ES2354897A1 - Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa. Las SSs en plantas (incluida la SSIV) y la glucógeno sintasa en bacterias catalizan la transferencia de la parte glucosídica de la molécula de ADP-glucosa (el donador activado de glucosa) a un glucano {al}(1-4) preexistente. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre con otras SSs, la SSIV es capaz de añadir unidades de glucosa sobre maltotriosas. Además, a diferencia de lo que ocurre con otras SSs "solubles", SSIV está unida al gránulo de almidón. En esta invención se describe por primera vez la obtención de plantas que poseen altos niveles y rendimientos de almidón y biomasa, como consecuencia de la expresión de genes que codifican para SSIV.
Description
Procedimiento para la producción de plantas
transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y
biomasa.
La presente invención se engloba dentro del
campo de la ingeniería genética y de la fisiología vegetal.
Concretamente la invención comprende un procedimiento para la
producción de plantas transgénicas con alto contenido y rendimiento
en almidón y biomasa; así como los vectores utilizados para
transformar las células, las propias células transformadas, las
plantas transgénicas obtenidas por dicho procedimiento y sus
respectivos usos.
El glucógeno (en animales y bacterias) y el
almidón (en plantas) constituyen las formas principales de
almacenamiento de carbohidratos de reserva. En plantas el almidón se
acumula en grandes cantidades en órganos tales como semillas y
tubérculos, y es un constituyente fundamental de la dieta del ser
humano. Por otro lado, el almidón constituye una fuente de material
renovable y completamente biodegradable, siendo utilizado
frecuentemente en las industrias papelera, cosmética, farmacéutica y
alimentaria, además de emplearse como componente fundamental para la
fabricación de plásticos biodegradables, pinturas de bajo impacto
medioambiental y bioetanol.
La biosíntesis de almidón es un proceso complejo
que requiere la acción concertada de diferentes actividades
enzimáticas tales como la sacarosa sintasa, la fosfoglucomutasa, la
ADP-glucosa pirofosforilasa, diferentes tipos de
glucosil transferasas comúnmente designadas como almidón sintasas
(SS), y las enzimas ramificante y desrramificante del almidón
(1).
La SS en plantas y la glucógeno sintasa (GlgA)
en bacterias catalizan la transferencia de la mitad glucosídica de
la molécula de ADP-Glucosa (el donador activado de
glucosa) a un glucano \alpha(1-4)
preexistente. En todos los organismos fotosintéticos que acumulan
almidón se han encontrado las mismas SSs denominadas SSI, SSII,
SSIII, SSIV y GBSSI. Este alto grado de conservación indica que cada
una de estas proteínas desempeña funciones diferentes en el proceso
de creación del gránulo de almidón (2). Así por ejemplo, la GBSSI
está implicada en la producción de amilosa, mientras que la SSI, la
SSII y la SSIII están implicadas en la producción de cadenas de
almidón cortas, intermedias y largas de amilopectina,
respectivamente (3).
La SSIV es la menos conocida de la familia de
proteínas comúnmente designadas como SSs solubles. Su secuencia
aminoacídica con respecto a SSI, SSII y SSIII varía entre un 30% y
un 50% (4, 5). A pesar de su designación, todavía no se ha
demostrado su actividad SS. Es más, recientemente se ha instalado la
idea de que SSIV no cubre el campo de acción y función de las otras
SSs (6). Sin embargo, existen evidencias que sugieren que SSIV puede
estar implicada en la determinación del número de gránulos de
almidón existentes en el plastidio (7).
Son múltiples las referencias que muestran que
la reducción de la actividad SSI, SSII y SSIII conlleva una
reducción en los niveles de almidón y la alteración de la estructura
y composición del gránulo (8, 9). Mutantes de Arabidopsis que
no poseen SSIV acumulan niveles reducidos de almidón pero (a) el
balance amilosa/amilopectina y la estructura molecular de la
amilopectina son normales y (b) tan solo producen un gránulo de
almidón por cloroplasto (7).
Contrariamente a lo esperado, plantas
transgénicas que sobre-expresan la GlgA de
Escherichia coli acumulan bajo contenido en almidón (10). Si
bien la expresión ectópica de SSI, SSII y SSIII ha sido utilizada
como estrategia para incrementar el contenido en almidón (WO
00/66745) y modificar propiedades del almidón tales como el
contenido en fosfato (WO2007/009823) (11-13) o el
balance amilosa/amilopectina (WO 2006/084336; WO 2002/018606), no
existen evidencias experimentales que indiquen que (a) SSIV tiene
actividad SS y (b) la expresión ectópica de SSIV pueda ser utilizada
como una estrategia biotecnológica para incrementar la cantidad del
almidón, así como el rendimiento y tasa de acumulación de biomasa de
las plantas. En la presente invención, tras demostrar que SSIV es
una SS que reúne propiedades totalmente diferentes a las SSs
solubles SSI, SSII y SSIII, se describe por primera vez que la
sobre-expresión de SSIV es una estrategia
biotecnológica para la producción de plantas transgénicas con altos
niveles de almidón y altos rendimientos de almidón y biomasa.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la producción de plantas transgénicas que
presentan alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa,
mediante la expresión ectópica de SSIV. Además la presente invención
se refiere a las propias plantas transgénicas caracterizadas por
dichas propiedades.
Los efectos técnicos mostrados en la presente
invención son extrapolables a cualquier tipo de órgano de la planta
tal como tubérculos, hojas, frutos y semillas; así como a cualquier
tipo de planta como por ejemplo: Arabidopsis, patata, tabaco,
tomate, arroz, cebada, trigo y maíz. Los resultados mostrados en la
presente invención fueron conseguidos, tanto expresando
constitutivamente AtSSIV (el gen que codifica para SSIV en A.
thaliana) bajo el control del promotor 35S, como expresando
AtSSIV bajo el control de un promotor específico de tubérculo
utilizado (promotor del gen de la patatina). Cabe decir que la
expresión constitutiva fue particularmente preferida. Los resultados
mostrados en la presente invención fueron conseguidos tras
sobre-expresar cualquier isoforma y secuencia de
SSIV (siendo particularmente preferida la SSIV de
Arabidopsis). Es decir, cualquier promotor expresable en
plantas que produzca la sobre-expresión de AtSSIV,
así como cualquier isoforma de SSIV, estarían comprendidos en la
presente invención.
A efectos de la presente invención, se hacen
constar los siguientes términos:
- \bullet
- Planta transgénica: planta cuyo genoma ha sido modificado mediante ingeniería genética con el objetivo de conseguir características biológicas diferentes y/o mejoradas respecto a las de la planta silvestre control (WT).
- \bullet
- Célula vegetal transformada: son células vegetales que presentan una alteración genética resultado de la introducción y expresión de material genético externo en su genoma.
- \bullet
- Sobre-expresión de SSIV: una planta sobre-expresa el enzima SSIV cuando la intensidad de la banda obtenida en un western blot de un extracto de una planta transformada es significativamente superior a la obtenida con un extracto de plantas WT cultivadas en las mismas condiciones y en el mismo momento. A modo ilustrativo, en la Figura 11A se puede observar que la intensidad de las bandas obtenidas a partir de extractos de plantas transgénicas de Arabidopsis y de patata que sobre-expresan AtSSIV es significativamente superior a la obtenida a partir de extractos de plantas WT en western blots en los que se utilizó un anticuerpo específico de AtSSIV.
- \bullet
- Alto contenido de almidón: según se utiliza en la presente invención, esta expresión está directamente referida a un valor estadísticamente significativo, superior a los valores observados en las plantas control. A modo ilustrativo, en la Figura 13 se puede observar que el contenido medio de almidón en los tubérculos de las plantas de patata silvestres analizadas es de aproximadamente 525 \mumoles de glucosa/g de peso fresco, con un margen de variación del 10%. Por lo tanto podría considerarse como "alto contenido en amidón" aquel que supere, al menos en un 10%, dicho valor de 525 umoles de glucosa/g de peso fresco. En la presente invención se supera dicho valor consiguiendo tubérculos transgénicos que acumulan cantidades de almidón de 600 \mumoles de glucosa/g de peso fresco como mínimo.
- \bullet
- Alta productividad en biomasa: según se utiliza en la presente invención, esta expresión está directamente referida a un valor estadísticamente significativo, superior a los valores observados en las plantas control. A modo ilustrativo, en la Figura 14 se puede observar que el incremento del peso fresco de plantas transgénicas de Arabidopsis a lo largo del desarrollo de la planta es más acelerado que en las plantas silvestres.
- \bullet
- Actividad SSIV: la actividad de la enzima SSIV comprende (a) transferir unidades de glucosa desde ADPglucosa a maltotriosa y poliglucanos tales como almidón, amilosa, amilopectina y glucógeno y (b) estar localizada en la superficie del gránulo de almidón.
Figura 1. Mapa de restricción del plásmido
pAtSSIV resultante del clonaje de un cDNA completo que codifica para
el gen AtSSIV de Arabidopsis thaliana en el vector
pGEM-T easy (Promega).
Figura 2. (a-h) Comparación de
secuencias aminoacídicas deducidas de AtSSI, AtSSII, AtSSIII y
AtSSIV. Los aminoácidos conservados en todas las SSs están
enmarcados en negro. El fragmento de AtSSIV empleado para obtener
anticuerpos específicos contra esta proteína se indica con una línea
negra, subrayada.
Figura 3. Mapa de restricción del plásmido
pGEX-4T3_FragSSIV utilizado para la síntesis del
péptido necesario para la producción del anticuerpo específico de
SSIV.
Figura 4. Etapas de construcción del plásmido
binario pK2GW7,0-AtSSIV (alternativamente designado
pKan-35S-AtSSIV) necesario para la
transformación de plantas con Agrobacterium tumefaciens.
Figura 5. Mapa de restricción del plásmido
pET-AtSSIV necesario para la expresión en E.
coli de la SSIV madura.
Figura 6. Etapas de construcción del plásmido
binario pAtSSIV-GFP necesario para la transformación
de plantas en Agrobacterium tumefaciens.
Figura 7. Zimograma de actividad SS empleando
glucógeno como cebo.
Figura 8. Especificidad de sustrato. Ensayo
in vitro de SSI, SSII, SSIII y SSIV con diferentes
malto-oligosacáridos como sustrato.
Figura 9. SSIV es capaz de complementar el
fenotipo "glycogen-less" de las células AglgAP.
Patrón de tinción en iodina tras 12, 24 y 36 horas de incubación de
(A) AglgAP, (B) AglgAP que expresan GlgA y (C,D) AglgAP que expresan
SSIV.
Figura 10. Localización subcelular de AtSSIV. La
ilustración muestra la fluorescencia producida en células de plantas
de Arabidopsis transformadas con AtSSIV-GFP
que han sido sometidas a análisis mediante un microscopio confocal
D-Eclipse C1 (NIKON) equipado con un láser con
excitación Ar 488, un filtro para emisión verde BA515/30, un filtro
para emisión roja BA650LP y un detector de luz. En las fotografías
puede observarse que SSIV-GFP está localizado en la
superficie de gránulos de almidón.
Figura 11. Análisis mediante western blot (A) y
cuantificación (B) de los niveles de proteína SSIV en el ecotipo
silvestre Col-0 (WT) y en las líneas transgénicas
que sobre-expresan el gen AtSSIV (L10, L11, L12 y
L13) tras integrar en su genoma la construcción
35S-AtSSIV haciendo uso de la cepa de A.
tumefaciens DSM 19675. En (C), análisis mediante western blot de
SSIV en tubérculos de patata que expresan AtASSIV tras integrar en
su genoma la construcción 35S-AtSSIV haciendo uso de
la cepa de A. tumefaciens DSM 19675. Las plantas transgénicas
reciben la designación 2, 6, 7, 8 y 9.
Figura 12. Niveles de almidón en hojas de
plantas de Arabidopsis a lo largo de un ciclo 16 h luz/8 h
oscuridad. Los círculos blancos corresponden a plantas silvestres de
Arabidopsis thaliana, ecotipo Col-0. Los
círculos negros corresponden a plantas transgénicas de
Arabidopsis que sobre-expresan el gen AtSSIV
que codifica para la SSIV de Arabidopsis thaliana.
Figura 13. Contenido de almidón en tubérculos de
plantas de patata silvestres y plantas de patata que expresan
AtASSIV tras integrar en su genoma la construcción
35S-AtSSIV haciendo uso de la cepa de A.
tumefaciens DSM 19675. Los tubérculos silvestres analizados se
designan como WT. Las plantas transgénicas reciben la designación 2,
6, 7, 8 y 9. Los valores representados se corresponden a la media y
desviación típica de tubérculos de 10 plantas diferentes por
línea.
Figura 14. (A) Evolución del peso fresco de
plantas silvestres de Arabidopsis thaliana, ecotipo
Col-0 (círculos blancos) y plantas transgénicas de
Arabidopsis que sobre-expresan el gen AtSSIV
(círculos negros) a lo largo del crecimiento. Los datos son la media
de tres medidas. Cada medida se realizó pesando conjuntamente la
parte aérea de 5 plantas y dividiendo el valor obtenido por cinco.
Las barras indican la desviación estándar de las medidas. (B)
Comparación visual entre plantas de Arabidopsis ecotipo
Col-0 (parte izquierda de la fotografía) y plantas
transgénicas de Arabidopsis que
sobre-expresan el gen AtSSIV (parte derecha de la
fotografía).
AtSSIV está codificada por el gen At4g18240 (o
AtSSIV). A partir de su secuencia nucleotídica se sintetizaron
oligonucleótidos específicos para el gen AtSSIV. Estos
oligonucleótidos se emplearon para amplificar mediante
RT-PCR a partir de RNA total de hojas de
Arabidopsis el fragmento completo de cDNA que codifica para
AtSSIV. El fragmento amplificado se clonó en el vector
pGEM-T easy (Promega) dando lugar al plásmido
pAtSSIV (Figura 1) que fue amplificado en la bacteria hospedadora
XL1 Blue.
Para la obtención de un anticuerpo policlonal
contra AtSSIV se seleccionó como zona antigénica un fragmento de la
región amino terminal de la proteína que no presentaba homología con
las otras SSs presentes en Arabidopsis (Figura 2). En
concreto la región comprendida entre los aminoácidos Glutámico 236 y
Glutámico 414 de la secuencia de aminoácidos de AtSSIV. En la
clonación de la secuencia de cDNA que codifica para dicho fragmento
se emplearon los oligonucleótidos caracterizados por las SEQ ID NO:
5 y 6.
El fragmento de 512 pares de bases se amplificó
mediante PCR empleando dichos oligonucleótidos y cDNA (SEQ ID NO: 3)
de primera cadena obtenido a partir de mRNA de hojas como molde. Los
oligonucleótidos introducen sitios de restricción para las enzimas
NdeI y XhoI en los extremos 5' y 3' respectivamente del fragmento
amplificado, los cuales fueron usados para clonar el fragmento de
cDNA en el vector de expresión pGEX-4T (Amersham
Biosciences) dando lugar al plásmido
pGEX-4T3_FragSSIV (Figura 3). Este vector de
expresión contiene la secuencia codificante para la proteína
glutatión S-transferasa (GST). La clonación del
fragmento de cDNA de AtSSIV en el vector se llevó a cabo respetando
la pauta de lectura marcada por el gen que codifica la GST,
permitiendo la fusión traduccional del fragmento de polipéptido de
AtSSIV con el extremo carboxi-terminal de la
proteína GST. La construcción fue confirmada mediante secuenciación
de DNA y con ella se transformó la estirpe de E. coli BL21
(DE3).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se procedió entonces a la expresión y
purificación del polipéptido de fusión GST-SSIV con
glutatión agarosa, y la posterior purificación del fragmento
polipeptídico de AtSSIV de la GST mediante rotura con trombina y
unión de la GST a una matriz de glutatión. La expresión de
pGEX-4T3_FragSSIV tuvo lugar mediante la adición de
1 mM
isopropyl-D-thiogalactopyranoside
(IPTG) en 100 ml de cultivo celular cuando la densidad óptica del
mismo era de 0.6. Tras 2 horas adicionales de cultivo las células se
centrifugaron a 10,000 g durante 5 minutos, se resuspendieron en 50
mM HEPES (pH 7.0) y se sonicaron. El sobrenadante que contiene el
fragmento de AtSSIV recombinante fusionado con GST
(GST-SSIV) se hizo pasar por una columna de afinidad
de Glutation-Sefarosa (GE Healthcare). Después de
lavar la columna para eliminar las proteínas que no se habían unido
a ella, el fragmento de SSIV se eluyó mediante tratamiento con
trombina, que corta la unión del fragmento SSIV con la proteína GST,
la cual permanece unida a la columna de afinidad. El fragmento de
AtSSIV recombinante purificado fue mezclado con adyuvante completo
de Freund (en una relación 50/50) y posteriormente fue alicuotado en
tres fracciones iguales, que se enviaron al Centro de Producción y
Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla, donde se
obtuvieron anticuerpos policlonales de conejo contra dicho
polipéptido. Finalmente, el anticuerpo anti-SSIV se
purificó mediante FPLC usando una columna de Proteína A Sepharosa
(Amersham Bioscience).
La sobre-expresión constitutiva
de AtSSIV requirió la producción de un plásmido binario cuyo proceso
de producción se ilustra en la Figura 4. AtSSIV fue amplificado por
PCR a partir de pAtSSIV y posteriormente se clonó en pDONR/Zeo,
dando lugar al plásmido pDONR/Zeo-AtSSIV. A partir
de pDONR/Zeo-AtSSIV y pK2GW7,0 (14) se obtuvo el
plásmido pK2GW7,0-AtSSIV (o
pKan-35S-AtSSIV), el cual posee el
promotor constitutivo 35S, AtSSIV y el terminador 35S.
pK2GW7,0-AtSSIV se introdujo por electroporación en
A. tumefaciens, dando lugar a la cepa DSM 19675, que fue
depositada en el "Germán National Resource Centre for Biological
Material" el 18 de septiembre de 2007, sita en el DMSZ,
Mascheroder Weg 1b D-38124 (Braunschweig, Alemania).
Esta cepa se utilizó para transformar plantas de patata y
Arabidopsis según protocolos descritos en la literatura (15,
16).
La secuencia de AtSSIV que codifica para la
proteína madura AtSSIV fue amplificada por PCR a partir de pATSSIV y
posteriormente se clonó en pET-45b(+) (Novagen)
dando lugar al plásmido pET-AtSSIV según se ilustra
en la Figura 5. pET-AtSSIV fue introducido por
electroporación en las cepas de E. coli BL21(DE3)
AglgAP y AglgCAP (17). Estas cepas no poseen actividad glucógeno
sintasa que pueda interferir con la actividad SS. La
sobre-expresión de AtSSIV tuvo lugar mediante la
adición de 1 mM
isopropyl-D-thiogalactopyranoside
(IPTG) en 100 ml de cultivo celular cuando la densidad óptica del
mismo era de 0.6. Tras 2 horas adicionales de cultivo las células se
centrifugaron a 10,000 g durante 5 minutos, se resuspendieron en 50
mM HEPES (pH 7.0) y se sonicaron.
Es una SS (EC 2.4.1.21) que transfiere la
glucosa desde el ADP-glucosa al extremo de una
cadena almidón o glucógeno (u otro tipo de polisacárido de moléculas
de glucosa unidas entre sí por enlaces covalentes de tipo
\alpha-(1,4)) mediante la creación de un nuevo enlace de tipo
\alpha-(1,4). Además, posee la peculiaridad de utilizar
maltotriosa como sustrato. La identificación de SSIV podrá
realizarse de cualquiera de las maneras siguientes: (a) mediante
zimogramas, (b) mediante análisis de la incorporación de
radiactividad a partir de ADP-glucosa marcada
radiactivamente en polisacáridos de glucosa, (c) mediante
complementación del fenotipo "glycogen-less" de
la cepa AglgAP de E. coli, (d) mediante immunoblots haciendo
uso de anticuerpos específicos contra AtSSIV y (e) mediante análisis
por microscopía confocal de la localización subcelular de SSIV
fusionada con la green fluorescence protein (GFP):
- \bullet
- Por zimogramas: SSIV separado electroforéticamente en un gel nativo (50 mM GlyGly/NaOH pH 9; 100 mM (NH4)SO4; 5 mM (3-mercaptoetanol; 5 mM MgCl2, 0,25 g 1 BSA) que contenga glucógeno (o cualquier otro tipo de polisacárido de moléculas de glucosa unidas entre sí por enlaces \alpha-(1,4)) y que haya sido incubado en una solución con ADPglucosa dará lugar a una banda obscura en una solución de lugol (0,5% I/1,5% KI). Dicha tinción es debida a la afinidad que presenta el lugol por los polímeros de glucosa de larga cadena.
- \bullet
- Por medida de radiactividad de polímeros de glucosa generados a partir de ADPglucosa marcada radiactivamente: SSIV incubado según se describe en (3) con ADPglucosa marcada radiactivamente en una solución glicina/NaOH 50 mM (pH 9.0), 100 mM (NH4)2SO4, 5 mM (3-mercaptoetanol, 5 mM MgCl2 que contenga maltotriosa (10 miligramos/mililitro), glucógeno o cualquier otro tipo de polisacárido largo de moléculas de glucosa unidas entre sí por enlaces \alpha-(1,4) (1 miligramo/mililitro) dará lugar a un polímero de glucosa marcado radiactivamente como resultado de la incorporación de la glucosa marcada radiactivamente del ADPglucosa. La radiactividad incorporada en tal polímero puede ser medida haciendo uso de un contador de centelleo.
- \bullet
- Por complementación del fenotipo "glycogen-less" de la cepa AglgAP de E. coli: la mutante insercional AglgAP de E. coli no acumula glucógeno ya que no posee el gen glgA que codifica para la GlgA. Este enzima es responsable de la síntesis de glucógeno a partir del ADPglucosa existente en la célula. Por lo tanto, la identificación de la actividad SSIV en células AglgAP de E. coli se manifiesta mediante la observación de acúmulo de glucógeno en la mutante transformada con pET-AtSSIV.
- \bullet
- Por western blot: En el caso de plantas de patata, la AtSSIV se detectó haciendo uso del anticuerpo específico anti-AtSSIV según la metodología de western blot descrita en (18). En el caso de Arabidopsis, el complejo antígeno-anticuerpo se detectó mediante incubación con un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa y empleando el Kit de detección ECL Advanced® (Amersham) el cual da lugar a un producto quimioluminiscente. La señal lumínica se detectó y cuantificó mediante el captador de imágenes ChemiDoc de Bio-Rad empleando el software de análisis de imágenes "Quantity One" de la misma casa comercial.
- \bullet
- Por análisis de su localización subcelular mediante microscopía confocal. Plantas de patata y/o Arabidopsis fueron transformadas con la construcción quimérica AtSSIV-GFP obtenida según se ilustra en la Figura 6. Las plantas fueron sometidas a observación por microscopía confocal para identificar la localización subcelular de la fluorescencia de GFP.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para el aislamiento de almidón de hojas, éstas
se trituraron en un mortero con nitrógeno líquido. El extracto crudo
obtenido se centrifugó a 13.000 r.p.m. durante 1 hora a través de
una capa de Percoll (SIGMA) al 90%, constituyendo el precipitado
obtenido la fracción purificada de almidón. El almidón purificado se
cuantificó mediante un método espectrofotométrico consistente en la
degradación total del almidón a residuos de glucosa mediante la
acción de la enzima amiloglucosidasa y posterior cuantificación de
la glucosa usando un ensayo enzimático acoplado con las enzimas
hexoquinasa y glucosa-6-fosfato
deshidrogenada (7).
Los microorganismos utilizados en la presente
invención fueron depositados en el "Germán National Resource
Centre for Biological Material" el 18 de septiembre de 2007, sita
en el DMSZ, Mascheroder Weg 1b D-38124
(Braunschweig, Alemania) con nº de depósito DSM 19675.
A continuación se procede a la exposición de los
ejemplos en los que se muestra detalladamente el procedimiento para
la obtención de las plantas transgénicas de Arabidopsis y
patata con alto contenido en almidón, alto rendimiento y alta
productividad de biomasa como consecuencia del incremento de la
actividad SSIV. Los modos de realización, ejemplos y las figuras que
siguen se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser
limitantes de la presente invención.
El conocimiento de la secuencia nucleotídica del
gen AtSSIV que codifica para AtSSIV permitió la creación de dos
cebadores específicos cuyas secuencias son, en sentido
5'-3', SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Haciendo uso de
estos cebadores y de RNA de hojas de Arabidopsis se amplificó
por métodos convencionales de RT-PCR un cDNA
completo de AtSSIV (At4g18240), que se clonó en
pGEM-T easy (Promega) (Figura 1).
Las secuencias nucleotídicas del DNA amplificado
y la secuencia aminoacídica deducida se representan en SEQ ID NO: 3
y SEQ ID NO: 4, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Identificación zimográmica: 100 \mug de proteína de extractos crudos de células de E. coli BL21(DE3) AglgCAP transformadas con pET-45b(+) o con pET-AtSSIV se sometieron a electroforesis en condiciones nativas en un gel de poliacrilamida al 7,5% sin SDS, el cual contenía 0,3% (p/v) de glucógeno de hígado de cerdo (SIGMA). Tras incubar el gel durante una noche a temperatura ambiente en GlyGly/NaOH 50 mM pH 9; (NH4)SO4 100 mM; (3-mercaptoetanol 5 mM; MgCl2 5 mM, BSA 0,25 g 1 y ADP-glucosa 1 mM, éste fue incubado en una solución yodada (Lugol) compuesta por 0,5% I/1,5% KI. La presencia de nuevas cadenas de glucógeno quedará revelada gracias a la aparición de una banda obscura en el gel. Dicha banda obscura es debida a la afinidad que presenta el Lugol por los polímeros de glucosa de larga cadena, de manera que allí donde una SS haya detenido su migración y hayan elongado cadenas del poliglucano por la adición de glucosas mediante enlaces \alpha-(1,4), se observará una zona más teñida y oscura en el gel. Tal como se puede apreciar en el zimograma de la Figura 7, células BL21(DE3) AglgCAP transformadas con pET-AtSSIV presentan una actividad elongante del glucógeno dependiente de ADP-glucosa. Dicha actividad está ausente en BL21(DE3) transformada con pET-45(+).
- \bullet
- Identificación por incorporación de radiactividad a partir de ADPglucosa radiativa (Figura 8). Las enzimas purificadas se incubaron a 30ºC durante 30 min en 100 \mul de la siguiente mezcla de reacción: 50 mM Glygly/NaOH pH 9; 100 mM (NH4)2SO4; (3-mercaptoetanol 5 mM; 5 mM MgCl2; 0.25 g/1 BSA; 1 mM ADP-[U-C] Glucosa (3.7 GBq/mol). Por ultimo, se añadió 10 mg/ml de malto-oligosacárido (con grado de polimerización entre 2 y 7) o amilopectina de maíz dependiendo del sustrato analizado. La reacción se paró hirviendo la muestra durante 10 min y los glucanos producidos se elongaron mediante incubación a 30ºC durante toda la noche con 7,5 U de fosforilasa a de conejo (Sigma) en presencia de 50 mM de Glucosa-1-P (concentración final). La reacción se detuvo mediante la adición de 3.5 ml de una solución de 75% metano 1 y 1% KCl y posterior centrifugación para precipitar el glucano sintetizado. El pellet obtenido se lavó tres veces con la misma solución de parado y finalmente se cuantificó la radioactividad incorporada al mismo mediante la adición de 5 ml de líquido de centelleo Ready Protein MR (Beckman) y posterior lectura en un contador de centelleo modelo LS 6000 IC (Beckman). La elongación con fosforilasa a se omitió cuando el sustrato empleado era amilopectina. Tal y como se observa en la Figura 8, ensayos de especificidad de sustrato de SSIV muestran que SSIV es capaz de transferir moléculas de glucosa a partir de ADP-glucosa a poliglucanos tales como amilopectina. Malto-oligosacáridos de 4, 5, 6 ó 7 unidades de glucosa no son buenos sustratos para SSIV. Sorprendentemente, la maltotriosa es un excelente sustrato para la SSIV (tan bueno como la amilopectina). Este patrón de especificidad de sustrato distingue a SSIV de otras SSs ya que, tal y como se ilustra en la Figura 8, SSI, SSII y SSIII no actúan eficientemente sobre la maltotriosa (3).
- \bullet
- Identificación por complementación del fenotipo "glycogen-less" de la cepa AglgAP de E. coli: tal y como se observa en la Figura 9A, las células AglgAP de E. coli no acumulan glucógeno ya que no poseen GlgA. El fenotipo "glycogen-less" de esta cepa desaparece al expresar ectópicamente el gen glgA que codifica para la GlgA de E. coli (Figura 9B). Al igual que las células AglgAP de E. coli transformadas con pET-glgA, células AglgAP de E. coli transformadas con pET-AtSSIV acumulan glucógeno (Figura 9C, D).
- \bullet
- Identificación por localización subcelular: plantas de patata y/o Arabidopsis fueron transformadas con la construcción quimérica AtSSIV-GFP obtenida según se ilustra en la Figura 6. Las plantas fueron sometidas a análisis de la localización subcelular de la fluorescencia de GFP mediante un microscopio confocal D-Eclipse C1 (NIKON) equipado con un láser con excitación Ar 488, un filtro para emisión verde BA515/30, un filtro para emisión roja BA650LP y un detector de luz. En las fotografías de la Figura 10 puede observarse que, a diferencia de lo que ocurre con otros miembros de la familia de "almidón cintazas solubles", SSIV-GFP está unido a gránulos de almidón.
Estos métodos de identificación de SSIV
demuestran que la proteína AtSSIV es una SS con actividad glucosil
transferasa desde la molécula donadora ADP-glucosa
hasta las cadenas de un poliglucano de larga cadena tal como la
amilopectina, la amilosa o el glucógeno. Además, a diferencia de lo
que ocurre con otras SSs, SSIV es capaz de añadir unidades de
glucosa a la maltotriosa. Finalmente, SSIV es el único miembro de la
familia de "almidón sintasas solubles" que está asociada al
gránulo de almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando la cepa de Agrobacterium
tumefaciens DSM 19675 (que alberga al plásmido
pK2GW7,0-AtSSIV, alternativamente designado como
pKan-35S-AtSSIV) se obtuvieron
plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana y patata
(Solanum tuberosum) que sobre-expresan AtSSIV
de manera constitutiva. Cuando se compara con plantas no
transformadas, las plantas que sobre-expresan AtSSIV
acumulan niveles significativamente superiores de una proteína de
aproximadamente 112 kDa que es reconocida por el anticuerpo
policlonal específico de la AtSSIV (Figura 11). En el caso de la
patata, tal proteína sufre recortes internos que dan lugar a
fragmentos de aproximadamente 80 y 100 kDa. Las hojas de las plantas
de Arabidopsis que sobre-expresan AtSSIV, así como
los tubérculos de plantas de patata que
sobre-expresan AtSSIV, acumulan niveles
significativamente superiores de almidón que los correspondientes
órganos control (Figura 12 y Figura 13, respectivamente). Además,
las plantas de Arabidopsis mostraron un rendimiento en la producción
de biomasa y crecimiento superior al observado en las plantas
control no transformadas (Figura 14). Finalmente, las plantas que
sobre-expresan AtSSIV no presentan una morfología
externa aberrante, tras ser comparada con la de las plantas no
transformadas.
\vskip1.000000\baselineskip
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> IDEN BIOTECHNOLOGY
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE
PLANTAS TRANSGÉNICAS QUE PRESENTAN ALTO CONTENIDO Y RENDIMIENTO EN
ALMIDÓN Y BIOMASA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P-02874
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ATSSIV_Directo
5'-3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ATSSIV_Inverso
5'-3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AtASS4 5'-3'
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1040
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AtASS4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
5'-3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
5'-3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (19)
1. Procedimiento para la obtención de plantas
transgénicas con alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa,
caracterizado por la transformación de la planta silvestre
con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica
que codifica para una enzima con actividad SSIV y la expresión de
dicha secuencia nucleotídica en el interior de la planta
transformada.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado porque el nivel de expresión de SSIV en el
interior de la planta transformada es al menos 2 veces superior al
nivel de expresión de SSIV de la planta silvestre.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la secuencia nucleotídica comprendida en
el vector de expresión utilizado para transformar la planta
silvestre es la SEQ ID NO: 3 que codifica para la SEQ ID NO: 4.
4. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado porque el vector de expresión utilizado para
transformar la planta es Agrobacterium tumefaciens DSM 19675
que comprende el plásmido pK2GW7,0.AtSSIV.
5. Célula transformada con un vector de
expresión, preferentemente un plásmido, que comprende una secuencia
nucleotídica que codifica para una proteína o un fragmento proteico
con actividad SSIV.
6. Célula, según la reivindicación 5,
transformada con un vector de expresión seleccionado entre:
Agrobacterium tumefaciens DSM 19675, plásmido
pET-AtSSIV o plásmido
pGEX-4T3_FragSSIV.
7. Célula vegetal, según la reivindicación 6,
caracterizada por haber sido transformada con
Agrobacterium tumefaciens DSM 19675 y pertenecer a cualquiera
de las siguientes especies de plantas: patata (Solanum
tuberosum), tabaco (Nicotiana tabacum), cebada
(Hordeum vulgare), arroz (Oryza sativa), maíz (Zea
mays) o arabidopsis (Arabidopsis thaliana).
8. Célula bacteriana, según la reivindicación 6,
caracterizada por haber sido transformada con un plásmido
bacteriano seleccionado entre: pET-AtSSIV o
pGEX-4T3_FragSSIV y pertenecer a una cepa de E.
coli seleccionada entre: BL21(DE3),
BL21(DE3)AglgAP o BL21(DE3)AglgCAP.
9. Vector de expresión Agrobacterium
tumefaciens DSM 19675 caracterizado por comprender el
plásmido
pK2GW7,0-AtSSIV que codifica para una enzima con actividad SSIV.
pK2GW7,0-AtSSIV que codifica para una enzima con actividad SSIV.
10. Plásmido pET-AtSSIV
caracterizado por codificar para una enzima con actividad
SSIV.
11. Plásmido pGEX-4T3_FragSSIV
caracterizado por codificar para un fragmento antigénico de
una enzima con actividad SSIV.
12. Uso de las células bacterianas transformadas
con el plásmido pET-AtSSIV de la reivindicación 8,
para la producción de una enzima con actividad SSIV.
13. Uso de las células bacterianas transformadas
con el plásmido pGEX-4T3_FragSSIV de la
reivindicación 8, para la producción de anticuerpos frente a un
fragmento específico de una enzima con actividad SSIV.
14. Uso de la célula de la reivindicación 6 para
la producción de almidón y/o biomasa.
15. Planta transgénica vascular
caracterizada por estar transformada con el vector de la
reivindicación 9 y por poseer alto contenido y rendimiento en
almidón y biomasa, en comparación con la planta silvestre sin
transformar.
16. Planta transgénica, según la reivindicación
15, caracterizada por presentar un nivel de expresión de SSIV
al menos 2 veces superior al observado en la planta silvestre sin
transformar.
17. Planta transgénica, según la reivindicación
15, caracterizada porque su contenido en almidón y/o biomasa
es al menos un 10% superior al contenido en almidón y/o biomasa de
las plantas silvestres sin transformar.
18. Planta transgénica, según la reivindicación
15, seleccionada del grupo que comprende: patata (Solanum
tuberosum), tabaco (Nicotiana tabacum), cebada
(Hordeum vulgare), arroz (Oryza sativa), maíz (Zea
mays) o arabidopsis (Arabidopsis thaliana).
19. Uso de las plantas transgénicas de las
reivindicaciones 15 a 18, para la producción de almidón y
biomasa.
Priority Applications (6)
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ES200930009A ES2354897B1 (es) | 2009-03-24 | 2009-03-24 | Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa. |
PCT/ES2010/070158 WO2010109045A1 (es) | 2009-03-24 | 2010-03-17 | Procedimiento para la producción de plantas transgénicas que presentan alto contenido y rendimiento en almidón y biomasa |
EP10714044.4A EP2412814B1 (en) | 2009-03-24 | 2010-03-17 | Method for the production of transgenic plants having high starch and biomass content and yield |
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