JPWO2016035875A1 - 糖液の製造方法 - Google Patents

Abstract

木質系バイオマスから糖液を製造するプロセスにおいて、従来技術では、木質系バイオマスの糖化液に含まれる特定の成分が糖化液を精密ろ過膜および／または限外ろ過膜でろ過する際のろ過性能を著しく悪化させるという課題があった。本発明では、木質系バイオマスを加水分解して得られた液成分にマンナナーゼを反応させることにより、該糖化液の精密ろ過膜および／または限外ろ過膜のろ過性能を高め、効率的に糖液を製造することが可能となった。

Description

本発明は、木質系バイオマスから糖液を効率的に製造する方法に関する。

糖を原料とした化学品の発酵生産プロセスは、種々の工業原料生産に利用されている。この発酵原料となる糖として、現在、さとうきび、澱粉、テンサイなどの食用原料に由来するものが工業的に使用されているが、今後の世界人口の増加による食用原料価格の高騰、あるいは食用と競合するという倫理的な側面から、再生可能な非食用資源、すなわちセルロース含有バイオマスから効率的に糖液を製造するプロセス、あるいは得られた糖液を発酵原料として、効率的に工業原料に変換するプロセスの構築が今後の課題となっている。

セルロース含有バイオマスは、大きく草本系バイオマスと木質系バイオマスに分類される。木質系バイオマスはこれまで製紙業界において工業的に利活用されていたが、近年、ペーパーレス化による需要低下などの要因から、前述の糖原料としても活用することが研究されている。（特許文献１、２）
セルロース含有バイオマスは、主に芳香族系重合物のリグニンと、単糖の重合物であるセルロースやヘミセルロースからなる。糖液を得るには、リグニンに保護されたセルロースやヘミセルロースを、機械的・熱化学的に加水分解する方法や、機械的・熱化学的に加水分解した後、さらに糖化酵素により加水分解する方法知られている。

これまでセルロース含有バイオマスの糖液製造において、固形分や低分子の発酵阻害物質が多い、使用する酵素量が多く製造コストを逼迫するという課題があった。そこで、ナノろ過膜や逆浸透膜で糖液を精製する方法（特許文献３）、精密ろ過膜によって固液分離する方法（特許文献４）、限外ろ過膜を用いて酵素回収する方法（特許文献５）など膜分離を用いて糖液を処理する方法が検討されている。

特開２０１０−３６０５８号公報 特開昭６３−１３７６９１号公報 特開２０１１−２２３９７５号公報 国際公開第２０１０／０６７７８５号 特開平８−３１７７９５号公報

本発明者は、従来技術をもとにセルロース含有バイオマスから糖液を製造する検討を行ってきた。その結果、セルロース含有バイオマスとして木質系バイオマスを利用した場合、木質系バイオマス由来の糖化液に含まれる特定の成分が糖化液を精密ろ過膜および／または限外ろ過膜でろ過する際のろ過の性能を著しく悪化させ、さらに、当該成分は、特に高分子性の膜に対して付着性が高く運転条件により物理洗浄を行っても長期的な運転性を悪化させることを見出した。

本発明では、上述するような課題、すなわち木質系バイオマス由来の糖化液を精密ろ過膜および／または限外ろ過膜でろ過する際のろ過性能を高めることにより、効率的に糖液を製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者は鋭意検討の結果、前述の木質系バイオマス由来の糖化液に含まれる精密ろ過膜および／または限外ろ過膜のろ過性能を著しく悪化させる成分がマンナナーゼによって分解され、その結果、該糖化液の精密ろ過膜および／または限外ろ過膜のろ過性能を高めることができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の［１］から［１０］で構成される。
［１］木質系バイオマスを加水分解処理して得られた液成分にマンナナーゼを反応させて糖化液を得る工程（Ａ）、工程（Ａ）の糖化液を精密ろ過膜および／または限外ろ過膜にてろ過して透過液側から糖液を回収する工程（Ｂ）を含む、糖液の製造方法。
［２］前記木質系バイオマスが針葉樹系バイオマスであることを特徴とする、［１］に記載の糖液の製造方法。
［３］前記工程（Ａ）の加水分解処理が、水熱処理、水蒸気爆砕処理および希酸処理からなる群から選択される１種または２種以上であることを特徴とする、［１］または［２］に記載の糖液の製造方法。
［４］前記工程（Ａ）において、液成分にセルラーゼを反応させることを特徴とする、［１］から［３］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［５]前記工程（Ａ）において、マンナナーゼの添加量が液成分に含まれる全マンノース量（ｇ）に対して０．０１Ｕｎｉｔ／ｇ以上であることを特徴とする請求項［１］から［４］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［６］前記工程（Ｂ）の精密ろ過膜および／または限外ろ過膜の材質の機能面が有機膜であることを特徴とする、［１］から［５］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［７］前記工程（Ｂ）の精密ろ過膜が平均細孔径０．０１〜０．５μｍの精密ろ過膜であることを特徴とする、［１］から［６］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［８］前記工程（Ｂ）の限外ろ過膜が分画分子量５０００〜１５００００の限外ろ過膜であることを特徴とする、［１］から［７］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［９］前記工程（Ｂ）で得られた糖液を分画分子量３００〜１０００の限外ろ過膜にてろ過し、非透過液側からマンノビオースおよび／またはマンノトリオースを含む糖液を回収し、透過液側から単糖を含む糖液を回収する工程（Ｃ）を含むことを特徴とする、［１］から［８］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［１０］［１］から［９］のいずれかに記載の糖液の製造方法において、工程（Ｂ）として限外ろ過膜処理を含み、かつ、限外ろ過膜の非透過液側から回収される酵素成分を利用して工程（Ａ）を行うことを特徴とする、糖液の製造方法。

本発明によって、木質系バイオマス由来の糖化液を精密ろ過膜および／または限外ろ過膜でろ過できることが可能になる。さらに、本発明によって、グルコースやキシロースといった発酵原料である単糖を製造すると同時に有価物としてマンノビオース、マンノトリオースを製造することが可能になり、結果として発酵を利用した化学品製造の低コスト化に貢献することができる。

図１は木質系バイオマス由来の糖化液に対して、精密ろ過膜および限外ろ過膜を組み合わせてマンナナーゼ、セルラーゼを回収しながら膜透過する方法を模式的に書いたプロセスフローである。 図２は木質系バイオマス由来の糖化液に対して、限外ろ過膜を用いてマンナナーゼ、セルラーゼを回収しながら膜透過する方法を模式的に書いたプロセスフローである。 図３は本発明で得られた精密ろ過膜および／または限外ろ過膜の透過液に対しては、分画分子量３００〜１，０００の限外ろ過膜処理でマンノビオース、マンノトリオースと単糖を分離する方法を模式的に書いたプロセスフローである。 図４は本発明で得られた分画分子量３００〜１，０００の限外ろ過膜処理の透過液から単糖濃縮液を得る方法を模式的に書いたプロセスフローである。

以下、本発明を詳細に説明する。

木質系バイオマスとは、茎および根において発達した維管束形成層の分裂活動による肥大成長により、多量の木部を形成され、その細胞壁の多くが木質化して強固になる多年生の植物由来のバイオマスである。木質系バイオマスの具体的な供給源としては、製紙用木材、製紙工場・製材工場残材、未利用間伐材、建設発生木材、廃木材、古紙・廃紙・再生紙類、木屑、樹皮などが挙げられる。

木質系バイオマスの組成としては、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、灰分などから構成される。さらにヘミセルロースとしては、『ウッドケミカルスの技術』（シーエムシー出版）によれば、グルクロノキシラン、アラビノグルクロノキシラン、グルコマンナン、ガラクトグルコマンナン、アラビノガラクタン、ガラクタン、リグニン・炭水化物複合体などからなる。また、これらの単糖組成を調べるために濃硫酸によって加水分解することによってセルロースおよびヘミセルロースは、ほぼ全てのセルロース・ヘミセルロース中の糖が単糖まで加水分解することによって、主にグルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトースの単糖に分解し、単糖組成を知ることができる。本発明では、バイオマスに含まれる多糖成分であるセルロースやヘミセルロースを、加水分解処理および／または酵素処理することにより、発酵原料として利用可能な単糖を含む糖液を製造することができる。

木質系バイオマスは主に針葉樹系バイオマスまたは広葉樹系バイオマス、単子葉植物のうち木質化するバイオマスなどが含まれる。

針葉樹は一般的に寒い地域に多く分布し、多くは常緑樹であり、針のような細い葉を持ち、樹木は背が高く軟らかいものが多い裸子植物門、球果植物綱の樹木を言う。特に本発明の針葉樹とは、マンノース含有量がバイオマスの乾燥重量をベースに２重量％以上１５重量％以下のものである。具体的には、スギ、マツ、モミ、カラマツ、アカマツ、クロマツ、イチイ、イチョウ、イヌマキ、エゾマツ、カヤ、カラマツ、コウヤマキ、サワラ、ツガ、トガサワラ、トドマツ、ネズコ、ヒノキ、ヒバ、ヒメコマツ、トウヒ、クロベ、カリトリス、ビャクシン、フェロスファエラ、エダハマキ、ウラジロモミ、アオモリトドマツ、シラベ、エゾマツ、アカエゾマツ、ネズコ、アスナロ、ヒメコマツなどが例示できるが特に樹種に限定されるものではない。

一方、広葉樹とは葉が広く平たい被子植物に属す木本のことである。中でも本発明の広葉樹とは、マンノース含有量が２重量％未満のものである。具体的には、ナラ、ドノロキ、ヤマナラシ、オニグルミ、サワグルミ、ヤマハンノキ、ミズメ、シラカンバ、マカンバ、アカシデ、アサダ、クリ、シイノキ、ブナ、イヌブナ、アカガシ、シラカシ、イチイガシ、クヌギ、ミズナラ、コナラ、ハルニレ、ケヤキ、ヤマグワ、カツラ、ホオノキ、クスノキ、タブノキ、イスノキ、ヤマザクラ、イヌエンジュ、キハダ、イタヤカエデ、トチノキ、シナノキ、オオバボダイジュ、ヒメシャラ、ハリグリ、ミズキ、シオジ、ヤチダモ、アオダモ、キリ、コジイ、オオバヤナギ、サクラ、ユーカリ、ヤシ、モクレン、ヤナギ、ツツジ、クルミ、ヤマモモ、モクマオウ、サガリバナ、カキノキなどが例示できるが特に樹種に限定されるものではない。

単子葉植物のうち木質化するバイオマスは、竹などが例示できるが、特にこれらに限定されない。

また、上記木質系バイオマスの中には、例えば、幹、樹皮、ＥＦＢ（Ｅｍｐｔｙ Ｆｒｕｉｔ Ｂｕｎｃｈｅｓ）と呼ばれる空果房（実や果肉などは含まない）、木屑、竹の廃材といった非可食のセルロース系未利用資源も含む。

加水分解処理とは、木質系バイオマスを主にヘミセルロース成分およびリグニンを分解することをいう。この加水分解処理によって、これらの成分は単糖、オリゴ糖、多糖などの糖類や、ポリフェノール、芳香族・フラン族成分、有機酸など様々なフラクションに分解される。加水分解処理としては、水熱処理、水蒸気爆砕処理、希酸処理が具体例として挙げられる。

水熱処理とは、特段の酸の添加は行わず、木質系バイオマスが、０．１〜５０重量％となるよう、１００〜４００℃の加圧熱水で、１秒〜６０分処理する方法をいう。処理する木質系バイオマスに接触する時の水の温度は特に制限されない。圧力は処理温度に依存されるため、特に限定されないが好ましくは０．０１〜１０ＭＰａである。

水熱処理では、水の処理温度により熱水への溶出成分が異なる。特開２００２−５９１１８号公報によれば、加圧熱水の温度を上昇させていくと、木質系バイオマスから最初にタンニン、リグニンの第１グループが流出し、次に１４０〜１５０℃以上でヘミセルロースの第２グループが流出し、更に約２３０℃を越えてセルロースの第３グループが流出する。また、流出と同時にヘミセルロース、セルロースの加水分解反応が起こることもある。本加水分解反応については、バイオマスから溶出する酢酸、蟻酸といった有機酸が加水分解処理を補助すると言われている。前記の処理温度による流出成分の違いを利用して、セルロース、ヘミセルロースに対しての後段の酵素による反応効率を向上させる目的などで処理温度を２段階以上の多段反応処理をしてもよい。温度は特に限らないがこの加圧熱水への溶出成分を含んだ水を液成分と呼び、水熱処理を行ったセルロース含有バイオマスから液成分を除いたものを固形分と呼ぶ。液成分と固形分の分離方法は特に限定はされず、分離時の温度も特に限定されない。また、前記２段階以上の多段反応処理の場合は、液成分は段階ごとに２種類以上あってもよく、そのうち２種類以上を混合したものでも良い。固形分と液成分に分けることができるが、酵素（マンナナーゼ、セルラーゼなど）による分解は、バイオマス固形分と液成分を分けてそれぞれ行っても良いし、固形分と液成分を混ぜて行っても良い。

水蒸気爆砕処理とは、高圧水蒸気に木質系バイオマスを曝露させて約１ＭＰａから５ＭＰａ程度までの高圧状態で1秒から１０分間保持し、その後、一気に大気圧に開放する方法を言う。高圧水蒸気によって、前期加水処理と同様に一般的にリグニンを溶解させ、さらに結晶性の低いヘミセルロース成分より加水分解が起き、次いで結晶性の高いセルロース成分が分解される。さらに大気開放状態になることで、バイオマスの組織が一気に破砕され酵素が反応するサイトを増やす効果がある。得られた粉砕バイオマス中にはリグニンや糖の分解物・過分解物が含んでおり、発酵を阻害する固形分・化合物が多量に含まれている。そこで、バイオマスを水や薬液などに浸し固液分離することによって阻害成分を固形分から除去することができる。この固液分離で液成分と固形分に分離することが可能である。酵素（マンナナーゼ、セルラーゼなど）による分解は、バイオマス固形分と液成分を分けてそれぞれ行っても良いし、固形分と液成分を混ぜて行っても良い。

希酸処理とは、硫酸や亜硫酸塩などの酸性水溶液または有機酸水溶液と木質系バイオマスを高温高圧の条件下で処理する方法をいう。一般的にリグニンを溶解させ、さらに結晶性の低いヘミセルロース成分より加水分解が起き、次いで結晶性の高いセルロース成分が分解されるという特徴を有する。特に、水熱処理に比して、酸によりセルロース、ヘミセルロースの加水分解が促進されるため、同じ処理温度の場合、単糖濃度が増加する傾向にある。また、２段階以上の工程を設定することで、ヘミセルロース、セルロースに適した加水分解条件が設定でき、分解効率、および糖収率を向上させることが可能になる。酸処理における、酸の種類について加水分解を起こすものであれば特に限定はされないが、経済性の観点から硫酸、酢酸、クエン酸、乳酸が望ましい。酸の濃度は０．１〜１５重量％であることが好ましく、より好ましくは、０．５〜５重量％である。反応温度は１００〜３００℃の範囲で設定することができる。反応時間は１秒〜６０分の範囲で設定することができる。処理回数は特に限定されず前記処理を１回以上行えばよい。本処理も固形分と液成分に分けることができるが、酵素（マンナナーゼ、セルラーゼなど）による分解は、バイオマス固形分と液成分を分けてそれぞれ行っても良いし、固形分と液成分を混ぜて行っても良い。酸処理によって得られた固形分および液成分は、酸を含んでおり、さらに糖化酵素による加水分解反応を行うため中和を行う必要がある。

なお、上記に挙げた水熱処理、水蒸気爆砕処理、希酸処理は単独で行ってもよいし組み合わせてもよいが、好ましくはいずれかの単独処理であり、より好ましくは水熱処理である。

木質系バイオマスを加水分解して得られる液成分には、前述のとおり、ヘミセルロース、リグニン、タンニン、一部のセルロース成分が溶出している。一方、固形分には、リグニンとヘミセルロース成分の多くが除かれて、主にセルロースが含まれている液成分と固形分は通常の固液分離により分離することができる。

固液分離としては、ろ過分離、遠心分離、沈降分離が具体例として挙げられるが、遠心分離またはろ過分離が好ましい。

遠心分離である場合の加速度は特に限定されないが、低い加速度でも目的が達成できるので、実施容易性やコストの観点から、５００〜４，０００Ｇが好ましく、１，０００〜３，０００Ｇがより好ましい。具体的な装置としては、スクリューデカンタ装置が例示できる。

ろ過分離する場合のろ過方法は特に限定されないが、スクリュープレス、スクリーンフィルタ、ベルトフィルタ、ベルトプレス、フィルタプレスなどが例示できる。また固液分離装置ではなく、水熱処理、水蒸気爆砕処理、希酸処理を行う加水分解装置内にスクリーンやメッシュによるろ過分離や沈降分離、遠心分離機能を有する部位を設けて分離しても構わない。

本発明では、工程（Ａ）として前記液成分にマンナナーゼを処理して糖化液を得ることを特徴とする。液成分をマンナナーゼ処理することで後段の精密ろ過膜および／または限外ろ過膜の膜処理を阻害する木質系バイオマス由来のファウリング物質が分解され、その結果、当該処理をしない場合と比較して後段の精密ろ過膜および／または限外ろ過膜の膜処理の際のろ過性能が格段に向上する。

マンナナーゼとは、β−１，４マンノシド結合を加水分解するエンド型の酵素成分を含む酵素のことである。マンナナーゼは微生物により産生され、例えば、単一の微生物が産生するものであっても、複数の微生物が産生するものであってもよい。マンナナーゼを産生する微生物としては、アスペルギルス属、トリコデルマ属、アクレモニウム属、ペニシリウム属またはバチラス属に属する微生物が具体例として挙げられるが、特にアスペルギルス属に属する微生物が産生するマンナナーゼは活性が高く、好ましく使用される。アスペルギルス属に属する微生物由来のマンナナーゼとしては、アマノエンザイム製の“マンナナーゼＢＧＭアマノ”、新日本科学製の“スミチームＡＣＨ”、エイチビィアイ製の“セルロシンＧＭ５”、ノボザイムジャパン製の“マンナウェイ”などが挙げられる。

前記液成分へのマンナナーゼの添加量は前記ファウリング物質を分解できる範囲においては特に制限はないが、液成分に含有されている全マンノース量（ｇ）に対してろ過性の向上効果が確認できている観点から０．０１Ｕｎｉｔ／ｇ以上であることが好ましい。また、経済性の観点から１００００Ｕｎｉｔ／ｇ以下であることがより好ましい。好ましいマンナナーゼの添加量は、０．０１Ｕｎｉｔ／ｇ以上１００００Ｕｎｉｔ／ｇ以下であり、より好ましくは、０．１Ｕｎｉｔ／ｇ以上１００００Ｕｎｉｔ／ｇ以下である。

なお、前記液成分に含まれる全マンノースの量は、液成分を真空蒸発乾燥させた後、ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６１８『Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass』の記載に則り、濃硫酸および希硫酸によって強制的に全て単糖まで加水分解し、ＨＰＬＣなどを用いてマンノースの量を分析することにより算出することができる。これは、最もマンナナーゼがマンナンに対して反応性が高く、なおかつそれ以上添加しても効果が少ないため、マンナナーゼの使用コストとしても最も優れる値だからである。本マンナナーゼの反応により、マンノトリオース、マンノビオース、マンノースが生成される。また、本発明のマンナナーゼはマンノシダーゼを含まない、またはβ−マンナナーゼに比べて活性ベースで１００分の１以下であることが好ましい。すなわち、マンナンのうち全てを単糖のマンノースまで分解しても、発酵原料として微生物の代謝に利用されないため、発酵産物との分離精製や廃液処理としてコストがかかってしまうためである。そのため、膜で分離しやすいマンノトリオース、マンノビオースとして有価物をつくることができるためである。

前記液成分には、マンナナーゼの効果をさらに促進する酵素としてセルラーゼを添加することが好ましい。セルラーゼとは、セルロースを分解する活性を有する、あるいはセルロースの分解を補助する酵素成分のことを指す。具体的な酵素成分としては、セルビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、バイオマス膨潤酵素などを例示することができる。セルラーゼは微生物により産生され、単一の微生物が産生するセルラーゼであっても、複数の微生物が産生するセルラーゼであってもよい。セルラーゼを産生する微生物としては、トリコデルマ属またはアクレモニウム属に属する糸状菌由来のものが好ましく用いられ、ノボザイム社の“セリック・シーテック”、“セリック・エイチテック”シリーズや、ダニスコジャパン社の“アクセルレース”シリーズ、シグマ・アルドリッチ社の“Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921”、“Cellulase from Trichoderma viride”、“Cellulase from Trichoderma longibrachiatum”、メイジセイカ・ファルマ製の“メイセラーゼ”、“アクレモニウムセルラーゼ”、“ＥＮＭ−３０６４”、“ＥＮＭ−０８１４”、“ＥＮＭ−０１１５”などが例示できる。

セルラーゼ中の各酵素成分の種類、その成分比は特に限定されない。例えば、トリコデルマ・リーセイ由来の培養液には、セルビオハイドロラーゼ、βグルコシダーゼ等が含まれている。なお、βグルコシダーゼは、細胞内又は細胞表層に保持されるため、培養液中のβグルコシダーゼ活性は低くなるので、この場合は、培養上清中にさらに異種又は同種のβグルコシダーゼを添加してもよい。

セルラーゼはマンノースの効果を促進するとともに、前記液成分に含まれるヘミセルロースとセルラーゼの酵素反応によってグルコース、キシロースなどの単糖を得ることができる効果がある。従って、後段で述べる膜分離によって単糖とマンノビオース、マンノトリオースに分離することによって、マンノビオース、マンノトリオースを食品や飼料用途といった有価物として利用することにより、発酵原料の単糖を安価に製造することが可能になる。

工程（Ａ）において、セルラーゼとマンナナーゼを液成分へ添加する順番は、特に限定されないが、液成分にセルラーゼを添加して反応させた後、マンノース添加する方法、または、セルラーゼとマンナナーゼを同時に添加する方法が通常実施される。

工程（Ａ）で得られた糖化液は木質系バイオマス由来の不純物を含むため、本発明では工程（Ｂ）として糖化液を精密ろ過膜および／または限外ろ過膜でろ過して透過液側から糖液を回収する。

精密ろ過膜および／または限外ろ過膜によるろ過方法は特に限定されないが、好ましくはクロスフローろ過である。前記液成分をマンナナーゼで処理しても膜処理時のファウリング成分全てが分解することはなく、一部、固形分として残存してしまうが、クロスフローろ過であれば膜面に水平方向の流れを作って堆積物を減らすことができるため、膜の長期運転性を確保することができる。なお、固形分が約５重量％以上の高濃度で存在する場合には流路閉塞が発生してしまい膜面に液そのものが触れないことがあり得るが、その場合は、固液分離工程を精密ろ過膜および／または限外ろ過膜によるろ過の前に設けることによって、流路閉塞のリスクを回避してもよい。固液分離の具体的方法は特に限定されず、ろ過分離、遠心分離、沈降分離などが例示できるが、金属網、織布、不織布を用いたろ過分離は固形分除去に殆ど効果がないことから、遠心分離、沈降分離が好ましい。より好ましくは、設備スペース、設備費の観点から遠心分離である。

精密ろ過膜とは機能面が多孔性の膜である。多孔性の精密濾過膜とは、機能面が互いに連通する空隙が形成されたスポンジ状の三次元網目構造をなしている膜を言う。例えば、膜機能面が織布、不織布であるものは含まない。ただし、機能面でない基材には織布、不織布が使用されていても構わない。

精密ろ過膜の平均細孔径は０．０１〜０．５μｍの精密ろ過膜であることが好ましい。精密ろ過膜の平均細孔径が０．０１〜０．５μｍであれば、精密ろ過膜処理の後処理として限外ろ過膜処理、ナノろ過膜処理、逆浸透膜処理を行う際に膜ファウリングを低減する効果も得られる。精密濾過膜の平均細孔径は、各分離膜メーカーが提示の公称径を採用してもよいし、実際に測定してもよい。精密濾過膜の平均細孔径を測定する方法として、直接観察法やバブルポイント法を適用できるが、本発明の平均細孔径はバブルポイント法を用いた方法で測定したものとする。バブルポイント法は、膜二次側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力を測定し、使用した液体の表面張力と圧力との関係式から平均細孔径を算出する方法であり、ＡＳＴＭ Ｆ３１６−０３に準拠して測定することが可能である。ＡＳＴＭ Ｆ３１６−０３に準拠した精密ろ過膜の平均細孔径の測定は、例えば、日本ベル株式会社製の貫通細孔分布／ガス透過性解析装置を用いて測定することができる。

精密濾過膜の材質としては、例えば有機膜（例えばセルロース系、芳香族ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリスルホン、ポリフッ化ビニルデン、ポリエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン）、セラミックス、金属などを用いることができる。マンナナーゼおよびセルラーゼによる膜ファウリング効果が顕著であることから、有機膜が好ましく、特にポリフッ化ビニルデンが好ましい。

限外ろ過膜は分画分子量が３００〜２００，０００となる膜のことであり、ウルトラフィルトレーション、ＵＦ膜などと略称されるものである。ここで、限外濾過膜は、孔径が小さすぎて膜表面の細孔径を電子顕微鏡等で計測することが困難であり、平均細孔径の代わりに分画分子量という値を孔径の大きさの指標とすることになっている。分画分子量とは、日本膜学会編 膜学実験シリーズ 第ＩＩＩ巻 人工膜編 編集委員／木村尚史・中尾真一・大矢晴彦・仲川勤 （１９９３ 共立出版） ９２頁に、『溶質の分子量を横軸に、阻止率を縦軸にとってデータをプロットしたものを分画分子量曲線とよんでいる。そして阻止率が９０％となる分子量を膜の分画分子量とよんでいる。』とあるように、限外濾過膜の膜性能を表す指標として当業者には周知のものである。

限外濾過膜の材質としては、微粒子の除去、酵素（マンノースおよびセルラーゼなど）回収の機能を有すれば、特に限定されるものではないが、有機膜（セルロース、セルロースエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、塩素化ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリフッ化ビニリデン、ポリ４フッ化エチレン等の有機材料）、金属膜（ステンレスなど）、セラミック材料（アルミナ、ジルコニアなど）が挙げられる。マンナナーゼおよびセルラーゼによる膜ファウリング効果が顕著であることから、有機膜が好ましく、特にポリフッ化ビニルデン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンが好ましい。

限外濾過膜の形態は特に限定されるものではなく、平膜、中空糸いずれであってもよい。前記糖化液を限外ろ過膜に通じてろ過する場合、前記液成分に反応させた酵素成分（マンナナーゼ、セルラーゼ）を回収することも可能であり、本発明のプロセスコストが大幅に低減できる。本発明で使用される酵素成分は分子量が５０００〜１５００００の範囲にあり、これらを阻止することができる分画分子量を有する限外ろ過膜、具体的には分画分子量が５０００〜１５００００の範囲の限外ろ過膜を使用することで、酵素成分を非透過液側より回収することができる。分画分子量５０００〜１５００００の範囲の限外ろ過膜としては、東レ株式会社の“トレフィル”ＨＦＵシリーズ、旭化成株式会社の“マイクローザ”ＡＩＰシリーズ、ＡＣＰシリーズ、ＡＨＰシリーズ、ＳＩＰシリーズ、ＳＬＰシリーズ、ＤＥＳＡＬ社のＧＭシリーズ、ＰＷシリーズ、ＨＷＳシリーズ、アルファラバル社のＧＲ４０ＰＰ、ＧＲ５１ＰＰ、ＧＲ６０ＰＰ、ＧＲ６１ＰＰ、ＧＲ８１ＰＰ、ＥＴＮＡ１０ＰＰ、ＤＳＳ社のＦＳシリーズ、ＲＣシリーズ、ＡＭＴ社のＥＤ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ社のＰＥＳ１０Ｋ、ＫＯＣＨ社のＨＦＭ−１８０、ＨＦＭ−１８３、ＨＦＭ−２５１、ＨＦＰ−２７６、ＨＦＭ−３００、ＨＦＭ−１１６、ＨＦＭ−１３１、ＨＦＭ−３２８、ＰＭ５Ｋ、ＰＭ１０Ｋ、ＰＭ３０Ｋ、ＰＭ５０Ｋ、ＰＭ１００Ｋ、ＣＭ、ＸＭ５Ｋ、ＸＭ８Ｋ、ＭＰＴ−Ｕ２０、ＭＰＴ−Ｕ２０Ｐ、ＭＰＴ−Ｕ２０Ｓ、Ｓｙｎｄｅｒ社のＳＰＥ５、ＳＰＥ１０、ＳＰＥ３０、ＳＰＥ１００、ＳＰＶ５、ＳＰＶ５０、ＳＰＶ１００、ＳＯＷ３０などが例示できる。

回収された酵素成分は、精密ろ過膜および／または限外ろ過膜処理の前に反応させて再利用することで、工程（Ａ）における酵素使用量を削減することができる。特に工程（Ｂ）として限外ろ過膜を使用する場合、図１および２に示すように限外ろ過膜の非透過液側から回収される酵素成分に連続的に木質系バイオマスの液成分を投入することで、工程（Ａ）および（Ｂ）を連続的に実施することが可能になり、連続化による設備コスト低減をすることが可能になる。

精密ろ過膜および／または限外ろ過膜の透過液に対しては、図３に示すようにさらに工程（Ｃ）として分画分子量３００〜１，０００の限外ろ過膜処理を行うことが好ましい。本処理を行うことによってマンナナーゼで分解されたマンノビオース、マンノトリオースを膜の非透過液側に、グルコース、キシロースなどの単糖を膜の透過液側に分離することが可能になる。結果として、非透過液成分を食品・飼料用途に、透過液成分を発酵原料として利用することが可能になる。分画分子量３００〜１，０００の限外ろ過膜の材質としては、例えば有機膜（芳香族ポリアミド、ピペラジンポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、スルホン化ポリスルホン、ポリフッ化ビニルデン、ポリエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン）、セラミックス、金属などを用いることができるが、孔径制御の観点から、芳香族ポリアミド、ピペラジンポリアミド、ポリビニルアルコール、スルホン化ポリスルホンが好ましい。使用する限外濾過膜の形態は特に限定されるものではなく、スパイラル型、中空糸型、チューブラー型、平膜型のいずれであってもよい。

分画分子量が３００〜１０００の範囲の限外濾過膜の具体例としては、ＤＥＳＡＬ社のＧ−５タイプ、ＧＥタイプ、Ｓｙｎｄｅｒ社のＳＰＥ１、ＫＯＣＨ社製のＰＭ１０００、ＰＭ２０００、ＭＰＳ−３６、ＳＲ２、アルファラバル製ＧＲ９５Ｐｐ、ＥＴＮＡ０１ＰＰ、日東電工株式会社製のＮＴＲ−７４５０（分画分子量６００〜８００、文献ＷａｔｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ３７（２００３）８６４−８７２に記載）、ＮＴＲ−７４１０（分画分子量１，０００、第５回衛生工学シンポジウム６−４に記載）、Ｓｙｎｄｅｒ社のＮＦＧ（分画分子量６００〜８００）、ＮＦＷ（分画分子量３００〜５００）などが挙げられる。使用する分画分子量３００〜１０００の限外ろ過膜の形態は特に限定されるものではなく、スパイラル型、中空糸型、チューブラー型、平膜型のいずれであってもよい。

また、マンノビオース、マンノトリオースの精製手段としては、特に上記に限定はされない。例えば単糖とマンノビオース、マンノトリオースが混合された状態で発酵を行い、グルコース・キシロースが消費された後の液を利用し、当該液からマンノビオース、マンノトリオースを分画分子量３００〜１，０００の限外ろ過膜処理を利用して回収してもかまない。

精密ろ過膜および／または限外ろ過膜の透過液は、ナノろ過膜および／または逆浸透膜に通じてろ過することで透過液に含まれる単糖を濃縮することが好ましい。具体的には、図４に示すように、精密ろ過膜および／または限外ろ過膜の透過液を、一度分画分子量３００〜１，０００の限外ろ過膜処理し透過液を得て、さらにナノろ過膜および／または逆浸透膜処理を行って膜非透過液として単糖主体の糖濃縮液を得る方法である。ナノろ過膜および／または逆浸透膜で単糖を濃縮することにより、ＷＯ２０１０／０６７７８５号に記載のとおり、液成分中に含まれる蟻酸、酢酸、ＨＭＦ、フルフラール、バニリンなどの発酵阻害物質を膜透過側に除去しながら単糖を濃縮する機能を有しており、同時に単糖を濃縮することが可能である。

ナノろ過膜とは、ナノフィルター（ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜）とも呼ばれるものであり、”一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられる。ナノ濾過膜の具体例としては、ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製のＧＥｓｅｐａ ＤＫシリーズ、ＨＬシリーズ、アルファラバル社製のＮＦ９９又はＮＦ９９ＨＦ、フィルムテック社製のＮＦ、ＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００、ＮＦ−２７０又はＮＦ−４００、東レ株式会社製ＳＵ−２００シリーズ、ＳＳＵ−６００シリーズ（ＳＵ６１０，ＳＵ６２０など）が挙げられる。日東電工株式会社製のＮＴＲ７６９ＳＲ、ＮＴＲ−７２９ＨＦ、ＮＴＲ７２５０、ＮＴＲ−７２５ＨＦが挙げられる。

逆浸透膜とは、ＲＯ膜とも呼ばれるものであり、”１価のイオンを含めて脱塩機能を有する膜」と一般に定義される膜である。数オングストロームから数ナノメートル程度の超微小空隙を有していると考えられる膜で、主として海水淡水化や超純水製造などイオン成分除去に用いられる。

逆浸透膜の具体例としては、例えば、東レ株式会社製の超低圧タイプのＳＵＬ−Ｇシリーズ、低圧タイプのＳＵ−７００シリーズ、高圧タイプのＳＵ−８００シリーズ、酢酸セルロースタイプのＳＣ−Ｌ１００Ｒ、ＳＣ−Ｌ２００Ｒ、ＳＣ−１０００シリーズ、ＳＣ−２０００シリーズ、ＳＣ−３０００、ＳＣ−３２００、ＳＣ−８０００シリーズ、日東電工（株）製ＮＴＲ−７５９ＨＲ、ＮＴＲ−７０ＳＷＣ、ＥＳ１０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｕ、ＥＳ１５−Ｄ、ＥＳ１５−Ｕ、ＬＦ１０−Ｄ、アルファラバル製ＲＯ９８ｐＨｔ、ＲＯ９９、ＨＲ９８ＰＰ、ＣＥ４０４０Ｃ−３０Ｄ、ＧＥ製ＧＥ Ｓｅｐａ、Ｆｉｌｍｔｅｃ製ＢＷ３０−４０４０、ＴＷ３０−４０４０、ＸＬＥ−４０４０、ＬＰ−４０４０、ＬＥ−４０４０、ＳＷ３０−４０４０、ＳＷ３０ＨＲＬＥ−４０４０、ＫＯＣＨ製ＴＦＣ−ＨＲ、ＴＦＣ−ＵＬＰ、ＴＲＩＳＥＰ製ＡＣＭ−１、ＡＣＭ−２、ＡＣＭ−４、東洋紡製のＨＡ５３３０、ＨＳ５３３０、ＨＫＣ３０３５、ＨＳ５２０５Ａ、ＣＭ１０などが挙げられる。

使用するナノろ過膜、逆浸透膜の形態は特に限定されるものではなく、スパイラル型、中空糸型、チューブラー型、平膜型のいずれであってもよい。

得られた単糖は発酵を用いた化学品生産に利用される。発酵工程により得られる化学品としては、上記微生物や培養細胞が培養液中に生産する物質であれば制限はなく、具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、ブタノール、１，３−プロパンジオール、２，３−ブタンジオール、１,４−ブタンジオール、グリセロールなど、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、核酸であれば、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、またカダベリンなどのジアミン化合物を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。

（参考例１）糖濃度の測定方法
各実施例、比較例において得られた糖液に含まれる糖濃度（グルコース濃度、キシロース濃度、マンビオース、マンノトリオース濃度）は、以下に示す条件でＨＰＬＣにより分析し、標品との比較により定量した。
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ―５０ ４Ｅ（Ｓｈｏｄｅｘ製）
移動相：超純水：アセトニトリル＝２５：７５（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：フェニルヒドラジン
検出方法：蛍光検出法
温度：３０℃。

（参考例２）フラン系・芳香族系化合物の濃度の測定方法
糖液に含まれるフラン系化合物（ＨＭＦ、フルフラール）及びフェノール系化合物（バニリンなど）の濃度は、以下に示す条件でＨＰＬＣにより分析し、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ＨｉｄｒｏＲＰ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製）
移動相：アセトニトリル−０．１％Ｈ３ＰＯ４（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：ＵＶ（２８３ｎｍ）
温度：４０℃。

（参考例３）有機酸の濃度の測定方法
糖液に含まれる有機酸（酢酸、ギ酸）は、以下に示す条件でＨＰＬＣにより分析し、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−ＨとＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＣＲ１０１Ｈ（株式会社島津製作所製）の直列
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。

（参考例４）濁度の測定方法
糖液の濁度は、ＨＡＣＨ社製室内用高度濁度計（２１００Ｎ）を用いて定量した。なお、この濁度計は、１０００ＮＴＵ以下の濁度でなければ測定できないため、必要に応じて糖液を蒸留水で希釈し、測定を行った。測定できた値を希釈率で割った値を濁度とした。

（参考例５）ＳＳ濃度の測定方法
糖液のＳＳ濃度は、ＪＩＳ Ｋ０１０２ １４．１（２００８年）に準拠して測定した。ガラス繊維ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製 ＧＳ−２５）を１０５℃で２時間加熱し、ガラス繊維ろ紙の重量（重量ａ）を測定した。乾燥させたガラス繊維ろ紙を濾過用フィルターホルダー（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製 ＫＰ−４７Ｓ）にセットし、サンプル液ＶｍＬ（２〜１０ｍＬ）を吸引濾過した。再度ガラス繊維ろ紙を１０５℃で２時間加熱した後に重量（重量ｂ）を測定し、ＭＬＳＳ濃度を次の式１にて算出した。
ＳＳ濃度［ｍｇ／Ｌ］＝（ｂ−ａ）［ｍｇ］／Ｖ［ｍＬ］×１０００ （式１）。

（参考例６）液成分に含まれる全マンノース濃度の測定方法
ＮＲＥＬが発行しているＬＡＰ法（“Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass, Laboratory Analytical Procedure(LAP)”）を参考に以下に示す方法で組成を分析した。

試料の適量を分取し、赤外線水分計（ケット科学研究所製、ＦＤ−７２０）を使用して１２０℃に保持し、蒸発後の安定値と初期値の差分から得られる値から含水率を測定した。

次に分析液をステンレス型バット上で真空乾燥し、バットから全量剥ぎ取り、絶乾重量補正することによって、各成分の絶乾ベースでの含有量を算定した。この絶乾した分析用試料を０．３ｇを７２％硫酸３ｍＬを加え、３０℃で１時間攪拌した。この反応液を精製水８４ｍＬで耐圧瓶に移した後、１２０℃で１時間、オートクレーブで加熱分解した。加熱分解後、分解液と残渣をろ別し、ろ液と残渣の洗液に加えて１００ｍＬに定容したものを検液とした。検液中の単糖（キシロース・マンノース・グルコース）について、参考例１の方法で定量を行った。得られた分解液の単糖濃度と絶乾試料分解量から、分析液中の構成糖量から、その一項目してマンノース含有率が算定され、さらに事前に測定した含水率値を用いて液成分中に存在する全マンノース濃度を以下の式１にて算出し求めた。

なお、マンノースの構成糖量については、加熱分解時の糖過分解補正係数（Ｓｆ：サバイバルファクター、マンノースの場合１．０６）を用いて構成糖量を補正した。
全マンノース濃度（ｇ／Ｌ）＝（１００−含水率（%））×マンノース含有率(%)÷１０（式１）。

（実施例１）木質系バイオマスの水熱処理による加水分解物の液成分（水熱処理液）
工程（１）の木質系バイオマスを水熱処理によって加水分解処理する方法について例を挙げて説明する。木質系バイオマスとして、針葉樹であるスギ、マツ、広葉樹であるユーカリの３種類の木屑を使用した。前記木質系バイオマスを水に浸し、攪拌しながら２００℃で１０分間オートクレーブ処理（日東高圧株式会社製）した。処理後は５０℃まで冷却した後、液成分（以下、水熱処理液）と固形分に遠心分離（１５００Ｇ）を用いて固液分離した。水熱処理液のｐＨはそれぞれ共に３．８であった。各水熱処理液の濃度を示す。水熱処理液の成分を表１に濁度およびＳＳ濃度、全マンノース濃度を表２に示す。

次に水熱処理液に対して水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを５．０に調製した後、２つに分け、一方（液量１Ｌ）はマンナナーゼである“マンナナーゼ ＢＧＭ（アマノ）”（天野エンザイム製）を０．２ｇ添加し、もう一方（液量１Ｌ）は“マンナナーゼ ＢＧＭ（アマノ）”（天野エンザイム製）を０．２ｇ加え、さらにセルラーゼである”アクセルレース デュエット”（ダニスコジャパン製）を２ｍＬ添加して酵素反応を５０℃で２４時間行った。それぞれ液を糖化液Ａ、糖化液Ｂと称す。本来はクロスフローろ過で測定するべきだが、検討のしやすさのため、一旦、６０００Ｇで遠心して概ね固形分を除去した後、精密ろ過膜である材質がＰＶＤＦの平膜である東レ株式会社製“メンブレイＴＭＲ１４０”（登録商標）（孔径：０．０８μｍ）を用いてデッドエンドろ過を行って精密ろ過膜のろ過性を加速試験として評価した。ろ過面積は直径４ｍｍφの円状に切り出して使用した。ろ過性を評価する指標としては、膜面に液を常に浸した状態で５０ｋＰａを加圧し、加圧開始より０〜１分でろ過できた液量と、１〜２分（さらに１分間）でろ過できた液量を測定した。ろ過前の濁度とそれぞれのろ過液量の結果を表３（糖化液Ａの場合）および表４（糖化液Ｂの場合）に示す。糖化液Ａ又はＢを調製する際のマンナナーゼ添加量は、液成分に含まれる全マンノース量（ｇ）に対して、スギ：７１Ｕｎｉｔ／ｇ、マツ：６７Ｕｎｉｔ／ｇ、ユーカリ：２００Ｕｎｉｔ／ｇであった。

（比較例１）酵素を無添加またはセルラーゼ添加して精密ろ過膜でろ過した場合
実施例１で得られたスギおよびマツの水熱処理液（ｐＨ５）１Ｌにセルラーゼである“アクセルレース デュエット”（ダニスコジャパン製）を２ｍＬ添加して酵素反応を５０℃で２４時間行い、糖化液Ｃを得た。実施例１で得られたスギ、マツ、ユーカリの水熱処理液（ｐＨ５）および糖化液Ｃ（スギ、マツ）を６０００Ｇで遠心して概ね固形分を除去した後、精密ろ過膜である材質がＰＶＤＦの平膜の東レ株式会社製“メンブレイＴＭＲ１４０”（登録商標）（孔径：０．０８μｍ）を用いてデッドエンドろ過を行って精密ろ過膜のろ過性を加速試験として評価した。ろ過面積は直径４ｍｍφの円状に切り出して使用した。ろ過性を評価する指標としては、膜面に液を常に浸した状態で５０ｋＰａを加圧し、加圧開始より０〜１分でろ過できた液量と、１〜２分（さらに１分間）でろ過できた液量を測定した。結果を表５および６に示す。結果から、酵素添加なし、およびセルラーゼ添加では精密ろ過膜を適用することは極めて困難であることがわかった。

（比較例２）織布、スクリーン、不織布でろ過した場合
実施例１で得られたスギおよびユーカリの水熱処理液（ｐＨ５）、糖化液Ａに対して６０００Ｇで遠心して概ね固形分を除去した後、様々なろ過面を適用し検討を行った。織布としては、Ｔ２７３１Ｃ（敷島カンバス製、ポリエステル、二重織、通気度１．６７ｃｃ／ｃｍ^２・ｓｅｃ）、ＰＰ９３４Ｋ（中尾フィルター製、ポリプロピレン、二重織、通気度０．３ｃｃ／ｃｍ^２・ｓｅｃ）を利用し、スクリーンとしては金属メッシュ２０ミクロン（飯田工業株式会社製、綾織）を直径４ｍｍφの円状に切断して利用し、不織布としては不織布膜Ｇ−２２６０−３Ｓ（東レ株式会社製、ポリエステル、通気度１１ｃｃ／ｃｍ^２・ｓｅｃ）を利用した。ろ過した結果を表７および８に示す。結果から、ろ過性の向上はろ材により有意な差があることがわかり、実施例１との比較から、木質系バイオマスの加水分解物においては、特に精密ろ過膜において、マンナナーゼ添加によるろ過効果があることがわかった。

（比較例３）草本系バイオマスを使用した場合
実施例１の比較として草本系バイオマスを水熱処理によって加水分解処理する方法について例を挙げて説明する。草本系バイオマスとして、サトウキビの搾りかすであるバガスを使用した。前記草本系バイオマスを水に浸し、攪拌しながら１８０℃および２００℃の２条件で１０分間オートクレーブ処理（日東高圧株式会社製）した。１８０℃の条件を加えたのは、草本系のヘミセルロースは一般的に木質系よりも分解されやすいことが知られているため同等の処理として設定した。処理後は５０℃まで冷却した後、液成分（以下、バガス水熱処理液）と固形分に遠心分離（１５００Ｇ）を用いて固液分離した。バガス水熱処理液のｐＨはそれぞれ共に３．６、３．２であった。各水熱処理液の濃度を示す。水熱処理液の成分を表９に濁度およびＳＳ濃度、全マンノース濃度を表１０に示す。

固液分離で得られた水熱処理液に対して水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを５．０に調製した後、液量１Ｌに対してマンナナーゼである“マンナナーゼ ＢＧＭ（アマノ）”（天野エンザイム製）を０．２ｇ添加して酵素反応を５０℃で２４時間行った。得られた液を一旦、６０００Ｇで遠心して概ね固形分を除去した後、精密ろ過膜である材質がＰＶＤＦの平膜東レ株式会社製“メンブレイＴＭＲ１４０”（登録商標）（孔径：０．０８μｍ）を用いてデッドエンドろ過を行って精密ろ過膜のろ過性を加速試験として評価した。ろ過面積は直径４ｍｍφの円状に切り出して使用した。ろ過性を評価する指標としては、膜面に液を常に浸した状態で５０ｋＰａを加圧し、加圧開始より０〜１分でろ過できた液量と、１分〜２分（さらに１分間）でろ過できた液量を測定した。加水分解処理１８０℃および２００℃の場合について、ろ過前の濁度とろ過液量の結果を表１１（水熱処理液）および表１２（マンナナーゼ添加後）に示す。

実施例１との比較結果から、草本系バイオマスの水熱処理液においては、バイオマス中にマンノースは含まれているが、マンナナーゼ添加による効果は少ないことが判明した。

（実施例２）加水分解処理として水蒸気爆砕処理、希酸処理を施した場合
工程（１）の木質系バイオマスとしてスギを用いて水蒸気爆砕処理または希酸処理により加水分解した。水蒸気爆砕処理としては、水熱爆砕装置（日本電熱株式会社製、３０Ｌサイズ）に、スギの木屑を投入して蒸気を導入し、３．５ＭＰａを２．５分間維持して水蒸気爆砕処理を行った。この水蒸気爆砕処理したスギを直ちに水に添加し、最終的に固形分１０質量％になるようにして水を追加で添加し攪拌して１５００Ｇで１分の遠心分離で固形分と液成分に分離した。本液成分を爆砕処理加水分解物と称す。

希酸処理としては、スギの木屑を硫酸の０．５％水溶液に固形分濃度２０ｗｔ％で浸し、１７０℃の温度で１０分間オートクレーブ処理（日東高圧株式会社製オートクレーブを使用）した。処理後、１５００Ｇで１分の遠心分離で固形分と液成分に分離した。得られた液成分を希酸処理化水分解物と称す。それぞれの液成分に関する組成、ＳＳ濃度、濁度を表１３および１４に示す。

得られた希酸処理化水分解物、爆砕処理加水分解物に対して水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを５．０に調製した後、２つに分け、一方（液量１Ｌ）はマンナナーゼである“マンナナーゼ ＢＧＭ（アマノ）”（天野エンザイム製）を０．２ｇ添加し、もう一方（液量１Ｌ）は“マンナナーゼ ＢＧＭ（アマノ）”（天野エンザイム製）を０．２ｇ加え、さらにセルラーゼである“アクセルレース デュエット”（ダニスコジャパン製）を２ｍＬ添加して酵素反応を５０℃で２４時間行った。その後実施例１と同様の方法による精密ろ過膜のろ過性評価とろ過前の濁度を測定した。結果を表１５および１６に示す。マンナナーゼの添加量は、各々の加水分解物含まれる全マンノース量（ｇ）に対して計算すると、水蒸気爆砕処理加水分解物の調製液:１６７ｇ、希酸処理液加水分解物の調製液:１６７Ｕｎｉｔ／ｇであった。

（比較例４）加水分解処理として水蒸気爆砕処理、希酸処理を施した場合
実施例２で得られたｐＨ５に調製した各々の加水分解物について、実施例１と同様の方法による精密ろ過膜のろ過性評価とろ過前の濁度を測定した結果を表１７に示す。

実施例１、２との比較結果から、木質系バイオマスを水蒸気爆砕処理または希酸処理して得られる加水分解物においても本発明の効果が得られることがわかった。

（実施例３）マンナナーゼ添加量の検討
実施例１で使用したスギの木屑を水熱処理して得られた水熱処理液（ｐＨ５、全マンノース濃度２８ｇ／Ｌ）１Ｌについて、“マンナナーゼ ＢＧＭ（アマノ）”（天野エンザイム製）（ガラクトマンナン活性濃度：１０，０００Ｕｎｉｔ／ｇ）の添加量を０．２８ｍｇ、２．８ｍｇ、２８ｍｇ、２８０ｍｇ、２．８ｇを添加した液について、それぞれ実施例１と同様の方法による精密ろ過膜のろ過性評価とろ過前の濁度を測定した。結果を表１８に示す。表１８に記載のとおり、マンナナーゼ添加量は、水熱処理液に含まれる全マンノース量（ｇ）に対して、０．０１Ｕｎｉｔ／ｇ、０．１Ｕｎｉｔ／ｇ、１．０Ｕｎｉｔ／ｇ、１０Ｕｎｉｔ／ｇ、１００Ｕｎｉｔ／ｇ、１０００Ｕｎｉｔ／ｇであった。

（参考例７）セルラーゼ酵素液中のマンナナーゼ量分析
セルラーゼ中に入っているマンナナーゼの効果が影響していないか確認するため、セルラーゼ酵素液である“アクセルレース デュエット”（ダニスコジャパン製）のガラクトマンナン活性を測定したところ、０．０８４Ｕｎｉｔ／ｍＬであった。これは０．００６Ｕｎｉｔ／ｇに相当し、セルラーゼ中のマンナナーゼの影響は極めて少ないと言える。

（実施例４）精密ろ過膜処理の長期安定性試験＜無機膜、有機膜＞
実施例１で得られたスギの木屑の糖化液Ａ、Ｂを精密ろ過膜でクロスフローろ過し、長期安定性を評価した。本検討は無機膜、有機膜それぞれで実施した。有機膜としては精密ろ過膜“トレフィルＨＦＭ”（東レ株式会社製、材質：ＰＶＤＦ、孔径：０．１μｍ）を、無機膜としては、精密ろ過膜“ＭＥＭＢＲＡＬＯＸ”（ＰＡＬＬ製、材質：、孔径：０．２μｍ）について、膜面積を０．２４ｍ^２としてろ過を行った。膜面線速度は３０ｃｍ／秒、膜ろ過速度は０．５ｍ／Ｄとして、糖化液Ａ、Ｂそれぞれ４０Ｌを用意し、ろ過圧力（膜間差圧）が１００ｋＰａに到達するまでろ過を行った。その後、膜を水洗浄し、残った糖化液Ａ、Ｂの液をもう一度ろ過を行い再度１００ｋＰａに到達するまでろ過を行った。運転開始直後、水洗浄し運転再開直後のろ過圧力値を表１９に示す。また、１００ｋＰａに到達した時間を表２０に示す。

（比較例４）精密ろ過膜処理の長期安定性試験＜酵素無添加でろ過した場合＞
実施例１で得られたスギの木屑の水熱処理液（ｐＨ５）を実施例４と同様に精密ろ過膜でクロスフローろ過し、長期安定性を評価した。運転開始直後、水洗浄し運転再開直後のろ過圧力値を表２１に示す。また、１００ｋＰａに到達した時間を表２２に示す。

実施例４との比較から開始直後の圧力が高く、すぐに１００ｋＰａに達してしまいファウリングの懸念が大きく、また、精密ろ過膜として有機膜を使用した場合の効果がより顕著であることが判明した。

（実施例５）酵素処理液からのマンノビオース、マンノトリオースと単糖の分離
実施例１の条件で糖化液Ｂを精密ろ過膜処理し、さらにＧＥ社製のクロスフロー型ろ過装置ＳＥＰＡＩＩに限外ろ過膜ＰＷ（ＧＥ製、材質：ポリエーテルサルホン、分画分子量１０，０００）を装着してろ過をしたところ、表２３の組成の糖液を得た。

このろ液をさらに２つに分けて、ＧＥ社製のクロスフロー型ろ過装置ＳＥＰＡＩＩに限外ろ過膜ＮＴＲ−７４５０（日東電工株式会社製、材質：スルホン化ポリエーテルスルホン、分画分子量：６００〜８００）、ＳＰＥ１（Ｓｙｎｄｅｒ製、材質：ポリエーテルスルホン、分画分子量：１，０００）それぞれでろ過し６倍濃縮した。結果を各膜についてそれぞれ表２４および２５に示す。

濃縮側の組成は表２３の濃度以下になっていないが、加水ろ過、すなわち、ダイアフィルトレーションろ過することによって、マンノビオース、マンノトリオースに富む液にすることが可能であった。

（実施例６）限外ろ過膜による連続ろ過
実施例１で作成した水熱処理液（ｐＨ５）を利用して、連続的に糖化・酵素回収を行う例を示す。１Ｌのタンクに５００ｍＬの水熱処理液を滞留させ、中に“マンナナーゼ ＢＧＭ（アマノ）”（天野エンザイム製）を０．１ｇ、セルラーゼである“アクセルレース デュエット”（ダニスコジャパン製）を１ｍＬ添加して連続１０時間でろ過を行った。限外ろ過膜“マイクローザＳＬＰ−００５３”（旭化成株式会社製、材質：ポリスルホン、分画分子量：１０，０００）を利用した。タンクを５０度に保持した状態で運転開始４時間はモジュールとタンクを循環するだけ行い、その後、５ｍＬ／分の時間でろ過を開始し、同時に、同量の５ｍＬ／分の量でタンクに水熱処理液を補給しつづけた。タンク温度は常に５０℃で保持した。ろ過開始から０時間後、１時間後、５時間後、１０時間後のろ過液の糖液の組成を表２６に示すとおりで、常にほぼ同じ組成の糖液が得られることが判明した。すなわち、限外ろ過膜によってマンナナーゼ、セルラーゼを回収しながら膜の非透過側およびタンクに酵素を保持した状態で水熱処理液を連続的にマンノビオース、マンノオリゴ糖を生成しながらろ過できていた。マンノビオース、マンノオリゴ糖の濃度結果も実施例５の表２３と同等であり、糖化と酵素回収、さらには膜処理を一体化できることが判明した。また膜処理中の操作圧力も特に増加は見られず、連続して本プロセスが運転できることがわかった。

（比較例６）限外ろ過膜による連続ろ過（液成分）
実施例６と同様の方法で酵素を添加せずにろ過を実施した。その結果、９０分後にろ液が出なくなり、ろ過が行えなくなった。

（実施例７）広葉樹由来の農林廃棄物である油ヤシ空果房を使用した場合
実施例１および２の方法と同様に、木質系バイオマスとして、油ヤシ空果房について、実施例１および２と同様の方法（すなわち、水熱処理、水蒸気爆砕処理、希酸処理）で、工程（１）加水分解処理する方法について例を挙げて説明する。

水熱処理については、油ヤシ空果房を水に浸し、攪拌しながら２００℃で１０分間オートクレーブ処理（日東高圧株式会社製）した。処理後は５０℃まで冷却した後、液成分（以下、水熱処理液）と固形分に遠心分離（１５００Ｇ）を用いて固液分離した。水熱処理液のｐＨはそれぞれ共に３．８であった。

水蒸気爆砕処理については油ヤシ空果房を投入して蒸気を導入し、３．５ＭＰａを２．５分間維持して水蒸気爆砕処理を行った。この水蒸気爆砕処理したスギを直ちに水に添加し、最終的に固形分１０質量％になるようにして水を追加で添加し攪拌して１５００Ｇで１分の遠心分離で固形分と液成分に分離した。本液成分を爆砕処理加水分解物と称す。

希酸処理としては、油ヤシ空果房を硫酸の０．５％水溶液に固形分濃度２０ｗｔ％で浸し、１７０℃の温度で１０分間オートクレーブ処理（日東高圧株式会社製オートクレーブを使用）した。処理後、１５００Ｇで１分の遠心分離で固形分と液成分に分離した。得られた液成分を希酸処理化水分解物と称す。それぞれの液成分に関する組成、ＳＳ濃度、濁度を表２７および２８に示す。

次に得られた水熱処理液、爆砕処理加水分解物、希酸処理化水分解物に対して水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを５．０に調製した後、２つに分け、一方（液量１Ｌ）はマンナナーゼである“マンナナーゼ ＢＧＭ（アマノ）”（天野エンザイム製）を０．２ｇ添加し、もう一方（液量１Ｌ）は“マンナナーゼ ＢＧＭ（アマノ）”（天野エンザイム製）を０．２ｇ加え、さらにセルラーゼである”アクセルレース デュエット”（ダニスコジャパン製）を２ｍＬ添加して酵素反応を５０℃で２４時間行った。それぞれ液を糖化液Ｅ、糖化液Ｆと称す。本来はクロスフローろ過で測定するべきだが、検討のしやすさのため、一旦、６０００Ｇで遠心して概ね固形分を除去した後、精密ろ過膜である材質がＰＶＤＦの平膜である東レ株式会社製“メンブレイＴＭＲ１４０”（登録商標）（孔径：０．０８μｍ）を用いてデッドエンドろ過を行って精密ろ過膜のろ過性を加速試験として評価した。ろ過面積は直径４ｍｍφの円状に切り出して使用した。ろ過性を評価する指標としては、膜面に液を常に浸した状態で５０ｋＰａを加圧し、加圧開始より０〜１分でろ過できた液量と、１〜２分（さらに１分間）でろ過できた液量を測定した。ろ過前の濁度とそれぞれのろ過液量の結果を表３（糖化液Ｅの場合）および表４（糖化液Ｆの場合）に示す。糖化液Ｅ，Ｆを調整する際に添加されたマンナナーゼ量は、それぞれの液成分に含まれる全マンノース量（ｇ）に対して、水熱処理：８０ｕｎｉｔ／ｇ、水蒸気爆砕処理：６７Ｕｎｉｔ／ｇ、希酸処理：５０Ｕｎｉｔ／ｇであった。

（比較例７）油ヤシ空果房の加水分解物液成分、酵素添加なしの場合
実施例７で得た油ヤシ空果房の水熱処理液、爆砕処理加水分解物、希酸処理化水分解物を実施例７と同様に精密ろ過膜でクロスフローろ過し、各々実施例１と同様の方法による精密ろ過膜のろ過性評価とろ過前の濁度を測定した結果を表３１に示す。

実施例７との比較結果から、油ヤシ空果房を加水分解処理して得られる液成分においても本発明の効果が得られることがわかった。

（比較例８）農林廃棄物でもある油ヤシ空果房に加水分解処理せずマンナナーゼを適用した場合
実施例７で検討を行った油ヤシ空果房について、加水分解処理を行わずにマンナナーゼ処理を行った場合について示す。なお、油ヤシ空果房中（乾燥ベース）に存在する全マンノース量については、参考例６の方法を用いて、分析した結果、２５ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ油ヤシ空果房と判明した。

実施例７で使用した油ヤシ空果房に対して固形分濃度２０％になるように水を加水し攪拌しながら３規定の酢酸ナトリウムでｐＨを５．０に調製した後、３つに分け、それぞれ糖化液Ｇ（液量１Ｌ）としてマンナナーゼである“マンナナーゼ ＢＧＭ（アマノ）”（天野エンザイム製）を０．２ｇ添加した液、糖化液Ｈ（液量１Ｌ）として“マンナナーゼ ＢＧＭ（アマノ）”（天野エンザイム製）を０．２ｇ加えさらにセルラーゼである”アクセルレース デュエット”（ダニスコジャパン製）を２ｍＬ添加した液、無添加液（液量１Ｌ）として酵素を添加しない液を調整した。糖化液Ｇ，糖化液Ｈ、無添加液をｐＨ５．０に調整し、５０℃で２４時間保持した。反応後、６０００Ｇで遠心して概ね固形分を除去した後、実施例６と同様の方法で精密ろ過膜のろ過性の加速試験評価を行った。実施例６と同様に、加圧開始より０〜１分でろ過できた液量と、１〜２分（さらに１分間）でろ過できた液量を測定した。ろ過前の濁度とそれぞれのろ過液量の結果を表３２に示す。得られたマンノース、マンノビオース、マンノトリオースの濃度についても記す。

表の結果から、油ヤシ空果房そのものを加水分解処理しても効果は得られず、酵素添加によりろ過性が悪化することが分かった。

本発明によって、木質系バイオマスから低コストかつ高品質な糖（単糖、マンノビオース・マンノトリオース）を得ることができ、該単糖液を発酵原料とすることができる。

１ 酵素糖化槽
２ 分画分子量５０００〜１５０，０００の限外ろ過膜
３ 回収酵素
４ 糖化液
５ 精密ろ過膜
６ 固形分
７ 分画分子量３００〜１，０００の限外ろ過膜
８ マンノビオース、マンノトリオース水溶液
９ 単糖糖液
１０ ナノろ過膜／逆浸透膜
１１ 発酵用濃縮液
１２ 発酵阻害物質

Claims (10)

1. 木質系バイオマスを加水分解処理して得られた液成分にマンナナーゼを反応させて糖化液を得る工程（Ａ）、工程（Ａ）の糖化液を精密ろ過膜および／または限外ろ過膜にてろ過して透過液側から糖液を回収する工程（Ｂ）を含む、糖液の製造方法。
2. 前記木質系バイオマスが針葉樹系バイオマスであることを特徴とする、請求項１に記載の糖液の製造方法。
3. 前記工程（Ａ）の加水分解処理が、水熱処理、水蒸気爆砕処理および希酸処理からなる群から選択される１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１または２に記載の糖液の製造方法。
4. 前記工程（Ａ）において、液成分にセルラーゼを反応させることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の糖液の製造方法。
5. 前記工程（Ａ）において、マンナナーゼの添加量が液成分に含まれる全マンノース量（ｇ）に対して０．０１Ｕｎｉｔ／ｇ以上であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の糖液の製造方法。
6. 前記工程（Ｂ）の精密ろ過膜および／または限外ろ過膜の材質の機能面が有機膜であることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の糖液の製造方法。
7. 前記工程（Ｂ）の精密ろ過膜が平均細孔径０．０１〜０．５μｍの精密ろ過膜であることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の糖液の製造方法。
8. 前記工程（Ｂ）の限外ろ過膜が分画分子量５０００〜１５００００の限外ろ過膜であることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の糖液の製造方法。
9. 前記工程（Ｂ）で得られた糖液を分画分子量３００〜１０００の限外ろ過膜にてろ過し、非透過液側からマンノビオースおよび／またはマンノトリオースを含む糖液を回収し、透過液側から単糖を含む糖液を回収する工程（Ｃ）を含むことを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の糖液の製造方法。
10. 請求項１から９のいずれかに記載の糖液の製造方法において、工程（Ｂ）として限外ろ過膜処理を含み、かつ、限外ろ過膜の非透過液側から回収される酵素成分を利用して工程（Ａ）を行うことを特徴とする、糖液の製造方法。

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