KR20080028950A

KR20080028950A - 식물 중 전분 합성효소의 과발현

Info

Publication number: KR20080028950A
Application number: KR1020087001595A
Authority: KR
Inventors: 클라우스 프로베르크; 랄프 크리스티안 쉬미트
Original assignee: 바이엘 크롭사이언스 아게
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2006-07-24
Publication date: 2008-04-02
Also published as: CN101228280A; AR054174A1; AU2006271887B2; WO2007009823A1; BRPI0613674A2; KR101474025B1; JP5312937B2; AU2006271887A1; BRPI0613674B1; JP2009502127A; US20130117894A1; CN101228280B; US9428760B2; EP1910543A1; US20090106863A1

Abstract

본 발명은 가용성 전분 합성효소 II를 코딩하는 외래 핵산 분자의 도입에 의하여 상응하는 야생형 식물 세포로부터의 전분과 비교시 유전자 변형 식물 세포의 전분의 포스페이트 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전자 변형 식물 세포 중 상기 가용성 전분 합성효소 II의 과발현에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개선된 품질 특징을 갖는 쌀 전분 및 쌀가루, 상기 쌀 전분을 포함하는 쌀알, 및 상기 쌀알이 자라는 벼에 관한 것이다.

가용성 전분 합성효소 II, 유전자 변형, 쌀 전분, 쌀가루

Description

식물 중 전분 합성효소의 과발현{OVEREXPRESSION OF STARCH SYNTHASE IN PLANTS}

본 발명은 유전자 변형 식물 세포의 전분의 포스페이트 함량을 상응하는 유전자 비변형 야생형 식물 세포로부터의 전분과 비교시 증가시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 식물 세포는 가용성 전분 합성효소 II를 코딩하는 외래 핵산 분자의 도입에 의해 유전자 변형되고, 상기 전분 합성효소 II는 과발현된다.

또한, 본 발명은 개선된 품질 특성을 갖는 쌀 전분 및 쌀가루, 상기 쌀 전분을 포함하는 쌀알, 및 상기 쌀알이 자란 벼에 관한 것이다.

쌀은 전세계 인구의 절반 이상에 대한 가장 중요한 식품이다. 일부 국가에서, 쌀은 전체 식품 섭취량의 대략 80%에 이른다. 연간 전세계적 쌀 생산량은 550 백만 톤이다.

쌀알은 대략 76%의 전분 및 대략 7 ∼ 8%의 단백질로 구성된다. 이는 오로지 1.3%의 지방 및 다수의 미량 원소 (0.6%), 예컨대 인, 철 및 마그네슘을 함유한다.

경제적으로 가장 중요한 쌀 종류는 오리자 사티바 (Oryza sativa)이며, 이의 기본 종류는 2 가지 군으로 분류될 수 있다:

오로지 장립종 쌀을 포함하는 "인디카 (indica)" 군, 및

중립종 및 단립종 쌀을 함유하는 "자포니카 (japonica)" 군.

장립종 쌀 (그 낟알이 조리시 분리되는 쌀 종류)은 주로 인도 또는 자바 유래이고; 단립종 쌀 (예컨대, "푸딩쌀 (pudding rice)", 즉 그 낟알이 조리시 점착성인 쌀 종류)은 주로 일본 유래이다. 중국 및 동남아 유래의 종류는 이의 중간이다.

모든 종류에 있어서, 이어서, 2 가지 주요 유형이 존재한다: 반투명한 낟알 또는 불투명한 낟알. 이들은 이의 전분 조성에 있어서 상이하다: 반투명한 쌀의 전분은 대략 20%의 아밀로오스 및 80%의 아밀로펙틴으로 이루어지는 한편, 불투명한 쌀의 전분은, 이에 반해, 실질적으로 오로지 아밀로펙틴으로 이루어진다.

아밀로펙틴은 특이적 집단 (cluster) 구조를 갖고, 하기 4 가지 효소 종류의 다양한 소단위 또는 아이소형에 의해 합성된다: 가용성 전분 합성효소 (SS), 전분-분지 효소 (SBE), 전분-탈분지 효소 (SDE) 및 ADP 글루코스 파이로포스포릴라제 [Nakamura 2002, Plant Cell Physiol. 43(7): 718-725].

조리 및 맛 특성은 대부분 쌀 배유의 아밀로오스 함량에 의해 결정된다. 저 아밀로오스 함량을 갖는 종류는 조리 후 축축하고 점착성이 있는 한편, 고 아밀로오스 함량을 갖는 낟알은 조리시 건조하고 복슬복슬해진다 [H. ten Have in Hoffmann Mudra Plarre (HMP) 1985: Lehrbuch der Zuchtung landw. Kulturpflanzen, Volume 2, pp. 110-123].

낟알 품질은 소비자 뿐만 아니라, 제분 산업에도 매우 중요하며; 낟알 특성, 예컨대 낟알 크기, 낟알 형태 및 낟알 품질은 분쇄된 쌀의 수율 및 파쇄립의 백분율에 영향을 미치므로 이는 중요한 특성이다 [ten Have 1985, 상동].

쌀가루는 상대적으로 맛이 중성이며, 따라서 부드러운 맛의 제품의 주성분으로서 또는 혼합물로서 매우 적절하다. 이의 저알레르기유발성으로 인하여, 이는 또한 유아식 또는 알레르기 환자에 대한 식이로서도 매우 적절하다.

오일, 지방 및 단백질 이외에, 다당류도 식물로부터의 가장 중요한 재생가능한 원료이다. 셀룰로오스 이외에, 고등 식물 중 가장 중요한 저장 물질 중 하나인 전분은 다당류 중 가장 중요한 것이다.

다당류 전분은 화학적으로 균일한 단위인, 글루코스 분자의 중합체이다. 그러나, 이는 그 중합도 및 글루코스 사슬의 분지의 발생 및 그 사슬 길이에 있어서 상이하며, 추가로 유도체화, 예를 들어 인산화될 수 있는 상이한 분자 형태의 매우 복잡한 혼합물을 구성한다. 따라서, 전분은 균일한 원료를 구성하지 않는다. 특히, α-1,4-글리코시드 결합된 글루코스 분자의 본질적으로 비분지된 중합체인 아밀로오스 전분은, 상이하게 분지된 글루코스 사슬의 복잡한 혼합물인 아밀로펙틴 전분과 상이하다. 분지는 추가의 α-1,6-글리코시드 결합의 발생에 의해 형성된다. 산업적 전분 제조에 사용되는 전형적인 식물, 예를 들어, 옥수수, 밀 또는 감자에 있어서, 합성된 전분은 대략 20% ∼ 25%가 아밀로오스 전분이고 대략 70% ∼ 75%가 아밀로펙틴 전분이다.

전분의 기능적 특성은 아밀로오스/아밀로펙틴의 비율 및 포스페이트 함량 뿐만 아니라, 분자량, 측쇄 분포의 패턴, 이온 함량, 지질 및 단백질 함량, 전분 낟 알의 평균 크기, 전분 낟알의 형태 등에 크게 영향을 받는다. 이러한 문맥에서 언급될 수 있는 중요한 기능적 특성은, 예를 들어, 용해도, 노화 거동, 물 결합 능력, 필름 형성 특성, 점도, 호화 특성, 냉동-해동 안정성, 산에 대한 안정성, 겔 강도 등이다.

전분의 합성을 야기하는 기본 생화학 합성 경로는 오로지 대략적으로 공지되어 있다. 그러나, 전분 과립 및 전분의 합성을 야기하는 자세한 메커니즘이 이제까지 해명되지 않아서 이에 따라 여전히 연구의 주제인, 일련의 단계가 존재한다.

식물 육종만으로 식물 중 공유 결합된 전분 포스페이트의 함량에 영향을 미치는 것은 현재 가능하지 않다.

식물 육종법에 대한 대안은 재조합법에 의한 전분 생성 식물의 표적화된 변형이다. 이에 대한 필요 조건은, 그러나, 전분 합성 및/또는 전분 변형에 참여하는 효소의 식별 및 특성화, 및 상기 효소를 코딩하는 핵산 분자의 단리 및 이어서 트랜스제닉 식물의 기능 분석이다.

식물 세포에 있어서, 전분 합성은, 광합성 활성 조직에서는 엽록체이고, 광합성 불활성의, 전분 저장 조직에서는 녹말체인 색소체 내에서 일어난다. 전분 합성의 역할을 하는 중요한 효소는 R1 단백질 (= 알파-글루칸 물 디키나아제, E.C. 2.7.9.4; 문헌 [Lorberth 등 (1998) Nature Biotechnology 16: 473-477]), 전분 합성효소 및 분지 효소 (= BE, 예를 들어, 문헌 [Ponstein 등, Plant Physiol. 29 (1990), 234-241]; [Kossmann 등, 1991, Mol. Gen. Genet. 230, 39-44]; [Safford 등, 1998, Carbohydrate Polymers 35, 155-168]; [Jobling 등 1999, The Plant Journal 18(2): 163-171] 참고)이다. 분지 효소는 선형 α-1,4-글루칸으로의 α-1,6-분지의 도입에 촉매 작용을 한다. 전분 합성효소에 있어서, 각종 아이소형이 기재되어 왔고, 이들 모두는 ADP-글루코스로부터 α-1,4-글루칸으로의 글루코실 잔기의 이동에 의한 중합 반응에 촉매 작용을 한다.

전분 생합성의 역할을 하는 효소의 변종이 관측된, 각종 식물 종류로부터 단리된 천연 전분에 대한 개관은 문헌 [Kossmann 및 Lloyd (2000, Critical Reviews in Plant Sciences 19(3): 171-226]에서 찾을 수 있다.

전분 합성효소 (EC 2.4.1.21)는 하기 2 가지 종류로 분류될 수 있다: 전분 과립 결합 전분 합성효소 ("과립 결합 전분 합성효소 I"; GBBS I) 및 가용성 전분 합성효소 ("가용성 전분 합성효소"; SSS, "SS"로도 일컬어짐). 이들의 구별은 각 경우에 명백하지 않은데, 왜냐하면 일부 전분 합성효소는 전분 과립 결합 형태 및 가용성 형태 모두에 존재하기 때문이다 ([Denyer 등, Plant J. 4 (1993), 191-198]; [Mu 등, Plant J. 6 (1994), 151-159]).

아밀로오스의 합성을 야기하는 GBSS I에 반해, 각종 종류의 가용성 전분 합성효소의 전분 생합성에서의 정확한 효소 기능에 대해서는 아직까지 거의 알려지지 않았다.

생화학적 특성화의 결과, 대략 60 내지 대략 180 kDa의 분자량을 갖는 가용성 전분 합성효소가 식별되었다. 전분 합성효소를 코딩하는 cDNA의 클로닝은 서열 상동성의 결과로서 및 (가용성) 전분 합성효소의 기능적 특징의 결과로서 정의된 상이한 종류를 구별하는 것을 가능하게 하였다.

현재까지, 하기 8 가지 종류의 전분 합성효소가 고등 식물에서 식별되어 왔다 (특히, 문헌 [Li 등 (2003) Funct. Intergr. Genomics 3:76-85]에 의함):

- 전분 과립 결합 전분 합성효소 I (Granule-Bound Starch Synthase I = GBBS I) (쌀: 예를 들어, 문헌 [Okagaki (1992) Plant Mol Biol. 19:513-516]; 감자: 문헌 [van der Leij 등 (1991) Mol. Gen Genet. 228:240-248]; 옥수수: 예를 들어, 문헌 [Kloesgen 등 (1986) Mol. Gen Genet. 203:237-244]);

- 가용성 전분 합성효소 I (= SSI; 쌀: 문헌 [Baba 등 (1993) Plant Physiol. 103:565-573]; 감자: 문헌 [Kossmann 등 (1999) Planta 208: 503-511]; 옥수수: 문헌 [Knight 등 (1998) Plant J. 14:613-622]);

- 가용성 전분 합성효소 II (= SSII; 완두콩: 문헌 [Dry 등 (1992) Plant J. 2:193-202], 감자: 문헌 [Edwards 등 (1995) Plant J 8: 283-294], 옥수수: 문헌 [Harn 등, (1998) Plant Mol. Biol. 37(4): 639-649]; 밀: 문헌 [Walter 등 (1996) Genbank Acc. U66377]; 쌀: 문헌 [Yamamoto 및 Sasaki (1997) Plant Mol. Biol. 35:135-144] 및 보리: 문헌 [Li 등 (2003), Funct. Integr. Genomics 3: 76-85]);

- 가용성 전분 합성효소 III (= SSIII; 감자: 문헌 [Abel 등 (1996) Plant J 10:981-991]; 사료 완두콩: GenBank Acc.No AJ225088);

- 가용성 전분 합성효소 IV (= SSIV; 밀: GenBank Acc.No AY044844);

- 가용성 전분 합성효소 V (= SSV; 사료 완두콩: GenBank Acc.No VUN006752; 아라비돕시스 (Arabidopsis): GenBank Acc.No AL021713; 옥수수: WO 97/26362) 및

- 분명하지 않음 (dull) [Gao 등 (1998) Plant Cell 10:399-412];

- 가용성 전분 합성효소 VI (= SSVI; 옥수수: WO 01/12826).

공유 결합된 전분 포스페이트의 함량은 식물 종에 따라 다르다. 따라서, 예를 들어, 특정 옥수수 돌연변이체는 증가된 전분 포스페이트 함량 (찰옥수수 0.002% 및 고 아밀로오스 옥수수 0.013%)을 갖는 전분을 합성하는 한편, 통상의 옥수수 종류는 오로지 미량의 전분 포스페이트를 함유한다. 소량의 전분 포스페이트는 또한 밀 (0.001%)에서도 발견되는 한편, 전분 포스페이트는 귀리 및 기장에서는 검출되지 않았다. 마찬가지로, 통상의 쌀 종류 (0.013%)에서보다 더 적은 전분 포스페이트가 쌀 돌연변이체 (찹쌀 0.003%)에서 발견되었다. 유의한 양의 전분 포스페이트가 덩이줄기 또는 뿌리 저장 전분을 합성하는 식물, 예를 들어, 타피오카 (0.008%), 고구마 (0.011%), 갈분 (0.021%) 또는 감자 (0.089%)에서 검출되었다. 전분 포스페이트 함량에 대한 상기 백분율은 각 경우 전분의 건조 중량을 기준으로 한 것이고 문헌 [Jane 등, 1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832]에 의해 측정되었다. SSI-안티센스 감자에 대한 연구는 이의 포스페이트 함량이 야생형에 비하여 30 ∼ 70% 만큼 증가하였다는 점을 밝혔다 (WO 96/15248).

WO 00/08184는 전분 합성효소 III (= SSIII) 및 분지 효소 I (= BEI) 모두의 활성이 감소된 식물을 기재한다. 야생형 식물로부터의 전분과 비교시, 상기 식물로부터의 전분은 상승된 포스페이트 함량을 갖는다. 감자로부터의 R1 유전자의 과발현의 결과로서, R1 단백질의 증가된 활성 및 증가된 전분 포스페이트 함량을 갖는 밀 식물이 국제 특허 출원 WO 02/34923에 기재되어 있다.

식물에 의해 합성된 전분 (천연 전분) 중 포스페이트의 분포는, 대략 30% 내 지 40%의 포스페이트 잔기가 글루코스 분자의 C3 위치에, 대략 60% 내지 70%의 포스페이트 잔기가 C6 위치에 공유 결합된다는 사실에 의해 일반적으로 구별된다 [Blennow 등, 2000, Int. J. of Biological Macromolecules 27: 211-218]. 이에 반해, 화학적으로 인산화된 전분은, 화학 반응이 불특정한 양식으로 진행되므로, 글루코스 분자의 C2 위치에 결합된 포스페이트 잔기를 추가로 갖는다.

WO 03/023024는 DSC T-개시 온도가 69.5℃ 이하이고/이거나 DSC T-피크 온도가 73.6℃ 이하인 쌀 전분을 개시하며; 자포니카 및 인디카 군의 대략 총 400 가지 의 쌀 종류가 상기 특성에 대하여 분석되어 왔다.

문헌 [Umemoto 등, 2002, Theor. Appl. Genet. 104:1-8]은 자포니카 종류 (니폰베어, Nipponbare) 및 인디카 종류 (카살라스, Kasalath) 간의 역교배 순계주의 분석을 기재한다. 이들은 그 결과로부터 자포니카 및 인디카 종류 간의 상이한 젤라틴화 개시 온도 (DSC T-개시)의 원인이 되는 alk(t), gel(t) 및 acl(t) 유전자좌는 전분 합성효소 아이소형 SSIIa일 수 있다고 결론지었다.

WO 03/023024는 인디카 형태 IR36으로부터의 전분 합성효소 IIa (SSIIa)의 유전자가 형질전환된 자포니카 종류 (킨메이즈, Kinmaze)의 쌀 형질전환체 (#78-1)를 기재한다. 아밀로펙틴 측쇄 프로파일에서 생성되는 변화가 밝혀져 있고, 그 결과, 자포니카 프로파일로부터 인디카 종류의 프로파일로의 전환을 나타낸다 (WO 03/023024에서 도 22).

WO 03/023024는 쌀 전분 또는 가루 중 포스페이트 함량, 아밀로오스 함량이나 리올로지 특성을 기재하지 않는다.

SSIIa에 의해 유발된 아밀로펙틴 측쇄 프로파일의 변화 및 전분의 DSC T-개시 온도 간의 관계는, 형질전환체 및 상응하는 "수여" 및 "기증" 주에 대한 값에 관하여 최근 발행된 논문 [Nakamura 등, (2005) PMB; 58(2): 213-27]에 다시 밝혀져 있다 (도 6B). 도 6B는 생성된 SSIIa-형질전환체의 전분의 DSC T-개시 온도를 보여준다. 어떠한 경우에도, DSC T-개시는 70℃보다 높지 않다. 그에 설명되어 있는 최고 T-개시 값은 69.5℃이며, 이는 또한 WO 03/023024 (pp. 21-24)에 기재된 바와 같다.

따라서, WO 03/023024 및 Nakamura 등 (2005) 모두는 DSC T-개시 온도가 70℃를 초과하는 쌀 전분이 생성될 수 있는 방법을 교시하지 않는다.

그러나, 더 높은 DSC T-개시 온도는 이것이 전분의 개선된 열적 안정성 및 이에 따라 열 효과의 결과로서 결정질 구조의 변화에 대한 중요한 특성인 한 바람직하다.

따라서, 본 발명의 목적은 새로운 특성, 특히 개선된 열적 안정성을 갖는 쌀 전분 및 쌀가루, 및 이의 제조 수단 및 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 가용성 전분 합성효소 II의 유전자 발현을 증가시키는 것이 식물의 전분 특성에 어떻게 영향을 미치는지는 이제까지 알려져 있지 않다. 고 포스페이트 함량은, 이것이 전분의 변형된 생리화학적 특징 및 이에 따라 전분의 신규한 용도를 야기하므로 바람직하다.

따라서, 본 발명의 추가의 목적은 식물의 전분의 포스페이트 함량이 생체내에서 증가될 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적은 특허청구범위에 명시된 사용 형태를 제공함에 의해 달성될 수 있다.

본 발명은 유전자 변형 식물 세포의 전분의 포스페이트 함량을 상응하는 유전자 비변형 야생형 식물 세포로부터의 전분 (100%)과 비교시 150 내지 500%까지 증가시키는 방법에 관한 것이고, 여기서

a) 가용성 전분 합성효소 II를 코딩하는 외래 핵산 분자의 도입에 의해 식물 세포를 유전자 변형하며,

b) 상기 가용성 전분 합성효소 II는 과발현된다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "전분의 포스페이트 함량"은 전분의 글루코스 단량체에 공유 결합된 포스페이트기를 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "전분의 포스페이트 함량의 증가"는 상응하는 야생형 식물 세포로부터의 전분 (100%)과 비교시 C6 위치의 포스페이트 함량이 150 ∼ 500%, 바람직하게는 160 ∼ 400% 및 특히 바람직하게는 170 ∼ 380%까지 증가함을 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "C6 위치의 포스페이트 함량"은 전분의 글루코스 단량체의 탄소 원자의 위치 "6"에 결합된 포스페이트기의 함량을 의미하는 것으로 이해된다. 대체로, 글루코스 단위의 C3 및 C6 위치는 생체내 전분 중 인산화될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, C6 위치의 포스페이트 함량 (= C-6-P 함량)은 하기 기재된 시각적 효소 어세이에 의한 글루코스-6-포스페이트 측정을 통해 측정된다 [Nielsen 등, 1994, Plant Physiol. 105, 111-117]; (C6 위치의 포스페이트 함량 (C6-P 함량)의 측정).

본 발명에서 매우 놀라웠던 점은, 포스페이트 함량을 야생형 (100%)과 비교시 150% 초과까지 현저하게 증가시키는 것이 가능했다는 점이다.

본 발명의 문맥에서, 전분의 포스페이트 함량의 상승은, 예를 들어, 추출전 전분의 화학적 인산화에 의해, 시험관내가 아닌 생체내에서 달성된다. 따라서, 본 발명의 이점은 화학적 인산화에 사용되는 화학 작용제가 불필요하다는 점이다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "유전자 변형 식물 세포"는 식물 세포가 유전자 변형되었음을 의미하며, 상기 유전자 변형은 상응하는 유전자 비변형 야생형 식물 세포의 SSII 활성과 비교시 가용성 전분 합성효소 II (= SSII)의 증가된 활성을 야기한다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "야생형 식물 세포"는, 본 발명에 따른 방법에 대한 출발 물질로서 작용하는, 즉, 도입되어 가용성 전분 합성효소 II (= SSII)의 증가된 활성을 야기하는 유전자 변형을 제외한 그 유전자 정보가 유전자 변형 식물 세포의 것에 상응하는 식물 세포를 의미한다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "상응하는"은, 복수 개의 대상체를 비교시, 서로 비교되는 해당 대상체가 동일한 조건 하에 유지됨을 의미한다. 본 발명의 문맥에서, 야생형 식물 세포의 문맥에서의 용어 "상응하는"은 서로 비교되는 식물 세포가 동일한 배양 조건 하에서 성장되고 이들이 바람직하게는 동일한 (배양) 연령임을 의미한다.

용어 "배양 연령"은 (식물) 유기체가 영양 배지 중 보낸/성장한 기간을 의미하는 것으로 이해된다. 이는, 예를 들어, 파종으로부터 수확까지의 기간, 또는 식물 세포가 조직 배양 배지 중 특정 발달 단계까지 배양되는 기간일 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 이는 서로 비교되는 식물 세포가 동일 배양 조건 하에 동일한 발달 기간을 보낸다는 점을 의미한다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "외래 핵산 분자"는 상응하는 야생형 식물 세포 중 자연적으로 발생하지 않거나 상응하는 야생형 식물 세포 중 특정 공간 배열로 자연적으로 발생하지 않는 분자 또는 식물 세포의 게놈 중 자연적으로 발생하지 않는 위치에 국소화된 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 외래 핵산 분자/폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 그 조합 또는 특정 공간 배열이 식물 세포 중 자연적으로 발생하지 않는 각종 원소로 이루어진 재조합 분자이다. 이는, 예를 들어, 서던 블롯 (Southern blot) 분석의 도움으로 증명될 수 있다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "과발현됨"은 유전자 변형 식물 세포 중 SSII 단백질의 효소 활성이 상응하는 유전자 비변형 야생형 식물 세포와 비교시 증가함을 의미한다. 본 발명의 목적상, 용어 "과발현됨"은 또한 자연적으로는 어떠한 검출가능한 SSII 활성을 갖지 않는 식물 또는 식물 세포가, 가용성 전분 합성효소 II를 코딩하는 외래 핵산 분자가 식물 세포의 게놈에 도입되는 본 발명에 따른 유전자 변형 이후, 효소도(zymogram)에 의해 검출될 수 있는 SSII 활성을 가짐을 의미한다. 세포 중 SSII 단백질의 효소 활성의 증가는 바람직하게는 하기 기재되는 바와 같이 효소도의 도움으로 측정된다 ("활성 겔에 의한 SSII 활성의 측정").

상기 문맥에서, SSII 활성의 증가는 상응하는 비 유전자 변형 세포와 비교시 SSII 활성이 200% 이상, 특히 350 ∼ 2000%, 바람직하게는 600 ∼ 1500% 및 특히 바람직하게는 700 ∼ 1200%까지 증가함을 의미한다. 본 발명의 문맥에서, "SSII 활성의 증가"는 또한 어떠한 검출가능한 SSII 활성을 갖지 않는 식물 또는 식물 세포가, 가용성 전분 합성효소를 코딩하는 외래 핵산 분자가 식물 세포의 게놈에 도입되는 본 발명에 따른 유전자 변형 이후, 검출가능한 SSII 활성을 가짐을 의미한다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "가용성 전분 합성효소 II"는 가용성 전분 합성효소 단백질 (ADP-글루코스-1,4-α-D-글루칸 4-α-D-글루코실트랜스퍼라제; EC 2.4.1.21)의 클래스 II를 의미하는 것으로 이해된다. 가용성 전분 합성효소는 글리코실화 반응에 촉매 작용을 하고, 여기서 ADP-글루코스 기질의 글루코스 잔기가 α-1,4-결합된 글루칸 사슬로 전달되어, α-1,4-결합 (ADP-글루코스 + {(1,4)-α-D-글루코실}(N) <=> ADP + {(1,4)-α-D-글루코실}(N+1))을 형성한다.

SSII 단백질의 구조는 특정 도메인의 서열을 나타낸다. "N" 말단에서, SSII 단백질은 색소체로의 운반을 위한 신호 펩티드를 갖는다. N-말단 부위 및 촉매 도메인은 C 말단의 방향으로 뒤따른다 [Li 등, 2000, Plant Physiology 123, 613-624]. 각종 SSII 단백질의 주요 서열 비교에 기초한 추가의 분석 (http://hits.isb-sib.ch/cqi-bin/PFSCAN)은 SSII 단백질이 3 개의 특정 도메인을 갖는다는 점을 밝혔다. 상기 도메인은 하기 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산을 포함한다: 서열 1에서 보여지는 밀 SSII 유전자 서열의 bp 1190 내지 1279 (= 부위 1), bp 1493 내지 1612 (부위 2) 및 bp 2147 내지 2350 (부위 3).

본 발명의 문맥에서, SSII 단백질은 따라서 그 아미노산 서열이 서열 3에서 보여지는 부위 1과 86% 이상, 바람직하게는 93% 이상 및 특히 바람직하게는 100% 의 동일성을 갖고, 서열 4에서 보여지는 부위 2와 83% 이상, 바람직하게는 86% 이상 및 특히 바람직하게는 100%의 동일성을 가지며, 서열 5에서 보여지는 부위 3과 70% 이상, 바람직하게는 82% 이상, 바람직하게는 86% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상 및 특히 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는 가용성 전분 합성효소를 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "동일성"은 다른 단백질의 아미노산과 일치하는 아미노산의 백분율 (동일성)을 의미하는 것으로 이해된다. 동일성은 바람직하게는 컴퓨터 프로그램의 도움으로 측정된다. 서로 비교되는 서열의 길이가 상이한 경우, 동일성은, 더 짧은 서열이 더 긴 서열과 공유하는 아미노산의 수가 백분율 동일성을 결정하는 방식으로 측정될 것이다. 동일성은 공개적으로 이용가능한 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, ClustalW [Thompson 등, (1994) Nucleic Acids Research 22: 4673-4680]에 의해 일상적으로 측정될 수 있다.

ClustalW는 D - 69117 하이델베르크, 마이어호프슈트라쎄 소재의 유럽 분자생물학 실험실의 Julie Thompson (Thompson＠EMBL-Heidelberg.DE) 및 Toby Gibson (Gibson＠ EMBL - Heidelberg . DE)에 의해 공개적으로 이용가능하다. ClustalW는 마찬가지로 각종 인터넷 페이지, 특히 IGBMC (프랑스, 67404 일키르크 세덱스, 비.피.163 소재의 Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) 및 EBI (ftp :// ftp . ebi . ac . uk / pub / software /), 및 모든 반영된 EBI 인터넷 페이지 (영국, 캠브리지 CB10 1SD, 힝스톤, 웰컴 트러스트 게놈 캠퍼스 소재의 유럽 생물정보학 기관)로부터 다운로드될 수 있다.

ClustallW 컴퓨터 프로그램 버젼 1.8을 사용하여 본원에 기재된 단백질 및 기타 단백질 간의 동일성을 측정하는 것이 바람직하다. 하기 파라미터가 설정될 것이다: KTUPLE=1, TOPDIAG=5, WIND0W=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=1O, GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP.

ClustalW 컴퓨터 프로그램 버젼 1.8을 사용하여 본원에 기재된 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 및 기타 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 간의 동일성을 측정하는 것이 바람직하다. 하기 파라미터가 설정될 것이다: KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB, GAPOPEN=IO, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: 측량되지 않음.

본 발명의 문맥에서, 용어 "SSII 활성 증가"는 상응하는 비 유전자 변형 야생형 벼 또는 야생형 벼 세포와 비교시 SSII 활성이 100% 이상, 특히 200% ∼ 2000%, 바람직하게는 400% ∼ 1400% 및 특히 바람직하게는 500% ∼ 900% 만큼 증가함을 의미한다. 본 발명의 문맥에서, SSII 활성은 하기 기재된 방법 ("활성 겔에 의한 SSII 활성의 측정")을 이용하여 검출된다. 본 발명의 문맥에서, "SSII 활성 증가"는 또한 어떠한 검출가능한 SSII 활성도 갖지 않는 식물 또는 식물 세포가, 가용성 전분 합성효소를 코딩하는 외래 핵산 분자가 식물 세포의 게놈으로 도입되는 본 발명에 따른 유전자 변형 이후, 검출가능한 SSII 활성을 나타내는 것을 의미한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 또한 외래 핵산 분자가 이종 가용성 전분 합성효소 II의 코딩 부위의 형태를 취하는 것이다.

본 발명의 문맥에서, "이종 가용성 전분 합성효소 II"는 식물 세포 중 자연적으로 발생하지 않으나, 그 코딩 DNA 서열이 재조합법, 예를 들어, 세포의 형질전환에 의해 세포로 도입되는 가용성 전분 합성효소 II를 의미하는 것으로 이해된다. 상기 문맥에서, 코딩 DNA 서열은 형질전환된 식물 세포 또는 식물 이외의 식물 종으로부터 유래하거나, 그 자체의 프로모터의 제어 하에 있지 않다. 코딩 DNA 서열은 바람직하게는 형질전환된 식물 세포 또는 식물 이외의 식물 속으로부터 유래한다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "식물 속"은 생물 분류학의 계층 수준을 의미하는 것으로 이해된다. 속은 하나 또는 하나 초과의 종을 포함한다. 속의 예는 트리티쿰 엘. (Triticum L.) (밀)이다. 속 내의 모든 종은 항상, 속명에 이외에 추가로 종 칭호를 포함하는 이항 명을 갖는다. 트리티쿰 애스티붐 엘. (Triticum aestivum L., 통칭 빵밀)은 따라서, 트리티쿰 속의 종이다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "SSII 유전자"는 "가용성 전분 합성효소 II"를 코딩하는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드 (DNA, cDNA)를 의미하는 것으로 이해된다. 추가의 실시양태에서, SSII 유전자는 단자엽 식물 유래이다. 바람직한 실시양태에서, SSII 유전자는 밀 유래이다.

추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 단자엽 식물로부터의 가용성 전분 합성효소 II가 사용되는 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, SSII는 서열 1에서 보여지는 뉴클레오티드 서열의 코딩 부위에 의해 코딩되고, 서열 2에서 보여지는 아미노산 서열을 갖는다.

그 전분이 본 발명에 따는 방법에 의해 변형된 유전자 변형 식물은 임의의 식물 종, 즉 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물 모두에 속할 수 있다. 상기 식물은 바람직하게는 농사 농작물의 식물, 즉 영양 목적 또는 기술적 목적, 특히 산업적 목적을 위하여 인간에 의해 재배되는 식물, 및 이의 세포의 형태를 취한다. 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 전분 저장 식물, 예를 들어, 완두콩, 감자, 고구마, 카사바, 옥수수 및 쌀에 적용된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 벼에 대해 수행된다.

본 발명은 또한 70℃ 내지 80℃의 DSC T-개시 온도를 갖는 쌀 전분에 관한 것이다.

쌀 배유 및 쌀가루의 전분의 열적 특징은 시차 주사 열량측정 = DSC에 의해 분석될 수 있다. 이는 DSC T-개시 (= 최저 젤라틴화 온도) 및 DSC T-피크 (= 최고 젤라틴화 온도) 값과 함께 젤라틴화 온도로서 보여진다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "DSC T-개시 온도"는 따라서 전분 또는 가루 샘플의 상 전이의 시작을 나타내는 온도를 의미하는 것으로 이해된다. 이는 기준선 및 탄성점을 가로질러 피크의 상승 측면에 그려진 접선의 투사로서 특징지어진다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 벼는 70℃ 내지 80℃, 특히 77℃ 내지 80℃의 DSC T-개시 온도를 갖는 전분을 합성한다. 본 발명에 따른 쌀 전분은 특히 72 내지 79℃, 바람직하게는 74℃ 내지 79℃, 매우 특히 바람직하게는 76℃ 내지 78℃의 DSC T-개시를 갖는다.

추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀 전분은 상승된 DSC T-피크 온도 (DSC T-피크)를 갖는다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 벼는 80 내지 87℃, 바람직하게는 81 내지 86℃의 DSC T-피크 온도를 갖는 전분을 합성한다. 82℃ 내지 83℃의 DSC T-피크 온도를 갖는 본 발명에 따른 쌀 전분이 특히 바람직하다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "DSC T-피크 온도"는 DSC 곡선이 최대값에 도달하고 곡선의 1차 미분값이 0인 온도를 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명의 문맥에서, "DSC T-개시" 및 "DSC T-피크" 온도는 하기 기재된 방법 ("시차 주사 열량측정에 의한 쌀가루/전분의 열적 분석")에 의해 측정된다.

본 발명에 따른 쌀 전분의 DSC T-개시 온도가 상기 정도까지 상승한다는 사실은, 특히 본 발명에 따른 쌀 전분의 전분 포스페이트 함량이 동시에 증가하기 때문에, 당업자에게 매우 놀라운 것이었다. 왜냐하면 현재까지 상승된 인산화도는 이중 나선 및 전분 과립의 결정 질서의 불안정화를 초래하여, 감소된 DSC T-개시 온도를 야기하는 것으로 가정되어 왔기 때문이다 [Safford 등, (1998) Carbohydrate Polymers 35: 155-168]. 고도의 인산화를 갖는 천연 전분은 보통 저 포스페이트 함량을 갖는 비슷한 전분보다 현저하게 낮은 온도에서 결정성이 손실된다.

그러나, 과립성 쌀 전분의 사용은 다수의 열 처리 단계 및 용도에 바람직하다. 이에 따라 특히 유리한 것은 본 발명에 따른 쌀 전분의 놀랍게 높은 DSC T-개시 또는 T-피크 온도, 즉 본 발명에 따른 쌀가루의 RV 분석 동안의 놀랍게 높은 호화 온도인데, 왜냐하면 상기 특성은 상승된 공정 온도에서 전분 과립의 구조를 보유하는 것을 가능하게 하기 때문이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀 전분은 가수분해된 전분 밀리그램당 0.70 내지 2.5 nmol 포스페이트의 C6 위치의 포스페이트 함량 (C-6-P)을 갖는다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀 전분은 전분 밀리그램당 0.9 내지 2.3 nmol 포스페이트의 C6 위치의 포스페이트 함량을 갖는다. 특히 바람직한 실시양태에서, C6 위치의 포스페이트 함량은 전분 밀리그램당 1.5 내지 2.0 nmol 포스페이트이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 쌀 전분을 포함하는 유도체화 쌀 전분까지 확장된다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "유도체화 쌀 전분"은 식물 세포로부터의 이의 단리 이후, 그 특성이 예를 들어, 열적, 화학적, 효소적 또는 기계적 공정의 도움으로 변형된 본 발명에 따른 쌀 전분을 의미한다.

본 발명에 따른 쌀 전분은 통상의 전분보다 유도체화 쌀 전분의 제조를 위한 출발 물질로서 더 적절한데, 왜냐하면, 더 높은 전분 포스페이트 함량의 결과로서, 이는 높은 비율의 반응성 관능기를 함유하기 때문이며, 그리고 본 발명에 따른 쌀 전분은 비슷한 포스페이트 함량을 갖는 전분보다 더 높은 호화 온도, 또는 더 높은 열적 안정성을 갖기 때문이다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 유도체화 쌀 전분의 제조 방법에 관한 것이며, 여기서 본 발명에 따른 쌀 전분이 이어서 변형된다.

특히, 본 발명에 따른 유도체화 쌀 전분은 열 및/또는 산 처리된 전분의 형태를 취한다.

추가의 실시양태에서, 유도체화 쌀 전분은 전분 에테르, 특히 전분 알킬 에테르, O-알킬 에테르, 히드록시알킬 에테르, O-카르복시메틸 에테르, 질소 함유 전분 에테르, 포스페이트 함유 전분 에테르 또는 황 함유 전분 에테르의 형태를 취한다.

추가의 실시양태에서, 유도체화 쌀 전분은 가교 전분의 형태를 취한다.

추가의 실시양태에서, 유도체화 쌀 전분은 전분 그래프트 중합체의 형태를 취한다.

추가의 실시양태에서, 유도체화 쌀 전분은 산화 전분의 형태를 취한다.

추가의 실시양태에서, 유도체화 쌀 전분은 전분 에스테르, 특히 유기산의 사용으로 전분에 도입된 전분 에스테르의 형태를 취한다. 특히 바람직하게는, 이들은 포스페이트, 니트레이트, 설페이트, 크산테이트, 아세테이트 또는 시트레이트 전분의 형태를 취한다.

본 발명에 따른 유도체화 쌀 전분은 약학 산업, 식품 분야 및/또는 비식품 분야에서의 다양한 용도에 적절하다. 본 발명에 따른 유도체화 전분의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있고 일반 문헌에 광범위하게 기재되어 있다. 유도체화 전분의 제조에 대한 개관은, 예를 들어, 문헌 [Orthoefer, in Corn, Chemistry and Technology, 1987, eds. Watson and Ramstad, Chapter 16, 479-499]에서 발견된다. 쌀 전분의 유도체화는 또한, 예를 들어, 문헌 [Shih 및 Daigle, 2003, Nahrung 47(1): 64-67]에도 기재되어 있다.

본 발명은 또한 유도체화 전분의 제조를 위한 본 발명에 따른 쌀 전분의 용도에 관한 것이다.

천연 또는 유도체화 형태의, 본 발명에 따른 쌀 전분은 식품 또는 비식품 분야의 다양한 용도에 적절하다. 추가의 실시양태는 본 발명에 따른 유도체화 쌀 전분의 산업 분야에서의 용도를 포함한다. 본 발명에 따른 쌀 전분의 작은 과립 크기의 결과로서, 이는 또한 사진 용지의 제조에 특히 적절하다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 쌀 전분을 포함하는 조성물까지 확장된다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 쌀 전분을 포함하는 쌀가루까지 확장된다.

추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀가루는 72℃ 내지 81℃, 바람직하게는 74℃ 내지 80℃, 특히 77℃ 내지 80℃의 DSC T-개시 온도를 갖는다. 76℃ 내지 79℃의 DSC T-개시 온도를 갖는 본 발명에 따른 쌀가루가 특히 바람직하다.

추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀가루는 81℃ 내지 90℃, 바람직하게는 82℃ 내지 86℃의 DSC T-피크 온도를 갖는다. 82℃ 내지 85℃의 DSC T-피크 온도를 갖는 쌀가루가 특히 바람직하다.

추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀가루는 RVA (신속 점도 분석기) 분석에서 75 내지 90℃, 바람직하게는 78℃ 내지 88℃, 특히 83℃ 내지 86℃ 및 특히 바람직하게는 80℃ 내지 85℃의 RVA PT 호화 온도를 갖는다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "호화 온도" (RVA PT)는, RVA 분석에 따라 점도 발생의 시작에서 측정된 값이, 가열 공정 동안 점도 곡선이 기준선을 떠나고 점도가 0.1 분의 기간 내에 36 cP 초과만큼 변화하는 온도인 것을 의미한다.

본 발명의 문맥에서, "RVA PT 호화 온도"는 하기 기재되는 "신속 점도 분석기 (RVA)에 의한 쌀가루의 분석" 방법의 도움으로 측정된다.

상응하는 야생형 벼로부터의 쌀가루와 비교시, 본 발명에 따른 쌀가루는 상승된 호화 온도 (RVA PT)를 갖는다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "상승된 호화 온도 (RVA PT)"는 상응하는 야생형 벼로부터의 쌀가루의 호화 온도 RVA PT와 비교시 호화 온도 (RVA PT)가 5℃ 내지 15℃, 특히 6℃ 내지 14℃, 바람직하게는 8℃ 내지 12℃ 더 높음을 의미한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀가루는 호화 온도에의 도달 및 피크 점도에의 도달 사이의 감소된 기간을 특징으로 한다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "호화 온도에의 도달 및 피크 점도에의 도달 사이의 감소된 기간" (피크 시간 - 호화 시간)은 하기 기재된 바와 같은 RVA 분석에 따른 시간에 있어서의 차이가 40 초 내지 130 초, 특히 바람직하게는 50 ∼ 100 초 및 특히 바람직하게는 60 ∼ 75 초에 이름을 의미한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 쌀가루의 제조 방법에 관한 것이고, 여기서, 본 발명에 따른 쌀알, 바람직하게는 본 발명에 따른 정미된 쌀알은 분쇄된다. 쌀알의 정미 및 분쇄 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Fitzgerald 등, 2003, J. of Agrocult. And Food Chemistry 51: 2295-2299] 또는 [Ramesh 등, 1999, Carbohydrate Polymers 38: 337-347]에 기재되어 있다.

"쌀알"은 당업자에게 벼의 성숙된, 수정된 꽃을 의미한다.

본 발명은 또한 식료품 및/또는 동물 사료의 제조를 위한 본 발명에 따른 쌀가루의 용도까지 확장된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 쌀가루를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 쌀 전분을 포함하는 쌀알까지 확장된다.

바람직한 실시양태에서, 이는 가공된 쌀알의 형태를 취한다.

가공은 당업자에게 생쌀 (벼)을 현미 또는 백미로 전환하는 것을 의미하는 것으로 이해되고; 가공 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 특히 문헌 [Fitzgerald 등, 2003, J. of Agrocult. and Food Chemistry 51: 2295-2299] 또는 [Ramesh 등, 1999, Carbohydrate Polymers 38: 337-347]에 기재되어 있다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀알은 조리에 사용될 수 있다.

추가의 실시양태에서, 쌀알은 조리 후 변화된 특징을 갖는다.

본 발명의 문맥에서, "조리 후 변화된 특징"은 조리 후, 특히 조리된 쌀의 냉각 또는 재가열 후 품질에 관련된 쌀알의 특징, 예를 들어, 질감 (texture) 또는 낟알 경도 및 낟알 점착성이 변화됨을 의미하는 것으로 이해된다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀알은 -10 내지 -200 g, 바람직하게는 -12 g 내지 -150 g, 특히 바람직하게는 -15 g 내지 -130 g (g 단위의 인장력으로 측정됨)의 점착성을 갖는다.

용어 "점착성"은 당업자에게 조리 동안 물 흡수 및 가열의 효과 및 조리 후 수반되는 쌀알의 경도 및 다른 쌀알 또는 다른 표면 (예를 들어, 포크, 젓가락 등)에 대한 쌀알의 접착성을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명의 문맥에서, 점착성은, "조리 특징 및 조리된 쌀알의 질감의 측정" 방법에 기재된 바와 같이, 최적으로 조리된 쌀알을 미리 압착한 후 질감 분석기에 의해 측정한 최대 음의 힘 (인장력)을 의미하는 것으로 이해된다. 상기 문맥에서 높은 음의 값은 낮은 음의 값보다 더 높은 점착성을 의미한다. 본 발명의 문맥에서 "최적으로 조리된 쌀알"은, 문헌 [Juliano 1984; J. of Tex. Studies 15: 357-376]에 의해 기재된 바와 같이, 최소 조리 시간에 도달한 후 (90%의 낟알이 유리 시트 시험에서 측정시 더이상 심백을 갖지 았을 때) 2 분 더 조리된 쌀알을 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명에서, 점착성은, 4℃에서 22 시간 동안 저장된 후 다시 실온으로 되돌려진 쌀알, 또는 4℃에서 (22 시간 동안) 저장된 후 오븐 내에서 80℃에서 5 분 동안 재가열되거나 4℃에서 (22 시간) 저장된 후 전자레인지 (600 W/3 분)의 도움으로 재가열된 쌀알인, 최적으로 조리된 쌀알에 대하여 측정된다.

재가열은 당업자에게 조리된 쌀을 전자레인지, 오븐, 수조 또는 고온 캐비닛의 사용으로 1 내지 4 회 재가열하고, 재가열 사이에, 예를 들어, 실온에서 정치시킴에 의해 냉각시키는 것을 의미하는 것으로 이해되며; 바람직하게는, 이는 단일 재가열 경로를 의미하는 것으로 이해된다.

"점착성"은 쌀에 대한 중요한 품질 파라미터이므로, 본 발명에 따른 쌀알은 이로운 용도를 제공한다. 이는, 무엇보다도, 제조시 오로지 잠깐 조리되고, 그 후 다시 건조되며, 이의 최종 소비 이전에 향미 및 경도에 임의의 악영향을 미치지 않고 오로지 잠깐 재가열되거나 비등되는 (예를 들어, 매점 내 가내 점포에서), 반가공 제품의 용도의 분야를 포함한다.

상기 문맥에서 추가의 품질 파라미터는 물 중 비등시 낟알 치수의 세로축 방향으로의 확대이다. 상기 형태 변화는, 특히 장립종 쌀의 경우에 중요한 시각적 품질 파라미터이다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀알은 이것이 1.50 내지 1.90, 특히 바람직하게는 1.55 내지 1.80 및 특히 바람직하게는 1.60 내지 1.70의 신장률 (ER)을 갖는다는 사실에 의해 구별된다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀알은 상응하는 야생형 벼의 쌀알과 비교시 증가된 신장률을 갖는다.

본 발명의 문맥에서, 증가된 신장률은 5% 내지 25%, 바람직하게는 10% 내지 20%, 특히 바람직하게는 14% 내지 18% 만큼 증가된 산장률을 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명의 문맥에서, "신장률"은 조리되지 않은 쌀알의 낟알 길이에 대한 조리된 쌀알의 낟알 길이의 비율을 의미하는 것으로 이해된다. 낟알 길이는, 예를 들어, "조리에 의한 낟알 치수 변화의 측정" 방법에서 기재된 바와 같이 mm 단위로 측정되며; 상기 측정은 바람직하게는 슬라이드 계량기를 이용하여 수행한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀알은 2.8 내지 6.2, 바람직하게는 3.5 내지 5.5 및 특히 바람직하게는 4.0 내지 5.0의 CDC 값을 갖는다.

"CDC 값" (CDC = 치수 변화의 계수)은 조리의 결과로서 너비를 따른 치수 변화에 대한 길이를 따른 치수 변화의 비율, 즉 조리되지 않은 상태의 낟알 너비 (Wu)에 대한 조리된 상태의 낟알 너비 (Wc)의 비율에 대한 조리되지 않은 상태의 낟알 길이 (Lu)에 대한 조리된 상태의 낟알 길이 (Lc)의 비율 = (Lc/Lu)/(Wc/Wu)을 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명의 추가의 주제는 본 발명에 따른 하나 이상의 쌀알을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 하나 이상의 쌀알이 성장하고/거나 본 발명에 따른 쌀 전분을 포함하는 벼를 포함한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 유전자 변형 벼 세포 및 벼를 포함하며, 여기서 유전자 변형은 상응하는 유전자 비변형 야생형 벼, 또는 야생형 벼 세포와 비교시 가용성 전분 합성효소 II (SSII)의 증가된 활성을 야기한다.

또한, 본 발명에 따른 쌀 전분이 상응하는 야생형 식물 세포 또는 야생형 식물로부터의 쌀 전분과 비교시 특정 측쇄의 변형된 분포를 갖는다는 점은 놀라운 것이었다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 20 내지 25의 dp (= 중합도)를 갖는 아밀로펙틴 측쇄의 정도는 상응하는 야생형 벼로부터의 쌀 전분과 비교시 5 ∼ 35% 만큼 증가하는 것으로 나타났다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "20 내지 25의 dp (= 중합도)를 갖는 아밀로펙틴 측쇄 함량의 증가"는 20 ∼ 25의 DP를 갖는 아밀로펙틴 측쇄 함량이 상응하는 야생형 벼 세포 또는 야생형 벼로부터의 20 ∼ 25의 DP를 갖는 아밀로펙틴 측쇄 함량과 비교시 5% ∼ 35%, 바람직하게는 6% ∼ 30%, 특히 바람직하게는 8% ∼ 24% 만큼 증가함을 의미한다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 6 내지 10의 dp를 갖는 아밀로펙틴 측쇄의 함량이 감소된다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "6 내지 10의 dp를 갖는 아밀로펙틴 측쇄 함량의 감소"는 6 ∼ 10의 DP를 갖는 아밀로펙틴 측쇄 함량이 상응하는 야생형 벼 세포 또는 야생형 벼로부터의 6 ∼ 10의 DP를 갖는 아밀로펙틴 측쇄 함량과 비교시 20% ∼ 60%, 바람직하게는 25% ∼ 55%, 특히 바람직하게는 30% ∼ 55% 만큼 감소함을 의미한다.

본 발명의 문맥에서, 측쇄 분포의 측정은 하기 기재된 방법 ("고압 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 아밀로펙틴 측쇄 분포의 분석을 위한 쌀가루/전분의 가공")에 의해 수행된다. 짧은 측쇄의 백분율은 전체 모든 측쇄 중 특정 측쇄의 백분율의 측정을 통해 측정된다. 전체 모든 측쇄는 HPLC 크로마토그램 중 DP 6 내지 48의 중합도를 나타내는 피크 하의 총 면적의 측정을 통해 측정된다. 전체 모든 측쇄 중 특정 측쇄의 백분율은 HPLC 크로마토그램 중 총 면적에 대하여 상기 측쇄를 나타내는 피크 하의 면적의 비율의 측정을 통해 측정된다. 피크 면적을 측정하기 위하여, 미국 디오넥스 (Dionex) 사 제 프로그램 Chromelion 6.60이 예로서 사용될 수 있다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "야생형 벼"는 본 발명에 따른 벼에 대한 출발 물질로서 작용하고, 즉, 가용성 전분 합성효소 II (SSII)의 활성의 증가를 야기하는 도입되는 유전자 변형을 제외하고, 그 유전자 정보가 유전자 변형 벼의 것에 상응하는 벼를 의미하기 위한 것이다.

바람직하게는, 용어 "야생형 벼"는 그 낟알이 영국, AB21 9YA, 스코틀랜드, 아버딘, 벅스번, 크라이브스톤 에스테이트, 퍼구손 빌딩 소재의 NCIMB Ltd. 기탁소에 번호 NCIMB 41352로서 2005년 11월 17일에 기탁된, 25.2% 값의 S-형 아밀로펙틴을 갖는 쌀 종류인, M202 종류를 말한다.

본 발명에 따른 방법의 문맥에서, 유전자 변형은 바람직하게는 가용성 전분 합성효소 II (SSII)를 코딩하는 하나 이상의 외래 핵산 분자를 식물 세포의 게놈에 도입하는 것을 포함하며, 상기 하나 이상의 외래 핵산 분자의 도입은, 유전자 변형 식물 세포 및 그로부터 재생된 식물로부터 수득가능한 전분이, 도입된 SSII의 발현의 결과로서, 상응하는 유전자 비변형 야생형 식물 세포와 비교시 C6 위치에서 증가된 포스페이트 함량을 갖는 것을 야기한다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 외래 핵산 분자의 도입은 본 발명에 따른 쌀 전분의 합성을 야기한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 벼 및 벼 세포는 외래 핵산 분자가 이종 가용성 전분 합성효소 II의 코딩 부위인 것이다.

DNA를 식물 숙주 세포에 도입하기 위하여 다수의 기술이 이용가능하다. 상기 기술은 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조게네스 (Agrobacterium rhizogenes)를 형질전환제로서 사용하는, T-DNA를 사용한 식물 세포의 형질전환, 원형질체의 융합, DNA의 주입, 전기천공, 유전자총 접근법에 의한 DNA의 도입, 및 기타 가능성을 포함한다.

아그로박테리움을 사용한 형질전환에 기초한, 벡터에 의한 단자엽 식물의 형질전환은, 예를 들어, 문헌 [Chan 등, 1993, Plant Mol. Biol. 22: 491-506]; [Hiei 등, 1994, Plant J. 6: 271-282]; [Deng 등, 1990, Science in China 33: 28-34]; [Wilmink 등, 1992, Plant Cell Reports 11: 76-80]; [May 등, 1995, Bio/Technology 13: 486-492]; [Conner 및 Domisse, 1992, Int. J. Plant Sci. 153: 550-555] 및 [Ritchie 등, 1993, Transgenic Res. 2: 252-265]에 기재되어 있다. 단자엽 식물의 형질전환을 위한 대안적 시스템은 유전자총 접근법에 의한 형질전환 ([Wan 및 Lemaux, 1994, Plant Physiol. 104: 37-48]; [Vasil 등, 1993, Bio/Technology 11: 1553-1558]; [Ritala 등, 1994, Plant Mol. Biol. 24: 317-325]; [Spencer 등, 1990, Theor. Appl. Genet. 79: 625-631]), 원형질체의 형질전환, 부분 침투된 세포의 전기천공, 및 유리 섬유에 의한 DNA의 도입이다. 각종 곡물 종의 성공적 형질전환이, 예를 들어, 보리 ([Wan 및 Lemaux, 상동]; [Ritala 등, 상동]; [Krens 등, 1982, Nature 296: 72-74]), 밀 [Nehra 등, 1994, Plant J. 5: 285-297], 쌀 [Ishida 등, 1996, Nature Biotechnology 14 (6): 745-750] 및 옥수수 [Koziel 등 (1993), Biotechnology 11: 194-200]에 대하여 기재되어 있다.

본 발명에 따른 방법의 유전자 변형 식물 세포의 재생은, 그 유전자 정보가 상응하는 유전자 비변형 야생형 식물에 상응하고 본 발명에 따른 방법의 유전자 변형 식물 세포 중 이미 존재하는 가용성 전분 합성효소 II의 활성을 증가시키기 위해 동일하게 도입된 유전자 변형을 함유하는 유전자 변형 식물의 생성을 야기한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 단립종 및 중립종 쌀 종류, 예를 들어, 찹쌀, 푸딩쌀, 모치쌀 (mochi rice), 니시키쌀 (nishiki rice), 리베쌀 (ribe rice), 적미, 흑미, 스시쌀 (sushi rice)을 포함하는, 자포니카 군 (오리자 사티카 종류의 자포니카)으로부터의 벼에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 자포니카 군으로부터의 야생형 벼는 본 발명에 따른 벼를 생성하기 위한 출발 물질로서 사용된다.

추가의, 매우 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 S-형 아밀로펙틴을 갖는 벼에 관한 것이다.

쌀 아밀로펙틴에 있어서, L- 및 S-형이 구별될 수 있다. L-형 아밀로펙틴은 주로 인디카 군으로부터의 쌀에서 발견되는 한편, S-형 아밀로펙틴은, 이에 반해, 주로 자포니카 군으로부터의 쌀에서 발견된다. 본 발명의 문맥에서, S-형 아밀로펙틴은, L-형과 비교시, 짧은 알파-1,4-글루칸 사슬 (DP <= 10)의 양이 DP <= 24의 총 -1,4-글루칸 사슬의 20% 초과에 이른다는 사실에 의해 구별된다 [Nakamura 2002, Starch 54: 117-131].

매우 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 형질전환체 GAOS0353-02301, GAOS0353-01301 및 GAOS0353-01502의 유전자 변형 벼 (오리자 사티바 종류의 자포니카)를 포함한다. 형질전환체 M202 GAOS0353-01502의 종자는 영국, AB21 9YA, 스코틀랜드, 아버딘, 벅스번, 크라이브스톤 에스테이트, 퍼구손 빌딩 소재의 NCIMB Ltd.에 번호 NCIMB 41352로 2005년 11월 17일에 기탁되었다.

추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀가루는 상응하는 야생형 벼로부터의 쌀가루보다 더 적은 겉보기 아밀로오스 함량을 갖는다. 본 발명의 문맥에서, 겉보기 아밀로오스 함량은 바람직하게는 하기 기재된 "겉보기 아밀로오스 함량의 측정" 방법의 도움으로 측정된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀가루의 겉보기 아밀로오스 함량은 상응하는 야생형 벼로부터의 가루 중 겉보기 아밀로오스 함량과 비교시 10% 내지 20%, 특히 바람직하게는 12% 내지 18% 및 매우 특히 바람직하게는 13% 내지 15% 만큼 감소된다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 가용성 전분 합성효소 II를 코딩하는, 도입된 외래 핵산 분자는 배유 특이적 프로모터의 제어 하에 있다. 배유 특이적 프로모터는 본 발명에 따른 식물의 배유 중 가용성 전분 합성효소 II를 코딩하는 외래 핵산 분자의 전사체의 양을 상응하는 야생형 식물의 배유와 비교시 특이적으로 증가시키는 것을 가능하게 한다.

배유 특이적 발현을 위한 프로모터, 예를 들어, 쌀로부터의 글루텔린 프로모터 ([Leisy 등 (1990) Plant Mol. Biol. 14: 41-50]; [Zheng 등 (1993) Plant J. 4:357-366]), 밀로부터의 HMWG 프로모터 [Anderson 등 (1989) Nucleic Acid Res 17:461-462], 밀부터의 GBSSII 프로모터 (WO 02/02785), USP 프로모터 [Baumlein 등 (1991) Mol. Gen Genetics 225: 121-128], 강낭콩으로부터의 파세올린 프로모터 [Kawagoe 및 Murai (1992) Plant J 2 (6):927-36], 옥수수로부터의 제인 유전자의 프로모터 ([Pedersen 등, (1982) Cell 29: 1015-1026]; [Quatroccio 등, (1990) Plant Mol. Biol. 15: 81-93]), 옥수수로부터의 쉬룬켄-1 (shrunken-1) 프로모터 (sh-1) [Werr 등 (1985) EMBO J. 4:1373-1380] 또는 쌀로부터의 프롤라민 프로모터 [Qu & Takaiwa (2004) Plant Biotechnology Journal, 2:113-125]를 사용하는 것이 바람직하다.

쌀로부터의 글로불린 프로모터를 사용하는 것이 특히 바람직하다 [Nakase 등 (1996) Gene 170(2): 223-226].

추가의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 벼를 생성하는 방법에 관한 것이고, 여기서 본 발명에 따른 벼는 본 발명에 따른 벼 세포로부터 재생되고, 여기서, 재생 후, 가용성 전분 합성효소 II의 과발현이 증가된 SSII 활성을 야기하는 벼가 선택된다.

본 발명의 문맥에서, 선택이라는 용어는, 군집 내에서, 고의로 선택된 특성이 기준이 되어, 상기 특성을 나타내는 식물은 재배되는 한편, 소정의 특성을 나타내지 않는 식물은 폐기되는 것을 의미한다.

본 발명의 문맥에서, 선택된 식물은 증가된 SSII 활성의 특성을 갖는 것이었다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 벼 세포를 함유하는, 본 발명에 따른 유전자 변형 벼의 번식 물질에 관한 것이다.

상기 문맥에서, 용어 "번식 물질"은 영양 또는 유성 경로를 통한 자손의 생성에 적절한 식물의 부분을 포함한다. 영양 번식에 적절한 것은, 예를 들어, 삽목또는 캘러스 (callus) 배양이다. 번식 물질은, 예를 들어, 과일, 종자, 묘목, 원형질체, 세포 배양액 등을 포함한다. 번식 물질은 바람직하게는 배유 함유 낟알이다.

유전자 변형 식물 세포를 포함하는, 본 발명에 따른 벼의 쌀알이 본 발명의 추가의 주제이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 벼 및/또는 본 발명에 따른 쌀알 및/또는 본 발명에 따른 쌀가루로부터 전분을 추출하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 변형 쌀 전분의 제조 방법을 포함한다. 추출법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Wang 및 Wang, 2004, Journal of Cereal. Science 39: 291-296] 또는 [Patindol 및 Wang, 2003, J. Agric Food Chem. 51: 2777-2784]에 기재되어 있다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 그 소화성이 야생형 식물로부터의 전분의 소화성과 비교시 감소된 난소화성 전분에 관한 것이다.

식품의 소화성은 특히 이것이 함유하는 전분의 유형에 의해 결정된다. 다수의 식품 성분은 위, 및 소장 내부에서 뿐만 아니라 심지어 그로 향하는 도중에 분해된다. 일부 전분은, 그러나, 오로지 대장에서만 분해되고, 따라서 난소화성 전분 (= RS)으로서 일컬어진다. 이들은 4 가지 유형으로 분류될 수 있다. 제 1 유형 (RS 1)은 완전한 세포 내에 함유된 전분을 포함한다. 이의 소화 효소에 대한 접근성은 따라서 단지 희박하다. 이는, 예를 들어, 전립 (whole) 또는 거칠게 분쇄된 곡물 낟알 중 전분 및 콩류 중 전분의 일부에 적용된다. 제 2 유형 (RS 2)은 소장에서 천연 형태로 소화되지 않는 전분을 포함한다. 상기 경우의 이유는 전분 낟알의 구조 및 전분 낟알 중 전분 분자의 배열이다. 이에 포함되는 것은, 예를 들어, 생감자, 녹색 바나나 또는 아밀로오스 풍부 옥수수 종류 (아밀로메이즈, amylomaize) 중 전분이다. 제 3 유형 (RS 3)은 소위 노화 전분을 포함한다. 이는 가열된, 전분 함유 식료품, 예컨대 빵 및 조리된 감자의 냉각 이후 생성된다. 상기 동안, 일부 전분 분자가 재배열되고, 결정질 영역이 형성되며 이는 소화 효소 (예를 들어, 아밀로오스)에 접근하기 어렵다. 제 4 유형 (RS 4)은, 예를 들어, 가교 또는 에스테르화 (아세틸화 등)에 의해 생성되는 소화되지 않는 화학적 변형 전분을 포함한다.

난소화성 전분의 건강 증진 효과는 특히, 세균 반응에 영향을 미치고, 대변 중량을 증가시키며, 대장 점막 세포에 대한 주요 에너지 공급원을 대표하는 단쇄 지방산의 생성을 야기하는 이의 발효에 있다. 또한, 종양 억제에 있어서 중요한 역할은 부티레이트에 의한 것으로 돌려진다 (추가의 상세한 설명은 특히 문헌 [Wisker (2001), UGB-Forum 01: 75-77]에서 찾을 수 있음).

예를 들어, 고 비율의 전립 곡물 낟알 (및 따라서 RS 1)을 함유하는 빵의 소비자에서 글루코스 및/또는 인슐린 수준은 미세 분쇄된 곡물로부터 만들어진 빵에 비하여 낮다. 혈중 글루코스의 더 작은 증가도 마찬가지로 다수의 콩류에서 발견되었다. 이는 유형 1의 난소화성 전분이, 식료품이 혈중 글루코스에 미치는 효과에 영향을 미침을 나타낸다. 혈중 글루코스 및 인슐린 이외에, 또한 지방의 연소에 매우 중요한 것은 탄수화물이다. 지속적으로 변동하는 인슐린 수준은 지방의 연소를 방해하고 또한 공복감을 증가시킨다. 이러한 이유로, 소화성이 낮거나 감소되어 이에 따라 인슐린 수준을 오로지 약간 증가시키는 탄수화물이 유리하다. 따라서, 적절한 제품 중 상기 전분이 소량의 탄수화물 (= "저 탄수화물")의 흡수를 수반하는 식이의 모든 요건을 충족시키는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 방법의 전분은 야생형 전분과 비교시 뚜렷하게 감소된 소화성을 보여주는 것으로 나타났다. 이는 단리된 전분 (도 3)을 조사하는 경우 명백하였다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 전분은 증가된 식이 섬유 및 "저 탄수화물" 분야 모두에 및 그를 넘어서 사용하는 것을 가능하게 하는 고 영양 품질을 보여준다.

당업자는 소화에 필요한 시간에 따라 전분을 구별한다: 소화되기 위하여 20 분이 걸리는 전분은 "빠른 소화 전분 (RDS)"으로 일컬어지고, 60 분이 걸리는 전분은 "느린 소화 전분 (SDS)"으로 일컬어지며, 120 분 이후에 남아있는 전분은 "난소화성 전분 (RS)"으로 일컬어진다.

놀랍게도, 단리된 전분의 소화성은 감소된다. 야생형과 비교시 소화성이 10 내지 65% 감소된 전분이 바람직하고, 소화성의 10 내지 55%의 감소가 특히 바람직하고, 12 내지 45%의 감소가 매우 특히 바람직하며, 15 내지 30%의 감소가 가장 특히 바람직하다.

이는, 본 발명에 따른 전분 중 난소화성 전분 RS의 백분율이 야생형 전분과 비교시 증가함을 의미한다. RS 함량은 (총 전분의 건조 중량 (100%) - 120 분 후 총 전분으로부터 유리되지 않은 (deliberated) 글루코스의 백분율)로부터의 차이로서 측정된다 (하기 방법 15에 기재된 바와 같음). 상기 문맥에서, 증가는 RS 함량이 100 ∼ 750%, 바람직하게는 150 ∼ 700% 및 특히 바람직하게는 200 ∼ 600%까지 증가함을 의미한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 쌀 전분은 15% ∼ 45%, 바람직하게는 17% ∼ 40% 및 가장 바람직하게는 20% ∼ 38%의 RS 함량을 나타낸다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 제조되고, 상응하는 야생형 식물, 또는 야생형 식물로부터의 전분과 비교시 감소된 소화성을 나타내는 전분을 포함하는 식물 및 식물 세포를 포함한다.

물질 및 방법

하기 방법이 실시예에 이용되었다. 이들 방법은 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해 이용되고; 이들은 본 발명의 구체적 실시양태를 나타내나, 본 발명이 이들 방법에 제한되는 것은 아니다. 당업자는 기재된 방법을 수정하고/하거나 개별 방법론의 항목을 대안적 방법론의 항목으로 대체함에 의해 본 발명이 동일하게 수행될 수 있다는 점을 안다. 예외는 오로지 "전분 결합 글루코스-6-포스페이트의 함량의 측정" 방법이며, 이는, 본 발명의 문맥에서, 오로지 하기 14)에서 기재된 방식으로만 수행된다.

1) 식물 재료 및 배양

벼: 오리자 사티바, 자포니카 군, 종류 M202.

종자는 2005년 11월 17일에 NCIMB Ltd. (영국, AB21 9YA, 아버딘; 벅스번, 크레이브스톤 에스테이트, 퍼구손 빌딩 소재의 국립 산업 박테리아 수집소)에 기탁되었다. 종자 종류 M202-야생형에는 기탁 번호 NCIMB 41352가 주어졌고; 형질전환체 M202-GAOS0353-01502의 종자에는 기탁 번호 NCIMB 41353이 주어졌다.

벼는 온실 내에서 하기 방식의 조건 하에 재배되었다:

파종: 기질: 1.6 ℓ의 장미 포트 중 100%의 스파그넘 피트 (sphagnum peat) 및 1001의 모래/qm 및 점토: 180 kg/qm의 혼합물 (제조업체: 독일, H. 마이어 (H. Meyer)). pH: 5.4 ∼ 6.2;

곡물 비료: Hakaphos (독일, 콤포 (Compo)) 14%의 N - 16%의 P - 18%의 K + 2%의 Mg; 2 kg/qm;

영양: 개화시까지 식물당 3.5 g: NH₄NO₃ (1.75 g) 및 Flory 2 Basis (제조업체: 독일, 아우플로어 (Euflor)): 1.75 g; 3%의 N - 16%의 P - 15%의 K + 5%의 Mg.

온도: 낮 28℃ / 밤 24℃ (16 시간 / 8 시간); 상대 대기 습도: 85 ∼ 95%; 빛: 16 시간, 350/μEinstein/s x qm

2) 형질전환에 사용되는 서열 및 구조체의 유래

밀로부터의 서열 Ta_SSIIa를 쌀의 형질전환에 사용하였다. 단리 및 클로닝을 WO 97-45545 ("pTaSS1"의 이름으로)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 사용된 형질전환 벡터, AH32-191은 실시예 1에 기재되어 있다.

3) 벼의 형질전환 및 재생

벼를 문헌 [Ishida 등, 1996, Nature BioTechnology, 14 (6): 745-750]에 기재된 방법에 의해 형질전환하고 재생하였다.

4) 쌀알의 가공

충분한 양의 연구 재료를 생성하기 위하여, 벼를 온실 조건 하에 재배하고 완전히 성숙되었을 때 수확하였다. 추가의 건조를 위하여, 성숙된 (즉, 완전히 발달된) 쌀알을 37℃에서 3 ∼ 7 일 동안 저장하였다.

그 후, 탈각기 (sheller) (미국, 플로리다주, 마이애미 소재의 그레인만 (Grainman) 사 제 실험실 벼 탈각기)에 의해 낟알의 껍질을 제거하고, 생성되는 현미를 1 분 동안 정미함에 가공하여 (캘리포니아주, 빌라 파크 소재의 케트 (Kett) 사 제 Pearlest 정미기) 백미를 제공한다. 후자를 전립 (whole grain)의, 예를 들어, 알칼리 분산가, 낟알 치수, 낟알 중량 등의 분석을 위한 출발 물질로서 사용한다.

낟알 조성 및 전분 및 가루의 특징을 연구하기 위하여, 백미를 실험실 제분기 (덴마크, 포스 (Foss) 사 제 샘플 제분기, Cyclotec)에 의해 제분하여 쌀가루를 제공한다. 실험실 제분기의 원리는 0.5 mm 미만의 입자 크기에 도달했을 때만 제분기 원료가 제분 챔버를 나가는 것이다. 제분 공정은 모든 샘플 재료가 제분 챔버를 나갔을 때 완료된다.

5) 노던 블롯 ( Northern blot )에 의한 전분 합성효소 II 의 발현 수준의 분석

쌀 중 밀로부터의 전분 합성효소 II의 발현을 노던 블롯에 의해 분석하였다. 상기 목적을 위하여, 3 개의 미성숙 쌀알 (개화 후 대략 15 일)을 각 독립적 트랜스제닉 사건에 대하여 연구하였다. 균질화를 위하여, 냉동 쌀알을 4.5 mm의 강철 볼과 함께 96 웰 플레이트 중 Retsch 제분기 (모델 MM300) 내에서 30 헤르츠의 진동수에서 30 초 동안 진탕시켰다. 그 후, 제조업체의 지시에 따라, 96 웰 스케일의 Promega RNA 추출 키트 (만하임, 프로메가 (Promega) 사 제 SV 96 총 RNA 단리 시스템, 주문 번호 Z3505)에 의해 RNA를 단리하였다.

샘플당 2 ㎍의 RNA를 균일 부피가 되게 하고, 동일 부피의 RNA 샘플 완충제 (65% (v/v)의 포름아미드, 8%의 포름알데히드, 13% (v/v)의 겔 완충제 (상기 참고), 50 ㎍/㎖의 에티듐 브로마이드)로 처리하였다. 가열 (10 분, 65℃) 및 즉시 빙상 냉각 이후, RNA 유동 완충제 (20 mM의 MOPS pH 8.0, 5 mM의 아세트산나트륨, 1 mM의 EDTA)를 사용하여, 1.2% 농도 (w/v)의 아가로스 겔 (20 mM의 MOPS pH 8.0, 5 mM의 아세트산나트륨, 1 mM의 EDTA, 6% (v/v)의 포름알데히드) 상에서 50 ∼ 80 mA의 일정 전류량에서 대략 2 시간 동안 RNA를 분리시켰다.

그 후, RNA를 10x SSC (1.5 M의 NaCl, 150 mM의 시트르산나트륨 pH 7.0)을 사용하여 확산 블롯에 의해 Hybond N 막으로 이동시키고, UV 조사에 의해 막 상에 고정시켰다.

SSII cDNA의 5' 부위를 구성하는, 플라스미드 AH32-191 (Bp 4568 ∼ 5686)의 대략 1 kb의 Spel/BspHI 단편을 노던 블롯의 하이브리드화에 사용하였다. DNA 단편을 제조업체의 지시에 따라 ³²P-α-dCTP를 사용하여 로쉐 (Roche) 사 제 무작위 프라이밍된 DNA 표지 키트 (주문 번호 1004 760)에 의해 방사성 표지하였다.

노던 블롯을 하이브리드화 완충제 (250 mM의 인산나트륨 완충제 pH 7.2, 1 mM의 EDTA, 6% (w/v)의 SDS, 1% (w/v)의 BSA)와 함께 수조 내에서 가볍게 진탕시키면서 60℃에서 4 시간 동안 예비 항온배양한 후, 방사성 표지된 DNA를 하이브리드화를 위해 첨가하였다. 16 시간 동안 항온배양한 후, 하이브리드화 용액을 제거하고, 막을 수조 내에서 가벼운 진탕과 함께 60℃에서 3xSSC 및 2xSSC (상기 참고)로 잇따라 세정하여 비특이적으로 결합된 DNA 분자를 제거하였다. 표지된 RNA를 검출하기 위하여, 막을 -70℃에서 1 내지 3 일 동안 x-선 필름 상에서 방사능 사진 촬영하였다.

6) 활성 겔에 의한 SSII 활성의 측정

미성숙 쌀알 중 상이한 전분 합성효소 활성을 활성 겔에 의해 검출하고 (효소도), 여기서 단백질 추출물을 자연 조건 하에 폴리아크릴아미드 겔 중 분리하며 이어서 적절한 기질과 함께 항온배양하였다. 형성된 반응 생성물 (전분)을 겔 중 루골 용액 (2% (w/v)의 Kl; 0.2% (w/v)의 I₂)에 의해 염색하였다.

단일 미성숙 쌀알 (개화 시작일로부터 측정시, 개화 후 대략 15 일)을 액체 질소 중 급송 냉동시키고 150 ∼ 200 ㎕의 저온 추출 완충제 (50 mM의 Tris/HCl pH 7.6, 2.5 mM의 EDTA, 2 mM의 DTT, 4 mM의 PMSF, 0.1% (w/v)의 글리코겐, 10% (v/v)의 글리세롤) 중 균질화하였다. 원심분리 (15 분, 13,000 g, 4℃) 후, 맑은 상청액을 새로운 반응 용기에 옮기고, 추출물의 분액을 문헌 [Bradford, 1976, Anal Biochem 72: 248-254]의 방법에 의한 단백질 함량 측정에 사용하였다.

단백질 추출물을 단일 농축 유동 완충제 (25 mM의 Tris/HCl, 192 mM의 글리신)를 사용하여 연속 7.5% 농도의 폴리아크릴아미드 겔 (7.5%의 AA/BAA 37.5:1; 25 mM의 Tris/HCl pH 7.6, 192 mM의 글리신, 0.1 % (w/v)의 APS, 0.05% (v/v)의 TEMED)에 의해 분리하였다. 겔을 로딩하기 전에, 유리 라디칼을 제거하기 위한 예비 가동을 8 mA 및 4℃에서 30 분 동안 수행하였다. 15 ㎍의 단백질을 각 샘플에 적용하고 4℃에서 2 ∼ 2.5 시간 동안 전기 이동시켰다.

그 후, 겔을 지속적으로 진탕시키면서 15 ㎖의 항온배양 완충제 (0.5M의 시트르산나트륨 pH 7.0, 25 mM의 아세트산칼륨, 2mM의 EDTA, 2 mM의 DTT, 0.1% (w/v)의 아밀로펙틴, 5O mM의 트리신/NaOH pH 8.5, 1 mM의 ADP-글루코스) 중 실온에서 밤새 항온배양하였다. 형성된 전분을 루골 용액에 의해 염색하였다.

효소도에 의하여 SSII 활성 증가의 정도를 측정하기 위하여, 유전자 변형 주의 단백질 추출물을 단계적으로 희석하여 상기 기재된 방법에 따라 사용하였다. 효소도를 루골 용액으로 염색한 후, 상이한 희석액에 대한 SSII 밴드의 강도를 희석되지 않은 야생형과 시각적으로 비교함에 의해 활성 증가의 정도를 측정하였다.

7) 쌀가루로부터 쌀 전분의 추출

쌀가루로부터 쌀 전분의 추출을 문헌 [Wang 및 Wang, 2004; Journal of Cereal Science 39: 291-296]에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 수행하였다.

10 g의 쌀가루를 실온에서 진탕기 상에서 16 ∼ 18 시간 동안 40 ㎖의 0.05% (w/v)의 NaOH와 함께 항온배양하였다. 그 후, 현탁액을 Warring 혼합기로 옮겨 소화를 완결하고 저속에서 15 초 동안, 및 그 후 고속에서 45 초 동안 혼합하였다. 거친 성분 (예를 들어, 세포벽)을 제거하기 위하여, 현탁액을 망 크기 125 ㎛의 체, 및 그 후 망 크기 63 ㎛의 체를 통해 통과시켰다. 1500 rpm에서 15 분 동안 원심분리한 후 (Microfuge 3.OR; 헤라에우스 (Heraeus)), 상청액을 경사 분리하고, 펠렛의 표면에 존재하는 단백질 층을 스파튤라 (spatula)를 사용하여 제거하였다. 나머지 펠렛을 0.05% (w/v)의 NaOH에 재현탁시키고, 상기 기재된 절차를 반복하였다. 그 후, 펠렛을 물에 재현탁시키고, HCl을 사용하여 현탁액의 pH를 6.5 ∼ 7이 되게 하였다. 수득된 쌀 전분을 물로 세정하고 (총 3 회), 이때 각 세정 단계는 침강 (1500 rpm, 15 분, RT), 상청액의 폐기 및 새로운 물 중 재현탁을 포함한다. 마지막 세정 단계 이전, pH를 다시 점검하고, 적절한 경우, HCl을 사용하여 pH 7이 되게 하였다. 마지막 세정 단계의 쌀 전분 펠렛을 아세톤에 재현탁시키고 침강시키며, 상청액을 폐기하였다. 펠렛을 아세톤에 다시 재현탁시킨 후, 현탁액을 페트리 접시에 붓고 적어도 18 시간 동안 훈연 캐비닛 중 실온에서 건조시켰다.

마지막 단계에서, 쌀 전분을 막자 및 절구로 분쇄하여 미세 분말을 제공하고, 이를 모든 추가의 분석에 직접 사용하였다.

8) 고압 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 아밀로펙틴 측쇄 분포의 연구를 위한 쌀가루/전분의 가공

각 샘플에 대하여, 10 mg의 쌀가루 또는 쌀 전분을 2 ㎖의 Eppendorf 컵에 계량하고 250 ㎕의 90% (v/v)의 DMSO로 처리하였다. 샘플을 60℃에서 진탕시키면서 용해시킨 후, 375 ㎕의 물을 첨가하고, 혼합물을 95℃에서 1 시간 동안 항온배양하였다. 300 ㎕의 16.7 mM의 아세트산나트륨, pH 3.5 및 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.)으로부터의 0.5 U의 이소아밀라제 (Megazyme; 아일랜드, 브레이 (Bray))를 200 ㎕의 반응 혼합물에 첨가하였다. 37℃에서 24 시간 동안 항온배양한 후, 추가의 0.5 U의 이소아밀라제를 첨가하고, 항온배양을 추가의 24 시간 동안 지속하였다.

크로마토그래피를 위하여, 100 ㎕의 반응 혼합물을 물을 사용하여 1:5로 희석하고, 이어서 Ultrafree-MC 필터튜브 (밀리포어 (Millipore))를 통해 여과하였다. 대략 90 ㎕의 여과액이 주입되었다.

크로마토그래피:

방법:

HPLC 시스템: GP 50 Dionex 구배 펌프

ED 50 Dionex 전기화학 검출기/ PAD

AS 50 오토샘플러

칼럼 오븐

칼럼: 가드 칼럼 PA 100 4 x 50 mm (P/N 046115)와 함께

Dionex CarboPac PA 100 4 x 250 mm (P/N 046110)

장치 구성:

HPAEC 프로그램:

압력.하한선 = 50

압력.상한선 = 3500

%A.동일물 ="NaOH 0.15 M"

%B.동일물 ="NaOAc 1.0 M"

%C.동일물 = "NaOH 0.15 M 중 NaOAc 1.0 M"

%D.동일물 = "Millipore 물"

ECD.데이터_수집_속도 = 1.0

파형 시간 = 0.00, 전위 = 0.05

파형 시간 = 0.20, 전위 = 0.05, 통합 = 시작

파형 시간 = 0.40, 전위 = 0.05, 통합 = 종료

파형 시간 = 0.41, 전위 = 0.75

파형 시간 = 0.60, 전위 = 0.75

파형 시간 = 0.61, 전위 = -0.15

파형 시간 = 1.00, 전위 = -0.15

세포 = 온(On)

세척(Flush) 부피 = 500

세척상태 대기

바늘높이 = 2

절단구획부피 = 10

세척기속도 = 4 ;

주기 = 0

온도 대기 = 거짓

샘플준비 대기

0.000 유량 = 1.00

%B = 0.0

%C = 0.0

%D = 0.0

곡선 = 5

로드

주입

대기

ECD.오토제로

ECD_1.AcqOn

유량 = 1.00

%B = 0.0

%C = 0.0

%D = 0.0

곡선 = 5

5.000 유량 = 1.00

%B = 11.0

%C = 0.0

%D = 0.0

곡선 = 5

유량 = 1.00

%B = 11.0

%C = 0.0

%D = 0.0

곡선 = 4

130.000 유량 = 1.00

%B = 35.0

%C = 0.0

%D = 0.0

곡선 = 4

132.000 유량 = 1.00

%B = 0.0

%C = 100.0

%D = 0.0

곡선 = 5

133.000 유량 = 1.00

%B = 0.0

%C = 100.0

%D = 0.0

곡선 = 5

142.000 유량 = 1.00

%B = 0.0

%C = 0.0

%D = 0.0

곡선 = 5

143.000 유량 = 1.00

%B = 0.0

%C = 0.0

%D = 95.0

곡선 = 5

152.000 유량 = 1.00

%B = 0.0

%C = 0.0

%D = 95.0

곡선 = 5

ECD_1.AcqOff

종료

Dionex Chromeleon v6.60 (미국, 캘리포니아주, 서니베일 소재의 디오넥스 코포레이션 (Dionex Corporation))을 이용하여 데이터 평가를 수행하였다. "설명서 및 사용자 메뉴얼" 버젼 6.60 (2004년 3월)은 디오넥스로부터 입수되거나 홈페이지 (http://www.dionex.com)로부터 다운로드될 수 있다.

크로마토그램을 서로 비교하기 위하여, 상이한 말토올리고당의 식별된 피크를 각 크로마토그램에 대하여 평균 정규화하였다 (모든 피크 영역의 합계 = 1). 평가는 "로그 기준선"에 대하여 Dionex Chromeleon v.6.60에 기재된 바와 같이, "힘 공동 기준선"에 기초한 것이었다. 이를 수행하기 위하여, 로그 기준선을 측정 경로의 최단 크로마토그램의 첫번째 측쇄 피크 직전 및 마지막 평가가능한 피크에 이르게 위치시키고; 이는 모든 크로마토그램에 대한 마지막 평가가능한 피크를 계산하기 위한 기초를 형성한다.

9) 조리 특징 및 조리된 쌀알의 질감의 측정

4) "쌀알의 가공"에 기재된 바와 같이 가공된 백미 낟알을 조리 특징의 측정에 사용하였다. 조리 전에, 낟알 치수 및 낟알 중량을 측정하였다. 조리는 20:1의 물-쌀 비율을 수반하였다.

물을 비등시키고, 쌀을 첨가하며, 열 유입량을 감소시켜 물이 약하게 끓게 하였다 (상기 공정 동안, 쌀을 매 3 분마다 교반하였다). 최소 조리 시간을 문헌 [Juliano, 1984; J. of Tex. Studies 15: 357-376]에 기재된 바와 같이 유리 시트 시험에 의해 측정하였다. 이를 위하여, 각 경우 10 개의 낟알을 1 분의 간격으로 2 개의 유리 시트 사이에서 짓눌렀다. 최소 조리 시간은, 90%의 낟알이 더이상 심백을 보여주지 않는 시점에서 도달하였다. 최적의 조리 시간은 조리 과정을 2 분 더 연장시킴에 의해 도달되었다. 체를 통해 쌀을 거르고 실온에서 냉각시켰다. 그 후, 조리된 낟알의 낟알 치수 및 중량을 다시 측정하였다. 새롭게 조리된 쌀알 (조리 후 대략 1 시간)을 사용하여, 4℃에서 22 시간 동안 저장되고 실온으로 재가열된 쌀알, 및 4℃에서 (22 시간 동안) 저장된 후 오븐 또는 전자레인지를 이용하여 재가열된 쌀알에 대하여 질감을 측정하였다. 조리된 쌀알을 오븐 내에서 재가열하기 위하여, 이를 알루미늄 포일로 밀봉된 알루미늄 접시 내에 위치시켜 수분 손실을 피하였다. 접시를 오븐 내에서 80℃에서 20 분 동안 항온배양하였다. 전자레인지 중 낟알의 재가열을 적절한 전자레인지 용기 내에서 360 와트에서 3 분 동안 수행하였다. 2 회의 재가열 과정 이후, 낟알을 실온에서 30 분 동안 저장하여 측정 동안 낟알의 균일한 온도를 보장하였다.

상기 기재된 실험으로부터 조리된 쌀의 질감을 직경 2.5 cm의 원형 탐침을 갖는 질감 분석기 TAXT2 (영국, 고달밍 소재의 스테이블 마이크로 시스템스 (Stable Micro Systems)) 및 측정 방법으로서 이중 압축 시험 (문헌 [Champagne 등 (1998) Cereal Chem. 75 (2): 181-186]로부터 조절됨)을 이용하여 측정하였다. 이를 위하여, 쌀알을 첫번째 주기에서 압축한 후 감압 및 재압축하며, 이때 낟알이 탐침에 가하는 힘 (압력 또는 인력)을 지속적으로 기록하였다. 분석될 각 샘플에, 각 경우 3 개의 낟알에 대하여 10 회의 측정을 수행하고, 이때 쌀알이 서로 접촉되지 않으며 탐침의 가장자리를 넘어서 확장되지 않는 방식으로 이를 탐침 아래에 두었다. 기록된 파라미터는 조리된 쌀알의 경도 (H) (첫번째 압축 단계 동안 최대의 힘) 및 점착성 (-H) (첫번째 압축 단계 동안 최소의 힘)이었다 (도 2 참고). 하나의 샘플에 대한 모든 측정치를 개별적으로 평가하고, 해당 파라미터에 대한 평균치를 그 후 확립하였다.

10) 조리 결과로서의 낟알 치수 변화의 측정

낟알 치수 (길이, 너비 및 영역)를 시스타트 (Systat) (독일, 어크라스) 사 제 소프트웨어 "SigmaScan Pro" 버젼 5.0.0을 이용하여 측정하였다. 이를 위하여, 각 경우 30 개의 쌀알 (조리되지 않은 것 및 조리된 것)을 주사하고, 형성된 이미지를 소프트웨어에 의해 평가하였다. 하기 파라미터를 기록하거나 계산하였다:

L_u - 조리되지 않은 쌀의 낟알 길이 W_u - 조리되지 않은 쌀의 낟알 너비

L_c - 조리된 쌀의 낟알 길이 W_c - 조리된 쌀의 낟알 너비

L/W 비율 = L_u/W_u 또는 L_c/W_c

ER - 신장률 = L_c/L_u

CDC - 치수 변화의 계수 = (L_c-L_u)/(W_c-W_u)

11) 시차 주사 열량측정 (= DSC )에 의한 쌀가루/전분의 열적 분석

대략 10 ㎎ (건조 중량)의 쌀가루 또는 쌀 전분을 과량의 이중 증류수 (바람직하게는 30 ㎕) 중 스테인리스강 팬 (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer), "큰 부피의 스테인리스강 팬" [03190218], 부피 60 ㎕)에 계량하고 팬을 밀봉 봉인하였다. 샘플을 DSC 장치, 타입 Diamond (퍼킨 엘머) 내에서 10℃/분의 가열 속도로 20℃로부터 150℃까지 가열하였다. 비어 있는 봉인된 스테인리스강 팬을 기준으로서 사용하였다. 정의된 양의 인듐을 사용하여 시스템을 검정하였다.

Pyris (퍼킨 엘머, 버젼 7.0)로부터의 소프트웨어 프로그램에 의해 데이터를 분석하였다. T-개시 (℃), T-피크 (℃), T-종료 (℃) 및 dH (J/ｇ)에 대한 1차 상 전이의 각 피크를 분석함에 의해 평가가능한 원 데이터를 처리하였다 (표준은 직선의 기준선임)

DSC T-개시는 기준선 및 탄성점을 가로질러 피크의 상승 측면에 그려진 접선의 투사로서 특징지어진다. 이는 상 전이의 시작을 특징짓는다.

최대 온도 DSC T-피크는 DSC 곡선이 최대값에 도달하는 최대 온도 (즉, 곡선의 1차 미분값이 0이 되는 온도)를 말한다.

Pyris (계산된 피크 영역)에 사용된 함수에 있어서, 시작 온도 및 최종 온도는 기준선 장치에 대하여 수동으로 입력된다.

12) 겉보기 아밀로오스 함량의 측정

겉보기 아밀로오스 함량을 문헌 [Juliano, 1971, Cereal Science Today 16 (10): 334-340]으로부터 조절된 방법에 의해 측정하였다.

각 샘플에 대하여, 50 ㎎의 쌀가루를 100 ㎖의 Erlenmeyer 플라스크에 계량하고 (2 회), 1 ㎖의 95% 농도의 에탄올 및 9 ㎖의 1M의 NaOH로 잇따라 적셨다.

동시에, 정의된 양의 순수 아밀로오스를 갖는 플라스크를 동일하게 가루 샘플에 처리하여 표준 곡선을 확립하였다. 플라스크를 잠깐 팽창시켜 샘플을 혼합하고 이어서 가볍게 진탕시키면서 비등 수조 내에서 20 분 동안 항온배양하였다. 실온에서 5 ∼ 10 분 동안 냉각시킨 후, 부피를 물로 100 ㎖로 만들었다.

100 ㎕의 분액을 1 ㎖의 시험 용액 (10 mM의 아세트산, 0.004% (w/v)의 I₂, 0.04% (w/v)의 Kl)으로 처리하고, 완전히 혼합하며, 620 nm에서 흡수율을 해당 블랭크 값에 대하여 측정하였다. 검정 곡선의 확립에 사용된 아밀로오스 표준의 도움으로 아밀로오스 함량을 계산하였다.

13) 신속 점도 분석기 ( RVA )에 의한 쌀가루의 분석

본 분석 원리는 물 및 쌀가루의 현탁액에 정의된 온도 및 전단 프로토콜을 실시하여, 그동안 현탁액의 점도를 지속적으로 기록하는 것에 기초로 한다. 사용된 측정 장치는 해당 소프트웨어 "Thermocline for Windows", 버젼 2.3을 갖는 뉴포트 사이언티픽 (Newport Scientific) (영국, 맥클레스필드) 사 제 RVA Super3이다.

분석을 위하여, 3 ｇ의 쌀가루 (0%의 수분으로 보정한, 순수 건조 중량의 샘플 재료로서 계량함)을 분석 용기에 계량하고, 25 ㎖의 물로 처리하며, 분석 용기에 교반기를 제공한 후 이를 장치에 도입하였다.

하기 온도 및 전단 프로파일을 적용하였다:

시간	유형	값
00:00:00	온도	50℃
00:00:00	속도	960 rpm
00:00:10	속도	160 rpm
00:01:00	온도	50℃
00:04:48	온도	95℃
00:07:18	온도	95℃
00:11:06	온도	50℃
00:12:30	시험의 종료

측정이 종료된 후 하기 파라미터를 측정하였다:

피크 점도 (2 내지 7 분의 측정 기간 동안 최고 점도)

최저 점도 (7 내지 12 분의 측정 기간 동안 최저 점도)

최종 점도 (측정의 말기에서의 점도)

붕괴 (breakdown) = 피크 - 최저

후퇴 (setback) = 최종 - 최저

호화 온도 (0.1 분의 시간 간격 동안 점도가 36 cp 초과만큼 변하는 온도)

피크 시간 (피크 점도에 도달하는 시간).

14) C6 위치의 포스페이트 함량 ( C6 -P 함량)의 측정

전분 중, 글루코스 단위의 C3 및 C6 위치는 인산화될 수 있다. 전분의 C6-P 함량을 측정하기 위하여 (문헌 [Nielsen 등, 1994, Plant Physiol. 105: 111-117]의 수정된 방법), 50 ｇ의 쌀가루를 지속적으로 진탕시키면서 500 ㎕의 0.7 M의 HCl 중 95℃에서 4 시간 동안 가수분해하였다. 그 후, 샘플을 15,500 ｇ에서 10 분 동안 원심분리하고, 필터막 (0.45 μM)에 의하여 상청액으로부터 탁도를 제거하였다. 20 ㎕의 맑은 가수분해물을 180 ㎕의 이미다졸 완충제 (300 mM의 이미다졸, pH 7.4; 7.5 mM의 MgCl₂, 1 mM의 EDTA 및 0.4 mM의 NADP)와 혼합하였다. 광도계 중 340 nm에서 측정을 수행하였다. 베이스 흡수율을 기록한 후, 2 단위의 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제 (뵈링거 만하임 (Boehringer Mannheim), 레우코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) 유래)의 첨가에 의해 효소 반응을 시작하였다. 흡수율의 변화는 글루코스-6-포스페이트 및 NADP의 6-포스포글루코네이트 및 NADPH로의 동일 몰량의 전환으로 인한 것이며, NADPH의 형성을 상술한 파장에서 기록하였다. 안정기에 도달할 때까지 반응을 모니터링하였다. 상기 측정 결과는 가수분해물 중 글루코스-6-포스페이트 함량을 제공한다. 가수분해도는 유리된 글루코스의 함량에 대하여 동일한 가수분해물로부터 측정되었다. 가수분해도는 글루코스-6-포스페이트 함량을 새로운 중량의 양으로부터의 가수분해된 전분의 백분율과 관련시키기 위하여 사용된다. 이를 위하여, 10 ㎕의 가수분해물을 10 ㎕의 0.7 M의 NaOH로 중성화하고 이어서 물을 사용하여 1:100으로 희석시켰다. 4 ㎕의 상기 희석액을 196 ㎕의 측정 완충제 (100 mM의 이미다졸 pH 6.9; 5 mM의 MgCl₂, 1 mM의 ATP, 0.4 mM NADP)로 처리하고 베이스 흡수율을 측정하기 위하여 사용하였다. 2 ㎕의 효소 믹스 (측정 완충제 중 헥소키나제 1:10; 효모 유래의 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제 1:10)를 첨가하여 안정기에 도달할 때까지 340 nm에서 반응을 모니터링하였다. 측정 원리는 첫번째 반응의 것에 상응한다.

상기 측정 결과는 출발 물질 중 존재하는 전분으로부터 가수분해 동안 유리된 글루코스의 양 (㎎ 단위)을 제공한다.

그 후, 2 개의 측정치의 결과를 서로 관련시켜 가수분해된 전분의 ㎎당 글루코스-6-포스페이트의 함량을 표현한다. 글루코스-6-포스페이트의 양을 새로운 중량의 샘플과 관련시킬 때에 반하여, 상기 계산은 글루코스-6-포스페이트의 양을, 완전히 가수분해되어 글루코스를 제공하며, 이에 따라 또한 글루코스-6-포스페이트의 공급원으로서 구성될 수 있는 전분의 일부에만 관련시킨다.

15) 난소화성 전분 함량 (소화성)의 측정

난소화성 전분 함량을 문헌 [Englyst 등, 1992, Europ. J. of Clinical Nutrition, 46/2: 33-50]에 기재된 것에 기초하여, 하기 기재된 것과 같이 수정한 방법에 의해 측정한다.

1.2 ｇ의 췌장 효소 (머크 (Merck))를 8 ㎖의 물로 37℃에서 10 분 동안 추출함에 의해 효소 용액을 제조한다. 원심분리 (3000 rpm; RT, 10')한 후, 5.4 ㎖의 상청액을 84 U의 아밀로글루코시다제 (타우프키어헨 소재 시그마-알드리히 (Sigma-Aldrich))와 혼합하고, 물을 사용하여 7 ㎖의 최종 부피로 만든다.

동시에, 샘플 (새로운 중량)당 10 ㎎의 쌀 전분을 2 ㎖의 반응 용기 중 0.75 ㎖의 아세트산나트륨 완충제 (0.1 M의 아세트산나트륨, pH 5.2; 4 mM의 CaCl₂)와 혼합하고 37℃에서 5 분 동안 항온배양하여 혼합물을 가온한다.

0.25 ㎖의 효소 용액을 각 혼합물에 첨가하여 전분의 소화를 시작한다. 대조군 혼합물은 첨가된 효소 용액 대신 물을 가졌다. 100 ㎕의 분액을 20, 60 및 120 분 후 제거하고 에탄올의 부피에 4 회 직접 첨가하여, 이에 따라 효소를 불활성화시킨다. 상기 희석액을 사용하여 글루코스 함량을 측정한다.

상기 목적을 위하여, 2 ㎕의 희석된 샘플을 200 ㎕의 측정 완충제 (100 mM의 이미다졸/HCl pH 6.9, 5 mM의 MgCl₂, 1 mM의 ATP, 2 mM의 NADP)와 혼합하고, 340 nm에서 샘플의 흡수율을 측정한다. 2 ㎕의 효소 믹스 (10㎕의 헥소키나제, 10 ㎕의 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제, 80 ㎕의 측정 완충제)를 첨가함에 의해 글루코스의 전환을 시작하고, 이어서 안정기에 도달할 때까지 NADP의 NADPH로의 동일 몰량의 전환을 수행한다. 측정된 글루코스의 양 및 전분 건조 중량 (새로운 중량 - 물 함량으로부터 계산됨) 간의 관계는 적절한 기간 이후 글루코스로서 유리된 샘플의 비율을 제공한다.

난소화성 전분의 양을 하기와 같이 계산하였다:

RS[%] = 100 x 유리되지 않은 글루코스 (㎎) / 전분 건조 중량 (㎎)

실시예 1: 쌀 중 밀 전분 합성효소 IIa 를 발현시키기 위한 형질전환 벡터

쌀 형질전환 벡터 IR103-123 (WO 05/030941에 기재되어 있음) 및 플라스미드 CF31-191 (WO 97/45545에 pTaSSI의 이름으로 기재되어 있음)를 사용하였다. 쌀 형질전환 벡터 IR103-123은 쌀로부터의 글로불린 프로모터에 의해 표적 유전자의 배유 특이적 발현의 기능을 한다. 첫번째 단계 a)에서, 벡터 IR103-123을 제한 효소 EcoRV 및 Xhol을 사용하여 선형화한다. 플라스미드 CF31-191은 밀 (트리티쿰 애스티붐)로부터의 전분 합성효소 II (SSII)의 cDNA를 함유한다. 두번째 단계 b)에서, SSII의 cDNA를 제한 효소 Ecl13611 및 Xhol을 사용하여 플라스미드 CF31-191로부터 절제한다. 단계 a)에서 선형화된 벡터 IR103-123 및 플라스미드 CF 31-191의, 단계 b)에서 수득된 단편의 결찰은 벡터 AH32-191을 제공한다.

실시예 2: 증가된 SSII 활성을 갖는 유전자 변형 벼의 생성

증가된 전분 합성효소 II (SSII) 활성을 갖는 유전자 변형 식물을 생성하기 위하여, 문헌 [Ishida 등, 1996, Nature Biotechnology 14 (6): 745-750]에 기재된 바와 같이 종양균의 도움으로 플라스미드 AH32-191의 T-DNA를 벼로 이동시켰다. SSII 활성의 증가는 효소도에 의해 측정된다.

도 1은 SSII 활성을 야생형과 비교하여 측정하기 위한 3 개의 유전자 변형 쌀 주의 효소도를 보여준다. 사용된 물질은 야생형 및 각 유전자 변형 주의 미성숙 낟알 (개화 시작 후 15 일)로부터의, 각 경우 동일량의 총 단백질 추출물이었다. 유전자 변형 주로부터의 단백질 추출물을 단계적으로 희석하고, 이들 레인 중 SSII 밴드의 강도를 "야생형 레인"과 시각적으로 비교함에 의해 활성이 증가하는 정도를 측정하였다. GAOS0353-01502 주의 SSII 활성은 야생형 낟알보다 10 배 높고, GAOS0353-01301 주는 6 배 높으며, GAOS0353-02301 주는 2 배 높다.

실시예 3: 상이한 SSII 활성 수준을 갖는 상이한 트랜스제닉 주로부터의 쌀 전분의 특징

쌀알을 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성된 식물로부터 수확하고, 이어서 상기 기재된 방법 ("4) 쌀알의 가공")에 의해 가공하여 쌀가루를 제공하였다. 쌀가루의 전분 성분을 이어서 이의 C6 위치의 포스페이트 함량에 대하여 상기 기재된 방법 ("7) C6 위치의 포스페이트 함량 (C6-P 함량)의 측정")에 의해 분석하였다.

증가된 SSII 활성을 갖는 쌀 전분의 특징
주	SS2 발현 (중량의 x배)	C-6-P (중량% 단위)
야생형	1	100
GAOS0353-01301	6	184
GAOS0353-02501	10	358

표 1: 야생형 (중량)과 비교시 증가된 SSII 활성을 갖는 쌀 전분의 특징. 기재된 데이터는 SSII 활성 (야생형의 배수로서) 및 전분 결합 글루코스-6-포스페이트 (C-6-P)의 함량이다.

전분 합성효소 II의 활성 수준은 C6 위치의 포스페이트 함량의 수준과 관련되어 있다는 점을 알 수 있다. GAOS0353-01301 주의 발현은 인자 6만큼 증가하고, C-6-P 함량은 야생형과 비교시 거의 2 배가 되었다. 가장 현저한 효과는 GAOS0353-02501 주에 의해 나타나며, 이의 SSII 발현은 인자 10만큼 증가하고, 이의 C6-P 함량은 야생형 (100%)과 비교시 350%가 넘게 증가한다.

실시예 4: 상이한 SSII 발현 수준을 갖는 상이한 유전자 변형 주의 쌀알, 쌀 전분 및 쌀가루의 특성의 목록

야생형과 비교시 변형된 SSII 발현을 갖는 쌀알로부터의 쌀 전분의 특성
주	SSII 발현 (WT의 x배)	증가된 AP-SC 범위	감소된 AP-SC 범위	C6P (nmol/ ㎎ 전분)	DSC T_개시	DSC T_피크	DSC T_개시 (%)	DSC T_피크 (%)
야생형	1	x	x	0.50	64.1	69.5	100	100
GAOS0353-02301	2	10∼26	6∼9	0.74	76.2	80.8	119	116
GAOS0353-01301	6	11∼29	6∼9	0.92	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
GAOS0353-01502	10	12∼31	6∼10	1.80	77.6	82.5	121	119

기재된 데이터는 미성숙 쌀알 중 SSII 활성 (야생형의 배수로서), 야생형에 비하여 유의하게 변형된 전분의 아밀로펙틴 측쇄 (AP-SC)의 범위, 포스페이트 함량 (C6P) 및 쌀 전분의 ℃ 단위 및 % 단위 (야생형과 비교시)의 DSC 값이다 (n.d. = 검출되지 않음).

유전자 변형 주로부터의 전분의 C6 위치의 포스페이트 함량은 야생형과 비교시 SSII 활성 수준의 함수로서 유의하게 증가한다.

야생형과 비교시 변형된 SSII 발현을 갖는 쌀알로부터의 쌀가루의 특성
주	SSII 발현 (WT의 x배)	DSC T_개시	DSC T_피크	DSC T_개시 (%)	DSC T_피크 (%)	아밀로오스 (%)	아밀로오스 (중량%)
야생형	1	65.6	71.5	100	100	14.0	100
GAOS 0353-02301	2	77.4	82.0	118	115	12.5	89
GAOS 0353-01301	6	77.6	82.5	118	115	12.5	89
GAOS 0353-01502	10	78.8	84.6	120	118	11.7	84

기재된 데이터는 미성숙 쌀알 중 SSII 발현 (야생형의 배수로서), ℃ 단위 및 야생형의 백분율 (%) 단위의 쌀가루의 DSC 값의 변화이다.

유전자 변형 주의 겉보기 아밀로오스 함량은 오로지 소량의 변화를 나타내고; 이들 모두는 야생형의 것보다 약간 적다.

쌀가루 및 이로부터 단리된 전분 모두의 열적 안정성은 상이한 유전자 변형 주에 있어서 SSII 활성의 함수로서 점차 증가한다 (도 1 및 표 1 및 2를 비교하라). 증가된 DSC T-개시 및 DSC T-피크의 최고의 표명은 그 SSII 활성이 10 배 증가된 주에 의해 나타난다. 데이터는 각 경우 야생형을 기준으로 대략 120%이다.

실시예 5: 야생형 ( WT )과 비교시 활성 수준 및 아밀로펙틴 측쇄에 있어서 상이한 유전자 변형 쌀 주의 비교

표 4는 야생형과 비교시 상이한 유전자 변형 쌀 주의 아밀로펙틴 측쇄의 분포를 기재한다. 도시된 곡선은 분석된 글루칸의 사슬 길이 (DP = 중합도) 대 시험된 모든 총 DP 중 특정 DP의 백분율을 플롯팅한 결과이다.

상이한 중합도를 갖는 군으로 분류된, 야생형 (WT) 가루와 비교시 유전자 변형 주의 아밀로펙틴의 측쇄 프로파일의 분포
중합도 (dp)	WT 가루를 기준으로 한 %
중합도 (dp)	GAOS0353-2301	GAOS0253-1301	GAOS0253-1502
dp 6∼10	81.4	66.3	47.0
dp 20∼25	108.7	115.7	123.8

SSII 활성 증가는 아밀로펙틴 측쇄 분포의 뚜렷한 변화를 수반한다는 점을 알 수 있다. SSII 활성의 증가는 6 ∼ 10의 DP를 갖는 측쇄의 점차적인, 상이하게 나타나는 감소 및 20 ∼ 25의 DP를 갖는 측쇄의 증가를 야기한다.

실시예 6: 조리된 쌀알의 질감

상이한 유전자 변형 주 및 상응하는 야생형의 쌀알을 해당 최적의 조리 시간까지 조리하였다 ("조리된 쌀알의 특징의 측정" 방법을 참고하라). 조리 후, 4℃에서 22 시간 동안 저장된 쌀알 (표 5a, 기재된 데이터는 샘플 (각 경우 3 개의 낟알)당 10 회 측정치의 평균치임) 또는 새롭게 조리된 쌀알 (조리 후 대략 1 시간) 및 저온에서 (4℃, 22 시간) 저장된 후 오븐 또는 전자레인지 내에서 재가열된 쌀알 (표 5b)에 대한 질감을 측정한다.

조리 후 4℃에서 22 시간 동안 저장된 쌀알의 질감
샘플	힘 2 (ｇ 단위의 점착성)	힘 1 (ｇ 단위의 낟알 경도)
야생형 M202 평균치	-239.5	1164.6
GAOS0353-02301 평균치	-137.0	1393.0
GAOS0353-01301 평균치	-82.0	1775.4
GAOS0353-01502 평균치	-18.3	1735.3

조리된 쌀알의 점착성은 SSII 활성의 증가에 따라 감소한다 (표 5a). 점착성의 감소는 GAOS0353-02301 주에 있어서 대략 절반까지, GAOS0353-01301 주에 있어서 대략 3배 만큼, 및 GAOS0353-01502 주에 있어서 대략 13배 만큼 감소한다.

새롭게 조리되거나 재가열된 쌀알의 질감
시험 낟알의 가공	샘플	점착성 (ｇ)	점착성 (%)
새롭게 조리됨	야생형 M202	-235.8	100.0
	GAOS0353-01502	-121.4	51.5
오븐 (80℃/5 분) 중 재가열됨	야생형 M202	-230.5	100.0
	GAOS0353-01502	-95.0	41.2
전자레인지 (600 W/3 분) 중 재가열됨	야생형 M202	-182.2	100.0
	GAOS0353-01502	-85.3	46.8

조리하고 (4℃에서 22 시간 동안 저장한 후) 오븐 또는 전자레인지 내에서 재가열한 후 조리된 쌀알의 점착성을 측정하는 데이터의 편집물. 각 가공 변형에 있어서, GAOS0353-01502 주의 점착성은 야생형의 것보다 현저하게 낮다.

실시예 7: 조리되지 않은 쌀알 및 조리된 쌀알의 낟알 치수의 측정

유전자 변형 주 및 상응하는 야생형의 조리되지 않은 쌀알 및 조리된 쌀알의 낟알 치수를 SigmScan 소프트웨어를 이용하여 측정하였다. 그로부터 유도된 결과 및 파라미터는 표 6a 및 b에 기재되어 있다.

조리되지 않은 쌀알 및 조리된 쌀알의 낟알 치수를 측정하는 데이터의 편집물
	야생형	GAOS0353- 02301	GAOS0353- 01301	GAOS0353- 01502
Lu (mm 단위)	5.36	4.81	4.94	4.87
Wu (mm 단위)	2.60	2.58	2.65	2.50
Lc (mm 단위)	7.59	7.50	8.18	7.87
Wc (mm 단위)	3.74	3.61	3.23	3.26
ER	1.41	1.56	1.65	1.62
Lc/Wc	2.05	2.10	2.56	2.43
CDC	2.20	2.95	4.92	4.39
기재된 데이터는 30 회의 독립적 측정치의 평균치임 (L = 낟알 길이; W = 낟알 너비; u = 조리되지 않음; c = 조리됨; ER = 신장률; (Lc/Lu); CDC = 치수 변화의 계수 (Lc/Lu)/(Wc/Wu))

야생형과 비교시 낟알 치수의 상대적 변화율
	야생형	GAOS0353- 02301	GAOS0353- 01301	GAOS0353- 01502
Lu	0	-10.3	-7.8	-9.1
Wu	0	-0.8	1.9	-3.8
Lc	0	-1.2	7.8	3.7
Wc	0	-3.5	-13.6	-12.8
ER	0	10.6	17.0	14.9
Lc/Wc	0	2.4	24.9	18.5
CDC	0	34.1	123.6	99.5
모든 데이터는 백분율 단위임: % 변화율 = (샘플 - 야생형)/야생형 * 100

조리된 쌀알의 낟알 치수에 있어서, 쌀의 증가된 SSII 활성은 조리 동안 낟알의 세로축을 따른 유의하게 더 큰 신장을 야기한다. 이는 증가된 신장률 (ER) 및 증가된 길이/너비 비율 (Lc/Wc)로부터 명백하다. 게다가, 그 SSII 활성이 2 배 증가된 주 (GAOS0353-02301)는 상기 기재된 파라미터에 대하여 더 작은 변화 정도를 나타내는 한편, 그 SSII 활성이 6 배 (GAOS0353-01301) 또는 10 배 (GAOS0353-01502) 증가된 2 개의 주는 훨씬 더 큰 현저한 발현을 나타낸다.

실시예 8: 신속 점도 분석기 ( RVA )에 의한 쌀가루의 생리화학적 특징의 분석

상이한 유전자 변형 주 및 상응하는 야생형으로부터의 쌀가루를 "RVA에 의한 쌀가루의 분석" 방법에 기재된 바와 같이 그 생리화학적 특징에 대하여 분석하였다.

쌀가루/물 현탁액의 점도를 정의된 온도 및 전단 프로그램에 대하여 기록하였다. 상이한 주의 그래프 및 분석 데이터는 표 7a+b에 기재되어 있다.

상이한 SSII 활성을 갖는 유전자 변형 주로부터의 쌀알로 만들어진 쌀가루의 점도 거동의 측정에서 수득된 데이터의 편집물
샘플:	야생형	353-02301	353-01301	353-01502
피크 점도 (cP)	4767	4626	4322	3787
최저 (cP)	2122	1755	1647	1515
붕괴(breakdown) (cP)	2645	2871	2675	2272
말기 점도 (cP)	2934	2338	2249	2065
후퇴(setback) (cP)	812	583	602	550
후퇴 라이스 (setback rice) (cP)	-1833	-2288	-2073	-1722
피크 시간 (분)	5.36	5.02	5.04	4.56
호화 온도 (℃)	72.8	82.3	81.7	83.9
호화 시간 (분)	2.56	3.36	3.4	3.48
피크 시간 - 호화 시간 (초)	144.0	73.2	76.8	64.8

야생형과 비교시 RVA 파라미터의 상대적 변화율
샘플:	야생형	353-02301	353-01301	353-01502
피크 점도 (cP)	0.0	-3.0	-9.3	-20.6
최저 (cP)	0.0	-17.3	-22.4	-28.6
붕괴 (cP)	0.0	8.5	1.1	-14.1
말기 점도 (cP)	0.0	-20.3	-23.3	-29.6
후퇴 (cP)	0.0	-28.2	-25.9	-32.3
후퇴 라이스 (cP)	0.0	24.8	13.1	-6.1
피크 시간 (분)	0.0	-9.5	-9.5	-12.0
호화 온도 (℃)	0.0	13.0	12.2	15.2
호화 시간 (분)	0.0	32.8	31.3	35.9
피크 시간 - 호화 시간 (초)	0.0	-49.2	-46.7	-55.0
(모든 데이터는 백분율 단위임) % 변화율 = (샘플 - 야생형)/야생형 * 100

야생형 및 유전자 변형 주로부터의 가루의 점도 진행은 복수 개의 파라미터에 있어서 상이하다. 유전자 변형 샘플은 현저하게 느린 시점에서 호화가 시작되고, 이는 증가된 "호화 온도"로부터 알 수 있다. 이어서 피크 점도까지의 점도 진전은 매우 빠르게 진행되고, 이는 유전자 변형 샘플의 더 짧은 "피크 시간"으로부터 알 수 있다. 모든 기타 점도 파라미터 (피크, 최저, 최종)는 야생형의 경우에서보다 유전자 변형 샘플의 경우에 더 낮다. 여기서, 야생형에 대한 변화의 정도는 SSII 활성 수준과 관련되어 있다는 점이 언급되어야 한다. 최고 SSII 활성을 갖는 주 (GAOS0353-1502)는 가장 낮은 피크, 최저 및 최종 점도를 보이며, 호화 온도에 있어서 10℃ 초과의 값으로 최고의 차이를 나타낸다.

또다른, 매우 명백한 측면은 유전자 변형 샘플의 점도의 급속한 진전이며, 이는 호화의 개시 및 피크 점도 시간 사이의 매우 짧은 간격에 반영되어 있다. 게다가, 상기 파라미터는 그 효과의 SSII 활성이 증가하는 정도에 대한 현저한 의존성을 보여준다.

실시예 9: 단리된 전분의 소화성

형질전환체 GAOS353-2501 및 GAOS 353-1301의 전분은 야생형과 비교시 뚜렷하게 감소된 소화성을 나타낸다.

야생형과 비교시 형질전환체 GAOS 353-1301의 경우에 단리된 전분의 효소 분해는 20 분 후 53%, 60 분 후 67% 및 120 분 후 84%이다.

야생형과 비교시 형질전환체 GAOS 353-2501의 경우에 단리된 전분의 효소 분해는 20 분 후 39%, 60 분 후 49% 및 120 분 후 68%이다 (도 3).

쌀 전분의 RS 함량
	RS 함량 (%)
야생형	6.2
353-2501	35.8
353-1301	20.8

SEQUENCE LISTING <110> Bayer CropScience GmbH <120> Overexpression of starch synthase in plants <130> BCS 05-5006-PCT <150> EP05090220.4 <151> 2005-07-22 <150> US 60/701,764 <151> 2005-07-22 <150> EP05090349.1 <151> 2005-12-23 <150> US 60/757,216 <151> 2006-01-06 <150> EP06090003.2 <151> 2006-01-06 <150> US 60/757,810 <151> 2006-01-10 <160> 5 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 3006 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> CDS <222> (227)..(2623) <223> <220> <221> Region1 <222> (1190)..(1279) <223> <220> <221> Region2 <222> (1493)..(1612) <223> <220> <221> Region3 <222> (2147)..(2350) <223> <300> <302> Nucleic acid molecules encoding enzymes from wheat which are involved in starch synthesis <308> Derwent/AAV01528 <309> 1998-05-21 <310> wo 97 45545 <311> 1997-05-28 <312> 1997-12-04 <313> (1)..(2825) <400> 1 ctccaccgcg gtggcggccg ctctagaact agtggatccc ccgggctgca ggaattcggc 60 acgagcttcg gcctgacccc gttcgtttac ccccacacag agcacactcc agtccagtcc 120 agcccactgc caccgcgcta ctctccactc ccactgccac cacctccgcc tgcgccgcgc 180 tctgggcgga ccaacccgcg aaccgtacca tctcccgccc cgatcc atg tcg tcg 235 Met Ser Ser 1 gcg gtc gcg tcc gcc gca tcc ttc ctc gcg ctc gcg tca gcc tcc ccc 283 Ala Val Ala Ser Ala Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala Ser Ala Ser Pro 5 10 15 ggg aga tca cgc agg cgg gcg agg gtg agc gcg cag cca ccc cac gcc 331 Gly Arg Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Ser Ala Gln Pro Pro His Ala 20 25 30 35 ggg gcc ggc agg ttg cac tgg ccg ccg tgg ccg ccg cag cgc acg gct 379 Gly Ala Gly Arg Leu His Trp Pro Pro Trp Pro Pro Gln Arg Thr Ala 40 45 50 cgc gac gga gct gtg gcg gcg ctc gcc gcc ggg aag aag gac gcg ggg 427 Arg Asp Gly Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Gly Lys Lys Asp Ala Gly 55 60 65 atc gac gac gcc gcc gcg tcc gtg agg cag ccc cgc gca ctc cgc ggt 475 Ile Asp Asp Ala Ala Ala Ser Val Arg Gln Pro Arg Ala Leu Arg Gly 70 75 80 ggc gcc gcc acc aag gtc gcg gag cga agg gat ccc gtc aag acg ctc 523 Gly Ala Ala Thr Lys Val Ala Glu Arg Arg Asp Pro Val Lys Thr Leu 85 90 95 gac cgc gac gcc gcg gaa ggc ggc ggg ccg tcc ccg ccg gca gcg agg 571 Asp Arg Asp Ala Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ala Ala Arg 100 105 110 115 cag gac gcc gcc cgt ccg ccg agt atg aac ggc atg ccg gtg aac ggc 619 Gln Asp Ala Ala Arg Pro Pro Ser Met Asn Gly Met Pro Val Asn Gly 120 125 130 gag aac aaa tct acc ggc ggc ggc ggc gcg act aaa gac agc ggg ctg 667 Glu Asn Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys Asp Ser Gly Leu 135 140 145 ccc acg ccc gca cgc gcg ccc cat ccg tcg acc cag aac aga gca ccg 715 Pro Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Pro Ser Thr Gln Asn Arg Ala Pro 150 155 160 gtg aac ggt gaa aac aaa gct aac gtc gcc tcg ccg ccg acg agc ata 763 Val Asn Gly Glu Asn Lys Ala Asn Val Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ile 165 170 175 gcc gag gcc gcg gct tcg gat tcc gca gct acc att tcc atc agc gac 811 Ala Glu Ala Ala Ala Ser Asp Ser Ala Ala Thr Ile Ser Ile Ser Asp 180 185 190 195 aag gcg ccg gag tcc gtt gtc cca gct gag aag acg ccg ccg tcg tcc 859 Lys Ala Pro Glu Ser Val Val Pro Ala Glu Lys Thr Pro Pro Ser Ser 200 205 210 ggc tca aat ttc gag tcc tcg gcc tct gct ccc ggg tct gac act gtc 907 Gly Ser Asn Phe Glu Ser Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ser Asp Thr Val 215 220 225 agc gac gtg gaa caa gaa ctg aag aag ggt gcg gtc gtt gtc gaa gaa 955 Ser Asp Val Glu Gln Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val Val Val Glu Glu 230 235 240 gct cca aag cca aag gct ctt tcg ccg cct gca gcc ccc gct gta caa 1003 Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Pro Pro Ala Ala Pro Ala Val Gln 245 250 255 gaa gac ctt tgg gat ttc aag aaa tac att ggt ttc gag gag ccc gtg 1051 Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Ile Gly Phe Glu Glu Pro Val 260 265 270 275 gag gcc aag gat gat ggc cgg gct gtc gca gat gat gcg ggc tcc ttt 1099 Glu Ala Lys Asp Asp Gly Arg Ala Val Ala Asp Asp Ala Gly Ser Phe 280 285 290 gaa cac cac cag aat cac gac tcc gga cct ttg gca ggg gag aat gtc 1147 Glu His His Gln Asn His Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly Glu Asn Val 295 300 305 atg aac gtg gtc gtc gtg gct gct gag tgt tct ccc tgg tgc aaa aca 1195 Met Asn Val Val Val Val Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp Cys Lys Thr 310 315 320 ggt ggt ctg gga gat gtt gcg ggt gct ctg ccc aag gct ttg gca aag 1243 Gly Gly Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala Leu Ala Lys 325 330 335 aga gga cat cgt gtt atg gtt gtg gta cca agg tat ggg gac tat gaa 1291 Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly Asp Tyr Glu 340 345 350 355 gaa gcc tac gat gtc gga gtc cga aaa tac tac aag gct gct gga cag 1339 Glu Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala Ala Gly Gln 360 365 370 gat atg gaa gtg aat tat ttc cat gct tat atc gat gga gtt gat ttt 1387 Asp Met Glu Val Asn Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly Val Asp Phe 375 380 385 gtg ttc att gac gct cct ctc ttc cga cac cgt cag gaa gac att tat 1435 Val Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gln Glu Asp Ile Tyr 390 395 400 ggg ggc agc aga cag gaa att atg aag cgc atg att ttg ttc tgc aag 1483 Gly Gly Ser Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu Phe Cys Lys 405 410 415 gcc gct gtt gag gtt cca tgg cac gtt cca tgc ggc ggt gtc cct tat 1531 Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly Val Pro Tyr 420 425 430 435 ggg gat gga aat ctg gtg ttt att gca aat gat tgg cac acg gca ctc 1579 Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp His Thr Ala Leu 440 445 450 ctg cct gtc tat ctg aaa gca tat tac agg gac cat ggt ttg atg cag 1627 Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp His Gly Leu Met Gln 455 460 465 tac act cgg tcc att atg gtg ata cat aac atc gct cac cag ggc cgt 1675 Tyr Thr Arg Ser Ile Met Val Ile His Asn Ile Ala His Gln Gly Arg 470 475 480 ggc cct gta gat gaa ttc ccg ttc acc gag ttg cct gag cac tac ctg 1723 Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr Glu Leu Pro Glu His Tyr Leu 485 490 495 gaa cac ttc aga ctg tac gac ccc gtg ggt ggt gaa cac gcc aac tac 1771 Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu His Ala Asn Tyr 500 505 510 515 ttc gcc gcc ggc ctg aag atg gcg gac cag gtt gtc gtg gtg agc ccc 1819 Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Gln Val Val Val Val Ser Pro 520 525 530 ggg tac ctg tgg gag ctg aag acg gtg gag ggc ggc tgg ggg ctt cac 1867 Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu Gly Gly Trp Gly Leu His 535 540 545 gac atc ata cgg cag aac gac tgg aag acc cgc ggc atc gtc aac ggc 1915 Asp Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys Thr Arg Gly Ile Val Asn Gly 550 555 560 atc gac aac atg gag tgg aac ccc gag gtg gac gcc cac ctc aag tcg 1963 Ile Asp Asn Met Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Ala His Leu Lys Ser 565 570 575 gac ggc tac acc aac ttc tcc ctg agg acg ctg gac tcc ggc aag cgg 2011 Asp Gly Tyr Thr Asn Phe Ser Leu Arg Thr Leu Asp Ser Gly Lys Arg 580 585 590 595 cag tgc aag gag gcc ctg cag cgc gag ctg ggc ctg cag gtc cgc gcc 2059 Gln Cys Lys Glu Ala Leu Gln Arg Glu Leu Gly Leu Gln Val Arg Ala 600 605 610 gac gtg ccg ctg ctc ggc ttc atc ggc cgc ctg gac ggg cag aag ggc 2107 Asp Val Pro Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly Gln Lys Gly 615 620 625 gtg gag atc atc gcg gac gcc atg ccc tgg atc gtg agc cag gac gtg 2155 Val Glu Ile Ile Ala Asp Ala Met Pro Trp Ile Val Ser Gln Asp Val 630 635 640 cag ctg gtg atg ctg ggc acc ggg cgc cac gac ctg gag agc atg ctg 2203 Gln Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu Ser Met Leu 645 650 655 cag cac ttc gag cgg gag cac cac gac aag gtg cgc ggg tgg gtg ggg 2251 Gln His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly Trp Val Gly 660 665 670 675 ttc tcc gtg cgc ctg gcg cac cgg atc acg gcg ggg gcg gac gcg ctc 2299 Phe Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala Asp Ala Leu 680 685 690 ctc atg ccc tcc cgg ttc gag ccg tgc ggg ctg aac cag ctc tac gcc 2347 Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ala 695 700 705 atg gcc tac ggc acc gtc ccc gtc gtg cac gcc gtc ggc ggc ctc agg 2395 Met Ala Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Ala Val Gly Gly Leu Arg 710 715 720 gac acc gtg ccg ccg ttc gac ccc ttc aac cac tcc ggg ctc ggg tgg 2443 Asp Thr Val Pro Pro Phe Asp Pro Phe Asn His Ser Gly Leu Gly Trp 725 730 735 acg ttc gac cgc gcc gag gcg cac aag ctg atc gag gcg ctc ggg cac 2491 Thr Phe Asp Arg Ala Glu Ala His Lys Leu Ile Glu Ala Leu Gly His 740 745 750 755 tgc ctc cgc acc tac cga gac ttc aag gag agc tgg agg gcc ctc cag 2539 Cys Leu Arg Thr Tyr Arg Asp Phe Lys Glu Ser Trp Arg Ala Leu Gln 760 765 770 gag cgc ggc atg tcg cag gac ttc agc tgg gag cac gcc gcc aag ctc 2587 Glu Arg Gly Met Ser Gln Asp Phe Ser Trp Glu His Ala Ala Lys Leu 775 780 785 tac gag gac gtc ctc gtc aag gcc aag tac cag tgg tgaacgctag 2633 Tyr Glu Asp Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr Gln Trp 790 795 ctgctagccg ctccagcccc gcatgcgtgc atgacaggat ggaactgcat tgcgcacgca 2693 ggaaagtgcc atggagcgcc ggcatccgcg aagtacagtg acatgaggtg tgtgtggttg 2753 agacgctgat tccaatccgg cccgtagcag agtagagcgg aggtatatgg gaatcttaac 2813 ttggtattgt aatttgttat gttgtgtgca ttattacaat gttgttactt attcttgtta 2873 agtcggaggc caagggcgaa agctagctca catgtctgat ggatgcacgt gccatggttg 2933 gtttggtagc gcagtgcaaa cggcaagaat gggaagtgaa ttcctccctg cttgaaaaaa 2993 aaaaaaaaaa aaa 3006 <210> 2 <211> 799 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 2 Met Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala Ser 1 5 10 15 Ala Ser Pro Gly Arg Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Ser Ala Gln Pro 20 25 30 Pro His Ala Gly Ala Gly Arg Leu His Trp Pro Pro Trp Pro Pro Gln 35 40 45 Arg Thr Ala Arg Asp Gly Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Gly Lys Lys 50 55 60 Asp Ala Gly Ile Asp Asp Ala Ala Ala Ser Val Arg Gln Pro Arg Ala 65 70 75 80 Leu Arg Gly Gly Ala Ala Thr Lys Val Ala Glu Arg Arg Asp Pro Val 85 90 95 Lys Thr Leu Asp Arg Asp Ala Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro 100 105 110 Ala Ala Arg Gln Asp Ala Ala Arg Pro Pro Ser Met Asn Gly Met Pro 115 120 125 Val Asn Gly Glu Asn Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys Asp 130 135 140 Ser Gly Leu Pro Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Pro Ser Thr Gln Asn 145 150 155 160 Arg Ala Pro Val Asn Gly Glu Asn Lys Ala Asn Val Ala Ser Pro Pro 165 170 175 Thr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Ala Ser Asp Ser Ala Ala Thr Ile Ser 180 185 190 Ile Ser Asp Lys Ala Pro Glu Ser Val Val Pro Ala Glu Lys Thr Pro 195 200 205 Pro Ser Ser Gly Ser Asn Phe Glu Ser Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ser 210 215 220 Asp Thr Val Ser Asp Val Glu Gln Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val Val 225 230 235 240 Val Glu Glu Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Pro Pro Ala Ala Pro 245 250 255 Ala Val Gln Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Ile Gly Phe Glu 260 265 270 Glu Pro Val Glu Ala Lys Asp Asp Gly Arg Ala Val Ala Asp Asp Ala 275 280 285 Gly Ser Phe Glu His His Gln Asn His Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly 290 295 300 Glu Asn Val Met Asn Val Val Val Val Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp 305 310 315 320 Cys Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala 325 330 335 Leu Ala Lys Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly 340 345 350 Asp Tyr Glu Glu Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala 355 360 365 Ala Gly Gln Asp Met Glu Val Asn Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly 370 375 380 Val Asp Phe Val Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gln Glu 385 390 395 400 Asp Ile Tyr Gly Gly Ser Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu 405 410 415 Phe Cys Lys Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly 420 425 430 Val Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp His 435 440 445 Thr Ala Leu Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp His Gly 450 455 460 Leu Met Gln Tyr Thr Arg Ser Ile Met Val Ile His Asn Ile Ala His 465 470 475 480 Gln Gly Arg Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr Glu Leu Pro Glu 485 490 495 His Tyr Leu Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu His 500 505 510 Ala Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Gln Val Val Val 515 520 525 Val Ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu Gly Gly Trp 530 535 540 Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys Thr Arg Gly Ile 545 550 555 560 Val Asn Gly Ile Asp Asn Met Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Ala His 565 570 575 Leu Lys Ser Asp Gly Tyr Thr Asn Phe Ser Leu Arg Thr Leu Asp Ser 580 585 590 Gly Lys Arg Gln Cys Lys Glu Ala Leu Gln Arg Glu Leu Gly Leu Gln 595 600 605 Val Arg Ala Asp Val Pro Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly 610 615 620 Gln Lys Gly Val Glu Ile Ile Ala Asp Ala Met Pro Trp Ile Val Ser 625 630 635 640 Gln Asp Val Gln Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu 645 650 655 Ser Met Leu Gln His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly 660 665 670 Trp Val Gly Phe Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala 675 680 685 Asp Ala Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln 690 695 700 Leu Tyr Ala Met Ala Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Ala Val Gly 705 710 715 720 Gly Leu Arg Asp Thr Val Pro Pro Phe Asp Pro Phe Asn His Ser Gly 725 730 735 Leu Gly Trp Thr Phe Asp Arg Ala Glu Ala His Lys Leu Ile Glu Ala 740 745 750 Leu Gly His Cys Leu Arg Thr Tyr Arg Asp Phe Lys Glu Ser Trp Arg 755 760 765 Ala Leu Gln Glu Arg Gly Met Ser Gln Asp Phe Ser Trp Glu His Ala 770 775 780 Ala Lys Leu Tyr Glu Asp Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr Gln Trp 785 790 795 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 3 Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala Leu 1 5 10 15 Ala Lys Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr 20 25 30 <210> 4 <211> 40 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 4 Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly Val Pro Tyr Gly Asp Gly 1 5 10 15 Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp His Thr Ala Leu Leu Pro Val 20 25 30 Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp 35 40 <210> 5 <211> 68 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 5 Gln Asp Val Gln Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu 1 5 10 15 Ser Met Leu Gln His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly 20 25 30 Trp Val Gly Phe Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala 35 40 45 Asp Ala Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln 50 55 60 Leu Tyr Ala Met 65

Claims

a) 가용성 전분 합성효소 II를 코딩하는 외래 핵산 분자의 도입에 의해 식물 세포를 유전자 변형하고,

b) 상기 가용성 전분 합성효소 II가 과발현되는,

유전자 변형 식물 세포의 전분의 포스페이트 함량을 상응하는 유전자 비변형 야생형 식물 세포로부터의 전분 (100%)과 비교시 150 내지 500%까지 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 외래 핵산 분자가 이종 가용성 전분 합성효소 II의 코딩 부위인 방법.
제1항에 있어서, 가용성 전분 합성효소 II가 단자엽 식물로부터의 가용성 전분 합성효소 II인 방법.
제1항에 있어서, 가용성 전분 합성효소 II가 밀로부터의 가용성 전분 합성효소 II인 방법.
제1항에 있어서, 상기 가용성 전분 합성효소 II가 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변형 식물 세포가 감자, 옥수수 또는 쌀 식물 세포인 방법.
70℃ 내지 80℃의 DSC T-개시 온도를 갖는 쌀 전분.
제7항에 있어서, DSC T-개시 온도가 72℃ 내지 79℃인 쌀 전분.
제7항 또는 제8항에 따른 쌀 전분을 포함하는 유도체화 쌀 전분.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 쌀 전분을 포함하는 조성물.
제7항 또는 제8항에 따른 쌀 전분을 포함하는 쌀가루.
제10항에 따른 쌀가루를 포함하는 조성물.
제7항 또는 제8항에 따른 쌀 전분을 포함하는 쌀알.
제13항에 따른 하나 이상의 쌀알을 포함하는 조성물.
제13항에 따른 하나 이상의 쌀알이 자라고/거나 제7항 또는 제8항에 따른 쌀 전분을 포함하는 벼.