BR112020017104A2 - Método de produção - Google Patents

Abstract

a presente invenção pertencente ao campo da produção de oligossacarídeo provê um método para a produção de oligossacarídeos de comprimentos úteis sem produção substancial de quantidades de monossacarídeos e dissacarídeos (ilustrado na figura 1). é provido um método para a produção de um ingrediente adequado para incorporação em um alimento, cosmético ou nutracêutico, o dito ingrediente compreendendo um ou mais oligossacarídeos, onde os oligossacarídeos são produzidos em uma reação enzimática, a dita reação enzimática compreendendo a etapa de contato, em uma solução ou suspensão, de uma enzima de clivagem de polissacarídeo e um alimento contendo polissacarídeo, onde a dita reação enzimática não produz substancialmente quaisquer monossacarídeos ou dissacarídeos.

Description

MÉTODO DE PRODUÇÃO Campo da Invenção

[0001] A invenção refere-se à produção enzimática de oligossacarídeos e seu uso em produtos alimentícios, cosmético e nutracêuticos. Antecedentes da Invenção

[0002] Alimentos e bebidas açucarados são uma parte importante de hábitos culturais e de estilo de vida em todo o mundo, no entanto o açúcar que contêm tem sido associado à obesidade baixa saúde dentária e comportamento perturbado em pessoas. Tendo em vista isso, as preferências dos consumidores têm se alterado no sentido a não utilizarem alimentos contendo açúcar e os governos estão gradualmente implementado regulamentações opara encorajar consumo menor de açúcar.

[0003] Como tal, a indústria tem realizado pesquisas por adoçantes de baixa caloria apropriados por muitas décadas de maneira a substituir o açúcar em alimentos e bebidas. Infelizmente, muitos substitutos do açúcar são produzidos a partir de fontes não naturais e frequentemente apresentam um gosto residual amargo ou outros gostos desagradáveis juntamente com sua doçura, ambos os casos os consumidores acham não atraentes. Além disto, embora os adoçantes sejam capazes de mimetizar a doçura do açúcar em alimentos e bebidas, poucos são capazes de mimetizar os outros aspectos do açúcar tais como adição de volume, modulação de textura, provimento de estrutura, atuação como conservante e modulação de cor e sabor por meio de reações de caramelização e de Maillard.

[0004] Fibra dietética é uma parte importante de uma dieta positiva e auxilia na manutenção da saúde digestiva e uma flora intestinal bem regulada. Tal fibra compreende polissacarídeos de vários comprimentos de cadeia e tipos de sacarídeos. Em adição ao fato de serem encontradas na natureza em um amplo espectro de alimentos, as fibras podem ser também produzidas separadamente e adicionadas a outros alimentos durante sua fabricação.

[0005] Os métodos para a produção industrial de oligossacarídeos dietéticos podem envolver a clivagem química ou enzimática de polissacarídeos longos em cadeias mais curta. No entanto, em adição às cadeias de comprimento desejado, mono e dissacarídeos são liberados por esta ação de clivagem are. Tendo em vista que mono e dissacarídeos são classificados como ‘açúcar’ na rotulagem nutricional e, tendo em vista que causam os efeitos negativos sobre a saúde humana descritos acima, são indesejáveis em muitos usos alimentares para os oligossacarídeos. Glicose, galactose, frutose, maltose, sacarose e lactose em particular são indesejados, na medida em que são calóricos. No entanto, apesar das associações negativas com o excesso de mono e dissacarídeos na saúde humana, composições compreendendo altos níveis de mono e dissacarídeos, tal como 100%, são abundantemente utilizadas na indústria de alimentos. Sumário da Invenção

[0006] O presente inventor encontrou que composições de açúcar compreendendo sacarídeos de cadeia mais longa (oligossacarídeos), os quais substituem quantidades de mono e dissacarídeos nas composições utilizadas atualmente, ainda provêm a doçura desejada e propriedades de textura em um produto alimentício. No entanto, os efeitos negativos que são associados com as atuais composições de açúcar sobre a saúde humana são significativamente melhorados, por exemplo, as composições da presente invenção contêm muito menos calorias e apresentam um impacto sobre a saúde dentária.

[0007] Além disto, o presente inventor descobriu métodos enzimáticos para a produção de oligossacarídeos de comprimentos úteis sem produção substancial de quantidades de monossacarídeos e dissacarídeos e encontrou que produtos alimentícios derivados destes oligossacarídeos apresentam características melhoradas. Os monossacarídeos e dissacarídeos são frequentemente removidos das composições de oligossacarídeo, adicionando tempo, complexidade, energia e gasto nos processos de fabricação. Como resultado, os novos métodos do inventor são úteis na manufatura de produtos alimentícios, nutracêuticos e produtos cosméticos.

[0008] Adicionalmente, o inventor encontrou que quando a enzima é uma monoxigenase lítica de polissacarídeo (LPMO), algumas das cadeias de oligossacarídeo produzidas apresentam modificações químicas em um ou ambos os terminais que podem modular o sabor, cor, caramelização e outras propriedades do oligossacarídeo em formas tais que são úteis na indústria de alimentos.

[0009] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é provido um método para a produção de um ingrediente adequado para incorporação em um alimento, cosmético ou nutracêutico, o dito ingrediente compreendendo um ou mais oligossacarídeos, onde os oligossacarídeos são produzidos em uma reação enzimática, a dita reação enzimática compreendendo a etapa de contato, em uma solução ou suspensão, de uma enzima de clivagem de polissacarídeo e um alimento contendo polissacarídeo, onde a dita reação enzimática substancialmente não produz monossacarídeos ou dissacarídeos.

[0010] De acordo com um segundo aspecto da invenção, é provido um ingrediente para incorporação em um alimento, cosmético ou nutracêutico, compreendendo oligossacarídeos de β-1,4-glucano, onde um ou mais resíduos de sacarídeo terminal são oxidados a uma lactona, uma 4-cetoaldose, um ácido aldônico ou um diol geminal e onde o ingrediente substancialmente não compreende monossacarídeos ou dissacarídeos.

[0011] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é provido um ingrediente para incorporação em um alimento, cosmético ou nutracêutico, compreendendo oligossacarídeos de β-1,4-glucano e um outro oligossacarídeo. Breve descrição das Figuras

[0012] A Figura 1: gel PACE mostrando produtos da incubação de celulose embebida em ácido fosfórico com uma solução tamponada de PaLPMO9E e/ou ascorbato, como no exemplo 1.

[0013] A Figura 2: gel PACE mostrando produtos da incubação de aveia lavada com uma solução de GH16 liquenase de Bacillus subtilis, como no exemplo 2.

[0014] A Figura 3: Foto de tortas feitas pela incorporação no açúcar da massa do bolo, oligossacarídeos de glucano de ligação mista ou nem açúcar nem oligossacarídeo, como no exemplo 2.

[0015] A Figura 4: gel PACE mostrando produtos da incubação de lascas de madeira de abeto com uma solução tamponada de GH30 xilanase de Ruminiclostridium thermocellum, como no exemplo 3.

[0016] A Figura 5: gel PACE mostrando produtos da incubação de xiloglucano de tamarindo com uma solução tamponada de GH5 xiloglucanase de Paenibacillus sp, como no exemplo 4. Descrição Detalhada da Invenção

[0017] O inventor desenvolveu métodos enzimáticos para a produção de oligossacarídeos de comprimentos úteis em produtos alimentícios, cosméticos ou nutracêuticos sem produzir também quantidades substanciais de monossacarídeos e dissacarídeos. Algumas realizações oferecem adicionalmente produtos com novas propriedades.

[0018] Tal como utilizados aqui, “alimento” e “produto alimentício” referem-se a qualquer item destinado para consumo, que pode ser condumo por um humano ou por qualquer outro animal. Pode ser alimente, ração, uma bebida ou um ingrediente a ser utilizado na produção de qualquer um dos acima.

[0019] Tal como utilizado aqui, “nutracêutico” refere-se a qualquer composição introduzida em um humano ou outro animal, seja por ingestão, injeção, absorção ou qualquer outro métodos, com o propósito de prover nutrição ao humano ou outro animal. O uso em tal nutracêutico pode assumir a forma de uma bebida com fibra dietética adicionada, um aditivo probiótico, uma pílula ou outra cápsula, agente de ligação de tablete; ou qualquer outro uso adequado.

[0020] Tal como utilizado aqui, “cosmético” refere-se a qualquer composição que seja destinada para uso em humanos ou outros animais para aumentar seu aspecto estético ou prevenir perda futura de apelo estético, bem como quaisquer outras composições conhecidas genericamente falando como cosméticas. O apelo estético não está limitado à estética visual, mas se aplica também ao apelo textural ou qualquer outro apelo. O cosmético pode ser uma máscara, base, brilho labial, sombra, delineador, primer, batom, blush, esmalte de unha, bronzeador ou qualquer outra maquiagem; shampoo, condicionador, mousse modeladora, gel modelador, laquê, tintura para cabelo, cera para cabelo ou qualquer outro produto capilar; hidratante, esfoliante, filtro solar, limpador, pasta de dente ou um creme, uma loção, unguento ou qualquer outra composição efetiva na modificação de dente, pele, cabelo ou outras partes do corpo em alguma forma estética ou pode ser uma composição utilizada como um componente de uma máscara facial, escova, rolo de cabelo, outro dispositivo modelador ou outra estrutura sólida ou qualquer outra composição adequada.

[0021] Uma etapa do método da presente invenção é uma reação enzimática, na qual uma ou mais enzimas são colocadas em um vaso reacional adequado juntamente com uma ou mais matérias-primas, que podem ser solúveis ou insolúveis em água e um solvente adequado.

[0022] Uma variedade de enzimas são adequadas para uso na reação enzimática da presente invenção. Qualquer enzima que, quando atuando em um alimento contendo polissacarídeo, produza oligossacarídeos enquanto não produzindo substancialmente monossacarídeos ou dissacarídeos, pode ser apropriada. Preferivelmente, a reação enzimática compreende uma monoxigenase lítica de polissacarídeo (LPMO), uma liquenase, uma xiloglucano endoglucanase (XEG), uma mananase e/ou uma xilanase, tal como uma GH5, GH8, GH10, GH11 e/ou GH30 xilanase. Mais preferivelmente, a reação enzimática compreendendo uma LPMO. Ainda mais preferivelmente, a reação enzimática compreende uma mananase. Ainda mais preferivelmente, a reação enzimática compreende uma xilanase, tal como GH5, GH8, GH10, GH11 ou GH30 xilanase. Coquetéis de enzimas compreendendo numerosas enzimas são também previstos, por exemplo,

os compreendendo uma LPMO e uma xilanase ou os compreendendo uma LPMO, uma xilanase e uma liquenase ou os compreendendo uma xilanase e uma mananase. Cada enzima pode ser provida para a reação enzimática como uma enzima purificada, uma mistura semi-purificada derivada de alguma fonte natural ou uma cultura crescida em laboratório, na forma de uma cepa microbiana engenheirada para produzir a enzima ou de qualquer outra forma. Fusões destas enzimas ou com outras enzimas ou com módulos não enzimáticos tais como módulos de ligação a carboidrato (CBMs) são também previstas dentro de cada termo respectivo, por exemplo, uma LPMO fundida com uma CBM, uma xilanase fundida a uma CBM ou uma xilanase fundida a uma LPMO.

[0023] Tal como utilizado aqui, ,“monoxigenase lítica de polissacarídeo” e “LPMO” referem-se a uma classe de enzimas capazes de clivar de forma oxidativa polissacarídeos utilizando um meio compreendendo cobre e utilizando uma fonte de oxigênio, tal como uma molécula de oxigênio (O2), peróxido, ou qualquer outra fonte de oxigênio; e um agente redutor adequado. Como tal, quando é utilizada uma LPMO, a reação enzimática pode ser conduzida sob condições aeróbicas. Agentes redutores adequados não são particularmente limitados, mas exemplos incluem ácido ascórbico, ácido gálico, cisteína, NADH, NADPH, pirogalol, ditiotreitol, cianoborohidretos, borohidretos, pigmentos fotossintéticos, lignina, lignóis e uma combinação de celobiose e celobiose desidrogenase. Embora o técnico no assunto conheça uma ampla variedade de pigmentos fotossintéticos que podem ser utilizados, tilacoides e frações purificadas ou clorofilina, são preferidos, e luz pode ser fornecida.

[0024] O agente redutor é adicionado à reação enzimática a uma certa concentração molar em relação à enzima ou coquetel de enzimas. Esta proporção pode ser qualquer proporção adequada, por exemplo, de cerca de 101:1 a cerca de 108:1 , preferivelmente de cerca de 103:1 a cerca de 106:1 , mais preferivelmente de cerca de 104:1 a cerca de 105:1.

[0025] As condições aeróbicas podem compreender a adição de oxigênio, que pode ser provido por aeração da mistura substrato com um gás contendo oxigênio, tal como ar. A aeração pode ser conduzida pela introdução de bolhas de ar contendo oxigênio nas misturas substrato aquosas por vários sistemas, tais como um injetor de ar, uma frita de aeração, um sistema de membranas ou um reator de transporte de ar de circuito interno. Preferivelmente, a concentração de oxigênio molecular na reação enzimática é de cerca de 4 a cerca de 14 mg/L.

[0026] Como a atividade oxidante das LPMOs é particularmente potente, estas podem clivar de forma oxidativa mesmo polímeros recalcitrantes tais como celulose. Isto torna a produção de oligossacarídeos úteis possível mesmo a partir de matérias-primas que são tidas tradicionalmente como materiais de fonte pobres para alimentos e são, desta forma, muito baratos. Exemplos de tais matérias-primas incluem biomassa vegetal tal como grãos, palha de grão, vagens, cascas de semente e/ou outros materiais de semente; algas marinhas; palha de milho, sabugo de milho, palha, bagaço, miscanto, resíduo de sorgo, grama, bambu e/ou outros tecidos de monocotiledôneas; jacinto aquático, tecido foliar, raízes e/ou outra matéria vegetativa; madeira dura, cavacos de madeira dura, pasta de madeira dura, madeira macia, cavacos de madeira macia, pasta de madeira macia, papel, pasta de papel, papelão e/ou outras matérias-primas a base de madeira; cascas de caranguejo, biomassa de lula, cascas de camarão e/ou outras biomassas marinhas e/ou qualquer combinação de matérias-primas apropriadas. As matérias-primas adequadas para a produção do oligossacarídeo perfil da presente invenção quando submetidas às LPMOs podem compreender, por exemplo, celulose, quitina, quitosana, xilano e/ou manana, mas qualquer matéria-prima que possa ser submetida adequadamente é prevista.

[0027] Preferivelmente, as LPMOs são selecionadas das seguintes famílias: AA9, AA10, AA11 , AA13, AA14 e AA15. Mais preferivelmente, a LPMO é PaLPMO9E (SEQ ID NO: 1 ), uma LPMO AA9 originalmente isolada do fungo ascomiceto Podospora anserina que produz níveis particularmente baixos de monossacarídeos e dissacarídeos.

[0028] Quando as LPMOs agem em um substrato, dos dois novos resíduos terminais gerados em uma dada reação de clivagem, um é oxidado. Quando são utilizadas LPMOs, celulose, quitina e quitosana são os substratos preferidos. Se celulose, por exemplo, for o substrato, quando é clivada a ligação β-1,4 glicosídica, o resíduo ligado ao carbono C1 é convertido em uma lactona e o resíduo ligado ao carbono C4 é convertido em uma 4-cetoaldose. Os dois radicais podem então reagir espontaneamente com água de maneira a formar um ácido aldônico e diol geminal, respectivamente. Os oligossacarídeos resultantes são então altamente equivalentes a β-glucanos gerados de qualquer outra maneira, mas diferem sutilmente em alguns aspectos. Preferivelmente, os oligossacarídeos resultantes compreendem β- glucanos e/ou polímeros de glucosamina.

[0029] No caso de glucanos gerados por LPMOs, os produtos podem apresentar diferentes propriedades de caramelização, sabor, cor e outras propriedades em comparação com os equivalentes gerados por meios não oxidantes. Como tal, embora possam ser utilizadas nas mesmas aplicações que outros glucanos, essas provêm um refinamento sutil em termos destas propriedades que podem ser preferidas em relação a outras fontes de glucano em algumas aplicações. Similarmente, o uso de diferentes LPMOs produz diferentes proporções de diferentes tipos de produtos finais oxidados e assim o uso de diferentes LPMOs pode possibilitar a adaptação da oxidação de maneira a se adequar a diferentes aplicações de alimentos, nutracêuticas e cosméticas.

[0030] Uma outra enzima típica útil na invenção é uma liquenase, que pode se selecionada das famílias GH5, GH7, GH8, GH9, GH12, GH16, GH17 ou GH26, preferivelmente uma enzima GH16, mais preferivelmente, uma enzima GH16 derivada de Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 2). É reivindicada aqui uma liquenase que substancialmente não produz monossacarídeos ou dissacarídeos quando agindo sobre um polissacarídeo de substrato apropriado como liquenina ou outro glucano de ligação mista. A enzima é capaz de agir, por exemplo, sobre glucanos de ligação mista, que são glucanos compreendendo uma mistura de ligações β-1,3 e β -1,4 e podem clivar então ligações β-1,4 glicosídicas. Em um caso preferido no qual a liquenase age sobre um glucano de ligação mista, os β-glucanos produzidos podem ficar em abundância dentro da faixa de tamanho de cerca de 3 a cerca de 7 resíduos, desta forma são particularmente úteis nas indústrias de alimentos, cosméticos e nutracêuticos.

[0031] Os glucanos de ligação mista são abundantes em membros das famílias das gramíneas e das cavalinhas e, como tal, matérias-primas a base de gramíneas tais como palha apresentam altos níveis destes e podem ser submetidas a utilmente a liquenases.

[0032] Uma outra enzima alternativa útil na invenção é uma xilanase da família GH5, GH8, GH10, GH11 e/ou GH30, que pode agir, por exemplo, sobre matérias- primas compreendendo um esqueleto de xilano. A xilanase pode ser, por exemplo, uma glucuronoxilanase, uma arabinoxilanase ou uma glucuronoarabinoxilanase. A enzima pode ser ativa sobre uma variedade de polímeros apresentando um esqueleto de xilano, tal como glucuronoxilano, arabinoxilano, e glucuronoarabinoxilano. Estes polímeros são abundantes em várias matérias- primas derivadas de plantas, por exemplo, tanto madeira dura quanto madeira macia podem conter polissacarídeos apropriados, com a madeira dura contendo frequentemente glucuronoxilano e a madeira macia frequentemente contendo arabinoglucuronoxilano. As xilanases preferidas incluem xilanases GH5 de Ruminiclostridium thermocellum (SEQ ID NO: 3) e Gonapodya prolifera (SEQ ID NO: 4), e xilanases GH30 de Dickeya chrysanthemi (SEQ ID NO: 5), Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 6) e Bacteroides ovatus (SEQ ID NO: 7).

[0033] Matérias-primas compreendendo arabinoglucuronoxilano de madeira macia são matérias-primas preferidas e quando digeridas com xilanases GH30 os produtos compreendem oligossacarídeos contendo uma cadeia principal de um comprimento útil nas indústrias de alimentos, cosméticos e nutracêuticos. Estes oligossacarídeos podem conter mais de cerca de cinco resíduos de cadeia principal e substancialmente nenhum monossacarídeo ou dissacarídeo.

[0034] Matérias-primas compreendendo glucuronoxilano de madeira dura são uma outra matéria-prima preferida e quando digeridas com xilanases GH30 os produtos apresentam cadeias de glucuronoxilano compreendendo cadeias de cerca de 5 a cerca de 30 resíduos na cadeia principal.

[0035] Outras enzimas úteis na invenção incluem xiloglucanases e xiloglucano endoglucanases (XEGs), as quais são produzidas por numerosos organismos, incluindo microrganismos patogênicos a plantas. Estes são capazes de agir sobre xiloglucano, uma cadeia hemicelulósica de β-1,4-glucano abundante na parede celular primária de plantas superiores, que é composta de xilose, alguns dos resíduos xilose sendo adicionalmente contendo outros resíduos, tais como galactose. Quando as xiloglucanases ou XEGs apropriadas agem sobre xiloglucano, os produtos compreendem oligossacarídeos de xiloglucano apresentando uma cadeia principal de um comprimento útil nas indústrias de alimentos, cosméticos e nutracêuticos e substancialmente não compreendem monossacarídeos ou dissacarídeos. Uma xiloglucanase preferida é a xiloglucanase GH5 de Bacteroides ovatus (SEQ ID NO: 8).

[0036] A reação enzimática pode ocorrer em solução e/ou suspensão, em um vaso reacional adequado. A uma temperatura ou protocolo de temperatura apropriado para a combinação particular de enzima e matéria-prima, a reação pode ser deixada progredir por uma certa quantidade de tempo ou até que os produtos tenham alcançado uma concentração desejada ou até que alguma outra exigência tenha sido atendida.

[0037] Tal como utilizada aqui, “suspensão” refere-se a uma composição compreendendo pelo menos duas fases imiscíveis, por exemplo, uma fase sólida e uma fase líquida, onde o peso da fase sólida pode ser, como uma percentagem do peso da composição, na faixa de cerca de 0,5% a cerca de 30%, preferivelmente de 1% a cerca de 10%, mais preferivelmente de cerca de 2% a cerca de 7%, ainda mais preferivelmente de cerca de 3% a cerca de 5%. A suspensão pode compreender um solvente adequado, que é preferivelmente água. Pode ser particularmente benéfico se utilizar uma concentração ligeiramente maior, por exemplo, de maneira a melhorar o tempo de processo, de cerca de 1% a cerca de 35%, preferivelmente de 5% a cerca de 30%, mais preferivelmente de cerca de 8% a cerca de 25%, ainda mais preferivelmente de cerca de 10% a cerca de 20%.

[0038] De maneira a assegurar o contato ótimo entre as enzimas e a matéria-prima, a mistura reacional pode ser agitada, ou constantemente ou em intervalos. A agitação pode assumir a forma de movimento rítmico de todo o vaso reacional, de um ventilador ou outro dispositivo de agitação, de um aspersor de bolhas ou qualquer outro método de agitação.

[0039] A reação enzimática pode ser uma fermentação microbiana. A temperatura e o tempo de reação serão adequados para o crescimento do organismo microbiano utilizado. O organismo microbiano pode ser geneticamente modificado para produzir uma enzima adequada para a produção de um oligossacarídeo da presente invenção, enquanto não produzindo substancialmente monossacarídeos ou dissacarídeos. O microrganismo pode ser, por exemplo, uma bactéria, por exemplo, Escherichia coli, ou um fungo, tal como Saccharomyces cerevisiae.

[0040] Adicionalmente contida na presente invenção está um vetor de expressão adequado para modificar o microrganismo em questão de tal forma que este produza uma enzima ou mistura de enzimas da presente invenção. Onde desejado, o vetor de expressão, que pode ser um plasmídeo ou qualquer outro ácido nucleico capaz de induzir a produção da enzima, pode compreender uma ou mais das seguintes sequências reguladoras de maneira a controlar a expressão da enzima exógena: sequências reguladoras de um gene de choque térmico, sequências reguladoras de um gene de toxicidade e sequências reguladoras de um gene de formação de esporo.

[0041] A reação enzimática é conduzida a uma temperatura ou protocolo de temperatura apropriado às enzimas e substratos utilizados. Por exemplo, pode ser conduzida a uma temperatura constante na faixa de cerca de 10°C a cerca de 80°C, preferivelmente cerca de 20°C a cerca de 60°C, mais preferivelmente de cerca de 30°C a cerca de 40°C. Pode ser particularmente benéfico se utilizar uma temperatura ligeiramente mais alta, por exemplo, para melhorar o tempo de processo, de cerca de 30°C a cerca de 70°C, preferivelmente de cerca de 40°C a cerca de 60°C. Se a reação enzimática assumir a forma de uma fermentação microbiana, a temperatura pode ser apropriada para tal, por exemplo, a reação enzimática pode compreender o crescimento de E. coli e/ou a temperatura pode ser constante e aproximadamente de 37°C.

[0042] O pH da solução ou suspensão pode afetar a atividade das enzimas. O controle do pH pode ser importante para se garantir que a reação enzimática prossiga a uma taxa adequada. A reação enzimática da presente invenção pode ocorrer a um pH na faixa de cerca de 2 a cerca de 10, preferivelmente cerca de 3 a cerca de 8, mais preferivelmente cerca de 4 a cerca de 6.

[0043] A reação enzimática é deixada continuar por um certo período de tempo antes de ser opcionalmente interrompida e os produtos serem isolados ou de alguma outra forma coletados. Este período de tempo pode ser de cerca de 1 minuto a cerca de 5 dias e é preferivelmente de cerca de 0,5 dia a cerca de 3 dias, mais preferivelmente de cerca de 16 horas a cerca de 48 horas. A reação pode ser alternativamente deixada prosseguir até a completação ou completação aproximada da reação. Se a reação for deixada continuar até a completação ou completação aproximada da reação, isto pode mais longo que 5 dias.

[0044] A uma ou mais matérias-primas adicionadas à reação enzimática compreendem polissacarídeos. Tais polissacarídeos podem ter sido produzidos por uma reação separada que é realizada simultaneamente no vaso reacional. Os polissacarídeos presentes na reação enzimática são clivados pelas enzimas em oligossacarídeos úteis.

[0045] Qualquer substância que compreenda polissacarídeos apropriados pode formar parte da matéria-prima. Como as indústrias de alimentos, cosméticos e nutracêuticos utilizam uma ampla variedade de oligossacarídeos, os polissacarídeos apropriados para fazer parte na reação enzimática não são particularmente limitados. Preferivelmente, a matéria-prima compreende um ou mais polissacarídeo selecionados de celulose, quitina, quitosana, glucano de ligação mista, xilano e xiloglucano. Se os xilanos estiverem presentes, estes preferivelmente compreendem glucuronoxilano, arabinoxilano e/ou glucuronoarabinoxilano.

[0046] As matérias-primas compreendendo tais polissacarídeos não são particularmente limitadas, na medida em que a maioria das matérias vegetais é rica em tais polímeros. Como tal, a matéria-prima pode compreender biomassa vegetal tal como grão, farelo de grão, vagens, cascas de sementes e/ou outros materiais de sementes; algas marinhas; palha de milho, sabugo de milho, palha, bagaço, miscanto, resíduo de sorgo, grama, bambu e/ou outros tecidos de monocotiledôneas; jacinto aquático, tecido foliar, raízes e/ou outras matérias vegetativas; madeira dura, cavacos de madeira dura, pasta de madeira dura, madeira macia, cavacos de madeira macia, pasta de madeira macia, papel, pasta de papel, papelão e/ou outras matérias-primas a base de madeira; cascas de caranguejo, biomassa de lula, cascas de camarão e/ou outra biomassa marinha e/ou qualquer combinação de matérias-primas apropriadas. Preferivelmente, a matéria-prima compreende palha de aveia ou madeira. Como qualquer dada matéria-prima natural possivelmente compreende uma mistura de diferentes polissacarídeos, algumas vezes será o caso de um coquetel de diferentes ser benéfico. Tal coquetel pode compreender qualquer outra enzima. Por exemplo, tal coquetel pode compreender uma celulase com uma xilanase, uma celulase com uma mananase, uma xilanase com uma mananase, uma LPMO com uma xilanase, uma LPMO com uma liquenase, uma LPMO com uma mananase ou uma LPMO com uma LPMO diferente na qual os parceiros enzimáticos estão presentes em proporções molares preferivelmente entre 1:10 e 10:1. Em adição, na medida em que muitas matérias-

primas apropriadas são recalcitrantes, é previsto um pré-tratamento da matéria- prima.

[0047] Tal como utilizado aqui, “pré-tratamento” é qualquer processo que torna a matéria-prima mais facilmente utilizadas pelas enzimas inerentes na etapa da reação enzimática da presente invenção. O pré-tratamento ocorre antes da reação enzimática e pode compreender tratamento com ácido, por exemplo, com ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou ácido trifluoracético; tratamento alcalino, por exemplo, com hidróxido de sódio ou expansão de fibra por amônia; tratamento térmico, por exemplo, com água quente, vapor quente ou ácido quente e/ou tratamento enzimático, por exemplo, com uma a hidrolase, liase ou LPMO ou qualquer mistura dos processos acima.

[0048] Tal como utilizado aqui, “polissacarídeo” refere-se a um polímero sacarídeo de qualquer comprimento maior que dois resíduos. Polissacarídeos podem ser altamente ramificados, ligeiramente ramificados ou não ramificados, podem compreender qualquer número de ligações glicosídicas em qualquer combinação, qualquer número de, por exemplo, ligações a ou b e qualquer combinação de tipos de monômeros, tais como glicose, glucosamina, manose, xilose, galactose, fucose, frutose, ácido glucurônico, arabinose ou derivados destes tal como qualquer combinação dos monômeros acima contendo acetil ou outros grupos. O polissacarídeo pode ser um polímero celulósico ou hemicelulósico, polímeros hemicelulósicos previstos incluem xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanana e xiloglucano. Celulose é o polímero celulósico preferido. Manana é ainda mais preferida. Xilano é o mais preferido.

[0049] Tal como utilizados aqui, “altamente ramificado”, “ligeiramente ramificado”, e “não ramificado” referem-se ao número de cadeias laterais por extensão da cadeia principal em um sacarídeo. Os sacarídeos altamente ramificados apresentam uma média de 4 a 10 cadeias laterais por 10 resíduos da cadeia principal, sacarídeos ligeiramente ramificados apresentam uma média de 1 a 3 cadeias laterais por 10 resíduos de cadeia principal e sacarídeos não ramificados apresentam apenas uma cadeia principal e nenhuma cadeia lateral. A média é calculada pela divisão do número de cadeias laterais em um sacarídeo pelo número de resíduos da cadeia principal.

[0050] Tal como utilizado aqui, “sacarídeo” refere-se a qualquer polissacarídeo, oligossacarídeo, monossacarídeo ou dissacarídeo.

[0051] Tal como utilizado aqui, “oligossacarídeo” refere-se a polímeros de sacarídeo apresentando comprimentos de cadeia geralmente dentro da faixa que é útil no contexto do produto alimentício, cosmético ou nutracêutico. Estão compreendidos pelo menos dentro dos produtos da reação enzimática. Comprimentos típicos de cadeia podem ser de cerca de 3 a cerca de 16 resíduos de sacarídeos. Os oligossacarídeos podem ser altamente ramificados, ligeiramente ramificados ou não ramificados, podem compreender ligações glicosídicas em aa combinação, qualquer número de ligações a ou b e qualquer combinação de tipos de monômeros, tais como glicose, glucosamina, manose, xilose, galactose, fucose, frutose, ácido glucurônico, arabinose ou derivados destes. Derivados adequados incluem os monômeros acima compreendendo grupos acetil ou outros.

[0052] Os oligossacarídeos produzidos no processo da presente invenção recaem dentro de um limite inferior e um limite superior de tamanho. O limite inferior de tamanho é o de nenhum monossacarídeo ou dissacarídeos substancialmente não produzidos.

[0053] Tal como utilizado aqui, “substancialmente nenhum” monossacarídeo ou dissacarídeo refere-se a um conjunto de produtos nos quais representam em peso menos de cerca de 60%, preferivelmente menos de cerca de 50%, preferivelmente menos de cerca de 40%, mais preferivelmente menos de cerca de 30%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 20%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 15%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 10%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 1%, o mais preferível sendo de menos de cerca de 0,1%, dos sacarídeos capazes de ser representados em imagem serem monossacarídeos ou dissacarídeos.

[0054] Como descrito aqui, a reação enzimática da invenção é útil para produzir oligossacarídeos enquanto não produzindo substancialmente nenhum monossacarídeo e dissacarídeo. No entanto, é previsto que a reação irá ocorrer em um vaso grande com outras reações (por exemplo, enzimáticas) ocorrendo ao mesmo tempo. Estas outras reações enzimáticas irão também quebrar polissacarídeos em sacarídeos menores, incluindo oligossacarídeos, mas também podem produzir monossacarídeos e dissacarídeos. Desta forma, o método compreende adicionalmente uma segunda reação enzimática compreendendo o contato de uma segunda enzima de clivagem de polissacarídeo para um ou mais alimentos contendo polissacarídeos, o que pode produzir um ou mais dissacarídeos. Em alguns casos podem ser produzidos também monossacarídeos. Estes monossacarídeos e dissacarídeos podem ser incluídos no ingrediente, desta forma, em uma característica específica, adequadamente a quantidade de dissacarídeos no ingrediente produzido é menos de cerca de 50 %, preferivelmente menos de cerca de 40%, mais preferivelmente menos de cerca de 35%, mais preferivelmente menos de cerca de 30%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 25%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 20%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 15%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 10%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 5% dos sacarídeos capazes de ser representados em imagem.

[0055] Adequadamente a quantidade de monossacarídeos no ingrediente produzido é de menos de cerca de 25%, preferivelmente menos de cerca de 20%, mais preferivelmente menos de cerca de 15%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 10%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 3%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 1% dos sacarídeos capazes de ser representados em imagem.

[0056] Tal como utilizado aqui, “polissacarídeos capazes de serem representados em imagem” são aqueles que são visíveis no gel ou espectro quando um dos seguintes protocolos de formação de imagem é conduzido.

[0057] Uma forma de avaliar as percentagens em peso de diferentes polissacarídeos produzidos pela presente invenção é o processamento de uma amostra dos produtos da reação enzimática de maneira a derivatizar suas extremidades redutoras com um fluoróforo seguida da eletroforese em gel de poliacrilamida, antes da formação de imagem do gel de poliacrilamida, por exemplo, por formação de imagem fluorescente e conduzindo uma análise de densidade ótica em cada banda, o valor resultante a ser ajustado pela contagem de resíduo para fornecer uma indicação da massa. O técnico no assunto será capaz de realizar isto com a informação dentro deste pedido, em conjunto com Goubet et al. (2002). Este é o método previsto para o cálculo dos valores de percentagem em peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem.

[0058] Uma outra forma de avaliar as percentagens em peso dos diferentes polissacarídeos produzidos pela presente invenção é a análise por cromatografia líquida de alto rendimento, por exemplo, pela utilização de coluna cromatográfica de troca aniônica em uma solução alcalina, seguida de detecção amperimétrica pulsada. Os dados resultantes podem ser ajustados por contagem de resíduo para fornecer uma indicação da massa. O técnico no assunto será capaz de realizar isto com a informação dentro deste pedido em conjunto com Simmons et al. (2013).

[0059] Tal como utilizados aqui, “monossacarídeo” e “dissacarídeo” referem-se a compostos de sacarídeo consistindo, respectivamente, em um ou dois resíduos. Os monossacarídeos são compostos tais como glicose, glucosamina, xilose, galactose, fucose, frutose, ácido glucurônico, arabinose, ácido galacturônico; ou epímeros ou outros derivados destes. Derivados adequados incluem grupos acetil ou outros. Os dissacarídeos são compostos consistindo em dois monossacarídeos unidos por meio de uma ligação glicosídica. Previstas aqui são enzimas ou combinações de enzimas que substancialmente não produzem monossacarídeos ou dissacarídeos em tal reação.

[0060] O limite superior de tamanho dos oligossacarídeos depende das enzimas, matéria-prima, e condições reacionais utilizadas e podem ser do peso dos produtos compreendendo 16 ou mais resíduos em sua cadeia principal abaixo de uma certa percentagem de peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem.

[0061] Esta percentagem pode ser de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%; ou pode ser o peso dos produtos compreendendo 15 ou mais resíduos em sua cadeia principal abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem; ou pode ser o peso dos produtos compreendendo 14 ou mais resíduos em sua cadeia principal abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem, ou, em ordem crescente de preferência, que é o caso de produtos compreendendo 13, 12, 11, 10, 9, 8, ou 7 resíduos.

[0062] A matéria-prima pode compreender celulose e, quando submetida a LPMOs ou outras enzimas, o peso dos produtos compreendendo 7 ou mais resíduos em sua cadeia principal pode ser abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem. Ou pode ser o peso dos produtos compreendendo 8 ou mais resíduos em sua cadeia principal abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem.

[0063] A matéria-prima pode compreender quitina e, submetida a LPMOs ou outras enzimas, o peso dos produtos compreendendo 11 ou mais resíduos em sua cadeia principal pode ser abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem. Ou pode ser o peso dos produtos compreendendo 12 ou mais resíduos em sua cadeia principal abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem.

[0064] A matéria-prima pode compreender quitina, e, submetida a LPMOs ou outras enzimas, o peso dos produtos apresentando apenas 3 ou menos resíduos em sua cadeia principal pode ser abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem.

[0065] A matéria-prima pode compreender glucano de ligação mista, e quando submetida a liquenase ou outras enzimas, o peso dos produtos compreendendo 6 ou mais resíduos em sua cadeia principal pode ser abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de

[0066] 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem. Ou pode ser o peso dos produtos compreendendo 7 ou mais resíduos em sua cadeia principal abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem.

[0067] A matéria-prima pode compreender xilano, preferivelmente glucuronoxilano, arabinoxilano ou arabinoglucuronoxilano, mais preferivelmente glucuronoxilano de madeira dura ou arabinoglucuronoxilano de madeira macia.

[0068] O xilano pode compreender arabinoglucuronoxilano, preferivelmente arabinoglucuronoxilano de madeira macia, e, quando submetido a uma xilanase, tal como uma xilanase GH30 ou outra enzima, o peso dos produtos compreendendo 9 ou mais resíduos em sua cadeia principal pode ser abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem. Ou pode ser o peso dos produtos compreendendo 10 ou mais resíduos em sua cadeia principal abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem.

[0069] O xilano pode compreender arabinoglucuronoxilano, preferivelmente arabinoglucuronoxilano de madeira macia, e, quando submetido a uma xilanase, tal como uma xilanase GH30, ou outra enzima, o peso dos produtos apresentando apenas 5 ou menos resíduos em sua cadeia principal pode ser pode ser abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem.

[0070] A matéria-prima pode compreender glucuronoxilano, preferivelmente glucuronoxilano de madeira dura, e, quando submetida a xilanase, tal como uma xilanase GH30, ou uma outra enzima, o peso dos produtos compreendendo 31 ou mais resíduos em sua cadeia principal pode ser abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem.

[0071] A matéria-prima pode compreender glucuronoxilano de madeira dura, preferivelmente glucuronoxilano de madeira dura, e, quando submetida a xilanase, tal como uma xilanase GH30, ou uma outra enzima, o peso dos produtos apresentando apenas 4 ou menos resíduos em sua cadeia principal pode ser abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem.

[0072] A matéria-prima pode compreender xiloglucano, e, quando submetida a XEG ou outras enzimas, o peso dos produtos compreendendo 6 ou mais resíduos em sua cadeia principal pode ser abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem. Ou pode ser o peso dos produtos compreendendo 7 ou mais resíduos em sua cadeia principal que pode ser abaixo de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, o mais preferido sendo de menos de cerca de 1%, do peso dos polissacarídeos capazes de serem representados em imagem.

[0073] Onde os polímeros ramificados estão sendo descritos em termos da contagem de resíduos, o número de resíduos refere-se apenas à cadeia mais longa dos resíduos e não inclui quaisquer cadeias laterais.

[0074] Após a reação enzimática ter progredido até um ponto desejado, os produtos podem ser manipulados em uma variedade de formas. Como a mistura reacional irá frequentemente compreender uma mistura de produtos solúveis e insolúveis, com pelo menos alguma parte da matéria-prima original frequentemente também permanece, a mistura reacional pode ser filtrada para remover a matéria insolúvel e preparar os produtos solúveis para processamento posterior.

[0075] Quando utilizados aqui ou de alguma outra forma não qualificados, os termos “solúvel”, “solubilidade” e variantes gramaticais referem-se à solubilidade em água.

[0076] Os oligossacarídeos desejados podem ser também isolados da mistura reacional enzimática de um número de maneiras. Podem ser isolados com base na solubilidade, de tal forma que apenas uma composição de sacarídeos solúveis é extraída para processamento posterior e/ou isolados por cromatografia de maneira a produzir uma composição com uma banda mais estreita de comprimentos de cadeia de oligossacarídeo. O isolamento pode, por exemplo, ser baseado em precipitação, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatógrafa de troca iônica ou filtração, incluindo ultrafiltração e nanofiltração. No caso de ser conduzido o isolamento baseado na solubilidade, o perfil dos sacarídeos presentes na composição isolada irá depender da reação enzimática original, na medida em que polissacarídeos diferentes reduzem a solubilidade com comprimento em taxas diferentes.

[0077] Também previsto no escopo da invenção é o tratamento posterior dos oligossacarídeos produzidos de maneira a produzir outros produtos antes da incorporação em um alimento, cosmético ou nutracêutico. Este tratamento posterior pode compreender qualquer etapa química, física ou enzimática, tal como redução, preferivelmente aminação redutora onde apropriado; oxidação, caramelização, modificação com uma base de Schiff ou por meio da reação de Maillard ou por qualquer combinação de tais etapas e pode prover produtos diferentes apresentando propriedades que são melhoradas para o propósito desejado. Por exemplo, as propriedades de caramelização, valor calórico, sabor e cor podem ser modificados.

[0078] Os produtos de uma ou mais reações enzimáticas podem ser considerados como um ingrediente adequado para incorporação em um alimento, cosmético ou nutracêutico em qualquer estágio deste processo. Por exemplo, a mistura reacional em si, após o limite de tempo desejado ou outra condição para a completação, foi atingida, pode diretamente ser considerada como o ingrediente ou o componente sólido ou líquido dos produtos filtrados, pode ser o ingrediente ou a composição de oligossacarídeos isolados pode ser o ingrediente ou os oligossacarídeos tendo sido submetidos a tratamento posterior podem ser o ingrediente.

[0079] Tal como utilizado aqui, “ingrediente” é qualquer composição adequada para incorporação em um produto alimentício, cosmético ou nutracêutico, que pode incluir aqueles utilizados diretamente como o produto em si.

[0080] O presente ingrediente adequado para incorporação em um alimento, cosmético ou nutracêutico pode ser utilizável diretamente como um produto alimentício, cosmético ou nutracêutico ou pode ser misturado com outros ingredientes para formar um alimento, cosmético ou nutracêutico. O ingrediente pode ser também tratado de alguma forma física ou química antes ou durante a incorporação em um alimento, cosmético ou nutracêutico. Pode ser diretamente incorporado em um produto ou pode ser incorporado, por exemplo, em uma farinha, mistura de bolo, mistura de chocolate ou outro precursor alimentício; uma composição base cosmética; ou um nutracêutico e ser opcionalmente cozido ou de alguma outra forma tratado em uma maneira que possa causar uma modificação química, uma alteração de textura, uma alteração de cor ou outra modificação.

[0081] Uma vez obtida uma composição dos produtos de oligossacarídeo adequados para a aplicação em consideração e o tratamento posterior e/ou isolamento ser opcionalmente conduzidos, a derivação de um alimento, cosmético ou nutracêutico a partir da composição fornece um conjunto muito amplo de usos potenciais. Os ingredientes da presente invenção são úteis em aplicações nas quais oligossacarídeos são convencionalmente utilizados. São particularmente úteis em aplicações nas quais monossacarídeos e dissacarídeos são prejudiciais e deveriam de outra forma ser considerados para remoção.

[0082] A invenção inclui um alimento, cosmético ou nutracêutico compreendendo ou produzido a partir do ingrediente da presente invenção.

[0083] Por exemplo, na indústria alimentícia, os oligossacarídeos produzidos pelo método atual podem ser utilizados como adoçantes, agentes de volume, fibra dietética adicionada ou umectantes. Podem ser incorporados em bolos, pães, ou outros produtos assados ou em chocolate ou outro produto de confeitaria tais como puxa-puxa, fudge, merengue ou caramelo; ou bebidas, por exemplo para prover características de sabor ou cor agradáveis ou para aumentar o teor de fibra dietética. ou podem ser incorporados em ração animal, por exemplo, ou como um ingrediente isolado ou pela utilização de uma mistura reacional enzimática diretamente como ração.

[0084] De interesse particular, é o uso como agente adoçante. Na medida em que monossacarídeos e dissacarídeos contribuem para doenças dentárias, excesso calórico, obesidade e diabetes e potencialmente problemas comportamentais, em certas aplicações os fabricantes de alimentos prefeririam não incluir monossacarídeos e dissacarídeos em seus produtos. Os oligossacarídeos da presente invenção, na medida em que seu método de produção substancialmente não produz monossacarídeos ou dissacarídeos, podem ser utilizados como agentes adoçantes, permitindo que os produtos alimentícios sejam doces sem exercer os efeitos prejudiciais dos monossacarídeos e dissacarídeos.

[0085] Na indústria de cosméticos, os monossacarídeos e dissacarídeos podem contribuir para a deterioração se não removidos em algum estágio da fabricação, enquanto os oligossacarídeos são úteis como ingredientes, na medida em que podem melhorar a textura e retenção de umidade, atuam como moléculas absorvedoras de UV, mantêm uma estrutura de gel ou creme e/ou servem como agentes de volume. Desta forma, a presente invenção inclui um alimento,

cosmético ou nutracêutico compreendendo o ingrediente contendo oligossacarídeo obtenível pelo método da invenção.

[0086] Os oligossacarídeos da presente invenção são úteis quando incorporados em composições nutracêuticas, na medida em que foi mostrado que a fibra dietética que provêm sem provisão concomitante de açúcar dietético encoraja a saúde digestiva, flora intestinal bem regulada e outros benefícios para o bem-estar. Neste contexto, podem funcionar também como um ingrediente em uma bebida probiótica ou outra formulação prebiótica ou probiótica. Exemplos

[0087] Exemplo 1 – Fabricação de oligossacarídeos a partir de celulose pela utilização de uma LPMO

1. Celulose embebida em ácido fosfórico (PASC) foi preparada pela obtenção de uma pasta fluida de 1 g de celulose Avicel (Sigma-Aldrich) com 3 ml de H2O antes da adição de 30 ml de ácido fosfórico gelado e incubação a 0°C por 1 h. A celulose foi então lavada numerosas vezes com água até o fluxo de saída apresentar um pH neutro antes do utilizado nas reações.

2. Apo-PalPMO9E (SEQ ID NO: 1 ) foi pré-incubado por 0,5-1 h a 5°C em Cu(ll)(N03)2 0,9 estequiométrico imediatamente antes das reações enzimáticas.

3. 25 µg de PASC, 30 µg de PalPMO9E (pré-carregado com cobre) e 500 nmol de ascorbato foram incubados em 100 µl de acetato de amônio 100 mM pH 6 por 32 horas a 50°C com agitação intermitente.

4. As amostras foram centrifugadas e os sobrenadantes foram secados a vácuo.

5. Os sobrenadantes foram rotulados de forma redutora com ANTS e analisados por PACE (de acordo com Goubet et al. 2002). A Figura 1 mostra o gel resultante.

[0088] Exemplo 2 – Fabricação de oligossacarídeos a partir de glucano de ligação mista pela utilização de uma liquenase e incorporação dos ditos oligossacarídeos em um bolo

1. 250 g de aveia em pó para mingau moída foram fervidos em 2 L de água por 30 min.

2. Uma vez resfriados, foram adicionados 2 L de etanol 96% (v/v) gelado e a suspensão foi deixada sedimentar durante a noite a 5°C. A suspensão foi filtrada através de Miracloth até a secagem, suspendida novamente em etanol 50% (v/v) e novamente filtrada através de Miracloth.

3. A massa remanescente foi fervida em 1 L de água e incubada por 16 h a 30°C com 2000 U de liquenase de Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 2, Megazyme).

4. Uma vez resfriada, foram adicionados 2 L de etanol 96% (v/v) gelado e a suspensão foi deixada sedimentar durante a noite.

5. O sobrenadante foi coletado por centrifugação e secado a vácuo, produzindo 5,2 g de oligossacarídeos de glucano de ligação mista. Uma alíquota foi rotulada de forma redutora com ANTS e analisada por PACE. A Figura 2 mostra o gel resultante.

6. Um ovo médio foi batido com 50 g de manteiga e 50 g de farinha simples.

7. Foram tomados 3 g da mistura e misturados com 1 g de açúcar.

8. Foram tomados 3 g da mistura e misturados com 1 g de oligossacarídeos de glucano de ligação mista.

9. Foram tomados 4 g da mistura e não misturados adicional com mais qualquer outro ingrediente.

10. Todas as três massas foram assadas em uma bandeja de para assar em um forma preaquecido a 180°C por 5 min.

11. Após assados, os bolos foram resfriados, fotografados e provados. A Figura 3 mostra a fotografia.

12. O bolo sem açúcar ou oligossacarídeo adicionados não foi capaz de manter dentro a manteiga, que, ao contrário, vazou durante o cozimento. Apresentou uma superfície lisa e textura pastosa similar a pasta de torta e apresentou um sabor agradável.

[0089] O bolo contendo açúcar manteve bem a manteiga e apresentou uma textura e superfície mais quebradiças e esponjosas, características de bolos. Também se tornou marrom e crocante nas bordas. Apresentou um sabor muito doce.

[0090] Similar ao bolo contendo açúcar, o bolo contendo oligossacarídeos de glucano de ligação mista manteve bem a manteiga e apresentou uma textura e superfície caracteristicamente semelhantes a de bolo. Também se tornou marrom e crocante nas bordas como o bolo contendo açúcar. Era mais doce que o bolo sem a adição de açúcar ou oligossacarídeos, mas não tão doce quanto o bolo contendo açúcar.

[0091] Exemplo 3 – Fabricação de oligossacarídeos a partir de xilano pela utilização de uma xilanase GH30

1. Lascas de madeira de abeto foram misturadas em suspensão em um misturador de alimento até quebrarem em partículas pequenas e então foram moídas em moinho de bolas.

2. 100 µg de misturas reacionais contendo 3.3 mg lascas de madeira de abeto moídas e 100 mM de acetato de amônio pH 6 foram incubados por 16 h a 30°C com (ou sem) 5 µg de GH30 de Ruminiclostridium thermocellum (fornecida pela NZYTech).

3. Os produtos da reação foram rotulados de forma redutora com ANTS e analisados por PACE. A Figura 4 mostra o gel resultante.

[0092] Exemplo 4 – Fabricação de oligossacarídeos a partir de xiloglucano pela utilização de uma xiloglucanase

1. 100 µg de misturas reacionais contendo 1% (p/v) de xiloglucano de tamarindo e acetato de amônio 100 mM pH 6 foram incubados por 16 h a 30°C com (ou sem) 0,1 U de xiloglucanase (GH5, CAS: 76901-10-5) de Paenibacillus sp. (Megazyme).

2. Os produtos da reação foram rotulados de forma redutora com ANTS e analisados por PACE. A Figura 5 mostra o gel resultante.

[0093] Exemplo 5 Profético: Pão de banana assado pela utilização do ingrediente alimentício descrito

[0094] Uma receita básica de pão de banana produzindo 10 porções, consiste em uma xícara (US) (192 g) de açúcar (isto é, açúcar granulado puro de cana para bebidas e cereais, tal como o provido por Tate e Lyle), 113.5 g de manteiga, três bananas maduras, três ovos, duas xícaras de farinha multiuso, 1 colher de chá de bicarbonato de sódio e ½ colher de chá de sal.

[0095] Um forno é preaquecido para 190°C. As bananas foram amassadas em uma tigela utilizando-se um garfo. Em uma tigela separada, foram misturados a farinha, o bicarbonato de sódio e o sal. A manteiga e o açúcar foram batidos até estarem combinados e cremosos. As bananas amassadas foram adicionadas e bem misturadas e subsequente adição gradual dos ovos abatidos até estarem bem misturados. Então, a mistura de farinha é dobrada. A mistura é colocada em uma assadeira de pão untada e assada por 45 mins ou até que um palito de dente inserido ficar limpo. O pão básico é resfriado em uma prateleira de resfriamento. O pão foi cortado em 10 porções.

[0096] O pão de banana A é preparado utilizando-se a mesma receita pão básico de banana, exceto que 30% do açúcar é substituído pelo ingrediente descrito da invenção, desta forma, são utilizados 134 g de açúcar de cana e 58 g do ingrediente descrito da invenção.

[0097] O pão de banana B é preparado utilizando-se a mesma receita do pão básico de banana, exceto que 50% do açúcar é substituído pelo ingrediente descrito da invenção, desta forma foram utilizados 96 g de açúcar de cana e 96 g do ingrediente descrito da invenção.

[0098] O pão de banana C é preparado utilizando-se a mesma receita do pão básico de banana, exceto que 100% do açúcar é substituído pelo ingrediente descrito da invenção, desta forma são utilizados 0 g de açúcar de cana e 192 g do ingrediente descrito da invenção. Resultados

[0099] Os valores nutricionais dos pães de banana são mostrados na Tabela 1. Estes são calculados pela utilização do USDA National Nutrient Database for Standard Reference

Legacy Release, abril de 2018 (https://ndb.nal.usda.qov/ndb/search/list?home=true) utilizando-se os seguintes registros: ovos (NDB Id 01123), açúcar de cana (NDB Id 45167812), manteiga (NDB Id 01145), bananas (NDB Id 09040), farinha multiuso (NDB Id 45054364), bicarbonato de sódio (NDB Id 18372), sal de mesa (NDB Id 02047) e considerando a receita total produzindo 10 porções.

[0100] Há uma redução de 8% das calorias para o pão A em comparação com o pão básico, uma redução de 30% do açúcar adicionado e uma redução de 24% no açúcar total. Há uma redução de 12% das calorias para o pão B em comparação com o pão básico, uma redução de 50% do açúcar e uma redução de 39% no açúcar total. Há uma redução de 25% das calorias para o pão C em comparação com o pão básico, uma redução de 100% do açúcar adicionado e uma redução de 79% no açúcar total.

Tabela 1: Valor nutricional de uma porção de cada um dos pães de banana descritos.

Pão básico Pão A Pão B Pão C (uma porção) (uma porção) (uma porção) (uma porção) Proteína (g) 4,5 4,5 4,5 4,5 Gordura (g) 10,5 10,5 10,5 10,5 Carboidrato (g) 45,8 45,8 45,8 45,8 Fibra (g) 1,7 1,7 1,7 1,7 Açúcar (g) 24,4 18,6 14,8 5,2 Calorias (kcal) 291,5 269,9 255,5 219,5 Referências

[0101] Goubet F, Jackson P, Deery MJ, Dupree P. “Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.” Anal Biochem. 2002, 53-68

[0102] Simmons TJ, Uhrin D, Gregson T, Murray L, Sadler IH, Fry SC. “An unexpectedly lichenase-stable hexasaccharide from cereal, horsetail and lichen mixed-linkage β-glucans (MLGs): Implications for MLG subunit distribution.” Phytochemistry. 2013, 322-332 Sequências das Enzimas

LPMO

[0103] LPMO AA9 de Podospora anserine (SEQ ID NO: 1 ). Genbank ID CAP67740 1 mkgllsvaal slavsevsah yifqqlstgs tkhgvfqyir qntnynspvt dlssndlrcn 61 eggasgantq tvtvragdsf tfhldtpvyh qgpvsvylsk apgsassydg sgtwfkikdw 121 gptfpggqwt lagsytaqlp scitdgeyll riqslgihnp ypagtpqfyi scaqikvtgg 181 gsvnpsgvai pgafkatdpg ytaniysnfn sytvpgpsvf scgsngggss pvepqpqptt 241 tlvtstrapv atqpagcava kwgqcggngw tgcttcaags tcntqnayyh qcv Liquenase

[0104] Liquenase GH16 de Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 (SEQ ID NO: 2).

GenBank ID CAA86922.1 1 mpylkrvlll Ivtglfmslf avtatasaqt ggsffdpfng ynsgfwqkad gysngnmfnc 61 twrannvsmt slgemrlalt spaynkfdcg enrsvqtygy glyevrmkpa kntgivssff 121 tytgptdgtp wdeidieflg kdttkvqfny ytngagnhek ivdlgfdaan ayhtyafdwq 181 pnsikwyvdg qlkhtatnqi pttpgkimmn Iwngtgvdew Igsyngvnpl yahydwvryt 241 kk Xilanase

[0105] Arabinoxilanase GH5 de Ruminidostridium thermocellum (SEQ ID NO: 3). GenBank ID ABN53395.1 1 mgasiktsik irtvafvsii aialsilsfi pnrayaspqr grprlnaart tfvgdngqpl 61 rgpytstewt aaapydqiar vkelgfnavh lyaecfdpry papgskapgy avneidkive 121 rtrelglylv itignganng nhnaqwardf wkfyapryak ethvlyeihn epvawgppys 181 sstanppgav dmeidvyrii rtyapetpvl Ifsyavfggk ggaaealkdi rafnkavfgn 241 enavwtneav afhgyagwqe ttiaveellk agypcfmtey aggawgsgmg gldveltyel 301 erlgvswltf qyipptgvsd dvtkpeyfsa Ivensglswt pdygnwpaar gvygngglar 361 etatwinnfl tgttrieaed fdwggngvsy ydtdsvnvgg qyrpdegvdi ektsdtgggy 421 nvgwisegew leytirvrnp gyynlslrva gisgsrvqvs fgnqdktgvw elpatggfqt 481 wttatrqvfl gaglqklrin alsggfnlnw ielspistgt ipdgtykfln rangktlqev 541 tgnnsiitad ykgiteqhwk iqhigggqyr issagrgwnw nwwmgfgtvg wwgtgsstcf 601 iisptgdgyy rivlvgdgtn Iqissgdpsk iegkafhgga nqqwailpvs apafptglsa 661 vldssgntan Itwnaapgan synvkrstks ggpyttiatn itstnytdtg vatgtkyyyv 721 vsavsngvet Insaeailqy pkltgtvigt qgswnnignt ihkafdgdln tffdgptang 781 cwlgldfgeg vrnvitqikf cprsgyeqrm iggifqgank edfsdavtlf titslpgsgt 841 ltsvdvdnpt gfryvrylsp dgsngniael qffgtpagee nddvhlgdin ddgninstdl 901 qmlkrhllrs irltekqlln adtnrdgrvd stdlallkry ilrvittl

[0106] Xilanase GH5 de Gonapodya prolifera (SEQ ID NO: 4). GenBank ID KXS18720.1 1 marlsslial vlafvavsap alaargrprl ngktfvadsg vplrgpftst ewtpavpaan 61 ianmrnynfn aihlyaetfd pnypaagsqk pgyaatrvdq ivaatkaanm ywivlanga 121 nngkfnlnya kdfwsfyaar yknethviye ihnepvqwgp pyisstqspg avsmnadcyk 181 iiravapdtp vllftyasig ggssaagavk daqsfntavf gnanaqwtne aiaihgywga 241 qgasdaakal naagfswlt efaaatspts pnggqdtvlt gfmeqqgvsw Itflhvpptg 301 vsgdvtdpnq ytnrmtaagi gfdrdpglna vgggqaapvp vpapapvpsp vpapvpavpa 361 vrtttarpap spspvpapvp apapvpapvp apvpapvpap vpapvpaspa atttrrhrtr 421 pprtttapav papppaatpk vcg

[0107] Xilanase GH30 de Dickeya chrysanthemi (SEQ ID NO: 5). GenBank ID AAB53151.1 1 mngnvslwvr hclhaalfvs atagsfsvya dtvkidanvn yqiiqgfggm sgvgwindlt 61 teqintaygs gvgqiglsim rvridpdssk wniqlpsarq avslgakima tpwsppaymk 121 snnslinggr llpanysayt shlldfskym qtngaplyai siqnepdwkp dyescewsgd 181 efksylksqg skfgslkviv aeslgfnpal tdpvlkdsda skyvsiiggh lygttpkpyp 241 laqnagkqlw mtehyvdskq sannwtsaie vgtelnasmv snysayvwwy irrsygllte 301 dgkvskrgyv msqyarfvrp galriqaten pqsnvhltay kntdgkmviv avntndsdqm 361 Islnisnanv tkfekystsa slnveyggss qvdssgkatv wlnplsvttf vsk

[0108] Xilanase GH30 de Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 (SEQ ID NO: 6). GenBank ID CAA97612.1 1 miprikktic vllvcftmls vmlgpgatev laasdvtvnv saekqvirgf ggmnhpawag 61 dltaaqreta fgngqnqlgf silrihvden rnnwykevet aksavkhgai vfaspwnpps

121 dmvetfnrng dtsakrlkyn kyaayaqhln dfvtfmknng vnlyaisvqn epdyahewtw 181 wtpqeilrfm renagsinar viapesfqyl knlsdpilnd pqalanmdil gthlygtqvs 241 qfpyplfkqk gagkdlwmte vyypnsdtns adrwpealdv sqhihnamve gdfqayvwwy 301 irrsygpmke dgtiskrgyn mahfskfvrp gyvridatkn pnanvyvsay kgdnkwiva 361 inksntgvnq nfvlqngsas nvsrwitsss snlqpgtnlt vsgnhfwahl paqsvttfw 421 nr

[0109] Xilanase GH30 de Bacteroides ovatus (SEQ ID NO: 7). GenBank ID SDY64378.1 1 mknitllfcl flanillgac sggedekkem degkgayalf Ikksitvstg esqtdvwew 61 aktsweitlg egdivksvtp tsggsntgek qytkvrvscg anstmkkrtq tihlfdktne 121 ttvdllveqe ppfksvtltv dpsvkyqpw gfggmynpki wcgdnlisas qldkmygagg 181 Igysilrlmi ypnesdwsad veaakaaqan gaiifacpwd ctdaladkit vngkemkhlk 241 kenyeayanh liryvtfmke kgvnlyaisv qnepdmefty wtpsewdfv kqygariret 301 gvklmspeac gmqpeytdpi innaeafaqt dilaghlyqg ftdlssgyvk nrhdyicgvy 361 sriqgktwwm tehlfndgen sddsskwefl kwqyslnhlg keihmcmegy csayiywylk 421 rfyglmgdtd krsptsegei tkngyimahy aqyatettri kwtnneevc ataywdektg 481 evtivllnln gasqwleipl agikkasave tnetknmevi dtglmesaeg itvllsansi 541 tsvrltf Xiloglucanase

[0110] Xiloglucanase GH5 de Bacteroides ovatus (SEQ ID NO: 8). GenBank ID ALJ47680.1 1 mekqsfsdgl fsplgikrvi fmlvllttsf iscsnsdekg gslevaqeyr nlefdargsr 61 qtiqidgpae whistseswc ksshtigegk qyvnitvean dtqkertatv tvsasgapdi 121 iinvkqslys vpaydeyiap dntgmrdlts mqlsalmkag vnvgntfeav ivgndgslsg 181 detcwgnptp nkvlfegika agfdwripv ayshqfedaa tykiksawmd kveaavkaal 241 daglyviini hweggwlnhp vdankealde rleamwkqia Irfrdyddrl Ifagtnevnn

301 ddangaqpte enyrvqngfn qvfvntvrat ggrnhyrhli vqayntdvak avahftmpld 361 ivqnriflec hyydpydfti mpndenfksq wgaafaggdv satgqegdie atlsslnvfi 421 nnnvpviige ygptlrdqlt gealenhlks rndyieywk tcvknklvpl ywdagytekl 481 fdrttgqphn aasiaaimkg ln

[0111] Xilanase GH8 de Pseudoalteromonas haloplanktis (SEQ ID NO: 9) PDB: 2A8Z_A 1 afnnnpssvg ayssgtyrnl aqemgktniq qkvnstfdnm fgynntqqly ypytengvyk 61 ahyikainpd egddirtegq swgmtaavml nkqeefdnlw rfakayqknp dnhpdakkqg 121 vyawklklnq ngfvykvdeg papageeyfa fallnasarw gnsgefnyyn daitmlntik 181 nklmenqiir fspyidnltd psyhipafyd yfannvtnqa dknywrqvat ksrtllknhf 241 tkvsgsphwn Iptflsrldg spvigyifng qanpgqwyef dawrvimnvg Idahlmgaqa 301 whksavnkal gflsyaktnn skncyeqvys yggaqnrgca gegqkaanav allastnagq 361 aneffnefws Isqptgdyry yngslymlam Ihvsgnfkfy nntfn

[0112] Xilanase GH10 de Caldicellulosiruptor owensensis (SEQ ID NO: 10) GenBank: ADQ03732.1 1 mseyqdktip slaekykeyf kigaavtvkd legvhgeilv khfnsltpen dmkferihpd 61 ehrynfdavd kmkefaiknn mkmrghtfvw hnqtpewvfk dregndvsre llierlrehi 121 ktvcdryrdi vyawdwnea vedktekllr dsnwrriigd dyikiafeia keyagegklf 181 yndynnempy klektykllk elidketpid gigiqahwni wdknlidnlk raiemyaslg 241 leiqiteldm svfefedrrt dllepaeemm elqakvyedv fkvfreykgv itsvtfwgis 301 dkhtwkdnfp vigrkdwpll fdvngkpkea ffrivnf

[0113] Xilanase GH11 de Thermobifida halotolerans (SEQ ID NO: 11) GenBank: AEH04392.1 1 mndapahpks rrhgrirlfv grvctalval vtattmlpgv anaavtsnqt gthdgyfysf 61 wtdspgtvsm elgpggnyst swsntgnfw gkgwstggrr tvtysgsfnp sgnayltlyg 121 wtrnplveyy ivdnwgtyrp tgtykgtvts dggtydiyet trtnapsieg tatfkqywsv

181 rqsrrtggti tagnhfdawa rhgmnlgshd ymimategyq ssgssnitvg gsgggnpggn 241 pggnpggggc tatlsagqqw sdrynlgvsv sgssnwtvtm nvpspakiia twnisasypn 301 aqtltarpng ngnnwgvtiq hngnwtwptv scsan

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a produção de um ingrediente adequado para incorporação em um alimento, cosmético ou nutracêutico, o dito ingrediente compreendendo um ou mais oligossacarídeos, caracterizado pelo fato dos oligossacarídeos serem produzidos em uma reação enzimática, a dita reação enzimática compreendendo a etapa de contanto, em uma solução ou suspensão, de um enzima de clivagem de polissacarídeo e um alimento contendo polissacarídeo, onde a dita reação enzimática não produz substancialmente quaisquer monossacarídeos ou dissacarídeos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da enzima de clivagem de polissacarídeo ser uma xilanase, preferivelmente xilanase GH5, GH8, GH10, GH11 ou GH30.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato da enzima de clivagem de polissacarídeo ser uma mananase.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato do alimento contendo polissacarídeo compreender xilano, e a enzima de clivagem de polissacarídeo ser uma xilanase GH5, GH8, GH10, GH11 e/ou GH30, preferivelmente onde o alimento contendo polissacarídeo compreende glucuronoxilano, arabinoxilano e/ou glucuronoarabinoxilano.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do alimento contendo polissacarídeo compreender celulose, quitina e/ou quitosana, a enzima de clivagem de polissacarídeo é uma monoxigenase lítica de polissacarídeo (LPMO), e a reação enzimática ser realizada na presença de um ou mais agentes redutores adequados, preferivelmente, onde a LPMO é selecionada do grupo consistindo em AA9, AA10, AA11 , AA13, AA14 e AA15.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato do um ou mais agentes redutores adequados serem selecionados do grupo consistindo em ácido ascórbico, ácido gálico, cisteína, NADH, NADPH, pirogalol, ditiotreitol, cianoboro hidretos, boro hidretos, pigmentos fotossintéticos, lignina, lignóis e uma combinação de celobiose e celobiose desidrogenase.

7. Método de acordo com ou com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato dos oligossacarídeos produzidos na reação enzimática compreenderem β-glucanos, preferivelmente β-1,4-glucanos.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do alimento contendo polissacarídeo compreender glucano de ligação mista e a enzima de clivagem de polissacarídeo ser liquenase, preferivelmente onde a liquenase é selecionada da família GH16 e/ou preferivelmente onde os oligossacarídeos produzidos na reação enzimática compreendem β-glucanos.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do alimento contendo polissacarídeo compreender xiloglucano e a enzima de clivagem de polissacarídeo ser uma xiloglucanase, preferivelmente uma xiloglucano endoglucanase (XEG).

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato do alimento contendo polissacarídeo compreende biomassa, preferivelmente onde o método compreende adicionalmente, antes da realização da reação enzimática, uma ou mais etapas em que a biomassa é pré-tratada com ácido, álcali, calor ou tratamento enzimático.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de, em peso, menos de cerca de 60%, preferivelmente menos de cerca de 50%, preferivelmente menos de cerca de 40%, mais preferivelmente menos de cerca de 30%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 20%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 15%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 10%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 1%, dos sacarídeos capazes de serem representados em imagem produzidos na reação enzimática são monossacarídeos ou dissacarídeos; e/ou pelo fato de, em peso, menos de cerca de 15%, preferivelmente menos de cerca de 10%, mais preferivelmente menos de cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 2%, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 1%, dos sacarídeos capazes de serem representados em imagem produzidos na reação enzimática contêm dezesseis ou mais resíduos, mais preferivelmente dez ou mais resíduos, ainda mais preferivelmente sete ou mais resíduos.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente uma segunda reação enzimática compreendendo o contato de uma segunda enzima de clivagem de polissacarídeo com o um ou mais alimentos contendo polissacarídeos o que produz um ou mais dissacarídeos.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato da quantidade de dissacarídeos ser de menos de cerca de 50% dos sacarídeos capazes de serem representados em imagem produzidos a partir de reações enzimáticas.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato das reações enzimáticas produzirem um ou mais monossacarídeos em uma quantidade de menos de cerca de 25% dos sacarídeos capazes de serem representados em imagem produzidos a partir de reações enzimáticas.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato da enzima de clivagem de polissacarídeo ser produzida por um ou mais micróbios presentes na reação enzimática.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato da enzima de clivagem de polissacarídeo ser operacionalmente ligada a um módulo catalítico ou não catalítico, preferivelmente onde a enzima de clivagem de polissacarídeo é ligada operacionalmente a um módulo não catalítico e o módulo não catalítico é um módulo de ligação a carboidrato.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a etapa de isolamento dos oligossacarídeos da reação enzimática, preferivelmente onde os oligossacarídeos solúveis são isolados de oligossacarídeos e polissacarídeos insolúveis.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato da reação enzimática ser seguida de uma etapa em que os oligossacarídeos são submetidos a tratamento químico, físico ou enzimático, tal como redução, oxidação, caramelização ou reação de Maillard.

19. Ingrediente para incorporação em um alimento, alimento cosmético ou nutracêutico, compreendendo oligossacarídeos de β-1,4-glucano, caracterizado pelo fato de um ou mais resíduos de sacarídeo terminal serem oxidados para uma lactona, um 4-cetoaldose,

um ácido aldônico ou um diol geminal, e pelo fato de não compreender substancialmente quaisquer monossacarídeos ou dissacarídeos.

20. Ingrediente para incorporação em um alimento cosmético ou nutracêutico, caracterizado pelo fato de ser obtenível pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

21. Ingrediente para incorporação em um alimento, cosmético ou nutracêutico, compreendendo oligossacarídeos de β-1,4-glucano e um outro oligossacarídeo, caracterizado pelo fato de ser obtenível pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

22. Ingrediente de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de compreender dissacarídeos em uma quantidade de menos de cerca de 40% dos sacarídeos capazes de serem representados em imagem produzidos a partir de reações enzimáticas.

23. Ingrediente de acordo ou com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de compreender monossacarídeos em uma quantidade de menos de cerca de 25% dos sacarídeos capazes de serem representados em imagem produzidos a partir de reações enzimáticas