BR112017003943B1

BR112017003943B1 - Métodos para a produção de um líquido de açúcar

Info

Publication number: BR112017003943B1
Application number: BR112017003943-5A
Authority: BR
Inventors: Atsushi Minamino; Yuka Asahi; Hiroyuki Kurihara; Jumpei Kishimoto; Masashi Higasa; Katsushige Yamada
Original assignee: Toray Industries, Inc.
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2015-09-04
Publication date: 2023-01-10
Also published as: EP3190189A1; AU2015312858A2; AU2015312858A1; US20170275663A1; BR112017003943A2; CA2960152C; EP3190189A4; AU2015312858B2; JP6641628B2; JPWO2016035875A1; CA2960152A1; EP3190189B1; MY195489A; US10781466B2; WO2016035875A1

Abstract

MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE UM LÍQUIDO DE AÇÚCAR. A presente invenção se refere ao processo de produção de um líquido de açúcar a partir de uma biomassa lenhosa, as técnicas convencionais apresentam uma desvantagem em que os componentes específicos contidos no líquido sacarificado da biomassa lenhosa provocam a deteriorização do desempenho de filtração durante a filtração do líquido sacarificado por meio de uma membrana de microfiltração e/ou uma membrana de ultrafiltração. Na presente invenção, a mananase reage com o componente líquido obtido através da hidrólise da biomassa lenhosa para aumentar o desempenho de filtração da membrana de microfiltração e/ou da membrana de ultrafiltração para o líquido sacarificado, de maneira que a produção eficiente de um açúcar líquido seja possível.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]A presente invenção se refere a um método para a produção eficiente de líquido de açúcar a partir da biomassa lenhosa.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O processo da produção de fermentação dos produtos químicos utilizando os açúcares como materiais brutos são utilizados para a produção de diversos materiais industriais. Como açúcares que são utilizados como materiais brutos para a fermentação, aqueles que são derivados a partir de materiais comestíveis, tais como a cana de açúcar, amido e beterraba de açúcar são industrialmente utilizados no presente. No entanto, em vista do fato de que o aumento dos preços dos materiais comestíveis é esperado devido ao aumento da população mundial no futuro ou em uma vista ética do fato que aqueles açúcares competem com os açúcares para a utilização comestível, um processo para a produção eficiente de um líquido de açúcar a partir de um recurso não comestível renovável, isto é, a biomassa que contém a celulose ou um processo utilizando o líquido de açúcar resultante como matéria prima para a fermentação para converter o mesmo, de maneira eficiente, em um material industrial é uma tarefa do futuro.

[003]A biomassa que contém a celulose é grosseiramente classificada em biomassa herbácea e biomassa lenhosa. Até o momento, a biomassa lenhosa é industrialmente utilizada na indústria do papel. No entanto devido aos fatores, tais como a redução recente por sua procura devido à tendência em relação à sociedade sem papel, foram realizados estudos para a sua utilização como material bruto para os açúcares (Documentos de Patente 1 e 2) - a biomassa que contém a celulose, principalmente contém a lignina, que é um polímero aromático, e a celulose e hemicelulose que são polímeros de um monossacarídeo. Os exemplos de métodos conhecidos para se obter um líquido de açúcar, incluem os métodos em que a celulose e hemicelulose, protegidas pela lignina, são hidrolisadas de maneira mecânica ou térmica, e os métodos em que a hidrólise mecânica e térmica, ainda é seguida pela hidrólise por meio da enzima de sacarificação.

[004] Na produção dos líquidos de açúcar a partir da biomassa que contém a celulose, existem problemas de que a biomassa que contém a celulose contém uma grande quantidade de componentes sólidos e de substâncias inibidoras da fermentação de baixo peso molecular, e que uma grande quantidade de enzimas precisa ser utilizada, conduzindo a um custo elevado de produção. Nestas circunstâncias, os métodos com base no processamento do líquido de açúcar por meio da membrana de separação estão em estudo. Os exemplos de tais métodos incluem um método em que o líquido de açúcar é purificado utilizando a membrana de nanofiltração ou uma membrana de osmose inversa (Documento de Patente 3), um método em que a separação sólido-líquido é realizada utilizando uma membrana de microfiltração (Documento de Patente 4), e um método em que a enzima é recuperada utilizando a membrana de ultrafiltração (Documento de Patente 5).

DOCUMENTOS DE PATENTE

[005] Documento de Patente 1: JP 2010-36.058 A.

[006] Documento de Patente 2: JP 63-137.691 A.

[007] Documento de Patente 3: JP 2011-223.975 A.

[008] Documento de Patente 4: WO 2010/067.785.

[009] Documento de Patente 5: JP 8-317.795 A.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[010]Com bases na técnica anterior, os presentes Depositantes estudaram a produção de um líquido de açúcar a partir da biomassa que contém a celulose. Como resultado, os presentes Depositantes descobriram quando se utiliza uma biomassa lenhosa como a biomassa que contém a celulose, os componentes especiais contidos no líquido sacarificado derivado da biomassa lenhosa provoca uma deterioração significativa do desempenho da filtração durante a filtração do líquido sacarificado por meio da membrana de microfiltração e/ou da membrana de ultrafiltração, e que, até nos casos em que a lavagem física é realizada por meio da mudança das condições operacionais, estes componentes ainda provocam a deterioração da operabilidade de longo prazo, devido à sua adesão elevada especialmente às membranas poliméricas.

[011]A presente invenção pretende resolver os problemas descritos acima, isto é, aumentar o desempenho da filtração durante a filtração de um líquido sacarificado derivado da biomassa lenhosa por meio de uma membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração, por conseguinte, para fornecer um método para a produção eficiente de um líquido de açúcar.

[012]Como resultado de estudos intensivos, os presentes Depositantes descobriram que os componentes descritos acima, que estão contidos no líquido sacarificado derivado da biomassa lenhosa provocaram uma deterioração significativa do desempenho da filtração de uma membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração, podem ser degradados por mananase, e que, como resultado, o desempenho da filtração de uma membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração para o líquido sacarificado pode ser aumentado, por conseguinte, completando a presente invenção.

[013] Isto é, a presente invenção consiste em de [1] a [10] abaixo: [1] Um método para a produção de líquido de açúcar, o método compreende as etapas de: (A) reagir a mananase com um componente líquido obtido por meio do tratamento de hidrólise da biomassa lenhosa para obter um líquido sacarificado, e (B) filtrar o líquido sacarificado da Etapa (A) por meio da membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração para coletar o líquido de açúcar a partir do lado do permeado. [2] O método para a produção de líquido de açúcar, de acordo com [1], em que a biomassa lenhosa é a biomassa conífera. [3] O método para a produção de líquido de açúcar, de acordo com [1] ou [2], em que o tratamento de hidrólise da Etapa (A), é um ou mais selecionado a partir do grupo que consiste em tratamento hidrotérmico, tratamento de explosão por vapor e tratamento com o ácido diluído. [4] O método para a produção de líquido de açúcar, de acordo com de [1] a [3], em que na Etapa (A), a celulase é reagida com o componente líquido. [5] O método para a produção de líquido de açúcar, de acordo com de [1] a [4], em que na Etapa (A), a quantidade da mananase adicionada é inferior a 0,01 Unidade/g em relação à quantidade total de manose (g) contida no componente líquido. [6] O método para a produção de líquido de açúcar, de acordo com de [1] a [5], em que uma superfície(s) funcional(is) de um material(is) da membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração na Etapa (B) é/são membrana(s) orgânica(s). [7] O método para a produção de líquido de açúcar, de acordo com de [1] a [6], em que a membrana de microfiltração na Etapa (B) é uma membrana de microfiltração que possui um tamanho médio de poro de 0,01 a 0,5 μm. [8] O método para a produção de líquido de açúcar, de acordo com de [1] a [7], em que a membrana de microfiltração na Etapa (B) é uma membrana de microfiltração que possui um peso molecular de corte de 5.000 a 150.000. [9] O método para a produção de líquido de açúcar, de acordo com de [1] a [8], que compreende a etapa de: - filtrar o líquido de açúcar obtido na etapa (B) por meio de uma membrana de ultrafiltração que possui um peso molecular de corte de 300 a 1.000, para coletar o líquido de açúcar contido na manobiose e/ou manotriose a partir do lado da alimentação, e para coletar um líquido de açúcar contido em um monossacarídeo, a partir do lado permeado. [10] O método para a produção de líquido de açúcar, o método compreende, no método para a produção de líquido de açúcar, de acordo com qualquer uma de [1] a [9], as etapas de: - realizar o tratamento da membrana de ultrafiltração como Etapa (B); e - realizar a Etapa (A) utilizando o(s) componente(s) de enzima coletado(s) a partir do lado de alimentação da membrana de ultrafiltração.

[014] De acordo com a presente invenção, um líquido sacarificado derivado a partir da biomassa lenhosa pode ser filtrado por meio de uma membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração. Além disso, de acordo com a presente invenção, a manobiose e manotriose podem ser produzidas como substâncias valiosas durante a produção dos monossacarídeos, tais como a glicose e a xilose, como uma matéria prima de fermentação. Como resultado, a presente invenção pode contribuir para a redução do custo para a produção dos produtos químicos utilizando a fermentação.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[015]A Figura 1 mostra um fluxo de processo esquematicamente ilustrando um método em que a membrana de filtração de um líquido sacarificado derivado da biomassa lenhosa é realizada utilizando a combinação de uma membrana de microfiltração e uma membrana de ultrafiltração enquanto a mananase e a celulase são recuperadas; A Figura 2 mostra um fluxo de processo esquematicamente ilustrando um método em que a membrana de filtração de um líquido sacarificado derivado da biomassa lenhosa é realizada utilizando uma membrana de ultrafiltração enquanto a mananase e a celulase são recuperadas; A Figura 3 mostra um fluxo de processo esquematicamente ilustrando um método em que o permeado a partir da membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração obtido na presente invenção, é submetido ao tratamento utilizando uma membrana de ultrafiltração que possui um peso molecular de corte de 300 a 1.000, para separar os monossacarídeos da manobiose e manotriose; e A Figura 4 mostra um fluxo de processo esquematicamente ilustrando um método em que o concentrado de monossacarídeo é obtido a partir de um permeado obtido na presente invenção por meio do tratamento utilizando uma membrana de ultrafiltração que possui um peso molecular de corte de 300 a 1.000.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[016]A presente invenção é descrita mais especificamente abaixo.

[017]A biomassa lenhosa é a biomassa derivada a partir dos vegetais perenes, em que uma grande quantidade de xileno é formada pelo crescimento espessante devido à atividade de divisão do câmbio vascular desenvolvida nos caules e raízes, em que uma grande proporção de paredes celulares é submetida à liquefação para se tornar sólida. Os exemplos específicos das fontes de biomassa lenhosa, incluem a madeira para a fabricação de papel; materiais restantes de moinhos de papel e serrarias, desbastes não utilizados, madeira derivada de construção, resíduos de madeira, resíduos de papel, papel reciclado, lascas de madeira e casca.

[018] Em relação à composição da biomassa lenhosa, ela é composta por celulose, hemicelulose, lignina, teor de cinza e similares. De acordo com "Advanced Technologies for Chemicals from Wood Resources" (CMC Publishing Co., Ltd.), os exemplos de hemicelulose incluem o glucuronoxilano, arabinoglucuronoxilano, glucomanano, galactomanano, arabinogalactano, galactano, e complexos de lignina em carboidratos. A investigação da composição de monossacarídeos da celulose e hemicelulose é possível por meio da hidrólise utilizando o ácido sulfúrico concentrado. A hidrólise quase completa de açúcares na celulose e hemicelulose em monossacarídeos produz, como resultado da degradação, os monossacarídeos tais como a glicose, xilose, arabinose, manose e galactose. Devido a isto, a composição de monossacarídeos pode ser conhecida. Na presente invenção, submetendo a celulose e a hemicelulose, que são componentes de polissacarídeos contidos na biomassa, ao tratamento por hidrólise, e/ou tratamento enzimático, pode ser produzido um açúcar que contém os monossacarídeos que pode ser utilizado como uma matéria prima de fermentação.

[019]Os exemplos de biomassa lenhosa principalmente incluem a biomassa de coníferas e a biomassa de árvores de folhas largas, e a biomassa de monocotiledôneas que mostram a lignificação.

[020] Em geral, as coníferas principalmente estão distribuídas na região fria, e a sua maioria é de árvores perenes. Elas possuem folhas finas de formato de agulha, e madeira alta e macia, e pertencem à Coniferae em Gymnospermae. Mais especialmente, o termo “coníferas”, na presente invenção, significa aquelas que possuem um teor de manose de 2% em peso a 15% em peso com base no peso seco da biomassa. Mais especialmente, os exemplos de coníferas incluem Cryptomeria japonica, Pinus, Abies, Larix kaempferi, Pinus densiflora, Pinus thunbergii, Taxus cuspidata, Ginko bilota, Podocarpus macrophyllus, Picea jezoensis, Torreya nucifera, Larix kaempferi, Sciadopitys verticillata, Chamaecyparis pisifera, Tsuga sieboldii, Pseudotsuga japonica, Abies sachalinensis, Thuja standisii, Chamaecyparis obtusa, Thujopsis dolabrata, Pinus parviflora, abeto, Thuja standisii, Callitris, Juniperus, Pherosphaera, Phyllocladus, Abies homolepis, Abies mariesii, Abies Veitchii, Picea jezoensis, Picea glehnii, Thuja standisii, Thujopsis dolabrata, e Pinus parviflora. No entanto, as espécies de coníferas não estão limitadas a estas.

[021] Por outro lado, as árvores de folhas largas são os vegetais lenhosos que possuem folhas largas e planas, que pertencem a Angiospermae. Em especial, as árvores de folhas largas na presente invenção, são aquelas que possuem um teor de manose inferior a 2% em peso. Mais especificamente, as árvores de folhas largas incluem o carvalho, Populus suaveolens, Populus tremula, Juglans mandshurica, Pterocarya rhoifolia, Alnus hirsuta, Betula gross, Betula platyphylla, Betulla maximowicziana, Carpinus laxiflora, Ostrya japonica, Castanea crenata, Castanopsi, Fagus crenata, Fagus japonica, Quercus acuta, Quercus myrsinifolia, Quercus gilva, Quercus acutíssima, Quercus crispula, Quercus serrata, Ulmus davidian, Zelkova serrata, Morus australis, Cercidiphyllum japonicum, Magnolia obovata, Cinnamomum camphora, Machilus thunbergii, Distylium racemosum, Cerasus jamasakura, Maackia amurensis, Phellodendron amurense, Acer pictum, Aesculus turbinata, Tilia japonica, Tilia maximowicziana, Stewartia monadelfa, Kalopanax septemlobus, Cornus controversa, Fraxinus platypoda, Fraxinus mandshurica, Fraxinus lanuginosa, Paulownia tomentosa, Castanopsis cuspidata, Toisusu Urbaniana, Prunus, Eucalyptus, Arecaceae, Magnolia quinquepeta, Salix, Rhododendron, Juglans, Morella rubra, Casuarinaceae, Barringtonia racemosa, e Diospyros kaki. No entanto, as espécies de árvores de folhas largas não estão limitadas a estas.

[022] Os exemplos de biomassa de monocotiledôneas que mostram a lignificação incluem, mas não estão limitados ao bambu.

[023] Os exemplos de biomassa lenhosa também incluem os recursos não utilizados à base de celulose não comestível, tais como o tronco, casca, cachos sem frutos (que não contêm frutos ou material novo) denominados EFB (cachos vazios de frutos), lascas de madeira e resíduos de bambu.

[024] O tratamento de hidrólise significa a degradação dos componentes principais da hemicelulose e lignina na biomassa lenhosa. Por meio deste processo de hidrólise, estes componentes são degradados em diversas frações, tais como os açúcares incluindo os monossacarídeos, oligossacarídeos, e polissacarídeos, polifenóis, componentes de furano / aromático e ácidos orgânicos. Os exemplos de tratamento de hidrólise incluem o tratamento hidrotérmico, tratamento de explosão por vapor, tratamento com o ácido diluído.

[025] O tratamento hidrotérmico é um método em que a biomassa lenhosa é tratada com água quente sob pressão em de 100 a 400° C durante de 1 segundo a 60 minutos de maneira que a biomassa lenhosa está contida em de 0,1 a 50% em peso, sem a adição de ácido. A temperatura da água no momento do contato com a biomassa lenhosa a ser tratada não é limitada. A pressão não é limitada uma vez que depende da temperatura do tratamento. A pressão, de preferência, é de 0,01 a10 MPa.

[026] No tratamento hidrotérmico, os componentes eluídos em água quente podem variar dependendo da temperatura durante o tratamento com a água. De acordo com a patente JP 2002/59.118, a medida que a temperatura da água quente sob pressão aumenta, a eluição do primeiro grupo, que inclui o tanino e a lignina, em primeiro lugar ocorre a partir da biomassa lenhosa e, em seguida, a eluição do segundo grupo, que inclui a hemicelulose, ocorre não inferior a de 140 a 150° C, seguida por eluição do terceiro grupo, que inclui a celulose, a uma temperatura superior a cerca de 230° C. Além disso, ao mesmo tempo como a eluição, pode ocorre a hidrólise de hemicelulose e de celulose. Isto significa que nesta reação de hidrólise, os ácidos orgânicos, tais como o ácido acético e o ácido fórmico, eluídos a partir da biomassa, auxiliam o tratamento de hidrólise. Para o propósito, por exemplo, de aumentar a eficiência da reação da celulose e da hemicelulose, com as enzimas descritas anteriormente, a diferença nos componentes eluídos dependendo da temperatura de tratamento pode ser utilizada para realizar um tratamento da reação de múltiplos estágios com dois ou mais estágios em temperatura de tratamento. A água que contém um componente eluído, em qualquer temperatura, na água quente sob pressão é referido como “componente líquido”, e a porção preparada por meio da remoção do componente líquido a partir da biomassa que contém a celulose após o tratamento hidrotérmico é referido como “componente sólido”. O método de separação do componente líquido a partir do componente sólido não é limitado e a temperatura durante a separação não é limitada. Nos casos do tratamento da reação de múltiplos estágios com dois ou mais estágios, existem duas ou mais espécies de componentes líquidos correspondentes aos diferentes estágios, e/ou pode existir uma mistura de dois ou mais componentes líquidos. Embora o componente líquido e o componente sólido possam estar separados entre si, a degradação com a enzima (mananase, celulase e/ou similares) pode ser realizada separadamente para cada componente líquido e o componente sólido da biomassa, ou para a mistura do componente líquido e do componente sólido.

[027] Um tratamento de explosão por vapor significa um método em que a biomassa lenhosa é exposta a um vapor de água de pressão elevada e, em seguida, mantida sob condições de pressão elevada de cerca de 1 MPa a 5 MPa durante de 1 segundo a 10 minutos, seguida por liberação da pressão para a pressão atmosférica de uma só vez. Em geral, de maneira similar aos casos do tratamento da hidrólise, o vapor de água de pressão elevada primeiramente provoca a eluição da lignina. Isto é seguido por hidrólise do componente de hemicelulose, que possui cristalinidade baixa e, em seguida, a degradação do componente de celulose, que possui cristalinidade elevada. Além disso, a liberação da pressão para a pressão atmosférica apresenta um efeito para provocar a ruptura rápida do tecido da biomassa, que aumenta os locais em que a enzima pode reagir. A biomassa pulverizada resultante contém os produtos de degradação e excessivamente degrada os produtos de lignina e açúcares, bem como uma grande quantidade de componentes sólidos e compostos que inibem a fermentação. Os componentes de inibição podem ser removidos do componente sólido por meio da realização da separação sólido- líquido através do encharcamento da biomassa em água, líquido reagente e similares. Através da separação sólido-líquido, a biomassa pode ser separada em componente líquido e componente sólido. A degradação utilizando a enzima. (mananase, celulase e similares) pode ser realizada para cada componente líquido e componente sólido da biomassa, após a sua separação entre si, ou pode ser realizada para uma mistura do componente líquido e do componente sólido.

[028] O tratamento com o ácido diluído, é um método em que a biomassa lenhosa é tratada com a solução aquosa de ácido, tal como uma solução aquosa de ácido sulfúrico e sulfito, ou com uma solução aquosa de ácido orgânico, em condições de temperatura elevada e pressão elevada. Em geral, neste método, a lignina é primeiramente dissolvida, seguida por hidrólise do componente de hemicelulose, que possui cristalinidade baixa e, em seguida, a degradação do componente de celulose, que possui cristalinidade elevada. Em comparação com o tratamento hidrotérmico, a hidrólise da celulose e hemicelulose especialmente é promovida, de maneira que a concentração de monossacarídeos tende a ser elevada até mesmo para a mesma temperatura de tratamento. Além disso, definindo dois ou mais estágios, as condições adequadas para a hidrólise de cada hemicelulose e celulose podem ser definidas, de maneira que a degradação eficiente e o rendimento de açúcar podem aumentar. O tipo de ácido no tratamento ácido não é limitado desde que provoque a hidrólise. A partir do ponto de vista econômico, o ácido, de preferência, é o ácido sulfúrico, ácido acético, ácido cítrico ou ácido láctico. A concentração do ácido, de preferência, é de 0,1 a 15% em peso, de maior preferência, de 0,5 a 5% em peso. A temperatura de reação pode ser ajustada no intervalo de 100 a 300° C. O tempo de reação pode ser ajustado em um intervalo de 1 segundo a 60 minutos. O número de vezes do tratamento não é limitado e o tratamento pode ser realizado uma ou mais vezes. Também por meio deste tratamento, a biomassa pode ser separada em componente sólido e componente líquido. A degradação por enzimas (mananase, celulase e similares) pode ser realizada separadamente para cada componente líquido e componente sólido da biomassa, ou pode ser realizada para uma mistura do componente líquido e do componente sólido. Uma vez que o componente sólido e o componente líquido obtidos por meio do tratamento de ácido que contém o ácido, precisam ser submetidos à neutralização antes de realizar a hidrólise por meio da enzima de sacarificação.

[029] O tratamento hidrotérmico, tratamento de explosão por vapor e tratamento com o ácido diluído podem ser realizados isoladamente ou em combinação. De preferência, qualquer um dos tratamentos é realizado isoladamente. O tratamento hidrotérmico é de maior preferência.

[030] O componente líquido obtido por meio da hidrólise da biomassa lenhosa contém a hemicelulose, lignina, tanino, e uma parte do componente de celulose obtida por meio da hidrólise, conforme descrito acima. Por outro lado, o componente sólido principalmente contém a celulose devido à remoção da maior parte da lignina e do componente da hemicelulose. O componente líquido e o componente sólido podem ser separados por meio da separação convencional de sólido-líquido.

[031]Os exemplos específicos de uma separação sólido-líquido incluem a separação por filtração, centrifugação, sedimentação. A separação por centrifugação ou filtração é de preferência.

[032] Nos casos da centrifugação, a aceleração não é limitada. A partir do ponto de vista da facilidade de operação e de custo, a aceleração, de preferência, é de 500 a 4.000 G, de maior preferência, de 1.000 a 3.000 G. Os exemplos específicos de um dispositivo incluem o decantador de rosca.

[033]Os exemplos do método de filtração na separação por filtragem incluem, mas não estão limitados, àqueles utilizando uma prensa de rosca, filtro de tela, filtro de correia, prensa de correia ou filtro de prensa. A separação pode ser realizada utilizando, em vez de um dispositivo de separação de sólido-líquido, uma porção fornecida no dispositivo de hidrólise para ser utilizada para o tratamento hidrotérmico, tratamento de explosão por vapor ou tratamento com o ácido diluído, em que a porção possui uma função para realizar a separação por filtração por meio de uma tela ou malha, sedimentação ou centrifugação.

[034]A presente invenção é caracterizada pelo fato de que o componente líquido é tratado com a mananase para obter um líquido sacarificado na Etapa (A). Por meio do tratamento da mananase do componente líquido, as substâncias de incrustação derivadas da biomassa lenhosa, que inibem o tratamento de membrana anteriormente descrito por meio de uma membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração, podem ser degradadas e, como resultado, o desempenho da filtração no tratamento de membrana anteriormente descrito por meio de uma membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração pode ser significativamente aumentado em comparação com os casos em que o tratamento da mananase não é realizado.

[035]A mananase, que é uma enzima que contém um componente de enzima do tipo endo que hidrolisa a ligação de β-1,4-man0sido. A mananase é produzida por microrganismos. Pode ser utilizada a mananase que é produzida por um único tipo de microrganismo ou a mananase que é produzida por uma pluralidade de microrganismos. Os exemplos específicos de microrganismos que produzem a mananase incluem os microrganismos que pertencem a Aspergillus, Trichoderma, Acremonium e Bacillus. As mananases produzidas por microrganismos que pertencem a Aspergillus são especialmente de preferência utilizadas uma vez que essas mananases possuem atividade elevada. Os exemplos de mananases derivadas a partir de microrganismos que pertencem a Aspergillus incluem "Mananase BGM Amano", produzida por Amano Enzyme Inc.; "Sumizyme ACH", produzida por Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. "Cellulosin GM5", produzida por HBI Enzymes Inc.; e "Mannaway" produzida pela Novozymes Japan.

[036]A quantidade de mananase adicionada ao componente líquido não está limitada desde que as substâncias de incrustação possam se degradar. A quantidade, de preferência, é inferior a 0,01 Unidade/g a partir do ponto de vista de que um efeito para aprimorar o desempenho de filtração para a quantidade total de manose (g), contida no componente líquido foi confirmado com essa quantidade. A partir do ponto de vista econômico, a quantidade, de maior preferência, não é superior a 10.000 Unidades/g. A quantidade da mananase adicionada, de preferência, é de 0,01 Unidade/g a 10.000 Unidade/g, de maior preferência, de 0,1 Unidade/g a 10.000 Unidades/g.

[037]A quantidade total de manose contida no componente líquido pode ser calculada submetendo o componente líquido à evaporação por vácuo e, em seguida, submetendo o produto resultante para forçar a hidrólise completa em monossacarídeos utilizando o ácido sulfúrico concentrado e o ácido sulfúrico diluído de acordo com o NREL/TP-510-42618 "Determination of Structural Carbohydratos and Lignin in Biomass", seguido pela análise da quantidade de manose utilizando um HPLC ou similar. A mananase possui uma reatividade mais elevada com a manana, e sua adição posterior quase não aumenta o efeito. Por conseguinte, o valor acima é de maior preferência do ponto de vista de custos da mananase utilizada. A reação com a mananase, produz a manotriose, manobiose e manose. De preferência, a mananase da presente invenção não contém a manosidase, ou seu teor não é superior a 1% em relação à β-mananase em termos de atividade. Isto é, mesmo se a manana for totalmente degradada para a manose de monossacarídeos, não é utilizada como uma matéria prima de fermentação no metabolismo dos microrganismos, de maneira que o custo aumenta devido à separação e purificação do produto de fermentação e tratamento de resíduos líquidos. Por conseguinte, a condição acima possibilita a produção de substâncias valiosas tais como a manobiose e manotriose, que podem ser facilmente separadas utilizando uma membrana(s).

[038]O componente líquido, de preferência, contém uma celulase como uma enzima para promover ainda mais o efeito da mananase. A celulase significa um componente de enzima que possui uma atividade para degradar a celulose, ou que auxilia a degradação da celulose. Os exemplos específicos de componentes de enzima incluem a celobiohidrolase, endoglucanase, exoglucanase, beta-glucosidase, xilanase, xilosidase, enzimas da biomassa expandida. A celulase pode ser a celulase que é produzida por um único tipo de microrganismo ou a celulase que é produzida por uma pluralidade de microrganismos Como as celulases produzidas por microrganismo(s), a celulase derivada dos fungos/fungo filamentosos pertencentes a Trichoderma, ou Acremonium, de preferência, é utilizada. Os exemplos de celulase incluem as séries “Cellic CTec” e “Cellic HTec”, manufaturadas por Novozymes; série “Accellerase”, manufaturada por Danisco Japan; “Celulase a partir de Trichoderma reesei ATCC 26921”, “Celulase a partir de Trichoderma viride”, e “Celulase a partir de Trichoderma longibrachiatum”, manufaturada por Sigma Aldrich; e “Meicelase”, “Acremonium Cellulase”, “ENM-3064”, “ENM-0814”, e “ENM-0115”, manufaturado por Meiji Seika Pharma Co. Ltd.

[039]Os tipos e proporções do componente dos componentes de enzima na celulase não são limitados. Por exemplo, um líquido de cultura derivado de Trichoderma reesei contém uma celobiohidrolase, β-glucosidase e similares. Uma vez que a β-glucosidase é retida na célula ou na superfície da célula, a atividade da β-glucosidase no líquido de cultura é baixa. Neste caso, um tipo diferente ou o mesmo tipo de β-glucosidase ainda pode ser adicionado ao sobrenadante da cultura.

[040]A celulase promove o efeito de manose, e possui um efeito para possibilitar a produção de monossacarídeos tal como a glicose e xilose por meio da reação enzimática da celulase com a hemicelulose contida no componente líquido. Por conseguinte, por meio da separação de monossacarídeos por meio de manotriose e manobiose por meio da separação de membrana descrita acima, e utilizando a manotriose e manobiose como substâncias valiosas para a alimentação, e rações, os monossacarídeos como matéria prima de fermentação podem ser produzidos de maneira não dispendiosa.

[041] Na Etapa (A), a ordem de adição de celulase e mananase não é limitada. Um método em que a celulase é adicionada ao componente líquido, e a reação, em seguida, pode continuar, seguida pela adição de mananase, ou um método em que a celulase e mananase são adicionadas de uma só vez, normalmente é realizado.

[042] Uma vez que o líquido sacarificado resultante na Etapa (A) contém as impurezas derivadas da biomassa lenhosa, o líquido sacarificado é filtrado por meio da membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração para coletar o líquido de açúcar a partir do lado de permeado na Etapa (B) na presente invenção.

[043] O método de filtração de acordo por meio da membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração não é limitado. O método de preferência, é a filtração de fluxo cruzado. O tratamento do componente líquido com a mananase não permite a degradação total dos componentes de incrustação no tratamento da membrana e o componente de incrustação permanece parcialmente. No entanto, a operabilidade de longa duração da membrana pode estar segura na filtração de fluxo cruzado, uma vez que o fluxo horizontal pode ser formado para reduzir a deposição na superfície da membrana. Nos casos em que o componente sólido está presente em uma concentração de tão elevada quanto não inferior a 5% em peso a incrustação do canal pode ocorrer para prevenir o contato do próprio líquido na superfície da membrana. Nestes casos a etapa de separação sólido-líquido pode ser fornecida antes da filtração por meio de uma membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração para evitar a incrustação do canal. Os exemplos específicos do método da separação sólido-líquido incluem, mas não estão limitados à separação por filtração, centrifugação ou sedimentação. A separação por filtração ou centrifugação é de preferência, uma vez que a separação por filtração, utilizando uma malha de metal, tecido tecido ou tecido não tecido raramente é eficiente para a remoção de componente sólido. O método da separação sólido-líquido, de preferência, é a centrifugação a partir do ponto de vista do espaço necessário para o dispositivo e custo do dispositivo.

[044]A membrana de microfiltração é uma membrana que possui uma superfície funcional porosa. A membrana de microfiltração porosa significa uma membrana que possui, em uma superfície funcional porosa, uma estrutura de rede tridimensional de formato em esponja, em que os vazios são formados de tal maneira que se comunicam entre si. Por exemplo, a membrana cuja superfície funcional é um tecido tecido ou um tecido não tecido não estão incluídas. Deve ser observado que a membrana de microfiltração pode conter um tecido tecido ou um tecido não tecido no seu material de base que não é uma superfície funcional.

[045]A membrana de microfiltração, de preferência, é uma membrana de microfiltração que possui um diâmetro médio de poros de 0,01 a 0,5 μm. No caso em que o diâmetro médio de poro da membrana de microfiltração é de 0,01 a 0,5 μm, a incrustação da membrana pode ser reduzida de maneira eficiente quando o tratamento da membrana de microfiltração, tratamento da membrana de ultrafiltração e/ou tratamento de membrana de osmose inversa é/são realizado(s) como um pós tratamento da membrana de microfiltração. Como o tamanho médio do poro da membrana de microfiltração, o tamanho nominal apresentado por cada fabricante da membrana de separação pode ser empregado ou o tamanho médio do poro realmente pode ser medido. Como um método para a medição do tamanho médio de poro da membrana de microfiltração, pode ser aplicado o método de observação direta e o método de ponto de bolha. O diâmetro médio de poro da presente invenção é medido utilizando o método de ponto de bolha. No método de ponto de bolha, uma pressão de ar é aplicada a partir do lado secundário da membrana secundário, e a pressão mínima à qual a geração de bolhas de ar pode ser observada na superfície da membrana é medida. De acordo com a expressão de relação entre a tensão superficial do líquido utilizado e a pressão, é calculado o tamanho médio de poros. Este método possibilita a medição de acordo com a norma ASTM F316-03. A medição do tamanho médio do poro da membrana de microfiltração, de acordo com a norma ASTM F316-03, por exemplo, pode ser medida utilizando um analisador de permeabilidade de gás / distribuição do poro de penetração produzido por BEL Japan Ltd.

[046] Os exemplos do material da membrana de microfiltração que podem ser empregados incluem as membranas orgânicas (por exemplo, a membrana à base de celulose, poliamida aromática, álcool polivinílico, polissulfona, fluorado de polivinilideno, polietileno, poliacrilonitrila, polipropileno, policarbonato, politetrafluoroetileno), cerâmicas e metais. As membranas orgânicas são de preferência, uma vez que possuem um efeito significativo de incrustação de membrana por mananase e celulase. O fluorado de polivinilideno é de preferência.

[047]A membrana de ultrafiltração na presente invenção significa uma membrana que possui um peso molecular de corte de 300 a 200.000, e é referida como ultrafiltração, membrana de UF ou similar abreviado. No presente, na membrana de ultrafiltração, o tamanho de poro na superfície da membrana é demasiadamente pequeno para medir com um microscópio eletrônico ou similar, de maneira que um valor denominado “peso molecular de corte” é utilizado como o índice do tamanho de poro, em vez do tamanho médio de poros. Na Membrane Society do Japão ed., Membrane Experiment Séries, volume III, Artificial Membrane, membros do Conselho Editorial: Shoji Kimura, Shin-ichi Nakao, Haruhiko Ohya e Tsutomu Nakagawa (1993, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd.) página 92, existe a seguinte descrição: “A curva obtida ao plotar o peso molecular do soluto ao longo da abscissa e a taxa de bloqueio ao longo do normal é denominada “curva do peso molecular de corte”. O peso molecular em que a taxa de bloqueio atinge 90% é denominado “peso molecular de corte da membrana”. Por conseguinte, o peso molecular de corte é bem conhecido dos técnicos no assunto no estado da técnica como um índice que representa o desempenho da membrana de uma membrana de ultrafiltração.

[048] O material da membrana de ultrafiltração não é limitado, desde que a membrana possua funções que possibilitem a remoção de partículas, e a recuperação das enzimas (manose, celulases e similares). Os exemplos da membrana de ultrafiltração incluem as membranas orgânicas (por exemplo, os materiais orgânicos, tais como a celulose, éster de celulose, polissulfona, sulfona de poliéter, polietileno clorado, polipropileno, poliolefina, álcool polivinílico, metacrilato de polimetila, fluoreto de polivinilideno, e politetrafluoroetileno), membranas de metal (por exemplo, o aço inoxidável), materiais de cerâmica (por exemplo, a alumina e zircônia). Os materiais orgânicos são de preferência desde que possuam o efeito significativo de incrustação da membrana por mananase e celulase. O fluoreto de polivinilideno, polissulfona, sulfona de poliéter são de preferência.

[049]A forma de membranas de ultrafiltração não é limitada, e a membrana pode ser uma membrana plana ou uma membrana de fibra oca. Nos casos em que o líquido sacarificado é filtrado por meio de uma membrana de ultrafiltração, os componentes de enzima (mananase e celulase) reagidos com o componente líquido também podem ser recuperados., de maneira que o custo do processamento na presente invenção pode ser muito reduzido. Os componentes de enzima utilizados na presente invenção possuem pesos moleculares dentro do intervalo de 5.000 a 150.000. Por meio da utilização de uma membrana de ultrafiltração que possui um peso molecular de corte com que os componentes de enzima podem ser bloqueados, mais especificamente, por meio da utilização de uma membrana de ultrafiltração que possui um peso molecular de corte dentro do intervalo de 5.000 a 150.000, os componentes de enzima podem ser recuperados a partir do lado da alimentação. Os exemplos da membrana de ultrafiltração que possui um peso molecular de corte dentro do intervalo de 5.000 a 150.000 incluem as séries “Torayfil” HFU, produzidas por de Toray Industries, Inc.; séries “Microza” AIP, séries ACP, séries AHP, séries SIP, séries SLP, produzidas por Asahi Kasei Corporation; séries GM, séries PW e séries HWS, produzidas por DESAL; GR40PP, GR51PP, GR60PP, GR61PP, GR81PP, ETNA10PP, produzidas por Alfa Laval, séries FS e séries RC, produzidas por DSS; ED produzida por AMT, PES10K, produzida por Applied Membrane; HFM-180, HFM-183, HFM-251, HFP-276, HFM-300, HFM-116, HFM-131, HFM-328, PM5K, PM10K, PM30K, PM50K, PM100K, CM, XM5K, XM8K, MPT-U20, MPT-U20P, MPT-U20S, produzidas por KOCH, e SPE5, SPE10, SPE30, SPE100, SPV5, SPV50, SPV100, SOW30 produzidas por Synder.

[050]Os componentes de enzima recuperada podem ser reutilizados por meio da realização da reação antes do tratamento da membrana de microfiltração e/ou da membrana de ultrafiltração, para reduzir a quantidade de enzima utilizada na Etapa (A). Especialmente nos casos em que uma membrana de ultrafiltração é utilizada na Etapa (B), o componente líquido da biomassa lenhosa pode ser alimentado de maneira contínua para o componente de enzima recuperada a partir do lado da alimentação da membrana de ultrafiltração, conforme mostrado na Figura 1 e na Figura 2. Uma vez que devido a isto, a Etapa (A) e a Etapa (B), podem ser realizadas de maneira contínua, é possível a redução de custo do equipamento, por meio de um processo contínuo.

[051]O permeado a partir da membrana de microfiltração de permeado e/ou membrana de ultrafiltração, de preferência, é submetido ao tratamento com a membrana de ultrafiltração que possui um peso molecular de corte de 300 a 1.000, como Etapa (C), conforme mostrado na Figura 3. Ao realizar este tratamento, a manobiose e manotriose produzidas por meio da degradação por mananase podem ser separadas no lado da alimentação da membrana, e os monossacarídeos tais como a tais como a glicose e xilose podem ser separados no lado do permeado da membrana. Como resultado, os componentes permeados podem ser utilizados como matéria prima para a fermentação. Os exemplos do material da membrana de ultrafiltração que possuem um peso molecular de corte de 300 a 1.000 que podem ser utilizados incluem as membranas orgânicas (poliamida aromática, poliamida de piperazina, álcool polivinílico, policsulfona, sulfona de poliéter, polisulfona sulfonada, fluoreto de polivinilideno, polietileno, poliacrilonitrila, polipropileno, policarbonato, politetrafluoroetileno), cerâmicas e metais. A partir do ponto de vista do controle de tamanho de poro, a poliamida aromática, poliamida de piperazina, álcool polivinílico, e polisulfona sulfonada são de preferência. A forma de membrana de ultrafiltração a ser utilizado não é limitada, e pode ser qualquer tipo de uma membrana espiral, fibra oca, tipo tubular e plana.

[052] Os exemplos específicos da membrana de ultrafiltração que possui um peso molecular de corte de 300 a 1.000, incluem o tipo G-5, tipo GE, produzidos por DESAL, SPE1 produzido por Synder, PM1000, PM2000, MPS- 36, SR2 produzidos por Koch; GR95PP e ETNA01PP, produzidos por Alfa Laval, NTR-7450 (peso molecular de corte de 600 a 800, descrito em WaterResearch37 (2003) 864-872), e NTR-7410 (peso molecular de corte de 1.000, descrito em Collection of Papers for 5th Sanitary Engineering Symposium, 6-4), produzido por Nitto Denko Co., e NFG (peso molecular de corte de 600 a 800), e NFW (peso molecular de corte de 300 a 500), produzido por Synder. A forma da membrana de ultrafiltração que possui um peso molecular de corte de 300 a 1.000 não é limitada, e pode ser qualquer tipo de uma membrana espiral, fibra oca, tipo tubular e plana.

[053]Os meios para a purificação de manobiose e manotriose não são limitados àqueles descritos acima. Por exemplo, a fermentação pode ser realizada em um estado em que os monossacarídeos são misturados com a manobiose e manotriose, e o líquido após o consumo de xilose e glicose pode ser utilizado para a recuperação de manobiose e manotriose a partir do líquido utilizando a membrana de ultrafiltração que possui um peso molecular de corte de 300 a 1.000.

[054] O permeado a partir da membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração, de preferência é filtrado por meio de uma membrana de ultrafiltração e/ou membrana de osmose inversa para concentrar os monossacarídeos contidos no permeado. Mais especificamente, em tal método, conforme mostrado na Figura 4, o permeado a partir da membrana de microfiltração e/ou da membrana de ultrafiltração, é uma vez tratado com a membrana de ultrafiltração que possui um peso molecular de corte de 300 a 1.000, e o permeado resultante, ainda é submetido ao tratamento com uma membrana de nanofiltração e/ou membrana de osmose inversa para obter, como um não permeado da membrana, um açúcar concentrado que principalmente contém os monossacarídeos. Conforme descrito na publicação WO 2010/067785, a concentração de monossacarídeos com a membrana de nanofiltração e/ou membrana de osmose inversa possui a função de remover as substâncias inibidoras de fermentação, tais como o ácido fórmico, ácido acético, HMF, furfural e vanilina contidas no componente líquido para o lado do permeado da membrana, ao mesmo tempo concentrando os monossacarídeos.

[055]A membrana de nanofiltração é uma membrana que também é denominada “nanofiltro” (ou “membrana de NF”) e, em geral, definida como "membrana que possibilita a permeação dos íons monovalentes, mas bloqueia os íons divalentes”. Uma membrana é considerada por possuir microvazios que possuem tamanhos de diversos nanômetros, e principalmente utilizada para bloquear as micropartículas, moléculas, íons, sais e/ou similares em água. Os exemplos específicos da membrana de nanofiltração incluem a GEsepa séries DK e séries HL produzidas por GE Osmonics, NF99 e NF99HF produzidas por Alfa Laval, NF, NF-45, NF-90, NF-200, NF-270 ou NF-400, produzidas por Filmtec Corporation; e séries SU-200 e séries SSU-600 (tais como SU610 e SU620) produzidas por Toray Industries, Inc. Os exemplos específicos de membrana de nanofiltração também incluem NTR769SR, NTR-729HF, NTR7250 e NTR-725HF produzidos por Nitto Denko Corporation.

[056]A membrana de osmose inversa também é denominada “membrana de RO e, em geral, é definida como "uma membrana que possui uma função de dessalinização também para os íons monovalentes. Uma membrana é considerada por possuir vazios ultrafinos que possuem tamanhos variando de diversos angstroms a diversos nanômetros, e principalmente é utilizada para a remoção dos componentes iônicos, tais como a dessalinização de água salgada ou a produção de água ultrapura.

[057]Os exemplos específicos de membrana de osmose inversa incluem: um tipo de pressão ultrabaixa de séries SUL-G, tipo de baixa pressão de séries SU-700, tipo de pressão elevada de séries SU-800, e tipo de celulose de acetato de séries SC-L100R, SC-L200R, SC-1000, SC-2000 séries, SC- 3000, SC-3200, SC-8000 séries, produzido por Toray Industries, Inc., NTR- 759HR, NTR-70SWC, ES10-D, ES20-D, ES20-U, ES15-D, ES15-U e LF10-D produzidos por Nitto Denko Corporation, RO98pHt, RO99, HR98PP, e CE4040C-30D, produzidos por Alfa Laval; GE Sepa produzido por GE; BW30- 4040, TW30-4040, XLE-4040, LP-4040, LE-4040, SW30-4040 e SW30HRLE- 4040, produzidos por Filmtec Corporation; TFC-HR e TFC-ULP produzidos por KOCH; ACM-1, ACM-2, ACM-4, produzidos por TRISEP, e HA5330, HS5330, HKC3035, HS5205A, e CM10 produzidos por Toyobo Co., Ltd.

[058]As formas de membrana de nanofiltração e da membrana de osmose inversa a serem utilizadas não são limitadas, e pode ser qualquer tipo de uma membrana espiral, fibra oca, tipo tubular e plana.

[059]Os monossacarídeos obtidos são utilizados na produção de produtos químicos por meio da fermentação. O produto químico produzido por meio da etapa de fermentação não é limitado, desde que seja uma substância produzida em um líquido de cultura pelos microrganismos ou células. Os exemplos específicos de produto químico incluem os álcoois, ácidos orgânicos, amino ácidos e ácidos nucleicos, que são as substâncias produzidas em massa na indústria de fermentação. Os exemplos de álcool incluem o etanol, butanol, 1,3-propanodiol, 2,3- butanodiol, 1,4-butanodiol, e glicerol; os exemplos dos ácidos orgânicos incluem o ácido acético, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido succínico, ácido málico, ácido itacônico, e ácido cítrico, os exemplos de ácido nucleico incluem os nucleosídeos, tais como a inosina e guanosina, e nucleotídeos, tais como o ácido inosínico e ácido guanílico; e os compostos de diamina, tal como a cadaverina. A presente invenção também pode ser aplicada para a produção de substâncias tais como as enzimas, antibióticos e proteínas recombinantes.

EXEMPLOS EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1 MÉTODO PARA MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCAR

[060]A análise da concentração de açúcar (concentração de glicose, concentração de xilose e concentrações de manobiose e manotriose) nos líquidos de açúcar obtidos nos Exemplos e Exemplos Comparativos foi realizada por HPLC sob as seguintes condições, e a quantificação de açúcar foi realizada com base na comparação com as amostras padrão; - Coluna: Asahipak NH2P-50 4E (produzido por Shodex); - Fase móvel: água ultrapura: acetonitrila = 25:75 (taxa de fluxo de 1,0 mL/min); - Líquido de reação: hidrazina de fenila; - Método de detecção: detecção de fluorescência; e - Temperatura: 30° C.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2 MÉTODO PARA A MEDIÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DE FURANO / COMPOSTOS AROMÁTICOS

[061]A análise das concentrações dos compostos de furano (HMF e furfural) e dos compostos de fenol (vanilina e similares) contidos no líquido de açúcar foi realizada por HPLC sob as seguintes condições, e a quantificação desses compostos foi realizada com base na comparação com as amostras padrão; - Coluna: Synergi HidroRP 4,6 mm x 250 mm (produzido por Phenomenex); - Fase móvel: acetonitrila - 0,1% de H3PO4 (taxa de fluxo, 1,0 mL/min); - Método de detecção: UV (283 nm); e - Temperatura: 40°C.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3 MÉTODO PARA A MEDIÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DE ÁCIDO ORGÂNICO

[062]A análise dos ácidos orgânicos (ácido acético e ácido fórmico) contidos no líquido de açúcar foi realizada por HPLC sob as seguintes condições, e a quantificação desses ácidos orgânicos foi realizada com base na comparação com as amostras padrão; - Coluna: Shim-Pack SPR-H e Shim-Pack SCR101H (produzido pela Shimadzu Corporation) que estão dispostos de maneira linear; - Fase móvel: 5 mM de ácido p-toluenossulfônico (taxa de fluxo, 0,8 mL/min); - Solução de reação: 5 mM de ácido p-tolueno-sulfônico, 20 mM de Bis-Tris, 0,1 mM de EDTA • 2Na (taxa de fluxo: 0,8 mL/min); - Método de detecção: condutividade elétrica; e - Temperatura: 45°C.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 4 MÉTODO PARA A MEDIÇÃO DA TURVAÇÃO

[063]A turvação de cada líquido de açúcar foi quantificada utilizando um medidor de turvação laboratorial de desempenho elevado (2100N) produzido por HACH. Uma vez que o medidor de turvação apenas é aplicável para medir as turvações não superiores a 1.000 NTU, o líquido de açúcar foi diluído com água destilada, caso necessário, antes das medições. O valor medido resultante foi dividido pela taxa de diluição para fornecer a turvação.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 5 MÉTODO PARA A MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE SS

[064]A concentração de SS do líquido de açúcar foi medida de acordo com a norma JIS K0102 14.1 (2008). O papel de filtro de fibra de vidro (produzido por Advantec Co. GS-25) foi aquecido durante 2 horas a 105° C e, em seguida, o peso do papel de filtro de fibra de vidro foi medido (peso A). O papel de filtro de fibra de vidro seco foi colocado em um suporte do filtro de filtração (produzido por Advantec Co. KP-47) e, em seguida, a filtração por sucção de V mL de um líquido de amostra (de 2 a 10 mL) foi realizada. O papel de filtro de fibra de vidro foi novamente aquecido durante 2 horas a 105° C, e o seu peso (peso b), em seguida, foi medido seguido pelo cálculo da concentração de MLSS, de acordo com a seguinte Equação 1. - concentração de SS [mg/L] = (b-a) [mg] / V [mL] x 1.000 (Fórmula 1).

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 6 MÉTODO PARA MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO TOTAL DE MANOSE CONTIDA NO COMPONENTE LÍQUIDO

[065]Com referência ao método LAP publicado por NREL ("Determinação de Carboidratos Estruturais e Lignina em Biomassa, Procedimento Analítico Laboratorial (LAP)"), a análise da composição foi realizada por meio do seguinte método.

[066] Uma quantidade adequada de uma amostra foi tomada, e mantida a 120° C utilizando o medidor de umidade de infravermelhos (FD-720, produzido por Kett Electric Laboratory). Por meio de um valor obtido a partir da diferença entre o valor estável após a evaporação e o valor inicial, o teor de umidade foi medido.

[067] Posteriormente, o líquido de análise foi secado sob vácuo, em uma bandeja de aço inoxidável, e toda, em seguida, a amostra foi tirada da bandeja. A amostra, em seguida, foi submetida à correção de peso seco absoluto para calcular o teor do peso seco absoluto de cada componente. Para 0,3 g da amostra da análise absolutamente seca, foram adicionados 3 mL de ácido sulfúrico a 72%, a mistura restante foi agitada durante 1 hora a 30° C. O líquido de reação resultante foi transferido com 84 mL de água purificada para a garrafa de pressão, e submetido à degradação por aquecimento utilizando uma autoclave durante 1 hora a 120° C. Em seguida, o líquido de degradação e o resíduo foram separados entre si por meio da filtração. O filtrado e o líquido de lavagem a partir do resíduo foram combinados e o volume da mistura resultante foi ajustado para 100 mL para fornecer um líquido da amostra. Os monossacarídeos (xilose, manose e glicose) no líquido da amostra foram quantificados por meio do método no Exemplo de Referência 1. A partir das concentrações de monossacarídeos no líquido de degradação obtido e a quantidade da amostra absolutamente seca degradada e a partir das quantidades de açúcares constituintes no líquido de análise, o teor de manose foi calculado como um seu item. Também ao utilizar o valor do teor de umidade medido anteriormente, a concentração total de manose presente no componente do líquido foi determinada por meio do cálculo de acordo com a seguinte Equação 1.

[068]A quantidade de manose como o açúcar constituinte foi submetida à correção utilizando o fator de correção de degradação excessiva do açúcar no momento da degradação por aquecimento (Sf, fator de sobrevivência; 1,06 nos casos de manose); - concentração total de manose (g/L) = (100 - teor de umidade (%)) x teor de manose (%) + 10 (Equação 1).

EXEMPLO 1 COMPONENTE LÍQUIDO DO HIDROLISADO (LÍQUIDO TRATADO DE MANEIRA HIDROTÉRMICA) PRODUZIDO POR MEIO DO TRATAMENTO HIDROTÉRMICO DA BIOMASSA LENHOSA

[069]O método de tratamento da hidrólise da biomassa lenhosa por meio do tratamento hidrotérmico na Etapa (1) será descrito abaixo como um exemplo. Como a biomassa lenhosa, foram utilizados três tipos de lascas de madeira, isto é, as lascas de madeira de coníferas Cryptomeria japonica e Pinus, bem como as lascas de madeira de uma árvore de folhas largas de Eucalyptus. A biomassa lenhosa foi embebida em água, e processada utilizando uma autoclave (produzida por Nitto Koatsu Co., Ltd.) a 200° C durante 10 minutos com agitação. Após o tratamento, a biomassa pode resfriar a 50° C, e a centrifugação (1.500 G) foi realizada para a separação sólido- líquido do componente líquido (a seguir referido como “líquido tratado de maneira hidrotérmica) e o componente sólido. O pH de cada líquido tratado de maneira hidrotérmica foi de 3,8. As concentrações observadas para cada líquido tratado de maneira hidrotérmica foram as seguintes. Os componentes em cada líquido tratado de maneira hidrotérmica são mostrados na Tabela 1, e a turvação, concentração de SS, concentração total de manose são mostradas na Tabela 2. TABELA 1 COMPOSIÇÃO DO LÍQUIDO TRATADO DE MANEIRA HIDROTÉRMICA

TABELA 2 TURVAÇÃO E CONCENTRAÇÃO SS DO LÍQUIDO TRATADO DE MANEIRA HIDROTÉRMICA

[070] Posteriormente, o pH de cada líquido tratado de maneira hidrotérmica foi ajustado para 5,0 utilizando uma solução de hidróxido de sódio. O líquido resultante foi dividido em duas porções e 0,2 g de mananase "Mananase BGM (Amano)" (produzida por Amano Enzyme Inc.) foram adicionados a uma dessas porções (volume de líquido, 1 L), e 0,2 g de "Mananase BGM (Amano)" (produzida por Amano Enzyme Inc.), assim como 2 mL de celulase “Accellerase DUET” (produzida por Danisco Japão) foram adicionados à outra porção (volume de líquido, 1 L). A reação da enzima foi realizada a 50° C durante 24 horas. Os líquidos resultantes são referidos como Líquido Sacarificado A e Líquido Sacarificado B, respectivamente. Originalmente, a medição por meio da filtração de fluxo cruzado deveria ser realizada, mas, para facilidade de estudo, o componente sólido foi removido de uma só vez por meio da centrifugação a 6.000 G e, em seguida, a filtração sem saída foi realizada como um teste de aceleração utilizando uma membrana de microfiltração, "Menbray TMR140" (marca registada) (tamanho de poro, 0,08 μm) que é uma membrana plana cujo material é o PVDF produzido por Toray Industries, Inc., para avaliar o desempenho de filtração da membrana de microfiltração. A membrana foi cortada em formato de disco que possui um diâmetro de 4 mm para fornecer a área de filtração antes da utilização. Para obter um índice para avaliar o desempenho de filtração, a superfície da membrana foi mantida imersa no líquido enquanto uma pressão de 50 kPa foi aplicada. A quantidade de líquido que pode ser filtrada durante o período de Minuto 0 a Minuto 1 após o início da pressurização, e a quantidade de líquido que pode ser filtrada durante o período de Minuto 1 a Minuto 2 (isto é, durante o período de 1 minuto seguinte) foram medidas. Os resultados da turvação antes da filtração e a quantidade do líquido filtrado para cada amostra são mostrados na Tabela 3 (para os casos do Líquido Sacarificado A) e Tabela 4 (para os casos do Líquido Sacarificado B). A quantidade de mananase adicionada para a preparação do Líquido Sacarificado A ou B foi 71 Unidades/g no caso de Cryptomeria japonica, 67 Unidades/g no caso de Pinus, e 200 Unidades/g no caso de Eucalyptus, em relação à quantidade total de manose (g) contida no componente líquido. TABELA 3 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO POR MEIO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO (LÍQUIDO SACARIFICADO A)

TABELA 4 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO POR MEIO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO (LÍQUIDO SACARIFICADO B)

EXEMPLO COMPARATIVO 1 CASOS DE FILTRAÇÃO POR MEIO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO SEM ADIÇÃO DE ENZIMA APÓS ADIÇÃO DE CELULASE

[071] Para 1 mL de cada líquido tratado de maneira hidrotérmica de Cryptomeria japonica e Pinus (pH 5) obtido no Exemplo 1, 2 mL de celulase “Accellerase DUET” (produzida por Danisco Japão) foram adicionados e a reação da enzima pode continuar a 50° C durante 24 horas, para obter o Líquido Sacarificado C. Após remover a maior parte do componente sólido a partir dos líquidos tratados de maneira hidrotérmica de Cryptomeria japonica, Pinus e Eucalyptus (pH 5) obtidos no Exemplo 1 e os Líquidos Sacarificados C (Cryptomeria japonica, e Pinus) por meio da centrifugação a 6.000 G, a filtração sem saída foi realizada como um teste de aceleração utilizando uma membrana de microfiltração, "Menbray TMR140" (marca registada) (tamanho de poro, 0,08 μm) que é uma membrana plana cujo material é o PVDF produzido por Toray Industries, Inc., para avaliar o desempenho de filtração da membrana de microfiltração. A membrana foi cortada em formato de disco que possui um diâmetro de 4 mm para fornecer a área de filtração antes da utilização. Para obter um índice para avaliar o desempenho de filtração, a superfície da membrana foi mantida imersa no líquido enquanto uma pressão de 50 kPa foi aplicada. A quantidade de líquido que pode ser filtrada durante o período de Minuto 0 a Minuto 1 após o início da pressurização, e a quantidade de líquido que pode ser filtrada durante o período de Minuto 1 a Minuto 2 (isto é, durante o período de 1 minuto seguinte) foram medidas. Os resultados são apresentados nas Tabelas 5 e 6. A partir dos resultados, foi descoberto que a aplicação da membrana de microfiltração é extremamente difícil nos casos em que nenhuma enzima é adicionada, ou apenas a celulase é adicionada. TABELA 5 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO POR MEIO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO (LÍQUIDO TRATADO DE MANEIRA HIDROTÉRMICA, SEM ADIÇÃO DE ENZIMA)

TABELA 6 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO POR MEIO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO (LÍQUIDO SACARIFICADO C, ADIÇÃO DE APENAS CELULASE)

EXEMPLO COMPARATIVO 2 CASOS DE FILTRAÇÃO POR MEIO DE TECIDO TECIDO, TELA, TECIDO NÃO TECIDO

[072] Os líquidos tratados de maneira hidrotérmica de Cryptomeria japonica e Eucalyptus (pH 5) obtidos no Exemplo 1 e o Líquido Sacarificado A foram centrifugados a 6.000 G para remover a maior parte do componente sólido e a aplicação dos líquidos resultantes para diversas superfícies de filtração foi estudada. Como tecidos , T2731C (produzido por Shikishima Canvas Co., Ltd.; poliéster, pano duplo, permeabilidade ao ar, 1,67 cc/cm2- seg), e PP934K (produzido por Nakao Filter Media Corp., polipropileno, pano duplo, permeabilidade ao ar, 0,3 cc/cm2-seg) foram utilizados. Como uma tela, uma malha de metal de 20 μm (lida Kogyo Co., Ltd, torcida) que foi cortada em formato de disco que possui um diâmetro de 4 mm foi utilizada. Como um tecido não tecido, uma membrana de tecido não tecido G-2260-3S (produzido por Toray Industries, Inc., poliéster, permeabilidade ao ar de 11 cc/cm2-seg). Os resultados filtrados são mostrados nas Tabelas 7 e 8. A partir dos resultados, foi descoberto que o aprimoramento no desempenho de filtração é significativamente diferente entre os materiais de filtro. A comparação com o Exemplo 1 mostrou que, nos casos de um hidrolisado da biomassa lenhosa, a adição de mananase é especialmente eficiente para a filtração utilizando a membrana de microfiltração. TABELA 7 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO DO LÍQUIDO TRATADO DE MANEIRA HIDROTÉRMICA

TABELA 8 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO DO LÍQUIDO SACARIFICADO A

EXEMPLO COMPARATIVO 3 CASOS DE UTILIZAÇÃO DA BIOMASSA HERBÁCEA

[073] Para a comparação com o Exemplo 1, um método de tratamento de hidrólise da biomassa herbácea por meio do tratamento hidrotérmico está descrito abaixo por meio de um Exemplo. Como uma biomassa herbácea, foi utilizado o bagaço que é o resíduo da cana. A biomassa herbácea foi embebida em água, e processada utilizando uma autoclave (produzida por Nitto Koatsu Co., Ltd.) a 180° C ou 200° C durante 10 minutos O tratamento a 180° C foi realizado como um tratamento equivalente uma vez que a hemicelulose herbácea normalmente é conhecida por ser mais facilmente degradada que a biomassa lenhosa. Após o tratamento, a biomassa pode resfriar a 50° C, e a centrifugação (1.500 G) foi realizada para a separação sólido-líquido do componente líquido (a seguir referido como “bagaço do líquido tratado de maneira hidrotérmica) e o componente sólido. Os pHs do bagaço dos líquidos tratados de maneira hidrotérmica foi de 3,6 e 3,2, respectivamente. As concentrações observadas para cada líquido tratado de maneira hidrotérmica foram as seguintes. Os componentes em cada líquido tratado de maneira hidrotérmica são mostrados na Tabela 9, e a turvação, concentração de SS, concentração total de manose são mostradas na Tabela 10. TABELA 9 COMPOSIÇÃO DO LÍQUIDO TRATADO DE MANEIRA HIDROTÉRMICA

TABELA 10 TURVAÇÃO E CONCENTRAÇÃO SS DO LÍQUIDO TRATADO DE MANEIRA HIDROTÉRMICA

[074] O pH de cada líquido tratado de maneira hidrotérmica obtido na separação sólido-líquido foi ajustado para 5,0 utilizando a solução aquosa de hidróxido de sódio. Para 1 mL do líquido preparado, 0,2 g de mananase "Mananase BGM (Amano)" (produzida por Amano Enzyme Inc.) foram adicionados. A reação da enzima foi realizada a 50° C durante 24 horas. O líquido obtido foi centrifugado a 6.000 g para remover a maior parte do componente sólido e, em seguida, submetido à filtração sem saída como um teste de aceleração utilizando uma membrana de microfiltração, "Menbray TMR140" (marca registada) (tamanho de poro, 0,08 μm) que é uma membrana plana cujo material é o PVDF, produzido por Toray Industries, Inc., para avaliar o desempenho de filtração da membrana de microfiltração. A membrana foi cortada em formato de disco que possui um diâmetro de 4 mm para fornecer a área de filtração antes da utilização. Para obter um índice para avaliar o desempenho de filtração, a superfície da membrana foi mantida imersa no líquido enquanto uma pressão de 50 kPa foi aplicada. A quantidade de líquido que pode ser filtrada durante o período de Minuto 0 a Minuto 1 após o início da pressurização, e a quantidade de líquido que pode ser filtrada durante o período de Minuto 1 a Minuto 2 (isto é, durante o período de 1 minuto seguinte) foram medidas. Para cada caso em que o tratamento de hidrólise foi realizado a 180° C ou 200° C, os resultados na turvação antes da filtração e a quantidade do líquido filtrado são mostrados na Tabela 11 (líquido tratado de maneira hidrotérmica) e Tabela 12 (após a adição de mananase).

[075] Com base no resultado de comparação com o Exemplo 1, foi descoberto que, enquanto o líquido tratado de maneira hidrotérmica da biomassa herbácea contém a manose, a adição de mananase ao líquido apenas apresenta um efeito pequeno. TABELA 11 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO POR MEIO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO (ANTES DA HIDRÓLISE)

TABELA 12 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO POR MEIO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO (APÓS A ADIÇÃO DA MANASE)

EXEMPLO 2 CASOS EM QUE O TRATAMENTO DE EXPLOSÃO POR VAPOR OU TRATAMENTO COM ÁCIDO DILUÍDO FORAM REALIZADOS COMO TRATAMENTO DE HIDRÓLISE

[076]Como a biomassa lenhosa da Etapa (1), foi utilizada a Cryptomeria japonica. A biomassa foi hidrolisada por meio do tratamento de explosão por vapor ou tratamento com o ácido diluído. O tratamento de explosão por vapor foi realizado por meio da alimentação das lascas de madeira de Cryptomeria japonica para o dispositivo de explosão por vapor (produzido por Nihon Dennetsu Co., Ltd., tamanho 30-L) e, em seguida, introduzindo um vapor no dispositivo para manter a pressão a 3,5 MPa durante 2,5 minutos. O produto tratado com a explosão por vapor de Cryptomeria japonica imediatamente foi colocado em água, e a água adicional ainda foi adicionada para o teor de sólido de 10% em massa. O produto, em seguida, foi agitado e centrifugado a 1.500 G durante 1 minuto para separar o componente sólido e o componente líquido entre si. Este componente líquido é referido como “hidrolisado tratado por explosão”.

[077]O tratamento com o ácido diluído, foi realizado embebendo as lascas de madeira de Cryptomeria japonica em solução aquosa de ácido sulfúrico a 0,5%, em uma concentração de sólidos de 20% em peso e, em seguida, autoclavando as lascas de madeira a uma temperatura de 170° C durante 10 minutos (utilizando uma autoclave produzida por Nitto Koatsu Co., Ltd.). Em seguida, a centrifugação foi realizada 1.500 G durante 1 minuto para separar o componente líquido e o componente sólido entre si. O componente líquido obtido é referido como “hidrolisado tratado com o ácido diluído”. A composição, a concentração de SS e a turvação de cada componente líquido são mostradas nas Tabelas 13 e 14. TABELA 13 COMPOSIÇÕES DE HIDROLISADO TRATADO COM EXPLOSÃO POR VAPOR E HIDROLISADO TRATADO COM ÁCIDO DILUÍDO

TABELA 14 TURVAÇÃO E CONCENTRAÇÃO SS DE HIDROLISADO TRATADO COM EXPLOSÃO POR VAPOR E HIDROLISADO TRATADO COM ÁCIDO DILUÍDO

[078]Os pHs de cada hidrolisado tratado com o ácido diluído e o hidrolisado tratado por explosão foram ajustados para 5,0 utilizando a solução aquosa de hidróxido de sódio. Cada hidrolisado, em seguida, foi dividido em duas porções e 0,2 g de mananase "Mananase BGM (Amano)" (produzida por Amano Enzyme Inc.) foram adicionados a uma dessas porções (volume de líquido, 1 L), e 0,2 g de "Mananase BGM (Amano)" (produzida por Amano Enzyme Inc.), assim como 2 mL de celulase “Accellerase DUET” (produzida por Danisco Japão) foram adicionados à outra porção (volume de líquido, 1 L). A reação da enzima foi realizada a 50° C durante 24 horas. Em seguida, por meio dos mesmos métodos como no Exemplo 1, a avaliação do desempenho de filtração e da membrana de microfiltração, e a medição da turvação antes da filtração foram realizadas. Os resultados são mostrados nas Tabelas 15 e 16. A quantidade de mananase adicionada, conforme calculada em relação à quantidade total de manose (g), contida em cada do hidrolisado foi de 167 Unidades/g no líquido preparado a partir do hidrolisado tratado por explosão e 167 Unidades/g no líquido preparado a partir do hidrolisado tratado com o ácido diluído. TABELA 15 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO POR MEIO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO (SOMENTE A MANASE)

TABELA 16 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO POR MEIO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO (ADIÇÃO DE MANASE E CELULASE)

EXEMPLO COMPARATIVO 4 CASOS EM QUE O TRATAMENTO DE EXPLOSÃO POR VAPOR OU TRATAMENTO COM ÁCIDO DILUÍDO FORAM REALIZADOS COMO TRATAMENTO DE HIDRÓLISE - Cada hidrolisado cujo pH foi ajustado para 5 obtido no Exemplo 2 foi submetido à avaliação do desempenho da filtração e medição da turvação, antes da filtração, por meio dos mesmos métodos como no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela 17. TABELA 17 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO POR MEIO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO (HIDROLISADO, SEM ADIÇÃO DE ENZIMA)

[079]Como um resultado da comparação com os Exemplos 1 e 2, foi descoberto que o efeito da presente invenção também pode ser obtido para os hidrolisados obtidos por meio do tratamento de explosão por vapor, ou tratamento com o ácido diluído de uma biomassa lenhosa.

EXEMPLO 3 ESTUDO DA QUANTIDADE DE MANANASE ADICIONADA

[080]Cada um dos líquidos preparados por meio da adição de 0,28 mg, 2,8 mg, 28 mg, ou 2,8 g de "Mananase BGM (Amano)" (produzida por Amano Enzyme Inc.) (concentração ativa de galactomanano, 10.000 Unidades/g) para 1L do líquido tratado de maneira hidrotérmica obtido por meio do tratamento hidrotérmico 1 de lascas de madeira de Cryptomeria japonica utilizadas no Exemplo 1 (pH 5, concentração total de manose, 28 g/L) foi submetido à avaliação do desempenho da filtração e medição da turvação, antes da filtração, por meio dos mesmos métodos como no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela 18. Conforme mostrado na Tabela 18, a quantidade de mananase foi de 0,01 Unidade/g, 0,1 Unidade/g, 1,0 Unidade/g, 100 Unidades/g, ou 1.000 Unidades/g, em relação à quantidade total de manose contida no hidrolisado. TABELA 18 ESTUDO NA QUANTIDADE DE MANANASE ADICIONADA

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 7 ANÁLISE DA QUANTIDADE DE MANANASE NO LÍQUIDO DE ENZIMA DE CELULASE

[081]A fim de investigar se os resultados foram influenciados pelo efeito da mananase contida na celulase, foi medida a atividade de galactomanano de um líquido de enzima de celulase “Accellerase DUET” (produzido por Danisco Japão). Como resultado, a atividade foi de 0,084 Unidade/mL. Uma vez que isto corresponde a 0,006 Unidade/g, pode ser afirmado que o efeito da mananase em celulase é muito pequeno.

EXEMPLO 4 TRATAMENTO DE ESTABILIDADE A LONGO PRAZO DO TRATAMENO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO < MEMBRANA INORGÂNICA, MEMBRANA ORGÂNICA>

[082] Os Líquidos Sacarificados A e B derivados a partir de lascas de madeira de Cryptomeria japonica, obtidos no Exemplo 1, foram submetidos à filtração de fluxo cruzado por meio das membranas de microfiltração para avaliar a estabilidade a longo prazo. Este estudo foi realizado em cada membrana inorgânica e membrana orgânica. Como a membrana orgânica, foi utilizada uma membrana de microfiltração "Trorayfil HFM" (produzida por Toray Industries, Inc., material: PVDF, tamanho de poro, 0,1 μm). Como a membrana inorgânica, foi utilizada uma membrana de microfiltração "Membralox" (produzida por PALL, material de tamanho de poro: 0,2 μm). A filtração foi realizada para a área de membrana de 0,24 m2. Quarenta litros de cada um dos Líquidos Sacarificados A e B foram fornecidos, e cada um destes foi filtrado com a velocidade linear de superfície de 30cm/seg., e uma taxa de filtração de membrana de 0,5 m/D até a pressão de filtração (diferença da pressão de transmembrana) alcançar 100 kPa. Em seguida, a membrana foi lavada com água, e os Líquidos Sacarificados A e B foram novamente submetidos à filtração até a pressão de filtração alcançar 100 kPa. O valor da pressão de filtração imediatamente após o reinício da operação, seguido por lavagem com água são mostrados na Tabela 19. O período de tempo necessário para alcançar 100 kPa é mostrado na Tabela 20. TABELA 19 VALOR DE PRESSÃO DA FILTRAÇÃO

TABELA 20 TEMPO NECESSÁRIO PARA ALCANÇAR 100 KPA

EXEMPLO COMPARATIVO 4 TESTE DE ESTABILIDADE A LONGO PRAZO PARA O TRATAMENO DA MEMBRANA DE FILTRAÇÃO < CASOS DE FILTRAÇÃO SEM ADIÇÃO DE ENZIMA >

[083] O líquido tratado de maneira hidrotérmica derivado a partir de lascas de madeira de Cryptomeria japonica (pH 5) obtido no Exemplo 1 foi submetido à filtração de fluxo cruzado por meio de membranas de microfiltração, e suas estabilidades a longo prazo foram avaliadas da mesma maneira como no Exemplo 4, foi avaliada a estabilidade a longo prazo. O valor da pressão de filtração medido imediatamente após o início da operação, e o valor da pressão de filtração medido imediatamente após o reinício da operação, seguido por lavagem com água são mostrados na Tabela 21. O período de tempo necessário para alcançar 100 kPa é mostrado na Tabela 22. TABELA 21 VALOR DE PRESSÃO DA FILTRAÇÃO

TABELA 22 TEMPO NECESSÁRIO PARA ALCANÇAR 100 KPA

[084] Por meio da comparação com o Exemplo 4, foi descoberto que a pressão imediatamente após o início é elevada, e que a pressão de filtração alcança 100 kPa em um curto período de tempo, de maneira que existe um risco elevado de incrustação. Também foi descoberto que o efeito é significantemente maior quando uma membrana orgânica é utilizada como a membrana de microfiltração.

EXEMPLO 5 SEPARAÇÃO DE MANOBIOSE E MANOTRIOSE A PARTIR DO LÍQUIDO TRATADO COM ENZIMA

[085] O Líquido Sacarificado B foi submetido ao tratamento de membrana de microfiltração sob as mesmas condições do Exemplo 1, e ainda à filtração por meio de um dispositivo de filtração de fluxo cruzado SEPA II, produzido por GE, para o qual uma membrana de ultrafiltração PW (produzida por GE; material, sulfona de poliéter, peso molecular de corte de 10.000) foi anexada. Como um resultado, foi obtido um líquido de açúcar que possui a composição mostrada da Tabela 23. TABELA 23 COMPOSIÇÃO DE LÍQUIDO TRATADO DE MANEIRA HIDROTÉRMICA / MEMBRANA DE ULTRAFILTRAÇÃO (MW: 10.000) - LÍQUIDO TRATADO

[086] O filtrado resultante foi dividido em duas porções, e cada porção foi filtrada por meio de um dispositivo de filtração de fluxo cruzado SEPA II, produzido por GE, para o qual uma membrana de ultrafiltração NTR- 7450 (produzida por Nitto Denko Corporation; material, sulfona de poliéter sulfonado, peso molecular de corte, de 600 a 800) ou SPE1 (produzida por Synder; material, sulfona de poliéter sulfonado, peso molecular de corte: 1.000) foi anexada. Devido a isto, cada porção foi concentrada seis vezes. Os resultados obtidos para cada membrana são mostrados nas Tabelas 24 e 25. TABELA 24 COMPOSIÇÃO DO LÍQUIDO SEPARADO COM “NTR-7450”

TABELA 25 COMPOSIÇÃO DO LÍQUIDO SEPARADO COM “SPE1”

[087] Embora as concentrações dos componentes no lado do concentrado não fossem inferiores àquelas mostradas na Tabela 23, os líquidos que contêm grandes quantidades de manobiose e manotriose puderam ser obtidos por meio da filtração de adição de açúcar, isto é, a diafiltração.

EXEMPLO 6 FILTRAÇÃO CONTÍNUA COM A MEMBRANA DE ULTRAFILTRAÇÃO

[088] O seguinte é um Exemplo em que a sacarificação e a recuperação da enzima foram realizadas de maneira contínua utilizando o líquido tratado de maneira hidrotérmica preparado no Exemplo 1 (pH 5). Em um tanque de 1 L, 500 mL do líquido tratado de maneira hidrotérmica foram retidos e 0,1 g de "Mananase BGM (Amano)" (produzida por Amano Enzyme Inc.) e 1 mL de celulase “Accellerase DUET” (produzido por Danisco Japão)" foi adicionado ao tanque, seguido por filtração de maneira contínua durante 10 horas. Uma membrana de ultrafiltração "Microza SLP-0053" (produzida por Asahi Kasei Corporation, material; sulfona de poliéter sulfonado, peso molecular de corte, 10.000) foi utilizada. Enquanto o tanque foi mantido a 50° C, apenas a circulação entre o módulo e o tangue foi realizada durante as quatro primeiras horas após o início da operação. Em seguida, a filtração foi realizada a 5 mL/min enquanto o líquido tratado de maneira hidrotérmica foi abastecido para o tanque na mesma taxa, 5 mL/min. A temperatura do tanque foi mantida constante a 50° C. Na Hora 0, Hora 1, Hora 5 e Hora 10 horas após o início da filtração, a composição do filtrado como um líquido de açúcar era conforme mostrado na Tabela 26. Por conseguinte, foi descoberto que os líquidos de açúcar que substancialmente possuem a mesma composição sempre podem ser obtidos. Isto é, em um estado em que a enzima foi retida no lado da alimentação da membrana e o tanque de recuperação da mananase e celulase por meio da filtração, o líquido tratado de maneira hidrotérmica pode ser filtrado de maneira contínua, enquanto a manobiose e mano- oligossacarídeos foram produzidos. Os resultados nas concentrações de manobiose e mano-oligossacarídeos foram equivalentes àqueles mostrados na Tabela 23, do Exemplo 5. Por conseguinte, foi descoberto que a sacarificação e a recuperação da enzima, assim como o tratamento da membrana podem ser integrados entre si. Uma vez que nenhum aumento na pressão operacional foi descoberto durante o tratamento da membrana, foi descoberto que o processo pode ser operado de maneira contínua. TABELA 26 COMPOSIÇÃO DO FILTRADO DA MEMBRANA OBTIDO POR MEIO DO TRATAMENTO CONTÍNUO DA MEMBRANA

EXEMPLO COMPARATIVO 6 FILTRAÇÃO CONTÍNUA COM A MEMBRANA DE ULTRAFILTRAÇÃO (COMPONENTE LÍQUIDO)

[089] Por meio do mesmo método como no Exemplo 6, a filtração foi realizada sem a adição de enzimas. Como resultado, após 90 minutos de filtração, a produção do filtrado foi interrompida, e a filtração se tornou impossível.

EXEMPLO 7 CASOS EM QUE O CACHO VAZIO DE FRUTOS DE ÓLEO DE PALMA DE RESÍDUOS DE FLORESTAIS E DE AGRICULTURA FOI UTILIZADO

[090] Um método para a realização da hidrólise na Etapa (1) por meio do mesmo método como nos Exemplo 1 e 2 (isto é, o tratamento hidrotérmico, tratamento de explosão por vapor ou tratamento com o ácido diluído), exceto aquele o cacho vazio de frutos do óleo de palma, é utilizado como a biomassa lenhosa está descrito abaixo por meio de um exemplo similar aos métodos nos Exemplos 1 e 2.

[091]O tratamento hidrotérmico foi realizado embebendo o cacho vazio de frutos do óleo de palma em água, e realizando o tratamento utilizando uma autoclave (produzida por Nitto Koatsu Co., Ltd.) a 200° C durante 10 minutos. Após o tratamento, a biomassa pode resfriar a 50° C e a centrifugação (1.500 G) foi realizada para a separação sólido-líquido para o componente líquido (a seguir, referido como “líquido tratado de maneira hidrotérmica) e o componente sólido. O pH do líquido tratado de maneira hidrotérmica era de 3,8.

[092] O tratamento de explosão por vapor foi realizado por meio da alimentação do cacho vazio de frutos do óleo de palma e, em seguida, introduzindo o vapor, seguido por manter a pressão a 3,5 MPa durante 2,5 minutos. O produto tratado com a explosão por vapor de Cryptomeria japonica imediatamente foi colocado em água, e a água adicional ainda foi adicionada para o teor de sólido de 10% em massa. O produto, em seguida, foi agitado e centrifugado a 1.500 G durante 1 minuto para separar o componente sólido e o componente líquido entre si. Este componente líquido é referido como “hidrolisado tratado por explosão”.

[093]O tratamento com o ácido diluído, foi realizado embebendo o cacho vazio de frutos do óleo de palma em uma solução aquosa de ácido sulfúrico a 0,5%, a uma concentração de sólidos de 20% em peso, em seguida, autoclavando o cacho vazio de frutos do óleo de palma a uma temperatura de 170° C durante 10 minutos (utilizando uma autoclave produzida por Nitto Koatsu Co., Ltd.). Em seguida, a centrifugação foi realizada a 1.500 G durante 1 minuto para separar o componente sólido e o componente líquido entre si. O componente líquido obtido é referido como “hidrolisado tratado com o ácido diluído”. A composição, concentração de SS e turvação para cada componente líquido são mostradas nas Tabelas 27 e 28. TABELA 27 COMPOSIÇÃO DO COMPONENTE LÍQUIDO

TABELA 28 TURVAÇÃO E CONCENTRAÇÃO SS DO LÍQUIDO TRATADO DE MANEIRA HIDROTÉRMICA

[094] Os pHs do líquido tratado de maneira hidrotérmica, o hidrolisado tratado por explosão e o hidrolisado tratado com o ácido diluído obtidos foram ajustados para 5,0 utilizando a solução aquosa de hidróxido de sódio. Cada hidrolisado, em seguida, foi dividido em duas porções e 0,2 g de mananase "Mananase BGM (Amano)" (produzida por Amano Enzyme Inc.) foram adicionados a uma dessas porções (volume de líquido, 1 L), e 0,2 g de "Mananase BGM (Amano)" (produzida por Amano Enzyme Inc.), assim como 2 mL de celulase “Accellerase DUET” (produzida por Danisco Japão) foram adicionados à outra porção (volume de líquido, 1 L). A reação da enzima foi realizada a 50° C durante 24 horas. Os líquidos resultantes são referidos como Líquido Sacarificado E e Líquido Sacarificado F. Originalmente, a medição por meio da filtração de fluxo cruzado deveria ser realizada, mas, para facilidade de estudo, o componente sólido foi removido de uma só vez por meio da centrifugação a 6.000 G e, em seguida, a filtração sem saída foi realizada como um teste de aceleração utilizando uma membrana de microfiltração, "Menbray TMR140" (marca registada) (tamanho de poro, 0,08 μm) que é uma membrana plana cujo material é o PVDF produzido por Toray Industries, Inc., para avaliar o desempenho de filtração da membrana de microfiltração. A membrana foi cortada em formato de disco que possui um diâmetro de 4 mm para fornecer a área de filtração antes da utilização. Para obter um índice para avaliar o desempenho de filtração, a superfície da membrana foi mantida imersa no líquido enquanto uma pressão de 50 kPa foi aplicada. A quantidade de líquido que pode ser filtrada durante o período de Minuto 0 a Minuto 1 após o início da pressurização, e a quantidade de líquido que pode ser filtrada durante o período de Minuto 1 a Minuto 2 (isto é, durante o período de 1 minuto seguinte) foram medidas. Os resultados da turvação antes da filtração e a quantidade do líquido filtrado para cada amostra são mostrados na Tabela 29 (para os casos do Líquido Sacarificado E) e Tabela 30 (para os casos do Líquido Sacarificado F). A quantidade de mananase adicionada para a preparação do Líquido Sacarificado E ou F foi de 80 Unidades/g no caso do tratamento hidrotérmico, 67 Unidades/g no caso do tratamento de explosão por vapor e 50 Unidades/g no caso do tratamento com o ácido diluído, em relação à quantidade total de manose (g) contida no componente líquido. TABELA 29 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO POR MEIO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO (LÍQUIDO SACARIFICADO E)

TABELA 30 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO POR MEIO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO (LÍQUIDO SACARIFICADO F)

EXEMPLO COMPARATIVO 7 COMPONENTES NO HiDROLISADO DO CACHO VAZIO DE FRUTOS DE ÓLEO DE PALMA: CASOS SEM ADIÇÃO DE ENZIMA

[095]O líquido tratado de maneira hidrotérmica, o hidrolisado tratado por explosão e o hidrolisado tratado com o ácido diluído do cacho vazio de frutos do óleo de palma obtido no Exemplo 7, foram submetidos à filtração de fluxo cruzada utilizando uma membrana da mesma maneira como no Exemplo 7. Para cada hidrolisado, a avaliação do desempenho da filtração de microfiltração e da medição da turvação antes da filtração foram realizadas por meio dos mesmos métodos como no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela 31. TABELA 31 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO POR MEIO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO (SEM NENHUMA ADIÇÃO)

[096]Como um resultado da comparação com o Exemplo 7, foi descoberto que o efeito da presente invenção também pode ser obtido para o tratamento de hidrólise do cacho vazio de frutos do óleo de palma.

EXEMPLO COMPARATIVO 8 CASOS EM QUE A MANANASE FOI APLICADA PARA O CACHO VAZIO DE FRUTOS DE ÓLEO DE PALMA DE RESÍDUOS DE FLORESTAIS E DE AGRICULTURA SEM REALIZAR O TRATAMENTO DE HIDRÓLISE

[097] Casos em que o cacho vazio de frutos do óleo de palma estudado no Exemplo 7 foi submetido ao tratamento de mananase sem realizar o tratamento de hidrólise descrito abaixo. Foi descoberto que a quantidade total de manose presente no cacho vazio de frutos do óleo de palma (com base no peso seco) era de 25 mg/g do cacho vazio de frutos do óleo de palma como resultado da análise utilizando o método no Exemplo de Referência 6.

[098]A água foi adicionada ao cacho vazio de frutos do óleo de palma utilizado no Exemplo 7 para concentração de sólidos de 20%, e o pH foi ajustado a 5,0 com o acetato de sódio a 3 N com agitação. A mistura, em seguida, foi dividida em três porções. Posteriormente, 0,2 g de mananase "Mananase BGM (Amano)" (produzida por Amano Enzyme Inc.) foram adicionados a uma dessas porções para preparar o Líquido Sacarificado G (volume de líquido, 1 L), e 0,2 g de "Mananase BGM (Amano)" (produzida por Amano Enzyme Inc.), assim como 2 mL de celulase “Accellerase DUET” (produzida por Danisco Japão) foram adicionados à outra porção para preparar o Líquido Sacarificado H (volume de líquido, 1 L) e a porção resultante foi fornecida como um líquido ao qual nenhuma enzima foi adicionada (volume de líquido 1 L). Os pHs do Líquido Sacarificado G, do Líquido Sacarificado H, e do líquido ao qual nenhuma enzima foi adicionada foram ajustados para 5,0, e cada líquido foi mantido a 50° C durante 24 horas. Após a reação, a centrifugação foi realizada a 6.000 g para remover a maior parte do componente sólido e cada líquido foi submetido a uma avaliação do desempenho de filtração da membrana de microfiltração por meio do teste acelerado por meio do mesmo método como no Exemplo 6. De maneira similar ao Exemplo 6, a quantidade de líquido que pode ser filtrada durante o período de Minuto 0 a Minuto 1 após o início da pressurização, e a quantidade de líquido que pode ser filtrada durante o período de Minuto 1 a Minuto 2 (isto é, durante o período de 1 minuto seguinte) foram medidas. Os resultados da turvação antes da filtração e a quantidade do líquido filtrado para cada amostra são mostrados na Tabela 32. As concentrações de manose, manobiose e manotriose também são mostradas na Tabela. TABELA 32 RESULTADOS DA FILTRAÇÃO POR MEIO DA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO (LÍQUIDOS SACARAFICADOS G E H)

[099]A partir dos resultados da Tabela, foi descoberto que o tratamento de hidrólise do próprio cacho vazio de frutos do óleo de palma não é eficiente, e que a adição de enzima conduz a um desempenho reduzido de filtração.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[0100] Por meio da presente invenção, os açúcares de qualidade elevada (monossacarídeos, manobiose e manotriose) podem ser obtidos a partir da biomassa lenhosa a um baixo custo e o líquido de monossacarídeo pode ser utilizado como uma matéria prima de fermentação. DESCRIÇÃO DOS SÍMBOLOS (1) tanque de sacarificação enzimática; (2) membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 5.000 a 150.000; (3) enzima recuperada; (4) líquido sacarificado; (5) membrana de microfiltração; (6) componente sólido; (7) membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 300 a 1.000; (8) solução aquosa de manobiose / manotriose; (9) líquido de açúcar de monossacarídeos; (10) membrana de nanofiltração / membrana de osmose inversa; (11) líquido concentrado para a fermentação; e (12) inibidor da fermentação.

Claims

1. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM LÍQUIDO DE AÇÚCAR, caracterizado pelo método compreender as etapas de: (A) reagir a mananase com um componente líquido obtido por meio do tratamento de hidrólise da biomassa lenhosa para obter um líquido sacarificado, e (B) filtrar o líquido sacarificado obtido na Etapa (A) por meio da membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração para coletar o líquido de açúcar a partir do lado do permeado.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela biomassa lenhosa ser biomassa conífera.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo tratamento de hidrólise da Etapa (A) ser um ou mais selecionado a partir do grupo que consiste em tratamento hidrotérmico, tratamento de explosão por vapor e tratamento com ácido diluído.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por, na etapa (A), a celulase ser reagida com o componente líquido.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por, na Etapa (A), a quantidade de mananase adicionada não ser inferior a 0,01 Unidade/g em relação à quantidade total de manose (g) contida no componente líquido.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela(s) superfície(s) funcional(is) do(s) material(is) da membrana de microfiltração e/ou membrana de ultrafiltração na Etapa (B) ser(em) uma(s) membrana(s) orgânica(s).

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela membrana de microfiltração na Etapa (B) ser uma membrana de microfiltração que possui um tamanho médio de poro de 0,01 a 0,5 μm.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela membrana de ultrafiltração na Etapa (B) ser uma membrana de ultrafiltração que possui um peso molecular de corte de 5.000 a 150.000.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por compreender a etapa de: (C) filtrar o líquido de açúcar obtido na etapa (B) por meio de uma membrana de ultrafiltração que possui um peso molecular de corte de 300 a 1.000, para coletar o líquido de açúcar contido na manobiose e/ou manotriose a partir do lado da alimentação, e para coletar um líquido de açúcar contido em um monossacarídeo, a partir do lado permeado.

10. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM LÍQUIDO DE AÇÚCAR, caracterizado pelo método compreender, no método para a produção do líquido de açúcar, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, as etapas de: - realizar o tratamento da membrana de ultrafiltração, conforme Etapa (B); e - realizar a Etapa (A) utilizando o(s) componente(s) de enzima coletado(s) a partir do lado de alimentação da membrana de ultrafiltração.