A amilopectina possui uma estrutura em agrupamentos específi-ca e é sintetizada por uma variedade de subunidades ou isoformas de quatroclasses de enzimas: amido sintase solúvel (SS)1 enzimas de ramificação doamido (SBE)1 enzimas de desramificação do amido (SDE) e ADP glicosepirofosforilase (Nakamura 2002, Plant Cell Physiol. 43(7): 718-725).

As características de cozimento e de alimentação são determi-nadas principalmente pelo teor de amilose do endosperma do arroz. As vari-edades com um baixo teor de amilose são úmidas e grudentas após o cozi-mento, enquanto que os grãos com um alto teor de amilose ficam secos esoltos após o cozimento (H. ten Have in Hoffmann Mudra Plarre (HMP)1985: Lehrbuch der Züchtung landw. Kulturpflanzen, Volume 2, pp. 110-123).

A qualidade dos grãos é muito importante não somente para oconsumidor, mas também para a indústria de moagem; as propriedades dosgrãos tais como o tamanho do grão, o formato do grão e a qualidade do grãosão características importantes uma vez que afetam o rendimento do arrozmoído e a porcentagem de grãos quebrados (ten Have 1985, supra).

A farinha de arroz tem sabor relativamente neutro e, portanto, émuito adequada como a base para produtos com sabor suave ou outros naforma de uma mistura. Graças a sua hipoalergenicidade, é também muitoadequada para fórmulas para bebês ou como uma dieta para pessoas quesofrem de alergia.

Além dos óleos, das gorduras e das proteínas, os polissacarí-deos são os materiais brutos renováveis mais importantes das plantas. Alémda celulose, o amido, que é um dos materiais de armazenamento mais im-portantes nas Plantas Superiores, é de grande importância entre os polissa-carídeos.O polissacarídeo amido é um polímero de unidades quimicamen-te uniformes, as moléculas de glicose. Entretanto, constitui uma mistura al-tamente complexa de formas diferentes de moléculas que diferem em rela-ção a seu grau de polimçrização e à ocorrência de ramificações das cadeiasde glicose e seu comprimento de cadeia e, adicionalmente, pode ser deriva-tizado, por exemplo, fosforilado. O amido, portanto, não constitui um materialbruto uniforme. Em particular, amilose amido, um polímero essencialmentenão-ramificado de moléculas de glicose ligadas de forma a-1,4-glicosídica,difere de amilopectina amido, que por sua vez, é uma mistura complexa decadeias de glicose diferencialmente ramificadas. As ramificações são forma-das pela ocorrência de ligações a-1,6-glicosídicas adicionais. Nas plantastípicas utilizadas para a produção de amido industrial, por exemplo, milho,trigo ou batata, o amido sintetizado é aproximadamente 20% - 25% de ami-lose amido e aproximadamente 70% - 75% de amilopectina amido.

As propriedades funcionais do amido são afetadas enormementenão apenas pela proporção de amilose/amilopectina e pelo teor de fosfato,mas também pelo peso molecular, pelo padrão da distribuição de cadeiaslaterais, pelo teor iônico, pelo teor de lipídeos e de proteínas, pelo tamanhomédio dos grãos de amido, pela morfologia dos grãos de amido e similares.As propriedades funcionais importantes que podem ser mensionadas nestecontexto são, por exemplo, a solubilidade, o comportamento de retrodegra-dação, a capacidade de ligação com a água, as propriedades formadoras defilmes, a viscosidade, as propriedades de formação de pasta, a estabilidadede congelamento-descongelamento, a estabilidade a ácidos, a concentraçãodo gel e similares.

As vias sintéticas bioquímicas básicas que levam à síntese doamido são apenas pouco conhecidas. Entretanto, existe uma série de etapasem que os mecanismos detalhados que levam à síntese dos grânulos deamido e do amido não estão até agora elucidados e, portanto, são ainda oobjetivo de pesquisa.

Não é possível atualmente influenciar o teor de fosfato do amidoligado covalentemente nas plantas através apenas do cruzamento de plan-tas.

Uma alternativa para os métodos de cruzamento de plantas é amodificação direcionada de plantas que produzem amido através de méto-dos recombinantes. O pré-requisito para isso, entretanto, é a identificação ea caracterização das enzimas que participam na síntese do amido e/ou namodificação do amido e o isolamento das moléculas de ácidos nucleicos quecodificam estas enzimas e a análise funcional subsequente nas plantastransgênicas.

Nas células vegetais, a síntese do amido ocorre nos plastídeos,que são os cloroplastos no tecido fotossinteticamente ativo e os amiloplastosno tecido que armazena amido fotossinteticamente inativo. As enzimas im-portantes que desempenham uma função na síntese do amido são as prote-ínas R1 (= água diquinase alfa-glucana, E.C. 2.7.9.4; Lorberth e outros(1998) Nature Biotechnology 16: 473-477), amido sintases e as enzimas deramificação (= BE; ver, por exemplo, Ponstein e outros, Plant Physiol. 29(1990), 234-241; Kossmann e outros, 1991, Mol. Gen. Genet. 230, 39-44;Safford e outros, 1998, Carbohydrate Polymers 35, 155-168; Jobling e outros1999, The Plant Journal 18(2): 163-171). As enzimas de ramificação catali-sam a introdução de ramificações a-1,6 nas a-1,4-glucanas lineares. Nasamido sintases, foi descrita uma variedade de isoformas, das quais todascatalisam uma reação de polimerização através da transferência de um resí-duo de glicosila da ADP-glicose para a-1,4-glucanas.

Uma visão geral dos amidos nativos isolados de várias espéciesde plantas, em que variações das enzimas que desempenham uma funçãona biossíntese do amido são observadas, pode ser encontrada em Koss-mann e Lloyd (2000, Criticai Reviews in Plant Sciences 19(3): 171-226).

As amido sintases (EC 2.4.1.21) podem ser divididas em duasclasses: as amido sintases ligadas ao grânulo de amido ("amido sintases Iligadas ao grânulo"; GBSS I) e a amido sintase solúvel ("amido sintase solú-veis"; SSS, também referida como "SS"). Esta distinção não é ambígua emcada caso uma vez que parte das amido sintases existe tanto na forma liga-da ao grânulo de amido quanto na forma solúvel (Denyer e outros, Plant J. 4(1993), 191-198; Mu e outros, Plant J. 6 (1994), 151-159).

Em contraste à GBSSI, que leva à síntese de amilose, pouco éconhecido ainda em relação à função enzimática precisa das várias classesde amido sintase solúvel na biossíntese do amido.

A caracterização bioquímica resultou na identificação das proteí-nas amido sintases solúveis com pesos moleculares entre aproximadamente60 até aproximadamente 180 kDa. A clonagem dos cDNAs que codificam asamido sintases tornou possível distinguir classes diferentes que foram defi-nidas como o resultado das homologias de seqüência e como o resultadodas características funcionais das amido sintases (solúveis).

Até hoje, oito classes de amido sintases foram identificadas emplantas superiores (inter alia por Li e outros (2003) Funct. Intergr. Genomics3: 76-85):

- amido sintase I ligada ao grânulo de amido (Amido Sintase ILigada ao Grânulo de Amido (Granule-Bound Starch Synthase I) = GBSS I)(arroz: por exemplo, Okagaki (1992) Plant Mol Biol. 19: 513-516; batata: vander Leij e outros (1991) Mol. Gen Genet. 228: 240-248; milho: por exemplo,Kloesgen e outros (1986) Mol. Gen Genet. 203: 237-244);

- amido sintase solúvel I (= SSI; arroz: Baba e outros (1993)Plant Physiol. 103: 565-573; batata: Kossmann e outros (1999) Planta 208:503-511; milho: Knight e outros (1998) Plant J. 14: 613-622);

- amido sintase solúvel Il (= SSII; ervilha: Dry e outros (1992)Plant J. 2: 193-202, batata: Edwards e outros (1995) Plant J 8: 283-294, mi-lho: Harn e outros, (1998) Plant Mol. Biol. 37(4): 639-649; trigo: Walter e ou-tros (1996) Genbank Acc. U66377; arroz: Yamamoto e Sasaki (1997) PlantMol. Biol. 35: 135-144 e cevada: Li e outros (2003), Funct. Integr. Genomics3: 76-85);

- amido sintase solúvel Ill (= SSIII; batata: Abel e outros (1996)Plant J 10:981-991: ervilha forrageira: GenBank Acc. No AJ225088);

- amido sintase solúvel IV (= SSIV; trigo: GenBank Acc. NoAY044844);

- amido sintase solúvel V (= SSV; ervilha forrageira: GenBankAcc. No VUN006752; Arabidopsis: GenBank Acc. No AL021713; milho: WO97/26362) e

- dull (Gao e outros (1998) Plant Cell 10: 399-412);

- amido sintase solúvel Vl (= SSVI; milho: WO 01/12826).

O teor de amido fosfato ligado covalentemente varia, dependen-do da espécie vegetal. Assim, por exemplo, certos mutantes de milho sinteti-zam amido com um maior teor de amido fosfato (milho ceroso 0,002% e mi-lho com alto teor de amilose 0,013%), enquanto que as variedades de milhotradicionais contêm apenas traços de amido fosfato. Pequenas quantidadesde amido fosfato são também encontradas no trigo (0,001%), enquanto nãofoi detectado amido fosfato em aveia e painço. Similarmente, menos amidofosfato foi encontrado em mutantes de arroz (arroz ceroso 0,003%) que nasvariedades de arroz tradicionais (0,013%). Quantidades significativas de a-mido fosfato foram detectadas em plantas que sintetizam amido de reservanos tubérculos ou nas raízes tais como, por exemplo, tapioca (0,008%), ba-tata doce (0,011%), araruta (0,021%) ou batata (0,089%). Estas porcenta-gens para o teor de amido fosfato são em cada caso baseadas no peso secode amido e foram determinadas por Jane e outros (1996, Cereal Foods Wor-ld 41 (11), 827-832). Estudos sobre batatas com SSI antissenso revelaramque seu teor de fosfato era aumentado em 30-70% em relação ao do tiposelvagem (WO 96/15248).

O WO 00/08184 descreve plantas em que as atividades tanto daamido sintase Ill (=SSIII) quanto da enzima de ramificação I (= BEI) são re-duzidas. Em comparação com o amido de plantas do tipo selvagem, o amidode tais plantas revelou um teor maior de fosfato. As plantas de trigo que,como o resultado da superexpressão de um gene R1 da batata, possuemuma maior atividade de uma proteína R1 e um maior teor de amido fosfatosão descritas no pedido de patente internacional WO 02/34923.

A distribuição de fosfato no amido que foi sintetizado pelas plan-tas (amido nativo) é geralmente distinguida pelo fato de que aproximada-mente 30% até 40% dos resíduos de fosfato estão ligados covalentementena posição C3 e aproximadamente 60% até 70% dos resíduos de fosfato naposição C6 das moléculas de glicose (Blennow e outros, 2000, Int. J. of Bio-Iogical Macromolecules 27: 211-218). Em contraste, os amidos quimicamen-te fosforilados possuem adicionalmente resíduos de fosfato ligados na posi-ção C2 das moléculas de glicose uma vez que a reação química prosseguede uma maneira não direcionada.

O WO 03/023024 divulga amidos de arroz que possuem umatemperatura de início de DSC T de até 69,5°C e/ou uma temperatura máxi-ma de DSC T de até 73,6°C; um total de aproximadamente 400 variedadesde arroz dos grupos japonica e indica foi analisado em relação a estas ca-racterísticas.

Umemoto e outros (2002, Theor. Appl. Genet. 104: 1-8) descre-vem a análise de linhagens cultivadas de forma retrocruzada entre uma vari-edade japonica (Nipponbare) e uma variedade indica (Kasalath). Eles con-cluem partindo de seus resultados que os lóci alk(t), gel(t) e acl(t), que sãoresponsáveis pelas temperaturas de início da gelatinização diferentes (iníciode DSC T) entre as variedades japonica e indica, poderiam ser a isoformaSSIIa da amido sintase.

O WO 03/023024 descreve um transformante de arroz ( N0 78-1)da variedade japonica (Kinmaze) no qual foi transformado um gene de amidosintase Ila (SSIIa) da forma IR36 de indica. As alterações resultantes no per-fil de cadeia lateral da amilopectina são mostrados e, como uma conseqüên-cia, indicam uma modificação do perfil de japonica em direção ao da varie-dade indica (Figura 22 no WO 03/023024).

O WO 03/023024 não descreve os teores de fosfato, os teoresde amilose nem as propriedades reológicas dos amidos ou das farinhas dearroz.

A relação entre a alteração no perfil de cadeia lateral da amilo-pectina, que é realizada pela SSIIa e a temperatura de início de DSC T dosamidos são novamente mostradas, em um artigo publicado recentemente(Nakamura e outros, (2005) PMB; 58(2): 213-27), com referência aos valorespara os transformantes e para as linhagens "receptoras" e "doadoras" cor-respondentes (Figura 6B). A Figura 6B mostra as temperaturas para o iníciode DSC T dos amidos dos transformantes de SSIIa gerados. Em nenhumcaso o início de DSC T é maior que 70°C. O valor de início de T mais altodetalhado aqui é de 69,5°C, como descrito também no WO 03/023024 (pp. 21-24).

Assim, nem o WO 03/023024 nem Nakamura e outros (2005)ensinam uma maneira em que podem ser gerados amidos de arroz cujatemperatura de início de DSC T excede 70°C.

Entretanto, uma temperatura de início de DSC T maior é deseja-da até onde esta seja uma característica importante de uma estabilidadetérmica maior dos amidos e assim também para a alteração na estruturacristalina como o resultado do efeito do calor.

Era um objetivo da presente invenção, portanto, fornecer amidosde arroz e farinhas de arroz com novas propriedades, em particular umamaior estabilidade térmica e meios e métodos para a preparação dos mesmos.

Como o aumento da expressão gênica da amido sintase solúvelIl afeta as propriedades do amido nas plantas é desconhecido até agora. Umalto teor de fosfato é desejado uma vez que leva a características físico-químicas modificadas do amido e assim a novas aplicações do amido.

É, portanto, um objetivo adicional da presente invenção fornecerum processo através do qual o teor de fosfato dos amidos de plantas possaser aumentado in vivo.

Estes objetivos são atingidos através do fornecimento das for-mas de uso especificadas nas reivindicações da patente.

A presente invenção se refere a um processo para aumentar oteor de fosfato dos amidos de células vegetais modificadas geneticamentepara 150 até 500% em comparação com os amidos das células vegetais dotipo selvagem não-modificadas geneticamente correspondentes (100%), emque

a) uma célula vegetal é modificada geneticamente através daintrodução de uma molécula de ácido nucleico estranha que codifica umaamido sintase solúvel Il eb) esta amido sintase solúvel Il é superexpressa.

No contexto da presente invenção, o termo "teor de fosfato doamido" é entendido como significando grupos fosfato que estão ligados co-valentemente aos monômeros de glicose do amido.

No contexto da presente invenção, o termo "aumento no teor defosfato dos amidos" é entendido como significando um aumento do teor defosfato na posição C6 para 150-500%, preferencialmente para 160-400% eespecial e preferencialmente para 170-380% em comparação com o amidodas células vegetais do tipo selvagem correspondentes (100%).

No contexto da presente invenção, o termo "teor de fosfato naposição C6" é entendido como significando o teor nos grupos fosfato quesão ligados na posição "6" dos átomos de carbono dos monômeros de glico-se do amido. Em princípio, as posições C3 e C6 das unidades de glicosepodem ser fosforiladas no amido in vivo. No contexto da presente invenção,o teor de fosfato na posição C6 (= teor de C-6-P) é determinado através deuma determinação de glicose-6-fosfato através do ensaio visual com enzimadescrito aqui abaixo (Nielsen e outros, 1994, Plant Physiol. 105, 111-117);(determinação do teor de fosfato na posição C6 (teor de C6-P).

O que era extremamente surpreendente na presente invençãoera que era possível aumentar o teor de fosfato até notavelmente mais que150% em comparação com o do tipo selvagem (100%).

No contexto da presente invenção, a elevação do teor de fosfatodos amidos é realizada in vivo, não in vitro, tal como, por exemplo, atravésde fosforilação química de um amido pré-extraído. Consequentemente, avantagem da presente invenção é que os agentes químicos utilizados para afosforilação química podem ser fornecidos juntamente.

No contexto da presente invenção, o termo "célula vegetal modi-ficada geneticamente" significa que a célula vegetal é modificada genetica-mente, a modificação genética levando a uma maior atividade de uma amidosintase solúvel Il (=SSII) em comparação com a atividade de SSII de umacélula vegetal do tipo selvagem não-modificada geneticamente correspon-dente.No contexto da presente invenção, o termo "célula vegetal dotipo selvagem" significa que são células vegetais que atuam como materialde partida para o processo de acordo com a invenção, isto é, cuja informa-ção genética, com a exceção da modificação genética que foi introduzida eque leva a uma maior atividade de uma amido sintase solúvel Il (= SSII), cor-responde àquela de uma célula vegetal modificada geneticamente.

No contexto da presente invenção, o termo "correspondente"significa, quando se compara um grande número de objetos, os objetos emquestão, que são comparados um com os outros, são mantidos sob condi-ções idênticas. No contexto da presente invenção, o termo "correspondente"no contexto de células vegetais do tipo selvagem significa que as célulasvegetais que são comparadas uma com a outra foram cultivadas sob condi-ções de cultura idênticas e que possuem preferencialmente a mesma idade(em cultura).

O termo "idade em cultura" é entendido como significando o pe-ríodo ao longo do qual um organismo (planta) gasta/cresce em um meio denutrientes. Este pode ser, por exemplo, o período de tempo desde a semea-dura até a colheita ou ainda o período de tempo durante o qual as célulasvegetais são cultivadas em um meio de cultura de tecido até um certo está-gio do desenvolvimento. No contexto da presente invenção, isto significa queas células vegetais que são comparadas com uma outra gastam o mesmoperíodo de tempo de desenvolvimento sob as mesmas condições de cultura.

No contexto da presente invenção, o termo "molécula de ácidonucleico estranha" é entendido como significando tal molécula que não ocor-re naturalmente nas células vegetais do tipo selvagem correspondentes ouque não ocorrem naturalmente nas células vegetais correspondentes na dis-posição espacial específica ou uma que é localizada em uma posição, nogenoma de célula vegetal, em que não ocorre naturalmente. A molécula deácido nucleico/polinucleotídeo estranho é preferencialmente uma molécularecombinante que consiste em vários elementos cuja combinação ou arranjoespacial específico não ocorre naturalmente nas células vegetais. Isto podeser verificado, por exemplo, com o auxílio de uma análise de Southern blot.Dentro do contexto da presente invenção, o termo "superexpres-so" significa um aumento da atividade enzimática das proteínas SSII nascélulas vegetais modificadas geneticamente em comparação com as célulasvegetais do tipo selvagem não-modificadas geneticamente correspondentes.

Para as finalidades da presente invenção, o termo "superexpresso" significaainda, além disso, que as plantas ou as células vegetais que naturalmentenão possuem qualquer atividade de SSI detectável, após a modificação ge-nética de acordo com a invenção, em que uma molécula de ácido nucleicoestranha que codifica uma amido sintase solúvel Il é introduzida no genomade uma célula vegetal, terão uma atividade de SSII que pode ser detectadaatravés de um zimograma. O aumento da atividade enzimática das proteínasSSII nas células é preferencialmente determinado com o auxílio de zimo-gramas como descrito posteriormente aqui ("determinação da atividade deSSII através de gel").

Neste contexto, um aumento na atividade de SSII significa umaumento na atividade de SSII em comparação com as células vegetais não-modificadas geneticamente correspondentes, para pelo menos 200%, emparticular para 350-2000%, preferencialmente para 600-1500% e especial epreferencialmente para 700-1200%. No contexto da presente invenção, um"aumento da atividade de SSII" significa ainda que as plantas ou as célulasvegetais que não possuem atividade de SSII detectável, após a modificaçãogenética de acordo com a invenção, em que uma molécula de ácido nucleicoestranha que codifica uma amido sintase solúvel é introduzida no genoma deuma célula vegetal, terão uma atividade de SSII detectável.

No contexto da presente invenção, o termo "amido sintase solú-vel II" é entendido como significando a classe Il de proteínas amido sintasessolúveis (ADP-glicose 1,4-a-D-glucana 4-a-D-glucosiltransferase; EC2.4.1.21). As amido sintases solúveis catalisam uma reação de glicosilaçãoem que os resíduos de glicose do substrato ADP-glicose são transferidospara cadeias de glucana ligadas a a-1,4 com a formação de uma ligação a-1,4 (ADP-glicose + {(1,4)-a-D-glucosil}(N) <=> ADP + {(1,4)-a-D-glucosil}(N+1)).A estrutura das proteínas SSII mostra uma seqüência de domí-nios específicos. No terminal "N", as proteínas SSII possuem um peptídeosinal para o transporte para dentro dos plastídeos. Uma região N-terminal eum domínio catalítico seguem na direção do terminal C (Li e outros, 2000,Plant Physiology 123, 613-624). Análises adicionais baseadas em compara-ções das seqüências primárias (http://hits.isb-sib.ch/cqi-bin/PFSCAN) deuma variedade de proteínas SSII revelaram que as proteínas SSII possuemtrês domínios específicos. Estes domínios compreendem os aminoácidosque são codificados pelos nucleotídeos: pb 1190 até 1279 (= região 1), pb1493 até 1612 (região 2) e pb 2147 até 2350 (região 3) da seqüência do ge-ne SSII do trigo que é mostrada na Seq ID No. 1.

No contexto da presente invenção, uma proteína SSII é, portan-to, entendida como significando uma amido sintase solúvel cuja seqüênciade aminoácidos possui pelo menos 86%, preferencialmente pelo menos 93%e especial e preferencialmente 100% de identidade com a região 1 mostradana Seq ID No. 3 e pelo menos 83%, preferencialmente pelo menos 86% eespecial e preferencialmente 100% de identidade com a região 2 mostradana Seq ID No. 4 e pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 82%, porpreferência 86%, particular e preferencialmente 98% e especial e preferenci-almente 100% de identidade com a região 3 mostrada na Seq ID No. 5.

No contexto da presente invenção, o termo "identidade" é enten-dido como significando a porcentagem de aminoácidos que concorda com ade aminoácidos de outras proteínas (identidade). A identidade é preferenci-almente determinada com o auxílio de programas de computador. Se as se-quências que são comparadas com cada outra são diferentes em compri-mento, a identidade deve ser determinada de forma que o número de ami-noácidos que a seqüência mais curta compartilha com a seqüência maislonga determina a porcentagem de identidade. A identidade pode ser deter-minada rotineiramente através de programas de computador conhecidos queestão disponíveis publicamente tal como, por exemplo, CIustaIW (Thompsone outros, (1994) Nucleic Acids Research 22: 4673-4680).

CIustaIW foi tornado público por Julie Thompson (Thomp-son@EMBL- Heidelberg.DE) e Toby Gibson (Gibson(5).EMBL-Heidelberq.DE). European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1,D - 69117 Heidelberg. CIustaIW pode ser similarmente baixado partindo devárias páginas da internet, inter alia do IGBMC (Institut de Génétique et deBiologie Moléculaire et Cellulaire, Β. P.163, 67404 Illkirch Cedex, França;ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) e do EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) eoutras páginas da internet espelhada no EBI (European Bioinformatics Insti-tute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD,Reino Unido).

É preferido utilizar o programa de computador CIustaIW Versão1.8 para determinar a identidade entre as proteínas descritas aqui e outrasproteínas. Devem ser ajustados os parâmetros a seguir: KTUPLE=I, TOP-DIAG=5, WIND0W=5, PAIRGAP=3, GAP0PEN=10, GAPEXTEND=0,05,GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP.

É preferido utilizar o programa de computador CIustaIW Versão1.8 para determinar a identidade entre as seqüências de nucleotídeos dasmoléculas de ácidos nucleicos descritas aqui e da seqüência de nucleotí-deos de outras moléculas de ácidos nucleicos. Devem ser ajustados os pa-râmetros a seguir: KTUPLE=2, T0PDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMA-TRIX:IUB, GAPOPEN=10, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: nãopesado.

No contexto da presente invenção, o termo "aumento da ativida-de de SSII" significa o aumento da atividade de SSII em comparação com asplantas de arroz do tipo selvagem ou células vegetais de arroz do tipo selva-gem não-modificadas geneticamente em pelo menos 100%, em particularem 200% - 2000%, preferencialmente em 400% - 1400% e especial e prefe-rencialmente em 500% - 900%. No contexto da presente invenção, a ativida-de de SSII é detectada utilizando o método descrito posteriormente aqui("determinação da atividade de SSII através de gel"). No contexto da presen-te invenção, "aumento da atividade de SSII" significa ainda que as plantasou as células vegetais que não possuem atividade de SSII detectável, apósa modificação genética de acordo com a invenção, em que uma molécula deácido nucleico estranha que codifica uma amido sintase solúvel é introduzidano genoma de uma célula vegetal, exibirão uma atividade de SSII detectável.

Em uma modalidade preferida, o processo de acordo com a in-venção é, além disso, um em que a molécula de ácido nucleico estranhatoma a forma da região codificadora de uma amido sintase solúvel Il heteróloga.

No contexto da presente invenção, uma "amido sintase solúvel Ilheteróloga" é entendida como significando uma amido sintase solúvel Il quenão ocorre naturalmente na célula vegetal, mas cuja seqüência de DNA co-dificadora é introduzida na célula através de métodos recombinantes, talcomo, por exemplo, a transformação da célula. Neste contexto, a seqüênciade DNA codificadora se origina de uma espécie vegetal sem ser aquela dacélula vegetal ou da planta transformada ou não está sob o controle de seupróprio promotor. A seqüência codificadora de DNA se origina preferencial-mente de um gênero de planta sem ser aquele da célula vegetal ou da plan-ta transformada.

No contexto da presente invenção, o termo "gênero de planta" éentendido como significando um nível hierárquico de sistemáticas biológicas.Um gênero compreende uma ou mais de uma espécie. Um exemplo de umgênero é Triticum L. (trigo). Todas as espécies dentro de um gênero semprepossuem um nome binominal que, além do nome genérico, contém adicio-nalmente um epíteto de espécie. Triticum aestivum L. (trigo comum de pani-ficação) é, consequentemente, uma espécie do gênero Triticum.

No contexto da presente invenção, o termo "gene SSN" é enten-dido como significando uma molécula de ácido nucleico ou um polinucleotí-deo (DNA, cDNA) que codifica uma "amido sintase solúvel II". Em uma mo-dalidade adicional, o gene SSII se origina de uma planta monocotiledônea.Em uma modalidade preferida, o gene SSII se origina do trigo.

Em uma modalidade preferida adicional, o processo de acordocom a invenção é um em que é utilizada a amido sintase solúvel II de umaplanta monocotiledônea. Em uma modalidade especialmente preferida, aSSII é codificada pela região codificadora da seqüência de nucleotídeosmostrada na SEQ ID No.1 ou possui a seqüência de aminoácidos mostradana SEQ ID No. 2.

As plantas modificadas geneticamente cujo amido é modificadoatravés do processo de acordo com a invenção podem pertencer a qualquerespécie de planta, isto é, tanto às plantas monocotiledôneas quanto às plan-tas dicotiledôneas. As plantas preferencialmente tomam a forma de plantasde cultivo agrícola, isto é, plantas que são cultivadas pelo ser humano com afinalidade de nutrição ou para finalidades técnicas, em particular, industriaise suas células. O processo de acordo com a invenção é preferencialmenteaplicado em plantas que armazenam amido tais como, por exemplo, ervi-lhas, batata, batata doce, mandioca, milho e arroz.

Em uma modalidade especialmente preferida, o processo deacordo com a invenção é realizado em plantas de arroz.

A presente invenção se refere, além disso, a um amido de arrozcom uma temperatura de início de DSC T entre 70°C e 80°C.

As características térmicas do amido do endosperma do arroz edas farinhas de arroz podem ser analisadas através da calorimetria por var-redura diferencial = DSC. Estas são mostradas na forma da temperatura degelatinização com os valores de início de DSC T (= temperatura de gelatini-zação mais baixa) e de máxima de DSC T (= temperatura de gelatinizaçãomais alta).

No contexto da presente invenção, o termo "temperatura de iní-cio de DSC T" é, portanto, entendido como significando a temperatura querepresenta o início da fase de transição da amostra de amido ou de farinha.É caracterizada como a projeção da linha de base e da tangente desenhadano flanco ascendente do pico ao longo do ponto de flexão.

Surpreendentemente, as plantas de arroz de acordo com a in-venção sintetizam amidos com temperaturas de início de DSC T entre 70°Ce 80°C, em particular, entre 77°C e 80°C. O amido de arroz de acordo com ainvenção, em particular, possui um início de DSC T entre 72 e 79°C, prefe-rencialmente entre 74°C e 79°C, muito particular e preferencialmente entre76°C e 78°C.

Em uma modalidade adicional, os amidos de arroz de acordocom a invenção possuem uma temperatura máxima de DSC T elevada (picode DSC T).

Surpreendentemente, as plantas de arroz de acordo com a in-venção sintetizam amidos com uma temperatura máxima de DSC T entre 80e 87°C, preferencialmente entre 81 e 86°C. Um amido de arroz de acordocom a invenção com uma temperatura máxima de DSC T entre 82°C e 83°Cé especialmente preferido.

No contexto da presente invenção, o termo "temperatura máximade DSC T" é entendido como significando a temperatura em que a curva deDSC atingiu um máximo e a primeira diferenciação da curva é zero.

No contexto da presente invenção, as temperaturas "de início deDSC T" e "máxima de DSC T" são determinadas através do método descritoposteriormente aqui ("análise térmica da farinha/amido de arroz através decalorimetria por varredura diferencial").

O fato de que a temperatura de início de DSC T do amido dearroz de acordo com a invenção foi elevada a tal grau foi extremamente sur-preendente para um versado na técnica, em particular por que o teor de a-mido fosfato dos amidos de arroz de acordo com a invenção era simultane-amente elevado. Isso porque foi postulado até hoje que um maior grau defosforilação leva à desestabilização das duplas hélices e a ordem cristalinado grânulo de amido, que deveria resultar em uma temperatura de início deDSC T reduzida (Safford e outros, (1998) Carbohidrate Polymers 35: 155-168). Os amidos nativos com um alto grau de fosforilação geralmente per-dem sua característica de cristalização a temperaturas notavelmente meno-res que os amidos comparáveis com um baixo teor de fosfato.

Entretanto, o uso de amidos de arroz granulares é desejável emum grande número de etapas de processamento térmico e aplicações. Oque é, portanto, particularmente vantajoso, é a temperatura de início de DSCT alta ou máxima de T dos amidos de arroz de acordo com a invenção, emoutras palavras, a temperatura de formação de pasta surpreendentementealta durante a análise de RV das farinhas de arroz de acordo com a inven-ção, uma vez que esta propriedade torna possível manter a estrutura dosgrânulos de amido a temperaturas elevadas de processo.

Em uma modalidade adicional, o amido de arroz de acordo coma invenção possui um teor de fosfato na posição C6 (C-6-P) entre 0,70 e 2,5nmols de fosfato por miligrama de amido hidrolisado.

Em uma modalidade preferida, o amido de arroz de acordo coma invenção possui um teor de fosfato na posição C6 entre 0,9 e 2,3 nmols defosfato por miligrama de amido. Em uma modalidade especialmente preferi-da, o teor de fosfato da posição C6 fica entre 1,5 e 2,0 nmols de fosfato pormiligrama de amido.

Além disso, a presente invenção se estende ao amido de arrozderivatizado que compreende o amido de arroz de acordo com a invenção.

No contexto da presente invenção, o termo "amido de arroz deri-vatizado" significa um amido de arroz de acordo com a invenção cujas pro-priedades foram modificadas com o auxílio, por exemplo, de processos tér-micos, químicos, enzimáticos ou mecânicos após seu isolamento das célulasvegetais.

Os amidos de arroz de acordo com a invenção são melhor ade-quados como material de partida para a preparação de amidos de arroz de-rivatizados que os amidos convencionais uma vez que, como o resultado domaior teor de amido fosfato, contêm uma maior proporção de grupos funcio-nais reativos e uma vez que o amido de arroz de acordo com a invençãopossui uma maior temperatura de formação de pasta ou maior estabilidadetérmica, que os amidos com um teor de fosfato comparável.

A presente invenção, portanto, se refere ainda a métodos deprodução de um amido de arroz derivatizado de acordo com a invenção, emque o amido de arroz de acordo com a invenção é subseqüentemente modi-ficado.

Em particular, o amido de arroz derivatizado de acordo com ainvenção toma a forma do amido tratado térmicamente e/ou com ácido.

Em uma modalidade adicional, os amidos de arroz derivatizadostomam a forma de éteres de amido, em particular, alquil éteres de amido, O-alil éteres, hidroxilalquil éteres, O-carboxilmetil éteres, éteres de amido con-tendo nitrogênio, éteres de amido contendo fosfato ou éteres de amido con-tendo enxofre.

Em uma modalidade adicional, os amidos de arroz derivatizadostomam a forma de amidos reticulados.

Em uma modalidade adicional, os amidos de arroz derivatizadostomam a forma de polímeros com enxerto de amido.

Em uma modalidade adicional, os amidos de arroz derivatizadostomam a forma de amidos oxidados.

Em uma modalidade adicional, os amidos de arroz derivatizadostomam a forma de ésteres de amido, em particular ésteres de amido queforam introduzidos no amido através da utilização de ácidos orgânicos. Es-pecial e preferencialmente, tomam a forma de amidos fosfato, nitrato, sulfa-to, xantato, acetato ou citrato.

Os amidos de arroz derivatizados de acordo com a invenção sãoadequados para uma variedade de usos na indústria farmacêutica, no setorde alimentos e/ou no setor sem ser de alimentos. Os métodos de preparaçãodos amidos derivatizados de acordo com a invenção são conhecidos peloversado e descritos extensivamente na literatura geral. Uma visão geral dapreparação de amidos derivatizados é encontrada, por exemplo, em Orthoe-fer (em Corn, Chemistry and Technology, 1987, eds. Watson e Ramstad,Capítulo 16, 479-499). A derivatização de amidos de arroz também é descri-ta, por exemplo, em Shih e Daigle (2003, Nahrung 47(1): 64-67).

A presente invenção se refere, além disso, ao uso de amidos dearroz de acordo com a invenção para a preparação de amido derivatizado.

O amido de arroz de acordo com a invenção, na forma nativa ouderivatizada, é adequado para uma variedade de aplicações no setor alimen-tício ou sem ser alimentício. Uma modalidade adicional compreende o usodo amido de arroz derivatizado de acordo com a invenção no setor industrial.Como o resultado do tamanho pequeno de grânulos do amido de arroz deacordo com a invenção, o último é também particularmente adequado para aprodução de papel fotográfico.

A presente invenção se estende, além disso, a uma composiçãoque compreende o amido de arroz de acordo com a invenção.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção se estendeà farinha de arroz que compreende o amido de arroz de acordo com a in-venção.

Em uma modalidade adicional, as farinhas de arroz de acordocom a invenção possuem temperaturas de início de DSC T entre 72°C e81°C preferencialmente entre 74°C e 80°C, em particular, entre 77°C e80°C. Uma farinha de arroz de acordo com a invenção com uma temperaturade início de DSC T entre 76°C e 79°C é especialmente preferida.

Em uma modalidade adicional, as farinhas de arroz de acordocom a invenção possuem temperaturas máximas de DSC T entre 810C e90°C, preferencialmente entre 82°C e 86°C. Uma farinha de arroz com umatemperatura máxima de DSC T entre 82°C e 85°C é especialmente preferi-da.

Em uma modalidade adicional, as farinhas de arroz de acordocom a invenção possuem uma temperatura de formação de pasta RVA PTentre 75 e 90°C, preferencialmente entre 78°C e 88°C, em particular, entre83°C e 86°C e especial e preferencialmente entre 80°C e 85°C na análise deRVA (Rapid Visco Analyser).

No contexto da presente invenção, o termo "temperatura de for-mação de pasta" (RVA PT) significa que o valor medido no início do desen-volvimento da viscosidade de acordo com as análises de RVA é a tempera-tura em que a curva de viscosidade durante o processo de aquecimento dei-xa a linha de base e em que a viscosidade é alterada em mais que 36cPdentro de um período de 0,1 minuto.

No contexto da presente invenção, a "temperatura de formaçãode pasta RVA PT" é determinada com o auxílio do método "análise de fari-nha de arroz através do Rapid Visco Analyser (RVA)" que é descrito posteri-ormente aqui.

Em comparação com as farinhas de arroz das plantas de arrozdo tipo selvagem correspondentes, a farinha de arroz de acordo com a in-venção possui uma temperatura de formação de pasta (RVA PT) elevada.

No contexto da presente invenção, o termo "temperatura de for-mação de pasta (RVA PT) elevada" significa que a temperatura de formaçãode pasta (RVA PT) é 5°C até 15°C, em particular, 6°C até 14°C, preferenci-almente 8°C até 12°C, maior em comparação com a temperatura de forma-ção de pasta RVA PT de farinhas de arroz de plantas de arroz do tipo selva-gem correspondentes.

Em uma modalidade adicional, a farinha de arroz de acordo coma invenção apresenta um período reduzido entre atingir a temperatura deformação de pasta e atingir a vacina máxima.

No contexto da presente invenção, o termo "período reduzidoentre atingir a temperatura de formação de pasta e atingir a viscosidade má-xima" (tempo máximo - tempo de formação de pasta) significa que a dife-rença em termos de tempo de acordo com a análise de RVA como descritoaqui abaixo atinge 40 segundos até 130 segundos, especial e preferencial-mente 50-100 segundos e especial e preferencialmente 60-75 segundos.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção se refere aum método de preparação de uma farinha de arroz de acordo com a inven-ção, em que os grãos de arroz de acordo com a invenção, preferencialmentegrãos de arroz polidos de acordo com a invenção, são moídos. Os métodospara o polimento e a moagem dos grãos de arroz são conhecidos pelo ver-sado e descritos, por exemplo, em Fitzgerald e outros (2003, J. of Agrocult.And Food Chemistry 51: 2295- 2299) ou em Ramesh e outros (1999, Carbo-hidrate Polymers 38: 337-347).

Um "grão de arroz" é tido pelo versado como significando a florfertilizada madura de uma planta de arroz.

A presente invenção se estende ainda ao uso de uma farinha dearroz de acordo com a invenção para a preparação de matérias alimentíciase/ou alimentos para animais.

A presente invenção se refere, além disso, a uma composiçãoque compreende a farinha de arroz de acordo com a invenção.Em uma modalidade adicional, a presente invenção se estendea um grão de arroz que compreende o amido de arroz de acordo com a invenção.

Em uma modalidade preferida, este toma a forma de um grão dearroz processado.

O processamento é entendido pelo versado como significando aconversão do arroz bruto (com casca) em arroz marrom ou branco; os méto-dos de processamento são conhecidos pelos versados e descritos, inter alia,em Fitzgerald e outros (2003, J. of Agrocult. And Food Chemistry 51: 2295-2299) ou em Ramesh e outros (1999, Carbohidrate Polymers 38: 337-347).

Em uma modalidade adicional da presente invenção, o grão dearroz de acordo com a invenção pode ser utilizado para cozimento.

Em uma modalidade adicional, o grão de arroz possui caracterís-ticas alteradas após o cozimento.

No contexto da presente invenção, "características alteradasapós o cozimento" é entendido como significando que as características dogrão de arroz que se referem à qualidade, tais como, por exemplo, a texturaou a dureza dos grãos e a viscosidade dos grãos após o cozimento, em par-ticular, após o resfriamento ou o reaquecimento do arroz cozido, são alteradas.

Em uma modalidade preferida, os grãos de arroz de acordo coma invenção possuem uma viscosidade de -10 até -200 g, preferencialmentede -12 g até -150 g, especial e preferencialmente de -15 g até - 130 g (me-dida em g de força de tensão).

O termo "viscosidade" é entendido pelo versado como signifi-cando o efeito de captação de água e aquecimento durante o cozimento e aconsistência dos grãos de arroz e a adesão dos grãos de arroz a outrosgrãos de arroz ou outras superfícies (por exemplo, garfo, hashi e similares)que este acarreta após o cozimento. No contexto da presente invenção, aviscosidade deve ser entendida como significando a força máxima negativa(força de tensão) que é medida através de um analisador de textura apóscomprimir previamente os grãos de arroz cozidos de forma ótima, como des-crito no método "determinação das características de cozimento e a texturados grãos de arroz cozidos". Um valor negativo alto neste contexto significauma maior viscosidade que um valor negativo mais baixo. No contexto dapresente invenção, "grãos de arroz cozidos de forma ótima" são entendidoscomo significando grãos de arroz que são cozidos durante mais dois minutosadicionais após terem atingido o tempo de cozimento mínimo (quando 90%dos grãos não possuírem mais um centro branco, como é determinado noteste com lâminas de vidro que é descrito por Juliano 1984; J. of Tex. Studi-es 15: 357-376).

Na presente invenção, a viscosidade é medida em grãos de ar-roz cozidos de forma ótima, grãos de arroz que foram armazenados durante22 horas a 4°C e então levados novamente à temperatura ambiente ougrãos de arroz que, após o armazenamento a 4°C (durante 22 horas), foramreaquecidos durante 5 minutos a 80°C em um forno ou que foram reaqueci-dos após o armazenamento a 4°C (22 horas) com o auxílio de um micro-ondas (600W/3 min).

O reaquecimento é entendido pelo versado como significando oreaquecimento uma até quatro vezes do arroz que foi cozido e, o reaqueci-mento intermediário, resfriado, por exemplo, permitindo que fique em repou-so à temperatura ambiente, utilizando um micro-ondas, um forno, um banhode água ou uma estufa aquecida; preferencialmente, é entendido como sig-nificando uma única via de reaquecimento.

Uma vez que a "viscosidade" é um parâmetro de qualidade im-portante para o arroz, os grãos de arroz de acordo com a invenção oferecemusos vantajosos. Isto inclui, acima de tudo, o campo de aplicação de produ-tos semi-acabados que são apenas cozidos rapidamente quando produzi-dos, então secos novamente e reaquecidos ou fervidos apenas rapidamenteantes de seu consumo final (por exemplo, em recintos domésticos, em canti-nas), sem qualquer efeito adverso sobre o sabor e a consistência.

Um parâmetro de qualidade adicional neste contexto é a exten-são da dimensão dos grãos após a fervura em água na direção do eixo lon-gitudinal. Tal alteração no formato é um parâmetro de qualidade visual im-portante, em particular no caso de arroz de grãos longos. Em uma modali-dade adicional da presente invenção, os grãos de arroz de acordo com ainvenção são distinguidos pelo fato de que possuem uma taxa de alonga-mento (ER) de 1,50 até 1,90, especial e preferencialmente de 1,55 até 1,80e particular e preferencialmente de 1,60 até 1,70.

Em uma modalidade adicional da presente invenção, os grãosde arroz de acordo com a invenção possuem uma taxa maior de alongamen-to em comparação com os grãos de arroz de plantas de arroz do tipo selva-gem correspondentes.

No contexto da presente invenção, uma maior taxa de alonga-mento é entendida como significando uma taxa de alongamento que é maiorem 5% até 25%, preferencialmente em 10% até 20%, especial e preferenci-almente em 14% até 18%.

No presente contexto, a "taxa de alongamento" é entendida co-mo significando a proporção do comprimento de grão do grão de arroz cozi-do em relação ao comprimento de grão do grão de arroz não-cozido. O com-primento do grão é medido em mm, como é descrito, por exemplo, no méto-do "medida da alteração nas dimensões dos grãos através do cozimento"; amedida é preferencialmente realizada utilizando um paquímetro.

Em uma modalidade adicional, os grãos de arroz de acordo coma invenção possuem um valor de CDC de 2,8 até 6,2, preferencialmente de3,5 até 5,5 e especial e preferencialmente de 4,0 até 5,0.

O "valor de CDC" (CDC = coeficiente de alterações dimensio-nais) é entendido como significando a proporção da alteração dimensionalao longo do comprimento em relação à alteração dimensional ao longo dalargura como o resultado do cozimento, isto é, a proporção do comprimentodo grão no estado cozido (Lc) em relação ao estado não-cozido (Lu) em re-lação à proporção da largura do grão no estado cozido (Wc) em relação aoestado não-cozido (Wu) = (Lc/Lu)/(Wc/Wu).

Um assunto de objeto adicional da presente invenção se refere auma composição que compreende pelo menos um grão de arroz de acordocom a invenção.A presente invenção compreende, além disso, uma planta dearroz em que pelo menos um grão de arroz de acordo com a invenção cres-ce e/ou que compreende o amido de arroz de acordo com a invenção.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção compreendecélulas vegetais de arroz e plantas de arroz modificadas geneticamente emque a modificação genética leva a uma maior atividade da amido sintasesolúvel Il (SSII) em comparação com as plantas de arroz do tipo selvagemou as células vegetais de arroz do tipo selvagem não-modificadas genetica-mente correspondentes.

Era, além disso, surpreendente que o amido de arroz de acordocom a invenção tivesse uma distribuição modificada de certas cadeias late-rais em comparação com o amido de arroz de células vegetais do tipo selva-gem ou de plantas do tipo selvagem correspondentes.

Em uma modalidade adicional da presente invenção, foi deduzi-do o grau de cadeias laterais de amilopectina com um dp (= grau de polime-rização) de 20 até 25 é aumentado em 5-35% em comparação com o amidode arroz de plantas de arroz do tipo selvagem correspondentes.

No contexto da presente invenção, o termo "aumento do conteú-do de cadeias laterais de amilopectina com um dp (= grau de polimerização)de 20 até 25" significa o aumento do conteúdo de cadeias laterais de amilo-pectina com um DP de 20-25 em 5%- 35%, preferencialmente em 6%-30%,especial e preferencialmente em 8%-24%, em comparação com o conteúdode cadeias laterais com um DP de 20-25 de amilopectina de células vegetaisde arroz do tipo selvagem ou de plantas de arroz do tipo selvagem corres-pondentes.

Em uma modalidade adicional da invenção, o conteúdo de ca-deias laterais de amilopectina com um dp de 6 até 10 é reduzido.

No contexto da presente invenção, o termo "redução do conteú-do de cadeias laterais de amilopectina com um dp de 6 até 10" significa umaredução do conteúdo de cadeias laterais de amilopectina com um DP de 6-10 em 20%-60%, preferencialmente em 25%-55%, especial e preferencial-mente em 30%-55%, em comparação com um conteúdo de cadeias lateraiscom um DP de 6-10 de amilopectina de células vegetais de arroz do tipo sel-vagem ou de plantas de arroz do tipo selvagem correspondentes.

No contexto da presente invenção, a determinação da distribui-ção de cadeias laterais é realizada através do método descrito aqui abaixo("processamento da farinha/amido de arroz para a análise da distribuição decadeias laterais de amilopectina através de cromatografia de troca aniônicaem alta pressão"). A porcentagem de cadeias laterais curtas é determinadaatravés da determinação da porcentagem de uma cadeia lateral específicado total de todas as cadeias laterais. O total de todas as cadeias laterais édeterminado através da determinação da área total sob os picos que repre-sentam os graus de polimerização do DP de 6 até 48 no cromatograma deHPLC. A porcentagem da cadeia lateral específica do total de todas as ca-deias laterais é determinada através da determinação da proporção da áreasob o pico que representa esta cadeia lateral no cromatograma de HPLC emrelação à área total. Para determinar as áreas dos picos, pode ser utilizado oprograma Chromelion 6.60 da Dionex1 EUA, por exemplo.

No contexto da presente invenção, o termo "planta de arroz dotipo selvagem" é tido como significando plantas de arroz que atuam comomaterial de partida para as plantas de arroz de acordo com a invenção, istoé, cuja informação genética, à parte da modificação genética introduzida queleva a um aumento na atividade de uma amido sintase solúvel Il (SSII), cor-responde àquela de uma planta de arroz modificada geneticamente.

Preferencialmente, o termo "planta de arroz do tipo selvagem" serefere à variedade M202, uma variedade de arroz com amilopectina do tipoS com um valor de 25,2%, cujos grãos foram depositados em 17 de novem-bro de 2005, na NCIMB Ltd. depository, Ferguson Building, Craibstone Esta-te, Bucksburn, Aberdeen, Escócia, AB21 9YA, Reino Unido como o númeroda NCIMB 41352.

No contexto do processo de acordo com a invenção, a modifica-ção genética compreende preferencialmente a introdução de pelo menosuma molécula de ácido nucleico estranha que codifica uma amido sintasesolúvel Il (SSII) dentro do genoma de uma célula vegetal, a dita introduçãode pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha resultando no fatode que o amido que pode ser obtido partindo da célula vegetal modificadageneticamente e da planta regenerada partindo da mesma possui, como oresultado da expressão da SSII que foi introduzida, um maior teor de fosfatona posição C6 em comparação com as células vegetais do tipo selvagemnão-modificadas geneticamente correspondentes.

Em uma modalidade adicional da presente invenção, a introdu-ção de pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha resulta na sín-tese de um amido de arroz de acordo com a invenção.

Em uma modalidade preferida, as plantas de arroz e as célulasvegetais de arroz de acordo com a invenção são aquelas em que a moléculade ácido nucleico estranha é a região codificadora de uma amido sintasesolúvel II heteróloga.

Está disponível um grande número de técnicas para a introduçãode DNA em uma célula vegetal hospedeira. Estas técnicas compreendem atransformação de células vegetais com T-DNA utilizando Agrobacterium tu-mefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como o agente de transformação, afusão de protoplastos, a injeção, a eletroporação de DNA, a introdução doDNA através da abordagem de biolística e outras possibilidades.

A transformação de plantas monocotiledôneas através de veto-res baseados na transformação com Agrobacterium foi descrita, por exem-plo, em Chan e outros, 1993, Plant Mol. Biol. 22: 491-506; Hiei e outros,1994, Plant J. 6: 271-282; Deng e outros, 1990, Science in China 33: 28-34;Wilmink e outros, 1992, Plant Cell Reports 11: 76-80; May e outros, 1995,Bio/Technology 13: 486-492; Conner e Domisse, 1992, Int. J. Plant Sei. 153:550-555 e em Ritchie e outros, 1993, Transgenic Res. 2: 252-265. Sistemasalternativos para a transformação de plantas monocotiledôneas são: a trans-formação através da abordagem de biolística (Wan e Lemaux, 1994, PlantPhysiol. 104: 37-48; Vasil e outros, 1993, Bio/Technology 11: 1553-1558;Ritala e outros, 1994, Plant Mol. Biol. 24: 317-325; Spencer e outros, 1990,Theor. Appl. Genet. 79: 625- 631), a transformação de protoplastos, a ele-troporação de células parcialmente permeabilizadas e a introdução de DNAatravés de fibras de vidro. A transformação bem-sucedida de várias espéciesde cereais foi descrita, por exemplo, para a cevada (Wan e Lemaux, supra·,Ritala e outros, supra\ Krens e outros, 1982, Nature 296: 72-74), para o trigo(Nehra e outros, 1994, Plant J. 5: 285-297), arroz (lshida e outros, 1996, Na-ture Biotechnology 14 (6): 745-750) e milho (Koziel e outros (1993), Biotech-nology 11: 194-200).

A regeneração das células vegetais modificadas geneticamentedo processo de acordo com a invenção resulta na produção de plantas modi-ficadas geneticamente cuja informação genética corresponde àquela de umaplanta do tipo selvagem não-modificada geneticamente correspondente eque contém a mesma modificação genética introduzida para aumentar a ati-vidade de uma amido sintase solúvel Il que já está presente nas células ve-getais modificadas geneticamente do processo de acordo com a invenção.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere aplantas de arroz do grupo japonica (Oryza sativa var. japonica), que compre-ende variedades de arroz de grãos curtos e de grãos longos tais como, porexemplo, arroz pegajoso, arroz doce, arroz mochi, arroz nishiki, arroz ribe,arroz vermelho, arroz preto, arroz para sushi. Em uma modalidade especi-almente preferida da presente invenção, as plantas de arroz do tipo selva-gem do grupo japonica são utilizadas como o material de partida para a pro-dução das plantas de arroz de acordo com a invenção.

Em uma modalidade muito especialmente preferida adicional, apresente invenção se refere a plantas de arroz com amilopectina do tipo S.

Na amilopectina do arroz, os tipos LeS podem ser distinguidos.A amilopectina do tipo L é predominantemente encontrada no arroz do grupoindica, enquanto que a amilopectina do tipo S, em contraste, é encontradano arroz do grupo japonica. No contexto da presente invenção, a amilopecti-na do tipo S é distinguida pelo fato de que, em comparação com o tipo L, aquantidade das cadeias de alfa-1,4-glucana curtas (DP <=10) eqüivale atémais que 20% do total das cadeias de a-1,4-glucana de DP <= 24 (Nakamu-ra 2002, Starch 54: 117-131).

Em uma modalidade muito especialmente preferida, a presenteinvenção compreende plantas de arroz modificadas geneticamente (Oryzasativa var. japonica) dos transformantes GAOS0353-02301, GAOS0353-01301 e GAOS0353-01502. A semente do transformante M202 GAOS0353-01502 foi depositada em 17.11.2005 na NCIMB Ltd., Ferguson Building,Craibstone Estate1 Bucksburn, Aberdeen1 Escócia, AB21 9YA, Reino Unido,sob o número da NCIMB 41353.

Em uma modalidade adicional, a farinha de arroz de acordo coma invenção possui um conteúdo menor de amilose aparente que a farinha dearroz de plantas de arroz do tipo selvagem correspondentes. No contexto dapresente invenção, o conteúdo de amilose aparente é preferencialmente de-terminado com o auxílio do método "determinação do conteúdo de amiloseaparente" descrito posteriormente aqui. Em uma modalidade preferida, oconteúdo de amilose aparente da farinha de arroz de acordo com a invençãoé reduzido em 10% até 20%, especial e preferencialmente em 12% até 18%e muito especial e preferencialmente em 13% até 15% em comparação como conteúdo de amilose aparente na farinha de plantas de arroz do tipo sel-vagem correspondentes.

Em uma modalidade adicional da invenção, a molécula de ácidonucleico estranha introduzida, que codifica uma amido sintase solúvel II, estásob o controle de um promotor específico ao endosperma. Os promotoresespecíficos ao endosperma tornam possível aumentar especificamente aquantidade do produto da transcrição das moléculas de ácidos nucleicosestranhas que codificam uma amido sintase solúvel Il no endosperma dasplantas de acordo com a invenção em comparação com o endosperma deplantas do tipo selvagem correspondentes.

É preferido utilizar promotores para uma expressão específicaao endosperma, tal como, por exemplo, o promotor da glutelina do arroz(Leisy e outros (1990) Plant Mol. Biol. 14: 41-50; Zheng e outros (1993) PlantJ. 4: 357-366), o promotor HMWG do trigo (Anderson e outros (1989) NucleicAcid Res 17: 461-462), os promotores GBSSII do trigo (WO 02/02785), opromotor USP (Báumlein e outros (1991) Mol. Gen Genetics 225: 121- 128),o promotor da faseolina do feijão (Kawagoe e Murai (1992) Plant J 2 (6):927-36), os promotores dos genes Zein do milho (Pedersen e outros, (1982)Celi 29: 1015-1026; Quatroccio e outros, (1990) Plant Mol. Biol. 15: 81-93), opromotor shrunken-1 (sh-1) do milho (Werr e outros (1985) EMBO J. 4:1373-1380) ou os promotores da prolamina do arroz (Qu & Takaiwa (2004)Plant Biotechnology Journal, 2: 113-125).

É especialmente preferido utilizar o promotor da globulina doarroz (Nakase e outros (1996) Gene 170(2): 223-226).

Em uma modalidade adicional, a presente invenção se refere aum método de produção de uma planta de arroz de acordo com a invenção,em que uma planta de arroz de acordo com a invenção é regenerada deuma célula vegetal de arroz de acordo com a invenção e em que, após aregeneração, são selecionadas tais plantas de arroz em que a superexpres-são da amido sintase solúvel Il resulta em uma maior atividade de SSII.

No contexto da presente invenção, o termo seleção significaque, dentro de uma população, uma característica escolhida deliberadamen-te é o critério de acordo com o qual as plantas que exibem esta característi-ca são cultivadas, enquanto que aquelas que não exibem a característicadesejada são descartadas.

No contexto da presente invenção, as plantas que foram sele-cionadas eram aquelas que possuíam a característica de maior atividade deSSII.

A presente invenção se refere, além disso, ao material de pro-pagação das plantas de arroz modificadas geneticamente de acordo com ainvenção, que contêm as células vegetais de arroz de acordo com a invenção.

Neste contexto, o termo "material de propagação" compreendeaquelas partes da planta que são adequadas para a produção de progênieatravés da rota vegetativa ou sexual. Aquelas que são adequadas para apropagação vegetativa são, por exemplo, mudas ou culturas de calos. O ma-terial de propagação compreende, por exemplo, frutos, sementes, plantasjovens partindo de sementes, protoplastos, culturas de células e similares. Omaterial de propagação é preferencialmente grãos contendo endosperma.Os grãos de arroz de plantas de arroz de acordo com a inven-ção, que compreendem células vegetais modificadas geneticamente, consti-tuem um assunto de objeto adicional da presente invenção.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção compreendeum método de produção de um amido de arroz modificado de acordo com ainvenção, que compreende a extração do amido de uma planta de arroz deacordo com a invenção e/ou de grãos de arroz de acordo com a invençãoe/ou da farinha de arroz de acordo com a invenção. Os métodos de extraçãosão conhecidos pelos versados e descritos, por exemplo, em Wang e Wang(2004, Journal of Cereal. Science 39: 291-296) ou Patindol e Wang (2003, J.Agric Food Chem. 51: 2777-2784).

Em uma modalidade adicional, a presente invenção se refere aamidos resistentes cuja digestibilidade é reduzida em comparação com adigestibilidade de amidos de plantas do tipo selvagem.

A digestibilidade de alimentos é determinada inter alia pelo tipode amido que contêm. Muitos constituintes do alimento são degradadosmesmo em seu caminho para, assim como dentro, do estômago e do intesti-no delgado. Alguns amidos são, entretanto, degradados apenas no intestinogrosso e são, portanto, referidos como amidos resistentes (= RS). Estes po-dem ser divididos em quatro tipos. O primeiro tipo (RS 1) inclui o amido inse-rido dentro de células intactas. Sua acessibilidade para as enzimas digesti-vas é, portanto, apenas fraca. Isto se aplica, por exemplo, ao amido dentrode grãos de cereais inteiros ou grosseiramente moídos e à parte do amidonos legumes. O segundo tipo (RS 2) inclui o amido que não é digerido naforma nativa no intestino delgado. A razão neste caso é a estrutura dosgrãos de amido e a distribuição das moléculas de amido no grão de amido. Éincluído aqui, por exemplo, o amido as batatas cruas, nas bananas verdesou nas variedades de milho ricas em amilose (amilomilho). O terceiro tipo(RS 3) abrange o assim chamado amido retrodegradado. Este é produzidoapós o resfriamento de produtos alimentícios contendo amido aquecidos taiscomo pão e batatas cozidas. Durante esse processo, parte das moléculas deamido se rearranja e zonas cristalinas são formadas e ficam inacessíveispara as enzimas digestivas (por exemplo, amiloses). O quarto tipo (RS 4)inclui amido modificado quimicamente que não pode ser digerido que é pro-duzido, por exemplo, através da reticulação ou da esterificação (acetilaçãoetc.).

O efeito promotor de saúde dos amidos resistentes consiste, emparticular, de suas reações bacterianas que influenciam a fermentação, au-mentando o peso das fezes e levando à produção de ácidos graxos de ca-deia curta que representam o suprimento de energia principal para as célu-las da mucosa do intestino grosso. Em adição, uma função importante nainibição de tumores é atribuída ao butirato (detalhes adicionais devem serencontrados inter alia em Wisker (2001), UGB-Forum 01: 75-77).

Os níveis de glicose e/ou de insulina, por exemplo, nos consu-midores de pão contendo uma alta proporção de grãos de cereais inteiros (eassim RS1) são menores que com o pão feito de cereais finamente moídos.Um aumento menor na glicose do sangue foi similarmente observado commuitos legumes. Isto indica que o amido resistente do tipo 1 influencia noefeito que um produto alimentício possui sobre a glicose do sangue. Além daglicose e da insulina no sangue, são também muito importantes para aqueima de gorduras os carboidratos. Um nível de insulina continuamenteflutuante interfere com a queima de gorduras e leva adicionalmente a umaumento da sensação de fome. Por esta razão, os carboidratos cuja digesti-bilidade é baixa ou diminuída e que levam assim a apenas um ligeiro aumen-to no nível de insulina são vantajosos. É assim possível que tais amidos, emprodutos apropriados, satisfaçam todos os requerimentos de uma dieta queenvolve a absorção de pequenas quantidades de carboidratos (= "Baixo Te-or de Carboidratos").

Deduziu-se que os amidos do método de acordo com a invençãoexibem uma digestibilidade distintamente reduzida em comparação com oamido do tipo selvagem. Isto era evidente quando o amido isolado (figura 3)foi investigado. Assim, os amidos produzidos através do método de acordocom a invenção exibem uma alta qualidade nutricional que torna possível ouso tanto para uma dieta com maior quantidade de fibras quanto na área de"Baixo Teor de Carboidratos" e além.

O versado na técnica distingue os amidos de acordo com o tem-po necessário para a digestão: o amido que leva 20 minutos para ser digeri-do é chamado de "amido digerido rápido (RDS)", o amido que leva 60 minu-tos é chamado de "amido que é digerido lentamente (SDS)" e o amido que émantido após 120 minutos é chamado de "amido resistente (RS)".

Surpreendentemente, a digestibilidade do amido isolado é redu-zida. São preferidos os amidos com uma redução de 10 até 65% na digesti-bilidade comparado com o do tipo selvagem, uma redução na digestibilidadede 10 até 55% é particularmente preferida, uma redução de 12 até 45% émuito particularmente preferida e uma redução de 15 até 30% é mais parti-cularmente preferida.

Isto significa, que a porcentagem de amido resistente RS nosamidos de acordo com a invenção é maior em comparação com o amido dotipo selvagem. O conteúdo de RS é determinado como a diferença partindodo peso seco total do amido (100%) menos a porcentagem da glicose calcu-lada partindo do amido total após 120 minutos (como descrito no método 15abaixo). Neste contexto, um aumento significa um aumento do conteúdo deRS para 100-750%, preferencialmente para 150-700% e especial e prefe-rencialmente para 200-600%.

Em uma outra modalidade, os amidos de arroz de acordo com ainvenção exibem um conteúdo de RS de 15%-45%, preferencialmente a17%-40% e mais preferido de 20%-38%.

A presente invenção abrange ainda plantas e células vegetaisque compreendem um amido que foi produzido através do método de acordocom a invenção e que exibe uma digestibilidade reduzida em comparaçãocom o amido das plantas do tipo selvagem correspondentes ou das plantasdo tipo selvagem.

Materiais e métodos

Os métodos a seguir foram utilizados nos exemplos. Estes mé-todos podem ser utilizados para a realização dos métodos de acordo com ainvenção; estes representam modalidades específicas da presente invenção,mas não limitam a presente invenção a estes métodos. Os versados sabemque a invenção pode ser realizada igualmente através da modificação dosmétodos descritos e/ou através da substituição das seções metodológicasindividuais por seções metodológicas alternativas. Uma exceção é apenas ométodo "determinação do conteúdo da glicose-6-fosfato ligada ao amido",que, no contexto da presente invenção, é somente realizada da maneiradescrita abaixo sob 14.

1) Material vegetal e cultivo

Plantas de arroz: Oryza sativa, grupo japonica, variedade M202.

A semente foi depositada na NCIMB Ltd. (National Collection ofIndustrial Bactéria, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn; Aber-deen, AB21 9YA, Reino Unido) em 17.11.2005. O tipo selvagem da varieda-de de semente M202 recebeu o número de depósito da NCIMB 41352; asemente do transformante M202-GAOS0353-01502 recebeu o número dedepósito da NCIMB 41353.

As plantas de arroz foram cultivadas na estufa sob as seguintescondições de regime: Semeadura: substrato: mistura de 100% de turfa sfag-no e 100 L de areia/qm e argila: 180 kg/qm em vasos de rosa de 1,6 L (fabri-cante: H. Meyer, Alemanha). pH: 5,4-6,2: Adubo dos grãos: Hakaphos(Compo, Alemanha) 14% de N -16% de P -18% de K + 2% de Mg; 2 kg/qm;Alimentação: 3,5 g/planta até o florescimento: NH4NO3 (1,75 g) e Flory 2 Ba-sis (fabricante: Euflor, Alemanha): 1,75 g; 3% de N -16% de P -15% de K +5% de Mg. Temperatura: dia 28°C/noite: 24°C (16 h/8 h); umidade atmosféri-ca relativa: 85-95%; Luz: 16 h, 350pEinstein/s χ qm

2) Origem das seqüências e das construções utilizadas para a transformação

A seqüência Ta_SSIIa do trigo foi utilizada para a transformaçãodo arroz. O isolamento e a clonagem foram realizados como descrito no WO97-45545 (então sob o nome "pTaSSI"). O vetor de transformação utilizado,AH32-191, é descrito no Exemplo 1.

3) Transformação e regeneração de plantas de arroz

As plantas de arroz foram transformadas e regeneradas atravésdo método descrito por Ishida e outros (1996, Nature BioTechnoIogy, 14 (6):745-750).

4) Processamento de grãos de arroz

Para gerar quantidades suficientes de materais para estudo, asplantas de arroz foram cultivadas sob condições de estufa e colhidas quandocompletamente maduras. Para a secagem adicional, os grãos de arroz ma-duros (isto é, completamente desenvolvidos) foram armazenados durante 3-7 dias a 37°C.

Depois disso, os grãos são liberados das cascas através de umdescascador (Laboratory Paddy sheller, Grainman, Miami, Flórida, EUA) e oarroz marrom resultante é processado através do polimento durante 1 minu-to (Pearlest Rice Polisher, Kett, Villa Park, CA) para fornecer o arroz branco.O último é utilizado como o material de partida para as análises do grão in-teiro tal como, por exemplo, o valor de espalhamento em álcali, as dimen-sões dos grãos, o peso dos grãos e similares.

Para estudar a composição dos grãos e as características doamido e da farinha, os grãos brancos são moídos através de um moinho delaboratório (Cyclotec, Amostra mill, Foss, Dinamarca) para fornecer uma fa-rinha de arroz. O princípio do moinho de laboratório é que o estoque do moi-nho deixa a câmara de moagem somente quando um tamanho de particula-do menor que 0,5 mm foi atingido. O processo de moagem está completoquando todo o material da amostra tiver deixado da câmara de moagem.

5) Análise do nível de expressão da amido sintase Il através de Northern blot

A expressão da amido sintase Il do trigo no arroz foi analisadaatravés de Northern blot. Para este fim, três grãos de arroz imaturos (apro-ximadamente 15 dias após o florescimento) foram estudados para cada e-vento transgênico independente. Com a finalidade de homogeneização, osgrãos de arroz congelados foram agitados em um moinho Retsch (modeloMM300) em uma placa de 96 poços com uma bola de aço de 4,5 mm duran-te 30 segundos na freqüência de 30 hertz. Depois disso, o RNA foi isoladoatravés do kit de extração de RNA da Promega na escala de 96 poços se-guindo as instruções do fabricante (SV 96 Total RNA Isolation System, OrderNo. Ζ3505, Promega, Mannheim).

2 pg de RNA por amostra foram levados para um volume uni-forme e tratados com um volume idêntico de tampão de amostra de RNA(65% (v/v) de formamida, 8% de formaldeído, 13% (v/v) de tampão de gel(ver acima), 50 pg/mL de brometo de etídio). Após o aquecimento (10 min,65°C) e o resfriamento imediato em gelo, o RNA foi separado durante apro-ximadamente 2 horas a uma amperagem constante de 50-80 mA em um gelde agarose a uma concentração de 1,2% (p/v) (MOPS a 20 mM pH 8,0, ace-tato de Na a 5 mM, EDTA a 1 mM, 6% (v/v) de formaldeído), utilizando tam-pão de corrida de RNA (MOPS a 20 mM pH 8,0, acetato de Na a 5 mM, ED-TA a 1 mM).

Depois disso, o RNA foi transferido para uma membrana HybondN através de um "blot" por difusão utilizando 10x SSC (NaCI a 1,5 M, citratode Na a 150 mM pH 7,0) e imobilizado sobre a membrana através de irradia-ção com UV.

Um fragmento de aproximadamente 1 kb de Spel/BspHI doplasmídeo AH32-191 (Bp 4568-5686), que constitui a região a 5' do cDNA deSSII, foi utilizado para a hibridização do Northern blot. O fragmento de DNAfoi marcado radioativamente através do kit "Random primed DNA labeling"da Roche (Order No. 1004 760) utilizando 32P-a-dCTP de acordo com asinstruções do fabricante.

O Northern blot foi pré-incubado durante 4 horas a 60°C comagitação suave em um banho de água com tampão de hibridização (tampãofosfato de Na a 250 mM pH 7,2, EDTA a 1 mM, 6% (p/v) de SDS, 1% (p/v)de BSA) antes do DNA marcado radioativamente ter sido adicionado para ahibridização. Após a incubação durante 16 horas, a solução de hibridizaçãofoi removida e a membrana foi lavada no banho de água em sucessão ao3xSSC e ao 2xSSC (ver acima) a 60°C com agitação suave para remover asmoléculas de DNA ligadas de forma inespecíficas. Para detectar o RNAmarcado, a membrana foi autorradiografada em um filme de raio X duranteum até três dias a -70°C.

6 - Determinação da atividade de SSII através de gelAs atividades diferentes da amido sintase nos grãos de arrozimaturos foram detectadas através de géis de atividade (zimogramas), nosquais os extratos de proteína são separados em um gel de poliacrilamidasob condições nativas e subseqüentemente incubados com substratos ade-quados. O produto de reação formado (amido) foi corado através de umasolução de Lugol (2% (p/v) de Kl; 0,2% (p/v) de I2) no gel.

Os grãos de arroz imaturos isolados (aproximadamente 15 diasapós o florescimento, medido partindo do dia do início da florescência) foramcongelados para choque em nitrogênio líquido e homogeneizados em 150-200 μL de tampão de extração gelado (Tris/HCI a 50 mM pH 7,6, EDTA a 2,5mM, DTT a 2 mM, PMSF a 4 mM, 0,1% (p/v) de glicogênio, 10% (v/v) de gli-cerol). Após a centrifugação (15 min, 13 000 g, 4°C), o sobrenadante trans-lúcido foi transferido para um recipiente de reação novo e uma alíquota doextrato foi utilizada para determinar o teor de proteína através do método deBradford (1976, Anal Biochem 72: 248-254).

Os extratos de proteína foram separados através de um gel depoliacrilamida com concentração contínua de 7,5% (7,5% de AAJBAA 37,5:1;Tris/HCI a 25 mM pH 7,6, glicina a 192 mM, 0,1% (p/v) de APS, 0,05% (v/v)de TEMED) utilizando tampão de corrida a uma concentração (Tris/HCI a 25mM, glicina a 192 mM). Antes de carregar no gel, foi realizada uma pré-corrida para a remoção de radicais livres durante 30 minutos a 8 mA e 4°C.15 pg de proteína foram aplicados para cada amostra e submetidos à eletro-forese durante 2-2,5 horas a 4°C.

Depois disso, os géis foram incubados durante a noite à tempe-ratura ambiente em 15 mL de tampão de incubação (citrato de sódio a 0,5 MpH 7,0, acetato de potássio a 25 mM, EDTA a 2 mM, DTT a 2 mM, 0,1%(p/v) de amilopectina, tricina/NaOH a 50 mM pH 8,5, ADP- glicose a 1 mM),com agitação contínua. O amido formado foi corado através de uma soluçãode Lugol.

Para determinar a extensão do aumento da atividade de SSIIatravés de zimogramas, os extratos de proteína das linhagens modificadasgeneticamente foram diluídos em etapas e utilizados de acordo com o méto-do descrito anteriormente. Após corar os zimogramas com a solução de Lu-gol, a extensão do aumento na atividade foi determinada através da compa-ração visual da intensidade da banda de SSII para as diluições diferentescom o tipo selvagem não-diluído.

7) Extração do amido de arroz da farinha de arroz

A extração do amido de arroz da farinha de arroz foi realizadaatravés de um método similar ao descrito por Wang e Wang (2004; Journalof Cereal Science 39: 291-296).

10 g de farinha de arroz foram incubados com 40 mL a 0,05%(p/v) de NaOH durante 16-18 horas em um agitador à temperatura ambiente.Depois disso, a suspensão foi transferida para dentro de um misturador War-ring para completar a digestão e misturada durante 15 segundos à velocida-de baixa e então durante 45 segundos à velocidade alta. Para remover osconstituintes mais grosseiros (por exemplo, parede celular), a suspensão foipassada através de uma peneira de tamanho de mescla de 125 pm e entãopor uma peneira de tamanho de mescla 63 pm. Após a centrifugação a 1500rpm durante 15 minutos (Microfuge 3.OR; Heraeus), o sobrenadante foi ex-traído por decantação e a camada de proteína, que estava na superfície dopélete, foi removida utilizando uma espátula. O restante do pélete foi ressus-penso em 0,05% (p/v) de NaOH e o procedimento descrito anteriormente foirepetido. Depois disso, o pélete foi ressuspenso em água e o pH da suspen-são foi levado para 6,5-7 utilizando HCI. O amido de arroz obtido foi lavadocom água (3 vezes no total), cada etapa de lavagem compreendendo sedi-mentação (1500 rpm, 15 min, à temperatura ambiente), descarte do sobre-nadante e ressuspensão em água fresca. Antes da última etapa de lavagem,o pH foi verificado novamente e, se apropriado, levado a pH 7 com HCI. opélete de amido de arroz da última etapa de lavagem foi ressuspensa emacetona e sedimentada e o sobrenadante foi descartado. Após o pélete tersido novamente ressuspenso em acetona, a suspensão foi vertida dentro deuma placa de Petri à temperatura ambiente em uma câmara de emanaçãode gases durante pelo menos 18 horas.

Em uma última etapa, o amido de arroz foi triturado em um pilãoe almofariz para fornecer um pó fino, que foi empregado diretamente em to-das as análises adicionais.

8) Processamento de farinha/amido de arroz para estudo da distribuição decadeias laterais de amilopectina através de cromatoqrafia de troca aniônicaem alta pressão

Para cada amostra, 10 mg de farinha de arroz ou de amido dearroz foram pesados em uma cuba Eppendorf de 2 ml_ e tratados com 250μL de 90% (v/v) de DMSO. Após a amostra ter sido dissolvida com agitaçãoa 60°C, 375 μL de água foram adicionados e a mistura foi incubada duranteuma hora a 95°C. 300 pL de acetato de sódio a 16,7 mM, pH 3,5 e 0,5 U deisoamilase de Pseudomonas sp. (Megazyme; Bray, Irlanda) foram adiciona-dos a 200 pL da mistura de reação. Após a incubação durante 24 horas a37°C, mais 0,5 U de isoamilàse foi adicionada e a incubação foi continuadadurante mais 24 horas.

Para a cromatografia, 100 pL da mistura de reação foram diluí-dos 1:5 com água e subseqüentemente filtrados através de tubos de filtroUItrafree-MC (Millipore). Aproximadamente 90 pL do filtrado foram injetados.

Cromatografia:

Método:

Sistema de HPLC: GP 50 Dionex Gradient Pump

ED 50 Dionex Electrochem. Detector/ PADAS 50 AutosamplerForno de coluna

Coluna: Dionex CarboPac PA 100 4 χ 250 mm (P/N 046110)com coluna guarda 1004 χ 50 mm (P/N 046115)

A configuração do equipamento é descrita na Figura 4.Programa de HPAEC:

Pressão Limitelnferior = 50Pressão LimiteSuperior = 3500

% A.Equacionar = "NaOH a 0,15 M"

% B.Equacionar = "NaOAc a 1,0 M"% C.Equacionar = "NaOAc a 1,0 M em NaOH a 0,15 M"% D.Equacionar = "Agua Milipore"

ECD.Taxa_de_Co!eta_de_Dados = 1,0

Forma da onda Tempo = 0,00, Potencial = 0,05

Forma da onda Tempo = 0,20, Potencial = 0,05, Integração =

Forma da onda Tempo = 0,40, Potencial = 0,05, Integração =

Forma da onda Tempo = 0,41, Potencial = 0,75Forma da onda Tempo = 0,60, Potencial = 0,75Forma da onda Tempo = 0,61, Potencial = -0,15

Forma da onda Tempo = 1,00, Potencial = -0,15Célula = LigadaVolume de Fluxo = 500Espera Estado de FluxoAltura da Agulha = 2

Volume do Segmento de Corte = 10Velocidade da Seringa = 4;Ciclo = 0

Espera Pela Temperatura = FalsoEspera Amostra Pronta

0,000 Fluxo = 1,00%B = 0,0%C = 0,0%D = 0,0curva= 5

CargaInjeçãoEspera

ECD AutozeroECD_1 .AcqOn

Fluxo = 1,00%B = 0,0%C = O1O%D = 0,0Curva = 55,000 Fluxo = 1,00% B = 11,0

%C = 0,0%D = 0,0Curva = 5Fluxo = 1,00%B = 11,0

%C = 0,0%D = 0,0Curva = 4130,000 Fluxo = 1,00%B = 35,0

%C = 0,0%D = 0,0Curva = 4132,000 Fluxo = 1,00%B = 0,0

%C = 100,0%D = 0,0Curva = 5133,000 Fluxo = 1,00%B = 0,0

%C = 100,0%D = 0,0Curva = 5142,000 Fluxo = 1,00%B = 0,0

%C = 0,0%D = 0,0Curva = 5143,000 Fluxo = 1,00%B = 0,0%C = 0,0%D = 95,0

Curva = 5152,000 Fluxo = 1,00%B = 0,0%C = 0,0%D = 95,0

Curva = 5ECD_1 .AcqOffFim

A avaliação de dados é realizada utilizando Dionex Chromeleonv6.60 (Dionex Corporation, Sunnyvale, Califórnia, EUA). A Versão 6.60 do"Manual Tutorial e do Usuário", março de 2004, pode ser obtida na Dionexou baixada na home page (http://www.dionex.com).

Para comparar os cromatogramas contra um outro, os picos i-dentificados, dos maltooligossacarídeos diferentes, foram normalizados paracada cromatograma (soma de todas as áreas de pico = 1). A avaliação sebaseava na "linha de base com força comum", como descrito em Dionex C-hromeleon v.6.60 para "linha de base em log". Para fazê-lo, a linha de baseem log é colocada logo antes do primeiro pico de cadeia lateral e até o últi-mo pico que possa ser avaliado do cromatograma mais curto de uma distân-cia de medida; isto forma a base para o cálculo do último pico que pode seravaliado para todos os cromatogramas.

9) Determinação das características de cozimento e da textura dos grãos dearroz cozidos

Os grãos de arroz brancos que foram processados como descri-to sob 4) "Processamento de grãos de arroz" foram utilizados para a deter-minação das características de cozimento. Antes do cozimento, as dimen-sões dos grãos e o peso dos grãos foram determinados. O cozimento acar-retou em uma proporção de água-arroz de 20:1.

A água foi levada até a fervura, o arroz foi adicionado e a entra-da de calor foi reduzida de forma que a água foi mantida em fervura suave-mente (durante este processo, o arroz foi misturado a cada 3 minutos). Otempo de cozimento mínimo foi determinado através do teste com lâminasde vidro como descrito por Juliano (1984; J. of Tex. Studies 15: 357-376).Para fazê-lo, em cada caso 10 grãos foram espremidos entre duas lâminasde vidro em intervalos de 1 minuto. O tempo de cozimento mínimo foi atingi-do no ponto de tempo em que 90% dos grãos não exibiam mais um centrobranco. O tempo de cozimento ótimo foi atingido através do prolongamentodo processo de cozimento em dois minutos adicionais. O arroz foi forçadoatravés de uma peneira e resfriado à temperatura ambiente. Depois disso,as dimensões dos grãos e o peso dos grãos cozidos foram novamente de-terminados. A textura foi medida utilizando grãos de arroz recém-cozidos(aproximadamente 1 h após o cozimento), em grãos de arroz que foram ar-mazenados durante 22 horas a 4°C e reaquecidos até a temperatura ambi-ente e em grãos de arroz que foram armazenados a 4°C (durante 22 horas)e então reaquecidos utilizando um forno ou um micro-ondas. Para reaqueceros grãos de arroz cozidos no forno, os primeiros foram colocados em umprato de alumínio que foi selado com folha de alumínio para evitar perdas naumidade. O prato foi incubado no forno durante 20 minutos a 80°C. O rea-quecimento dos grãos no micro-ondas foi realizado em um recipiente paramicro-ondas adequado durante 3 minutos a 360 watts. Após os dois proces-sos de reaquecimento, os grãos foram armazenados durante 30 minutos àtemperatura ambiente para garantir a temperatura uniforme dos grãos duran-te a medida.

A textura do arroz cozido proveniente dos experimentos descri-tos anteriormente foi medida utilizando um Texture Analyser TAXT2 (StableMicro Systems, Godalming, Reino Unido) com uma sonda circular de 2,5 cmde diâmetro e um teste de compressão dupla como o método de medida (a-daptado de Champagne e outros (1998) Cereal Chem. 75 (2): 181-186). Pa-ra fazê-lo, os grãos de arroz foram comprimidos em um primeiro ciclo, entãodescomprimidos e recomprimidos, a força que os grãos aplicam sobre asonda (pressão ou tração) sendo registrada continuamente. Cada amostraque seria analisada foi submetida a dez medidas sobre, em cada caso, trêsgrãos, os grãos de arroz sendo colocados sob a sonda de tal maneira quenão toquem um ao outro nem se estendam além das extremidades da son-da. Os parâmetros registrados eram a dureza (H) dos grãos de arroz cozidos(força máxima durante a primeira etapa de compressão) e a pegajosidade (-H) (força mínima após a primeira etapa de compressão), ver a figura 2. To-das as medidas de uma amostra foram avaliadas separadamente e formaestabelecidas depois disso médias para os parâmetros em questão.

10) Medida da alteração na dimensão dos grãos como o resultado do cozi-mento

As dimensões dos grãos (comprimento, largura e área) foramdeterminadas utilizando o software "SigmaScan Pro" Versão 5.0.0 da Systat(Erkrath, Alemanha). Para fazê-lo, em cada caso 30 grãos de arroz (não-cozidos e cozidos) sofreram varredura e a imagem formada foi avaliada a-través do software. Foram registrados ou calculados os parâmetros a seguir:

Lu - Comprimento do grão de arroz não-cozido

Wu - largura do grão de arroz não-cozido

Lc - Comprimento do grão de arroz não-cozido

Wc - largura do grão de arroz não-cozido

Proporção de L/W = Lu/Wu ou LJWc

ER - taxa de alongamento = Lc/Lu

CDC - Coeficiente de alteração dimensional = (Lc-Lu)/(Wc-Wu)

11) Análise térmica de farinha/amido de arroz através de calorimetria porvarredura diferencial (= DSC)

Aproximadamente 10 mg (peso seco) de farinha de arroz ou deamido de arroz foram pesados em cubas de aço inoxidável (Perkin Elmer,"Large Volume Stainless Steel Pans" [03190218], Volume 60 μ1_) em um ex-cesso de água duplamente destilada (preferencialmente 30 μΙ_) e as cubasforam seladas hermeticamente. A amostra foi aquecida em um aparelhoDSC, tipo Diamond (Perkin Elmer), de 20°C até 150°C a uma taxa de aque-cimento de 10°C/minuto. Uma cuba de aço inoxidável selada vazia foi utili-zada como referência. O sistema foi calibrado utilizando quantidades defini-das de índio.

Os dados foram analisados através de um programa de softwareda Pyris (Perkin Elmer, Versão 7.0). Os dados brutos que podiam ser avalia-dos foram processados através da análise de picos individuais das transi-ções de fase de primeira ordem para o início de T (°C)1 máximo de T (°C)1final de T (°C) e dH (J/g) (o padrão sendo a linha de base reta).

O início de DSC T é caracterizado como a projeção da linha debase e da tangente desenhada no flanco ascendente do pico ao longo doponto de flexão. Isto caracteriza o início da transição de fase.

A temperatura máxima do pico de DSC T se refere à temperatu-ra máxima em que a curva de DSC atingiu um máximo (isto é a temperaturaem que a primeira diferenciação da curva é zero).

Para a função utilizada em Pyris (área máxima calculada), umatemperatura de início e uma temperatura final são introduzidas manualmentepara o ajuste da linha de base.

12) Determinação do conteúdo de amilose aparente

O conteúdo de amilose aparente foi determinado através de ummétodo adaptado de Juliano (1971, Cereal Science Today 16 (10): 334-340).

Para cada amostra, 50 mg de farinha de arroz foram pesadosem frascos Erlenmeyer de 100 mL (duas vezes) e umedecidos em sucessãocom 1 mL de etano à concentração de 95% e 9 mL de NaOH a 1 M.

Em paralelo, frascos com quantidades definidas de amilose purasão tratados identicamente às amostras de farinha para estabelecer umacurva padrão. Os frascos foram inflados sucintamente para misturar a amos-tra e subseqüentemente incubados durante 20 minutos em um banho deágua em ebulição com agitação suave. Após o resfriamento à temperaturaambiente durante 5-10 minutos, o volume foi levado até 100 mL com água.

Uma alíquota de 100 μί foi tratada com 1 mL da solução de tes-te (ácido acético a 10 mM, 0,004% (p/v) de I2; 0,04% (p/v) de Kl), misturadavigorosamente e a absorção foi determinada em 620 nm contra um valor debranco correspondente. O conteúdo de amilose foi calculado com o auxíliodos padrões de amilose que são utilizados para o estabelecimento de umacurva de calibração.

13) Análise de farinha de arroz através do Rapid Visco Analvser (RVA)

O princípio desta análise se baseia em submeter uma suspen-são de água e farinha de arroz a uma temperatura definida e a um protocolode cisalhamento, durante o qual a viscosidade da suspensão é registradacontinuamente. O instrumento de medida utilizado é um RVA Super3 daNewport Scientific (Macclesfield, Reino Unido) com o software correspon-dente "Thermocline for Windows", Versão 2.3.

Para a análise, 3 g de farinha de arroz (pesados na forma dopeso seco puro do material de amostra, corrigido para 0% de umidade) fo-ram pesados em um suporte analítico, tratados com 25 mL de água e o su-porte analítico foi introduzido no aparelho após o último ter recebido um agi-tador.

Foi aplicado o perfil de temperatura e cisalhamento a seguir:

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Após a medida ter terminado, foram determinados os parâme-tros a seguir:

Viscosidade máxima (viscosidade mais alta durante o período demedida 2 até 7 minutos)

Viscosidade mínima (viscosidade mais baixa durante o períodode medida 7 até 12 minutos)

Viscosidade final (viscosidade no final da medida)"Breakdown" = Máxima - Mínima"setback" = Final - Mínima

Temperatura de formação de pasta (temperatura em que a vis-cosidade muda em mais de 36 cp durante um intervalo de tempo de 0,1 mi-nuto).

Tempo máximo (tempo em que a viscosidade máxima é atingida).

14) Determinação do teor de fosfato na posição C6 (conteúdo de C6-P)

No amido, as posições C3 e C6 das unidades de glicose podemestar fosforiladas. Para determinar o conteúdo de C6-P do amido (métodomodificado de Nielsen e outros, 1994, Plant Physiol. 105: 111-117), 50 g defarinha de arroz foram hidrolisados durante 4 horas a 95°C em 500 pL deHCI a 0,7 M, com agitação contínua. Depois disso, as amostras foram centri-fugadas durante 10 minutos a 15500 g e a turbidez foi removida dos sobre-nadantes através de uma membrana de filtro (0,45 μΜ). 20 pL do hidrolisadotranslúcido foram misturados com 180 pL de tampão imidazol (imidazol a300 mM, pH 7,4; MgCI2 a 7,5 mM, EDTA a 1 mM e NADP a 0,4 mM). A me-dida foi realizada em um fotômetro a 340 nm. Após a absorção da base tersido registrada, a reação enzimática foi iniciada através da adição de 2 uni-dades de glicose-6-fosfato desidrogenase (da Leuconostoc mesenteroides,Boehringer Mannheim). A alteração na absorção é causada por uma conver-são equimolar de glicose-6-fosfato e NADP em 6-fosfogluconato e NADPH, aformação do NADPH sendo registrada no comprimento de onde mencionadoacima. A reação foi monitorada até um platô ter sido atingido. O resultadodesta medida fornece o conteúdo de glicose-6-fosfato no hidrolisado. O graude hidrólise foi determinado partindo do hidrolisado idêntico com referênciaao conteúdo na glicose liberada. O grau de hidrólise é utilizado para relacio-nar o conteúdo de glicose-6-fosfato com a porcentagem de amido hidrolisa-do partindo da quantidade de peso fresco. Para este fim, 10 pL de hidrolisa-do foram neutralizados com 10 pL de NaOH a 0,7 M e subseqüentementediluídos 1:100 com água. 4 pL dessa diluição foram tratados com 196 pL detampão de medida (imidazol a 100 mM pH 6,9; MgCI2 a 5 mM, ATP a 1 mM,NADP a 0,4 mM) e utilizados para a determinação da absorção da base. Areação foi monitorada através adição de 2 μΙ_ da mistura de enzimas (hexo-quinase 1:10; g!icose-6-fosfato desidrogenase de levedura 1:10 em tampãode medida) e a 340 nm até o platô ter sido atingido. O princípio da medidacorresponde àquele da primeira reação.

O resultado desta medida fornece a quantidade de glicose (emmg) que foi liberada durante a hidrólise partindo do amido presente no mate-rial de partida.

Depois disso, os resultados das duas medidas são relacionadosum ao outro para expressar o conteúdo de glicose-6-fosfato por mg de ami-do hidrolisado. Oposto de quando se relacionada a quantidade de glicose-6-fosfato com o peso fresco da amostra, este cálculo se refere à quantidade deglicose-6-fosfato apenas até a parte do amido que foi hidrolisada completa-mente para fornecer glicose e que pode assim ser também configurada co-mo a fonte da glicose-6-fosfato.

15) Determinação do teor de amido resistente (diqestibilidade)

O teor de amido resistente é determinado através de um métodobaseado no que foi descrito por Englyst e outros (1992, Europ. J. of ClinicaiNutrition, 46/2: 33-50) com as modificações que são descritas abaixo.

A solução de enzima é preparada através da extração de 1,2 gde pancreatina (Merck) em 8 mL de água a 37°C durante 10 minutos. Após acentrifugação (3000 rpm; temperatura ambiente, 10 minutos), 5,4 mL do so-brenadante são misturados com 84 U de amiloglucosidase (Sigma-AIdrich,Taufkirchen) e levados até um volume final de 7 mL com água.

Em paralelo, 10 mg de amido de arroz por amostra (peso fresco)são misturados em um recipiente de reação de 2 mL com 0,75 mL de tam-pão acetato de sódio (acetato de sódio a 0,1 M, pH 5,2; CaCI2 a 4 mM) e in-cubados a 37°C durante 5 minutos para aquecer a mistura.

A digestão do amido é iniciada através da adição de 0,25 mL desolução de enzima a cada mistura. Uma mistura de controle possui água aoinvés da solução de enzima adicionada. Alíquotas de 100 pL são removidasapós 20, 60 e 120 minutos e adicionadas diretamente a quatro vezes o vo-lume de etanol, inativando assim as enzimas. Esta diluição é utilizada paramedir o conteúdo de glicose.

Para esta finalidade, 2 μL de amostra diluída são misturadoscom 200 μL de tampão de medida (imidazol/HCI a 100 mM pH 6,9, MgCI2 a 5mM, ATP a 1 mM, NADP a 2 mM) e é medida a absorção da amostra em340 nm. A conversão de glicose é iniciada através da adição de 2 μL de mis-tura de enzima (10 μL de hexoquinase, 10 μl de glicose-6-fosfato desidro-genase, 80 μL de tampão de medida) e a conversão equimolar de NADP emNADPH é seguida em 340 nm até um platô ser atingido. A relação entre asquantidades medidas de glicose e o peso seco de amido (calculado partindodo peso úmido menos o teor de água) fornece a proporção da amostra quefoi liberada na forma de glicose após o período apropriado.

A quantidade de amido resistente foi calculada como a seguir:RS [%] = 100 χ glicose deliberada (mg) / peso seco de amido

(mg)

Exemplos

Exemplo 1: Vetor de transformação para a expressão de uma amido sintaseIIa de trigo em arroz

Foram utilizados o vetor de transformação de arroz IR103-123(descrito no WO 05/030941) e o plasmídeo CF31-191 (descrito na WO97/45545 sob o nome pTaSSI). O vetor de transformação de arroz IR103-123 serve para a expressão específica ao endosperma do gene-alvo atravésdo promotor da globulina do arroz. Em uma primeira etapa a), o vetor IR103-123 é Iinearizado utilizando as enzimas de restrição EcoRV e Xhol. O plas-mídeo CF31-191 contém o cDNA de uma amido sintase Il (SSII) de trigo (Tri-ticum aestivum). Em uma segunda etapa b), o cDNA da SSII é cortado doplasmídeo CF31-191 utilizando as enzimas de restrição Ecl136ll e Xho\. Aligação do vetor IR103-123 que foi Iinearizado na etapa a) e o fragmento,obtido na etapa b), do plasmídeo CF 31-191 fornecem o vetor AH32-191.

Exemplo 2: Produção de plantas de arroz modificadas geneticamente comuma maior atividade de SSII

Para gerar plantas modificadas geneticamente com uma maioratividade da amido sintase Il (SSII), o T-DNA do plasmídeo AH32-191 foitransferido para plantas de arroz com o auxílio de agrobactéria como descri-to por Ishida e outros (1996, Nature Biotechnology 14 (6): 745-750). O au-mento da atividade de SSII é determinado através de zimogramas.

A Figura 1 mostra zimogramas de três linhagens de arroz modi-ficadas geneticamente para a determinação da atividade de SSII em compa-ração com o tipo selvagem. O material utilizado era o extrato de proteínastotais de grãos imaturos (15 dias após o início do florescimento) do tipo sel-vagem e das respectivas linhagens modificadas geneticamente, em cadacaso em quantidades idênticas. Os extratos de proteínas das linhagens mo-dificadas geneticamente foram diluídos em etapas e a extensão até a qual aatividade era maior foi determinada através da comparação visual da inten-sidade da banda de SSII nestas faixas com a da "faixa do tipo selvagem". Aatividade de SSII da linhagem GAOS0353-01502 é dez vezes mais alta quea nos grãos do tipo selvagem, a da linhagem GAOS0353-01301 seis vezesmais alta e a da linhagem GAOS0353-02301 duas vezes mais alta.

Exemplo 3: Características do amido de arroz de linhagens transqênicas di-ferentes com um nível de atividade de SSII diferente

Os grãos de arroz foram colhidos de plantas geradas como des-crito no exemplo 2 e subseqüentemente processados através do métododescrito anteriormente ("4 Processamento de grãos de arroz") para fornecerfarinha de arroz. O componente de amido da farinha de arroz foi subseqüen-temente analisado através do método descrito anteriormente ("7 Determina-ção do teor de fosfato na posição C6 (conteúdo de C6-P)") em relação aoseu teor de fosfato na posição C6.

Tabela 1: Características do amido de arroz com maior atividade de SSII

<table>table see original document page 50</column></row><table>

Tabela 1: Características do amido de arroz com maior atividade de SSII emcomparação com o tipo selvagem (wt). Os dados mostrados são a atividadede SSII (na forma de um múltiplo do tipo selvagem) e o conteúdo de glicose-6-fosfato (C-6-P) ligada ao amido.

Pode ser observado que o nível de atividade da amido sintase Ilse correlaciona com o nível do teor de fosfato na posição C6. A expressãoda linhagem GAOS0353-01301 é aumentada em um fator de 6 e o conteúdode C-6-P quase duplicou em comparação com o tipo selvagem. O efeitomais pronunciado é mostrado pela linhagem GAOS0353-02501, cuja ex-pressão de SSII é aumentada em um fator de 10 e cujo conteúdo de C6-P éaumentado para mais de 350% em comparação com o tipo selvagem(100%).

Exemplo 4: Lista das propriedades de grãos de arroz, amido de arroz e fari-nha de arroz de linhagens modificadas geneticamente diferentes com níveisde expressão de SSII diferentes<table>table see original document page 52</column></row><table>Os dados fornecidos são a atividade de SSII no grão de arrozimaturo (na forma de múltiplos do tipo selvagem), as faixas das cadeias late-rais de amilopectina do amido (AP-SC) que são modificadas significativa-mente em relação ao tipo selvagem, o teor de fosfato (C6P) e os valores deDSC em 0C e em % de amido de arroz (em comparação com o tipo selva-gem), (n.d. = não detectado).

O teor de fosfato na posição C6 dos amidos de linhagens modifi-cadas geneticamente é significativamente aumentado em comparação como tipo selvagem como uma função do nível de atividade de SSII.

Tabela 3: Propriedades da farinha de arroz de grãos de arroz com expressãode SSII modificada em comparação com o tipo selvagem.

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Os dados fornecidos são a expressão de SSII expressão no grãode arroz imaturo (como múltiplos do tipo selvagem), as alterações nos valo-res de DSC de farinha de arroz, em 0C e em porcentagem (%) do tipo selvagem.

O conteúdo de amilose aparente das linhagens modificadas ge-neticamente exibe apenas poucas modificações; as quais são todas ligeira-mente menores que aquelas do tipo selvagem.

A estabilidade térmica, tanto das farinhas de arroz quanto dosamidos isolados das mesmas, aumenta gradualmente nas linhagens modifi-cadas geneticamente diferentes como uma função da atividade de SSII(comparar a figura 1 e as tabelas 1 e 2). A maior manifestação do maior iní-cio de DSC T e da máxima DSC T é mostrada pela linhagem cuja atividadede SSII é maior dez vezes. Os dados são em cada caso de aproximadamen-te 120%, com base no tipo selvagem.

Exemplo 5: Comparação de linhagens de arroz modificadas geneticamentediferentes em relação ao nível de atividade e às cadeias laterais de amilo-pectina em comparação com o tipo selvagem (WT).

A Tabela 4 mostra a distribuição das cadeias laterais de amilo-pectina de linhagens de arroz modificadas geneticamente diferentes emcomparação com o tipo selvagem. As curvas mostradas são o resultado darepresentação gráfica do comprimento de cadeia (em DP = Grau de Polime-rização) das glucanas analisadas versus a porcentagem de DP particular dototal de todos os DPs testados.

Tabela 4: Distribuição do perfil das cadeias laterais de amilopectina das li-nhagens modificadas geneticamente em comparação à farinha do tipo sel-vagem (WT)1 dividido em grupos com graus de polimerização diferentes.

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Pode ser observado que um aumento na atividade de SSII acar-reta uma alteração distinta na distribuição de cadeias laterais de amilopecti-na. Um aumento na atividade de SSII resulta em uma redução diferentemen-te pronunciada gradualmente das cadeias laterais com um DP entre 6-10 eum aumento nas cadeias laterais com um DP de 20-25.

Exemplo 6: Textura dos grãos de arroz cozidos

Os grãos de arroz de linhagens modificadas geneticamente dife-rentes e do tipo selvagem correspondente foram cozidos durante até o tem-po de cozimento ótimo em questão (ver o método "determinação das carac-terísticas de grãos de arroz cozidos"). A textura é determinada em grãos dearroz que, após o cozimento, foram armazenados durante 22 horas a 4°C(tabela 5a, os dados mostrados são as médias de 10 medidas por amostra(em cada caso 3 grãos)) ou em grãos de arroz recém-cozidos (aproximada-mente 1 hora após o cozimento) e em grãos de arroz que foram armazena-dos no frio (4°C, 22 h) e então reaquecidos em um forno ou um micro-ondas(tabela 5b).

Tabela 5a: Textura de grãos de arroz que foram armazenados durante 22horas a 4°C após o cozimento

<table>table see original document page 55</column></row><table>

A pegajosidade dos grãos de arroz cozidos diminui com o au-mento da atividade de SSII (tabela 5a). A redução da pegajosidade na Iinha-gem GAOS0353-02301 é reduzida até aproximadamente a metade, na li-nhagem GAOS0353-01301 em aproximadamente um fator de 3 e na linha-gem GAOS0353-01502 aproximadamente em um fator de 13.

Tabela 5b: Textura de grãos de arroz recém-cozidos ou reaquecidos

<table>table see original document page 55</column></row><table>

A compilação dos dados para a determinação da pegajosidadedos grãos de arroz cozidos após o cozimento e o reaquecimento no forno ouno micro-ondas (após armazenamento durante 22 horas a 4°C). Em cadavariação do processamento, a pegajosidade da linhagem GAOS0353-01502é notavelmente menor que a do tipo selvagem.

Exempio 7: Determinação das dimensões do grão dimensions de grãos dearroz não-cozidos ou cozidos

As dimensões do grão de grãos de arroz não-cozidos ou cozidosde linhagens modificadas geneticamente e do tipo selvagem correspondenteforam determinadas utilizando o software SigmScan. Os resultados e os pa-râmetros derivados dos mesmos são mostrados nas tabelas 5a e b.

Tabela 6a: Compilação dos dados para a determinação das dimensões dogrão de grãos de arroz não-cozidos e cozidos.

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Os dados mostrados são as médias de 30 medidas independen-tes (L = comprimento do grão; W = largura do grão; u = não-cozido; c = cozi-do; ER = taxa de alongamento (Lc/Lu): CDC = coeficiente de alterações di-mensionais (Lc/Lu)/(Wc/Wu)).

Tabela 6b: Alterações relativas das dimensões do grão em comparação como tipo selvagem

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Todos os dados em porcentagem: % de alteração = (amostra -tipo selvagem)/tipo selvagem*100).

Em relação às dimensões do grão de grãos de arroz cozidos, amaior atividade de SSII no arroz resulta em um alongamento significativa-mente maior dos grãos durante o cozimento ao longo do eixo longitudinal.

Isso é evidente partindo da maior taxa de alongamento (ER) e da maior pro-porção de comprimento/largura (Lc/Wc). Novamente, a linhagem cuja ativi-dade de SSII é maior duas vezes (GAOS0353-02301) mostra um grau me-nor de alteração em relação aos parâmetros descritos anteriormente, en-quanto que as duas linhagens cujas atividades de SSII são seis vezes(GAOS0353-01301) ou dez vezes (GAOS0353-01502) maiores exibem ma-nifestações muito mais pronunciadas.

Exemplo 8: Análise das características físico-químicas da farinha de arrozatravés do Rapid Visco Analvzer (RVA)

As farinhas de arroz de linhagens modificadas geneticamentediferentes e do tipo selvagem correspondente foram analisadas em relaçãoas suas características físico-químicas como descrito no método "análise dafarinha de arroz através de RVA".

A viscosidade da suspensão farinha de arroz/água foi registradaao longo de uma temperatura definida e um programa de cisalhamento. Osgráficos e os dados analíticos das linhagens diferentes são mostrados nastabelas 6a+b.

Tabela 7a: Compilação dos dados obtidos na determinação do comporta-mento da viscosidade de farinhas de arroz feitas com grãos de arroz de li-nhagens modificadas geneticamente com atividades de SSII diferentes

<table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table>

Tabela 7b: Alterações relativas dos parâmetros de RVA em comparaçãocom o tipo selvagem

<table>table see original document page 58</column></row><table>

(todos os dados em porcentagem) % de alteração = (amostra - tipo selva-gem)/tipo selvagem*100

O curso da viscosidade de farinhas do tipo selvagem e das li-nhagens modificadas geneticamente difere em um grande número de parâ-metros. As amostras modificadas geneticamente começam a formação depasta em um ponto no tempo notavelmente posterior, que pode ser observa-do partindo da maior "temperatura de formação de pasta". O desenvolvimen-to subsequente da viscosidade até a viscosidade maxima procede muito ra-pidamente, como pode ser observado partindo do "tempo máximo" mais cur-to das amostras modificadas geneticamente. Todos os outros parâmetros deviscosidade (máxima, mínima, final) são inferiores no caso das amostrasmodificadas geneticamente que no caso do tipo selvagem. Tem que sermencionado aqui que a extensão das alterações ao longo do curso do tiposelvagem se refere ao nível da atividade de SSII. A linhagem com a ativida-de mais alta de SSII (GAOSCI353-1502) exibe as viscosidades máxima, mí-nima e final mais baixas e, com um valor de mais de 10°C, a diferença maisalta na temperatura de formação de pasta.

Um outro aspecto muito óbvio é o desenvolvimento rápido daviscosidade das amostras modificadas geneticamente, que é refletido em umintervalo muito rápido entre o início da formação de pasta e o tempo da vis-cosidade máxima. Novamente, este parâmetro mostra uma dependênciapronunciada do efeito sobre o grau em que a atividade de SSII é aumentada.

Exemplo 9: Diqestibilidade do amido isolado

Os amidos dos transformantes GAOS353-2501 e GAOS 353-1301 exibem uma digestibilidade distintamente reduzida comparada com osdo tipo selvagem.

A degradação enzimática do amido isolado no caso do transfor-mante GAOS 353-1301 em relação ao do tipo selvagem é de 53% após 20minutos, 67% após 60 minutos e 84% após 120 minutos.

A degradação enzimática do amido isolado no caso do transfor-mante GAOS 353-2501 em relação ao do tipo selvagem é de 39% após 20minutos, 49% após 60 minutos e 68% após 120 minutos (Figura 3).

Tabela 8: Conteúdo de RS de amidos de arroz

<table>table see original document page 59</column></row><table>Listagem de seqüência<110> Bayer CropScience CmbH

<120> Superexpressão da amido síntese em plantas

<130> BCS 05-5006-PCT

<150> EP05090220.4

<151> 200S-07-22

<150> US 60/701,764

<151> 2005-07-22

<150> EPOS090349.1

<151> 2005-12-23

<150> US 60/757,216

<151> 2006-01-06

<150> EP06090003.2

<151> 2006-01-06

<150> US 60/757,810

<151> 2006-01-10

<160> S

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 3006

<212> DNA

<213> Triticum aestivum<220>

<221> COS

<222> (227)..(2623)<223>

<220>

<221> Região 1<222> (1190)..(1279)<223>

<220>

<22ΐ> Região 2

<222> (1493)..(1612)<223>

<220>

<221> Região 3

<222> (2147)..(2350)<223>

<300>

<302> Moléculas de ácido nucleico codificando enzimas a partir de trigoque estão envolvidas na síntese de amido

<308> Derwent/AAV01S28

<309> 1998-05-21

<310> wo 97 45545

<311> 1997-05-28

<312> 1997-12-04

<313> (1)..(2825)

ctccaccgcg gtggcggccg ctctagaact agtggatccc ccgggctgca ggaattcggc 60acgagcttcg gcctgacccc gttcgtttac ccccacacag agcacactcc agtccagtcc 120agcccactgc caccgcgcta ctctccactc ccactgccac cacctccgcc tgcgccgcgc 180

<400> 1

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5

10

gcg tca gcc tcc ccc 283Ala Ser Ala Ser Pro15

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20 30

ggg gcc ggc agg ttg cac tgg ccg ccg tgg ccgGly Ala Gly Arg Leu His Trp Pro Pro Trp Pro

cag cca ccc cac gcc 331Gln pro Pro His Ala35

ccg cag cgc acg gct 379pro Gln Arg Thr Ala

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40

45427

gag gcc aag gat gat ggc cgg gct gtc gca gat gat gcg ggc tcc tttGlu Ala Lys Asp Asp Gly Arg Ala Val Ala Asp Asp Ala Gly Ser Phe280 28S 290

gaa cac cac cag aat cac gac tcc gga cct ttg gca ggg gag aat gtcGlu His His Gln Asn His Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly Glu Asn vai295 300 305

atg aac gtg gtc gtc gtg gct gct gag tgt tct ccc tgg tgc aaa acaMet Asn vai vai vai vai Ala Ala Glu Cys ser Pro Trp Cys Lys Thr310 315 320

475

523

571

619

cgc gac gga gct gtg gcg gcg ctc gçc gçc gqg aag aag gac gcg gggArq Aso Gly Ala vai Ala Ala Leu Ala Ala Gly Lys Lys Asp Ala Gly55 60 65

ate gac gac gcc gcc gcg tcc gtg agg cag ccc cgc gca ctc cgc ggtIle asp Asp Ala Ala Ala Ser vai Arg Gln Pro Arg Ala Leu Arg Gly70 75 80

ggc gcc gcc acc aag gtc gcg gag cga agg gat ccc gtç aag acg ctcGly Ala Ala Thr Lys Val Ala Glu Arg Arg Asp Pro Val Lys Thr Leu85 90 95

gac cgc gac gcc gcg gaa ggc ggc ggg ccg tcc ccg ccg gça gçg aggAsp Arg Asp Ala Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ala Ala Arg100 105 HO 115

cag gac gcc gcc cgt ccg ccg agt atg aac ggc atg ccg gtg aac gacGln Asp Ala Ala Arg Pro Pro ser Met Asn Gly Met Pro Val Asn Gly120 125 130

gag aac aaa tct acc ggc ggc ggc ggc gçg act aaa gac age ggg ctg 667Glu Asn Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys Asp Ser Gly Leu135 140 145

ccc acg ccc gca cgc gcg ccc cat ccg tcg acc cag aac aga gca ccg 715Pro Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Pro ser Thr Gln Asn Arg Ala Pro150 155 160

gtg aac ggt gaa aac aaa gct aac gtc gcc tcg ccg ccg acg age ata 763vai Asn Gly Glu Asn Lys Ala Asn vai Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ile165 170 175

gcc gag gcc gcg gct tcg gat tcc gca gct acc att tcc ate age gac 811Ala Glu Ala Ala Ala Ser Asp Ser Ala Ala Thr Ile Ser Ile ser Asp180 185 190 195

aag gcg ccg gag tcc gtt gtc cca gct gag aag acg ccg ccg tcg tcc 859Lys Ala Pro Glu Ser vai vai Pro Ala Glu Lys Thr Pro Pro Ser Ser200 205 210

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ggc tca aat ttc gag tcc tcg gcc tct gct ccc ggg tct gac açt gtçGly Ser Asn Phe Glu Ser Ser Ala Ser Ala Pro Gly ser Asp Thr vai215 220 225

age gac gtg gaa caa gaa ctg aag aag ggt gcg gtç gtt gtç gaa gaaser as ρ vai Glu Gln Glu Leu Lys Lys Gly ala vai vai vai Glu Glu230 235 240

gct cca aag cca aag gct ctt tcg ccg cct gca gcc ccc gct gta caa 1003Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Pro Pro Ala Ala Pro Ala vai Gln245 250 255

gaa gac ctt tgg gat ttc aag aaa tac att ggt ttc gag gag ccc gtgGlu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Xle Gly Phe Glu Glu Pro Val260 265 270 275

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1099

1147

1195ggt ggt ctg gga gat gtt gcg gat gct ctg ccc aag gct ttg gca aag 1243Gly Gly Leu Gly Asp vai Ala Gly Ala Leu pro Lys Ala Leu Ala Lys325 330 335

aga gga cat cgt gtt atg gtt gtg gta cca agg tat ggg gac tat gaa 1291Arg Gly His Arg vai Met vai vai vai Pro Arg Tyr Gly Asp Tyr Glu340 345 350 355

gaa gcc tac gat gtc gga gtc cga aaa tac tac aag gct gct gga cag 1339Glu Ala Tyr Asp vai Gly Val Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala Ala Gly Gln360 365 370

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420 425 430 435

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440

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1435

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485 490 495

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500 505 510 515

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550

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565

570

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1963

gac ggc tac acc aac ttc tcc ctg agg acg ctg gac tcc ggc aag cggAsp Gly Tyr Thr Asn Phe ser Leu Arg Thr Leu Asp Ser Gly Lys Arg580 585 590 595

2011<210> 2<211> 799<212> PRT

<213> Triticura aestivum<400> 2

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Ala ser Pro Gly Arg Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Ser Ala Gln Pro20 25 30

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Leu Arg Gly Gly Ala Ala Tlir Lys vai Ala Glu Arg Arg Asp Pro Val85 90 95

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Ala Ala Arg Gln Asp Ala Ala Arg Pro Pro Ser Met Asn Gly Met Pro115 120 125

vai Asn Gly Glu Asn Lys ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys Asp130 135 140

Ser Gly Leu Pro Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Pro ser Thr Gln Asn145 150 155 160

Ara Ala Pro vai Asn Gly Glu Asn Lys Ala Asn Val Ala Ser Pro Proy 165 170 175

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pro ser ser Gly Ser Asn Phe Glu ser Ser Ala ser Ala Pro Gly ser210 215 220Aso Thr vai Ser Asp Val Glu Gln Glu Leu Lys Lys Gly Ala vai vai225 230 235 240

240

vai Glu Glu Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Pro Pro Ala Ala Pro245 250 255

Ala Val Gln Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Ile Gly Phe Glu260 265 270

Glu Pro Val Glu Ala Lys Asp Asp Gly Arg Ala Val Ala Asp Asp Ala275 280 285

Gly ser Phe Glu His His Gln Asn His Asp ser Gly Pro Leu Ala Gly290 295 300

Glu Asn vai Met Asn vai Val vai vai Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp305 310 315 320

Cys Lys Thr Gly Gl^ Leu Gly Asp vai Ala Gly Ala Leu Pro L^s Ala

Leu Ala Lys Arg Gly His Arg vai Met vai vai Val Pro Arg Tyr Gly340 345 350

Asp Tyr Glu Glu Ala Tyr Asp Val Gly vai Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala355 360 365

Ala Gly Gln Asp Met Glu vai Asn Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly370 375 380

vai Asp Phe vai Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gln Glu385 390 395 400

Asp Ile Tyr Gly Gly Ser Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu405 410 415

Phe Cys Lys Ala Ala vai Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly420 425 430

vai Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu vai Phe Ile Ala Asn Asp Trp His435 440 445

Thr Ala Leu Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp His Gly450 455 460

Leu Met Gln Tyr Thr Arg Ser He Met Val Ile His Asn Ile Ala His465 470 475 480

Gln Gly Arg Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr Glu Leu Pro Glu485 490 495His Tyr Leu Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu His500 505 510

Ala Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Gln Val Val vai515 520 525

vai ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu Gly Gly Trp530 535 540

Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys Thr Arg Gly Ile545 550 555 560

Val Asn Gly Ile Asp Asn Met Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Ala His565 570 575

Leu Lys Ser Asp Gly Tyr Thr Asn Phe Ser Leu Arg Thr Leu Asp Ser580 585 590

Gly Lys Arg Gln Cys Lys Glu Ala Leu Gln Arg Glu Leu Gly Leu Gln595 600 605

vai Arg Ala Asp Val Pro Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly610 615 620

Gln Lys Gly Val Glu Ile Ile Ala Asp Ala Met Pro Trp Ile vai Ser625 630 635 640

Gln Asp vai Gln Leu vai Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu645 650 655

Ser Met Leu Gln His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly660 665 670

Trp Val Gly Phe Ser vai Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala675 680 685

Asp Ala Leu Leu Met Pro ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln690 695 700

Leu Tyr Ala Met Ala Tyr Gly Thr vai Pro Val vai His Ala Val Gly705 710 715 720

Gly Leu Arg Asp Thr vai Pro Pro Phe Asp Pro Phe Asn His ser Gly725 730 735

Leu Gly Trp Thr Phe Asp Arg Ala Glu Ala His Lys Leu Ile Glu Ala740 745 750

Leu Gly His Cys Leu Arg Thr Tyr Arg Asp Phe Lys Glu Ser Trp Arg755 760 765Ala Leu Gln Glu Arg Gly Met Ser Gln Asp Phe Ser Trp Glu His Ala770 775 780

Ala Lys Leu Tyr Glu Asp vai Leu Val Lys Ala Lys Tyr Gln Trp785 790 795

<210> 3<211> 30<212> PRT

<213> Triticum aestivum<400> 3

Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp vai Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala Leu1 5 10 15

Ala Lys Arg Gly His Arg vai Met vai vai vai Pro Arg Tyr20 25 30

<210> 4<211> 40<212> PRT

<213> Triticum aestivum<400> 4

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Asn Leu vai Phe Ile Ala Asn Asp Trp His Thr Ala Leu Leu Pro vai20 25 30

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<210> 5<211> 68<212> PRT

<213> Triticum aestivum<400> 5

Gln Asp Val Gln Leu vai Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu15 10 15Ser Met Leu Gln His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys vai Arg Gly20 25 30

Trp vai Gly Phe Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala35 40 45

Asp Ala Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln50 55 60

Leu Tyr Ala Met65

Claims (15)

1. Processo para aumentar o teor de fosfato dos amidos de célu-las vegetais modificadas geneticamente para 150 até 500% em comparaçãocom os amidos de células vegetais do tipo selvagem não-modificadas gene-ticamente correspondentes (100%), caracterizado pelo fato de quea) uma célula vegetal é modificada geneticamente através daintrodução de uma molécula de ácido nucleico estranha que codifica umaamido sintase solúvel Il eb) esta amido sintase solúvel Il é superexpressa.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe-lo fato de que a molécula de ácido nucleico estranha é a região codificadorade uma amido sintase solúvel Il heteróloga.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe-lo fato de que a amido sintase solúvel Il é uma amido sintase solúvel Il deuma planta monocotiledônea.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe-lo fato de que a amido sintase solúvel Il é uma amido sintase solúvel Il detrigo.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe-Io fato de que a amido sintase solúvel Il mostrada possui a seqüência denucleotídeos mostrada na SEQ ID No. 1.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 5, caracterizado pelo fato de que as células vegetais modificadas geneti-camente são células vegetais de batata, milho ou arroz.

7. Amido de arroz, caracterizado pelo fato de que possui umatemperatura de início de DSC T entre 70°C e 80°C.

8. Amido de arroz, de acordo com a reivindicação 7, caracteriza-do pelo fato de que a temperatura de início de DSC T fica entre 72°C e 79°C.

9. Amido de arroz derivatizado, caracterizado pelo fato de quecompreende o amido de arroz, como definido na reivindicação 7 ou 8.

10. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende oamido de arroz, como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9.

11. Farinha de arroz, caracterizada pelo fato de que compreendeo amido de arroz, como definido na reivindicação 7 ou 8.

12. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende afarinha de arroz, como definida na reivindicação 10.

13. Grão de arroz, caracterizado pelo fato de que compreende oamido de arroz, como definido na reivindicação 7 ou 8.

14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendepelo menos um grão de arroz como definido na reivindicação 13.

15. Planta de arroz,caracterizada pelo fato de que pelo menosum grão de arroz, como definido na reivindicação 13, cresce e/ou compre-ende o amido de arroz, como definido na reivindicação 7 ou 8.