ES2354897B1

ES2354897B1 - Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa.

Info

Publication number: ES2354897B1
Application number: ES200930009A
Authority: ES
Inventors: Javier Pozueta Romero; Francisco Jose Muñoz Perez; Jun Li; Sandy Raynaud; Paula Ragel De La Torre; Angel Mérida Berlanga
Original assignee: Iden Biotechnology SL
Current assignee: Iden Biotechnology SL
Priority date: 2009-03-24
Filing date: 2009-03-24
Publication date: 2012-01-26
Anticipated expiration: 2029-03-24
Also published as: ES2354897A1; US20120102597A1; WO2010109045A1; EP2412814B1; CA2756034A1; EP2412814A1; IL215269A0

Abstract

Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa. Las SSs en plantas (incluida la SSIV) y la glucógeno sintasa en bacterias catalizan la transferencia de la parte glucosídica de la molécula de ADP-glucosa (el donador activado de glucosa) a un glucano {al}(1-4) preexistente. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre con otras SSs, la SSIV es capaz de añadir unidades de glucosa sobre maltotriosas. Además, a diferencia de lo que ocurre con otras SSs ?solubles?, SSIV está unida al gránulo de almidón. En esta invención se describe por primera vez la obtención de plantas que poseen altos niveles y rendimientos de almidón y biomasa, como consecuencia de la expresión de genes que codifican para SSIV.

Description

Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa.

Campo de la invención

La presente invención se engloba dentro del campo de la ingeniería genética y de la ﬁsiología vegetal. Concretamente la invención comprende un procedimiento para la producción de plantas transgénicas con alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa; así como los vectores utilizados para transformar las células, las propias células transformadas, las plantas transgénicas obtenidas por dicho procedimiento y sus respectivos usos.

Estado de la técnica

El glucógeno (en animales y bacterias) y el almidón (en plantas) constituyen las formas principales de almacenamiento de carbohidratos de reserva. En plantas el almidón se acumula en grandes cantidades en órganos tales como semillas y tubérculos, y es un constituyente fundamental de la dieta del ser humano. Por otro lado, el almidón constituye una fuente de material renovable y completamente biodegradable, siendo utilizado frecuentemente en las industrias papelera, cosmética, farmacéutica y alimentaria, además de emplearse como componente fundamental para la fabricación de plásticos biodegradables, pinturas de bajo impacto medioambiental y bioetanol.

La biosíntesis de almidón es un proceso complejo que requiere la acción concertada de diferentes actividades enzimáticas tales como la sacarosa sintasa, la fosfoglucomutasa, la ADP-glucosa pirofosforilasa, diferentes tipos de glucosil transferasas comúnmente designadas como almidón sintasas (SS), y las enzimas ramiﬁcante y desrramiﬁcante del almidón (1).

La SS en plantas y la glucógeno sintasa (GlgA) en bacterias catalizan la transferencia de la mitad glucosídica de la molécula de ADP-Glucosa (el donador activado de glucosa) a un glucano α(1-4) preexistente. En todos los organismos fotosintéticos que acumulan almidón se han encontrado las mismas SSs denominadas SSI, SSII, SSIII, SSIV y GBSSI. Este alto grado de conservación indica que cada una de estas proteínas desempeña funciones diferentes en el proceso de creación del gránulo de almidón (2). Así por ejemplo, la GBSSI está implicada en la producción de amilosa, mientras que la SSI, la SSII y la SSIII están implicadas en la producción de cadenas de almidón cortas, intermedias y largas de amilopectina, respectivamente (3).

La SSIV es la menos conocida de la familia de proteínas comúnmente designadas como SSs solubles. Su secuencia aminoacídica con respecto a SSI, SSII y SSIII varía entre un 30% y un 50% (4, 5). A pesar de su designación, todavía no se ha demostrado su actividad SS. Es más, recientemente se ha instalado la idea de que SSIV no cubre el campo de acción y función de las otras SSs (6). Sin embargo, existen evidencias que sugieren que SSIV puede estar implicada en la determinación del número de gránulos de almidón existentes en el plastidio (7).

Son múltiples las referencias que muestran que la reducción de la actividad SSI, SSII y SSIII conlleva una reducción en los niveles de almidón y la alteración de la estructura y composición del gránulo (8, 9). Mutantes de Arabidopsis que no poseen SSIV acumulan niveles reducidos de almidón pero (a) el balance amilosa/amilopectina y la estructura molecular de la amilopectina son normales y (b) tan solo producen un gránulo de almidón por cloroplasto (7).

Contrariamente a lo esperado, plantas transgénicas que sobre-expresan la GlgA de Escherichia coli acumulan bajo contenido en almidón (10). Si bien la expresión ectópica de SSI, SSII y SSIII ha sido utilizada como estrategia para incrementar el contenido en almidón (WO 00/66745) y modiﬁcar propiedades del almidón tales como el contenido en fosfato (WO2007/009823) (11-13) o el balance amilosa/amilopectina (WO 2006/084336; WO 2002/018606), no existen evidencias experimentales que indiquen que (a) SSIV tiene actividad SS y (b) la expresión ectópica de SSIV pueda ser utilizada como una estrategia biotecnológica para incrementar la cantidad del almidón, así como el rendimiento y tasa de acumulación de biomasa de las plantas. En la presente invención, tras demostrar que SSIV es una SS que reúne propiedades totalmente diferentes a las SSs solubles SSI, SSII y SSIII, se describe por primera vez que la sobre-expresión de SSIV es una estrategia biotecnológica para la producción de plantas transgénicas con altos niveles de almidón y altos rendimientos de almidón y biomasa.

Descripción de la invención

Breve descripción de la invención

La presente invención se reﬁere a un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa, mediante la expresión ectópica de SSIV. Además la presente invención se reﬁere a las propias plantas transgénicas caracterizadas por dichas propiedades.

Los efectos técnicos mostrados en la presente invención son extrapolables a cualquier tipo de órgano de la planta tal como tubérculos, hojas, frutos y semillas; así como a cualquier tipo de planta como por ejemplo: Arabidopsis, patata, tabaco, tomate, arroz, cebada, trigo y maíz. Los resultados mostrados en la presente invención fueron conseguidos, tanto expresando constitutivamente AtSSIV (el gen que codiﬁca para SSIV en A. thaliana) bajo el control del promotor 35S, como expresando AtSSIV bajo el control de un promotor especíﬁco de tubérculo utilizado (promotor del gen de la patatina). Cabe decir que la expresión constitutiva fue particularmente preferida. Los resultados mostrados en la presente invención fueron conseguidos tras sobre-expresar cualquier isoforma y secuencia de SSIV (siendo particularmente preferida la SSIV de Arabidopsis). Es decir, cualquier promotor expresable en plantas que produzca la sobre-expresión de AtSSIV, así como cualquier isoforma de SSIV, estarían comprendidos en la presente invención.

A efectos de la presente invención, se hacen constar los siguientes términos:

•: Planta transgénica: planta cuyo genoma ha sido modiﬁcado mediante ingeniería genética con el objetivo de conseguir características biológicas diferentes y/o mejoradas respecto a las de la planta silvestre control (WT).

•: Célula vegetal transformada: son células vegetales que presentan una alteración genética resultado de la introducción y expresión de material genético externo en su genoma.

•: Sobre-expresión de SSIV: una planta sobre-expresa el enzima SSIV cuando la intensidad de la banda obtenida en un western blot de un extracto de una planta transformada es signiﬁcativamente superior a la obtenida con un extracto de plantas WT cultivadas en las mismas condiciones y en el mismo momento. A modo ilustrativo, en la Figura 11A se puede observar que la intensidad de las bandas obtenidas a partir de extractos de plantas transgénicas de Arabidopsis y de patata que sobre-expresan AtSSIV es signiﬁcativamente superior a la obtenida a partir de extractos de plantas WT en western blots en los que se utilizó un anticuerpo especíﬁco de AtSSIV.

•: Alto contenido de almidón: según se utiliza en la presente invención, esta expresión está directamente referida a un valor estadísticamente signiﬁcativo, superior a los valores observados en las plantas control. A modo ilustrativo, en la Figura 13 se puede observar que el contenido medio de almidón en los tubérculos de las plantas de patata silvestres analizadas es de aproximadamente 525 μmoles de glucosa/g de peso fresco, con un margen de variación del 10%. Por lo tanto podría considerarse como “alto contenido en amidón” aquel que supere, al menos en un 10%, dicho valor de 525 umoles de glucosa/g de peso fresco. En la presente invención se supera dicho valor consiguiendo tubérculos transgénicos que acumulan cantidades de almidón de 600 μmoles de glucosa/g de peso fresco como mínimo.

•: Alta productividad en biomasa: según se utiliza en la presente invención, esta expresión está directamente referida a un valor estadísticamente signiﬁcativo, superior a los valores observados en las plantas control. A modo ilustrativo, en la Figura 14 se puede observar que el incremento del peso fresco de plantas transgénicas de Arabidopsis a lo largo del desarrollo de la planta es más acelerado que en las plantas silvestres.

•: Actividad SSIV: la actividad de la enzima SSIV comprende (a) transferir unidades de glucosa desde ADPglucosa a maltotriosa y poliglucanos tales como almidón, amilosa, amilopectina y glucógeno y (b) estar localizada en la superﬁcie del gránulo de almidón.

Breve descripción de las ﬁguras

Figura 1. Mapa de restricción del plásmido pAtSSIV resultante del clonaje de un cDNA completo que codiﬁca para el gen AtSSIV de Arabidopsis thaliana en el vector pGEM-T easy (Promega).

Figura 2. (a-h) Comparación de secuencias aminoacídicas deducidas de AtSSI, AtSSII, AtSSIII y AtSSIV. Los aminoácidos conservados en todas las SSs están enmarcados en negro. El fragmento de AtSSIV empleado para obtener anticuerpos especíﬁcos contra esta proteína se indica con una línea negra, subrayada.

Figura 3. Mapa de restricción del plásmido pGEX-4T3_FragSSIV utilizado para la síntesis del péptido necesario para la producción del anticuerpo especíﬁco de SSIV.

Figura 4. Etapas de construcción del plásmido binario pK2GW7,0-AtSSIV (alternativamente designado pKan-35S-AtSSIV) necesario para la transformación de plantas con Agrobacterium tumefaciens.

Figura 5. Mapa de restricción del plásmido pET-AtSSIV necesario para la expresión en E. coli de la SSIV madura.

Figura 6. Etapas de construcción del plásmido binario pAtSSIV-GFP necesario para la transformación de plantas en Agrobacterium tumefaciens.

Figura 7. Zimograma de actividad SS empleando glucógeno como cebo.

Figura 8. Especiﬁcidad de sustrato. Ensayo in vitro de SSI, SSII, SSIII y SSIV con diferentes malto-oligosacáridos como sustrato.

Figura 9. SSIV es capaz de complementar el fenotipo “glycogen-less” de las células AglgAP. Patrón de tinción en iodina tras 12, 24 y 36 horas de incubación de (A) AglgAP, (B) AglgAP que expresan GlgA y (C,D) AglgAP que expresan SSIV.

Figura 10. Localización subcelular de AtSSIV. La ilustración muestra la ﬂuorescencia producida en células de plantas de Arabidopsis transformadas con AtSSIV-GFP que han sido sometidas a análisis mediante un microscopio confocal D-Eclipse C1 (NIKON) equipado con un láser con excitación Ar 488, un ﬁltro para emisión verde BA515/30, un ﬁltro para emisión roja BA650LP y un detector de luz. En las fotografías puede observarse que SSIV-GFP está localizado en la superﬁcie de gránulos de almidón.

Figura 11. Análisis mediante western blot (A) y cuantiﬁcación (B) de los niveles de proteína SSIV en el ecotipo silvestre Col-0 (WT) y en las líneas transgénicas que sobre-expresan el gen AtSSIV (L10, L11, L12 y L13) tras integrar en su genoma la construcción 35S-AtSSIV haciendo uso de la cepa de A. tumefaciens DSM 19675. En (C), análisis mediante western blot de SSIV en tubérculos de patata que expresan AtASSIV tras integrar en su genoma la construcción 35S-AtSSIV haciendo uso de la cepa de A. tumefaciens DSM 19675. Las plantas transgénicas reciben la designación 2, 6, 7,8y9.

Figura 12. Niveles de almidón en hojas de plantas de Arabidopsis a lo largo de un ciclo 16 h luz/8 h oscuridad. Los círculos blancos corresponden a plantas silvestres de Arabidopsis thaliana, ecotipo Col-0. Los círculos negros corresponden a plantas transgénicas de Arabidopsis que sobre-expresan el gen AtSSIV que codiﬁca para la SSIV de Arabidopsis thaliana.

Figura 13. Contenido de almidón en tubérculos de plantas de patata silvestres y plantas de patata que expresan AtASSIV tras integrar en su genoma la construcción 35S-AtSSIV haciendo uso de la cepa de A. tumefaciens DSM 19675. Los tubérculos silvestres analizados se designan como WT. Las plantas transgénicas reciben la designación 2, 6, 7, 8 y 9. Los valores representados se corresponden a la media y desviación típica de tubérculos de 10 plantas diferentes por línea.

Figura 14. (A) Evolución del peso fresco de plantas silvestres de Arabidopsis thaliana, ecotipo Col-0 (círculos blancos) y plantas transgénicas de Arabidopsis que sobre-expresan el gen AtSSIV (círculos negros) a lo largo del crecimiento. Los datos son la media de tres medidas. Cada medida se realizó pesando conjuntamente la parte aérea de 5 plantas y dividiendo el valor obtenido por cinco. Las barras indican la desviación estándar de las medidas. (B) Comparación visual entre plantas de Arabidopsis ecotipo Col-0 (parte izquierda de la fotografía) y plantas transgénicas de Arabidopsis que sobre-expresan el gen AtSSIV (parte derecha de la fotografía).

Descripción detallada de la invención

Obtención del cDNA que codiﬁca para SSIV

AtSSIV está codiﬁcada por el gen At4g18240 (o AtSSIV). A partir de su secuencia nucleotídica se sintetizaron oligonucleótidos especíﬁcos para el gen AtSSIV. Estos oligonucleótidos se emplearon para ampliﬁcar mediante RT-PCR a partir de RNA total de hojas de Arabidopsis el fragmento completo de cDNA que codiﬁca para AtSSIV. El fragmento ampliﬁcado se clonó en el vector pGEM-T easy (Promega) dando lugar al plásmido pAtSSIV (Figura 1) que fue ampliﬁcado en la bacteria hospedadora XL1 Blue.

Obtención de anticuerpos policlonales especíﬁcos contra la proteína AtSSIV

Para la obtención de un anticuerpo policlonal contra AtSSIV se seleccionó como zona antigénica un fragmento de la región amino terminal de la proteína que no presentaba homología con las otras SSs presentes en Arabidopsis (Figura 2). En concreto la región comprendida entre los aminoácidos Glutámico 236 y Glutámico 414 de la secuencia de aminoácidos de AtSSIV. En la clonación de la secuencia de cDNA que codiﬁca para dicho fragmento se emplearon los oligonucleótidos caracterizados por las SEQ ID NO:5y6.

El fragmento de 512 pares de bases se ampliﬁcó mediante PCR empleando dichos oligonucleótidos y cDNA (SEQ ID NO: 3) de primera cadena obtenido a partir de mRNA de hojas como molde. Los oligonucleótidos introducen sitios de restricción para las enzimas NdeI y XhoI en los extremos 5’ y 3’ respectivamente del fragmento ampliﬁcado, los cuales fueron usados para clonar el fragmento de cDNA en el vector de expresión pGEX-4T (Amersham Biosciences) dando lugar al plásmido pGEX-4T3_FragSSIV (Figura 3). Este vector de expresión contiene la secuencia codiﬁcante para la proteína glutatión S-transferasa (GST). La clonación del fragmento de cDNA de AtSSIV en el vector se llevó a cabo respetando la pauta de lectura marcada por el gen que codiﬁca la GST, permitiendo la fusión traduccional del fragmento de polipéptido de AtSSIV con el extremo carboxi-terminal de la proteína GST. La construcción fue conﬁrmada mediante secuenciación de DNA y con ella se transformó la estirpe de E. coli BL21 (DE3).

Se procedió entonces a la expresión y puriﬁcación del polipéptido de fusión GST-SSIV con glutatión agarosa, y la posterior puriﬁcación del fragmento polipeptídico de AtSSIV de la GST mediante rotura con trombina y unión de la GST a una matriz de glutatión. La expresión de pGEX-4T3_FragSSIV tuvo lugar mediante la adición de 1 mM isopropyl-D-thiogalactopyranoside (IPTG) en 100 ml de cultivo celular cuando la densidad óptica del mismo era de

0.6. Tras 2 horas adicionales de cultivo las células se centrifugaron a 10,000 g durante 5 minutos, se resuspendieron en 50 mM HEPES (pH 7.0) y se sonicaron. El sobrenadante que contiene el fragmento de AtSSIV recombinante fusionado con GST (GST-SSIV) se hizo pasar por una columna de aﬁnidad de Glutation-Sefarosa (GE Healthcare). Después de lavar la columna para eliminar las proteínas que no se habían unido a ella, el fragmento de SSIV se eluyó mediante tratamiento con trombina, que corta la unión del fragmento SSIV con la proteína GST, la cual permanece unida a la columna de aﬁnidad. El fragmento de AtSSIV recombinante puriﬁcado fue mezclado con adyuvante completo de Freund (en una relación 50/50) y posteriormente fue alicuotado en tres fracciones iguales, que se enviaron al Centro de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla, donde se obtuvieron anticuerpos policlonales de conejo contra dicho polipéptido. Finalmente, el anticuerpo anti-SSIV se puriﬁcó mediante FPLC usando una columna de Proteína A Sepharosa (Amersham Bioscience).

Obtención de plantas transgénicas que sobreexpresan AtSSIV

La sobre-expresión constitutiva de AtSSIV requirió la producción de un plásmido binario cuyo proceso de producción se ilustra en la Figura 4. AtSSIV fue ampliﬁcado por PCR a partir de pAtSSIV y posteriormente se clonó en pDONR/Zeo, dando lugar al plásmido pDONR/Zeo-AtSSIV. A partir de pDONR/Zeo-AtSSIV y pK2GW7,0 (14) se obtuvo el plásmido pK2GW7,0-AtSSIV (o pKan-35S-AtSSIV), el cual posee el promotor constitutivo 35S, AtSSIV y el terminador 35S. pK2GW7,0-AtSSIV se introdujo por electroporación en A. tumefaciens, dando lugar a la cepa DSM 19675, que fue depositada en el “Germán National Resource Centre for Biological Material” el 18 de septiembre de 2007, sita en el DMSZ, Mascheroder Weg 1b D-38124 (Braunschweig, Alemania). Esta cepa se utilizó para transformar plantas de patata y Arabidopsis según protocolos descritos en la literatura (15, 16).

Obtención de células de Escherichia coli AglgAP y AglgCAP que sobre-expresan AtSSIV

La secuencia de AtSSIV que codiﬁca para la proteína madura AtSSIV fue ampliﬁcada por PCR a partir de pATS-SIV y posteriormente se clonó en pET-45b(+) (Novagen) dando lugar al plásmido pET-AtSSIV según se ilustra en la Figura 5. pET-AtSSIV fue introducido por electroporación en las cepas de E. coli BL21(DE3) AglgAP y AglgCAP (17). Estas cepas no poseen actividad glucógeno sintasa que pueda interferir con la actividad SS. La sobre-expresión de AtSSIV tuvo lugar mediante la adición de 1 mM isopropyl-D-thiogalactopyranoside (IPTG) en 100 ml de cultivo celular cuando la densidad óptica del mismo era de 0.6. Tras 2 horas adicionales de cultivo las células se centrifugaron a 10,000 g durante 5 minutos, se resuspendieron en 50 mM HEPES (pH 7.0) y se sonicaron.

Identiﬁcación de SSIV

Es una SS (EC 2.4.1.21) que transﬁere la glucosa desde el ADP-glucosa al extremo de una cadena almidón o glucógeno (u otro tipo de polisacárido de moléculas de glucosa unidas entre sí por enlaces covalentes de tipo α-(1,4)) mediante la creación de un nuevo enlace de tipo α-(1,4). Además, posee la peculiaridad de utilizar maltotriosa como sustrato. La identiﬁcación de SSIV podrá realizarse de cualquiera de las maneras siguientes: (a) mediante zimogramas,

(b) mediante análisis de la incorporación de radiactividad a partir de ADP-glucosa marcada radiactivamente en polisacáridos de glucosa, (c) mediante complementación del fenotipo “glycogen-less” de la cepa AglgAP de E. coli, (d) mediante immunoblots haciendo uso de anticuerpos especíﬁcos contra AtSSIV y (e) mediante análisis por microscopía confocal de la localización subcelular de SSIV fusionada con la green ﬂuorescence protein (GFP):

•: Por zimogramas: SSIV separado electroforéticamente en un gel nativo (50 mM GlyGly/NaOH pH 9; 100 mM (NH4)SO4; 5 mM (3-mercaptoetanol; 5 mM MgCl2, 0,25 g 1 BSA) que contenga glucógeno (o cualquier otro tipo de polisacárido de moléculas de glucosa unidas entre sí por enlaces α-(1,4)) y que haya sido incubado en una solución con ADPglucosa dará lugar a una banda obscura en una solución de lugol (0,5% I/1,5% KI). Dicha tinción es debida a la aﬁnidad que presenta el lugol por los polímeros de glucosa de larga cadena.

•: Por medida de radiactividad de polímeros de glucosa generados a partir de ADPglucosa marcada radiactivamente: SSIV incubado según se describe en (3) con ADPglucosa marcada radiactivamente en una solución glicina/NaOH 50 mM (pH 9.0), 100 mM (NH4)2SO4, 5 mM (3-mercaptoetanol, 5 mM MgCl2 que contenga maltotriosa (10 miligramos/mililitro), glucógeno o cualquier otro tipo de polisacárido largo de moléculas de glucosa unidas entre sí por enlaces α-(1,4) (1 miligramo/mililitro) dará lugar a un polímero de glucosa marcado radiactivamente como resultado de la incorporación de la glucosa marcada radiactivamente del ADPglucosa. La radiactividad incorporada en tal polímero puede ser medida haciendo uso de un contador de centelleo.

•: Por complementación del fenotipo “glycogen-less” de la cepa AglgAP de E. coli: la mutante insercional AglgAP de E. coli no acumula glucógeno ya que no posee el gen glgA que codiﬁca para la GlgA. Este enzima es responsable de la síntesis de glucógeno a partir del ADPglucosa existente en la célula. Por lo tanto, la identiﬁcación de la actividad SSIV en células AglgAP de E. coli se maniﬁesta mediante la observación de acúmulo de glucógeno en la mutante transformada con pET-AtSSIV.

•: Por western blot: En el caso de plantas de patata, la AtSSIV se detectó haciendo uso del anticuerpo especíﬁco anti-AtSSIV según la metodología de western blot descrita en (18). En el caso de Arabidopsis, el complejo antígeno-anticuerpo se detectó mediante incubación con un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa y empleando el Kit de detección ECL Advanced® (Amersham) el cual da lugar a un producto quimioluminiscente. La señal lumínica se detectó y cuantiﬁcó mediante el captador de imágenes ChemiDoc de Bio-Rad empleando el software de análisis de imágenes “Quantity One” de la misma casa comercial.

•: Por análisis de su localización subcelular mediante microscopía confocal. Plantas de patata y/o Arabidopsis fueron transformadas con la construcción quimérica AtSSIV-GFP obtenida según se ilustra en la Figura 6. Las plantas fueron sometidas a observación por microscopía confocal para identiﬁcar la localización subcelular de la ﬂuorescencia de GFP.

Determinación del contenido en azúcares solubles y almidón

Para el aislamiento de almidón de hojas, éstas se trituraron en un mortero con nitrógeno líquido. El extracto crudo obtenido se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 1 hora a través de una capa de Percoll (SIGMA) al 90%, constituyendo el precipitado obtenido la fracción puriﬁcada de almidón. El almidón puriﬁcado se cuantiﬁcó mediante un método espectrofotométrico consistente en la degradación total del almidón a residuos de glucosa mediante la acción de la enzima amiloglucosidasa y posterior cuantiﬁcación de la glucosa usando un ensayo enzimático acoplado con las enzimas hexoquinasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenada (7).

Depósito de microorganismos según el tratado de Budapest

Los microorganismos utilizados en la presente invención fueron depositados en el “Germán National Resource Centre for Biological Material” el 18 de septiembre de 2007, sita en el DMSZ, Mascheroder Weg 1b D-38124 (Braunschweig, Alemania) con nº de depósito DSM 19675.

Ejemplos de realización de la invención

A continuación se procede a la exposición de los ejemplos en los que se muestra detalladamente el procedimiento para la obtención de las plantas transgénicas de Arabidopsis y patata con alto contenido en almidón, alto rendimiento y alta productividad de biomasa como consecuencia del incremento de la actividad SSIV. Los modos de realización, ejemplos y las ﬁguras que siguen se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1

Obtención del cDNA completo que codiﬁca para AtSSIV

El conocimiento de la secuencia nucleotídica del gen AtSSIV que codiﬁca para AtSSIV permitió la creación de dos cebadores especíﬁcos cuyas secuencias son, en sentido 5’-3’, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Haciendo uso de estos cebadores y de RNA de hojas de Arabidopsis se ampliﬁcó por métodos convencionales de RT-PCR un cDNA completo de AtSSIV (At4g18240), que se clonó en pGEM-T easy (Promega) (Figura 1).

Las secuencias nucleotídicas del DNA ampliﬁcado y la secuencia aminoacídica deducida se representan en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

Ejemplo 2

Identiﬁcación del producto con actividad SSIV

•: Identiﬁcación zimográmica: 100 μg de proteína de extractos crudos de células de E. coli BL21(DE3) AglgCAP transformadas con pET-45b(+) o con pET-AtSSIV se sometieron a electroforesis en condiciones nativas en un gel de poliacrilamida al 7,5% sin SDS, el cual contenía 0,3% (p/v) de glucógeno de hígado de cerdo (SIGMA). Tras incubar el gel durante una noche a temperatura ambiente en GlyGly/NaOH 50 mM pH 9; (NH4)SO4 100 mM; (3-mercaptoetanol 5 mM; MgCl2 5 mM, BSA 0,25 g 1 y ADP-glucosa 1 mM, éste fue incubado en una solución yodada (Lugol) compuesta por 0,5% I/1,5% KI. La presencia de nuevas cadenas de glucógeno quedará revelada gracias a la aparición de una banda obscura en el gel. Dicha banda obscura es debida a la aﬁnidad que presenta el Lugol por los polímeros de glucosa de larga cadena, de manera que allí donde una SS haya detenido su migración y hayan elongado cadenas del poliglucano por la adición de glucosas mediante enlaces α-(1,4), se observará una zona más teñida y oscura en el gel. Tal como se puede apreciar en el zimograma de la Figura 7, células BL21(DE3) AglgCAP transformadas con pET-AtSSIV presentan una actividad elongante del glucógeno dependiente de ADP-glucosa. Dicha actividad está ausente en BL21(DE3) transformada con pET-45(+).

•: Identiﬁcación por incorporación de radiactividad a partir de ADPglucosa radiativa (Figura 8). Las enzimas puriﬁcadas se incubaron a 30ºC durante 30 min en 100 μl de la siguiente mezcla de reacción: 50 mM Glygly/NaOH pH 9; 100 mM (NH4)2SO4; (3-mercaptoetanol 5 mM; 5 mM MgCl2; 0.25 g/1 BSA; 1 mM ADP-[U-C] Glucosa

(3.7 GBq/mol). Por ultimo, se añadió 10 mg/ml de malto-oligosacárido (con grado de polimerización entre 2 y 7) o amilopectina de maíz dependiendo del sustrato analizado. La reacción se paró hirviendo la muestra durante 10 min y los glucanos producidos se elongaron mediante incubación a 30ºC durante toda la noche con 7,5 U de fosforilasa a de conejo (Sigma) en presencia de 50 mM de Glucosa-1-P (concentración ﬁnal). La reacción se detuvo mediante la adición de 3.5 ml de una solución de 75% metano 1 y 1% KCl y posterior centrifugación para precipitar el glucano sintetizado. El pellet obtenido se lavó tres veces con la misma solución de parado y ﬁnalmente se cuantiﬁcó la radioactividad incorporada al mismo mediante la adición de 5 ml de líquido de centelleo Ready Protein MR (Beckman) y posterior lectura en un contador de centelleo modelo LS 6000 IC (Beckman). La elongación con fosforilasa a se omitió cuando el sustrato empleado era amilopectina. Tal y como se observa en la Figura 8, ensayos de especiﬁcidad de sustrato de SSIV muestran que SSIV es capaz de transferir moléculas de glucosa a partir de ADP-glucosa a poliglucanos tales como amilopectina. Malto-oligosacáridos de 4, 5, 6 ó 7 unidades de glucosa no son buenos sustratos para SSIV. Sorprendentemente, la maltotriosa es un excelente sustrato para la SSIV (tan bueno como la amilopectina). Este patrón de especiﬁcidad de sustrato distingue a SSIV de otras SSs ya que, tal y como se ilustra en la Figura 8, SSI, SSII y SSIII no actúan eﬁcientemente sobre la maltotriosa (3).

•: Identiﬁcación por complementación del fenotipo “glycogen-less” de la cepa AglgAP de E. coli: tal y como se observa en la Figura 9A, las células AglgAP de E. coli no acumulan glucógeno ya que no poseen GlgA. El fenotipo “glycogen-less” de esta cepa desaparece al expresar ectópicamente el gen glgA que codiﬁca para la GlgA de E. coli (Figura 9B). Al igual que las células AglgAP de E. coli transformadas con pET-glgA, células AglgAP de E. coli transformadas con pET-AtSSIV acumulan glucógeno (Figura 9C, D).

•: Identiﬁcación por localización subcelular: plantas de patata y/o Arabidopsis fueron transformadas con la construcción quimérica AtSSIV-GFP obtenida según se ilustra en la Figura 6. Las plantas fueron sometidas a análisis de la localización subcelular de la ﬂuorescencia de GFP mediante un microscopio confocal D-Eclipse C1 (NI-KON) equipado con un láser con excitación Ar 488, un ﬁltro para emisión verde BA515/30, un ﬁltro para emisión roja BA650LP y un detector de luz. En las fotografías de la Figura 10 puede observarse que, a diferencia de lo que ocurre con otros miembros de la familia de “almidón cintazas solubles”, SSIV-GFP está unido a gránulos de almidón.

Estos métodos de identiﬁcación de SSIV demuestran que la proteína AtSSIV es una SS con actividad glucosil transferasa desde la molécula donadora ADP-glucosa hasta las cadenas de un poliglucano de larga cadena tal como la amilopectina, la amilosa o el glucógeno. Además, a diferencia de lo que ocurre con otras SSs, SSIV es capaz de añadir unidades de glucosa a la maltotriosa. Finalmente, SSIV es el único miembro de la familia de “almidón sintasas solubles” que está asociada al gránulo de almidón.

Ejemplo 3

Obtención y caracterización de plantas transgénicas que sobre expresan SSIV

Utilizando la cepa de Agrobacterium tumefaciens DSM 19675 (que alberga al plásmido pK2GW7,0-AtSSIV, alternativamente designado como pKan-35S-AtSSIV) se obtuvieron plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana y patata (Solanum tuberosum) que sobre-expresan AtSSIV de manera constitutiva. Cuando se compara con plantas no transformadas, las plantas que sobre-expresan AtSSIV acumulan niveles signiﬁcativamente superiores de una proteína de aproximadamente 112 kDa que es reconocida por el anticuerpo policlonal especíﬁco de la AtSSIV (Figura 11). En el caso de la patata, tal proteína sufre recortes internos que dan lugar a fragmentos de aproximadamente 80 y 100 kDa. Las hojas de las plantas de Arabidopsis que sobre-expresan AtSSIV, así como los tubérculos de plantas de patata que sobre-expresan AtSSIV, acumulan niveles signiﬁcativamente superiores de almidón que los correspondientes órganos control (Figura 12 y Figura 13, respectivamente). Además, las plantas de Arabidopsis mostraron un rendimiento en la producción de biomasa y crecimiento superior al observado en las plantas control no transformadas (Figura 14). Finalmente, las plantas que sobre-expresan AtSSIV no presentan una morfología externa aberrante, tras ser comparada con la de las plantas no transformadas.

Bibliografía

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3.: Delvallé, D., Dumez, S., Wattlebled,F., Roldán, I., Planchot,V., Berbezy,P., Colonna,P., Vyas,D., Chatterjee, M., Ball, S., Mérida, A., D’Hulst,C.(2005) Soluble starch synthase I: a major determinant for the sintesis of amylopectin in Arabidopsis thaliana leaves. Plant J. 43, 398-412.

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5.: Leterrier, M., Holappa, L.D., Broglie, K.E., Beckles, D.M. (2008) Cloning, characterization and comparative análisis of a starch synthase IV gene in wheat: functional and evolutionary implications. BMC Plant Biol. Doi: 10.1186/1471-2229-8-98.

6.: Zhang, X., Szydlowski, N., Delvallé, D., D’Hulst, C., James, M.G., Myers, A.M. (2008) Overlapping functions of the starch synthases SSII and SSIII in amylopectin biosíntesis in Arabidopsis. BMC Plant Biol. doi: 10.1186/14712229-8-96

7. Roldán, I., Wattebled,F., Lucas, M.M., Delvallé, D., Planchot,V., Jiménez, S., Pérez, R., Ball, S., D’Hulst, C., and Mérida,A.(2007) The phenotype of soluble starch synthase IV defective mutants of Arabidopsis thaliana suggests a novel function of elongation enzymes in the control of starch granule formation. The Plant Journal 49:492

504.

8. Edwards, A., Fulton, D.C., Hylton, C.M., Jobling, S.A., Gidley, M., Rössner, U., Martín, C., Smith, A.M. A combined reduction in activity of starch synthases II and III of potato has novel effects on the starch of tubers. Plant

J. 17, 251-261.

9. Jobling, S.A., Westcott, R.J., Tayal, A., Jeffcoat, R., Schwall, G.P. (2002) Production of a freeze-thaw-stable potato starch by antisense inhibition of three starch synthase genes. Nat. Biotechnol 20, 295-299.

10. Shewmaker, C.K., Boyer, C.D., Wiesenborn, D.P., Thompson, D.B., Boersig, M.R., Oakes, J.V., Stalker,

D.M. (1994) Expression of Escherichia coli glycogen synthase in the tubers of transgenic potatoes results in a highly branched starch. Plant Physiol. 104, 1159-1166.

11.: Lloyd, J.R., Landschütze,V., Kossmann,J.(1999) Simultaneous antisense inhibition of two starch-synthase isoforms in potato tubers leads to accumulation of grossly modiﬁed amylopectin. Biochem. J. 338, 515-521.

12.: Abel, G.J.W., Springer,F., Willmitzer, L., Kossmann,J.(1996) Cloning and functional analisis of a cDNA encoding a novel 139 kDa starch synthase from potato (Solanum tuberosum L.). Plant J. 10, 981-991.

13.: Zhang, X., Myers, A.M., James, M.G. (2005) Mutations affecting starch synthase III in Arabidopsis alter leaf starch structure and increase the rate of starch síntesis. Plant Physiol. 138, 663-674.

14.: Karimi, M., Inze, D., Depicker,A(2002) GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7: 193-195.

15.: Rocha-Sosa, M., Sonnewald, U., Frommer,W., Stratmann,M., Schell, J., Willmitzer,L.(1989) Both developmental and metabolic signals activate the promoter of a class I patatine gene. EMBO J. 8, 23-29.

16.: Clough, S.J., Bent, A.F. (1998) Floral dip: a simpliﬁed method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16: 735-43.

17.: Morán-Zorzano, M.T., Alonso-Casajús, N., Muñoz, F.J., Viale, A.M., Baroja-Fernández, Eydallin G., Pozueta-Romero,J.(2007) Occurrence of more than one important source of ADPglucose linked to glycogen biosynthesis in Escherichia coli and Salmonella enterica. FEBS Lett. 581, 4423-4429

18.: Towbin, H., Staehelin,T., Gordon,J.(1979) “Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedures and some applications” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Procedimiento para la obtención de plantas transgénicas con alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa, caracterizado por la transformación de la planta silvestre con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codiﬁca para una enzima con actividad SSIV y la expresión de dicha secuencia nucleotídica en el interior de la planta transformada.
2.

Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de expresión de SSIV en el interior de la planta transformada es al menos 2 veces superior al nivel de expresión de SSIV de la planta silvestre.
3.

Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia nucleotídica comprendida en el vector de expresión utilizado para transformar la planta silvestre es la SEQ ID NO: 3 que codiﬁca para la SEQ ID NO:
4.
4.

Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el vector de expresión utilizado para transformar la planta es Agrobacterium tumefaciens DSM 19675 que comprende el plásmido pK2GW7,0.AtSSIV.
5.

Célula transformada con un vector de expresión, preferentemente un plásmido, que comprende una secuencia nucleotídica que codiﬁca para una proteína o un fragmento proteico con actividad SSIV.
6.

Célula, según la reivindicación 5, transformada con un vector de expresión seleccionado entre: Agrobacterium tumefaciens DSM 19675, plásmido pET-AtSSIV o plásmido pGEX-4T3_FragSSIV.
7.

Célula vegetal, según la reivindicación 6, caracterizada por haber sido transformada con Agrobacterium tumefaciens DSM 19675 y pertenecer a cualquiera de las siguientes especies de plantas: patata (Solanum tuberosum), tabaco (Nicotiana tabacum), cebada (Hordeum vulgare), arroz (Oryza sativa), maíz (Zea mays) o arabidopsis (Arabidopsis thaliana).
8.

Célula bacteriana, según la reivindicación 6, caracterizada por haber sido transformada con un plásmido bacteriano seleccionado entre: pET-AtSSIV o pGEX-4T3_FragSSIV y pertenecer a una cepa de E. coli seleccionada entre: BL21(DE3), BL21(DE3)AglgAP o BL21(DE3)AglgCAP.
9.

Vector de expresión Agrobacterium tumefaciens DSM 19675 caracterizado por comprender el plásmido pK2GW7,0-AtSSIV que codiﬁca para una enzima con actividad SSIV.
10. Plásmido pET-AtSSIV caracterizado por codiﬁcar para una enzima con actividad SSIV.
11.

Plásmido pGEX-4T3_FragSSIV caracterizado por codiﬁcar para un fragmento antigénico de una enzima con actividad SSIV.
12.

Uso de las células bacterianas transformadas con el plásmido pET-AtSSIV de la reivindicación 8, para la producción de una enzima con actividad SSIV.
13.

Uso de las células bacterianas transformadas con el plásmido pGEX-4T3_FragSSIV de la reivindicación 8, para la producción de anticuerpos frente a un fragmento especíﬁco de una enzima con actividad SSIV.
14. Uso de la célula de la reivindicación 6 para la producción de almidón y/o biomasa.
15.

Planta transgénica vascular caracterizada por estar transformada con el vector de la reivindicación 9 y por poseer alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa, en comparación con la planta silvestre sin transformar.
16.

Planta transgénica, según la reivindicación 15, caracterizada por presentar un nivel de expresión de SSIV al menos 2 veces superior al observado en la planta silvestre sin transformar.
17.

Planta transgénica, según la reivindicación 15, caracterizada porque su contenido en almidón y/o biomasa es al menos un 10% superior al contenido en almidón y/o biomasa de las plantas silvestres sin transformar.
18.

Planta transgénica, según la reivindicación 15, seleccionada del grupo que comprende: patata (Solanum tuberosum), tabaco (Nicotiana tabacum), cebada (Hordeum vulgare), arroz (Oryza sativa), maíz (Zea mays) o arabidopsis (Arabidopsis thaliana).
19. Uso de las plantas transgénicas de las reivindicaciones 15 a 18, para la producción de almidón y biomasa.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> IDEN BIOTECHNOLOGY

<120> PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS QUE PRESENTAN ALTO CONTENIDO Y RENDIMIENTO EN ALMIDÓN Y BIOMASA

<130> P-02874

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 69

<212> DNA

<213> Secuencia Artiﬁcial

<220>

<223> Cebador ATSSIV_Directo 5’-3’

<400> 1

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> Secuencia Artiﬁcial

<220>

<223> Cebador ATSSIV_Inverso 5’-3’

<400> 2

<210> 3

<211> 3123

<212> DNA

<213> Secuencia Artiﬁcial

<220>

<223> AtASS4 5’-3’

ES 2 354 897 Bl

<400> 3

ES 2 354 897 Bl

<210> 4

<211> 1040

<212> PRT

<213> Secuencia Artiﬁcial

<220>

<223> AtASS4

<400> 4

ES 2 354 897 Bl

ES 2 354 897 Bl

ES 2 354 897 Bl

ES 2 354 897 Bl

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Secuencia Artiﬁcial

<220>

<223> Oligonucleótido 5’-3’

<400> 5

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Secuencia Artiﬁcial

<220>

<223> Oligonucleótido 5’-3’

<400> 6

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 200930009

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 24.03.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C12N15/82 (01.01.2006) A01H5/00 (01.01.2006)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

Documentos citados Reivindicaciones afectadas

Y

US 20030097688 A1 (ALLEN STEPHEN M. et al.) 22.05.2003, páginas 14,34. 5-12,14

Y

ROLDAN I, et al. The phenotype of soluble starch synthase IV defective mutants of Arabidopsis thaliana suggests a novel function of elongation enzymes in the control of starch granule formation. 2007. The Plant Journal. Vol. 49 (3), páginas 492-504. Página 493. 5-12,14

A

WO 2008012356 A1 (INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE-INRA.CSIC) 31.01.2008 1-19

A

DIAN WEIMIN, et al. Evolution and expression analysis of starch synthase III and IV in rice. 2005. J. Exp. Bot. Vol. 56 (412), páginas 623-632. 1-19

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 16.02.2011

Examinador I. Rueda Molins Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 200930009

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12N, A01H Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de

búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXT

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200930009

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 16.02.2011

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-19 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones 1-4, 13, 15-19 Reivindicaciones 5-12,14 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200930009

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

US 20030097688 A1 (ALLEN STEPHEN M. et al.), páginas 14,34. 22.05.2003

D02

ROLDAN I, et al. The phenotype of soluble starch synthase IV defective mutants of Arabidopsis thaliana suggests a novel function of elongation enzymes in the control of starch granule formation.The Plant Journal. Vol. 49 (3), páginas 492-504. Página 493. 2007

D03

WO 2008012356 A1 (INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE-INRA.CSIC). 31.01.2008.

D04

DIAN WEIMIN, et al. Evolution and expression analysis of starch synthase III and IV in rice. J. Exp. Bot. Vol. 56 (412), páginas 623-632. 2005
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

La solicitud de patente divulga un procedimiento para la obtención de plantas transgénicas con alto contenido en almidón y biomasa.

El documento D01, que es el que refleja el estado de la técnica más cercano, muestra una construcción génica que presenta una secuencia que codifica para una determinada isoforma enzimática de la almidón sintasa (SS).

En el documento D02 se emplea el gen AtSS4 (At4g18240), que codifica para una proteína con actividad SSIV, para la elaboración de mutantes de Arabidopsis thaliana.

NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Artículos 6 y 8 LP11/1986)

En la solicitud de patente se reivindica una célula transformada con determinados vectores de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína con actividad SSIV (reivindicaciones 5-8). Vectores de expresión y plásmidos que codifican para un enzima con actividad SSIV (reivindicaciones 9-11). Así como, diferentes usos de las células transformadas (reivindicaciones 12 y 14).

El documento D01 muestra (en el ejemplo 5 de la página 14 y en las reivindicaciones 1, 6-8 y 13 de la página 34) un método para transformar una célula con una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína almidón sintasa, usos de dicha célula transformada y un vector de expresión que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica para dicha almidón sintasa.

Las diferencias entre la solicitud de patente y el documento D01 residen en que por un lado la secuencia nucleotídica para la cual codifica la célula transformada es diferente y por otro lado en que los vectores de expresión reivindicados no coinciden con los que muestra el documento D01. Teniendo en cuenta que la secuencia nucleotídica, para la cual codifica la célula transformada reivindicada en la solicitud de patente, está divulgada en la página 493 del documento D02, y que las diferencias entre los vectores reivindicados en la solicitud de patente y los que refleja el documento D01 no suponen ventajas técnicas, sino que son una alternativa que deriva de manera evidente del estado de la técnica para un experto en la materia, se puede afirmar que las reivindicaciones 5-12 y 14 presentan novedad pero no actividad inventiva según lo establecido en los Artículos 6 y 8 de la LP11/1986.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/4