BRPI0210010B1 - Imunógeno peptídico, bem como composição e aplicação compreendendo os mesmos - Google Patents
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Abstract
"composição de peptídeo imunogênico para prevenção e tratamento da doença de alzheimer". a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo um imunógeno peptídico útil para prevenção e tratamento da doença de alzheimer. mais particularmente, o imunógeno peptídico compreende um sítio funcional/regulatório principal, um fragmento n-terminal do peptídeo amilóide <225> (a<225>) ligado a um epítopo de célula t auxiliar (th) com motivos múltiplos de ligação a mhx classe ii. o imunógeno peptídico solicita uma resposta imune direcionada ao sítio contra o sítio funcional/regulatório principal do peptídeo a<225> e gera anticorpos, que são altamente reativos por cruzamento ao peptídeo a<225>~ 1-42~ solúvel e a placas amilóides formadas no cérebro de pacientes com doença de alzheimer. os anticorpos solicitados sendo de reação cruzada ao peptídeo a<225>~ 1-42~ solúvel, promovem desagregação fibrilar e inibem a agregação fibrilar conduzindo à imunoneutralização das 'toxinas derivadas de a<225>-solúvel' e sendo reativos cruzados às placas amilóides, aceleram a saída dessas placas do cérebro. portanto, a composição da invenção compreendendo o imunógeno peptídico é útil na prevenção e tratamento da doença de alzheimer.
Description
(54) Título: IMUNÓGENO PEPTÍDICO, BEM COMO COMPOSIÇÃO E APLICAÇÃO COMPREENDENDO OS MESMOS (73) Titular: UNITED BIOMEDICAL, INC., Sociedade Norte Americana. Endereço: 25 Davids Drive Hauppauge NY 11788, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: CHANG Yl WANG
Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 20/03/2018, observadas as condições legais
Expedida em: 20/03/2018
Assinado digitalmente por:
Júlio César Castelo Branco Reis Moreira
Diretor de Patente
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para IMUNÓGENO PEPTÍDICO, BEM COMO COMPOSIÇÃO E APLICAÇÃO COMPREENDENDO OS MESMOS.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo um imunógeno peptídico útil para prevenção e tratamento da Doença de Alzheimer. Mais particularmente, o imunógeno peptídico compreende um sítio funcional/regulatório principal, um fragmento N-terminal do peptídeo Amilóde β (Αβ) ligado a um epítopo de célula T auxiliar (Th) tendo motivos múltiplos de ligação a MHC classe II. O imunógeno peptídico solicita uma resposta imune direcionada ao sítio contra o sítio funcional/regulatório principal do peptídeo Αβ e gera anticorpos, que são altamente reativos por cruzamento ao peptídeo Αβ1.42 solúvel e às placas amilóides formadas no cérebro de pacientes com Doença de Alzheimer. Os anticorpos solicitados sendo reativos cruzados ao peptídeo Αβι.42 solúvel promovem desagregação fibrilar e inibem a agregação fibrilar conduzindo a imunoneutralização das toxinas derivadas de Αβ-solúvel e sendo reativos cruzados às placas amilóides, aceleram o espaço dessas placas do cérebro. Portanto, a composição da invenção compreendendo o imunógeno peptídico é útil na prevenção e tratamento da Doença de Alzheimer.
Antecedentes da Invenção
A Doença de Alzheimer (AD) é um distúrbio neurodegenerativo crônico, caracterizado por uma perda na capacidade cognitiva e graves anormalidades compartimentais em um paciente conduzindo a eventual morte do paciente. Existe atualmente 2,5 a 4,0 milhões de pacientes AD nos Estados Unidos e 17 a 25 milhões em todo o mundo. É a quarta causa que leva à morte nas culturas ocidentais, precedida apenas por doença cardíaca, câncer e derrame. ARICEPT® um inibidor de acetilcolinesterase foi aprovado por FDA para desacelerar a velocidade de declínio dos pacientes Alzheimer. Contudo, este é eficaz apenas durante um período limitado de tempo e em alguns pacientes. Até o presente não existe tratamento ou cura definitiva para esta doença devastadora.
Dois depósitos microscópicos ou seja, entrelaçados neurofibrilares (NFT) e placas amilóides senis, foram identificadas por Alois Alzheimer como o sinal patológico da doença. Os emaranhados neurofibrilares consiste em dois filamentos de 10 nm de amplitude torcidos entre si, referidos como filamentos helicoidais emparelhados (PHFs) sendo um componente principal destes tau fosforilado. A fosforilação de serina no aminoácido 262 da proteína tau representa uma etapa crucial levando à disfunção fisiológica de tau. PHFs são intracelulares e são encontrados em muitos processos anormais dendríticos e axonais, ou neuríticos que compõem a periferia de placas amilóides senis. As placas amilóides senis consistem de filamentos neurofilamentosos desorganizados em uma área de até 150 μιτι na seção transversal com um núcleo extracelular de depósito amilóide. As placas amilóides cerebrais são ultra-estruturalmente distintas de PHFs e consistem de filamentos de 4-8 nm de largura que são enrolados juntos em pares. O núcleo da placa consiste em agregados de um peptídeo inicialmente referido como A4, com uma massa molecular relativa (M) de cerca de 4.000 (Masters et a1, Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82:4245-4249).
Uma seqüência de aminoácido parcial de A4, agora novamente denominada peptídeo β amilóide (ou Αβι_42), mostra que é similar a proteína β amilóide dos vasos sangüíneos cerebrais dos pacientes com Doença de Alzheimer ou síndrome de Down (Glenner e Wong, Biochem Biophys Res Comm, 1984, 120:885-890, 122-1131-1135).
Relacionou-se, hipoteticamente, ΑβΊ.42 com AD por uma série de razões. Primeiramente, em amiloidoses periféricas, por exemplo, doença de cadeia livre primária ou amiloidose AA secundária, grande opressão amilóide correlaciona-se fortemente com disfunção tissular e orgânica. Em segundo lugar, a densidade da placa amilóide correlaciona-se positivamente com marcas de demência pré-mortem em AD. Em terceiro lugar, a deposição de Αβι-42 θ a marcação neuropatológica mais antiga em AD e distúrbios relacionados como síndrome de Down, onde ela pode preceder a formação de NFT por 2-3 décadas. Em quarto lugar, a β-amiloidose é relativamente específica a AD e distúrbios relacionados. Em quinto lugar, Αβι-42 é toxico para os neurônios (Yankner et al., Science, 1990, 250:279-282). E por fim, mutações, sem sentido no gene da proteína precursora amilóide estrutural (APP) causa o início prematuro de AD familiar (Goate et al., Nature 1991,349-704706, Mullan etal., Nature Genetics, 1992, 1:345-347). Notavelmente, uma tal mutação ocasiona uma superprodução dramática de ΑβΊ.42 (Citron et al., Nature, 1992, 360:672-674).
Em 1987, Kang et ai., (Nature), 1987, 325:733-737) e três outros grupos (ver relatos da posição em 1987 por Anderton, Nature 1987; 325:658659 e Barnes, Science 1987; 235:846-847) clonaram independentemente, o gene do qual derivou-se Αβι.42. Este gene, agora conhecido como o da proteína precursora amilóide (APP) codifica uma proteína de 695 resíduos de aminoácido com um peso molecular de cerca de 79.000 que é expresso virtualmente em todos os tecidos. Existem pelo menos cinco variantes de ementa de APP, quatro das quais contêm a seqüência peptídica β-amilóide.
Quatro genes foram bem implicados nas formas familiares de AD. Três desses genes, βΑΡΡ, presenilin I e presenilin 2, quanto passam por mutação, ocasionam formas primitivas dominantes autossomais de AD. O quardo gene, Apolipoproteína E, tem uma forma polimórfica de ocorrência natural, ApoE4, que representa um fator de risco genético principal para o desenvolvimento da doença. O conceito de que alterações em vários genes distintos pode conduzir a um desequilíbrio crônico entre a produção de Αβι^2 e seu clearance com a resultante agregação do primeiro, o peptídeo de 42 resíduos em seguida o peptídeo de 40 resíduos em placas citotóxicas, é apoiado por evidência disponível. A evidência sugere fortemente, que defeitos em cada um desses quatro genes, predispõe o fenótipo AD em (1) intensificando a produção e/o deposição dos peptídos Αβν42 ou (2) diminuindo o clearance de ApoE4 do tecido (Selkoe, J Biol. Chem, 1996, 271:1829518298).
Dos dados disponíveis parece que, peptídeos Αβι-42 agregados, porém, não monoméricos podem induzir disfunção celular e morte in vitro em uma faixa de mecanismos presumivelmente inter-relacionados. Estes incluem lesão oxidativa (Thomas et al., Nature, 1996; 380:168-171, Behl et al.,
Cell 1994, 77:817-827), alterações na homeostase do cálcio intracelular (Arispe et al., Proc Natl Acad Sei USA, 1993, 90;567-571) e reorganização citoesquelética (Busciglio et al., Neuron, 1995, 14:879-888). Desenvolveu-se conhecimento suficiente de algumas das principais etapas na cascata induzida por amilóide, mesmo sendo a hipótese de cascata fortemente contestada.
Tentativas farmacológicas de identificar moléculas pequenas que poderíam inibir uma ou outra etapa da cascata amilóide-induzida estão em andamento. De interesse particular são duas abordagens: tentativas em interferir com a agregação dos peptídeos Αβι.42 diminuindo-se a secreção dos peptídeos Αβι-42 da células neuronais e gliais ou inibir a toxicidade que esses agregados extracelulares produzem nos neurônios e células glial e seus processos. Uma terceira abordagem tenta controlar a resposta inflamatória especializada que parece ser acionada por ΑβΊ.42 agregado (incluindo estímulo microglial, ativação da cascata complementar clássica, liberação de citocina, e astrocitose reativa) pode provar ser benéfica para pacientes de Alzheimer.
A parte das abordagens farmacológicas supramencionadas, para intervenção de AD, intervenções imunológicas também foram tentadas. Soloman et al., (Proc. Natl Acad. Sei, 1996, 93:452-455, Proc Natl Aca. Sei 1997, 94:4109-4112) mostrou que, três anticorpos monoclonais específicos direcionados a um sítio na região N-terminal do peptídeo ΑβΊ_42 de humano, ligam-se em graus variados a fibrilas preformadas levando à sua desagregação e inibição de seu efeito neurotóxico. Os anticorpos também foram vistos prevenir a formação de ΑβΊ.42 fibrilar. Solomon et al., (WO 01/18169) também tentou preparar uma visão de fago de um epítopo do peptídeo ΑβΊ-42 e administrar o epítopo que apresentou o fago ou peptídeo contendo o epítopo intraperinonealmente a camundongos para solicitar anticorpos para o peptídeo Αβν^. O teste in vitro com fenocromocitoma de rato mostrou que, uma diluição 1:5 do antisoro evitou a neurotoxicidade de Αβι-42. O antisoro a uma diluição de 1:5 e 1:20 também demonstrou romper a estrutura fibrilar de Αβ in vitro com extensa deterioração da morfologia fibrilar. Contudo, o adjuvante usado para a primeira injeção foi Adjuvante Completo de Freund com o Adjuvante incompleto de Freund para a segunda injeção. Os adjuvantes usados são inteiramente inadequados para utilização em seres humanos. Alem disso, os níveis de anticorpos gerados eram baixos demais para serem eficazes, apesar do uso desses adjuvantes acrimoniosos.
Subseqüentemente, Schenk et al., (Nature, 1999: 400:173-177) mostraram que, a imunização com o peptídeo Αβι.42 inibe a formação de placas amilóide e os neuritos distróficos associados em uma modelo de camundongo de AD. Contudo, devido à baixa imunogenicidade do peptídeo Αβι-42, o método empregado precisou de administrações repetidas do antígeno com um adjuvante perigoso formador de lesão para obter os maiores níveis de anticorpos antiplaca Αβι-42 necessários para afetar a formação de placa. Além disso, advertiu-se que a imunização com Αβ^ poderia induzir mais acúmulo do próprio amilóide tóxico (Araújo, DM & Cotman, CW, Brain Res. 1992, 569, 141-145).
Apesar desses criticismos, estudos adicionais em modelos de camundongo AD transgênicos através de imunização ativa similar deram crédito às abordagens imunoprofilácticas e imunoterapêuticas para AD. Janus et al. (Nature, 2000, 408:979-982) descreveram a imunização peptídica Αβι-42 em uma modelo de camundongo para AD que reduziu o desajuste comportamental e as placas. Morgan et al. (Nature, 2000, 408-982-985) descreveu a vacinação com peptídeo Αβι.42 para evitar perda de memória no modelo de camundongo.
O suporte direto para eficácia de terapia imune surgiu da observação de que a administração periférica de anticorpos monoclonais ou policlonais contra peptídeo Αβι.42 reduziu a opressão amilóide (WO 99/27944, Bard et al., Nature Medicine 2000, 6:916-919). Apesar dos níveis relativamente modestos de soro, esses anticorpos passivamente administrados, monoclonais 3D6(anti^i-5) e 10D5(anti^i-12 ou policlonais anti^^, foram capazes de ingressar no sistema nervoso central. Então, os anticorpos ligaram-se às placas e induziram o clearance de placas amilóide preexistentes. Bard et al., descrevem que, quando examinados em ensaio ex vivo com cortes de cérebro de camundongos PDAPP (ou seja, transgênicos para um minigene APP acionado por um promotor do fator de crescimento derivado de plaqueta) ou tecido cerebral de paciente AD, anticorpos contra células da micróglia acionadas por Αβ-peptídeo a limpar as placas através de fagocitose mediada por receptor Fc, e subsequente degradação peptídica. Este estudo demonstrou, que, anticorpos passivamente administrados conta peptídeo Αβι.42 e a região N-terminal de Αβι-42 reduziram a extensão de deposição de placa em uma modelo de camundongo de AD, e que os anticorpos monoclonais ou anticorpos policlonais solicitados por vacinas direcionadas ao sítio são capazes de ingressar no SCN a níveis terapeuticamente relevantes.
Apesar das descobertas promissoras da intervenção imunológica em modelo de camundongos para AD, uma vacina contra AD adequada para seres humanos permanece muito distante (Chapman Nature, 2000, 408:915-916). O principal obstáculo reside no trabalho extenso necessário para projetar e formular uma composição imunogênica de utilidade para seres humanos, antes que uma vacina praticável para AD possa ser adquirida.
Alguns desses pontos de controvérsia que se apoiam em dados experimentais para orientação são: 1) Qual é o sítio alvo específico para reconhecimento do anticorpo dentro de Αβ? 2) Em que forma deveria o imunógeno se apresentar? 3) Que outros sítios necessários para inclusão antes de um imunógeno ser adquirido solicitariam um nível terapêutico de anticorpo?
4) O que é um sistema de distribuição de vacina eficaz empregando um adjuvante clinicamente aceitável para seres humanos?
Uma diferença principal existe entre o que foi apresentado na literatura e o que ainda precisa ser realizado. Qual é o sítio alvo específico adequado (ou seja a placa Αβ-ι-42 polimerizada ou o peptídeo Αβ^ solúvel monomérico) e como o sítio específico deve ser engenheirado geneticamente para intervenção imunológica. Apesar de algumas publicações 5.000 de Αβι-42 durante a última década, a hipótese de cascata amilóide é acirradamente debatida e a questão: a forma em que Αβι-42 deve ser usado para intervenção permanece controvertida. NO ponto crucial do problema questi7 onado por Terry e colaboradores, está a fraca correlação entre carga amilóide fibrilar e medidas da disfunção neurológica (The Neuropatholoqy of Alzheimer Disease and the Structure Basis of its Alterations, Ed. by Terry et al., Alzheimer Disease, p 187-206, Lippincott Williams and Wilkins, 1999).
Em pacientes AD, depósitos amilóides frequentemente formamse a uma distância do sítio do dano neuronal. A melhor correlação com demência patológica é a perda de terminais sinápticos. Contudo, a perda de terminais sinápticos correlaciona-se fracamente com a carga amilóide. Caso as manifestações de doença correlacionem-se fracamente com a carga amilóide, então qual é o papel de Αβ? O artigo de Klein et al, intitulado: Targeting small Αβι.42 oligomers: the solution to an Alzheimer's disease conumdrum? {Trends in Neuroscience, 2001, 24:219-224) sugere que as fibrilas não sejam a única forma tóxica de Αβ, e talvez não a neurotoxina que é mais relevante para AD. Oligômeros pequenos e protofibrilas também denominados como ligantes difusíveis derivados de Αβι.42 (ADDLs) também podem ter atividade neurológica tóxica potencial.
Uma vacina AD para intervenção imunológica de sucesso irá requisitar um imunógeno destinado a solicitar anticorpos com alta afinidade direcionada ao sítio, que se ligam às placas senis no tecido cerebral para acelerar o clearance da placas por células gliais, e imunoneutralizar as toxinas derivadas de Αβ solúvel.
O problema de desenvolver anticorpos direcionados ao sítio com alta afinidade contra peptídeos sítio-específicos fracamente imunogênicos é conhecido por décadas. Imunologistas e vacinologistas freqüentemente recorrem à abordagem do conjugado de proteína veículo hapten[peptídeo] clássico como demonstrado em WO 99/27944. Para o desenvolvimento de uma vacina direcionada ao sítio contra AD, Frenkel et al., tentaram a imunização contra placas de Αβι_42 por meio da administração de EFRH-fago {Proc Natl Acad Sei 2000, 97:11455-11459, WO 01/18169) como mencionado acima.
As tentativas: usando agregado de peptídeo Αβ^ ou conjugados de proteína veículo de fragmento peptídico Αβι.42 (WO99/27944) e usando fago filamentoso apresentando peptídeo EFRH como os agentes na indução de respostas imunológicas conta um depósito amilóide em uma paciente, são embaraçosas e ineficazes. Por exemplo, após a quarta imunização de 1011 fagos apresentando o epítopo EFRH, >95% dos anticorpos em soro imune de cobaias são contra os fagos. Apenas uma pequena população (<5%) dos anticorpos é contra o peptídeo Αβι-42 solúvel (Frenkel et al., Vaccine 2001, 19:2615-2619, WO 01/18169).
Métodos menos incômodos foram descritos em EP 526.511 e WO 99/27944 que apresentaram à administração do peptídeo Αβι-42 para tratar pacientes com AD pré-confirmada e a administração de Αβι-42 ou outros imunógenos a um paciente sob condições que geram uma resposta imune benéfica no paciente AD. contudo, uma revisão de WO 99/27944 mostra que há deficiências principais no projeto da vacina aí apresentada.
Em particular, o problema repousa na falta de um sistema de fornecimento de vacina farmaceuticamente aceitável e eficaz. WO 99/27944 revelou Αβν^ ou fragmentos ativos de Αβι-42 conjugado a uma molécula veículo tal com toxina da cólera como o componente de vacina ativo. Ver página 4 de WO 99/27944. Embora a página 5 ensine que uma composição farmacêutica compreendendo o imunógeno deve ser isenta de Adjuvante Completo de Freund (CFA) os únicos exemplos que mostram a eficácia da vacina Αβ i-42 para o tratamento de AD em camundongos transgênicos empregou grandes doses do peptídeo Αβ.42 agregado em CFA. Apesar de relatos repetitivos dos adjuvantes preferidos que devem ser usados com os agentes imunogênicos apresentados para intensificar a resposta imune, os dados experimentais demonstraram que, apenas as formulações empregando CFA/ICF providenciou um título suficientemente alto de anticorpos.
Ver página 25 de WO 99/27944. No exemplo 1, a eficácia profilática de Αβν42 contra AD foi demonstrada em camundongos PDAPP. Contudo, as formulações administradas consistem de uma dose de 100 ug por camundongo de Αβ42 agregado emulsificado em Adjuvante Completo de Freund [CFA] (p34 e WO 99/27944) seguido por doses de reforço múltiplas do mesmo peptídeo Αβι.42 emulsificado em Adjuvante incompleto de Freund.
No Exemplo IX, foram estudadas as respostas imune em camundongos para diferentes adjuvantes. Quando os adjuvantes: MPL, Alume, QS21 e CFA/ICFA foram usados com o imunógeno pretensamente potente AN1792 (ou seja, Αβ-ι-42 humano agregado), o nível de anticorpos para Αβι-4 foram reduzidos a um nível estatisticamente significante, em comparação com camundongos que receberam as vacinas CFA/ICFA. Ver Tabela 9 e páginas 59-64 de WO 99/27944.
No caso onde fragmentos de peptídeo Αβι-42 foram usados (peptídeos Αβι-42 humano de aminoácidos 1-5, 1-12, 13-28 e 33-42) cada fragmento foi conjugado para IgG anticamundongo de ovelha como 0 veículo de proteína. Em uma posterior descrição, a eficácia dos anticorpos para fragmentos peptídicos Αβ puderam apenas ser mostrados por imunização passiva com anticorpos monoclonais (Bard et al., Nature Medicine 2000, 6:916-919). A eficácia desses fragmentos conjugados a IgG anticamundongo de ovelha não foi demonstrada. Portanto, o único imunógeno mostrado como eficaz foi o peptídeo Αβι-42 agregado em CFA/ICFA.
Até o presente, todas as formulações de vacina mostraram ser eficazes empregaram CFA/IFA como adjuvante. Imunógenos peptídicos visando Αβι-42 foram assim, desde muito tempo, preparados por conjugação dos vários fragmentos Αβι-42 para imunoglobulina anticamundongo de ovelha, a conjugação de Αβ13-28 sintético através de éster m-maleimidobenzoilN-hidroxisuccinimida para anticorpo anti-CD3 ou o peptídeo Αβι.42 agregado sozinho. Esses imunógenos, ou seja, peptídeo Αβ42 sozinho ou conjugados de proteína Αβν42 peptídeo-veículo, foram emulsificados com adjuvante completo de Freund para a primeira imunização, seguido por reforços subseqüentes em adjuvante incompleto de Freund (Johnson-Wood et al., Proc Natl Acad Sei USA 1997; 94:1550-1555, Seubert et al., Nature, 1992 359:325-327, Schenk et al Nature, 1999, 400:173-177, Janus et al., Nature 2000 408:979-982, e Morgan et al., Nature 2000, 408-982-985). As formulações apresentadas em WO 99/27944 ou outros usando CFA e ICFA como adjuvantes ocasionam lesões e são severas demais para uso em seres humanos. Assim nenhuma das composições de vacina para AD descritas na técnica anterior são adequadas para uso em seres humanos.
Em suma, apesar das declarações que sugerem o potencial do peptídeo Αβι-42 para tratamento de AD em virtude das descrições antecedentes de Kline (EP 526.511) nenhum problema solucionando formulações de vacina foram oferecidas no ato em WO 99/27944 para solucionar este problema chave.
Uma outra desvantagem com os conjugados de proteína peptídeo-veículo e agregados Aβ 1.42 é que essas moléculas são altamente complexas e difíceis de caracterizar e é difícil desenvolver-se procedimentos de controle de qualidade eficazes para o processo de fabricação. Uma outra desvantagem é que, peptídeo Αβι-42 ou seus fragmentos são auto-moléculas quando administrados a seres humanos. Consequentemente, eles são menos imunogênicos ou não-imunogênicos em seres humanos. Torna-se, portanto, necessário desenvolver-se formulações de vacina clinicamente aceitáveis para administração em seres humanos.
Sabe-se que os epítopos Th desordenados podem ser empregados para provocar auxílio de célula T eficiente e podem ser combinados com epítopos de célula B fracamente imuogênicos para providenciar imunógenos potentes. Peptídeos quiméricos de epítopos de célula Th/B desordenados bem projetados demonstraram ser de utilidade na solicitação de respostas Th e resultantes respostas de anticorpo na maioria de membros de uma população geneticamente diferente, expressando haplotipos MHC diferentes. Th desordenados de uma série de patógenos, como proteína F do vírus do sarampo e antígeno superficial do vírus da hepatite B, são conhecidos. Tabelas 1 e 2 enumeram vários Th desordenados conhecidos que demonstraram ser eficazes na potencialização de um peptídeo fracamente imunogênico curto, o decapeptídeo do hormônio LHRH (US 5.759.551 e 6.025.468).
Epítopos Th potentes variam em tamanho de aproximadamente 15-40 resíduos de aminoácido em comprimento, freqüentemente dividem características estruturais comuns, e podem conter seqüências de demarcação específicas. Por exemplo, uma característica comum de um Th é que ele contém hélices antipáticas, estruturas alfa-helicoidal com resíduos de aminoácido hidrofóbicos dominando um lado da hélice com resíduos carregados e polares dominando os lados circundantes (Cease et al., Proc Natl Acad Sei USA 1987, 84:4249-4253). Os epítopos, freqüentemente, contêm padrões de aminoácido primários adicionais como Gly ou resíduo carregado seguido por dois ou três resíduos hidrofóbicos, seguido, por sua vez, por um resíduo carregado ou polar. Este padrão define o que se denomina de seqüências Rothbard. Epítopos Th freqüentemente obedecem a regra 1,4,5, 8, onde um resíduo positivamente carregado é seguido por resíduos hidrofóbicos na quarta, quinta e oitava posição após o resíduo carregado. Visto que todas essas estruturas são compostas de aminoácidos hidrofóbicos, carregados e polares, cada estrutura pode existir simultaneamente dentro de um único epítopo Th (Partidos et al., J Gen Virol, 1991,72:1293). Quase todos, se não todos, os epítopos de célula T desordenados ajustam-se a pelo menos uma das periodicidades acima descritas. Essas características podem ser incorporadas aos projetos de sítios Th artificiais idealizados, incluindo epítopos Th combinatoriais. Com relação ao projeto de sítios Th combinatoriais, estão disponíveis relações de posições variáveis e aminoácidos preferidos para motivos de ligação a MHC (Meister et al., Vaccine, 1995: 13:581-591). Além disso, um método de produzir Th combinatorial foi revelado para peptídeos de biblioteca combinatorial denominada biblioteca de antígeno sintético estruturado (Wang et al., WO 95/11998). Assim, a regra 1, 4, 5, 8 pode ser aplicada juntamente com motivos de ligação a MHC combinatorial conhecidos para conceder posições invariáveis e degeneradas em uma sítio Th combinatorial e a selecionar resíduos para sítios degenerados para ampliar extensamente a faixa de receptividade de um Th artificial Ver, Tabela 2 WO 99/66957, e WO 95/11998.
Wang et al. (U.S. 5.759.551) sugeriu o uso de elementos imunoestimuladores para tornar a autoproteína Amilina, imunogênica. Wang et al., sugeriram à administração de peptídeos amilina sintéticos imunogênicos como vacinas para o tratamento de diabetes mellitus não dependente de insulina (NIDDM) uma doença amiloidogência ocasionada por superprodu12 ção de Amilina (coluna 19, linhas 9-39, Patente US. 5.759.551). A amilina é um hormônio petídico de 37 resíduos de aminoácido produzido por células β das ilhotas de Langerhans. A superprodução de Amilina resultará na deposição de amilóide insolúvel levando à doença amiloidogênica no pâncreas. Similar à superprodução de Amilina, a superprodução do peptídeo Αβι.42 levará à deposição de amilóide insolúvel no cérebro de pacientes AD. Contudo, há uma homologia de seqüência limitada entre a Amilina e peptídeo Αβι.42. Apenas um curto prolongamento de resíduos de aminoácido, VGSN de Amilina 32=35 corresponde a Αβ24-27. Anticorpos produzidos contra o peptídeo amilina não é esperado ser de reação cruzada a peptídeos Αβι-42 solúveis, tampouco acelera o clearance de placas amilóides no cérebro em virtude dos estudos por Soloman et al, e Schenk et al., que mostraram que a seqüência EFRH é crítica.
É objetivo da invenção desenvolver um imunógeno que permitirá a geração de altos níveis de anticorpos de alta afinidade contra o sítio funcional N-terminal de peptídeo Αβ-ι-42 com alta reatividade cruzada à placas senis no cérebro de pacientes AD. Considera-se que, os anticorpos gerados por ligação ao peptídeo Αβι.42 θ à placas senis acelerem 0 clearance dessas placas do cérebro, promovendo desagregação fibrilar, inibindo a agregação fibrilar e a imunoneutralização das toxinas derivadas de Αβ-solúvel (também denominado como ligantes difusíveis derivados de Αβ ou ADDLs).
É ainda um outro objetivo da presente invenção desenvolver uma veículo fornecedor de vacina adequado para uso humano ou veterinário na profilaxia e tratamento da Doença de Alzheimer.
Breve Descrição dos Desenhos
Figuras 1a, 1b, 1c, 1 d, 1e e 1f são fotografias mostrando o manchamento com imunoperoxidase de cortes seriais de 2 cérebros AD, usando 0 método Completo de Anticorpo Avidina-Biotinilado (ABC) com soro imune e pré-imune a uma diluição de 1:100 com um aumento de 10X. As figuras 1a, e 1d mostram a ligação significativa de anticorpos a ambas as placas senis e placas Αβ (ambas rotuladas de P) em vasos sangüíneos tioflavina S positivos (rotulados como BV). Os anticorpos foram gerados em cobaias usando Th1-16 Αβι.28.εΚ-ΜνΡ (SEQ ID NO:74) preparados em emulsão água-em-óleo ISA51. As figuras 1b e 1e mostram a reatividade cruzada dos anticorpos crescidos contra o mesmo imunógeno peptídico em CFA/ICFA. Figura 1c e 1f mostram cortes cerebrais usando soros pré-imunes.
AS Figuras 2a, 2b, 2c, 2d e 2e são fotografias mostrando manchamento com imunoperoxidase de cortes seriais de cérebro AD com soros imune e pré-imunes a uma diluição 1:100 e sob aumento de 40X. As figuras 2a e 2d mostram os anticorpos em cobaias imunizados com Th1-16 Αβι_28. εΚ-MVF (SEQ ID NO.74) preparados em emulsão água-em-óleo ISA51 com manchamento acentuado das placas (P) que formam um padrão de núcleos. A figura 2b é uma fotografia do padrão de manchamento de cortes de cérebro de cobaias AD usando o mesmo imunógeno em formulação CFA/ICFA. O anti-soro reagiu predominantemente com placas nos vasos sangüíneos (BV). A figura 2c é uma fotografia de um corte de cérebro de cobaias com soro pré-imune e não mosram manchamento. A figura 2c mostra o corte do cérebro com soros hiperimunes gerados por imunização com peptídeo Αβι.28 sozinho em CFA/ICFA mostrando um padrão de manchamento surpreeendentemente fraco, apesar da forte reatividade com Αβι.28 por ELISA.
Breve Descrição da Invenção
A presente invenção refere-se a uma composição imunogênica compreendendo peptídeos sintéticos capazes de induzir anticorpos contra o sítio funcional/regulatório principal do peptídeo Αβ com alta reatividade cruzada, tanto ao peptídeo Αβι^2 solúvel e as placas no cérebro de pacientes com Doença de Alzheimer (AD). A composição imunogênica quando administrada a pacientes AD ou a uma pessoa predisposta a AD é esperada acelerar o clearance de placas amilóide e a imunoneutralização de toxinas derivadas de Αβ solúvel no cérebro para prevenir e tratar AD. Em particular, um imunógeno peptídico desta invenção compreende um epítopo TH selecionado dentre o grupo que consiste na SEQ ID N-: 1-64 e os análogos imunologicamente funcionais destes ligados a um fragmento de peptídeo Αβι-42 N-terminal curto selecionado dentre o grupo que consiste em 10 a 28 resíduos de aminoácidos compreendendo EFRH do peptídeo Αβι.42, SEQ ID
NO:65, ou um análogo imunologicamente funcional do fragmento de peptídeo Αβι-42· De preferência o fragmento de peptídeo Αβι_42 é selecionado do grupo de SEQ ID NOS: 66-69 ou um seu análogo imunologicamente funcional deste.
A presente invenção propicia ainda uma composição imunogênica compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição peptídica em uma formulação de vacina farmaceuticamente aceitável compreendendo um adjuvante ou emulsificante selecionado dentre o grupo que consiste na liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A monofosfiril emulsigeno (MPL) polisorbato 80, QS21, Montanide ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720, bem como os outros adjuvantes eficazes e emulsificantes.
A presente invenção providencia ainda um método para indução do clearance acelerado das placas amilóide e a imunoneutralização das toxinas solúveis Αβ-derivadas no cérebro, evitando e tratando a Doença de Alzheimer em uma mamífero, por administração de um ou mais peptídeos imunogênicos ao mamífero durante um tempo e sob condições suficientes para induzir anticorpos direcionados contra o sítio funcional/regulatório do peptídeo Αβι-42· Um exemplo típico de uma vacina da presente invenção é uma composição peptídica aproximadamente 5-1000 pg do imunógeno peptídico em uma vacina formulada como uma emulsão água-em-óleo em uma adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável. Um método típico de administração da vacina é injetar as formulações de vacina intramuscularmente a 0,5-2 ml por dose em uma programa de imunização de 0, 4 e 8 intervalos semanais.
Ainda um outro aspecto da invenção refere-se a um peptídeo sintético imunogênico de cerca de 30 a cerca de 60 aminoácidos consistindo em um epítopo (Th) de célula T auxiliar, ligado a um fragmento de peptídeo Αβι -42 N-terminal selecionado dentre o grupo que consiste em 10a 28 aminoácidos com cada fragmento compreendendo o resíduo 1 de aminoácido do peptídeo Αβι_42. Ver SEQ ID NO:65 onde D, ácido aspártico, é indicado como o resíduo 1 de aminoácido. De preferência o fragmento peptídeo Αβι-42 N-terminal é selecionado do grupo de SEQ ID NOS: 66-69 ou um análogo peptídico do fragmento N-terminal do peptídeo Αβι-42. Opcionalmente, espaçadores de aminoácido para separar os domínios imunogênicos podem ser incluídos. Os elementos do domínio imunogênico separados por espaçadores podem ser covalentemente ligados em qualquer ordem, contanto que, ou a imunorreatividade do peptídeo haptênio seja substancialmente preservada, ou que a imunorreatividade do fragmento do peptídeo Αβ N-terminal, peptídeo Αβι-42 solúvel e as placas sejam geradas.
Um fator importante que afeta a imunogenicidade de um peptídeo sintético para um imunógeno de fragmento Αβι-42 N-terminal é sua apresentação ao sistema imune pelos epítopos (Th) de célula auxiliar T. Tal Th é mais confiavelmente fornecido ao imunógeno peptídico por epítopos Th exógenos colocados em um elemento do domínio peptídico Th separado que sejam extrínsecos ao peptídeo ΑβθΙνο. Tais imunógenos peptídicos podem ser produzidos como polipeptídeos híbridos por expressão de DNA recombinante. Eles podem também ser mais simplesmente e menos onerosamente fornecidos como um imunógeno peptídico sintético compreendendo o sítio de célula B haptênio alvo do peptídeo Αβ e epítopos auxiliares T (Th) apropriados para o hospedeiro. Tais peptídeos reagem com receptores de célula auxiliar T e a classe II de moléculas MHC, além dos sítios de ligação ao anticorpo. (Babbitt et al., Nature, 1985, 317:359) e assim estimulam uma resposta ao anticorpo estritamente sítio-específico para o sítio de ligação ao anticorpo alvo.
Anteriormente tal Th era fornecido por imunógenos peptídeo Αβι42 elaborados por Th intrínseco ao peptídeo Αβ de comprimento total agregado (WO 99/66957, WO 1999/27944, Janus et al., 2000, Morgan et al., 2000) e podem ser fornecidos por proteína veículo. Um imunógeno peptídico totalmente sintético desfruta das seguintes vantagens sobre agregados de peptídeo Αβν^, conjugados veículo e polipeptídeos recombinantes pelo fato do produto ser quimicamente definido para facilidade de controle de qualidade. O imunógeno peptídico sintético é estável. Não elabora processamento a jusante, tampouco uma instalação de fabricação é necessária. A resposta imune é sítio-específica e focalizada no Αβ alvo e não ao veículo. Assim, respostas indesejáveis tais como supressão epitópica são evitada.
A imunogenicidade dos imunógenos peptídicos Αβ direcionados ao sítio, com funcionalidade N-terminal e sintéticos pode ser otimizada por (1) combinando o fragmento peptídeo Αβι-42 N-terminal com sítios Th desordenados exógenos selecionados aos quais a maioria de uma população é sensível, e (2) combinando o fragmento peptídico Αβ com Th cujo repertório é ampliado através da química combinatorial e, por isso acomoda-se às receptividades imune variáveis de uma população geneticamente diferente.
Descobriu-se que, a composição de peptídeos da presente invenção é eficaz na estimulação da produção de anticorpos contra o sítio funcional/regulatório principal do peptídeo Αβ, com reatividades cruzadas a Αβν 42 solúvel e as placas nos cérebros de pacientes AD. Com base nos dados de imunogenicidade obtidos em cobaias e babuínos, e os dados obtidos do manchamento com imunoperoxidase das placas amilóide presente em cortes cerebrais de AD humano por soros imunoespecíficos obtidos, espera-se que os imunógenos peptídicos da presente invenção formulados apropriadamente sejam eficazes em seres humanos. Deve-se observar que, os dados obtidos em babuínos são particularmente significativos, pelo fato de ser esta uma espécie cuja resposta imune, assemelha-se aproximadamente com a dos seres humanos.
Descrição Detalhada da Invenção
Esta invenção dirige-se a uma nova composição peptídica para geração de anticorpos policlonais com alta titulação com especificidade para sítio funcional/regulatório principal do peptídeo Αβ, com reatividade cruzada a Αβι.42 solúvel e placas no cérebro de pacientes (AD) Doença de Alzheimer. Os anticorpos gerados pela composição peptídica são altamente sítio específicos e ligam-se a peptídeos Αβ e às placas amilóides no cérebro. Portanto, a presente invenção propicia um método eficaz para acelerar 0 clearance das placas amilóide e imunoneutralização de toxinas derivadas de Αβ solúvel nos cérebros, para prevenção e tratamento de AD.
Fragmentos de peptídeo Αβι.42 N-terminal selecionados do grupo que consiste em 10 a 28 aminoácidos onde cada fragmento compreende
EFRH do peptídeo Αβι.42 (SEQ ID NO:65), são peptídeos lineares curtos que, por si mesmos, são não-imunogênicos. Os fragmentos de peptídeo Αβν 42 curtos podem ser imunopotencializados por acoplamento químico a uma proteína-veículo, por exemplo, hemocianina de lapa (keyhole) (KLH) ou por fusão a um polipeptídeo veículo através de expressão de DNA recombinante, por exemplo, antígeno de superfície da hepatite B. A deficiência de tais vacinas de proteína veículo- peptídeos Αβ, é que a maior parte dos anticorpos gerados são anticorpos não-funcionais direcionados contra a proteína veículo.
Os imunógenos da presente invenção são imunógenos peptídicos inteiramente sintéticos compreendendo fragmento N-terminal do peptídeo Αβ-ι-42 de 10 a 28 aminoácidos com cada fragmento compreendendo EFRH do peptídeo Αβι.42 covalentemente ligado a epítopos Th desordenados selecionados dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1 a 64. Os imunógenos da invenção solicitam a produção de anticorpos específicos para sítio que se ligam ao peptídeo Αβ-ι-42 e seus agregados e são reativos por cruzamento com placas amilóide no cérebro conferindo clearance acelerado de placas amilóide e imunoneutralização de toxinas derivadas de Αβ solúvel no cérebro. Portanto, o imunógeno da presente invenção é de utilidade na prevenção e tratamento de AD.
Os epítopos (Th) de célula T auxiliares úteis na invenção compreendem motivos de ligação MHC de classe II múltiplos. São providenciados exemplos específicos de Th covalentemente ligado a um fragmento de peptídeo Αβι.42 N-terminal. O resultados do anti-soro de animais imunizados com os peptídeos imunógenos da presente invenção demonstram que, anticorpos reativos de peptídeo Αβ direcionados ao sítio potentes são gerados, em uma população hospedeira geneticamente diversa.
Geralmente, 0 peptídeo imunogênico sintético da presente invenção é aproximadamente de 20 a 100 aminoácidos de comprimento e compreende:
(i) um epítopo (Th) de célula T auxiliar selecionado dentre 0 grupo consistindo na SEQ ID NOS: 1 a 64, (ii) um fragmento N-terminal de peptídeo Αβ-1.42 de cerca de 10 a cerca de 28 resíduos de aminoácido onde cada fragmento compreende EFRH do peptídeo Αβι-42, e (iii) opcionalmente, um espaçador consistindo na pelo menos um aminoácido para separar os domínios imunogênicos.
De preferência, o fragmento N-terminal do peptídeo ΑβΊ.42 é selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NOS: 66-69 e um análogo imunologicamente eficaz destas. O peptídeo Th é covalentemente ligado a ou o N- ou C- terminal do fragmento N-terminal do peptídeo Αβ-ι-42, opcionalmente com um espaçador (por exemplo, Gly-Gly, ε-Ν Lys).
O imunógeno peptídico desta invenção está representado por uma das seguintes fórmulas:
(A)n-(fragmento N-terminal do peptídeo Αβ1-42)-(Β)ο-(Τή)πι-Χ, ou (A)n-(Th)m-(B)o-(fragrnento N-terminal do peptídeo Αβι.42)-Χ, onde cada A é independentemente um aminoácido, cada B é um grupo de ligação selecionado do grupo que consiste em um aminoácido, Gly-Gly, (a, s-N)Lys, Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO:73).
Cada Th compreende uma seqüência de aminoácido que constitui um epítopo de célula T auxiliar ou um análogo ou segmento deste, intensificador imune, (fragmento N-terminal do peptídeo Αβι.42) é um antígeno direcionado ao sítio de célula B peptídica sintético e é um fragmento de cerca de 10 a cerca de 28 resíduos de aminoácido, onde cada fragmento compreende EFRH do peptídeo Αβι.42 ou um análogo imunologicamente funcional deste,
X é um α-COOH ou a-CONH2de um aminoácido, n é de 0 a cerca de 10, m é de 1 a cerca de 4, e o é de cerca de 0 a cerca de 10.
O imunógeno peptídico da presente invenção compreende de cerca de 20 a cerca de 100 resíduos de aminoácido, de preferência de cerca de 25 a cerca de 60 resíduos de aminoácido. De preferência o (fragmento Nterminal de peptídeo Αβ1-42) é selecionado dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOS: 66-69 e preferivelmente o epítopo Th é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 20, 38-40, 47-51 e 52-54. De preferência m = 1 e o = 1 ou 2.
Quando A é um aminoácido ele é um aminoácido de ocorrência não natural ou de ocorrência natural. Aminoácidos de ocorrência não-natural incluem sem limitação a, ε-Ν Lisina, β-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, ácido γ-aminobutírico, homoserina, citrulina e similares. Aminoácidos de ocorrência natural incluem alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina. Quando m é maior do que um e dois ou a maioria de A são aminoácido, então cada aminoácido pode ser independentemente, igual ou diferente. (A)n pode incluir um espaçador, por exemplo, Gly-Gly, ε-Ν Lys.
B é um espaçador e é um aminoácido que pode ser aminoácidos de ocorrência natural ou de ocorrência não-natural, conforme acima. Cada B é independentemente igual ou diferente. Os aminoácidos de B podem também providenciar um espaçador, por exemplo, Gly-Gly, ε-Ν Lys ou lisina entre o epítopo Th desordenado e o fragmento N-terminal do peptídeo Αβ^ (por exemplo, SEQ ID NOS: 66-69) ou um seu análogo imunologicamente funcional. Além disso, por separação física do epítopo Th do epítopo de célula B, ou seja, os fragmentos N-terminais do peptídeo Αβι-42 ou seu análogo imunologicamente funcional, o espaçador Gly-Gly ou ε-Ν Lys podem romper quaisquer estruturas secundárias ilusórias criadas pela união do epítopo Th com um fragmento N-terminal do peptídeo Αβι.42 ou de seu análogo imunologicamente funcional, e daí, eliminar a interferência entre as respostas Th e/ou célula B. Os aminoácidos de B também podem formar um espaçador que age como uma articulação flexível que intensifica a separação do Th e dos fragmentos N-terminais do peptídeo Αβι-42· Exemplos de seqüências codificando articulações flexíveis são encontrados na região de articulação de cadeia pesada da imunoglobulina. Seqüências de articulação flexíveis são freqüentemente ricas em prolina. Uma articulação flexível particularmente útil é provida pela seqüência Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO:77), onde Xaa é qualquer aminoácido, e, de preferência ácido aspártico. A separação conformacional providenciada pelos aminoácidos de B permite interações mais eficientes entre o imunógeno peptídico apresentado e as células Th e B apropriadas para melhorar as respostas imune para o epítopo Th e o epítopo solicitando anticorpo ou seus análogos imunologicamente funcionais
Th é uma seqüência de aminoácidos (aminoácidos de ocorrência natural ou não-natural) que compreende um epítopo Th. Um epítopo Th pode ser um epítopo contínuo ou descontínuo. Em uma epítopo Th descontínuo, nem todo aminoácido de Th é necessário. Um epítopo Th ou um seu fragmento ou análogo é capaz de intensificar ou estimular uma resposta imune ao fragmento N-terminal de peptídeo Αβι.42. Epítopos Th que são imunodominantes e desordenados são altamente e amplamente reativos por toda as populações animais e humanas com tipos MHC em muito, divergentes (Partidos et al., 1991, US 5.759.551). O epítopo Th dos presentes peptídeos é de cerca de 10 a 50 aminoácidos, de preferência de cerca de 10 a cerca de 30 aminoácidos. Quando epítopos Th múltiplos estão presentes (ou seja, m > 2) cada epítopo Th pode ser igual ou diferente. Um segmento Th compreende uma parte adjacente de um epítopo Th suficiente para intensificar ou estimular uma resposta imune para o fragmento N-terminal do peptídeo Αβι-42·
Epítopos Th da presente invenção incluem aqueles derivados de patógenos estranhos incluindo sem estar a eles limitado, aos exemplificados na Tabela 1 (SEQ ID NOS: 1-21), Além disso, epítopos Th incluem Th artificial idealizado e Th combinatorial artificial idealizado apresentado em WO 99/66957 e aqui relacionado na Tabela 2 como SEQ ID NOS: 22-64. Peptídeos compreendendo Th combinatorial são produzidos simultaneamente em uma síntese peptídica de fase sólida única, in tandem, com o fragmento Nterminal do peptídeo Αβι-42, A e B. Os epítopos Th também incluem seus análogos imunologicamente funcionais com substituições conservativas, adições, deleções e inserções de um a cerca de 10 resíduos de aminoácidos, desde que a função estimulante de Th não seja essencialmente modificada.
Nos peptídeos sintéticos desta invenção, o epítopo Th é covalentemente ligado através de um espaçador B a, seja o N-terminal ou Cterminal do fragmento N-terminal do peptídeo Αβι_42 ou de um seu análogo imunologicamente funcional. Um análogo imunologicamente funcional do fragmento N-terminal de peptídeo Αβι.42 pode compreender substituições, adições, deleções ou inserções conservativas de um a cerca de quatro resíduos de aminoácido desde que, respostas imune que sejam de reação cruzada com os peptídeo Αβ^2 sejam solicitadas. As substituições conservativas, adições e inserções podem ser realizadas com aminoácidos de ocorrência natural ou não-natural conforme acima.
Os imunógenos peptídicos preferidos desta invenção são os que compreendem o fragmento N-terminal dos fragmentos de peptídeo Αβι.42 selecionados dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOS: 66-69 ou um seu análogo imunologicamente funcional, um espaçador (por exemplo, GlyGly, ε-Lys); um epítopo Th selecionado do grupo que consiste em um HBS, (SEQ ID NO: 1), HBC Th (SEQ ID NO:20),MVF Th (SEQ ID NO: 8,9), PT Th (SEQ ID NOS: 4, 5, 7), TT Th (SEQ ID NOS: 3, 4, 6), CT Th (SEQ ID NOS: 12, 21), DT Th (SEQ ID NO: 13, 14), Th artificial derivado de MVF Th selecionado dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOS 38-40, 47-51), Th artificial derivado de HBV Th selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOS; 52-54.
Ver Tabelas 1 e 2.
As composições peptídicas contendo um coquetel dos imunógenos peptídicos da presente invenção, com dois ou mais epítopos Th pode melhorar a eficácia imunológica em uma população mais ampla e, assim, providenciar uma resposta imune melhorada para os peptídeos Αβι_42 e seus fragmentos.
Os imunógenos peptídicos desta invenção, podem ser produzidos por métodos de síntese química dos versados na técnica comum. Ver, por exemplo, Fields et al., capítulo 3 em Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co. New York NY, 1992 pág 77. Daí os peptídeos podem ser sintetizados usando as técnicas de Merrifield automatizadas de síntese de fase sólida com o a-NH2 protegido por quimíca de, ou t-Boc ou F-moc usando aminoácidos protegidos na cadeia lateral, por exemplo, um Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A ou 431. A preparação dos constructos peptídicos compreendendo peptídeos de biblioteca combinatorial para epítopos Th pode ser realizada para providenciar uma mistura de aminoácidos alternativos por acoplamento a uma dada posição variável. Após montagem completa do imunógeno peptídico desejada a resina é tratada de acordo com procedimentos padrão para clivar o peptídeo da resina e desbloquear os grupos funcionais nas cadeias laterais de aminoácido. O peptídeo livre é purificado por HPLC e caracterizado bioquimicamente, por exemplo, por análise de aminoácido ou por seqüênciamento. Métodos de purificação e caracterização para peptídeos são do conhecimento dos versados na técnica.
O imunógeno da presente invenção também pode ser preparado como um polímero ramificado por síntese do constructo peptídico desejado diretamente em uma resina de núcleo poli-lisil ramificada (Wang, et al., Science 1991: 254:285-288).
Alternativamente, os imunógenos peptídicos sintéticos maiores podem ser sintetizados por técnicas de DNA recombinante conhecidas. Tais técnicas são providenciadas em manuais padrão conhecidos com protocolos detalhados. Para construir um gene codificando um peptídeo desta invenção, a seqüência de aminoácido é traduzida ao inverso para obter uma seqüência de ácido nucléico codificando a seqüência de aminoácido, de preferência com códons que são ótimos para o organismo em que o gene deve ser expressado. A seguir, é produzido um gene sintético, tipicamente por sintetização de oligonucleotídeos que codificam o peptídeo e quaisquer elementos regulatórios, caso necessário. O gene sintético é inserido em uma vetor de clonagem adequado, e transfectado em uma célula hospedeira. O peptídeo é a seguir expresso, sob condições adequadas apropriadas para o sistema de expressão selecionado e o hospedeiro. O peptídeo é purificado e caracterizado por métodos padrão.
A eficácia da composição peptídica da presente invenção pode ser confirmada por injeção a um animal, por exemplo, cobaias, com uma composição imunogênica compreendendo os peptídeos da invenção. Ver Tabela 4, SEQ ID NOS: 70-75. A resposta imune humoral para o fragmento N-terminal do peptídeo Αβι_42 e o peptídeo Αβι.42 solúvel é monitorada. Uma descrição detalhada dos procedimentos usados é dada nos Exemplos a seguir:
Um outro aspecto da invenção providencia uma composição peptídica compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um ou mais imunógenos peptídicos desta invenção em uma sistema de fornecimento farmaceuticamente aceitável. Portanto, a composição peptídica da invenção pode ser formulada como uma vacina usando adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, veículos ou outros ingredientes rotineiramente empregados na formulação de vacinas. Dentre os ingredientes que podem ser usados nesta invenção estão adjuvantes ou emulsificantes incluindo alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL) polisorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206, e ISA 720 Montanide, bem como os outros adjuvantes e emulsificantes eficazes. A composição pode ser formulada para liberação imediata ou liberação prolongada. A composição pode também ser formulada por indução de imunidade sistêmica, por exemplo, por aprisionamento ou co-administração com micropartículas. Tais formulações são prontamente disponíveis aos versados na técnica.
Os imunógenos da presente invenção podem ser administrados por qualquer via convencional, como subcutânea, oral, intramuscular, parenteral ou entérica. Os imunógenos podem ser administrados em uma dose única ou em múltiplas doses. Um programa de imunização adequado é prontamente determinado e disponível aos versados na técnica.
A composição peptídica da presente invenção compreende uma quantidade eficaz de um ou mais imunógenos peptídicos da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma tal composição em uma forma unitária de dosagem adequada, geralmente contém cerca de 0,25 μ9 a cerca de 500 μρ do imunógeno por kg de peso corporal. Quando liberado em múltiplas doses, a quantidade eficaz pode ser convenientemente dividida por unidade de dosagem. Por exemplo, uma dose inicial, por exemplo, 0,0025-0,5 mg por kg de peso corporal, de preferência 1-50pg por kg de peso corporal do imunógeno peptídico deve ser administrado por injeção, de preferência, intramuscular, seguido por doses de reforço repetidas de uma quantidade similar. A dosagem dependerá da idade, peso e saúde geral do indivíduo, como é do conhecimento da técnica de vacina e terapêuticos.
A resposta imune dos imunógenos de peptídeo Αβμ42 sintéticos pode ser melhorada, por liberação através de encerramento em micropartículas biodegradáveis do tipo descrito por 0'Hagan et al., (Vaccine 1991, 9:768-771). Os imunógenos podem ser encapsulados com ou sem um adjuvante em micropartículas biodegradáveis para potencializar respostas imune, e para providenciar liberação controlada com o tempo para respostas prolongadas ou periódicas, e para administração oral. (O'Hagan et al, 1991 e Eldridge et al., 1991,28:287-294).
Os exemplos a seguir são dados para ilustrar a invenção. O escopo da invenção não deve ser limitado a imunógenos peptídicos específicos e composições providenciadas. Os exemplos demonstram que os imunógenos peptídicos da presente invenção são úteis para solicitar anticorpos direcionados ao sítio para fragmentos Αβ-ι-ι0 e Αβ-ι.14, bem como anticorpos de reação cruzada para peptídeos Αβι-42 solúveis tão próximos em termos de futuro quanto 4 semanas após a imunização inicial.
EXEMPLO 1
MÉTODOS TÍPICOS PARA SINTETIZAR IMUNÓGENOS DE PEPTÍDEO Αβ DA PRESENTE INVENÇÃO
Imunógenos peptídicos relacionados na tabela 4 (SEQ ID NOS: 70-76) foram sintetizados individualmente pela técnica de síntese de fase sólida Merrifield em sintetizadores peptídicos automatizados da Applied Biosystems (Models 430, 431 e 433A) usando química Fmoc. A preparação dos imunógenos peptídicos compreendendo uma biblioteca combinatorial
Th, ou seja, sítio Th artificial idealizado como Th1-8 derivado de MvF (SEQ ID Nos. 38-40), pode ser realizada providenciando-se uma mistura dos aminoácidos desejados para acoplamento químico a uma dada posição conforme especificado no projeto. Após conjunto completo do peptídeo desejado, a resina foi tratada de acordo com procedimento padrão usando ácido trifluoracético para clivar o peptídeo da resina e desbloquear os grupos protetores nas cadeias laterais de aminoácido. Os peptídeos clivados, extraídos e lavados foram purificados por HPLC e caracterizados por espectrometria de massa e HPLC de fase reversa.
EXEMPLO 2
AVALIAÇÃO DA IMUNOGENICIDADE DOS IMUNÓGENOS PEPTÍDICOS Αβ DA PRESENTE INVENÇÃO
Imunógenos peptídicos Αβ-derivados foram avaliados em grupos de cobaias conforme especificado pelo protocolo de imunização experimental resumido abaixo e por ensaios sorológicos para determinação da imunogenicidade.
Projeto Experimental Padrão:
Imunógenos (1) imunógeno peptídico individual ou (2) uma mistura de imunógenos peptídicos molares iguais, conforme especificado em cada exemplo.
Dose: 100 gg em 0,5 ml, por imunização, a menos que, de outro modo indicado
Via: intramuscular, a menos que de outro modo indicado.
Adjuvantes: Adjuvante Completo de Freund (CFA)/ Incompleto
Adjuvante (IFA), ou água em emulsões oleosas, a menos que, de outro modo indicado.
Grupos CFA/IFA receberam CFA semana 0, e IFA em semanas subseqüentes.
Programa de Dosagem: 0, 3 e 6 semanas ou, conforme indicado.
Programa de sangramento: semanas 0, 5, 8 ou conforme indicado.
Espécies: Cobaias Duncan-Hartley, ou conforme indicado.
Ensaio: ELISAs específicos, para cada atividade antipeptídeo de soro imune. O substrato de fase sólida foi o fragmento peptídico Αβ por exemplo, Αβι.14 ou Αβ1.42 de comprimento total (SEQ ID NOs: 67 e 65). O sangue foi coletado e processado no soro, e armazenado antes do ensaio ELISA com os peptídeos alvo.
A imunorreatividade dos anticorpos solicitados contra peptídeos Αβ e contra os peptídeos Αβι.42 solúveis foi determinada por ELISAs (ensaios imunoabsorventes ligados à enzima) usando placas de microtítulo de fundo chato de 96 cavidades, que foram revestidas com os fragmentos de peptídeo Αβι-42, SEQ ID NOs: 67 ou 65 como o imunoabsorvente. Alíquotas (100 μΙ) da solução imunogênica peptídica a uma concentração de 5 pg/ml foram incubadas durante 1 hora a 37°C. As placas foram bloqueadas por uma outra incubação a 37°C por 1 hora com uma solução de gelatina/PBS a 3%. As placas bloqueadas foram a seguir secas e usadas para o ensaio. Alíquotas (100 μΙ) dos soros imune do teste, iniciando com uma diluição de 1:100 em uma tampão de diluição da amostra e diluições seriais de dez vezes, foram a seguir, adicionadas para as placas revestidas de peptídeo. As placas foram incubadas por 1 hora a 37°C.
As placas foram lavadas seis vezes com tampão PBS/Tween® a 0,05%. 100 μΙ de anticorpo específico para anti-espécies de cabra rotulado com peroxidase de rábano silvestre foi adicionado a diluições apropriadas em tampão de diluição de conjugado (tampão de fosfato contendo NaCI 0,5M e soro de cabra normal). As placas foram incubadas por 1 hora a 37°C antes de serem lavadas como acima. Alíquotas (100 μΙ) da solução de substrato o-fenilenodiamina foram a seguir adicionadas. Deixou-se a cor desenvolver por 5-15 minutos antes da reação de cor enzimática ser interrompida por adição de 50 μΙ de H2SO4 2N. A A492nm dos teores de cada cavidade foi lida em uma leitora de placa. Títulos ELISA foram calculados com base na análise de regressão linear das absorbâncias, com segmentos A492nm ajustados a 0,5. O valor de segmento escolhido foi rigoroso com os valores para amostras de controle normais diluídas sendo inferiores a 0,15.
EXEMPLO 3
CARACTERIZAÇÃO DAS IMUNOGENICIDADES RELATIVAS DE Αβι-4? E DE SEUS FRAGMENTOS N-TERMINAIS PARA OTIMIZAÇÃO DO PROJETO PARA VACINA SINTÉTICA COM BASE EM PEPTÍDEO Αβ
DIRECIONADO AO SÍTIO
Para um modelo de vacina sintética total que gere um alto nível de anticorpos de alta afinidade contra os peptídeos Αβ com alta reatividade cruzada para os peptídeos Αβι-42 solúveis e as placas no cérebro de pacientes AD, foram caracterizadas, inicialmente as imunogenicidades relativas de Αβτ-42 e de seus fragmentos N-terminais. De modo a determinar as propriedades imunológicas relativas de várias regiões dentro do peptídeo Αβι-42, um adjuvante brando adequado para uso humano, alume, foi empregado no primeiro teste. As imunogenicidades relativas de peptídeo Αβ^ e um seu fragmento N-terminal, Αβι.28 foram comparadas. A avaliação da imunogenicidade foi realizada de acordo com procedimentos descritos no Exemplo 2. Inesperadamente, Αβι-2β foi visto ser mais imunogênico do que peptídeo Αβν 42, indicando que há uma imunossupressão dentro do fragmento C-terminal Αβ29-42 (Tabela 5).
A seguir, as imunogenicidades de Αβι-28 foram comparadas com Αβν-14, um fragmento N-terminal mais curto de Αβι-42. Um adjuvante mais potente adequado para uso humano (Montanide ISA51, Seppic, Paris, FR), foi empregado para preparação de uma emulsão água-em-óleo para formular a vacina. Com base nos dados obtidos, como se demonstra na Tabela 6, as imunogenicidades relativas para três peptídeos Αβ (ou seja, Αβνΐ4, Αβ-ι-28 e Αβι-42) foram classificadas Αβι.28> Αβ-|.42 > Αβ-ι-14. Surpreeendentemente, a perda do C-terminal 14 meros de Αβι-42 melhorou, ao invés de reduzir a imunogenicidade. A resposta de anticorpo contra Αβ é principalmente direcionada à região N-terminal, particularmente, 0 fragmento N-terminal Αβι-u como se vê nos dados ELISA (Tabela 6). Contudo, um outro encurtamento do fragmento Αβ-ι^άο C-terminal para formar 0 fragmento Αβι-14 resultou em perda da imunogenicidade.
O fragmento Αβ-ι-u contém o sítio funcional/regulatório principal,
EFRH localizado nas posições 3-6 do peptídeo Αβι_42 conforme relatado por Solomon et al. O bloqueio deste epítopo por anticorpos, modula a dinâmica da agregação, bem como a ressolubilização dos agregados já formados (Solomon et al., Proc Natl Acad. Sei, 1996, 93:452-455, Proc Natl Aca. Sei 1997, 94:4109-4112). A maioria dos anticorpos anti- Αβι-28 θ ΑβΊ-42 são direcionados contra o fragmento N-terminal do peptídeo Αβι.42 contendo este epítopo (Tabela 6). Contudo, o fragmento Αβι_ι4 por si mesmo, era fracamente imunogênico. Os resultados deste experimento sugere a presença de um epítopo Th intrínseco dentro do segmento Αβ-ι5-28. Este epítopo Th intrínseco responde pelas imunogenicidades mais fracas de peptídeos Αβι-28 θ Αβ-ι-42 em cobaias.
A presença de um epítopo Th no fragmento Αβ15.28 é desejável. Contudo, é conveniente ser capaz de engenheirar um imunógeno mais potente para uma vacina humana de sucesso quando se depara com a limitação de uma molécula MHC humana restrita, o número de doses apropriadas e o tipo de adjuvantes permitidos para uso humano. Conseqüentemente, tentou-se a ligação de um Th estranho ou extrínseco como aquele derivado de HBV Th (SEQ ID NO:1) ao C-terminal do peptídeo Αβι-28 (SEQ ID NO:66). O epítopo Th extrínseco aumento significativamente a imunogenicidade do fragmento Αβι^οοιτιο se vê na Tabela 6. A resposta do anticorpo ao imunógeno engenheirado com o fragmento Αβι-28 permaneceu direcionada para o fragmento N-terminal funcional do imunógeno peptídico (SEQ ID NO:70) fazendo deste constructo um imunógeno melhor do que o fragmento Αβι-28 ou somente fragmento Αβν42- Este imunógeno peptídico (SEQ ID NO:70) representa um imunógeno peptídico com a fórmula:
(A)n(fragmento N-terminal de peptídeo Αβ)-(Β)0-(ΤΙ)),η onde:
A é aNH2, sendo Αβι-28ιιιη fragmento N-terminal de Αβι.42)
B é glicina,
Th é um epítopo de célula T auxiliar derivado de um patógeno estranho,
HbsAg Th (SEQ ID NO:1) e onde n é 1, m é 1 eoé2.
EXEMPLO 4
LIMITE INFERIOR DO FRAGMENTO N-TERMINAL DE Αβ PARA O DESENVOLVIMENTO DE VACINA SINTÉTICA BASEADA EM Αβ
PARA AD
Visto estar o sítio funcional/regulatório principal compreendendo os resíduos EFRH localizado nas posições 3-6 do peptídeo Αβ1.42 (Soloman et al. Proc Natl Acad. Sei 1996, 93:452-455, Proc. Natl Aca. Sei 1997, 94:4109-4112) ele foi útil para explorar o fragmento N-terminal mais curto do peptídeo Αβι.42 como um sítio alvo de célula B ótimo em Αβ para incorporação ao imunógeno sintético da presente invenção.
Cada um dos vários fragmentos N-terminal não-imunogênicos curtos de Αβ, Αβι-w, Αβι_ι2, Αβν^, juntamente com Αβι.28ίοΐ incorporada aos imunógenos projetados com um Th artificial idealizado representativo (SEQ ID NO: 51). A ligação foi através de um espaçador εΝ-Lys. Os constructos engenheirados foram formulados com adjuvantes fortes, devido à baixa imunogenicidade esperada dos fragmentos Αβ curtos. Os três constructos sintéticos foram formulados em adjuvante completo e incompleto de Freund e testados quanto a suas imunogenicidades com base em procedimentos descritos no exemplo 2. Como se vê na Tabela 7, todos os quatro imunógenos peptídicos eram altamente imunogênicos com títulos ELISA Logio na faixa de 4,3 a 5,6 [ou seja, 1043 a 1056] com reatividades cruzadas muito elevadas ao peptídeo ΑβΊ.42 de comprimento total após apenas quatro semanas da imunização inicial. Mais importante, os fragmentos tão pequenos quanto Αβι_ι0> Αβι.Ί2 e Αβν14 cada qual ligados ao Th artificial idealizado (SEQ ID NO:51) foram vistos serem altamente imunogênicos após ligação ao epítopo Th artificial revelado (Tabela 7). Esses imunógenos peptídicos foram projetados de acordo com a fórmula:
(A)n-(fragmento N-terminal do peptídeo Αβ)-(Β)0-(ΤΚ)Γη onde:
A é aNH2, onde o fragmento N-terminal é Αβι-10, Αβι-ι2, Αβι-uou
Αβΐ-28.
B é ε-Ν-Liysina, um espaçador ligado através de seu grupo ε amino ao próximo aminoácido,
Th é um epítopo de célula T auxiliar derivado de um Th artificial idealizado,
MVF Th1 -16 (SEQ ID NO:51) onde n é 1, m é 1 e o é 1.
Descobriu-se que ulterior redução no comprimento do fragmento N-terminal de Αβ a menos que 10 meros resultaria em imunogenicidade mais limitada, portanto, indesejável. Parece que os peptídeos menores que 10 aminoácidos são problemáticos para reconhecimento do receptor pela classe II de molécula MHC (Immunology, Quinta edição, ed. Roitt et al, 1998, Mosby International Ltd, London, págs 88-89).
Com base neste teste de Αβ, o sítio de célula B útil derivado de Αβν42 deveria estar na faixa de tamanho de cerca de 10 a cerca de 28 resíduos.
Exemplo 5
IMUNORREATIVIDADE DIRECIONADA AO SÍTIO VISADA PELO IMUNÓGENO PEPTÍDICO SINTÉTICO LIGADO AO EPÍTOPO Th
ARTIFICIAL
O fragmento N-terminal não-imunogênico como ΑβΜ4 do peptídeo Αβ, foi ligado seja, através de um espaçador εΝ-lisina a um peptídeo Th artificial, projetado como MVF Th 1-16 (SEQ ID NO:51), ou através de um procedimento de acoplamento químico padrão a uma proteína veículo convencional KLH. Os dois constructos imunogênicos foram avaliados em cobaias quanto a suas relativas imunogenicidades direcionadas ao sítio para peptídeo Αβ e a resultante reatividade respectiva dos anticorpos no sentido de seus respectivos veículos, o epítopo Th artificial ou a proteína veículo KLH, de acordo com procedimentos descritos no Exemplo 2. O peptídeo Αβ-ιi4 curto sozinho como um imunógeno de controle e os dois constructos imunogênicos foram formulados em uma emulsão água-em-óleo contendo o adjuvante ISA51, uma formulação adequada para uso humano. Como se vê na Tabela 8, o fragmento N-terminal Αβι-ι4ροΓ si mesmo é não-imunogênico, conforme esperado. O imunógeno sintético compreendendo o fragmento Αβι.14β Th artificial (SEQ ID NO:73), foi visto ser altamente imunogênico em solicitar anticorpos direcionados ao sítio para Αβι-η- Os anticorpos também foram vistos ser altamente reativos por cruzamento a peptídeo Αβ-ι-42 tão logo como 4 semanas após a imunização inicial (títulos Logio de 4,094 e 4,126 por 4 e 6 semanas pós-imunização inicial respectivamente.) Quando esses soros imune com altos títulos Αβ-reativos foram testados por ELISA em placas revestidas no peptídeo MVF Th 1-16 (SEQ ID NO:51) foi visto serem negativos (título Logw de 0,038 e 0,064 por 4 e 6 semanas pósimunização inicial respectivamente) mostrando que anticorpos irrelevantes não foram produzidos. Os dados obtidos como se vê na Tabela 8 demonstram claramente a característica direcionada ao sítio altamente específica do imunógeno peptídico da presente invenção.
Os imunógenos com a proteína veículo KLH foi vista ser altamente imunorreativa com o conjugado de proteína veículo peptídeo convencional (por exemplo, títulos Logw de 4,903 e 5,018 por 4 e 6 semanas pósimunização inicial, respectivamente). Contudo, os anticorpos solicitados foram apenas moderadamente reativos cruzados com o peptídeo Αβι.42 solúvel (por exemplo, com títulos Logw de 3,342 e 2,736 por 4 e 6 semanas pósimunização inicial respectivamente.) Isto é aproximadamente 10X a 100X menos do que SEQ ID NO:73. Inesperadamente, os imunógenos peptídicos da presente invenção foram altamente direcionados ao sítio e reunidos. Apenas anticorpos de funcionalidade importante no sentido de sítios antiagregação e desagregação no fragmento N-terminal do peptídeo Αβ foram gerados, ao invés de sítios veículo irrelevantes.
EXEMPLO 6
AVALIAÇÃO DO IMUNÓGENO PEPTÍDICO Αβ POR REATIVIDADES CRUZADAS A PLACAS SENIS
Cérebros de pacientes AD com placas e emaranhados de vasos sangüíneos tioflavina S positivos (TSBV) contendo placas amilóide foram usados para avaliar as reatividades cruzadas a placas senis poliméricas dos soros imune crescidos em cobaias e babuínos contra imunógenos peptídicos Αβ. As reatividades de placas e TSBV foram detectadas por manchamento com imunoperoxidase usando método de Complexo anticorpo Avidina32 biotinilado (ABC) ou por manchamento imunofluorescente usando fragmento Fab conjugado com rodamina de espécies específicas anti-lgG. Todos os soros de cobaias foram testados a uma diluição de 1:100 com títulos finais determinados para algumas das amostras. Todos os soros de babuínos foram testados a uma diluição de 1:50. A avaliação dos soros imune e préimune foram gentilmente realizadas sob código do Dr. Gaskin conforme descrito (Gaskin et al. J. Exp. Med. 165:245, 1987).
Na Figura 1, cortes transversais em série de cérebros de 2 pacientes AD foram inicialmente examinados a uma magnitude de 10X. Cortes (a), (b) e (c) são do Cérebro 1 AD e (d), (e) e (f) são do cérebro AD 2. Soro normal pré-imune soros imunes de cobaias coletados em 6 semanas pósimunização inicial foram testados por manchamento com imunoperoxidase em cortes criostat do córtex temporal AD rico em placas e emaranhados neurofilamentosos (NFT). Os soros imune usados no primeiro teste vistos em lâminas nas Figuras 1a e 1d foram obtidos de animais imunizados com Αβι-28 -εΚ-MvF Th1-16 (SEQ ID NO:74) preparados em emulsão água em óleo ISA51. Os resultados mostram ligação significante a, tanto placas senis e placas amilóides nos vasos sangüíneos tioflavina S positivos (TSBV). As reatividades cruzadas dos soros imune elevados contra o imunógeno equivalente preparado em CFA/ICFA são mostrados nas lâminas nas Figuras 1b e 1d. Inesperadamente, em contraste com os resultados obtidos com a vacina formulada com ISA51, a ligação preferencial a placas Αβι-28 nos vasos sangüíneos (TSBV) foi observada para os soros elevados contra a vacina CFA/ICFA. Isto significa que os anticorpos solicitados pela vacina formulada com ISA51 é distinguível dos anticorpos elevados pela vacina formulada em CFA/ICFA. Além disso, anticorpos gerados pelas vacinas formuladas de acordo com a presente invenção providenciaram anticorpos que têm a desejada maior reatividade cruzada para placas senis no tecido cerebral. O soro pré-imune não conferiu manchamento nos cortes seriais correspondentes mostrados nas lâminas das Figuras 1c e 1f.
O manchamento com imunoperoxidase adicional dos cortes transversais seriais de cérebro AD 1 com soros pré-imune e imunes a uma diluição 1:100 são mostrados nas Figuras 2a a 2e a uma amplitude de 40X. O soros obtidos dos animais imunizados com Αβι-28--εΚ-ΜνΕ Th1-16 (SEQ ID NO:74) preparados em emulsão água -em-óleo ISA 51, mancharam fortemente as placas que formam um padrão de núcleos como se vê nas lâminas das Figuras 2a e 2d. Novamente, e com surpresa, o manchamento com soros imune preparados contra a correspondente formulação CFA/ICFA deu um padrão de manchamento diferente, pelo fato de que reatividades com placas estavam predominantemente nos vasos sangüíneos como se vê na Figura 2b ao invés das placas no tecido cerebral. Soro Pré-imune não manchou os cortes como mostrado na Figura 2c. Os soros hiperimunizados gerados por imunização com peptídeo Αβ^ sozinho em CFA/ICFA, apensa de suas fortes reatividades com Αβι-28 por ELISA, deu um padrão de manchamento surpreendentemente fraco no corte mostrado na Figura 2e.
Imunomanchamento similar de tecido cerebral AD foi realizado com 11 soros imune e pré-imune agrupados obtidos de cobaias imunizadas com as várias formulações de vacina descritas nos Exemplos 3, 4 e 5. Esses soros também foram avaliados quanto a sua reatividade de anticorpo com o sítio funcional por ELISA Αβι-ι4β com Αβ-ι-42 solúvel por Αβι.42 ELISA (Tabela 9). Em geral, tendências paralelas foram vistas com soros testados em todos os três ensaios. Como se vê da Tabela 9, as reatividades antipeptídeo do soro pré-imune e do soro elevado contra o peptídeo curto Αβι-u sozinho formulado em emulsão água-em-óleo ISA51 por ELISA foram baixas e as reatividades cruzadas para placas foram desprezíveis. Reatividades modestas foram encontradas com soros de animais vacinados com peptídeo Αβι-28 sozinho formulado em Alume e em ISA 51, e Αβνη conjugado a KLH e formulado em ISA51.
Ao passo que, reatividades direcionadas ao sítio significantes para o sítio Αβι-14funcional, Αβ solúvel e a placas e TSBV em cortes de tecido cerebral de pacientes AD foram encontradas com soros de animais imunizados com imunógenos Αβ-Th sintéticos da presente invenção. Os resultados obtidos desses testes, portanto, demonstram imunogenicidade excelente e útil dos imunógenos peptídicos compreendendo fragmento N-terminal de peptídeo Αβι-42 com aminoácidos de 1-28 a cerca de 1-10, ligados a epítopos Th extrínsecos. Além disso, os resultados demonstram que, a presença de um epítopo Th estranho, melhora a imunogenicidade dos imunógenos peptídicos da presente invenção em uma surpreendente extensão. Os imunógenos peptídicos da presente invenção em formulações de vacina clinicamente aceitáveis para uso em seres humanos geraram anticorpos com a desejada reatividade cruzada para placas senis nos tecidos cerebrais de pacientes AD.
EXEMPLO 7
A IMUNOGENICIDADE DE VACINAS Αβ PEPTÍDICAS REPRESENTATIVA EM BABUÍNOS COMO PROGNÓSTICO DE EFICÁCIA IMUNOTERAPÊUTICA PARA AD
Um imunógeno sintético representativo, Αβι-28--εΚ-ΜνΡ Th1-16 (SEQ ID NO:74), formulado em emulsão água-em-óleo ISA51 a níveis de dose de 25 ug/0,5 ml, 100 ug/0,5 ml e 400 ug/0,5 ml foram dados a três babuínos Y299, X398, X1198 a um programa de 0, 3 e 6 semanas da imunização inicial. Soros pré-imune e soros a semanas 5 e semanas 8 pósimunização inicial (Wpi) foram coletados. Para efeito de comparação, a um quarto babuíno X798 foi dado 100 ug/0,5 ml doses de uma mistura equimolar dos peptídeos Αβ-|.28 θ Αβ1.42 livres formulados em alume, o adjuvante padrão aprovado para uso humano. Soros pré-imune foram usados como controle negativo.
Soros de todos os quatro animais imunizados foram coletados e avaliados quanto a sua reatividade para anticorpo com o sítio funcional por Αβι-14 ELISA, e para reatividades com Αβι.42 solúvel por Αβ-|.42 ELISA (para soros coletados a 0, 5, e 8 wpi).As reatividades cruzadas dos anti-soros (8wpi apenas) com as placas senis e as placas em vasos sanguíneos tioflavina S positivos foram avaliadas por imunomanchamnento como descrito no exemplo 6. Em vez de usar Ig antibabuíno, 0 anticorpo detector usado como um fragmento Fab de IgG anti-humano que reconhece todos os isotipos humanos e é reativo cruzado com IgG de babuíno.
Tendências paralelas novamente foram encontradas com soros testados em todos os três ensaios. Como se vê na Tabela 10, soros préimune foram negativos. Reatividades ELISA modestas foram encontradas com soro de animal X798 vacinado com Αβι_28θ Αβι_42 formulado em Alume. Contudo, a reatividade deste soro era fraca para o reconhecimento de placas senis. Em contraste, reatividades direcionadas ao sítio significantes ao sítio funcional de Αβν^, Αβι-42 solúvel e para as placas e TSBV em cortes cerebrais de paciente AD foram encontradas com soros coletados a 8 semanas pós-imunização inicial de animais imunizados com a composição representativa da invenção (SEQ ID NO: 74) em tantas doses 100 ug/0,5 ml e 400 ug/0,5 ml formuladas com ISA51. Os resultados obtidos deste teste de babuíno, portanto, demonstraram a utilidade do imunógeno da presente invenção em uma formulação de vacina apropriada para seres humanos. A melhora na imunogenicidade (aumento de 10 a 100X em títulos de anticorpo específico para sítio funcional de Αβ) é muito significativa, em comparação com a vacina de peptídeo da técnica anterior com a sensibilidade imune em babuínos parecendo muito próxima com a dos seres humanos.
Similarmente, uma mistura contendo dois a três imunógenos sintéticos da presente invenção pode ser usada para formulação em vacinas de cerca de 25 a 1000 ug por dose para solicitar anticorpos 3ηΐϊ-Αβι-ι4 funcionais em populações humanas geneticamente diversas para prevenção e tratamento de AD. É esperada uma imunogenicidade ampla em seres humanos, devido à presença de um epítopo Th desordenado no imunógeno peptídico da presente invenção que providencia a aquisição de reconhecimento MHC amplo.
Tabela 1
Epítopos de Célula Auxiliar T Desordenados derivados de patógeno (Th)
| Descrição de Th | Seqüência de aminoácido | SEQ ID NO: |
| HBs Tha | FFLLTRILTIPQSLD | 1 |
| PTi Tha | KKLRRLLYMIYMSGLAVRVHVSKEEQYYDY | 2 |
| TT! Tha | KKQYIKANSKFIGITEL | 3 |
| TT2Tha | KKFNNFTVSFWLRVPKVSASHL | 4 |
| PT,ATha | YMSGLAVRVHVSKEE | 5 |
| TT3Tha | YDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIK | 6 |
Tabela 1 (Continuação)
Epítopos de Célula Auxiliar T Desordenados derivados de patógeno (Th)
| Descrição de Th | Seqüência de aminoácido | SEQ ID NO: |
| PT2Tha | GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL | 7 |
| MVn Tha | LSEIKGVIVHRLEGV | 8 |
| MVF2Tha | GILESRGI KARITHVDTESY | 9 |
| TT4Tha | WVRDIIDDFTNESSQKT | 10 |
| TT5 Tha | DVSTIVPYIGPALNHV | 11 |
| CT Tha | ALNIWDRFDVFCTLGATTGYLKGNS | 12 |
| DT1 Tha | DSETADNLEKTVAALSILPGHGC | 13 |
| DT2 Tha | EEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFA- | 14 |
| PF Tha | DHEKKHAKMEKASSVFNVVNS | 15 |
| SM Tha | KWFKTNAPNGVDEKHRH | 16 |
| TraT, Tha | GLQGKHADAVKAKG | 17 |
| TraT2 Tha | GLAAGLVGMAADAMVEDVN | 18 |
| TraT3 Tha | STETGNQHHYQTRWSNANK | 19 |
| HBc50.69 b | SDFFPSVRDLLDTASALYRE | 20 |
| CTPn Thc | TINKPKGYVGKE | 21 |
aUS 5.759.551 b Ferrari et al., J. Clin Invest, 1991,88:214 cStaggetal., Immunology, 1993 71:1
Tabela 2
Th Idealizado Artificial e Th Artificial Idealizado em Biblioteca Combinatorial a. Th MVF e epítopos Th derivados destes
| Identificador Th | Seqüência de aminoácido | SEQ ID NO |
| MVF Th1 | LSEIKGVIVHRLEGV | 22 |
| DLSDLKGLLLHKLDGL | 23 | |
| EI EIR III RIE I | 24 | |
| SSAL1 Thl | 25 | |
| v v vvv v v | ||
| F F FFF F F | 26 | |
| ISEIKGVIVHKIEGI | 27 | |
| MVF Thl-1 | MT RT TRM TM | 28 |
| L L V | 29 | |
| ISEIKGVIVHKIEGI | 30 | |
| MVF Thl-2 | T RT TR T | 31 |
| MSEIKGVIVHKLEGM | 32 | |
| MVF Thl-3 | LT MRT TRM TV | 33 |
Tabela 2 (Continuação)
Th Idealizado Artificial e Th Artificial Idealizado em Biblioteca Combinatorial a. Th MVF e epítopos Th derivados destes
| Identificador Th | Seqüência de aminoácido | SEQ ID NO |
| MVF Thl-4 | ISEIKGVIVHKIEGI | 34 |
| MVF Thl-5 | ITEIRTVIVTRIETI | 35 |
| MVF Thl-6 | MSEMKGVIVHKMEGM | 36 |
| MVF Thl-7 | LTEIRTVIVTRLETV | 37 |
| MVF Thl-8 | ISISEIKGVIVHKIEGILF MT RT TRM TM L L V | 38 39 40 |
| MVF Thl-9 | ISISEIKGVIVHKIEGILF T RT TR T | 41 42 |
| MVF Thl-10 | ISLSEIKGVIVHKLEGMLF MT MRT TRM TV | 43 44 |
| MVF Thl-11 | ISLTEIRTVIVTRLETVLF I II | 45 46 |
| MVF Thl-12 | ISISEIKGVIVHKIEGILF | 47 |
| MVF Thl-13 | ISITEIRTVIVTRIETILF | 48 |
| MVF Thl-14 | ISMSEMKGVIVHKMEGMLF | 49 |
| MVF Thl-15 | ISLTEIRTVIVTRLETVLF | 50 |
| MVF Thl-16 | ISITEIKGVIVHRIETILF | 51 |
b. Th HBsAg, protótipo e Derivados
| Identificador de Th | Seqüência de aminoácido | SEQ ID NO |
| HbsAg-Thl | FFLLTRILTIPQSLD | 52 |
| HbsAg-Thl-1 | KKKFFLLTRILTIPQSLD | 53 |
| HbsAg-Thl-2 | FFLLTRILTIPQSL | 54 |
| KKKLFLLTKLLTLPQ SLD | 55 | |
| RRRIKII RII I L IR | 56 | |
| SSAL2 Th2 | VRW VV V I V | 57 |
| F FF FF F V F | 58 | |
| F | 59 | |
| HbsAg Thl-3 | KKKIITITRIITIITTID | 60 |
| HbsAg Thl-4 | KKKIITITRIITIITTI | 61 |
| HbsAg Thl-5 | KKKMMTMTRMITMITTID | 62 |
| HbsAg Thl-6 | FITMDTKFLLASTHIL | 63 |
| HbsAg Thl-7 | KKKFITMDTKFLLASTHIL | 64 |
Tabela 3
Seqüências de aminoácido de peptídeos Αβι.42 e seus Fragmentos N-terminais
| SEQ ID NO | Seqüência de aminoácido | |
| SEQ ID NO:65 SEQ ID NO:66 | Αβ-Ι-42 Αβΐ-28 | DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK |
| SEQ ID NO:67 SEQ ID NO:68 SEQ ID NO:69 | Αβΐ-14 Αβΐ-12 Αβι.ιο | DAEFRHDSGYEVHH DAEFRHDSGYEV DAEFRHDSGY |
Tabela 4
| Imunógeno | Seqüência de aminoácido | SEQ ID NO |
| Αβΐ-28-GGHBV Th | DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-GG-FFLLTRILTIPQSLD | 70 |
| Αβ,.,ο-εΚ-ISMVF Thl-16 | DAEFRHDSGY-EK-ISITEIKGVIVHRIETILF | 71 |
| Αβν^-εΚ-ISMVF Thl-16 | DAEFRHDSGYEV-EK-ISITEIKGVIVHRIETILF | 72 |
| Apvu-eK-ISMVF Th1-16 | DAEFRHDSGYEVHH-eK-ISITEIKGVIVHRIETILF | 73 |
| Αβι_28·εΚ-Ι8- | DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-εΚ- | 74 |
| MVF Thl-16 | ISITEIKGVIVHRIETILF | |
| A^.u-eK-MVF | DAEFRHDSGYEVHH-RK-ISISEIKGVIVHKIEGILF | 75 |
| Th 1-9 | T RT TR T | 76 |
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| co | I— | o | LO | |||||||
| CD | co | > | r- | CO | ||||||
| O c Φ | õ | co | d | GG-HB | Õ | CM | d | |||
| CD | z | CM | z | z | z | |||||
| *o c | cS | Ω | co. | Ω | Ω | co. | Ω | |||
| 3 | < | < | < | |||||||
| E | σ | σ | co | σ | σ | |||||
| LU | LU | LU | LU | |||||||
| ω | ω | CQ. | ω | ω | ||||||
| < |
Tabela 7
| Média | 5,265 | 5,278 | 5,625 | 4,901 | |||||||
| <Μ | ο | ο | ο | ΙΟ | ο | ο | r- | LO | |||
| 00 | ΙΟ | ο | ΙΟ | ΙΟ | ο | 00 | ΙΟ | co | |||
| ώ. | Τ- | 00 | ο | ΙΟ | CM | ο | ’Φ | Τ- | ο | ||
| 0. | < | ιο | ΙΟ | CD | ’φ | ΙΟ | CD | ’Φ | ΙΟ | ιο | |
| CO | 03 | ο | ΙΟ | 00 | CM | ||||||
| “Ο | CM | ’Φ | 00 | σ> | |||||||
| φ | 00 | ΙΟ | co | ιο | |||||||
| ’φ | 00 | ||||||||||
| Ο | ’Φ | ΙΟ | Ο | ο | ’φ | CM | 00 | ’φ | |||
| 1 | τ— | CM | CN | ο | ’φ | CM | ’φ | 00 | ο | ||
| σ> | ώ. | CM | 00 | ΙΟ | ΟΟ | b- | C0 | ||||
| Ο | < | ’φ— | •φ· | ΙΟ | 00 | ’φ | ’Φ | CM | 00 | ’φ- | |
| ω | 03 | Τ— | ο | 00 | |||||||
| Ο | 00 | σ> | co | CM | |||||||
| ο | 00 | ο | CO | ||||||||
| ISA | 2 | ιθ | ’φ- | ΙΟ | ’φ | ||||||
| EL | CJ | ’φ | Ο | ο | CM | l·- | C0 | Ο | ΟΟ | ιο | |
| CM | ΙΟ | ο | 00 | ’Φ | τ— | 00 | 00 | ||||
| ώ. | σ> | CM | 1— | CO | co | ’Φ | CO | co | CO | ||
| < | ΙΟ | ΙΟ | φ7 | ’φ- | ΙΟ | ’φ | ’φ- | 00 | |||
| Ε | 03 | ΙΟ | ΙΟ | ΙΟ | |||||||
| ΤΟ | σ> | Ο) | 00 | ο | |||||||
| φ- | Méi | ’Φ | 4,4 | 3,2 | 3,2 | ||||||
| 00 | CO | r- | CM | ο | ’φ | ιο | l·- | ΙΟ | |||
| 1 | σ> | CT) | r- | CM | ο | CO | ΙΟ | ο | ’φ | ||
| οό. | CM | (Ο | ΙΟ | 00 | l·- | r- | 00 | r- | ΙΟ | ||
| < | ’Φ | ’φ- | ’Φ | ’φ- | 00 | φ- | 00 | co | CM | ||
| =8: | |||||||||||
| Ω | CO | 1^ | ’Φ | ΙΟ | ο | Τ— | ’φ | ιο | CO | ||
| CO | CO | co | CO | CO | CO | 00 | ΟΟ | 00 | |||
| CD | <ο | CO | CO | CO | CO | ΙΟ | ιο | ΙΟ | |||
| «f— | |||||||||||
| 0 | |||||||||||
| Φ Η—» | < | < | < | < | |||||||
| C φ > | LL | LL | LL | LL | |||||||
| Ϊ£ | |||||||||||
| LL | LL | LL | LL | ||||||||
| Ό < | Ο | Ο | Ο | Ο | |||||||
| CO | CO | CO | CO | ||||||||
| τ— | |||||||||||
| I | χ. | 1 | χ—«V | 1 | ,ζ·—s, | 1 s—«S, | |||||
| τ— | CM | 00 | Η- ’Φ | ||||||||
| JZ | 1^ | -C | -C | r- | -C | ||||||
| Ο | Η | 1- | 1- | 1- | |||||||
| C φ | LL | Ο | LL | Ο | LL | Ο | υ_ Ο | ||||
| σ> | > | Ζ | > | ζ | > | ζ | > ζ | ||||
| Ό C | Ω | Ω | Ω | Ω | |||||||
| Ο Ε | εΚ- | σ | ω | σ | k: ω | σ | ω σ | ||||
| Ο | LLI | CM | LLI | Ί· | LU | Ιο 111 | |||||
| τ | ω | ω | τ | ω | ω | ||||||
| CQ. | οό. | CO. | 0Q. | ||||||||
| < | < | < | < |
Tabela 8
| ELISA Titer (Logio) | 6WPI | Média | < 2 | 0,064 | 5,018 | |
| Pepitídeo Th ou KLH | < Z | < z | 0,065 | 0,063 I | 4,876 | 5,160 |
| Média | o 00 O t— | 4,126 | 2,736 | |||
| Cd GX < | 1,285 | 0,874 | 4,559 | 3,693 | 2,625 | 2,846 |
| 4WPI | Média | < z | 0,038 | 4,903 | ||
| Peptídeo Th ou KLH | NA | < z | 0,006 | o r- o o~ | 4,672 | 5,133 |
| Média | 0,975 | 4,094 | 3,342 | |||
| Cd Ύ t— CQ. < | I 1,229 | 0,720 | 4,388 | 3,800 | 3,181 | 3,502 |
| GPID# | 1658 | 1659 | 1662 | 1663 | 1670 | 1671 |
| Adju- vante | ISA 51 | ISA 51 | ISA 51 | |||
| Imunógeno | r^- co «· õ v Z Q — σ LU ω | £ CD õ ? 7 α σ < cn | V CD cct ri 5 § o Q ΐ σ —1 LU * |
| lmunomanchmentoade cortes congelados seriais de tecido cerebral de ADs, | TSBV | +4 | +5 | i +6 | 9+ | I Neg | CD + | 9+ | +6 | +5 | +4 | Neg | ||||||||||
| Placa | + | +3 | +4 | +4 | | Neg | r +4 | +4 | r +4 | +4 | +2 | Neg | |||||||||||
| o σ> o _1 < ω _l LU O +-» 1- | xt eS. < | Média | 2,326 | 2,291 | 3,201 | 3,510 | 1,129 | 4,232 | 3,285 | 4,450 | 4,455 | 3,102 | ||||||||||
| 1,244 | 3,408 | 2,341 | 2,241 | 3,355 i | 3,707 | 2,540 | 2,724 | ττ o o | 1,168 | i 1,090 | 3,700 | 4,764 | j 3,551 | 3,018 | 4,577 | 4,322 | 4,293 | 4,696 | 3,280 | 2,924 | <0,5 | |
| CM τΤ CQ_ < | Médiaj | 2,401 | 3,397 | 4,328 | 4,582 | 0,975 | 5,060 | 4,094 | 4,891 | 5,087 | 3,342 | |||||||||||
| 0,878 | 3,924 | 3,686 | 3,107 | 4,610 | 4,688 | 3,685 | 3,603 | 1,201 | 1,229 | 0,720 | 4,677 | 5,443 | 4,388 | 3,800 | 00 l-‘S | 4,682 | 4,924 | 5,250 | 3,181 J | 3,502 | <0,5 | |
| GPID# | 1630 | 1631 | 1632 | 1633 | 1584 | 1585 | 1586 | 1642 | 1643 | 1658 | 1659 | 1660 | 1661 | 1662 | 1663 | 1664 | 1665 | 1666 | 1667 | 1670 | 1635 | |
| Formulação de Vacina | E < _c 00 CM CQ < | LO < ω c co CJ ei < | < LL LL O _ c õ V O z i— o > ° 52 ω CO CM CQ < | IO < ω c co rí Z Ò LL — > σ 2 UJ £ 52 ω 1 00 CM T“ CQ. < | LO < ω Tj- col· < | < LL LL O _ C CO ω T V O ·- z H Q > ° 52 ω I Tt CQ. < | LO < ω C '7 co r- Λ Õ -Ω LL — > σ S UJ £ ω ω 1 1— CQ < | < U. LL O _ c c? co V O -r- Z H Q > σ , ω id ω Cl T~ CQ. < | Αβι.ιο-εΚ-MVF Th1-16 in CFA/IFA (SEQ ID NO: 71) | T— < ω c CQ < o ± id | Negative Control (preimmune serum) |
diluição serial @ 1:100
| Imunomanchamento de cortes congelados de cérebro AD (8 wpi) | TSBV | + | +6 | 9+ | + | Neg | |
| Placas | +2 | I +4 | -d- + | + | Neg | ||
| Título ELISA (Logw) | CQ. < | 8 WPI | 2,706 | 4,800 | 3,799 | 2,850 | |
| 5 WPI | 1,745 | 2,816 | 4,250 | Γ'- CM o“ | |||
| 0 WPI | 0,665 | 0,794 | 0,539 | 0,798 | |||
| CJ Μ- ι ca < | 8 WPI | 2,736 | 3,640 | 4,050 | 2,485 | ||
| I 5 WPI L | 2,962 | 2,987 | ι 2,696 | 1,963 | |||
| í 0 WPI | 0,894 | 0,610 | 969Ό | 0,897 | |||
| Dose | CD =L LO <\l | CD O o | CD d. o o ’Φ | CD =L o o | 1 | ||
| Formulação de vacina | ÍÕ < ω 1 * £ ° ll e 1 ° ω > ω — ω « CO CJ ca < | E < c <N ca < + 00 CJ ca < | Controle negativo | ||||
| Grupo # | - | CM | CO | •Φ | LO |
Claims (34)
- REIVINDICAÇÕES1. Imunógeno peptídico, caracterizado pelo fato de que compreende:(i) um epítopo (Th) de célula T auxiliar selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 1 a 64, (ii) um fragmento N-terminal de peptídeo Αβ-ι-42 selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NO: 66 a SEQ ID NO: 69; e (iii) opcíonalmente, um espaçador consistindo em pelo menos um aminoácido para separar os domínios imunogênicos.
- 2. Imunógeno peptídico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o espaçador é selecionado do grupo consistindo em aminoácido, Gly-Gly, (a-s-N)-Lys, e Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro.
- 3. Imunógeno peptídico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o espaçador é Gly-Gly.
- 4. Imunógeno peptídico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o espaçador é ε-Ν-Lys.
- 5. Imunógeno peptídico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Th é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 20, 38-40, 47-51 e 52-54.
- 6. Imunógeno peptídico de acordo com a reivindicação 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que Th é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID Nos. 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 20, 38-40, 47-51 e 52-54.
- 7. Imunógeno peptídico, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID Nos: 70, 71,72, 73 e 74.
- 8. Imunógeno peptídico de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que consiste na SEQ ID NO: 73.
- 9. Imunógeno peptídico de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que consiste na SEQ ID NO:74.
- 10. Imunógeno peptídico, caracterizado pelo fato de que é representado por uma das seguintes fórmulas:(A)n-(fragmento N-terminal do peptídeo A3i-42)-(B)o-(Th)m-X, ou (A)n-(Th)m-(B)o-(fragrnento N-terminai do peptídeo Αβ-Μ2}-Χ, sendo que cada A é independentemente um aminoácido, cada B é um grupo de ligação selecionado do grupo consistindo em um aminoácido, Gly-Gly, (a, e-N)-Lys e Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro;Th compreende uma sequência de aminoácido que constitui um epítopo de célula T auxiliar selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID Nos: 1-64 e um análogo intensificador imune do mesmo, (fragmento N-terminal do peptídeo Αβι^2) θ selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 66 a 69;X é um α-COOH ou a-CHNH2 de um aminoácido, n é de 0 a 10, m é de 1 a 4, e o é de 0 a 10.
- 11. Imunógeno peptídico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o espaçador é Gly-Gly.
- 12. Imunógeno peptídico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o espaçador é ε-Ν-Lys.
- 13. Imunógeno peptídico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que Th é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 20, 38-40, 47-51 e 52-54.
- 14. Imunógeno peptídico de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que Th é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 20, 38-40, 47-51 e 52-54.
- 15. Imunógeno peptídico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que Th é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 20, 38-40, 47-51 e 52-54.
- 16. Imunógeno peptídico de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que Th é selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 20, 38-40, 47-51 e 52-54.
- 17. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 1, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 18. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 2, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 19. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 3, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 20. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 4, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 21. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 5, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 22. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 6, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 23. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 7, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 24. Composição, caracterizada peio fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 8, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, 1SA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 25. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 9, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 26. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 10, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 27. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 11, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 28. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 12, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 29. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 13, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno mono5 fosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 30. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 14, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 31. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 15, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720 Montanide.
- 32. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno peptídico, como definido na reivindicação 16, e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em alume, liposina, saponina, esqualeno, L121, lipídio A emulsigeno monofosfirila (MPL), polissorbato 80, QS21, ISA51, ISA35, ISA206 e 1SA720 Montanide.
- 33. Uso de um imunógeno peptídico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição utilizável para prevenir ou tratar doença de Alzheimer.
- 34. Uso de um imunógeno peptídico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição utilizável para produzir anticorpos para peptídeo Αβι_42 que sejam de reação cruzada com peptídeos Αβ solúveis e placas de tecido cerebral formadas dos mesmos.1/2FIG 1ÍAÍPJ?*&> Λ ti* .ΥΛ.'.xS·· * ·»_ í, *'Hr-v . 3V.•.N>s4^ N ,w ’ * ’ t4.ÍK/s »fWíí ·«»’· ’ >* ' 'i ·:/?tW@7 * Ç V',47··A¥.,· '1 vy .»'· ;h - <*Ϊ W) * * «RM ·*- fa ·?#, ‘S -..<>$ ** -Ά, / rp'·· . Ô . ., .£r~·..- G?.’*.. . A - «0» -*£* * * >7* xW^·... .«fc,, £>’ '-.ί ojqsjço αν <4 r7^C ' ?' .' . ·$·/.:Λ . · . r 4Μ ' Λ V-, , --1-7., k/Mrt‘ 7.7.ÍSS* si' ·». Λ3.·;Z ojqajQQ αν
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| B21H | Decision of lapse of a patent or of a certificate of addition of invention cancelled [chapter 21.8 patent gazette] |
Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 21.6 NA RPI NO 2716 DE 24/01/2023 POR TER SIDO INDEVIDA. |
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| B21A | Patent or certificate of addition expired [chapter 21.1 patent gazette] |
Free format text: PATENTE EXTINTA EM 02/04/2022 |