JP2021514197A

JP2021514197A - 生成方法

Info

Publication number: JP2021514197A
Application number: JP2020544791A
Authority: JP
Inventors: トーマスシモンズ，
Original assignee: ケンブリッジグリコサイエンスエルティーディー
Priority date: 2018-02-21
Filing date: 2019-02-21
Publication date: 2021-06-10
Also published as: BR112020017104A2; CN112135911A; AU2019223155A1; US11248247B2; EP3530743A1; WO2019162416A1; EP3755808A1; MX2020008738A; CA3091790A1; US20210177021A1; US20210010043A1; AU2019223155B2

Abstract

オリゴサッカリド生成の分野にある本発明は、実質的量のモノサッカリドおよびジサッカリドを生成することなく、有用な長さのオリゴサッカリドを生成する方法を提供する（図１によって図示される）。食料品、化粧品、または機能性食品への組み込みに適した成分を生成するための方法が提供され、上記成分は、１種またはこれより多くのオリゴサッカリドを含み、ここでそのオリゴサッカリドは、酵素反応において生成され、上記酵素反応は、溶液または懸濁物中で、ポリサッカリド切断酵素およびポリサッカリド含有供給原料を接触させる工程を包含し、ここで上記酵素反応は、モノサッカリドもジサッカリドも実質的に生成しない。

Description

発明の分野
本発明は、オリゴサッカリドの酵素的生成、ならびに食料品、化粧品、および機能性食品におけるそれらの使用に関する。

発明の背景
糖分の多い食品およびドリンクは、世界中で文化および生活様式の習慣の重要な部分であるが、それらが含む糖分は、人々において肥満、糖尿病、口腔衛生不良、および破壊的行動に関連している。これが原因で、消費者の好みは、糖分含有食品から離れていっており、政府は、糖分のより少ない消費を奨励する規則をますます施行しつつある。

よって、産業界は、食品および飲料中の糖分の代用とするために、数十年にわたって適切な低カロリー甘味料を探索し続けてきた。不運なことに、多くの糖分代用品は、非天然供給源から生成され、しばしば、それらの甘さとともに、根底に苦味または他の不快な味が現れ、それらはともに、消費者の心を引きつけない。さらに、甘味料は、食品およびドリンク中の糖分の甘さを模倣し得るが、糖分の他の側面をほとんど模倣できない（例えば、かさ増しする、質感を調整する、構造をもたらす、保存剤として作用する、ならびにカラメル化およびメイラード反応を通じて色調および風味を調整する）。

食物線維は、積極的な食事療法の重要な部分であり、消化器系の健康状態および十分に調節された腸内細菌叢を維持する一助となる。このような線維は、種々の鎖長およびサッカリドタイプのポリサッカリドを含む。広い範囲の食品において天然に見出されることに加えて、線維はまた、別個に生成され得、それらの製造の間に他の食品に添加され得る。

食物オリゴサッカリドを産業的に生成する方法は、長いポリサッカリドを。より短い鎖へと化学的にまたは酵素的に切断する工程を包含し得る。しかし、その望ましい長さの鎖に加えて、モノサッカリドおよびジサッカリドが、この切断作用によって遊離される。モノサッカリドおよびジサッカリドは、栄養表示において「糖分（ｓｕｇａｒ）」として分類されることから、およびそれらが、上記で記載されるヒトの健康状態に対して負の影響を引き起こすことから、それらは、オリゴサッカリドに関する多くの食品用途において望ましくない。グルコース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、スクロースおよびラクトースは、特に望ましくない。なぜならそれらはカロリーが高いからである。しかし、ヒトの健康状態に対して過剰なモノサッカリドおよびジサッカリドとの負の関連にもかかわらず、高レベルのモノサッカリドおよびジサッカリド（例えば、１００％）を含む組成物は、食品産業において豊富に使用される。

発明の要旨
本発明者らは、現在使用される組成物中の実質的量のモノサッカリドおよびジサッカリドを置き換える長鎖化したサッカリド（オリゴサッカリド）を含む糖分組成物が、食料品において所望の甘さおよび質感特性をなお提供することを見出した。しかし、ヒトの健康状態に対する現在の糖分組成物と関連する負の影響は、有意に改善され；例えば、本発明の組成物は、かなり低いカロリーしか含まず、口腔衛生にあまり影響しない。

さらに、本発明者らは、実質的量のモノサッカリドおよびジサッカリドを生成することなく、有用な長さのオリゴサッカリドを生成する酵素的方法を発見し、これらオリゴサッカリドから派生した食料品が、改善された特性を有することを見出した。モノサッカリドおよびジサッカリドはしばしば、オリゴサッカリド組成物から除去され、これは、時間、複雑さ、エネルギー、および費用をその製造プロセスに追加する。結果として、本発明者らの新規な方法は、食料品、機能性食品、および化粧品製品を製造するにあたって有用である。

さらに、本発明者は、上記酵素が溶解性ポリサッカリドモノオキシゲナーゼ（ＬＰＭＯ）である場合に、上記生成されるオリゴサッカリド鎖のうちのいくらかが、上記オリゴサッカリドの風味、色調、カラメル化、および他の特性を食品産業において有用であるような方法で調整し得る、一方の末端または両方の末端に化学的改変を有することを見出した。

本発明の第１の局面によれば、食料品、化粧品、または機能性食品に組み込むために適切な成分を生成するための方法であって、上記成分は、１種またはこれより多くのオリゴサッカリドを含み、ここで上記オリゴサッカリドは、酵素反応において生成され、上記酵素反応は、溶液または懸濁物中で、ポリサッカリド切断酵素およびポリサッカリド含有供給原料を接触させる工程を包含し、ここで上記酵素反応は、モノサッカリドもジサッカリドも実質的に生成しない方法が提供される。

本発明の第２の局面によれば、食料品、化粧品、または機能性食品に組み込むための成分であって、上記成分は、β−１，４−グルカンオリゴサッカリドを含み、ここで１個またはこれより多くの末端サッカリド残基は、ラクトン、４−ケトアルドース、アルドン酸またはジェミナルジオールへと酸化され、ここで上記成分は、モノサッカリドもジサッカリドも実質的に含まない成分が、提供される。

本発明の第３の局面によれば、食料品、化粧品、または機能性食品に組み込むための成分であって、上記成分は、β−１，４−グルカンオリゴサッカリドおよび別のオリゴサッカリドを含む成分が、提供される。

図１：実施例１に従う、リン酸膨潤セルロースと、ＰａＬＰＭＯ９Ｅおよび／またはアスコルビン酸塩の緩衝化溶液とのインキュベーションの生成物を示すＰＡＣＥゲル。

図２：実施例２に従う、洗浄したオーツと、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するＧＨ１６リケナーゼの溶液とのインキュベーションの生成物を示すＰＡＣＥゲル。

図３：実施例２に従う、ケーキバッターに、糖分、混合結合型グルカンオリゴサッカリドまたは糖分もオリゴサッカリドもなしのもの組み込むことによって作られるケーキの写真。

図４：実施例３に従う、トウヒ木材チップと、Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍに由来するＧＨ３０キシラナーゼの緩衝化溶液とのインキュベーションの生成物を示すＰＡＣＥゲル。

図５：実施例４に従う、タマリンドキシログルカンと、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐに由来するＧＨ５キシログルカナーゼの緩衝化溶液とのインキュベーションの生成物を示すＰＡＣＥゲル。

発明の詳細な説明
本発明者は、実質的量のモノサッカリドおよびジサッカリドを生成することなく、食料品、化粧品、または機能性食品製品において有用な長さのオリゴサッカリドを生成する酵素的方法を発見した。いくつかの実施形態はさらに、新規特性を有する生成物を提供する。

本明細書で使用される場合、「食品（ｆｏｏｄ）」および「食料品（ｆｏｏｄｓｔｕｆｆ）」とは、消費（これは、ヒト、または任意の他の動物による消費であり得る）が予定されている任意の項目に言及する。それは、食品、飼料、飲料、または上記のうちのいずれかの生成において使用されるべき成分であり得る。

本明細書で使用される場合、「機能性食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）」とは、ヒトまたは他の動物に栄養を提供するという目的で、摂取、注射、吸収、または任意の他の方法によるかにかかわらず、そのヒトまたは他の動物へと導入される任意の生成物をいう。このような機能性食品における使用は、食物線維が添加されたドリンク、プレバイオティクス添加剤、丸剤もしくは他のカプセル剤、錠剤結合剤；または任意の他の適切な使用の形態をとり得る。

本明細書で使用される場合、「化粧品（ｃｏｓｍｅｔｉｃ）」とは、審美的異な魅力を増大させるかまたは審美的な魅力の将来的な喪失を防止するために、ヒトまたは他の動物に対する使用が意図された任意の組成物、および一般的な言い回しでは化粧品として公知の任意の他の組成物に言及する。審美的な魅力は、視覚的な魅力に限定されるのではなく、質感的なまたは任意の他の魅力にもあてはまる。その化粧品は、マスカラ、ファンデーション、リップグロス、アイシャドウ、アイライナー、化粧下地、リップブラシ、マニキュア液、ブロンザー、または任意の他の化粧用品；シャンプー、コンディショナー、スタイリングムース、スタイリングジェル、ヘアスプレー、毛髪染料、ヘアワックス、または任意の他のヘア製品；モイスチャライザー、角質除去剤（ｅｘｆｏｌｉａｎｔ）、日焼け止め、クレンザー、練り歯磨き、あるいはクリーム、ローション、軟膏またはもしくは歯、皮膚、ヘアもしくは身体の他の部分をある種の審美的な方法で変更するにあたって有効な任意の他の組成物であり得る。あるいはそれは、フェイスマスク、ブラシ、ヘアカーラー（ｈａｉｒｒｏｌｌｅｒ）、他のスタイリングデバイス、または他の固体構造の構成要素として使用される組成物、または任意の他の適切な組成物であり得る。

本発明の方法の１工程は、１種またはこれより多くの酵素が、１種またはこれより多くの供給原料（これは、水の中で可溶性であっても不溶性であってもよい）および適切な溶媒と一緒に適切な反応容器の中に配置された、酵素反応である。

種々の酵素が、本発明の酵素反応における使用に適している。ポリサッカリド含有供給原料に対して作用する場合に、オリゴサッカリドを生成し、それと同時に、モノサッカリドもジサッカリドも実質的に生成しない任意の酵素が、適切であり得る。好ましくは、その酵素反応は、溶解性ポリサッカリドモノオキシゲナーゼ（ＬＰＭＯ）、リケナーゼ、キシログルカンエンドグルカナーゼ（ＸＥＧ）、マンナナーゼ、および／またはキシラナーゼ（例えば、ＧＨ５、ＧＨ８、ＧＨ１０、ＧＨ１１および／またはＧＨ３０キシラナーゼ）を含む。より好ましくは、その酵素反応は、ＬＰＭＯを含む。さらにより好ましくは、その酵素反応は、マンナナーゼを含む。なおより好ましくは、その酵素反応は、キシラナーゼ（例えば、ＧＨ５、ＧＨ８、ＧＨ１０、ＧＨ１１またはＧＨ３０キシラナーゼ）を含む。多くの酵素を含む酵素カクテルがまた予想される（例えば、ＬＰＭＯおよびキシラナーゼを含むもの、またはＬＰＭＯ、キシラナーゼ、およびリケナーゼを含むもの、またはキシラナーゼおよびマンナナーゼを含むもの）。各酵素は、精製された酵素、いくつかの天然の供給源もしくは実験室で増殖された培養物から得られた半精製された混合物として、その酵素を精製するように操作された微生物系統の形態において、または任意の他の方法において、その酵素反応に提供され得る。これらの酵素と、他の酵素または非酵素モジュール（例えば、炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ））のいずれかとの融合物がまた、各それぞれの用語内で予想される（例えば、ＣＢＭに融合されたＬＰＭＯ、ＣＢＭに融合されたキシラナーゼ、またはＬＰＭＯに融合されたキシラナーゼ）。

本明細書で使用される場合、「溶解性ポリサッカリドモノオキシゲナーゼ（ｌｙｔｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）」および「ＬＰＭＯ」とは、銅を含む部分を使用して、ならびに酸素供給源（例えば、二酸素、ペルオキシド、または任意の他の酸素供給源）；および適切な還元剤を使用して、ポリサッカリドを酸化的に切断し得る酵素のクラスに言及する。よって、ＬＰＭＯが使用される場合、その酵素反応は、好気的条件下で行われ得る。適切な還元剤は、特に限定されないが、例としては、アスコルビン酸、没食子酸、システイン、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ピロガロール、ジチオスレイトール、シアノボロヒドリド、ボロヒドリド、光合成色素、リグニン、リグノール、およびセロビオースとセロビオースデヒドロゲナーゼの組み合わせが挙げられる。当業者は、使用され得る広く種々の光合成色素を認識しているが、チラコイドおよび精製画分、またはクロロフィルが好ましく、光が供給され得る。

その還元剤は、その酵素または酵素カクテルに対して特定のモル濃度比でその酵素反応に添加される。この比は、任意の適切な比、例えば、約１０^１：１〜約１０^８：１、好ましくは約１０^３：１〜約１０^６：１、より好ましくは約１０^４：１〜約１０^５：１であり得る。

好気的条件は、酸素の添加を含み得る。これは、基質混合物を酸素含有ガス（例えば、空気）で曝気することによって提供され得る。曝気は、種々のシステム（例えば、エアインジェクター、曝気フリット、膜システム、または内部ループエアリフトリアクター）によって、酸素含有気泡を水性基質混合物へと導入することによって行われ得る。好ましくは、その酵素反応中の分子酸素の濃度は、約４〜約１４ｍｇ／ｌである。

ＬＰＭＯの酸化活性は特に強力であることから、それらは、さらに非常に強固なポリマー（例えば、セルロース）を酸化的に切断し得る。これは、有用なオリゴサッカリドの生成を、食品用には不十分な、従って非常に安価な原材料として旧来から認められている供給原料からですら可能にする。このような供給原料の例としては、以下のような植物バイオマスが挙げられる：穀物、籾殻、豆の莢、種皮、および／もしくは他の種子物質；海藻；トウモロコシ茎葉、トウモロコシの穂軸、藁、バガス、ススキ、ソルガム残渣、スイッチグラス、竹、および／もしくは他の単子葉植物組織；ホテイアオイ、葉組織、根、および／もしくは他の植物物質；硬木、硬木材チップ、硬木材パルプ、軟木、軟木材チップ、軟木材パルプ、紙、製紙用パルプ、ボール紙、および／もしくは他の木材ベースの供給原料；カニ殻、イカバイオマス、エビ殻、および／もしくは他の海洋生物バイオマス；ならびに／または適切な供給原料の任意の組み合わせ。ＬＰＭＯが作用する場合の本発明のオリゴサッカリドプロフィールを生成するために適した供給原料は、例えば、セルロース、キチン、キトサン、キシランおよび／またはマンナンを含み得るが、適切に作用され得る任意の供給原料が予想される。

好ましくは、ＬＰＭＯは、以下のファミリーから選択される：ＡＡ９、ＡＡ１０、ＡＡ１１、ＡＡ１３、ＡＡ１４およびＡＡ１５。より好ましくは、そのＬＰＭＯは、ＰａＬＰＭＯ９Ｅ（配列番号１）、元々は特に低レベルのモノサッカリドおよびジサッカリドを生成する子嚢菌の真菌、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａａｎｓｅｒｉｎａから単離されたＡＡ９ＬＰＭＯである。

ＬＰＭＯが基質に対して作用する場合、任意の所定の切断反応において生成されるその２個の新たな末端残基のうち、一方は酸化される。ＬＰＭＯが使用される場合、セルロース、キチン、およびキトサンが好ましい基質である。例えば、セルロースがその基質であれば、そのβ−１，４グリコシド結合が切断される場合、そのＣ１炭素に結合した残基は、ラクトンに変換され、そのＣ４タンパク質に結合した残基は、４−ケトアルドースに変換される。次いで、その２つの部分は、自然に水と反応して、それぞれ、アルドン酸およびジェミナルジオールを形成し得る。その得られたオリゴサッカリドは、従って、任意の他の様式で生成されるβ−グルカンにおよそ等しいが、いくつかの点においては微細に異なる。好ましくは、その得られたオリゴサッカリドは、β−グルカンおよび／またはグルコサミンのポリマーを含む。

ＬＰＭＯによって生成されるグルカンの場合、その生成物は、非酸化的手段を介して生成される等価物と比較して、異なるカラメル化特性、風味、色調、および他の特性を有し得る。よって、それらは、他のグルカンと同じ適用において使用され得る一方で、いくつかの適用において他のグルカン供給源より好ましいこともあるこれらの特性に関して、微細な改善点を提供する。同様に、異なるＬＰＭＯの使用は、異なるタイプの酸化された末端の異なる割合を生じるので、異なるＬＰＭＯの使用は、異なる食品、機能性食品および化粧品適用にかなうように酸化を適合させることを可能にし得る。

本発明において有用な別の例示的な酵素は、リケナーゼであり、これは、ＧＨ５、ＧＨ７、ＧＨ８、ＧＨ９、ＧＨ１２、ＧＨ１６、ＧＨ１７、またはＧＨ２６ファミリー、好ましくはＧＨ１６酵素、より好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するＧＨ１６酵素（配列番号２）から選択され得る。適切なポリサッカリド基質（例えば、リケニンまたは他の混合結合型グルカン）に対して作用する場合に、モノサッカリドもジサッカリドも実質的に生成しないリケナーゼが、本明細書で特許請求される。その酵素は、例えば、混合結合型グルカン（これは、β−１，３結合およびβ−１，４結合の混合物を含むグルカンである）に対して作用し得、それらを、β−１，４グリコシド結合において切断し得る。そのリケナーゼが、混合結合型グルカンに対して作用する好ましい場合に、その生成されるβ−グルカンは大きくは、約３〜約７残基のサイズ範囲内に入り得るので、それらは、食品、化粧品および機能性食品産業において特に有用である。

混合結合型グルカンは、イネ科およびトクサ科（ｈｏｒｓｅｔａｉｌｆａｍｉｌｙ）のメンバーに豊富であり、よって、イネ科ベースの供給原料（例えば、藁）は、高レベルの混合結合型グルカンを有し、有用なことには、リケナーゼで作用され得る。

本発明において有用な別の代替の酵素は、ＧＨ５、ＧＨ８、ＧＨ１０、ＧＨ１１および／またはＧＨ３０ファミリーのキシラナーゼであり、これらは、例えば、キシラン骨格を含む供給原料に対して作用し得る。そのキシラナーゼは、例えば、グルクロノキシラナーゼ、アラビノキシラナーゼ、またはグルクロノアラビノキシラナーゼであり得る。その酵素は、キシラン骨格（例えば、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、およびグルクロノアラビノキシラン）を有する種々のポリマーに対して活性であり得る。これらのポリマーは、種々の植物由来の供給原料において豊富であり、例えば、硬木および軟木はともに、適切なポリサッカリドを含み得、硬木はしばしば、グルクロノキシランを含み、軟木はしばしば、アラビノグルクロノキシランを含む。好ましいキシラナーゼとしては、Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍに由来するＧＨ５キシラナーゼ（配列番号３）およびＧｏｎａｐｏｄｙａｐｒｏｌｉｆｅｒａに由来するＧＨ５キシラナーゼ（配列番号４）、ならびにＤｉｃｋｅｙａｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉに由来するＧＨ３０キシラナーゼ（配列番号５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するＧＨ３０キシラナーゼ（配列番号６）およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｏｖａｔｕｓに由来するＧＨ３０キシラナーゼ（配列番号７）が挙げられる。

軟木アラビノグルクロノキシランを含む供給原料は、好ましい供給原料であり、ＧＨ３０キシラナーゼで消化される場合、その生成物は、食料品、化粧品、および機能性食品産業において有用な長さの主鎖を有するオリゴサッカリドを含む。これらのオリゴサッカリドは、約５個より多くの主鎖残基を含み得、モノサッカリドもジサッカリドも実質的に含まない。

硬木グルクロノキシランを含む供給原料は、別の好ましい供給原料であり、ＧＨ３０キシラナーゼで消化される場合、その生成物は、大きくは約５〜約３０個の主鎖残基を含むグルクロノキシラン鎖を含む。

本発明において有用な他の酵素としては、キシログルカナーゼおよびキシログルカンエンドグルカナーゼ（ＸＥＧ）が挙げられ、これらは、多くの生物（植物病原性微生物が挙げられる）によって生成される。それらは、キシログルカン、高等植物の一次細胞壁に豊富な、キシロースで修飾されているヘミセルロース系のβ−１，４グルカン鎖に対して作用し得、そのキシロース残基のうちのいくつかは、他の残基（例えば、ガラクトース）でさらに修飾される。適切なキシログルカナーゼまたはＸＥＧがキシログルカンに対して作用する場合、その生成物は、食料品、化粧品、および機能性食品産業において有用な長さの主鎖を有するキシログルカンオリゴサッカリドを含み、モノサッカリドもジサッカリドも実質的に含まない。１つの好ましいキシログルカナーゼは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｏｖａｔｕｓに由来するＧＨ５キシログルカナーゼ（配列番号８）である。

その酵素反応は、適切な反応容器の中で、溶液および／または懸濁物中で起こり得る。酵素および供給原料の特定の組み合わせに適切な温度または温度プロトコールにおいて、その反応は、特定の量の時間にわたって、またはその生成物が望ましい濃度に達するまで、またはいくつかの他の要件が満たされるまで、進行させられ得る。

本明細書で使用される場合、「懸濁物（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）」とは、少なくとも２つの非混和性の相、例えば、固相および液相を含む組成物であって、ここでその固相の重量は、その組成物の重量のパーセンテージとして、約０．５％〜約３０％、好ましくは１％〜約１０％、より好ましくは約２％〜約７％、なおより好ましくは約３％〜約５％の範囲にあり得るものに言及する。その懸濁物は、適切な溶媒を含み得、この溶媒は、好ましくは水である。例えば、プロセス時間を改善するために、約１％〜約３５％、好ましくは５％〜約３０％、より好ましくは約８％〜約２５％、なおより好ましくは約１０％〜約２０％のわずかにより高濃度を使用することは、特に有益であり得る。

その酵素と供給原料との間の最適な接触を確実にするために、その反応混合物は、一定に、または間隔を空けて、いずれかで撹拌され得る。その撹拌は、反応容器全体を律動的に動かす、ファンまたは他の撹拌デバイスの、気泡スパージングの、または任意の他の撹拌方法の形態をとり得る。

その酵素反応は、微生物発酵であり得る。その温度および反応時間は、使用される微生物の増殖に適している。その微生物は、本発明のオリゴサッカリドの生成に適した酵素を生成し、それと同時に、モノサッカリドもジサッカリドも実質的に生成しないように遺伝的に変化させられ得る。その微生物は、例えば、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）または真菌（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり得る。

本発明の微生物を改変するために適した発現ベクターがさらに、本発明において具現化され、その結果、その微生物は、本発明の酵素または酵素の混合物を生成する。所望される場合、その発現ベクターは、プラスミドまたはその酵素の生成を誘導し得る任意の他の核酸であり得、外因性酵素の発現を制御するために、以下の調節配列のうちの１種またはこれより多くのを含み得る：ヒートショック遺伝子の調節配列、毒性遺伝子の調節配列、および芽胞形成遺伝子の調節配列。

その酵素反応は、その使用される酵素および基質に適した温度または温度プロトコールにおいて行われる。例えば、その反応は、約１０℃〜約８０℃、好ましくは約２０℃〜約６０℃、より好ましくは約３０℃〜約４０℃の範囲の一定温度で行われ得る。それは、約３０℃〜約７０℃、好ましくは約４０℃〜約６０℃のわずかにより高い温度を使用すること、例えば、プロセス時間を改善することは、特に有益であり得る。その酵素反応が、微生物発酵の形態を取り得る場合、その温度は、そのために適切であり得る。例えば、その酵素反応は、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖を含み得る、および／またはその温度は、一定かつおよそ３７℃であり得る。

その溶液または懸濁物のｐＨは、その酵素の活性に影響を及ぼし得る。ｐＨの制御は、適切な速度で酵素反応が進行することを保証するに当たって重要であり得る。本発明の酵素反応は、約２〜約１０、好ましくは約３〜約８、より好ましくは約４〜約６の範囲のｐＨにおいて起こり得る。

その酵素反応は、必要に応じてクエンチされ、その生成物が単離されるかまたは別の方法で集められる前に、ある一定の期間にわたって継続することが可能にされる。この期間は、約１分間〜約５日間であり得、好ましくは約０．５日間〜約３日間であり、より好ましくは約１６時間〜約４８時間である。あるいは、その反応は、その反応の完了またはおよその完了まで進行させられ得る。その反応が、その反応の完了またはおよその完了まで進行させられる場合、これは、５日間より長くてもよい。

その酵素反応に添加される１種またはこれより多くの供給原料は、ポリサッカリドを含む。このようなポリサッカリドは、その反応容器の中で同時に別個の反応が進行することによって生成されていてもよい。その酵素反応に存在するポリサッカリドは、酵素によって有用なオリゴサッカリドへと切断される。

適切なポリサッカリドを含む任意の基質は、その供給原料の一部を形成し得る。その食料品、化粧品、および機能性食品産業は、広く種々のオリゴサッカリドを使用することから、その酵素反応に参加するために適したポリサッカリドは、特に限定されない。好ましくは、その供給原料は、セルロース、キチン、キトサン、混合結合型グルカン、キシラン、およびキシログルカンから選択される１種またはこれより多くのポリサッカリドを含む。キシランが存在する場合、それらは、好ましくは、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、および／またはグルクロノアラビノキシランを含む。

このようなポリサッカリドを含む供給原料はまた、大部分の植物物質がこのようなポリマーに富んでいることから、特に限定されない。よって、その供給原料は、以下を含み得る：植物バイオマス（例えば、穀物、籾殻、豆の莢、種皮、および／もしくは他の種子物質；海藻；トウモロコシ茎葉、トウモロコシの穂軸、藁、バガス、ススキ、ソルガム残渣、スイッチグラス、竹、および／もしくは他の単子葉植物組織；ホテイアオイ、葉組織、根、および／もしくは他の植物物質；硬木、硬木材チップ、硬木材パルプ、軟木、軟木材チップ、軟木材パルプ、紙、製紙用パルプ、ボール紙、および／もしくは他の木材ベースの供給原料；カニ殻、イカバイオマス、エビ殻、および／もしくは他の海洋生物バイオマス；ならびに／または適切な供給原料の任意の組み合わせ。好ましくは、その供給原料は、コムギ藁または木材を含む。任意の所定の天然供給原料は、種々のポリサッカリドの混合物を含む可能性が高いので、種々の酵素のカクテルが有益である場合もときおりある。このようなカクテルは、任意の他の酵素を含み得る。例えば、このようなカクテルは、セルロースとキシラナーゼ、セルロースとマンナナーゼ、キシラナーゼとマンナナーゼ、ＬＰＭＯとキシラナーゼ、ＬＰＭＯとリケナーゼ、ＬＰＭＯとマンナナーゼ、またはＬＰＭＯと種々のＬＰＭＯを含み得、ここでそれら酵素パートナーは、好ましくは１：１０〜１０：１の間のモル比で存在する。さらに、多くの適した供給原料は強固であることから、その供給原料の予備処理が予想される。

本明細書で使用される場合、「予備処理（ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、供給原料に本発明の酵素反応工程において固有の酵素が容易に作用するようにする任意のプロセスである。その予備処理は、その酵素反応の前に起こり、例えば、硫酸、リン酸、もしくはトリフルオロ酢酸による酸処理；例えば、水酸化ナトリウムによるアルカリ処理、もしくはアンモニア線維膨張；例えば、熱水、加熱蒸気、もしくは高温の酸による酸処理；ならびに／または例えば、ヒドロラーゼ、リアーゼ、もしくはＬＰＭＯによる酵素処理、または上記のプロセスのいずれかの混合を含み得る。

本明細書で使用される場合、「ポリサッカリド（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」とは、２残基より長い任意の長さのサッカリドポリマーをいう。ポリサッカリドは、高度に分枝状であっても、軽度に分枝状であっても、非分枝状であってもよく、例えば、α結合型またはβ結合型の任意の組み合わせ、任意の数、およびモノマータイプ（例えば、グルコース、グルコサミン、マンノース、キシロース、ガラクトース、フコース、フルクトース、グルクロン酸、アラビノース、またはアセチル基もしくは他の基で修飾された上記のモノマーの任意の組み合わせのようなその誘導体）の任意の組み合わせにおいて、グリコシド結合の任意の様式を含み得る。そのポリサッカリドは、セルロース系またはヘミセルロース系のポリマー、予想されるヘミセルロース系のポリマー（キシラン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、グルコマンナン、およびキシログルカンが挙げられる）であり得る。セルロースは、好ましいセルロース系のポリマーである。マンナンは、さらにより好ましい。キシランは、なおさらにより好ましい。

本明細書で使用される場合、「高度に分枝状の（ｈｉｇｈｌｙｂｒａｎｃｈｅｄ）」、「軽度に分枝状の（ｌｉｇｈｔｌｙｂｒａｎｃｈｅｄ）」、および「非分枝状の（ｕｎｂｒａｎｃｈｅｄ）」とは、サッカリドの主鎖の一続きあたりの側鎖の数に言及する。高度に分枝状のサッカリドは、１０個の側鎖残基あたり平均して４〜１０本の側鎖を有し、軽度に分枝状のサッカリドは、１０個の側鎖残基あたり平均して１〜３本の側鎖を有し、非分枝状のサッカリドは、１本の主鎖のみを有し、側鎖を全く有しない。その平均は、サッカリドにおける側鎖数を主鎖の残基数によって除算することによって計算される。

本明細書で使用される場合、「サッカリド（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」とは、任意のポリサッカリド、オリゴサッカリド、モノサッカリド、またはジサッカリドに言及する。

本明細書で使用される場合、「オリゴサッカリド（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」とは、食料品、化粧品、または機能性食品製品の状況において有用である範囲内に概してある鎖長を有するサッカリドポリマーに言及する。それらは、少なくともその酵素反応の生成物の範囲内で構成される。代表的な鎖長は、約３〜約１６個のサッカリド残基であり得る。オリゴサッカリドは、高度に分枝状であっても、軽度に分枝状であっても、または非分枝状であってもよく、α結合型またはβ結合型の任意の組み合わせ、任意の数でのグリコシド結合、ならびにモノマータイプ（例えば、グルコース、グルコサミン、マンノース、キシロース、ガラクトース、フコース、フルクトース、グルクロン酸、アラビノース、またはその誘導体）の任意の組み合わせを含み得る。適切な誘導体は、アセチル基または他の基を含む上記のモノマーを含む。

本発明のプロセスにおいて生成されるオリゴサッカリドは、サイズ上限およびサイズ下限の範囲内にある。そのサイズ下限は、実質的にモノサッカリドもジサッカリドも生成されないことである。

本明細書で使用される場合、モノサッカリドもジサッカリドも「実質的にない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙｎｏ）」とは、重量で、その想定可能なサッカリドのうちの約６０％未満、好ましくは約５０％未満、好ましくは約４０％未満、より好ましくは約３０％未満、さらにより好ましくは約２０％未満、さらにより好ましくは約１５％未満、さらにより好ましくは約１０％未満、さらにより好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、なおより好ましくは約１％未満、最も好ましくは約０．１％未満が、モノサッカリドまたはジサッカリドである生成物のセットに言及する。

本明細書で記載される場合、本発明の酵素反応は、オリゴサッカリドを生成する一方で、モノサッカリドおよびジサッカリドを実質的に生成しないために有用である。しかし、その反応が、他の反応（例えば、酵素的な）が同時に起っている大きな容器の中で起こることは、予想される。これらの他の酵素反応はまた、ポリサッカリドをより小さなサッカリド（オリゴサッカリドを含む）へと分解するが、モノサッカリドおよびジサッカリドをも生成し得る。従って、その方法は、第２のポリサッカリド切断酵素を、１種またはこれより多くのジサッカリドを生じ得るその１種またはこれより多くのポリサッカリド含有供給原料へと接触させる工程を包含する第２の酵素反応をさらに含む。場合によっては、モノサッカリドも生成され得る。これらのモノサッカリドおよびジサッカリドは、その成分の中に含まれ得るので、具体的な特徴において、適切には、その生成される成分中のジサッカリドの量は、その想定可能なサッカリドのうちの約５０％未満、好ましくは約４０％未満、より好ましくは約３５％未満、より好ましくは約３０％未満、さらにより好ましくは約２５％未満、さらにより好ましくは約２０％未満、さらにより好ましくは約１５％未満、さらにより好ましくは約１０％未満、さらになおより好ましくは約５％未満である。

適切には、その生成される成分の中のモノサッカリドの量は、その想定可能なサッカリドのうちの約２５％未満、好ましくは約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、さらにより好ましくは約１０％未満、さらにより好ましくは約５％未満、さらになおより好ましくは約３％未満、さらになおより好ましくは約１％未満である。

本明細書で使用される場合、「想定可能なポリサッカリド（ｉｍａｇｅａｂｌｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」とは、以下の画像化プロトコールのうちの１つが行われる場合に、そのゲルまたはスペクトルの中で可視化可能であるものである。

本発明によって生成される種々のポリサッカリドの重量パーセンテージを評価する１つの方法は、酵素反応生成物のサンプルを処理して、それらの還元末端を蛍光色素で誘導体化し、続いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、その後得られたポリアクリルアミドゲルを、例えば、蛍光画像化によって画像化し、そして各バンドに対して光学密度分析を行い、その得られた値を残基計数によって調節して、質量の示度を与えることである。当業者は、これを、Ｇｏｕｂｅｔｅｔａｌ．（２００２）と合わせて、この適用の内部の情報とともに行い得る。これは、パーセンテージの値を、想定可能なポリサッカリドの重量によって計算するために予想される方法である。

本発明によって生成される種々のポリサッカリドの重量パーセンテージを評価する別の方法は、ハイスループット液体クロマトグラフィーによって、例えば、アルカリ性溶液中でアニオン交換クロマトグラフィーカラムを使用し、続いて、パルスドアンペロメトリー検出（ｐｕｌｓｅｄａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を使用して分析することである。その得られたデータは、残基計数によって調節されて、質量の示度を与え得る。当業者は、これを、Ｓｉｍｍｏｎｓｅｔａｌ．（２０１３）と合わせて、この適用の内部の情報とともに行い得る。

本明細書で使用される場合、「モノサッカリド（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」および「ジサッカリド（ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」とは、それぞれ、１個または２個の残基からなるサッカリド化合物をいう。モノサッカリドは、グルコース、グルコサミン、キシロース、ガラクトース、フコース、フルクトース、グルクロン酸、アラビノース、ガラクツロン酸；またはそのエピマーもしくは他の誘導体のような化合物である。適切な誘導体は、アセチル基または他の基を含む。ジサッカリドは、任意のグリコシド結合を介して繋がれた２個のモノサッカリドからなる化合物である。このような反応においてモノサッカリドもジサッカリドも実質的に生成しない酵素または酵素の組み合わせが、本明細書で予想される。

そのオリゴサッカリドのサイズ上限は、その使用される酵素、供給原料、および反応条件に依存し、それらの主鎖の中に１６個またはこれより多くの残基を含む生成物の重量が、想定可能なポリサッカリドの重量のある特定のパーセンテージを下回ることであり得る。

このパーセンテージは、約１５％、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得る；またはそのパーセンテージは、それらの主鎖の中に１５個またはこれより多くの残基を含む生成物の重量が、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得る；またはこのパーセンテージは、それらの主鎖の中に１４個またはこれより多くの残基を含む生成物の重量が、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得るか、または好ましい順に、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、もしくは７個の残基を含む生成物にも該当する。

その供給原料は、セルロースを含み得、ＬＰＭＯまたは他の酵素が作用した場合、それらの主鎖の中に７個またはこれより多くの残基を含む生成物の重量は、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得る。あるいは、それは、それらの主鎖の中に８個またはこれより多くの残基を含む生成物の重量が、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得ることであり得る。

その供給原料は、キチンを含み得、ＬＰＭＯまたは他の酵素が作用した場合、それらの主鎖の中に１１個またはこれより多くの残基を含む生成物の重量は、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得る。あるいはそれは、それらの主鎖の中に１２個またはこれより多くの残基を含む生成物の重量が、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得ることであり得る。

その供給原料は、キチンを含み得、ＬＰＭＯまたは他の酵素が作用した場合、それらの主鎖の中に３個またはこれより少ない残基のみを有する生成物の重量は、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得る。

その供給原料は、混合結合型グルカンを含み得、リケナーゼまたは他の酵素が作用した場合、それらの主鎖の中に６個またはこれより多くの残基を含む生成物の重量は、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得る。あるいはそれは、それらの主鎖の中に７個またはこれより多くの残基を含む生成物の重量が、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得ることであり得る。

その供給原料は、キシラン、好ましくはグルクロノキシラン、アラビノキシラン、またはアラビノグルクロノキシラン、より好ましくは硬木グルクロノキシランまたは軟木アラビノグルクロノキシランを含み得る。

そのキシランは、アラビノグルクロノキシラン、好ましくは軟木アラビノグルクロノキシランを含み得、キシラナーゼ（例えば、ＧＨ３０キシラナーゼ）または他の酵素が作用した場合、それらの主鎖の中に９個またはこれより多くの残基を含む生成物の重量は、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得る。あるいはそれは、それらの主鎖の中に１０個またはこれより多くの残基を含む生成物の重量が、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得ることであり得る。

そのキシランは、アラビノグルクロノキシラン、好ましくは軟木アラビノグルクロノキシランを含み得、キシラナーゼ（例えば、ＧＨ３０キシラナーゼ）または他の酵素が作用した場合、それらの主鎖の中に５個またはこれより少ない残基のみを有する生成物の重量は、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得る。

その供給原料は、グルクロノキシラン、好ましくは硬木グルクロノキシランを含み得、キシラナーゼ（例えば、ＧＨ３０キシラナーゼ）または別の酵素が作用した場合、それらの主鎖の中に３１個またはこれより多くの残基を含む生成物の重量は、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得る。

その供給原料は、硬木グルクロノキシラン、好ましくは硬木グルクロノキシランを含み得、キシラナーゼ（例えば、ＧＨ３０キシラナーゼ）または別の酵素が作用した場合、それらの主鎖の中に４個またはこれより少ない残基のみを有する生成物の重量は、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得る。

その供給原料は、キシログルカンを含み得、ＸＥＧまたは他の酵素が作用した場合、それらの主鎖の中に６個またはこれより多くの残基を含む生成物の重量は、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得る。あるいはそれは、それらの主鎖の中に７個またはこれより多くの残基を含む生成物の重量が、想定可能なポリサッカリドの重量のうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、最も好ましくは約１％未満であり得ることであり得る。

分枝状のポリマーが残基計数に関して記載されている場合、残基の数は、最長の残基の鎖にのみ言及し、いかなる側鎖をも含まない。

その酵素反応が望ましい点に進行した後は、その生成物は、種々の方法で扱われてもよい。その反応混合物がしばしば、可溶性生成物および不溶性生成物の混合物を含み、その元の供給原料のうちの少なくともいくらかもしばしば残っていることから、その反応混合物は、さらなる処理のために、その不溶性物質を濾過して除去し得、その可溶性生成物を調製し得る。

本明細書で使用され、別段不適切でない場合、「可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）」、「溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）」および文法上の変形は、水中での溶解性に言及する。

その所望のオリゴサッカリドはまた、その酵素反応混合物から多くの方法で単離され得る。それらは、溶解性に基づいて単離され得、その結果、可溶性サッカリドのみの組成物が、さらなる処理のために抽出される、および／またはオリゴサッカリド鎖長のより狭いバンドを有する組成物を生成するためにクロマトグラフィーで単離される。単離は、例えば、沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または濾過（限外濾過およびナノ濾過を含む）に基づき得る。溶解性に基づく単離が行われる場合、その単離された組成物に存在するサッカリドのプロフィールは、異なるポリサッカリドが、鎖長に伴って異なる速度で溶解性が減少することから、その元の酵素反応に依存する。

食料品、化粧品、または機能性食品に組み込む前にさらなる生成物を生成するために、その生成されたオリゴサッカリドのさらなる処理がまた、本発明の範囲内で予想される。このさらなる処理は、任意の化学的、物理的、または酵素的工程を含み得（例えば、還元、好ましくは適切な場合には還元的アミノ化；酸化、カラメル化、シッフ塩基での改変、もしくはメイラード反応を介するもの、またはこのような工程の任意の組み合わせによるもの）、所望の目的のために改善された特性を有する異なるプロフィールを提供し得る。例えば、そのカラメル化特性、カロリー値、風味、および色調は、改変され得る。

その１種またはこれより多くの酵素反応の生成物は、このプロセスの任意の段階で、食料品、化粧品、または機能性食品に組み込むために適した成分と思われ得る。例えば、その反応混合物自体は、所望の時間制限または完了のための他の条件が満たされた後、直接的にその成分と思われ得るか、またはその濾過された生成物の固体もしくは液体いずれかの構成要素が、その成分であり得るか、または単離されたオリゴサッカリドの組成物がその成分であり得るか、またはさらなる処理を受けたそのオリゴサッカリドが、その成分であり得る。

本明細書で使用される場合、「成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」は、食料品、化粧品、または機能性食品製品に組み込むために適した任意の組成物であり、それは、その製品自体として直接使用されるものを含み得る。

食料品、化粧品、または機能性食品への組み込むために適した本発明の成分は、食料品、化粧品、もしくは機能性食品製品として直接使用可能であり得るか、またはそれは、食料品、化粧品、または機能性食品を形成するために他の成分と混合され得る。その成分はまた、食料品、化粧品、または機能性食品に組み込む前にまたはその間に、ある物理的または化学的方法で処理され得る。それは、製品へと直接組み込まれ得るか、またはそれは、例えば、ドウ、ケーキ混合物、チョコレート混合物もしくは他の食品前駆物質；化粧品基剤組成物；または機能性食品へと組み込まれ得、必要に応じて調理され得るか、または化学的改変、質感の変化、色調の変化、もしくは他の改変を引き起こし得る方法で別途処理され得る。

考えられている適用に適したそのオリゴサッカリド生成物の組成物がいったん得られ、さらなる処理および／または単離が必要に応じて行われたら、その組成物からの食料品、化粧品、または機能性食品を派生させることによって、非常に広い範囲の潜在的使用が供給される。本発明の成分は、オリゴサッカリドが従来から使用されている適用において有用である。それらは、モノサッカリドおよびジサッカリドが有害でありかつ別途除去が考慮される適用において、特に有用である。

本発明は、本発明の成分を含むかまたはその成分から生成される食料品、化粧品、または機能性食品を含む。

例えば、食品産業において、本発明の方法によって生成されるオリゴサッカリドは、甘味料、増量剤、添加される食物線維、または保湿剤として使用され得る。それらは、例えば、有利な味もしくは色調特性を提供するために、または食物線維含有量を増大させるために、ケーキ、パン、もしくは他の焼成品に、あるいはチョコレートもしくは他の菓子（例えば、トフィー、ファッジ、メレンゲ、もしくはキャラメル）；またはドリンクに組み込まれ得る。あるいはそれらは、例えば、単離された成分として、または酵素反応混合物を飼料として直接利用することによって、いずれかで動物飼料へと組み込まれ得る。

甘味剤としての使用が、特に注記される。モノサッカリドおよびジサッカリドが歯科疾患、カロリー過剰、肥満症、および糖尿病、ならびに潜在的には、行動的な問題点に寄与するので、ある種の適用において、食品製造業者は、彼らの製品にモノサッカリドおよびジサッカリドを含めないことを好む。本発明のオリゴサッカリドは、それらの生成法がモノサッカリドもジサッカリドも実質的に生成しないことから、甘味剤として使用され得、モノサッカリドおよびジサッカリドの有害効果を発揮することなく、食料品に甘みがあることを可能にする。

化粧品産業において、モノサッカリドおよびジサッカリドは、ある製造段階で除去されなければ、変質に寄与し得るが、オリゴサッカリドは、これらが質感および水分保持を改善し得る、ＵＶ吸収分子として作用し得る、ゲルもしくはクリームの構造を維持し得る、ならびに／または増量剤として働き得ることから、成分として有用である。従って
本発明は、本発明の方法によって得られ得るオリゴサッカリド含有成分を含む食料品、化粧品、または機能性食品を含む。

本発明のオリゴサッカリドは、機能性食品組成物へと組み込まれる場合に有用である。なぜなら、それらが食物性糖分の実質的な付随する提供なしに提供する食物線維は、消化器系の健康状態、十分に調節された腸内細菌叢、および幸福な状態への他の利益を促進することが示されているからである。この状況において、それらはまた、プロバイオティックドリンクまたは他のプレバイオティックもしくはプロバイオティック製剤の中で成分として機能し得る。

実施例１ − ＬＰＭＯを使用する、セルロースからのオリゴサッカリドの製造
１．リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）を、１ｇアビセルセルロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と３ｍｌＨ_２Ｏとのスラリーを作製し、その後、３０ｍｌ氷冷リン酸を添加し、０℃で１時間インキュベートすることによって調製した。次いで、そのセルロースを、そのフロースルーが反応で使用する前に中性ｐＨを有するまで、水で何度も洗浄した。

２．Ａｐｏ−ＰａＬＰＭＯ９Ｅ（配列番号１）を、酵素反応の直前に０．９化学量論的Ｃｕ（ＩＩ）（ＮＯ_３）_２中で、０．５〜１時間、５℃で予めインキュベートした。

３．２５μｇＰＡＳＣ、３０μｇＰａＬＰＭＯ９Ｅ（銅を予め負荷）および５００ｎｍｏｌアスコルビン酸塩を、１００μｌ１００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６）中、５０℃で３２時間、間欠的に振盪しながらインキュベートした。

４．サンプルを遠心分離し、上清を真空中で乾燥させた。

５．上清を、ＡＮＴＳで還元的に標識し、ＰＡＣＥによって（Ｇｏｕｂｅｔｅｔａｌ．２００２に従う）分析した。図１は、得られたゲルを示す。

実施例２ − リケナーゼを使用する、混合結合型グルカンからのオリゴサッカリドの製造およびケーキへの上記オリゴサッカリドの組み込み
１．製粉済みポリッジオーツ粉２５０ｇを、２リットルの水で３０分間煮た。

２．いったん冷却し、２リットルの氷冷９６％（ｖ／ｖ）エタノールを添加し、その上清を５℃で一晩静置させた。その上清を、乾燥するまでミラクロスを通して濾過し、５０％（ｖ／ｖ）エタノール中に再懸濁し、再びミラクロスを通して濾過した。

３．その残りの塊を、１リットルの水中で煮て、３０℃で１６時間、２０００ＵのＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するリケナーゼ（配列番号２，Ｍｅｇａｚｙｍｅ）とともにインキュベートした。

４．一旦冷却し、２リットルの氷冷９６％（ｖ／ｖ）エタノールを添加し、その懸濁物を一晩静置させた。

５．その上清を遠心分離によって集め、真空中で乾燥させ、５．２ｇ混合結合型グルカンオリゴサッカリドを得た。アリコートをＡＮＴＳで還元的に標識し、ＰＡＣＥによって分析した。図２は、その得られたゲルを示す。

６．１個の中サイズの卵を、５０ｇバターおよび５０ｇ中力粉とかき混ぜた。

７．その混合物のうちの３ｇを取り出して、１ｇの糖分と混合した。

８．その混合物のうちの３ｇを取り出して、１ｇの混合結合型グルカンオリゴサッカリドと混合した。

９．その混合物のうちの４ｇを取り出して、いずれのものとも、さらに混合しなかった。

１０．３種全てのバッター混合物を、焼成用トレイに載せて、予熱したオーブン中で、１８０℃で５分間焼成した。

１１．焼成後、そのケーキを冷却し、写真を撮り、味見した。図３は、その写真を示す。

１２．糖分もオリゴサッカリドも添加しなかったケーキは、バターを内部に保持することができず、代わりに、焼成している間に漏れ出た。そのケーキは、滑らかな表面およびパイ生地に類似の生焼けの質感を有し、ピリッとした風味があった。

糖分を含むケーキは、バターを十分に保持し、ケーキに特徴的な、より砕けやすくかつスポンジのような質感および表面を有した。それはまた、縁部で茶色くかつサクサクになった。それは、非常に甘みがあった。

その糖分含有ケーキに類似して、その混合結合型グルカンオリゴサッカリドを含むケーキは、バターを十分に保持し、特徴的には、ケーキのような質感および表面を有した。それはまた、その糖分を含むケーキのように、縁部で茶色くかつサクサクになった。それは、糖分またはオリゴサッカリドを添加しなかったケーキより甘かったが、その糖分を含むケーキほど甘くはなかった。

実施例３ − ＧＨ３０キシラナーゼを使用する。キシランからのオリゴサッカリドの製造
１．トウヒ木材チップを、それらが小さな粒子へと破壊されるまで、食品ブレンダー中、懸濁した状態でブレンドし、次いで、ボールミルにかけた。

２．３．３ｍｇのボールミルにかけたトウヒ木材チップおよび１００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６）を含む１００μｌ反応混合物を、５μｇＲｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍＧＨ３０（ＮＺＹＴｅｃｈから供給）とともに（またはなしで）１６時間、３０℃℃でインキュベートした。

３．反応生成物をＡＮＴＳで還元的に標識し、ＰＡＣＥによって分析した。図４は、その得られたゲルを示す。

実施例４ − キシログルカナーゼを使用する、キシログルカンからのオリゴサッカリドの製造
１．１％（ｗ／ｖ）タマリンドキシログルカンおよび１００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６）を含む１００μｌ反応混合物を、１６時間、３０℃において、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．に由来する０．１Ｕキシログルカナーゼ（ＧＨ５、ＣＡＳ：７６９０１−１０−５）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）とともに（またはなしで）インキュベートした。

２．反応生成物をＡＮＴＳで還元的に標識し、ＰＡＣＥによって分析した。図５は、その得られたゲルを示す。

仮想実施例５：開示される食料品成分を使用して焼成されるバナナブレッド
１０切れ分の基本のバナナブレッドレシピは、糖分（すなわち、ＴａｔｅａｎｄＬｙｌｅによって提供されるもののようなドリンクおよびシリアル用の精製サトウキビグラニュー糖）１カップ（米国）（１９２ｇ）、バター１１３．５ｇ、熟したバナナ３本、卵３個、中力粉２カップ、ベーキングソーダティスプーン１杯および塩ティースプーン１／２杯からなる。

オーブンを、１９０℃に予熱する。バナナを、ボールの中でフォークを使って潰す。別個のボールの中で、小麦粉、ベーキングソーダおよび塩を混ぜる。バターおよび糖分を、合わさってクリーム状になるまで泡立てる。潰したバナナを加え、十分に混ぜ、続いて、泡立てた卵を少しずつ加えて、十分に混ざるまで混ぜ合わせる。次いで、その小麦粉混合物をさっくりと混ぜる。その混合物を、油を塗ったパウンド型に流し入れ、４５分間、または爪楊枝を刺して何も付いてこなくなるまで焼成する。その基本のブレッドを、クーリングラックに載せて冷却する。そのブレッドを１０等分に切る。

バナナブレッドＡを、その糖分のうちの３０％を、本発明の開示される成分で置き換える、よって、サトウキビ糖１３４ｇおよび本発明の開示される成分５８ｇが使用される以外は、その基本のバナナブレッドと同じレシピを使用して調製する。

バナナブレッドＢを、その糖分のうちの５０％を本発明の開示される成分で置き換える、よって、サトウキビ糖９６ｇおよび本発明の開示される成分９６ｇが使用される以外は、その基本のバナナブレッドと同じレシピを使用して調製する。

バナナブレッドＣを、その糖分のうちの１００％を本発明の開示される成分で置き換える、よって、サトウキビ糖０ｇおよび本発明の開示される成分１９２ｇが使用される以外は、その基本のバナナブレッドと同じレシピを使用して調製する。

結果
そのバナナブレッドの栄養価を、表１に示す。これらは、以下の記録：卵（ＮＤＢＩｄ０１１２３）、サトウキビ糖（ＮＤＢＩｄ４５１６７８１２）、バター（ＮＤＢＩｄ０１１４５）、バナナ（ＮＤＢＩｄ０９０４０）、中力粉（ＮＤＢＩｄ４５０５４３６４）、ベーキングソーダ（ＮＤＢＩｄ１８３７２）、食卓塩（ＮＤＢＩｄ０２０４７）を使用し、１０切れ分のレシピ全体を考慮して、ＵＳＤＡＮａｔｉｏｎａｌＮｕｔｒｉｅｎｔＤａｔａｂａｓｅｆｏｒＳｔａｎｄａｒｄＲｅｆｅｒｅｎｃｅＬｅｇａｃｙＲｅｌｅａｓｅ（２０１８年４月）（ｈｔｔｐｓ：／／ｎｄｂ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ｎｄｂ／ｓｅａｒｃｈ／ｌｉｓｔ？ｈｏｍｅ＝ｔｒｕｅ）を使用して計算する。

ブレッドＡは、基本のブレッドと比較してカロリーが８％低減、添加される糖分が３０％減少および全体の糖分が２４％減少される。ブレッドＢは、基本のブレッドと比較して、カロリーが１２％減少、添加される糖分が５０％減少および全体の糖分が３９％減少される。ブレッドＣは、基本のブレッドと比較してカロリーが２５％減少、添加される糖分が１００％減少および全体の糖分が７９％減少される。

参考文献
ＧｏｕｂｅｔＦ，ＪａｃｋｓｏｎＰ，ＤｅｅｒｙＭＪ，ＤｕｐｒｅｅＰ．Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ａｍｅｔｈｏｄｔｏｓｔｕｄｙｐｌａｎｔｃｅｌｌｗａｌｌｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓａｎｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ．２００２，５３−６８
ＳｉｍｍｏｎｓＴＪ，ＵｈｒiｎＤ，ＧｒｅｇｓｏｎＴ，ＭｕｒｒａｙＬ，ＳａｄｌｅｒＩＨ，ＦｒｙＳＣ．Ａｎｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄｌｙｌｉｃｈｅｎａｓｅ−ｓｔａｂｌｅｈｅｘａｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍｃｅｒｅａｌ，ｈｏｒｓｅｔａｉｌａｎｄｌｉｃｈｅｎｍｉｘｅｄ−ｌｉｎｋａｇｅ β−ｇｌｕｃａｎｓ（ＭＬＧｓ）：ＩｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＭＬＧｓｕｂｕｎｉｔｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１３，３２２−３３２

酵素配列
ＬＰＭＯ
Ｐｏｄｏｓｐｏｒａａｎｓｅｒｉｎｅに由来するＡＡ９ＬＰＭＯ（配列番号１）。
ＧｅｎｂａｎｋＩＤＣＡＰ６７７４０

リケナーゼ
Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｔｒ．１６８に由来するＧＨ１６リケナーゼ（配列番号２）。
ＧｅｎＢａｎｋＩＤＣＡＡ８６９２２．１

キシラナーゼ
Ｒｕｍｉｎｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍに由来するＧＨ５アラビノキシラナーゼ（配列番号３）。
ＧｅｎＢａｎｋＩＤＡＢＮ５３３９５．１

Ｇｏｎａｐｏｄｙａｐｒｏｌｉｆｅｒａに由来するＧＨ５キシラナーゼ（配列番号４）。
ＧｅｎＢａｎｋＩＤＫＸＳ１８７２０．１

Ｄｉｃｋｅｙａｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉに由来するＧＨ３０キシラナーゼ（配列番号５）。
ＧｅｎＢａｎｋＩＤＡＡＢ５３１５１．１

Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｔｒ．１６８に由来するＧＨ３０キシラナーゼ（配列番号６）。
ＧｅｎＢａｎｋＩＤＣＡＡ９７６１２．１

Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｏｖａｔｕｓに由来するＧＨ３０キシラナーゼ（配列番号７）。
ＧｅｎＢａｎｋＩＤＳＤＹ６４３７８．１

キシログルカナーゼ
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｏｖａｔｕｓに由来するＧＨ５キシログルカナーゼ（配列番号８）。
ＧｅｎＢａｎｋＩＤＡＬＪ４７６８０．１

Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓに由来するＧＨ８キシラナーゼ（配列番号９）。
ＰＤＢ：２Ａ８Ｚ＿Ａ

Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒｏｗｅｎｓｅｎｓｉｓに由来するＧＨ１０キシラナーゼ（配列番号１０）。
ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＱ０３７３２．１

Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓに由来するＧＨ１１キシラナーゼ（配列番号１１）。
ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＥＨ０４３９２．１

Claims

食料品、化粧品、または機能性食品への組み込みに適した成分を生成するための方法であって、前記成分は、１種またはこれより多くのオリゴサッカリドを含み、ここで前記オリゴサッカリドは、酵素反応において生成され、前記酵素反応は、溶液または懸濁物中で、ポリサッカリド切断酵素およびポリサッカリド含有供給原料を接触させる工程を包含し、ここで前記酵素反応は、モノサッカリドもジサッカリドも実質的に生成しない、方法。
前記ポリサッカリド切断酵素は、キシラナーゼ、好ましくはＧＨ５、ＧＨ８、ＧＨ１０、ＧＨ１１またはＧＨ３０キシラナーゼである、請求項１に記載の方法。
前記ポリサッカリド切断酵素は、マンナナーゼである、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
前記ポリサッカリド含有供給原料は、キシランを含み、前記ポリサッカリド切断酵素は、ＧＨ５、ＧＨ８、ＧＨ１０、ＧＨ１１および／またはＧＨ３０キシラナーゼであり、好ましくはここで前記ポリサッカリド含有供給原料は、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、および／またはグルクロノアラビノキシランを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
前記ポリサッカリド含有供給原料は、セルロース、キチン、および／またはキトサンを含み、前記ポリサッカリド切断酵素は、溶解性ポリサッカリドモノオキシゲナーゼ（ＬＰＭＯ）であり、前記酵素反応は、１種またはこれより多くの適切な還元剤の存在下で行われ、好ましくはここで前記ＬＰＭＯは、ＡＡ９、ＡＡ１０、ＡＡ１１、ＡＡ１３、ＡＡ１４およびＡＡ１５からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記１種またはこれより多くの適切な還元剤は、アスコルビン酸、没食子酸、システイン、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ピロガロール、ジチオスレイトール、シアノボロヒドリド、ボロヒドリド、光合成色素、リグニン、リグノール、およびセロビオースとセロビオースデヒドロゲナーゼの組み合わせからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
前記酵素反応において生成されるオリゴサッカリドは、β−グルカン、好ましくはβ−１，４−グルカンを含む、請求項５または６のいずれかに記載の方法。
前記ポリサッカリド含有供給原料は、混合結合型グルカンを含み、前記ポリサッカリド切断酵素は、リケナーゼであり、好ましくはここで前記リケナーゼは、ＧＨ１６ファミリーから選択される、および／または好ましくはここで前記酵素反応において生成されるオリゴサッカリドは、β−グルカンを含む、請求項１に記載の方法。
前記ポリサッカリド含有供給原料は、キシログルカンを含み、前記ポリサッカリド切断酵素は、キシログルカナーゼ、好ましくはキシログルカンエンドグルカナーゼ（ＸＥＧ）である、請求項１に記載の方法。
前記ポリサッカリド含有供給原料は、バイオマスを含み、好ましくはここで前記方法は、前記酵素反応を行う前に、前記バイオマスが酸、アルカリ、熱、または酵素処理を通じて予備処理される１またはこれより多くの工程をさらに包含する、前述のいずれかの請求項に記載の方法。
重量で、前記酵素反応において生成される想定可能なサッカリドのうちの約６０％未満、好ましくは約５０％未満、好ましくは約４０％未満、より好ましくは約３０％未満、さらにより好ましくは約２０％未満、さらにより好ましくは約１５％未満、なおより好ましくは約１０％未満、いっそうより好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、なおより好ましくは約１％未満が、モノサッカリドもしくはジサッカリドである；および／または重量で、前記酵素反応において生成される想定可能なサッカリドのうちの約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約２％未満、なおより好ましくは約１％未満が、１６個もしくはこれより多くの残基、より好ましくは１０個もしくはこれより多くの残基、なおより好ましくは７個もしくはこれより多くの残基を含む、前述のいずれかの請求項に記載の方法。
第２のポリサッカリド切断酵素と、１種またはこれより多くのジサッカリドを生成する前記１種またはこれより多くのポリサッカリド含有供給原料とを接触させる工程を包含する第２の酵素反応をさらに包含する、前述のいずれかの請求項に記載の方法。
ジサッカリドの量は、前記酵素反応から生成される想定可能なサッカリドのうちの約５０％未満である、請求項１２に記載の方法。
前記酵素反応は、前記酵素反応から生成される想定可能なサッカリドのうちの約２５％未満の量において、１種またはこれより多くのモノサッカリドを生成する、請求項１３に記載の方法。
前記ポリサッカリド切断酵素は、前記酵素反応に存在する１種またはこれより多くの微生物によって生成される、前述のいずれかの請求項に記載の方法。
前記ポリサッカリド切断酵素は、触媒モジュールまたは非触媒モジュールに作動可能に連結され、好ましくはここで前記ポリサッカリド切断酵素は、非触媒モジュールの作動可能に連結され、前記非触媒モジュールは、炭水化物結合モジュールである、前述のいずれかの請求項に記載の方法。
前記酵素反応から前記オリゴサッカリドを単離する工程をさらに包含し、好ましくはここで可溶性オリゴサッカリドは、不溶性のオリゴサッカリドおよびポリサッカリドから単離される、前述のいずれかの請求項に記載の方法。
前記酵素反応の後に、前記オリゴサッカリドが化学的処理、物理的処理、または酵素処理（例えば、還元、酸化、カラメル化、またはメイラード反応）を受ける工程が続く、前述のいずれかの請求項に記載の方法。
食料品、化粧品、または機能性食品に組み込むための成分であって、前記成分は、β−１，４−グルカンオリゴサッカリドを含み、ここで１個またはこれより多くの末端サッカリド残基は、ラクトン、４−ケトアルドース、アルドン酸またはジェミナルジオールへと酸化され、ここで前記成分は、モノサッカリドもジサッカリドも実質的に含まない成分。
食料品、化粧品、または機能性食品に組み込むための成分であって、前記成分は、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法によって得られ得る成分。
食料品、化粧品、または機能性食品に組み込むための成分であって、前記成分は、β−１，４−グルカンオリゴサッカリドおよび別のオリゴサッカリドを含み、前記成分は、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法によって得られ得る成分。
前記成分は、前記酵素反応から生成される想定可能なサッカリドのうちの約４０％未満の量でジサッカリドを含む、請求項２１に記載の成分。
前記成分は、前記酵素反応から生成される想定可能なサッカリドのうちの約２５％未満の量でモノサッカリドを含む、請求項２１または２２に記載の成分。