ES2360465T3 - Composición de péptido inmunogénico para la prevención y el tratamiento de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents
Composición de péptido inmunogénico para la prevención y el tratamiento de la enfermedad de alzheimer. Download PDFInfo
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Abstract
Un inmnunógeno del péptido representado por una de las siguientes fórmulas: (A)n-(fragmento N-terminal del péptido Aß1-42)-(B)o-(Th)m-X; o (A)n-(Th)m-(B)o-(fragmento N-terminal del Péptido Aß1-42)-X; en donde cada A es independientemente un aminoácido; cada B es un espaciador seleccionado del grupo que consiste de Gly-Gly, (α, ε-N)-Lys, y Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 77); Th es el epitope de la célula T auxiliar de SEQ ID NO: 51; (fragmento N-terminal del péptido Aß1-42) es el péptido de SEQ ID NO: 67; X es un α-COOH o α-CONH2 de un aminoácido; n es de 0 a aproximadamente 10; m es de 1 a aproximadamente 4; y o es de 0 a aproximadamente 10.
Description
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con una composición que comprende un inmnunógeno del péptido útil para la prevención y el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer. Más particularmente, el inmnunógeno del péptido comprende un sitio regulador/funcional principal, un fragmento N-terminal del péptido β(Aβ) Amiloide unido a un epitope de la célula T auxiliar (Th) que tiene múltiples motivos de enlace de MHC de clase II. El inmnunógeno del péptido induce una respuesta inmune de sitio-dirigido contra el sitio regulador/funcional principal del péptido Aβ y genera anticuerpos, que son altamente reactivos en cruz con el péptido Aβ1-42 soluble y las placas amiloides formadas en el cerebro de los pacientes con la Enfermedad de Alzheimer. Los anticuerpos inducidos que son reactivos en cruz con el péptido Aβ1-42 soluble, promueven la desagregación fibrilar e inhiben la agregación fibrilar conduciendo a la inmunoneutralización de las "toxinas derivadas de Aβ soluble"; y que son reactivas en cruz con las placas amiloides, aceleran la liquidación de estas placas a partir del cerebro. De esta manera, la composición de la invención que comprende el inmnunógeno del péptido es útil para la prevención y el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer.
Antecedentes de la invención
La Enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno crónico, neurodegenerativo caracterizado por una pérdida de la capacidad cognitiva y graves anormalidades del comportamiento en un paciente lo que conduce a la eventual muerte del paciente. En este momento existen 2.5 a 4.0 millones de pacientes con AD en los EE.UU. y 17 a 25 millones en todo el mundo. Es la cuarta causa que conduce a la muerte en las culturas Occidentales, precedida solamente por las enfermedades del corazón, cáncer, y accidente cerebro vascular. ARICEPT®, un inhibidor de la acetilcolinesterasa ha sido aprobado por la FDA, desacelerando la velocidad de descenso de los pacientes con Alzheimer. Sin embargo, es efectivo solamente por un periodo de tiempo limitado y en algunos pacientes. Hasta el momento no existe tratamiento o cura definitiva para esta devastadora enfermedad.
Dos depósitos microscópicos, i.e., ovillos neurofibrilares (NFT) y placas amiloides seniles, fueron identificados por Alois Alzheimer como las características patológicas de la enfermedad. Los ovillos neurofibrilares consisten de dos filamentos de 10nm de ancho trenzados uno alrededor del otro, conocidos como filamentos helicoidales apareados (PHFs), del cual un importante componente es tau fosforilada. La fosforilación de la serina en el aminoácido 262 de la proteína tau representa una etapa crucial que conduce a la disfunción fisiológica de tau. Los PHFs son intracelulares y se encuentran en muchos de los procesos dendríticos y axonales anormales, o neuritas que forman la periferia de las placas amiloides seniles. Las placas amiloides seniles consisten de filamentos neurófilos desorganizados en una zona de hasta 150 µm de sección transversal con un núcleo extra-celular del depósito de amiloide. Las placas amiloides cerebrales son ultraestructuralmente distintos a partir de los PHFs y consisten de filamentos de 4-8 nm de ancho que no se enrollan juntos en pares. El núcleo de la placa consiste de agregados de un péptido, inicialmente conocido como A4, con una masa molecular relativa (M) de aproximadamente 4,000 (Masters et a1., Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82:4245-4249).
Una secuencia de aminoácidos parcial de A4, que ahora se llama péptido β amiloide (o Aβ1-42), muestra que es similar a la proteína β amiloide aislada a partir de vasos sanguíneos cerebrales de pacientes con la enfermedad de Alzheimer o el síndrome de Down (Glenner and Wong, Biochem Biophys Res Comm, 1984; 120:885-890; 122:11311135).
Se ha formulado la hipótesis que Aβ1-42 se relaciona con AD por un número de razones. En primer lugar, en la amiloidosis periférica, por ejemplo, la enfermedad de cadena ligera primaria o amiloidosis AA secundaria, de gran carga amiloide se correlaciona fuertemente con la disfunción de órganos y tejidos. En segundo lugar, la densidad de la placa amiloide se correlaciona positivamente con las puntuaciones de demencia pre-morten en AD. En tercer lugar, la deposición del Aβ1-42 es el marcador neuropatológico precoz en AD y de los trastornos relacionados tales como síndrome de Down, donde este puede preceder la formación de NFT por 2-3 décadas. En cuarto lugar, la βamiloidosis es relativamente específica para AD y los trastornos relacionados. En quinto lugar, Aβ1-42 es tóxico para las neuronas (Yankner et al., Science, 1990; 250:279-282). Por último, mutaciones de aminoácidos en el gen de la proteína precursora amiloide estructural (APP) causan inicio precoz de AD familiar (Goate et al., Nature, 1991; 349: 704-706; Mullan et al., Nature Genetics, 1992; 1:345-347). Notablemente, una mutación causa una dramática sobreproducción de Aβ1-42 (Citron et al., Nature, 1992; 360:672-674).
En 1987, Kang et al. (Nature, 1987; 325:733-737) y otros tres grupos (ver 1987 status reports by Anderton, Nature, 1987; 325:658-659 and Barnes, Science, 1987; 235:846-847) independientemente clonados del gen a partir del cual Aβ1-42 se deriva. Este gen, ahora conocido como la proteína precursora amiloide (APP), codifica una proteína de 695 residuos de aminoácidos con un MW de aproximadamente 79,000 que se expresa en virtualmente todos los tejidos.
Existen al menos cinco variantes de corte y empalme de APP, cuatro de las cuales contienen la secuencia del péptido β-amiloide.
Cuatro genes han sido implicados en formas familiares de AD. Tres de los genes, βAPP, presenilin 1, y presenilin 2, cuando mutan, causan formas iniciales dominantes autosomales de AD. El cuarto gen, Apolipoproteina E, tiene una forma polimórfica que ocurre naturalmente, ApoE4, que representa un principal factor de riesgo genético para el desarrollo de la enfermedad. El concepto de que las alteraciones en varios genes distintos pueden conducir a un desequilibrio crónico entre la producción de Aβ1-42 y su liquidación, con la agregación resultante de los primeros 42residuos y luego los 40-residuos peptídicos en placas citotóxicas, se soporta por la evidencia disponible. La evidencia sugiere que los defectos en cada uno de estos cuatro genes predispuestos el fenotipo AD por (1) aumento de la producción y/o la deposición de péptidos Aβ1-42 o (2) por disminución de la liquidación de ApoE4 a partir del tejido (Selkoe, J Biol Chem, 1996; 271:18295-18298). ,
A partir de los datos disponibles, parece que los agregados, pero no los péptidos Aβ1-42 monoméricos pueden inducir la disfunción y muerte celular in vitro mediante un rango de mecanismos interrelacionados presumiblemente. Estos incluyen lesión oxidativa (Thomas et al., Nature, 1996; 380:168-171; Behl et al., Cell, 1994; 77:817-827), alteraciones en homeostasis de calcio intracelular (Arispe et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1993; 90:567-571), y reorganización del citoesqueleto (Busciglio et al., Neuron, 1995; 14: 879-888). El conocimiento suficiente de algunas de las principales etapas en la cascada inducida del amiloide ha surgido, incluso aunque la hipótesis de la cascada es muy refutada.
Las metodologías farmacológicas, para identificar pequeñas moléculas que podrían inhibir una u otra etapa de la cascada inducida del amiloide ahora están en curso. De particular interés son dos metodologías: ensayos para interferir con la agregación de péptidos Aβ1-42 por disminución de la secreción de péptidos Aβ1-42 a partir de células gliales y neuronas o inhibir la toxicidad que estos agregados extracelulares producidos en las células gliales y neuronas y sus procesos. Un tercer ensayo de metodología para controlar la respuesta inflamatoria especializada que parece ser desencadenada por Aβ1-42 agregado (incluyendo estimulación microglial, activación de la cascada complemento clásica, liberación de citoquinas, y astrocitosis reactiva) puede probar que es de beneficio para pacientes con Alzheimer.
A parte de las metodologías farmacológicas mencionadas anteriormente para la intervención de AD, las intervenciones inmunológicas también se han intentado. Soloman et al. (Proc Natl Acad. Sci, 1996; 93:452-455; Proc Natl Aca. Sci, 1997; 94: 4109-4112) mostró que tres anticuerpos monoclonales específicos, dirigidos hacia un sitio en la región N-terminal del péptido Aβ1-42 humano, se unen en diversos grados a las fibrillas preformadas que conducen a su desagregación e inhibición de su efecto neurotóxico. También se encontró que los anticuerpos previenen la formación de Aβ1-42 fibrilar. Solomon et al. (WO01/18169) también intentó preparar un expresión en fago de un epitope del péptido Aβ1-42 y la administración de la expresión en epitope de una expresión en fago o péptido que contiene el epitope intraperitonealmente a ratones que inducen anticuerpos para el péptido Aβ1-42. La prueba in vitro con fenocrocitoma de rata mostró que una dilución 1:5 de los antisueros previene la neurotoxicidad de Aβ1-42. También se demostró que el antisuero a una dilución de 1:5 y 1:20 desestabiliza la estructura fibrilar de Aβ in vitro con el deterioro extensivo de la morfología fibrilar. Sin embargo, el adyuvante utilizado para la primera inyección fue el Adyuvante de Freund completo con el Adyuvante de Freund incompleto para la segunda inyección. Los adyuvantes utilizados son totalmente inapropiados para uso en humanos. Además, los niveles de anticuerpos generados fueron muy bajos para ser efectivos a pesar del uso de estos adyuvantes irritantes.
Posteriormente, Schenk et al. (Nature, 1999; 400:173-177) mostró que la inmunización con el péptido Aβ1-42 inhibe la formación de placas amiloides y las neuritas distróficas asociadas en un modelo de ratón con AD. Sin embargo, debido a la baja inmunogenicidad del péptido Aβ1-42, el método empleado necesita administraciones repetidas del antígeno con un adyuvante de formación de lesión irritante, para obtener los niveles superiores de anticuerpos de placa anti- Aβ1-42 necesario para afectar la formación de placas. Además, se advirtió que la inmunización con Aβ1-42 podría inducir más acumulación del amiloide tóxico por sí mismo (Araujo, DM & Cotman, CW, Brain Res, 1992; 569, 141-145).
A pesar de estos críticas, estudios adicionales en modelos de ratones transgénicos con AD a través de inmunización activa similar, han dado credibilidad a las metodologías de inmunoprofilaxis e inmunoterapéuticas para AD. Janus et al. (Nature, 2000; 408:979-982) describe la inmunización del péptido Aβ1-42 en un modelo de ratón para AD que reduce el deterioro del comportamiento y las placas. Morgan et al. (Nature, 2000; 408:982-985) describe la vacunación con el péptido Aβ1-42 para prevenir la pérdida de memoria en el modelo de ratón.
El soporte directo a la efectividad de terapia inmune se origina de la observación que la administración periférica de anticuerpos, monoclonales o policlonales, contra el péptido-Aβ redujo la carga amiloide (WO 99/27944; Bard et al., Nature Medicine, 2000; 6:916-919). A pesar de los niveles séricos relativamente moderados, estos anticuerpos administrados pasivamente, monoclonales 3D6 (anti-Aβ1-5) y 10D5 (anti-Aβ1-12) o policlonales anti- Aβ1-42, fueron capaces de entrar al sistema nervioso central. Allí, los anticuerpos se unen a las placas e inducen la liquidación de las placas amiloides pre-existentes. Bard et al., reportaron que cuando se examinaron en un ensayo ex vivo con secciones de cerebro de ratones PDAPP (i.e., ratones transgénicos para un minigen APP impulsado por un promotor del factor de crecimiento derivado de plaquetas) o tejido de cerebro de paciente con AD, anticuerpos contra células microgliales activadas con el péptido Aβ, para desbloquear las placas a través de fagocitosis mediada por el receptor del Fc y la posterior degradación del péptido. Este estudio demostró que los anticuerpos administrados pasivamente contra el péptido Aβ1-42 y la región N-terminal Aβ1-42 redujeron el grado de deposición de las placas en un modelo de ratón de AD; y que los anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales inducidos por las vacunas de sitio-dirigido son capaces de entrar al CNS, a niveles terapéuticamente relevantes.
A pesar de los prometedores hallazgos de intervención inmunológica en el modelo de ratones para AD, una vacuna contra AD apropiada para seres humanos sigue estando muy lejos (Chapman, Nature, 2000; 408:915-916). Los obstáculos principales residen en el amplio trabajo, necesario para diseñar y formular una composición inmunogénica que sea útil en seres humanos antes de que una vacuna factible para AD se pueda lograr. Algunos de estos temas que se basan en los datos experimentales de orientación son: (1) Cual es el sitio diana específico para el reconocimiento del anticuerpo dentro del Aβ? (2) En qué forma debería estar presente el inmunógeno ? (3) Cuales otros sitios necesitan estar incluidos antes de que se logre que un inmnunógeno provoque un nivel terapéutico del anticuerpo? (4) Cuál es un sistema de administración efectivo de una vacuna, empleando un adyuvante clínicamente aceptable para seres humanos?.
Una importante brecha existe entre lo que se ha divulgado en la literatura y lo que queda por hacer. Cuál es el apropiado sitio diana específico (i.e., la placa polimerizada de Aβ1-42 o el péptido Aβ1-42 soluble monomérico) y cómo se debe diseñar el sitio específico para la intervención inmunológica. A pesar de unas 5,000 publicaciones sobre Aβ1-42 durante la última década, la hipótesis de la cascada del amiloide es objeto de acalorados debates y el la cuestión: la forma en la cual Aβ1-42 se debería utilizar para la intervención permanece contenciosa. En el centro del problema, argumentado por Terry and colleagues, está la débil correlación entre la carga amiloide fibrilar y las mediciones de la disfunción neurológica (The Neuropathology of Alzheimer Disease and the Structure Basis of its Alterations, Ed. by Terry et al., Alzheimer Disease, p187-206, Lippincott Williams and Wilkins, 1999).
En pacientes con AD, los depósitos amiloides con frecuencia se forman a una distancia del sitio del daño neuronal. La mejor correlación con la demencia patológica es la pérdida de terminales sinápticos. Sin embargo, la pérdida de terminales sinápticos se correlaciona mal con la carga amiloide. Si las manifestaciones de la enfermedad se correlaciona débilmente con la carga amiloide, entonces cuál es el papel de Aβ? El artículo de Klein et al, titulado "Targeting small Aβ1-42 oligomers: the solution to an enfermedad de Alzheimer conumdrum?"(Trends in Neurosciences, 2001; 24:219-224) sugiere que las fibrillas no son la única forma tóxica de Aβ, y posiblemente no la neurotoxina que es la más relevante para AD. Pequeños oligómeros y protofibrillas, también se llaman como ligandos difusibles derivados de Aβ1-42 (ADDLs), también pueden tener potente actividad neurológica tóxica.
Una vacuna contra AD para la exitosa intervención inmunológica necesitará un inmnunógeno diseñado para inducir los anticuerpos de alta afinidad de sitio-dirigido que se une a las placas seniles en el tejido de cerebro para acelerar la liquidación de la placa por las células gliales, e inmunoneutralizar las toxinas derivadas de Aβ soluble.
El problema de aumentar los anticuerpos de sitio-dirigido de alta afinidad contra los péptidos de sitio-específico muy poco inmunogénicos se ha conocido por décadas. Los inmunólogos y vacunólogos con frecuencia recurren a la metodología de la proteína portadora [péptido] hapteno clásica conjugada como se demuestra en WO 99/27944. Para el desarrollo de una vacuna de sitio-dirigida contra AD, Frenkel et al., ensayaron la inmunización contra placas de Aβ1-42 a través de administración fago-“EFRH” (Proc Natl Acad. Sci 2000; 97:11455-11459, WO 01/18169) como se menciona anteriormente.
Las metodologías: utilizando agregados del péptido Aβ1-42 o conjugados del fragmento del péptido Aβ1-42 -proteína portadora (WO99/27944) y utilizando la expresión en fago de filamentos "péptido EFRH" como los agentes para inducir las respuestas inmunes contra un depósito de amiloide en un paciente, son engorrosos e ineficientes. Por ejemplo, después de la cuarta inmunización de la expresión de fagos 1011 del epitope EFRH, >95% de los anticuerpos en el suero inmune de conejillo de Indias son contra los fagos. Solo una pequeña población (<5%) de los anticuerpos es contra el péptido Aβ1-42 soluble (Frenkel et al., Vaccine 2001, 19:2615-2619, WO 01/18169).
Los métodos menos complicados fueron descritos en EP 526,511 y WO 99/27944, que revelan la administración del péptido Aβ1-42 para tratar pacientes con AD pre-establecido y la administración de Aβ1-42 u otros inmunógenos a un paciente bajo condiciones que generan una respuesta inmune "benéfica" en el paciente con AD. Sin embargo, una revisión de WO99/27944 muestra que existen grandes deficiencias en el diseño de la vacuna revelada en este.
En particular, el problema radica en la falta de un sistema de administración de la vacuna efectivo y farmacéuticamente aceptable. WO99/27 revela Aβ1-42 o fragmentos activos de conjugados de Aβ1-42 con una molécula portadora tal como toxina de cólera como el componente de la vacuna activo. Ver página 4 de WO 99/27944. Aunque la página 5 enseña que una composición farmacéutica que comprende el inmnunógeno debería ser libre del Adyuvante de Freund completo [CFA], los únicos ejemplos que muestran la eficacia de la vacuna de Aβ1-42 para el tratamiento de AD en ratones transgénicos empleando grandes dosis del péptido Aβ42 agregado en CFA. A pesar del recital repetitivo de adyuvantes preferidos que se van a utilizar con los agentes inmunogénicos revelados para mejorar la respuesta inmune, los datos experimentales mostraron que solamente las formulaciones empleando CFA/ICFA proporcionaron un título de anticuerpos suficientemente alto. Ver, página 25 de WO 99/27944. En el ejemplo 1, la eficacia profiláctica de Aβ1-42 contra AD se demostró en ratones PDAPP. Sin embargo, las formulaciones administradas consisten de una dosis de 100ug por ratón de Aβ42 agregado emulsificado en Adyuvante de Freund completo [CFA] (p34 de WO 99/27944) después de múltiples dosis de refuerzo del mismo péptido Aβ1-42 emulsificado en Adyuvante de Freund Incompleto. En el Ejemplo IX, las respuestas inmunes en ratones para diferentes adyuvantes fueron estudiados. Cuando los adyuvantes: MPL, Alum, QS21, y CFA/ICFA fueron utilizados con el supuestamente potente inmnunógeno AN1792 (i.e., Aβ42 humano agregado), el nivel de anticuerpos para Aβ1-4 fueron reducidos en un nivel estadísticamente significante en comparación con los ratones que recibieron las vacunas CFA/ICFA. Ver, Tabla 9, y páginas 59-64 de WO 99/27944.
En el caso dónde los fragmentos del péptido Aβ1-42 fueron utilizados (péptidos Aβ1-42 humanos de aminoácidos 1-5, 1-12, 13-28, y 33-42), cada fragmento fue conjugado con IgG anti-ratón de oveja como en portador de la proteína. En una última divulgación, la eficacia de los anticuerpos con fragmentos del péptido Aβ solo podría ser mostrada por inmunización pasiva con anticuerpos monoclonales (Bard et al., Nature Medicine 2000; 6:916-919). La eficacia de estos fragmentos conjugados con IgG anti-ratón de oveja no fue mostrado. Por lo tanto, el único inmnunógeno que mostró que era efectivo fue el péptido Aβ1-42 agregado en CFA/ICFA.
WO 00/72880 A2 inter alia se relaciona con métodos para prevenir o tratar una enfermedad asociada con depósitos de amiloide de Aβ en el cerebro de un paciente por ejemplo la enfermedad de Alzheimer o síndrome de Down o deterioro cognitivo. Dichos métodos implican la administración de fragmentos de Aβ o análogos de estos mientras que el segmento N-terminal de Aβ se puede unir a su C-terminal a un polipéptido heterólogo. Los fragmentos empiezan en los residuos 1 - 3 de Aβ y terminan en los residuos 7 - 11 de Aβ, sin embargo, los fragmentos que son más largos que los residuos 1 - 12 son menos preferidos debido a que su actividad en la limpieza o prevención de depósitos amiloides no está clara.
Hasta el momento, todas las formulaciones de las vacunas mostraron que eran efectivas empleando CFA/IFA como el adyuvante. Los inmunógenos del péptido que dirigen Aβ1-42 hasta ahora han sido preparados por la conjugación de los diferentes fragmentos de Aβ1-42 con inmunoglobulina anti-ratón de oveja, conjugación de Ap13-28 sintético vía m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster con el anticuerpo anti-CD3, o péptido Aβ1-42 agregado solo. Estos inmunógenos, i.e., péptido Aβ42 solo o conjugados del péptido Aβ1-42-proteína portadora, fueron emulsificados con adyuvante de Freund completo para la primera inmunización, después de posteriores refuerzos en adyuvante de Freund incompleto (Johnson-Wood et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1997; 94:1550-1555; Seubert et al., Nature, 1992; 359:325-327; Schenk et al., Nature, 1999; 400: 173-177; Janus et al., Nature 2000; 408:979-982; and Morgan et al., Nature, 2000; 408:982-985). Las formulaciones reveladas en WO 99/27944 u otras utilizando CFA y ICFA como adyuvantes causan lesiones y son demasiado irritantes para uso en seres humanos. De esta manera, ninguna de las composiciones de vacunas para AD descritas en el oficio previo es apropiada para su uso en seres humanos.
En resumen, a pesar de las declaraciones que sugieren el potencial del péptido Aβ1-42 para el tratamiento de AD en vista de las divulgaciones anteriores de Kline (EP 526,511), las formulaciones de la vacuna que resuelven el problema, realmente no se ofrecieron en WO99/27944, para hacer frente a este problema clave.
Otra desventaja con los conjugados péptido-proteína portadora y agregados Aβ1-42, es que estas moléculas son altamente complejas y son difíciles de caracterizar y es difícil desarrollar procedimientos de control de calidad efectivos para los procesos de fabricación. Otra desventaja es que, el péptido Aβ1-42 o sus fragmentos son moléculas individuales cuando se administran a humanos. Por lo tanto, son menos inmunogénicos o no-inmunogénicos en seres humanos. Es, por tanto, necesario desarrollar formulaciones clínicamente aceptables de las vacunas para la administración en humanos.
Se sabe que los epitopes Th promiscuos pueden ser empleados para evocar la célula auxiliar T eficiente y se puede combinar con epitopes de célula B muy poco inmunogénicos para proporcionar inmunógenos potentes. Se ha demostrado que los péptidos quiméricos de epitopes promiscuos de la célula B/Th bien diseñados, son útiles en la obtención de respuestas de Th y respuestas del anticuerpo resultante en la mayoría de los miembros de una población genéticamente diversa que expresa haplotipos MHC diversos. Th promiscuos a partir de un número de patógenos, tales como proteína F del virus del sarampión y antígeno de la superficie del virus de la hepatitis B, se conocen. Las Tablas 1 y 2 enumeran muchos de los Th promiscuos conocidos que se ha demostrado que eran efectivos en la potenciación de un péptido corto muy poco inmunogénico, la hormona decapéptido LHRH (US 5,759,551, y 6,025,468).
Los epitopes Th potentes oscilan en tamaño a partir de aproximadamente 15-40 residuos de aminoácidos en longitud, con frecuencia comparten características estructurales comunes, y pueden contener secuencias de referencia específicas. Por ejemplo, una característica común de un Th es que contiene hélices anfipáticas, estructuras alfa-helicoidales con residuos de aminoácidos hidrofóbicos que dominan una cara de la hélice y con residuos cargados y polares que dominan las caras circundantes (Cease et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1987; 84: 4249-4253). Los epitopes Th frecuentemente contienen patrones adicionales de aminoácidos primarios tales como un residuo Gly o cargados después de dos a tres residuos hidrofóbicos, seguido a su vez por un residuo polar o cargado. Este patrón define las que se denominan secuencias Rothbard. Los epitopes Th con frecuencia obedecen la regla 1, 4, 5, 8, donde un residuo cargado positivamente está después de los residuos hidrofóbicos en la cuarta, quinta y octava posición después del residuo cargado. Dado que todas estas estructuras se componen de aminoácidos polares, cargados e hidrofóbicos comunes, cada estructura puede existir simultáneamente dentro de un único epitope Th (Partidos et al., J Gen Virol, 1991; 72:1293). La mayoría, si no todos, los epitopes promiscuos de la célula T adaptan al menos una de las periodicidades descritas anteriormente. Estas características se pueden incorporar en los diseños de sitios Th artificiales idealizados, incluyendo los epitopes Th combinatorios. Con respecto al diseño de sitios Th combinatorios, listas de aminoácidos preferidos y posición variable están disponibles para motivos de enlace de MHC (Meister et al., Vacuna, 1995; 13:581-591). Adicionalmente, un método para producir Th combinatorio se ha revelado para librerías combinatorias de péptidos denominada librería de antígeno sintético estructurado (Wang et al., WO 95/11998). De esta manera, la regla 1, 4, 5, 8 se puede aplicar junto con conocidas fracciones de enlace MHC combinatorias para asignar la posición invariante y degenerada en un sitio combinatorio Th, y para seleccionar los residuos para los sitios degenerados para aumentar enormemente el rango de sensibilidad inmune de un Th artificial. Ver, Tabla 2, WO 99/66957, y WO 95/11998.
Wang et al. (US 5,759,551) sugirió el uso de elementos inmunoestimulatorios para suministrar la auto-proteína Amilina inmunogénica. Wang et al. sugirieron la administración de péptidos de amilina sintéticos inmunogénicos como vacunas para el tratamiento de diabetes mellitus no-insulino dependiente (NIDDM), una enfermedad amiloidogénico causada por la sobreproducción de Amilina (columna 19, líneas 9-39, US 5,759,551 ). La amilina es una hormona del péptido de 37 residuos de aminoácidos producido por las células β en los islotes de Langerhans. La sobreproducción de Amilina dará lugar a la deposición de amiloide insoluble que conduce a una enfermedad amiloidogénica en el páncreas. Similar a la sobreproducción de Amilina, la sobreproducción del péptido Aβ1-42 dará lugar a la deposición del amiloide insoluble en el cerebro de pacientes con AD. Sin embargo, existe una homología de secuencia limitada entre la Amilina y el péptido Aβ1-42. Solo un pequeño tramo de residuos de aminoácidos, VGSN, de la Amilina32-35 corresponde a Aβ24-27. Los anticuerpos producidos contra el péptido de la Amilina no se espera que tengan reactividad cruzada con los péptidos Aβ1-42 solubles ni aceleren la liquidación de placas amiloides en el cerebro en vista de los estudios de Soloman et al.and Schenk et al., que demostraron que la secuencia EFRH es crítica.
Es el objeto de la invención desarrollar un inmnunógeno que permitirá la generación de altos niveles de anticuerpos de alta afinidad contra el sitio funcional N-terminal del péptido Aβ1-42 con alta reactividad cruzada con las placas seniles en el cerebro de pacientes con AD. Los anticuerpos generados por el enlace con el péptido Aβ1-42 y las placas seniles se espera que aceleran la liquidación de estas placas a partir del cerebro, que promuevan la desagregación fibrilar, inhiban la agregación fibrilar, y la inmunoneutralización de las "toxinas derivadas de Aβ soluble" [también denominadas como ligandos difusibles derivados de Aβ o ADDLs].
Otro objetivo de la presente invención es desarrollar un vehículo de administración de una vacuna que sea apropiado para uso humano o veterinario para la profilaxis y el tratamiento de Enfermedad de Alzheimer.
Breve descripción de la invención
La presente invención se relaciona con una composición inmunogénica, que comprende péptidos sintéticos capaces de inducir los anticuerpos contra el sitio regulador/funcional principal del péptido Aβ con alta reactividad cruzada tanto con el péptido Aβ1-42 soluble como con las placas en el cerebro de pacientes con Enfermedad de Alzheimer (AD). Se espera que, cuando la composición inmunogénica, se administre a un paciente con AD o a una persona predispuesta a AD, se acelere la liquidación de placas amiloides y la inmunoneutralización de las toxinas derivadas de Aβ solubles en el cerebro para prevenir y tratar AD. En particular, un inmnunógeno del péptido de esta invención comprende el epitope Th de SEQ ID NO: 51 unido a un fragmento del péptido Aβ1-42 N-terminal pequeño que comprende EFRH del péptido Aβ1-42, SEQ ID NO:65. El fragmento del péptido Aβ1-42 es SEQ ID NO: 67. Opcionalmente, se pueden incluir espaciadores de aminoácidos para separar los dominios inmunogénicos. Los elementos del dominio inmunogénico separados por espaciadores se pueden unir covalentemente en cualquier orden con la condición de que cualquiera de la inmunoreactividad del hapteno del péptido se preserve sustancialmente o que la inmunoreactividad con el fragmento del péptido Aβ N-terminal, péptido Aβ1-42 soluble, y las placas se genere.
La presente invención además proporciona una composición inmunogénica que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición de péptidos en una formulación de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende un adyuvante o emulsificante seleccionado del grupo que consiste de liposina, saponina, escualeno, L121, emulsigen monofosfiril lípido A (MPL), polisorbato 80, QS21, Montanide ISA51, ISA35, ISA206 y ISA 720 así como otros adyuvantes y emulsificantes eficaces.
La presente invención además proporciona un medicamento útil para la inducción de liquidación acelerada de placas amiloides y la inmunoneutralización de las toxinas derivadas de Aβ soluble en el cerebro, para prevenir y tratar la Enfermedad de Alzheimer en un mamífero, mediante la administración de uno o más de los péptidos inmunogénicos al mamífero por un tiempo y bajo condiciones suficientes para inducir los anticuerpos dirigidos contra el sitio regulador/funcional del péptido Aβ1-42. Un ejemplo típico de una vacuna de la presente invención es una composición de péptidos que comprende 5-1000 mg del inmnunógeno del péptido en una vacuna formulada como una emulsión agua en aceite en un adyuvante y/o portador farmacéuticamente aceptable. Un típico método de la administración de la vacuna es inyectar vía intramuscular la formulación de la vacuna a dosis de 0.5-2mL en un cronograma de inmunización de intervalos de 0, 4, y 8 semanas.
Un importante factor que afecta la inmunogenicidad de un péptido sintético por un inmnunógeno fragmento N-terminal de Aβ1-42, es su presentación con el sistema inmune por los epitopes de la célula auxiliar T (Th). Tal Th es la más fiable suministrada al inmnunógeno del péptido por epitopes Th foráneos colocados en un elemento de dominio del péptido Th separado, que son extrínsecos con el péptido Aβ diana. Tales inmunógenos del péptido se pueden producir como polipéptidos híbridos por expresión de ADN recombinante. También puede ser más simple y menos costoso que sean suministrados como un inmnunógeno del péptido sintético que comprende el sitio de la célula B del hapteno diana a partir del péptido Aβ y los epitopes de la T auxiliar (Th) apropiados para el huésped. Tales péptidos reaccionan con los receptores de la célula T auxiliar y las moléculas MHC de clase II, además con sitios de enlace del anticuerpo (Babbitt et al., Nature, 1985; 317:359) y de esta manera estimular una justa respuesta de anticuerpo de sitio específico con el sitio de enlace del anticuerpo diana. Previamente tal Th fue suministrado para los inmunógenos viables del péptido Aβ1-42 por el Th intrínseco al péptido Aβ de longitud completa agregado (WO 99/66957; WO 1999/27944; Janus et al., 2000, Morgan et al., 2000) y puede ser suministrado por la proteína portadora. Un inmnunógeno del péptido completamente sintético goza de la siguientes ventajas sobre los agregados del péptido Aβ1-42, polipéptidos recombinantes y conjugados del portador en que el producto se define químicamente para un fácil control de calidad. El inmnunógeno del péptido sintético es estable. No realizar un tratamiento adicional ni una instalación de fabricación elaborada es necesario. La respuesta inmune es de sitio específico y centrado en el Aβ diana y no en el portador. De esta manera, se evitan las respuestas indeseables tales como supresión epitópica.
La inmunogenicidad de inmunógenos del péptido Aβ sintético de sitio-dirigido funcional N-terminal, se puede optimizar por (1) combinación del fragmento del péptido Aβ1-42 N-terminal con sitios Th promiscuos foráneos seleccionados con los cual la mayoría de una población es sensible; y (2) combinación del fragmento del péptido Aβ con Th cuyo repertorio se amplía a través de química combinatoria, y por lo tanto se adapta a la sensibilidad inmune variable de una población genéticamente diversa.
Se ha encontrado que la composición de los péptidos de la presente invención es efectiva para estimular la producción de anticuerpos contra el sitio regulador/funcional principal de the péptido Aβ, con reactividades cruzadas con el Aβ1-42 soluble y las placas en los cerebros de pacientes con AD. Basándose en los datos de inmunogenicidad obtenidos en conejillos de indias y babuinos, y los datos obtenidos a partir de la tinción de la inmunoperoxidasa de las placas amiloides presentes en secciones de cerebro humano con AD, mediante los sueros inmunes específicos obtenidos, se espera que los inmunógenos del péptido de la presente invención, formulados apropiadamente sean efectivos en humanos. Cabe señalar que los datos obtenidos en babuinos son particularmente significantes en que esta es una especie cuya respuesta inmune se parece mucho a la de los humanos.
Descripción detallada de la invención
Esta invención se dirige a una novedosa composición del péptido para la generación de anticuerpos policlonales de alto título con especificidad para el sitio regulador/funcional principal del péptido Aβ, con reactividades cruzadas con el Aβ1-42 soluble y las placas en el cerebro de pacientes con la Enfermedad de Alzheimer (AD). Los anticuerpos generados por la composición del péptido son de sitio altamente específico y se unen con los péptidos Aβ y con las placas amiloides en el cerebro. De esta manera, la presente invención proporciona un método efectivo para acelerar la liquidación de placas amiloides y la inmunoneutralización de toxinas derivadas de Aβ solubles en el cerebro para la prevención y el tratamiento de AD.
Los fragmentos N-terminal del péptido Aβ1-42 seleccionado del grupo que consiste de 10 a 28 aminoácidos en donde cada fragmento comprende EFRH del péptido Aβ1-42 (SEQ ID NO:65), son péptidos lineales pequeños que, por ellos mismos no son inmunogénicos. Los fragmentos pequeños del péptido Aβ1-42 pueden ser inmuno-potenciados por acoplamiento químico con una proteína portadora, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH) o por fusión con un polipéptido portador a través de la expresión de ADN recombinante, por ejemplo, antígeno superficial de hepatitis B. La deficiencia de tales vacunas "péptido Aβ(s)-proteína portadora" es que una principal porción de los anticuerpos generados son anticuerpos no-funcionales dirigidos contra la proteína portadora.
Los inmunógenos de la presente invención son inmunógenos del péptido completamente sintéticos que comprenden un fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42 de SEQ ID NO: 67 que comprende EFRH del péptido Aβ1-42 covalentemente unido al epitope Th promiscuo de SEQ ID NO: 51. Los inmunógenos de la invención inducen la producción de anticuerpos de sitio-específico que se unen con el péptido Aβ1-42 y sus agregados y tienen reactividad cruzada con las placas amiloides en el cerebro para proporcionar la liquidación acelerada de placas amiloides y la inmunoneutralización de las toxinas derivadas de Aβ soluble en el cerebro. De esta manera, el inmnunógeno de la presente invención es útil en la prevención y el tratamiento de AD.
Los resultados de anti-sueros de animales inmunizados con los péptidos inmunogénicos de la presente invención demuestran que potentes anticuerpos reactivos del péptido Aβ de sitio-dirigido se generan, en una población huésped, diversa genéticamente.
El péptido inmunogénico sintético de la presente invención comprende:
5 (i) el epitope de la célula T auxiliar (Th) de SEQ ID No: 51j
(ii) el fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42 de SEQ ID NO:67
comprende EFRH del péptido Aβ1-42; y
(iii) opcionalmente un espaciador para separar los dominios inmunogénicos.
El péptido de Th se une covalentemente a cualquiera el N-o C-terminal del fragmento N-terminal diana del péptido 10 Aβ1-42 opcionalmente con un espaciador (por ejemplo, Gly-Gly, -N Lys).
El inmnunógeno del péptido de esta invención se representa por una de las siguientes fórmulas:
(A)n-(fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42)-(B)o-(Th)m-X; o
(A)n-(Th)m-(B)o-(fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42)-X;
en donde
15 cada A es independientemente un aminoácido;
cada B es un grupo de enlace seleccionado del grupo que consiste de gly-gly, (α, -N)lys, Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO:77);
Este el epitope de la célula T auxiliar de SEQ ID NO:51 (fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42) es el péptido SEQ ID NO:67;
20 X es un α-COOH o α-CONH2 de un aminoácido;
n es de 0 a aproximadamente 10;
m es de 1 a aproximadamente 4; y
o es de 0 a aproximadamente 10.
Cuando A es un aminoácido, es un aminoácido que no ocurre naturalmente o que ocurre naturalmente. Los
25 aminoácidos que no ocurren naturalmente incluyen, pero no se limitan a, -N lisina, β-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, ácido -amino butírico, homoserina, citrulina y similares. Los aminoácidos que ocurren naturalmente incluyen alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. Cuando m es mayor que uno, y dos o más de A son aminoácidos, entonces cada aminoácido
30 independientemente puede ser igual o diferente. (A)n puede incluir un espaciador, por ejemplo, Gly-Gly, -N Lys.
B es un espaciador. Cada B es independientemente igual o diferente. B proporciona un espaciador, por ejemplo, Gly-Gly, -Lys, o lisina entre el epitope Th promiscuo y el fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42 (SEQ ID NO:67). Además, mediante la separación física el epitope Th a partir del epitope de la célula B, i.e., el fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42, el espaciador Gly-Gly o e-Lys puede desestabilizar cualquiera de las estructuras secundarias 35 artefacto creadas por la unión del epitope Th con un fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42 y por consiguiente eliminan la interferencia entre las respuestas de la célula Th y/o B. Los aminoácidos de B, también pueden formar un espaciador que actúa como una bisagra flexible que mejora la separación de Th y los fragmentos N-terminal del péptido Aβ1-42. Ejemplos de las secuencias que codifican las bisagras flexibles se encuentran en la región bisagra de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Las secuencias de la bisagra flexible son con frecuencia ricas en prolina. 40 Una bisagra flexible particularmente útil se proporciona por la secuencia Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO:77), donde Xaa es cualquier aminoácido, y preferiblemente el ácido aspártico. La separación de conformación proporcionada por B permite más interacciones eficientes entre el inmnunógeno del péptido presente y las
apropiadas células Th y las células B para mejorar las respuestas inmunes con el epitope Th y el epitope que provoca el anticuerpo o sus análogos inmunológicamente funcionales.
Th es una secuencia de aminoácidos (aminoácidos naturales o no-naturales) que comprende un epitope Th. Un epitope Th puede ser un epitope continuo o discontinuo. En un epitope discontinuo Th, no cada aminoácido de Th es necesario. Un epitope Th es capaz de aumentar o estimular una respuesta inmune al fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42. Los epitopes Th que son inmunodominantes y promiscuos tienen poblaciones humanas y de animales de alta y amplia reactividad cruzada con tipos de MHC ampliamente divergentes (Partidos et al., 1991;US5,759,551).Un segmento Th comprende una porción contigua de un epitope Th, que es suficiente para mejorar o estimular una respuesta inmune al fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42.
El epitope Th de la presente invención es un Th artificial idealizado, SEQ ID No 51. Los péptidos que comprenden Th combinatorios se producen simultáneamente en una única síntesis de péptidos de fase sólida en tándem con el fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42, A yB.
En los péptidos sintéticos de esta invención, el epitope Th se une covalentemente a través de un espaciador B a cualquiera el N-terminal o C-terminal del fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42.
Los inmunógenos del péptido de esta invención se pueden preparar mediante métodos de síntesis química que son bien conocidos por el experto en la materia. Ver, por ejemplo, Fields et al., Chapter 3 en Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p. 77. Por lo tanto, los péptidos pueden ser sintetizados utilizando las técnicas Merrifield automatizadas de síntesis de fase sólida con la α-NH2 protegida por cualquiera química t- Boc o F-moc utilizando aminoácidos protegidos de cadena lateral en, por ejemplo, un Applied Biosystems Péptido Synthesizer Model 430A o 431. La preparación de las construcciones de péptidos que comprenden péptidos de bibliotecas combinatorias para los epitopes Th, se pueden lograr proporcionando una mezcla de aminoácidos alternativos para el acoplamiento en una posición variable dada. Después del ensamblaje completo del inmnunógeno del péptido deseado, la resina se trata de acuerdo con procedimientos estándar para dividir el péptido a partir de la resina y desbloquear los grupos funcionales sobre las cadenas laterales del aminoácido. El péptido libre se purifica por HPLC y se caracteriza bioquímicamente, por ejemplo, por análisis de aminoácidos o por secuenciación. Los métodos de purificación y caracterización de péptidos, son bien conocidos por alguien de habilidad en el oficio.
El inmnunógeno de la presente invención también se puede preparar como un polímero ramificado mediante la síntesis de la construcción del péptido deseado directamente sobre una resina de núcleo poly-lysyl ramificada (Wang, et al., Science, 1991; 254:285-288).
Por otra parte, los inmunógenos del péptido sintético grande se pueden sintetizar por técnicas de ADN recombinante bien conocidas. Tales técnicas se proporcionan en manuales estándar bien conocidos con protocolos detallados. Para construir un gen que codifica un péptido de esta invención, la secuencia de aminoácidos se traduce inversa para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos, preferiblemente con codones que son óptimos para el organismo en el cual el gen se debe expresar. A continuación, un gen sintético se hace, por lo general mediante la síntesis de oligonucleótidos que codifican el péptido y cualquiera de los elementos reguladores, si es necesario. El gen sintético se inserta en un vector de clonación apropiado y se transfecta en una célula huésped. El péptido luego se expresa bajo condiciones adecuadas, apropiadas para el sistema de expresión seleccionado y huésped. El péptido se purifica y caracteriza por métodos estándar.
La eficacia de la composición del péptido de la presente invención se puede lograr, inyectando un animal, por ejemplo, conejillos de indias, con una composición inmunogénica que comprende los péptidos de la invención. Ver, Tabla 4, SEQ ID NOS:70-75. La respuesta inmune humoral al fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42 y el péptido Aβ1-42 soluble se monitorea. Una descripción detallada de los procedimientos utilizados se proporciona en los Ejemplos a continuación.
Otro aspecto de esta invención, proporciona una composición del péptido que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de uno o más de los inmunógenos del péptido de esta invención en un sistema de administración farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, la composición del péptido sujeto, se puede formular como una vacuna utilizando adyuvantes, portadores u otros ingredientes farmacéuticamente aceptables rutinariamente empleados en la formulación de vacunas. Entre los ingredientes que se pueden utilizar en esta invención son adyuvantes o emulsificantes incluyendo alum, liposina, saponina, escualeno, L121, emulsigen monofosfiril lípido A (MPL), polisorbato 80, QS21, Montanide ISA51, ISA35, ISA206 y ISA 720 así como otros adyuvantes y emulsificantes eficaces. La composición se puede formular para liberación inmediata o liberación controlada. La composición también se puede formular por inducción de la inmunidad sistémica, por ejemplo, por compresión o coadministración con micropartículas. Tales formulaciones son fácilmente disponibles por alguien de habilidad en el oficio.
Los inmunógenos de la presente invención se pueden administrar vía cualquier ruta convencional, tal como vía subcutánea, oral, intramuscular, parenteral o enteral. Los inmunógenos se pueden administrar en una dosis única o en dosis múltiples. Un apropiado cronograma de inmunización se determina fácilmente y está disponible por alguien de habilidad en el oficio.
5 La composición del péptido de la presente invención comprende una cantidad efectiva de uno o más de los inmunógenos del péptido de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Dicha composición en una forma de unidad de dosificación apropiada generalmente contiene aproximadamente 0.25 mg a aproximadamente 500 mg del inmnunógeno por kg de peso corporal. Cuando se entrega en dosis múltiples, la cantidad efectiva se puede dividir convenientemente por unidad de dosificación. Por ejemplo, una dosis inicial, por
10 ejemplo 0.0025-0.5 mg por kg de peso corporal; preferiblemente 1-50 mg por kg de peso corporal del inmnunógeno del péptido se debe administrar por inyección, preferiblemente vía intramuscular, después de una dosis repetida (refuerzo) de una cantidad similar. La dosificación dependerá de la edad, peso y salud general del sujeto, como es bien conocido en los oficios de vacunas y terapéuticos.
La respuesta inmune de inmunógenos del péptido sintético Aβ1-42 se puede mejorar por la entrega a través de
15 atrapamiento en o sobre micropartículas biodegradables del tipo descrito por O’Hagan et al. (Vacuna, 1991; 9: 768771). Los inmunógenos se pueden encapsular con o sin un adyuvante en micropartículas biodegradables, para potenciar las respuestas inmunes, y para proporcionar la liberación de tiempo controlado para respuestas controladas o periódicas, y para la administración oral, (O’Hagan et al., 1991; and, Eldridge et al., 1991; 28: 287294).
20 Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención. El alcance de la invención no se limita a los inmunógenos del péptido específico y las composiciones proporcionadas. Los ejemplos demuestran que los inmunógenos del péptido de la presente invención son útiles para provocar anticuerpos de sitio-dirigido para ambos fragmentos de Aβ1-10 y Aβ1-14 así como anticuerpos de reactividad cruzada con los péptidos Aβ1-42 solubles a partir de 4 semanas después de la inmunización inicial.
MÉTODOS TÍPICOS PARA SINTETIZAR INMUNÓGENOS DEL PÉPTIDO Aβ DE LA PRESENTE INVENCIÓN
Los inmunógenos de péptidos enumerados en la Tabla 4 (SEQ ID NOS:70-76 mientras que SEQ ID NOS: 70,71, 72, 74, 75, y 76 no caen dentro del alcance de la presente invención y son sólo de referencia) fueron sintetizados individualmente mediante la técnica de síntesis de fase sólida Merrifield en Applied Biosystems automated péptido 30 synthesizers (Modelos 430, 431 y 433A) utilizando la química Fmoc. La preparación de los inmunógenos del péptido que comprenden un Th a partir de la librería combinatoria, i.e., sitio Th artificial idealizado tal como MvF derivado Th1-8 (SEQ ID NOs:38-40), se puede lograr proporcionando una mezcla de los aminoácidos deseados para el acoplamiento químico en una posición dada como se especifica en el diseño. Después del ensamblaje completo del péptido deseado, la resina se trató de acuerdo con el procedimiento estándar utilizando ácido trifluoroacético para
35 dividir el péptido de la resina y desbloquear los grupos protectores sobre las cadenas laterales del aminoácido. Los péptidos transformados, extraídos y lavados se purificaron por HPLC y se caracterizaron por espectrometría de masas y HPLC de fase reversa.
EJEMPLO 2
EVALUACIÓN DE LA INMUNOGENICIDAD DE LOS INMUNÓGENOS DEL PÉPTIDO Aβ DE LA PRESENTE
40 INVENCIÓN Los inmunógenos del péptido derivado de Aβ, fueron evaluados en grupos de conejillos de indias como se especifica
por el protocolo de inmunización experimental descrito a continuación y mediante pruebas serológicas para la
determinación de la inmunogenicidad.
Diseño Experimental Estándar:
45 Inmunógenos:
- (1)
- inmnunógeno del péptido individual; o
- (2)
- una mezcla de inmunógenos del péptido molar igual como se especifica en cada ejemplo. Dosis: 100 µg en 0.5 mL por inmunización a menos que se especifique de otra manera
Ruta: intramuscular a menos que se especifique de otra manera
Adyuvantes: Adyuvante de Freund completo (CFA)/ Adyuvante Incompleto (IFA); o emulsiones agua en aceite a menos que se especifique de otra manera. Los grupos CFA/IFA recibieron CFA en la semana 0, IFA en las semanas posteriores.
Programa de Dosis: 0, 3, y 6 semanas o especificados de otra manera.
Cronograma de Sangrado: semanas 0, 5, 8 o especificadas de otra manera
Especie: conejillos de indias Duncan-Hartley o especificados de otra manera
Ensayo: ELISAs específicos para cada actividad anti-péptido de suero inmune. El sustrato de fase Sólida fue el fragmento del péptido Aβ por ejemplo Aβ1-14 o Aβ1-42 de longitud completa (SEQ ID NOs: 67 y 65 sólo de referencia). La sangre se recolectó y procesó en suero, y se almacenó antes del ELISA con los péptidos diana.
Las inmunoreactividades de los anticuerpos inducidos contra los péptidos Aβ y contra los péptidos Aβ1-42 solubles fueron determinadas por ELISAs (ensayos inmunoabsorbentes de enzima ligada) utilizando placas de microtitulación de fondo plano de 96 pozos que fueron cubiertas con los fragmentos del péptido Aβ1-42, SEQ ID NOs: 67 o 65 sólo de referencia como el inmunosorbente. Las alícuotas (100 µL) de la solución del inmnunógeno del péptido a una concentración de 5 µg/mL fueron incubadas durante 1 hora a 37˚C. Las placas fueron bloqueadas por otra incubación a 37˚C durante 1 hora con una solución de gelatina/PBS al 3%. A continuación, las placas bloqueadas se secaron y utilizaron para el ensayo. Las alícuotas (100 µL) de los sueros inmunes de prueba, iniciando con una dilución 1:100 en una solución reguladora de dilución de muestra y diluciones en serie de diez veces en lo sucesivo, fueron adicionadas a las placas recubiertas del péptido. Las placas fueron incubadas durante 1 hora a 37˚C.
Las placas se lavaron seis veces con solución reguladora de PBS/Tween® al 0.05%. 100 µL del anticuerpo específico anti-especie-cabra marcado con peroxidasa de rábano picante, fueron adicionados a apropiadas diluciones en solución reguladora de dilución conjugada (Solución reguladora de fosfato que contiene NaCl 0.5M, y suero de cabra normal). Las placas fueron incubadas durante 1 hora a 37˚C antes de ser lavadas como arriba. Las alícuotas (100 µL) de solución de sustrato o-fenilenodiamina luego fueron adicionadas. El color se dejó desarrollar durante 5-15 minutos antes de que la reacción de color enzimático fuera detenida, por la adición de 50 µL de H2SO4 2N. La A492nm de los contenidos de cada pozo se leyó en un lector de placa. Los títulos de ELISA fueron calculados basados en el análisis de regresión lineal de las absorbancias, con un corte A492nm ajustado a 0.5. El valor de corte seleccionado fue riguroso con los valores para muestras control normales diluidas que era menos de 0.15.
EJEMPLO 3
CARACTERIZACIÓN DE LAS INMUNOGENICIDADES RELATIVAS DE Aβ1-42 Y SUS FRAGMENTOS NTERMINALES PARA LA OPTIMIZACIÓN DEL DISEÑO PARA VACUNA SINTÉTICA BASADA EN PÉPTIDO Aβ DE SITIO-DIRIGIDO (solo Aβ1-14 cae dentro del alcance de la invención)
Para diseñar una vacuna sintética total que genera un alto nivel de anticuerpos de alta afinidad contra los péptidos Aβ con alta reactividad cruzada a los péptidos Aβ1-42 solubles y las placas en el cerebro de pacientes con AD, las inmunogenicidades relativas de Aβ1-42 y sus fragmentos N-terminal fueron caracterizados inicialmente. Con el fin de determinar las propiedades inmunológicas relativas de las diferentes regiones dentro del péptido Aβ1-42, un adyuvante suave apropiado para uso humano, alum fue empleado en el primer estudio. Las inmunogenicidades relativas del péptido Aβ1-42 y un fragmento N-terminal de estos, Aβ1-28 se compararon. La evaluación de inmunogenicidad se realizó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 2. Inesperadamente, se encontró que Aβ1-28 era más inmunogénico que el péptido Aβ1-42, indicando que existe inmunosupresión dentro del fragmento C-terminal Aβ29-42 (Tabla 5).
Posteriormente, las inmunogenicidades de Aβ1-28 se compararon con Aβ1-14, un fragmento N-terminal pequeño de Aβ1-42. Un adyuvante más potente apropiado para uso humano (Montanide ISA51, Seppic, Paris, FR) fue empleado para la preparación de una emulsión agua-en-aceite para formular la vacuna. Basándose en los datos obtenidos como se muestra en la Tabla 6, las inmunogenicidades relativas para los tres péptidos Aβ (i.e. Aβ1-14, Aβ1-28 y Aβ1-42 fueron clasificados Aβ1-28 > Aβ1-42 >Aβ1-14. Sorprendentemente, la pérdida del C-terminal 14mer de Aβ1-42, mejora en lugar de reducir la inmunogenicidad. La respuesta de anticuerpo contra Aβ se dirige en primer lugar a la región N-terminal, de manera particular el fragmento N-terminal Aβ1-14 como se muestra por los datos de ELISA (Tabla 6). Sin embargo, una reducción adicional del fragmento Aβ1-28 a partir del C-terminal para formar el fragmento Aβ1-14 resultó en una pérdida de inmunogenicidad.
El fragmento Aβ1-14 pequeño contiene el sitio regulador/funcional principal, EFRH, localizado en la posición 3-6 del péptido Aβ1-42 como se reporta por Solomon et al. El bloqueo de este epitope por los anticuerpos modula las dinámicas de agregación como también la resolubilización de los agregados ya formados (Soloman et al., Proc Natl Acad. Sci, 1996; 93:452-455; Proc Natl Aca. Sci, 1997; 94:4109-4112). La mayoría de los anticuerpos anti- Aβ1-28 y Aβ1-42 se dirigen contra el fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42 que contiene este epitope (Tabla 6). Sin embargo, el fragmento Aβ1-14 por si mismo fue muy poco inmunogénico. Los resultados de este experimento sugieren la presencia de un epitope Th intrínseco dentro del segmento Aβ15-28. Este epitope Th intrínseco cuenta para las moderadas inmunogenicidades de los péptidos Aβ1-28 y Aβ1-42 en conejillos de indias.
La presencia de un epitope Th en el fragmento Aβ15-28 es deseable. Sin embargo, es deseable que sea capaz de diseñar un inmnunógeno más potente para una vacuna humana exitosa cuando se enfrenta con la limitación de una molécula MHC humana restringida, el número de dosis apropiada y el tipo de adyuvante permitido para uso humano. Por lo tanto, se ensayaron el enlace de un Th foráneo o extrínseco tal como aquel que se deriva del Th HBV (SEQ ID NO: 1) con el C-terminal del péptido Aβ1-28 (SEQ ID NO:66). El epitope Th extrínseco mejora significativamente la inmunogenicidad del fragmento Aβ1-28 como se muestra en la Tabla 6. La respuesta del anticuerpo con el inmnunógeno de ingeniería con el fragmento Aβ1-28 permaneció dirigido al fragmento N-terminal funcional del inmnunógeno del péptido (SEQ ID NO: 70) haciendo está construcción un inmunógeno mejor que el fragmento Aβ128 o fragmento Aβ1-42 solo. Este inmnunógeno del péptido (SEQ ID NO: 70) representa un inmnunógeno del péptido con the fórmula:
(A)n (fragmento N-terminal del péptido Aβ) -(B)o -(Th)m en donde:
A es αNH2, con Aβ1-28 que es un fragmento N-terminal de Aβ1-42;
B es glicina;
Th es un epitope de la célula T auxiliar derivada a partir de un patógeno foráneo, HBsAg Th (SEQ ID NO: 1), y en donde n es 1,
m es 1 y o es 2.
EJEMPLO 4
LIMITE INFERIOR DEL FRAGMENTO N-TERMINAL DE Aβ PARA EL DESARROLLO DE VACUNA SINTÉTICA BASADA EN Aβ PARA AD (solo Aβ1-14 cae dentro del alcance de la presente invención)
Dado que el sitio regulador/funcional principal que comprende los residuos EFRH se localiza en la posición 3-6 del péptido Aβ1-42 (Soloman et al. Proc Natl Acad. Sci, 1996; 93:452-455; Proc Natl Aca. Sci, 1997; 94:4109-4112), fue útil para explorar el fragmento N-terminal más pequeño del péptido Aβ1-42 como un sitio diana óptimo de la célula B sobre Aβ para la incorporación en el inmnunógeno sintético de la presente invención.
Cada uno de los diferentes fragmentos N-terminal no-imnunogénicos pequeños de Aβ, Aβ1-10, Aβ1-12, Aβ1-14 junto con Aβ1-28 fue incorporado en inmunógenos diseñados con un representativo Th artificial idealizado (SEQ ID NO:51). El enlace fue a través de un espaciador αN-Lys. Las construcciones de ingeniería fueron formuladas con adyuvantes fuertes debido a la baja inmunogenicidad esperada de los fragmentos pequeños Aβ. Las tres construcciones sintéticas fueron formuladas en adyuvante de Freund incompleto y completo y probadas para sus inmunogenicidades basándose en procedimientos como se describe en el Ejemplo 2. Como se muestra en la Tabla 7, todos los cuatro inmunógenos del péptido fueron altamente inmunogénicos con títulos de ELISA Log10 en el rango de 4.3 a 5.6 [i.e. 104.3 a 105.6] con muy altas reactividades cruzadas con el péptido Aβ1-42 de longitud completa después de solamente cuatro semanas a partir de la inmunización inicial. Más considerablemente, los fragmentos tan pequeños como Aβ1-10, Aβ1-12 y Aβ1-14 cada uno unido al Th artificial idealizado (SEQ ID NO:51) se encontraron que eran altamente inmunogénicos después del enlace con un epitope Th artificial revelado (Tabla 7). Estos inmunógenos del péptido fueron diseñados de acuerdo con la fórmula:
(A)n-(fragmento N-terminal del péptido Aβ)-(B)o-(Th)m en donde:
A es αNH2, en donde el fragmento N-terminal es Aβ1-10, Aβ1-12, Aβ1-14 o Aβ1-28;
B es -N Lisina, un espaciador unido a través de su grupo amino épsilon con el siguiente aminoácido;
Th es un epitope de la célula T auxiliar derivado de un Th artificial idealizado, MVF Th1-16(SEQ ID NO:51), en donde n es 1, m es 1 y o es 1.
Se encontró que otra reducción en la longitud del fragmento N-terminal de Aβ con menos de un 10mer daría por resultado una más limitada, por lo tanto indeseable, inmunogenicidad. Parece que los péptidos más pequeños de 10 aminoácidos son problemáticos para el reconocimiento del receptor por las moléculas MHC de clase II (Immunology, Fifth edition, ed. Roitt et al., 1998, Mosby International Ltd., London, pp88-89).
Basándose en este estudio de Aβ, el sitio de la célula B útil derivado de Aβ1-42 debería estar en el rango de tamaño de aproximadamente 10 a aproximadamente 28 residuos.
EJEMPLO 5
INMUNOREACTIVIDAD DE SITIO-DIRIGIDO, DIRIGIDA POR EL INMUNÓGENO DEL PÉPTIDO SINTÉTICO LIGADO AL EPITOPE Th ARTIFICIAL
El fragmento N-terminal no-inmunogénico tal como Aβ1-14 del péptido Aβ se unió ya sea a través de un espaciador N-lisina a un péptido Th artificial designado como MVF Th 1-16 (SEQ ID NO:51), o a través de un procedimiento de acoplamiento químico estándar a una proteína portadora convencional KLH. Las dos construcciones inmunogénicas fueron evaluadas en conejillos de indias por sus inmunogenicidades de "sitio-dirigido" relativas con el péptido Aβ y la reactividad respectiva resultante de los anticuerpos hacia sus portadores respectivos, el epitope Th artificial o la proteína portadora KLH, de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 2. El péptido Aβ1-14 pequeño solo como un inmnunógeno control, y las dos construcciones inmunogénicas fueron formulados en una emulsión agua-en-aceite que contiene el adyuvante ISA51, una formulación que es apropiada para uso humano. Como se muestra en la Tabla 8, el fragmento N-terminal de Aβ1-14 por sí mismo no es inmunogénico como se esperaba. El inmnunógeno sintético que comprende el fragmento de Aβ1-14 y Th artificial (SEQ ID NO: 73) sólo de referencia, se encontró que era altamente inmunogénico en la producción de anticuerpos dirigidos del sitio con Aβ1-14. También se encontró que los anticuerpos tienen alta reactividad cruzada con el péptido Aβ1-42 soluble a partir de 4 semanas después de la inmunización inicial (títulos de Log10 de 4.094 y 4.126 para 4 y 6 semanas después de la inmunización inicial respectivamente). Cuando estos sueros inmunes de titulo de alta reactividad de Aβ se probaron con ELISA sobre la placa recubierta con el péptido MVF Th1-16 (SEQ ID NO 51), se encontró que eran negativos (títulos de Log10 de 0.038 y 0.064 por 4 y 6 semanas después de la inmunización inicial respectivamente) mostrando que no se produjeron anticuerpos irrelevantes. Los datos obtenidos como se muestra en la Tabla 8 demostraron claramente la característica de sitio-dirigido altamente específico del inmnunógeno del péptido de la presente invención.
Se encontró que los inmunógenos con la proteína portadora KLH, eran altamente inmunoreactivos con el convencional conjugado péptido-proteína portadora (por ejemplo títulos de Log10 de 4.903 y 5.018 para 4 y 6 semanas después de la inmunización inicial respectivamente). Sin embargo, los anticuerpos inducidos tuvieron solo moderada reactividad cruzada con el péptido Aβ1-42 soluble (por ejemplo con títulos de Log10 de 3.342 y 2.736 para 4 y 6 semanas después de la inmunización inicial respectivamente). Esto es aproximadamente 10X a 100X menos que la SEQ ID NO:73. Inesperadamente, los inmunógenos del péptido de la presente invención fueron altamente dirigidos del sitio y centrados. Los anticuerpos importantes solo funcionalmente hacia los sitios anti-agregación y desagregación en el fragmento N-terminal del péptido Aβ se generaron en lugar de hacia sitios portadores irrelevantes.
EJEMPLO 6
EVALUACIÓN DEL INMUNÓGENO DEL PÉPTIDO Aβ MEDIANTE REACTIVIDADES CRUZADAS PARA LAS PLACAS SENILES (solo Aβ1-14 cae dentro del alcance de la presente invención)
Los cerebros de pacientes con AD con placas y ovillos neurofibrilares y vasos sanguíneos positivos a la tioflavina S (TSBV) que contienen placas amiloides fueron utilizados para la evaluación de reactividades cruzadas a placas seniles poliméricas de los sueros inmunes construidos en conejillos de indias y babuinos contra inmunógenos del péptido Aβ. Las reactividades en placas y TSBV se detectaron por tinción de la inmunoperoxidasa utilizando método Complejo de Anticuerpo Avidina-Biotinilado (ABC) o por tinción de inmunofluorescencia utilizando fragmento Fab conjugado con rodamina de anti-IgG específico de la especie. Todos los sueros de conejillo de india fueron probados a una dilución de 1:100 con títulos de punto final determinados por algunas de las muestras. Todos los sueros de babuinos fueron probados a una dilución de 1:50. La evaluación de los sueros inmunes y preinmunes fueron realizados suavemente bajo el código por Dr. Gaskin según se describe (Gaskin et al., J. Exp Med. 165:245, 1987).
El suero normal preinmune y los sueros inmunes de conejillos de indias recolectados a 6 semanas después de la inmunización inicial se probaron con tinción de inmunoperoxidasa sobre secciones de criostato a partir del cortex temporal de AD rico en placas y ovillos de neurofilamentos (NFT). Los sueros inmunes utilizados en el primer estudio fueron obtenidos a partir de animales inmunizados con Aβ1-28 -K-MvF Th1-16 (SEQ ID NO:74) preparados en emulsión agua-en-aceite ISA51. Los resultados muestran enlace significante con ambas placas seniles y placas amiloides en los vasos sanguíneos positivos a la tioflavina S (TSBV). Inesperadamente, en contraste con los resultados obtenidos con la vacuna formulada con ISA51, enlace preferencial con las placas Aβ1-28 en los vasos sanguíneos (TSBV) fueron observados para los sueros construidos contra la vacuna CFA/ICFA. Esto significa que los anticuerpos inducidos por la vacuna formulada con ISA51 se distinguen de los anticuerpos construidos por la vacuna formulada en CFA/ICFA. Además, los anticuerpos generados por las vacunas formuladas de acuerdo con la presente invención proporcionaron anticuerpos que tienen la deseada mayor reactividad cruzada a las placas seniles en el tejido de cerebro. El suero preinmune no dio la tinción en secciones en serie correspondientes.
Los sueros obtenidos de los animales inmunizados con Aβ1-28-K-MVF Th 1-16 (Seq ID NO:74) preparados en emulsión agua-en-aceite ISA 51 tiñeron fuertemente las placas que forman un patrón de núcleos. Una vez más, sorprendentemente, la tinción con sueros inmunes preparados contra la formulación CFA/ICFA correspondiente dio un patrón de tinción diferente en el que las reactividades con placas fueron predominantemente en los vasos sanguíneos diferentes que con las placas en el tejido de cerebro. El suero preinmune no tiño las secciones. Los sueros hiperinmunes generados por la inmunización con el péptido Aβ1-42 solo en CFA/ICFA, a pesar de sus fuertes reactividades con Aβ1-28 por ELISA, dieron un patrón de tinción sorprendentemente débil.
La inmunotinción similar del tejido de cerebro AD se desarrolló con 11 sueros inmunes y preinmunes mezclados obtenidos de conejillos de indias inmunizados con las diferentes formulaciones de las vacunas descritas en los Ejemplos 3, 4 y 5. Estos sueros también fueron evaluados por sus reactividades de los anticuerpos con el sitio funcional mediante un ELISA de Aβ1-14, y con el Aβ1-42 soluble mediante el ELISA Aβ1-42 (Tabla 9). En general, se encontraron tendencias paralelas con sueros probados en los tres ensayos. Como se muestra en la Tabla 9, las reactividades anti-péptido del suero pre-inmune y los sueros construidos contra el péptido Aβ1-14 pequeño solo formulados en emulsión agua-en-aceite ISA51 por el ELISA fueron bajas y las reactividades cruzadas a las placas fueron insignificantes. Las reactividades moderadas se encontraron con sueros a partir de animales vacunados con péptido Aβ1-28 solo formulado en Alum y en ISA51, y Aβ1-14 conjugado con KLH y formulado en ISA51. Dado que, reactividades de sitio-dirigido significantes con el sitio funcional de Aβ1-14, con Aβ soluble, y con las placas y TSBV en secciones de tejido de cerebro de paciente con AD se encontraron con sueros de animales inmunizados con inmunógenos Aβ/Th sintéticos de la presente invención. Los resultados obtenidos a partir de estos estudios, por consiguiente, demuestran excelente y útil inmunogenicidad de los inmunógenos del péptido que comprenden el fragmento N-terminal de Aβ1-42 que tienen aminoácidos de 1-28 a aproximadamente 1-10, unidos a epitopes Th foráneos. Además, los resultados mostraron que la presencia de un epitope Th foráneo mejora la inmunogenicidad de los inmunógenos del péptido de la presente invención a un grado sorprendente. Los inmunógenos del péptido de la presente invención en formulaciones clínicamente aceptables de las vacunas aceptables para su uso en humanos, generaron anticuerpos que tienen la deseada reactividad cruzada con las placas seniles en los tejidos de cerebro de pacientes con AD.
EJEMPLO 7
LA INMUNOGENICIDAD DE VACUNAS DEL PÉPTIDO Aβ REPRESENTATIVAS EN BABUINOS COMO PREDICTOR DE LA EFICACIA INMUNOTERAPÉUTICA PARA AD (solo Aβ1-14 cae dentro del alcance de la presente invención)
Un inmnunógeno sintético representativo, Aβ1-28--K-MvF Th1-16 (SEQ ID NO:74), formulado en emulsión agua-enaceite ISA51 a niveles de dosis de 25ug/0.5mL,100ug/0.5mL y 400ug/0.5mL fueron administrados a tres babuinos Y299, X398, X1198 en un cronograma de 0,3 y 6 semanas a partir de la inmunización inicial. Pre-sueros inmunes y sueros a 5 semanas y 8 semanas después de la inmunización inicial (wpi) fueron recolectados. Por comparación, un cuarta babuino X798 fue administrado con una dosis de 100ug/0.5mL de una mezcla equimolar de péptidos libres Aβ1-28 y Aβ1-42 formulada en alum, el adyuvante estándar aprobado para uso humano. Sueros preinmunes fueron utilizados como el control negativo.
Los sueros de los cuatro animales inmunizados fueron recolectados y evaluados por sus reactividades de los anticuerpos con el sitio funcional mediante el ELISA de Aβ1-14, y por reactividades con Aβ1-42 soluble mediante el ELISA de Aβ1-42 (para sueros recolectados a 0,5 y 8 wpi). Las reactividades cruzadas de los anti-sueros (8wpi solamente) con las placas seniles y las placas en vasos sanguíneos positivos a la tioflavina S fueron evaluados por inmunotinción como se describe en el Ejemplo 6. En lugar de utilizar Ig anti-babuino, el detector del anticuerpo utilizado es un fragmento Fab a partir de un IgG anti-humano que reconoce todos los isotipos humanos y tiene reacción cruzada con IgG babuino.
Tendencias paralelas de nuevo se encontraron con sueros probados en los tres ensayos. Como se muestra en la Tabla 10, pre-sueros inmunes fueron negativos. Reactividades moderadas de ELISA se encontraron con suero a partir de animal X798 vacunado con Aβ1-28 y Aβ1-42 formulado en Alum. Sin embargo, la reactividad de este suero fue débil para el reconocimiento de placas seniles. En contraste, las reactividades de sitio-dirigido significantes para el sitio funcional de Aβ1-14, para Aβ1-42 soluble, y para las placas y TSBV en secciones de cerebro de paciente con AD se encontraron con sueros recolectados a 8 semanas después de la inmunización inicial a partir de animales inmunizados con la composición representativa de la invención (SEQ ID NO:74) en ambas la dosis de 100ug/0.5mL y de 400ug/0.5mL formuladas con ISA51. Los resultados obtenidos a partir de este estudio de babuino, por consiguiente, demostraron la utilidad del inmnunógeno de la presente invención en una formulación de la vacuna apropiada para humanos. La mejora en inmunogenicidad (10 a 100X aumenta en títulos de anticuerpo específicos para el sitio funcional de Aβ) es muy significante en comparación con la vacuna del péptido del oficio previo con la sensibilidad inmune en babuinos muy parecida a la de los humanos.
Del mismo modo, una mezcla que contiene dos a tres inmunógenos sintéticos de la presente invención se pueden utilizar para la formulación en vacunas de aproximadamente 25 a 1000 ug por dosis para inducir anticuerpos antiAβ1-14 funcionales en poblaciones humanas genéticamente diversas para la prevención y el tratamiento de AD. Una amplia inmunogenicidad en humanos se espera debido a la presencia de un epitope Th promiscuo en el inmnunógeno del péptido de la invención que se proporciona para lograr un amplio reconocimiento de MHC.
Tabla 1 (sólo de referencia)
- Epitopes Promiscuos de la Célula Auxiliar T (Th) derivados de Patógenos
- Descripción de Th
- Secuencia de Aminoácidos SEQ ID NO
- HBs Tha
- FFLLTRILTIPQSLD 1
- PT1 Tha
- KKLRRLLYMIYMSGLAVRVHVSKEEQYYDY 2
- TT1 Tha
- KKQYIKANSKFIGITEL 3
- TT2 Tha
- KKFNNFTVSFWLRVPKVSASHL 4
- PTIA Tha
- YMSGLAVRVHVSKEE 5
- TT3 Tha
- YDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIK 6
- PT2 Tha
- GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL 7
- MVF1 Tha
- LSEIKGVIVHRLEGV 8
- MVF2 Tha
- GILESRGI KARITHVDTESY 9
- TT4 The
- WVRDIIDDFTNESSQKT 10
- TT5 Tha
- DVSTIVPYIGPALNHV 11
- CT Tha
- ALNIWDRFDVFCTLGATTGYLKGNS 12
- DT1 Tha
- DSETADNLEKTVAALSILPGHGC 13
- DT2 Tha
- EEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAATNFVESC 14
- PF Tha
- DHEKKHAKMEKASSVFNWNS 15
- SM Tha
- KWFKTNAPNGVDEKHRH 16
- TraT1 Tha
- GLQGKHADAVKAKG 17
- TraT2 Tha
- GLAAGLVGMAADAMVEDVN 18
- TraT3 Tha
- STETGNQHHYQTRVVSNANK 19
- HBc50-69 b
- SDFFPSVRDLLDTASALYRE 20
- CTP11 Thc
- TINKPKGYVGKE 21
- a US 5,759,551
b Ferrari et al., J Clin Invest, 1991; 88:214 c Stagg et al., Immunology, 1993; 71:1
Tabla 2 Tabla 3 Tabla 4
- Th Idealizado Artificial y Biblioteca Combinatoria de Th Idealizado Artificial a. Epitopes de Th y MVF Th derivado de estos
- Identificador de Th
- Secuencia de Aminoácidos SEQ ID NO
- MVF Th1
- LSEIKGVIVHRLEGV 22
- SSAL1 Th1 *
- DLSDLKGLLLHKLDGL 23 24 25 26
- MVF Th1-1*
- ISEIKGVIVHKIEGI 27 28 29
- MVF Th1-2 *
- 30 31
- MVF Th1-3 *
- MSEIKGVIVHKLEGM LT MRT TRM TV 32 33
- MVF Th1-4 *
- ISEIKGVIVHKIEGI 34
- MVF Th1-5 *
- ITEIRTVIVTRIETI 35
- MVF Th1-6 *
- MSEMKGVIVHKMEGM 36
- MVF
- LTEIRTVIVTRLETV 37
- Th1-7 * MVF Th1-8 *
- ISISEIKGVIVHKIEGILF 38 39 40
- MVF Th1-9 *
- ISISEIKGVIVHKIEGILF 41
- T RT TR T
- 42
- MVF Th1-10 *
- 43 44
- MVF Th1-11 *
- 45 46
- MVF Th1-12 *
- ISISEIKGVIVHKIEGILF 47
- MVF Th1-130 *
- ISITEIRTVIVTRIETILF 48
- MVF Th1-14 *
- ISMSEMKGVIVHKMEGMLF 49
- MVF Th1-15 *
- ISLTEIRTVIVTRLETVLF 50
- MVF Th1-16
- ISITEIKGVIVHRIETILF 51
- b. HBsAg Th, Prototipo y Derivados (sólo de referencia)
- Identificador de Th
- Secuencia de Aminoácidos SEQ ID NO
- HbsAg-Th1
- FFLLTRILTIPQSLD 52
- HbsAg-Th1-1
- KKKFFLLTRILTIPQSLD 53
- HbsAg-Th1-2
- FFLLTRILTIPQSL 54
- SSAL2 Th2
- 55 56 57 58 59
- HbsAg Th1-3
- KKKIITITRIITIITTID 60
- HbsAg Th1-4
- KKKIITITRIITIITTI 61
- HbsAg Th1-5
- KKKMMTMTRMITMITTID 62
- HbsAg Th1-6
- FITMDTKFLLASTHIL 63
- HbsAg Th1-7
- KKKFITMDTKFLLASTHIL 64
- * no dentro del alcance de la invención
- Secuencias de Aminoácidos de Péptidos Aβ1-42 y sus Fragmentos N-terminal
- SEQ ID NO
- Secuencia de Aminoácidos
- SEQ ID NO:65* SEQ ID NO:66*
- Aβ1-42 Aβ1-28 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK
- SEQ ID NO:67 Aβ1-14
- Aβ1-14 DAEFRHDSGYEVHH
- SEQ ID NO:68*
- Aβ1-12 DAEFRHDSGYEV
- SEQ ID NO:69 *
- Aβ1-10 DAEFRHDSGY
- * no dentro del alcance de la invención
- Inmunógeno
- Secuencia de Aminoácidos SEQ ID NO
- Aβ1-28-GG-HBV Th
- DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-GG-FFLLTRILTIPQSLD 70 *
- Aβ1-10-K-IS-MVF Th1-16
- DAEFRHDSGY-EK-ISITEIKGVIVHRIETILF 71 *
- Aβ1-12-K-IS-MVF Th1-16
- DAEFRHDSGYEV-K-ISITEIKGVIVHRIETILF 72 *
- Aβ1-14-EK-IS-MVF Th1-16
- DAEFRHDSGYEVHH-EK-ISITEIKGVIVHRIETILF 73
- Aβ1-28-EK-IS-MVF Th1-16
- DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-KISITEIKGVIVHRIETILF 74 *
- Aβ1-14-K-MVF Th1-9
- 75 * 76 *
- * no dentro del alcance de la invención
Tabla 5 (sólo de referencia)
- Inmunógeno
- Adyuvante GP ID # Título de ELISA (Log10)
- 4 WPI
- 6 WPI
- Aβ1-14
- Media Aβ1-42 Media Aβ1-14 Media Aβ1-42 Media
- Aβ1-28 (SEQ ID NO:66)
- Alum 1630 1.244 2.326 2.401 0.878 0.888 1.966 1.202 2.405
- 1631
- 3.408 3.924 3.044 3.608
- Aβ1-42 (SEQ ID NO:65)
- Alum 1634 0.773 1.124 0.680 1.461 1.062 1.784 1.203 1.807
- 1635
- 1.474 2.242 2.505 2.510
Tabla 6
- Inmunógeno
- Adyuvante GP ID # Título de ELISA (Log10)
- 4 WPI
- 6 WPI
- Aβ1
- Media Aβ1 Media Aβ1 Media Aβ1 Media
- 14
- 42 14 42
- AP1-14 (SEQ ID NO: 67)
- ISA51 1658 1.168 1.129 1.229 0.975 1.100 1.271 1.285 1.080
- 1659
- 1.090 0.720 1.441 0.874
- Aβ1-28(SEQID NO:66)*
- ISA51 1632 2.341 2.291 3.656 3.382 2.276 2.715 3.359 3.455
- 1633
- 2.241 3.107 3.153 3.550
- AP1-28-GGHBVTh (SEQ ID NO: 70)
- ISA51 1642 4.792 4.612 4.526 4.582 4.548 4.498 4.441 4.261
- 1643
- 4.432 4.637 4.447 4.081
- Aβ1-42(SEQID NO:65)*
- ISA51 1636 2.724 1.864 3.603 2.402 2.286 1.997 3.250 2.873
- 1637
- 1.004 1.201 1.707 2.495
- * no dentro del alcance de la invención
Tabla 7
- Inmunógeno
- Adyuvante GP ID # Título de ELISA (Log10)
- 4 WPI
- 6 WPI
- Aβ1-14
- Media Aβ1-42 Media Aβ1-14 Media Aβ1-42 Media
- Aβ1-10-k-MVF Th1-16 (SEQ ID NO:71*)
- CFA/IFA 1666 4.293 4.495 4.924 5.087 4.414 4.320 5180 5.265
- 1667
- 4.696 5.250 4.225 5.350
- Aβ1-12-k-MVF Th1-16 (SEQ ID NO:72*)
- CFA/IFA 1664 4.577 4.495 5.100 4.891 5.320 4.545 6.000 5.278
- 1665
- 4.322 4.682 3.700 4.555
- Aβ1-14-k-MVF Th1-16 (SEQ ID NO:73)
- CFA/IFA 1660 3.700 3.285 4.677 5.060 4.544 4.683 5.250 5.625
- 1661
- 4.764 5.443 4.822 6.000
- Aβ1-28-k-MVF Th1-16 (SEQ ID NO:74*)
- CFA/IFA 1584 3.355 3.201 4.610 4.328 2.743 3.592 4.487 4.901
- 1585
- 3.707 4.688 3.731 5.155
- 1586
- 2.545 3.685 4.304 5.061
- * no dentro del alcance de la invención
Tabla 8 Tabla 9
- Inmunógeno
- Adyuvante GP ID # Título de ELISA (Log10)
- 4 WPI
- 6 WPI
- Aβ114
- Media péptido Th o KLH Media Aβ114 Media péptido Th o KLH Media
- Aβ1-14 ID NO:67)
- ISA 51 1658 1.229 0.975 NA NA 1.285 1.080 NA NA
- 1659
- 0.720 NA 0.874 NA
- Th1-14-k-MVFTh1-16
- ISA 51 1662 4.388 4.094 0.006 0.038 4.559 4.126 0.065 0.064
- (SEQ ID NO:73)
- 1663 3.800 0.070 3.693 0.063
- KLH-(C) Aβ1-14 (SEQ ID NO: 67)
- ISA51 1670 3.181 3.342 4.672 4.903 2.625 2.736 4.876 5.018
- 1671
- 3.502 5.133 2.846 5.160
- Formulación de la Vacuna
- GP ID# Título de ELISA (Log10) Inmunotincióna de secciones congeladas en serie de tejido de cerebro con AD
- Aβ1-42
- Aβ1-14
- Media
- Media Placa TSBV
- Aβ1-28 en Alum b
- 1630 0.878 2.401 1.244 2.326 +1 +4
- 1631
- 3.924 3.408
- Aβ1-28 en ISA51 b
- 1632 3.686 3.397 2.341 2.291 +3 +5
- 1633
- 3.107 2.241
- Aβ1-28-k-MVF
- 1584 4.610 4.328 3.355 3.201 +4 +6
- Th1-16 en CFA/IFA (SEQ ID NO: 74)b
- 1585 4.688 3.707
- 1586
- 3.685 2.540
- Aβ1-28-k-MVF Th1-16 en ISA51 (SEQ ID NO: 74)b
- 1642 3.603 4.582 2.724 3.510 +4 +6
- 1643
- 1.201 1.004
- Aβ1-14 en ISA51
- 1658 1.229 0.975 1.168 1.129 Neg Neg
- 1659
- 0.720 1.090
- Aβ1-14k-MVF Th1-16 en CFA/IFA (SEQ ID NO: 73)
- 1660 4.677 5.060 3.700 4.232 +4 +6
- 1661
- 5.443 4.764
- Aβ1-14-k-MVF Th1-16 en ISA51 (SEQ ID NO: 73)
- 1662 4.388 4.094 3.551 3.285 +4 +6
- 1663
- 3.800 3.018
- Aβ1-12-k-MVF Th1-16 en CFA/IFA (SEQ ID NO: 72)b
- 1664 5.100 4.891 4.577 4.450 +4 +6
- 1665
- 4.682 4.322
- Aβ1-10k-MVF Th1-16 en CFA/IFA (SEQ ID NO: 71)b
- 1666 4.924 5.087 4.293 4.455 +4 +5
- 1667
- 5.250 4.696
- KLH-(C) Aβ1-14 en ISA51
- 1670 3.181 3.342 3.280 3.102 +2 +4
- 1635
- 3.502 2.924
- Control Negativo (suero preinmune)
- <0.5 <0.5 Neg Neg
- a: Dilución en serie @ 1:100
- b: sólo de referencia
Tabla 10 (sólo de referencia)
- Grupo #
- Formulación de la Vacuna Dosis Título de ELISA (Log10) Inmunotinción de secciones congeladas de cerebro con AD (8 wpi)
- Aβ1-42
- Aβ1-14
- 0WPI
- 5WPI 8WPI 0WPI 5WPI 8WPI Placas TSBV
- 1
- Aβ1-28-kVMVFTh1- 16 en 25 µg 0.894 2.962 2.736 0.665 1.745 2.706 +2 +
- 2
- ISA51 100 µg 0.610 2.987 3.640 0.794 2.816 4.800 +4 +6
- 3
- 400 µg 0.696 2.696 4.050 0.539 4.250 3.799 +4 +6
- 4
- Aβ1-28 + Aβ1-42 en Alum 100 µg 0.897 1.963 2.485 0.798 0.727 2.850 + +
- 5
- Control negativo - - - - - - - Neg Neg
5 <110> United Biomedical Inc.
<120> Composición de Péptidos Inmunogénicos como vacuna para la Prevención y Tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer
<130> 73868 ST/OH/NW
<150> US 01/865,294 10 <151> 2001-05-25
<160> 77
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15 15 <212> PRT
<213> Virus de la Hepatitis B
<400> 1
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> Bordetella pertussis
<400> 2
<210> 3 10 <211> 17
<212> PRT
<213> Clostridium tetani
<400> 3
<211> 22
<212> PRT
<213> Clostridium tetani
<400> 4
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> Bordetella pertussis
<400> 5
<210> 6
<211> 27
<212> PRT
<213> Clostridium tetani
<400> 6
<210> 7
<211> 24
<212> PRT 15 <213> Pertusaria trachythallina
<400> 7
<210> 8 20 <211> 15
<212> PRT
<213> Virus del Sarampión
<400> 8
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 9
<212> PRT
<213> Clostridium tetani
<400> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> Clostridium tetani
<400> 11
<210> 12
<211> 25
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 12
<210> 13
<211> 23
<212> PRT 10 <213> Difteria
<400> 13
<212> PRT
<213> Difteria
<400> 14
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> Plasmodium falciparum
<400> 15
<210> 16
<211> 17 10 <212> PRT
<213> Schistosoma mansoni
<400> 16
<210> 17 15 <211> 14
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 17
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 18
Asp Val Asn
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 19
<212> PRT
<213> Virus de la Hepatitis B
<400> 20
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> Chlamydia trachomatis 20 <400> 21
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> Virus del Sarampión
<400> 22
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
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<213> Virus de la Hepatitis B
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<213> Artificial
<220>
5 <223> ligador del péptido sintético
<220>
<221> MISC-FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X=CUALQUIER AMINOÁCIDO 10 <220>
<221> MISC-FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=CUALQUIER AMINOÁCIDO
<400> 77
Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto.
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- REIVINDICACIONES1. Un inmnunógeno del péptido representado por una de las siguientes fórmulas:(A)n-(fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42)-(B)o-(Th)m-X; o(A)n-(Th)m-(B)o-(fragmento N-terminal del Péptido Aβ1-42)-X; 5 en donde cada A es independientemente un aminoácido;cada B es un espaciador seleccionado del grupo que consiste de Gly-Gly, (α, -N)-Lys, y Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 77); Th es el epitope de la célula T auxiliar de SEQ ID NO: 51; 10 (fragmento N-terminal del péptido Aβ1-42) es el péptido de SEQ ID NO: 67;X es un α-COOH o α-CONH2 de un aminoácido;n es de 0 a aproximadamente 10; m es de 1 a aproximadamente 4; yo es de 0 a aproximadamente 10.
- 15 2. El inmnunógeno del péptido de la reivindicación 1, en donde el espaciador es Gly-Gly.
-
- 3.
- El inmnunógeno del péptido de la reivindicación 1, en donde el espaciador es -N-Lys.
-
- 4.
- El inmnunógeno del péptido de la reivindicación 1, en donde el espaciador es Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 77).
-
- 5.
- El inmnunógeno del péptido de la reivindicación 1, que tiene la SEQ ID NO: 73.
- 20 6. Una composición que comprende un inmnunógeno del péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un adyuvante y/o portador farmacéuticamente aceptable.
- 7. Uso de una composición de la reivindicación 6, para la preparación de un medicamento para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer.
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