WO2013146540A1 - エタノールの生産方法 - Google Patents

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WO2013146540A1
WO2013146540A1 PCT/JP2013/058106 JP2013058106W WO2013146540A1 WO 2013146540 A1 WO2013146540 A1 WO 2013146540A1 JP 2013058106 W JP2013058106 W JP 2013058106W WO 2013146540 A1 WO2013146540 A1 WO 2013146540A1
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WO
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yeast
fermentation
ethanol
mass
enzyme
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PCT/JP2013/058106
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English (en)
French (fr)
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野田　秀夫
真司 ▲濱▼
伸行 倉谷
近藤　昭彦
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関西化学機械製作株式会社
Ｂｉｏ－ｅｎｅｒｇｙ株式会社
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/14—Multiple stages of fermentation; Multiple types of microorganisms or re-use of microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ethanol. More specifically, the present invention relates to a method for producing ethanol from biomass.
  • biomass is a renewable resource, exists in large quantities on the earth, and does not increase carbon dioxide in the atmosphere even if it is used (carbon neutral), and can contribute to the prevention of global warming.
  • bioethanol is mainly made from corn and sugarcane, and competition with food is a problem. Therefore, in the future, production of bioethanol using lignocellulosic biomass such as rice straw, wheat straw and waste wood that does not compete with food will be required.
  • Lignocellulosic biomass is mainly composed of three types of components: cellulose, hemicellulose, and lignin.
  • cellulose can be used for ethanol fermentation by yeasts such as Saccharomyces cerevisiae that can assimilate glucose when it is degraded (saccharified) to glucose by hydrolysis.
  • cellulose hydrolase such as cellulase is usually used.
  • cellulose is separated from biomass and exposed before the enzymatic reaction. Is pre-processed.
  • hydrothermal decomposition methods, acid treatment methods, and alkali treatment methods are known as pretreatment methods.
  • acid treatment method a method using a dilute acid at a high temperature (200 ° C. or higher) and a method using concentrated sulfuric acid are known.
  • the hydrothermal decomposition method and acid treatment method partially decompose cellulose under extreme conditions, resulting in excessive decomposition products (by-products), low glucose yield (saccharification rate), and ethanol fermentation. The problem is that it can also produce inhibiting substances.
  • the pretreated product of lignocellulosic biomass is subjected to enzyme treatment.
  • the enzyme treatment the cellulose component and hemicellulose component constituting the pretreated product are hydrolyzed to generate oligosaccharides and monosaccharides.
  • the commercially available enzyme used for saccharification has a low titer, a large amount of enzyme is required for sufficient saccharification, which increases the cost.
  • a cell surface presentation technique is used as such a biotechnological technique.
  • an enzyme group that hydrolyzes cellulose that is, a yeast that surface-displays endoglucanase, cellobiohydrolase, ⁇ -glucosidase, and the like has been produced by a cell surface display technique (Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a method for producing ethanol from lignocellulosic biomass at low cost using yeast.
  • the inventors of the present invention can produce ethanol from lignocellulosic biomass at low cost by efficiently separating yeast that can reuse the fermented product after fermentation by using a combination of solid-liquid separation processes.
  • the present invention has been completed by finding out what can be done.
  • the present invention provides a method for producing ethanol from lignocellulosic biomass, the method comprising (1) a step of pretreating lignocellulosic biomass and (2) a cellulose fraction obtained in step (1).
  • the step of treating with cellulose hydrolase, (3) the step of mixing the saccharified biomass obtained in step (2) and yeast, and the ethanol fermentation, and (4) the fermented product obtained in step (3) are solidified.
  • the cycle consisting of steps (1), (2), (3) and (4) is repeated twice or more, and the yeast obtained in step (4) is added to the next cycle step ( Used as all or part of the yeast of 3).
  • the step (4) includes (a) a step of removing 30% by mass of the solid from 5% by mass of the fermented product, and (b) the remaining 5% of mass obtained in the step (a). Recovering 30% by mass of the solid part.
  • the concentration of yeast cells in the fermented product is 10 7 cells / mL or more.
  • the yeast is a yeast transformed to express one or two enzymes selected from the group consisting of ferulic acid esterase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -galactosidase, and pectinase.
  • the enzyme is displayed on the surface.
  • the present invention provides a yeast-containing composition for the production of ethanol from lignocellulosic biomass, wherein the yeast consists of ferulic acid esterase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -galactosidase, and pectinase. It has been transformed to express one or two more selected enzymes.
  • the enzyme is displayed on the surface.
  • a certain amount of residue containing yeast is used for fermentation in the next cycle, whereby the yeast cell concentration
  • the fermentation can be repeated over a long period of time without supplying new yeast, while maintaining a constant range from about 10 6 pieces / mL to about 10 7 pieces / mL to 10 7 pieces / mL or more. Since yeast is constantly growing, there is no problem that the freshness is lowered. Since the cost for newly preparing yeast can be reduced, ethanol can be produced at low cost. Moreover, the fermentation inhibition by a residue with a large specific gravity can also be suppressed.
  • a step of pretreating lignocellulosic biomass (2) a cellulose fraction obtained in step (1) is treated with a cellulose hydrolase.
  • Biomass refers to a carbohydrate material derived from biological resources. Examples thereof include starch obtained from corn and the like, and molasses (waste molasses) obtained from sugarcane and the like.
  • Lignocellulosic biomass refers to biomass composed mainly of three types of components, cellulose, hemicellulose, and lignin. Among these, cellulose is a fibrous polymer in which glucopyranose (glucose) is linked by ⁇ -1,4-glucoside bonds, and glucose obtained by hydrolysis is used as a fermentation substrate for yeast and the like.
  • lignocellulosic biomass Use of lignocellulosic biomass is preferable because it does not compete with food.
  • lignocellulosic biomass include wastes generated when processing biological materials such as rice, wheat, corn, sugarcane, wood (pulp), and napiergrass.
  • biological materials such as rice, wheat, corn, sugarcane, wood (pulp), and napiergrass.
  • rice straw, wheat straw, bagasse (residue after sugarcane juice), and waste materials For example, rice straw, wheat straw, bagasse (residue after sugarcane juice), and waste materials.
  • Pretreatment refers to, for example, in order to hydrolyze cellulose to glucose, before it is treated with a cellulose hydrolase such as cellulase, in order to facilitate the action of the enzyme on cellulose, The process of separating from biomass and exposing it.
  • the pretreatment method is not particularly limited. Examples include hydrothermal decomposition methods and pressing and steaming methods.
  • lignocellulosic biomass is pulverized as necessary, and mixed with water so as to have a content of, for example, about 20% by mass (dry mass), and this mixture is heat-treated.
  • the heat treatment is performed at 120 ° C. to 300 ° C., preferably 150 ° C. to 280 ° C., more preferably 180 ° C. to 250 ° C., for 15 seconds to 1 hour.
  • the treatment temperature and time can vary depending on the biomass used, and increasing the treatment temperature can shorten the treatment time. In addition, you may pressurize during heat processing.
  • the lignocellulosic biomass is pressed and steamed.
  • the order of pressing and steaming is not particularly limited, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • a pressing method For example, the method of pressing lignocellulosic biomass with a hydraulic press, a screw press, a meat mining machine, a press dehydrator, a centrifuge, etc. is mentioned.
  • a steaming method For example, the method of steaming lignocellulosic biomass with high temperature steam is mentioned.
  • the conditions for the steaming are not particularly limited.
  • the lignocellulosic biomass is impregnated with 1% by mass to 5% by mass of sulfuric acid, and 180 ° C. under a pressure of 1.0 Mpa to 1.6 Mpa.
  • the conditions include steaming at 200 ° C. for 5 to 30 minutes.
  • a water-soluble hemicellulose fraction and a water-insoluble cellulose fraction are separated.
  • the water-insoluble cellulose fraction can be easily separated as a solid content by a centrifugal separation method or the like.
  • a cellulose fraction can be obtained from lignocellulosic biomass.
  • it does not specifically limit as solid content which a cellulose fraction contains, Preferably, it is 100 g dry mass / L or more, More preferably, it is 200 g dry mass / L or more.
  • step (2) Treatment of cellulose fraction obtained in step (1) with cellulose hydrolase (step (2)) Cellulose hydrolase hydrolyzes the ⁇ -1,4-glucoside bond of cellulose to produce glucose. This process is called saccharification.
  • the cellulose hydrolase include, but are not limited to, endo ⁇ -1,4-glucanase (hereinafter simply referred to as “endoglucanase”), cellobiohydrolase, and ⁇ -glucosidase.
  • Endoglucanase is an enzyme called cellulase that cleaves cellulose from the inside of the molecule, and glucose, cellobiose, and cellooligosaccharide (degree of polymerization is 3 or more, and usually 10 or less, but is not limited thereto) ) Is generated.
  • Endoglucanase is highly reactive to low crystallinity or amorphous cellulose, such as non-crystallized cellulose, soluble cellooligosaccharides, and cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose (CMC), but has a crystalline structure Reactivity to cellulose microfibrils is low.
  • Endoglucanase is an example of an enzyme that hydrolyzes amorphous cellulose. Examples of endoglucanase include, but are not limited to, Trichoderma reesei-derived endoglucanase (particularly EGII).
  • Cellobiohydrolase decomposes from either the reducing end or non-reducing end of cellulose to release cellobiose.
  • Cellobiohydrolase degrades crystalline cellulose such as cellulose microfibrils with a crystalline structure, but is not reactive to low crystallinity or amorphous cellulose such as cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose (CMC).
  • CMC carboxymethylcellulose
  • Cellobiohydrolase is an example of an enzyme that hydrolyzes crystalline cellulose. Hydrolysis of crystalline cellulose by cellobiohydrolase is slower than hydrolysis of amorphous cellulose by endoglucanase due to the strong structure due to the intermolecular and intramolecular dense hydrogen bonds of crystalline cellulose. .
  • cellobiohydrolase 1 There are two types of cellobiohydrolase, which are called cellobiohydrolase 1 and cellobiohydrolase 2, respectively.
  • Examples of cellobiohydrolase include, but are not limited to, Trichoderma reesei cellobiohydrolase (particularly CBH2).
  • ⁇ -glucosidase is an exo-type hydrolase that separates glucose units from non-reducing ends in cellulose.
  • ⁇ -glucosidase cleaves a ⁇ 1,4-glucoside bond between an aglycon or sugar chain and ⁇ -D-glucose, and hydrolyzes cellobiose or cellooligosaccharide to produce glucose.
  • ⁇ -glucosidase is an example of an enzyme that hydrolyzes cellobiose or cellooligosaccharide.
  • One type of ⁇ -glucosidase is currently known and is referred to as ⁇ -glucosidase 1.
  • Examples of ⁇ -glucosidase include, but are not limited to, Aspergillus acreatas-derived ⁇ -glucosidase (particularly BGL1).
  • the cellulose hydrolase preparation is not particularly limited as long as it is a preparation containing the cellulose hydrolase. Commercially available enzyme preparations or those prepared by culturing enzyme-producing microorganisms may be used.
  • the activity of cellulose hydrolase is expressed as the amount of enzyme (1 FPU) that liberates 1 ⁇ mol of glucose from filter paper (for example, Filter Paper: No. 1 filter manufactured by Whatman) per minute.
  • the treatment concentration of the cellulose hydrolase is not particularly limited, but is preferably 4 FPU to 20 FPU / g cellulose fraction.
  • the treatment time for cellulose hydrolase is not particularly limited, but is preferably 0.5 hours to 10 hours, more preferably 0.5 hours to 8 hours, and further preferably 0.5 hours to 6 hours.
  • the treatment temperature of the cellulose hydrolase is not particularly limited as long as the enzyme works. Preferably, it is 40 ° C to 80 ° C.
  • Saccharified biomass can be obtained from the cellulose fraction by this step.
  • the saccharified biomass refers to biomass obtained by saccharification treatment, and includes, for example, glucose (monosaccharide) generated by hydrolysis of cellulose as a main component. Although it does not specifically limit as a shape of saccharified biomass, For example, a slurry form is mentioned.
  • a nutrient source for yeast may be added.
  • a nutrient source of yeast for example, YP (contains yeast extract 10g / L and polypeptone 20g / L), corn steep liquor (CSL), and these combination are mentioned
  • YP contains yeast extract 10g / L and polypeptone 20g / L
  • corn steep liquor CSL
  • corn steep It is a liquor. Since corn steep liquor is inexpensive, the cost required for ethanol fermentation can be reduced.
  • the amount of yeast nutrient source added is not particularly limited. For example, when YP is added, it may be 1 ⁇ YP to 10 ⁇ YP, and the total amount of the enzyme-treated solution is about 48 mL.
  • corn steep liquor for example, corn steep liquor with respect to the total amount (mL) of the enzyme treatment solution prepared when the cellulose fraction is treated with cellulose hydrolase.
  • the content of is, for example, 0.05% by mass to 2% by mass, preferably 0.0625% by mass to 1% by mass, and more preferably 0.125% by mass to 0.5% by mass. is there.
  • it does not specifically limit as a time which adds the nutrient source of yeast It may be before or after processing a cellulose fraction with a cellulose hydrolase, or during a process.
  • step (3) Ethanol fermentation by mixing saccharified biomass and yeast obtained in step (2) (step (3))
  • the yeast is not particularly limited as long as ethanol fermentation can be performed using glucose as a substrate. It may be a wild-type yeast or a transformed yeast.
  • the transformed yeast is appropriately prepared by a method commonly used by those skilled in the art.
  • Saccharomyces cerevisiae strains include, for example, Saccharomyces cerevisiae TJ14 strain (Moucamnerd et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010, Vol. 88, p. 87-94), and Saccharomyces cerevisiae KF-7 strain (Ting Et al., Process Biochem., 2006, Vol. 41, pp. 909-914).
  • the transformed yeast can be, for example, a yeast in which an enzyme for promoting saccharification of lignocellulosic biomass by the cellulose hydrolase preparation in step (2) is expressed.
  • an enzyme for promoting saccharification of lignocellulosic biomass by the cellulose hydrolase preparation in step (2) is expressed.
  • an enzyme for promoting saccharification of lignocellulosic biomass by the cellulose hydrolase preparation in step (2) is expressed.
  • examples of such an enzyme include, but are not limited to, ferulic acid esterase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -galactosidase, pectinase, and one or two combinations thereof.
  • Preferred is a yeast transformed to express ferulic acid esterase.
  • Ferulic acid esterase refers to an enzyme that causes an esterification reaction between ferulic acid and glycerol. Ferulic acid esterase has an action of hydrolyzing ferulic acid that connects lignin and polysaccharide in lignocellulosic biomass. By this action, the structure of lignocellulosic biomass is relaxed (that is, part of the structure of lignocellulosic biomass is decomposed), whereby saccharification by the cellulose hydrolase preparation can be promoted.
  • the ferulic acid esterase is not particularly limited.
  • Aspergillus genus for example, Aspergillus niger
  • Penicillium for example, Penicillium chrysogenum and Penicillium chrysogenum
  • ferulic acid esterase derived from Talamomyces funiculosus
  • Examples of the gene encoding ferulic acid esterase include a gene derived from Talamomyces funiculosus (FaeA: GenBank Accession Number: AJ31296).
  • Pectinase is a generic term for a group of enzymes that degrade pectin contained in the cell walls of higher plants.
  • the pectinase is not particularly limited, and examples thereof include bacteria belonging to the genus Bacillus, Trichosporon, Endomyces, Endomycopsis, Saccharomyces saccharomyces, Genus (Schizosaccharomyces), Pichia (Pichia), Hansenula (Hansenula), Debaryomyces (Debaryomyces), Hansenia spora (Hansenispora), Candida genus (Tulopsis) Yeasts belonging to, and Aspergillus Examples include pectinases derived from filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus and Rhizopus.
  • the ⁇ -glucosidase described above can be used as the ⁇ -glucosidase.
  • ⁇ -galactosidase refers to an enzyme that decomposes lactose into galactose and glucose.
  • ⁇ -galactosidase has an action of decomposing galactan in pectin and relaxing the structure of the plant cell wall (ie, decomposing part of the structure of lignocellulosic biomass). This is expected to soften lignocellulosic biomass and promote saccharification by cellulose hydrolase preparations.
  • ⁇ -galactosidase is not particularly limited, and examples thereof include, for example, Bacillus (for example, Bacillus circulans) and Aspergillus (for example, Aspergillus oryzae). And ⁇ -galactosidase.
  • the gene encoding the enzyme is amplified by polymerase chain reaction (PCR) using, for example, a genomic DNA or cDNA prepared from the organism from which the enzyme is derived as a template, and a primer pair prepared based on the sequence information of the structural gene. And get.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the enzyme may be secreted from yeast or expressed so as to be presented on the surface of the yeast.
  • a method known to those skilled in the art can be employed as a method for causing the enzyme to be displayed on the cell surface of yeast.
  • a GPI anchor of a cell surface localized protein JP-A-11-290078
  • a sugar chain A binding domain WO 02/085935
  • cell surface localized proteins used in these methods include ⁇ - or a-agglutinin (yeast aggregating protein), FLO proteins (eg, FLO1, FLO2, FLO4, FLO5, FLO9, FLO10 and FLO11), And alkaline phosphatase.
  • Examples of a method for presenting an enzyme on the cell surface using a GPI anchor include a method using a recombinant DNA comprising a DNA encoding a secretory signal sequence, a target gene, and a DNA encoding a GPI anchor adhesion recognition signal.
  • Glucoamylase expressed from this recombinant DNA and secreted outside the cell membrane can bind to the GPI anchor of the cell membrane via a GPI anchor attachment recognition signal.
  • the GPI anchor attachment recognition signal sequence for example, a GPI anchor attachment recognition signal sequence present in a 320 amino acid sequence counted from the C-terminus of yeast ⁇ -agglutinin can be used.
  • the enzyme is N-terminal side, C-terminal side, or N-terminal side and C-terminal side of a cell surface localized protein (aggregation functional domain).
  • aggregation functional domain a cell surface localized protein
  • the enzyme expressed from this recombinant DNA and secreted outside the cell membrane can remain on the cell surface layer when a plurality of sugar chains of the sugar chain binding domain interact with sugar chains in the cell wall.
  • the aggregation functional domain include sugar chain binding sites such as a lectin and a lectin-like protein, and typically include an aggregation functional domain of a GPI anchor protein.
  • the secretion signal sequence used for the recombinant DNA is not particularly limited, and may be an enzyme secretion signal, a cell surface localized protein secretion signal sequence, or leading the enzyme to the outside of the cell. Other secretory signal sequences can be used. If the enzyme activity is not affected, a part or all of the secretory signal sequence and pro-sequence may remain at the N-terminus after cell surface display.
  • the method for secreting an enzyme from yeast is carried out, for example, by introducing into the yeast a recombinant DNA in which a gene encoding the target enzyme is linked downstream of the DNA encoding the secretory signal sequence. obtain.
  • the synthesis and binding of the recombinant DNA can be performed, for example, by a method commonly used by those skilled in the art.
  • the recombinant DNA may be incorporated into an expression vector.
  • an expression vector is, for example, in the form of a plasmid.
  • a plasmid having a replication origin (Ori) of 2 ⁇ m plasmid of yeast and a replication origin of ColE1 is preferably used.
  • the plasmid preferably has a selection marker and a replication gene for Escherichia coli in terms of facilitating preparation of the plasmid and detection of the transformant.
  • selectable markers include drug resistance genes and auxotrophic genes.
  • the drug resistance gene include, but are not limited to, an ampicillin resistance gene (Ampr) and a kanamycin resistance gene (Kanr).
  • auxotrophic genes include N- (5′-phosphoribosyl) anthranilate isomerase (TRP1) gene, tryptophan synthase (TRP5) gene, malate ⁇ -isopropyl dehydrogenase (LEU2) gene, imidazole glycerol phosphate dehydration
  • TRP1 N- (5′-phosphoribosyl) anthranilate isomerase
  • TRP5 tryptophan synthase
  • LEU2 malate ⁇ -isopropyl dehydrogenase
  • imidazole glycerol phosphate dehydration Specific examples include, but are not limited to, the elementary enzyme (HIS3) gene, the histidinol dehydrogenase (HIS4) gene, the dihydroorotic acid dehydrogenase (URA1) gene, and the orotidine-5-phosphate decarboxylase (URA3) gene.
  • a replication gene for yeast is selected as necessary.
  • the expression vector preferably has an appropriate promoter and terminator for expressing a gene encoding the target enzyme in yeast.
  • promoters and terminators include GAPDH (glyceraldehyde 3′-phosphate dehydrogenase), PGK (phosphoglycerate kinase), PYK (pyruvate kinase), TPI (triose phosphate isomerase) promoters and terminators.
  • GAPDH glycose
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • PYK pyruvate kinase
  • TPI triose phosphate isomerase
  • the method for introducing recombinant DNA into yeast is not particularly limited. Examples thereof include a lithium acetate method, an electroporation method, and a protoplast method.
  • the introduced recombinant DNA may exist, for example, in the form of a plasmid, or may exist in a form inserted into a yeast chromosome or a form integrated into a yeast chromosome by homologous recombination.
  • Yeast into which the recombinant DNA has been introduced is selected by a selectable marker and selected by measuring the activity of the expressed enzyme. That the target enzyme is presented on the cell surface can be confirmed, for example, using an antibody against the enzyme.
  • the yeast cell concentration at the start of the first fermentation is not particularly limited. Preferably, it is about 2 to 20 g wet weight / L (1 ⁇ 10 7 pieces / mL to 1 ⁇ 10 8 pieces / mL).
  • Yeast culture conditions are not particularly limited. Usually, it may be the conditions for ethanol fermentation using glucose as a substrate.
  • the culture temperature is, for example, 30 ° C. to 37 ° C.
  • the culture pH is, for example, 4-8.
  • the culture time is usually 2 days to 3 days.
  • the end of the fermentation is determined based on, for example, the fact that the amount of generated carbon dioxide gas is 1/10 or less of that at the start of fermentation.
  • the fermented material after completion of fermentation contains solids such as lignin and ash derived from raw materials, in addition to the yeast and ethanol of the fermentation product. That is, a slurry containing a solid is also included.
  • the cell concentration of yeast in the fermented product after completion of fermentation is not particularly limited. For example, the cell concentration at the start of the first fermentation is about 1 ⁇ 10 7 cells / mL to 5 ⁇ 10 8 cells / mL.
  • yeast is efficiently recovered from this fermented product and reused.
  • the combination of the solid-liquid separation step is not particularly limited, but preferably (a) a step of removing a solid part of 5% by mass to 30% by mass of the fermented product (step (4) (a)), and (b) This is a combination of the steps (steps (4) and (b)) of recovering the solid portion of 5 to 30% by mass of the remainder obtained in the step (4) (a).
  • step (4) A step of removing a solid part of 5% by mass to 30% by mass of the fermented product (step (4) (a))
  • the yeast is recovered in the liquid part.
  • the solid part of 5% by mass to 30% by mass, preferably 5% by mass to 20% by mass, of the fermented product obtained in the step (3) is removed.
  • the means for removing the solid part is not particularly limited, but preferably includes 100G to 1000G centrifugation, hydra sieve, and decanter. In this step, most of ligrin and ash are removed as a solid part.
  • the yeast is recovered in the solid part.
  • the solid part of 5 to 30% by mass, preferably 20 to 30% by mass of the remainder obtained in the step (4) (a) is recovered.
  • the means for recovering the solid part is not particularly limited, but preferably includes a centrifugal separation of 1200 G to 5000 G, a filter press, and an Oliver filter. In this process, most of the fermentation product ethanol is recovered as a liquid part.
  • the yeast recovery rate in step (4) is not particularly limited, but is preferably 50% or more.
  • the percentage of residual bands such as lignin and ash is not particularly limited, but is preferably 10% or less.
  • the cycle comprising the above steps (1) to (4) is repeated twice or more, preferably 6 times or more.
  • the yeast obtained at the said process (4) is utilized as all or one part of the yeast of the process (3) of the next cycle.
  • the proportion of yeast obtained in step (4) is 50% by mass to 100% by mass, preferably 80% by mass to 100% by mass.
  • Example 1 Ethanol fermentation 1 using rice straw
  • Process 1 Hydrothermal treatment of rice straw
  • Rice straw is mixed with water to a content of about 20% by mass (dry mass), and this is mixed into a hydrothermal treatment apparatus (manufactured by Mitsubishi Heavy Industries, Ltd.) at about 180 ° C. and about 3 MPa for 5 minutes to 20 minutes. Processed. Subsequently, solid content was isolate
  • Step 2 Enzyme treatment
  • the composition is shown in Table 1.
  • This enzyme treatment solution is put into a 50 mL plastic test tube (Corning), and the enzyme treatment is performed at 50 ° C. and a rotation speed of 35 rpm using a thermoblock rotator (Nisshin Rika Co., Ltd., SN-06BN). went.
  • Yeast Saccharomyces cerevisiae TJ14 strain (Moucamnerd et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010, Vol. 88, p. 87-94) was used for fermentation.
  • yeast seed culture is performed overnight in a tester containing 5 mL of YPD liquid medium (yeast extract 10 g / L, polypeptone 20 g / L, glucose 20 g / L), and then the culture solution is a flask containing 500 mL of YPD liquid medium.
  • the main culture was performed for 2 days. This culture solution was centrifuged (3000 rpm, 4 ° C., 10 minutes), and the yeast cells were washed twice with sterile distilled water and then suspended in sterile distilled water so that the cell concentration was 100 g wet weight / L. .
  • the ethanol concentration produced in the fermentation broth was quantified over time by HPLC (High performance liquid chromatography system; Hitachi High-Tech Fielding, LaChrom Elite).
  • HPLC High performance liquid chromatography system; Hitachi High-Tech Fielding, LaChrom Elite.
  • ULTON PS-80H (Shinwa Kako Co., Ltd., 300 mm (L) ⁇ 8 mm (ID)) was used as the HPLC separation column, and ultrapure water (purified water using Milli-Q manufactured by Millipore Japan) was used as the mobile phase.
  • a refractive index detector was used as the detector.
  • the HPLC conditions were a liquid feed rate of 0.9 mL / min and a column temperature of 50 ° C.
  • yeast cell concentration in the fermentation broth to a YPD agar medium (YPD liquid medium with 20 g / L agar added), culturing at 30 ° C. for 2 days, and counting the number of colonies Quantified over time.
  • YPD agar medium YPD liquid medium with 20 g / L agar added
  • the yeast cell concentration was 1.5 g wet weight / L (7.6 ⁇ 10 6 cells / mL: at the start of the second cycle of ethanol fermentation).
  • fermentation was started at 37 ° C. in the same manner as in Step 3 above.
  • the ethanol concentration and the yeast cell concentration in the fermentation broth were quantified over time.
  • the yeast cell concentration at the end of the second cycle of ethanol fermentation was 6.4 g wet weight / L (3.2 ⁇ 10 7 cells / mL), which was increased from the start of fermentation.
  • FIG. 1 shows the results of quantifying the ethanol concentration produced in the fermentation broth and the yeast cell concentration over time.
  • ethanol fermentation could be continued without any problems even if the yeast was reused and the fermentation was repeated 4 to 6 times. It was not necessary to add additional yeast prepared separately.
  • the solid part containing yeast after the end of each fermentation cycle is charged at a rate of 10% by mass to 20% by mass with respect to the fermentation liquid of the next cycle, so that the yeast cell concentration in the fermentation liquid is constant (each fermentation It was found that ethanol fermentation can be performed for a long period of time while being maintained at about 10 6 pieces / mL to about 10 7 pieces / mL at the start of the cycle and 10 7 pieces / mL or more at the end.
  • Example 2 Ethanol fermentation 2 using rice straw
  • Step 4 of Example 1 filtration was performed using a hydra sieve (manufactured by Toyo Screen Industry Co., Ltd .; 0.1 mm screen) instead of centrifuging at a low rotation speed (100 G) using a centrifuge.
  • the experiment was conducted in the same manner as in Example 1 except that.
  • the collected filtrate (liquid part) was 85% by mass.
  • Example 3 Ethanol fermentation 3 using rice straw
  • Step 4 of Example 1 instead of centrifuging at a low rotation speed (100 G) using a centrifuge, a microseparator (TSK-80 basket type centrifuge; ⁇ : 31 m 2 , bowl capacity: 7 L
  • Disc-type centrifuge instead of centrifuging at a liquid flow rate of 50 L / H using a solid space: 4.8 L
  • the experiment was conducted.
  • the supernatant (liquid part) recovered by the first centrifugation was 83% by mass.
  • the precipitate (solid part) recovered by the second centrifugation was 25% by mass.
  • Table 3 shows the yeast cell concentration
  • the yeast cell concentration in the supernatant (liquid part) collected from the microseparator was 6.4 ⁇ 10 6 cells / mL, and the supernatant collected from the disk-type centrifuge ( There was almost no yeast in the liquid part) and a large amount of yeast (5.7 ⁇ 10 7 / mL) in the precipitate (solid part).
  • the yeast cell concentration in this solid part is capable of ethanol fermentation even when the solid part is charged at a rate of 10% by mass to 20% by mass with respect to the fermentation liquid of the next cycle. Cell density. Accordingly, it was found that ethanol fermentation can be performed for a long period of time by reusing the yeast separated by the solid-liquid separation method of the above Examples.
  • Example 4 Ethanol fermentation 4 using rice straw
  • Step 2 of Example 1 instead of 5.0 mL of 10 ⁇ YP, corn steep liquor (CSL) was added to 0.0625% by mass with respect to the total amount (mL) of the enzyme treatment solution. Then, ethanol fermentation was performed in the same manner as in Example 1 except that the enzyme treatment solution was prepared.
  • CSL corn steep liquor
  • Example 5 Ethanol fermentation 5 using rice straw
  • Ethanol fermentation was performed in the same manner as in Example 4 except that the enzyme treatment solution was prepared by adding corn steep liquor to 0.125% by mass with respect to the total amount (mL) of the enzyme treatment solution. It was.
  • the results of quantifying the ethanol concentration produced in the fermentation broth over time are shown in FIG.
  • Example 6 Ethanol fermentation 6 using rice straw
  • Ethanol fermentation was performed in the same manner as in Example 4 except that the enzyme treatment solution was prepared by adding corn steep liquor to 0.25 mass% with respect to the total amount (mL) of the enzyme treatment solution. It was. The results of quantifying the ethanol concentration produced in the fermentation broth over time are shown in FIG.
  • Example 7 Ethanol fermentation 7 using rice straw
  • Ethanol fermentation was carried out in the same manner as in Example 4 except that the corn steep liquor was added to 0.5% by mass with respect to the total amount (mL) of the enzyme-treated solution to prepare the enzyme-treated solution. It was.
  • the results of quantifying the ethanol concentration produced in the fermentation broth over time are shown in FIG.
  • corn steep liquor was 0.125% by mass (Example 5), 0.25% by mass (Example 6) and 0. 0% with respect to the total amount (mL) of the enzyme-treated solution. When it added so that it might become 5 mass% (Example 7), even if it repeated a fermentation cycle, it was able to perform ethanol fermentation stably.
  • corn steep liquor was added to 0.0625% by mass (Example 4) with respect to the total amount (mL) of the enzyme-treated solution, the ethanol concentration decreased after the third and fourth fermentation cycles. However, no decrease was observed in the ethanol concentration after the end of the first and second fermentation cycles. From this, it can be seen that ethanol fermentation was sufficiently performed even when an inexpensive nutrient source such as corn steep liquor was used instead of an expensive nutrient source such as YP.
  • Example 8 Ethanol fermentation 1 using bagasse
  • Step 1 of Example 1 instead of rice straw as a raw material, bagasse was used.
  • Step 2 instead of 5.0 mL of 10 ⁇ YP in the enzyme treatment solution, corn steep liquor was used as a whole solution of the enzyme treatment solution.
  • Ethanol fermentation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the enzyme treatment solution was prepared by adding 0.25 mass% with respect to the amount (mL). The results of quantifying the ethanol concentration produced in the fermentation broth over time are shown in FIG.
  • Example 9 Ethanol fermentation 2 using bagasse
  • Ethanol fermentation was carried out in the same manner as in Example 8 except that corn steep liquor was added to 0.5% by mass with respect to the total amount (mL) of the enzyme-treated solution to prepare the enzyme-treated solution. It was.
  • the results of quantifying the ethanol concentration produced in the fermentation broth over time are shown in FIG.
  • Example 10 Ethanol fermentation 3 using bagasse
  • Ethanol fermentation was performed in the same manner as in Example 8 except that the enzyme treatment liquid was prepared by adding corn steep liquor to 1% by mass with respect to the total amount (mL) of the enzyme treatment liquid.
  • the results of quantifying the ethanol concentration produced in the fermentation broth over time are shown in FIG.
  • Examples 11 to 14 ethanol fermentation using napier grass
  • Step 1 Napiergrass pressing and steaming
  • Napiergrass is squeezed with a uniaxial extruder under conditions of 79.7 N ⁇ m to remove unnecessary liquid in advance, impregnated with 1% by mass of sulfuric acid to the residue, and at 180 ° C. under a pressure of 1.0 Mpa. Steamed for 30 minutes. Subsequently, solid content was isolate
  • Step 2 Enzyme treatment
  • corn steep liquor 1.0 mass% or 0.1 mass% (concentration with respect to the total volume of the enzyme treatment liquid) or water as a nutrient source in the enzyme treatment liquid, obtained in step 1.
  • About 48 mL of four kinds of enzyme-treated liquids containing pressed napiergrass and steamed solids were prepared (Examples 11 to 14). The composition is shown in Table 4.
  • PGK406AG Japanese Patent Laid-Open No. 2011-142879
  • PGK406AG Japanese Patent Laid-Open No. 2011-142879
  • genomic DNA was extracted from cultured cells of Talamomyces funiculosus.
  • a primer SalI-ssFaeA-Fw (SEQ ID NO: 1) containing a secretory signal sequence of a glucoamylase gene derived from Rhizopus oryzae and a primer SalI-FaeA-Rv (SEQ ID NO: 2) PCR was performed.
  • the gene fragment thus obtained was digested with SalI and inserted into the SalI site of pGK406AG to construct plasmid pGK406-ssFaeA-AG.
  • PAUR101 (Takara Bio Inc.) was used as a vector to be introduced into yeast.
  • the primer pAuR101-SphI-Fw was used with pGK406-ssFaeA-AG as a template. PCR was performed using (SEQ ID NO: 3) and primer pAuR101-SphI-Rv (SEQ ID NO: 4).
  • This gene fragment was inserted into pAUR101 cleaved with SphI using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) to construct a plasmid pAUR101-pGK-ssFaeA-AG for display on the surface of FaeA yeast.
  • This pAUR101-pGK-ssFaeA-AG was digested with StuI and transformed into yeast (Saccharomyces cerevisiae TJ14 strain) using YAST MAKER yeast transformation system (Clontech Laboratories, Palo Alto, California, USA), A (Aureobasidin A) resistant strain was obtained, and FaeA surface display yeast was obtained.
  • the obtained FaeA surface display yeast was used in Examples 15 and 16 below.
  • Example 15 Ethanol Fermentation 1 Using FaeA Surface Display Yeast (Process 1: Bagasse Hydrothermal Treatment) Bagasse is mixed with water to a content of about 20% by mass (dry mass), and this is put into a hydrothermal treatment apparatus (manufactured by Mitsubishi Heavy Industries, Ltd.) and treated at about 180 ° C. and about 3 MPa for 5 to 20 minutes did. Subsequently, solid content was isolate
  • a hydrothermal treatment apparatus manufactured by Mitsubishi Heavy Industries, Ltd.
  • Step 2 Enzyme treatment
  • the composition is shown in Table 5.
  • This enzyme treatment solution is put into a 50 mL plastic test tube (Corning), and the enzyme treatment is performed at 50 ° C. and a rotation speed of 35 rpm using a thermoblock rotator (Nisshin Rika Co., Ltd., SN-06BN). went.
  • the yeast is seeded overnight in a test tube containing 5 mL of YPD liquid medium (liquid medium containing 10 g / L of yeast extract, 20 g / L of polypeptone and 20 g / L of glucose), and then the culture is treated with 500 mL of YPD. It moved to the flask containing a liquid medium, and main culture was performed for 2 days. This culture solution was centrifuged (3000 rpm, 4 ° C., 10 minutes), and the precipitated yeast cells were washed twice with sterilized distilled water.
  • YPD liquid medium liquid medium containing 10 g / L of yeast extract, 20 g / L of polypeptone and 20 g / L of glucose
  • the ethanol concentration produced in the fermentation broth was quantified over time by HPLC (Hitachi High-Tech Fielding, LaChrom Elite).
  • HPLC Hakachi High-Tech Fielding, LaChrom Elite
  • ULTON PS-80H (Shinwa Kako Co., Ltd., 300 mm (L) ⁇ 8 mm (ID)) was used as the HPLC separation column, and ultrapure water (purified water using Milli-Q manufactured by Millipore Japan) was used as the mobile phase.
  • a refractive index detector was used as the detector.
  • the HPLC conditions were a liquid feed rate of 0.9 mL / min and a column temperature of 50 ° C.
  • yeast cell concentration in the fermentation broth to a YPD agar medium (YPD liquid medium with 20 g / L agar added), culturing at 30 ° C. for 2 days, and counting the number of colonies Quantified over time.
  • YPD agar medium YPD liquid medium with 20 g / L agar added
  • the precipitate was recovered and added to 48 mL of the enzyme treatment solution obtained in the same manner as in Step 2 above.
  • yeast addition fermentation was started at 37 ° C. in the same manner as in Step 3 above.
  • the ethanol concentration and the yeast cell concentration in the fermentation broth were quantified over time.
  • Example 16 Ethanol fermentation using FaeA surface display yeast 2
  • the FaeA surface display yeast and the control were the same as in Example 15 except that the enzyme-treated solution was prepared (Table 5) by adding the hydrothermal solid content of bagasse to 150 g / L (dry weight basis).
  • Ethanol fermentation was performed using (yeast Saccharomyces cerevisiae TJ14 strain).
  • FIG. 6 shows the results of quantifying the ethanol concentration produced in the fermentation broth and the yeast cell concentration over time.
  • bagasse hydrothermally treated product was used at 200 g / L (Example 15) and 150 g / L (Example 16) on a dry weight basis.
  • more ethanol was stably produced as compared with the wild yeast TJ14 strain.
  • the yeast displaying the ferulic acid esterase on the surface promoted saccharification by cellulase of the bagasse hydrothermally treated product and showed higher ethanol production than the wild yeast TJ14 strain.
  • ethanol fermentation is performed for a long period of time while maintaining the yeast cell concentration in the fermentation broth at a constant level (approximately 10 6 cells / mL to 10 7 cells / mL at the start of each fermentation cycle and 10 7 cells / mL or more at the end). I understand that I was able to.
  • a certain amount of residue containing yeast is used for fermentation in the next cycle, whereby the yeast cell concentration
  • the fermentation can be repeated over a long period of time without supplying new yeast, while maintaining a constant range from about 10 6 pieces / mL to about 10 7 pieces / mL to 10 7 pieces / mL or more. Since yeast is constantly growing, there is no problem that the freshness is lowered. Since the cost for newly preparing yeast can be reduced, ethanol can be produced at low cost. Moreover, the fermentation inhibition by a residue with a large specific gravity can also be suppressed.

Abstract

　酵母を用いて、リグノセルロース系バイオマスから低コストでエタノールを生産する方法を提供する。本発明のリグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産方法は、（１）リグノセルロース系バイオマスを前処理する工程、（２）工程（１）で得られたセルロース画分をセルロース加水分解酵素で処理する工程、（３）工程（２）で得られた糖化バイオマスと酵母とを混合してエタノール発酵する工程、および（４）工程（３）で得られた発酵物を固液分離する工程を含み、工程（１）、（２）、（３）および（４）からなるサイクルを２回以上繰り返し、そして工程（４）で得られた酵母を、次のサイクルの工程（３）の酵母の全部または一部として用いる。

Description

エタノールの生産方法
　本発明は、エタノールの生産方法に関する。より詳細には、バイオマスからのエタノールの生産方法に関する。
　近年、化石燃料の枯渇が危惧される中、その代替燃料の開発が進められている。中でもバイオマスに由来するバイオエタノールが注目されている。バイオマスは、再生可能な資源であり、地球上に大量に存在し、そして使用しても大気中の二酸化炭素が増えず（カーボンニュートラル）、地球温暖化防止に寄与することができるからである。
　しかし、現在、生産されているバイオエタノールは、主にトウモロコシやサトウキビを原料としており、食糧との競合が問題となっている。このため、将来的には、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの生産が求められる。
　リグノセルロース系バイオマスは、主にセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの３種類の成分から構成される。このうちセルロースは、加水分解によりグルコースまで分解（糖化）されると、グルコースを資化することができる酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などによるエタノール発酵に利用することができる。
　セルロースを加水分解するには、通常、セルラーゼなどのセルロース加水分解酵素が用いられるが、酵素のセルロースへの作用を容易にするために、酵素反応の前にセルロースをバイオマスから分離し、露出させるための前処理が行われる。従来、前処理法としては、水熱分解法、酸処理法、アルカリ処理法が知られている。酸処理法としては、高温（２００℃以上）で希酸を用いる方法と、濃硫酸などを用いる方法とが知られている。しかし、水熱分解法や酸処理法は、過激な条件下でセルロースを部分分解するため、過分解物（副生成物）を生じ、グルコース収率（糖化率）が低いことや、エタノール発酵を阻害する物質をも生じ得ることが問題である。
　リグノセルロース系バイオマスの前処理物は酵素処理に供される。酵素処理では、前処理物を構成するセルロース成分やヘミセルロース成分を加水分解し、オリゴ糖や単糖を生成する。しかしながら、糖化に使用する市販の酵素の力価が低いことにより十分な糖化には酵素を大量に必要とするため、コストが高くなるという問題がある。
　一方、セルロース、ヘミセルロースなどを本来資化することができない酵母サッカロマイセス・セレビシエなどを、生物工学的手法を用いて改変することにより、バイオマスの前処理物から直接エタノールを生産させる試みがなされている。このような生物工学的手法として細胞表層提示技術が利用されている。例えば、セルロースを加水分解する酵素群、すなわちエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β－グルコシダーゼなどを表層提示した酵母が、細胞表層提示技術によって作製されている（特許文献１）。
国際公開第２０１０／０３２７６２号
　工業上の実用性を鑑みると、上記方法を組み合わせることでエタノールの生産性を向上させるための検討が必要である。特に、酵素処理法によりリグノセルロース系バイオマス前処理物の糖化を一定程度進めつつ、セルロース加水分解酵素群を細胞表層提示した酵母を用いてエタノール発酵させる方法が有力技術として検討されている。しかし、この方法では、１回の発酵ごとに酵母を調製および添加する必要があり、酵母の培養コストがエタノール製造コストに大きく影響を及ぼす。
　本発明は、酵母を用いて、リグノセルロース系バイオマスから低コストでエタノールを生産する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、固液分離工程の組み合わせを用いて、発酵終了後の発酵物を再利用可能な酵母を効率よく分離することによって、リグノセルロース系バイオマスから低コストでエタノールを生産することができることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は、リグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産方法を提供し、該方法は、（１）リグノセルロース系バイオマスを前処理する工程、（２）工程（１）で得られたセルロース画分をセルロース加水分解酵素で処理する工程、（３）工程（２）で得られた糖化バイオマスと酵母とを混合してエタノール発酵する工程、および（４）工程（３）で得られた発酵物を固液分離する工程を含み、工程（１）、（２）、（３）および（４）からなるサイクルを２回以上繰り返し、そして工程（４）で得られた酵母を、次のサイクルの工程（３）の酵母の全部または一部として用いる。
　１つの実施態様では、上記工程（４）は、（ａ）発酵物の５質量％から３０質量％の固体部を除去する工程、および（ｂ）工程（ａ）で得られた残部の５質量％から３０質量％の固体部を回収する工程を含む。
　１つの実施態様では、上記発酵物中の酵母の菌体濃度は、１０７個／ｍＬ以上である。
　１つの実施態様では、上記酵母が、フェルラ酸エステラーゼ、β－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１または２種の酵素を発現するように形質転換された酵母である。
　１つの実施態様では、上記酵素が、表層提示されている。
　さらに、本発明は、リグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産のための、酵母を含有する組成物を提供し、上記酵母が、フェルラ酸エステラーゼ、β－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１または２種の酵素を発現するように形質転換されている。
　１つの実施態様では、上記酵素が、表層提示されている。
　本発明の方法によれば、リグノセルロース系バイオマスのエタノール発酵物から比重の大きい残渣を除去した後の、酵母を含む一定量の残渣を次のサイクルの発酵に用いることによって、酵母の菌体濃度を１０６個／ｍＬ～１０７個／ｍＬ程度から１０７個／ｍＬ以上までの一定範囲に維持しながら、新たに酵母を供給することなく長期にわたって発酵を繰り返すことが可能になる。酵母は絶えず増殖を繰り返すため、鮮度が低下するという問題も生じない。新たに酵母を調製するためのコストを削減することができるため、低コストでエタノールを生産することができる。また、比重の大きい残渣による発酵阻害も抑制することができる。
稲ワラを原料として、酵母を繰返し再利用してエタノール発酵を行った場合の発酵液中のエタノール濃度および酵母の菌体濃度の経時変化を示すグラフである。 稲ワラを原料として、酵母を繰返し再利用してエタノール発酵を行った場合の発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。 バガスを原料として、酵母を繰返し再利用してエタノール発酵を行った場合の発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。 ネピアグラスを原料として、酵母を繰返し再利用してエタノール発酵を行った場合の発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。 バガスを原料として、ＦａｅＡ形質転換酵母を繰返し再利用してエタノール発酵を行った場合の発酵液中のエタノール濃度および酵母の菌体濃度の経時変化を示すグラフである。 バガスを原料として、ＦａｅＡ形質転換酵母を繰返し再利用してエタノール発酵を行った場合の発酵液中のエタノール濃度および酵母の菌体濃度の経時変化を示すグラフである。
　本発明のリグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産方法は、（１）リグノセルロース系バイオマスを前処理する工程、（２）工程（１）で得られたセルロース画分をセルロース加水分解酵素で処理する工程、（３）工程（２）で得られた糖化バイオマスと酵母とを混合してエタノール発酵する工程、および（４）工程（３）で得られた発酵物を固液分離する工程を含む。
　（１）リグノセルロース系バイオマスの前処理(工程（１））
　バイオマスとは、生物資源に由来する糖質材料をいう。例えば、トウモロコシなどから得られるデンプン、サトウキビなどから得られる糖蜜（廃糖蜜）が挙げられる。リグノセルロース系バイオマスとは、主にセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの３種類の成分から構成されるバイオマスをいう。このうち、セルロースは、β－１，４－グルコシド結合によりグルコピラノース（グルコース）が連なった繊維状高分子であり、加水分解されて得られるグルコースが酵母などの発酵基質として利用される。
　リグノセルロース系バイオマスの利用は、食糧と競合しない点で好ましい。リグノセルロース系バイオマスとしては、コメ、ムギ、トウモロコシ、サトウキビ、木材（パルプ）、ネピアグラス、などの生物材料の処理に際して生じる廃棄物などが挙げられる。例えば、稲ワラ、麦ワラ、バガス（サトウキビ搾汁後の残渣）、廃材が挙げられる。
　前処理とは、例えば、セルロースをグルコースまで加水分解するために、セルラーゼなどのセルロース加水分解酵素で処理する前に、酵素のセルロースへの作用を容易にするために、酵素反応の前にセルロースをバイオマスから分離し、露出させる処理をいう。前処理法としては、特に限定されない。例えば、水熱分解法ならびに圧搾および蒸煮方法が挙げられる。
　水熱分解法では、例えば、リグノセルロース系バイオマスを、必要に応じて粉砕し、例えば、約２０質量％（乾燥質量）の含量となるように水と混合し、この混合物を熱処理する。熱処理は、１２０℃～３００℃、好ましくは１５０℃～２８０℃、より好ましくは１８０℃～２５０℃にて、１５秒間～１時間行われる。処理温度および時間は用いるバイオマスによって変動し得、処理温度の上昇は処理時間を短縮し得る。なお、熱処理中に加圧してもよい。
　圧搾および蒸煮方法では、リグノセルロース系バイオマスの圧搾および蒸煮が行われる。圧搾および蒸煮の順番は特に限定されず、当業者によって適宜設定することができる。圧搾方法としては、特に限定されないが、例えば、油圧式圧搾機、スクリュープレス、採肉機、プレス脱水機、または遠心分離機等によりリグノセルロース系バイオマスを圧搾する方法が挙げられる。蒸煮方法としては、特に限定されないが、例えば、リグノセルロース系バイオマスを高温の水蒸気により蒸煮する方法が挙げられる。蒸煮するための条件としては、特に限定されないが、例えば、リグノセルロース系バイオマスに対して１質量％～５質量％の硫酸を含浸させて、１．０Ｍｐａ～１．６Ｍｐａの圧力下、１８０℃～２００℃にて５分～３０分間蒸煮する条件が挙げられる。
　リグノセルロース系バイオマスを前処理すると、水溶性のヘミセルロース画分と非水溶性のセルロース画分とが分離する。非水溶性のセルロース画分は、固形分として遠心分離法などにより容易に分離することができる。この工程により、リグノセルロース系バイオマスからセルロース画分を得ることができる。セルロース画分が含有する固形分としては、特に限定されないが、好ましくは、１００ｇ乾燥質量／Ｌ以上、より好ましくは、２００ｇ乾燥質量／Ｌ以上である。
　（２）工程（１）で得られたセルロース画分のセルロース加水分解酵素による処理(工程（２））
　セルロース加水分解酵素は、セルロースのβ－１，４－グルコシド結合を加水分解してグルコースを生成する。この過程を糖化という。セルロース加水分解酵素としては、例えば、エンドβ－１，４－グルカナーゼ（以下、単に「エンドグルカナーゼ」という）、セロビオヒドロラーゼ、およびβ－グルコシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
　エンドグルカナーゼは、セルラーゼと称される酵素であり、セルロースを分子内部から切断し、グルコース、セロビオース、およびセロオリゴ糖（重合度が３以上であり、そして通常、１０以下であるが、これに限定されない）を生じる。エンドグルカナーゼは、非結晶化されたセルロース、可溶性セロオリゴ糖、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性が高いが、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルへの反応性は低い。エンドグルカナーゼは、非晶性セルロースを加水分解する酵素の一つの例である。エンドグルカナーゼとしては、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ（特に、ＥＧＩＩ）が挙げられるが、これに限定されない。
　セロビオヒドロラーゼは、セルロースの還元末端または非還元末端のいずれかから分解してセロビオースを遊離する。セロビオヒドロラーゼは、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルのような結晶性セルロースを分解するが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性は低い。セロビオヒドロラーゼは、結晶性セルロースを加水分解する酵素の一つの例である。結晶性セルロースの分子間および分子内の密な水素結合による強固な構造に起因して、セロビオヒドロラーゼによる結晶性セルロースの加水分解は、エンドグルカナーゼによる非晶性セルロースの加水分解に比較して遅い。セロビオヒドロラーゼには２種類あり、それぞれセロビオヒドロラーゼ１およびセロビオヒドロラーゼ２と称される。セロビオヒドロラーゼとしては、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ（特に、ＣＢＨ２）が挙げられるが、これに限定されない。
　β－グルコシダーゼは、セルロースにおいては、非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素である。β－グルコシダーゼは、アグリコンまたは糖鎖とβ－Ｄ－グルコースとのβ１，４－グルコシド結合を切断し、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生成する。β－グルコシダーゼは、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解する酵素の一つの例である。β－グルコシダーゼは現在、１種類知られており、β－グルコシダーゼ１と称される。β－グルコシダーゼとしては、例えば、アスペルギルス・アクレアータス由来β－グルコシダーゼ（特に、ＢＧＬ１）挙げられるが、これに限定されない。
　セルロース加水分解酵素製剤としては、上記セルロース加水分解酵素を含む製剤であれば、特に限定されない。市販の酵素製剤でもよいし、酵素産生微生物などを培養して調製したものでもよい。セルロース加水分解酵素の活性は、１分間にろ紙（例えば、Ｆｉｌｔｅｒ　Ｐａｐａｒ：ワットマン社製Ｎｏ．１フィルター）から１μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量（１ＦＰＵ）で表される。セルロース加水分解酵素の処理濃度としては、特に限定されないが、好ましくは、４ＦＰＵ～２０ＦＰＵ／ｇセルロース画分である。セルロース加水分解酵素の処理時間としては、特に限定されないが、好ましくは０．５時間～１０時間、より好ましくは０．５時間～８時間、さらに好ましくは０．５時間～６時間である。セルロース加水分解酵素の処理温度は、酵素が働く温度であれば、特に限定されない。好ましくは、４０℃～８０℃である。
　この工程により、セルロース画分から糖化バイオマスを得ることができる。糖化バイオマスとは、糖化処理して得られたバイオマスをいい、例えば、セルロースの加水分解により生成したグルコース（単糖）を主成分として含む。糖化バイオマスの形状としては、特に限定されないが、例えば、スラリー状が挙げられる。
　この工程において、酵母の栄養源を添加してもよい。酵母の栄養源としては、特に限定されないが、例えば、ＹＰ（酵母エキス１０ｇ／Ｌおよびポリペプトン２０ｇ／Ｌを含有する）、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）およびこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは、コーンスティープリカーである。コーンスティープリカーは安価であるため、エタノール発酵に要するコストを抑えることができる。酵母の栄養源の添加量としては、特に限定されないが、例えば、ＹＰを添加する場合、１×ＹＰから１０×ＹＰのいずれであってもよく、酵素処理液の全体液量約４８ｍＬに対して、例えば、５ｍＬであり、例えば、コーンスティープリカーを添加する場合、例えばセルロース画分をセルロース加水分解酵素で処理する際に調製される酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対してコーンスティープリカーの含有量は、例えば、０．０５質量％～２質量％であり、好ましくは、０．０６２５質量％～１質量％であり、より好ましくは、０．１２５質量％～０．５質量％である。酵母の栄養源を添加する時期としては、特に限定されないが、セルロース画分をセルロース加水分解酵素で処理する前または後あるいは処理の間であってもよい。
　（３）工程（２）で得られた糖化バイオマスと酵母との混合によるエタノール発酵(工程（３））
　酵母としては、グルコースを基質としてエタノール発酵し得る限り、特に限定されない。野生株酵母であってもよいし、形質転換酵母であってもよい。形質転換酵母は、当業者が通常用いる方法により適宜作製される。
　特に限定されないが、サッカロマイセス属に属する酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビシエがさらに好ましい。サッカロマイセス・セレビシエの菌株としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株（Ｍｏｕｋａｍｎｅｒｄら、Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１０年、第８８巻、ｐ．８７－９４）、およびサッカロマイセス・セレビシエＫＦ－７株（Ｔｉｎｇら、Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００６年、第４１巻、ｐ．９０９－９１４）が挙げられる。
　形質転換酵母は、例えば、工程（２）のセルロース加水分解酵素製剤によるリグノセルロース系バイオマスの糖化を促進するための酵素を発現させた酵母であり得る。このような酵素としては、特に限定されないが、例えば、フェルラ酸エステラーゼ、β－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ペクチナーゼ、およびこれらの１または２種の組み合わせが挙げられる。好ましくは、フェルラ酸エステラーゼを発現するように形質転換された酵母である。
　フェルラ酸エステラーゼは、フェルラ酸とグリセロールとの間でエステル化反応を生じさせる酵素をいう。フェルラ酸エステラーゼは、リグノセルロース系バイオマス中のリグニンと多糖を繋ぐフェルラ酸を加水分解する作用を示す。この作用によりリグノセルロース系バイオマスの構造が緩む（すなわち、リグノセルロース系バイオマスの構造の一部を分解する）ことにより、セルロース加水分解酵素製剤による糖化を促進することができる。フェルラ酸エステラーゼとしては、特に限定されないが、例えば、アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ））、およびペニシリニウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（例えば、ペニシリニウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、およびタラモマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、タラモマイセス・フニクロサス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｓ））に由来するフェルラ酸エステラーゼが挙げられる。フェルラ酸エステラーゼをコードする遺伝子として、例えば、タラモマイセス・フニクロサス由来遺伝子（ＦａｅＡ：ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＪ３１２２９６）が挙げられる。
　ペクチナーゼは、高等植物の細胞壁に含まれているペクチン質を分解する酵素群の総称をいう。ペクチナーゼとしては、特に限定されないが、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌類、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｏｓｐｏｒｏｎ）、エンドマイセス属（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ）、エンドマイコプシス属（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア属（Ｐｉｃｈｉa）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンセニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、およびクルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母類、ならびにアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）に属する糸状菌類に由来するペクチナーゼが挙げられる。
　β－グルコシダーゼは、上述のβ－グルコシダーゼを用いることができる。
　β－ガラクトシダーゼは、ラクトースをガラクトースおよびグルコースに分解させる酵素をいう。β－ガラクトシダーゼはペクチン中のガラクタンを分解し、植物細胞壁の構造を緩める（すなわち、リグノセルロース系バイオマスの構造の一部を分解する）作用を示す。これによってリグノセルロース系バイオマスが軟化され、セルロース加水分解酵素製剤による糖化を促進することが期待される。β－ガラクトシダーゼとしては、特に限定されないが、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ））、およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）(例えば、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚｏｅ））に由来するβ－ガラクトシダーゼが挙げられる。
　上記酵素をコードする遺伝子は、例えば、それらの由来生物から調製したゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、その構造遺伝子の配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅して取得し得る。
　上記酵素は、例えば、酵母から分泌するか、または酵母表層に提示するように発現させてもよい。
　本発明において、酵素を酵母の細胞表層に提示させる方法は、当業者に公知のものが採用され得、例えば、細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカー（特開平１１－２９００７８号公報）、または糖鎖結合ドメイン（国際公開第０２／０８５９３５号）を利用することができる。これらの方法に用いられる細胞表層局在タンパク質としては、例えば、α－またはａ－アグルチニン（酵母の凝集性タンパク質）、ＦＬＯタンパク質（例えば、ＦＬＯ１、ＦＬＯ２、ＦＬＯ４、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０およびＦＬＯ１１）、およびアルカリホスファターゼが挙げられる。
　ＧＰＩアンカーを用いて酵素を細胞表層に提示する方法としては、例えば、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ－目的遺伝子－ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡからなる組換えＤＮＡを用いる方法が挙げられる。この組換えＤＮＡから発現され、細胞膜外に分泌されたグルコアミラーゼはＧＰＩアンカー付着認識シグナルを介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合し得る。ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列としては、例えば、酵母のα－アグルチニンのＣ末端から数えて３２０アミノ酸の配列中に存在するＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が利用され得る。
　糖鎖結合ドメインを用いて酵素を細胞表層に提示する方法としては、例えば、酵素を細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）のＮ末端側、Ｃ末端側、またはＮ末端側とＣ末端側との両方に結合させた組換えＤＮＡを用いる方法が挙げられる。この組換えＤＮＡから発現され、細胞膜外に分泌された酵素は糖鎖結合ドメインが有する複数の糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用を行うことによって、細胞表層に留まり得る。凝集機能ドメインとしては、例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位が挙げられ、代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。
　組換えＤＮＡに用いられる分泌シグナル配列は、特に限定されず、酵素の分泌シグナルであってもよいし、細胞表層局在タンパク質の分泌シグナル配列であってもよいし、酵素を細胞外へ導くことができる他の分泌シグナル配列であってもよい。酵素活性に影響を及ぼさなければ、細胞表層提示後に分泌シグナル配列およびプロ配列の一部または全部がＮ末端に残っていてもよい。
　本発明において、酵素を酵母から分泌させる方法は、例えば、上記分泌シグナル配列をコードするＤＮＡの下流に、目的の酵素をコードする遺伝子を連結させた組換えＤＮＡを酵母に導入することによって行われ得る。
　上記組換えＤＮＡの合成および結合は、例えば、当業者が通常用いる方法により行うことができる。
　上記組換えＤＮＡは、発現ベクターに組み込まれてもよい。このような発現ベクターは、例えば、プラスミドの形態である。例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製起点（Ｏｒｉ）とＣｏｌＥ１の複製起点とを有するプラスミドが好適に用いられる。プラスミドは、プラスミドの調製および形質転換体の検出を容易にする点で、選択マーカーと大腸菌用の複製遺伝子とを有することが好ましい。選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子、および栄養要求性遺伝子が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、およびカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）が挙げられるが、特に限定されない。栄養要求性遺伝子としては、例えば、Ｎ－（５'－ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）遺伝子、リンゴ酸β－イソプロピル脱水素酵素（ＬＥＵ２）遺伝子、イミダゾールグリセロールリン酸脱水素酵素（ＨＩＳ３）遺伝子、ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＩＳ４）遺伝子、ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＵＲＡ１）遺伝子、およびオロチジン－５－リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）遺伝子が挙げられるが、特に限定されない。酵母用の複製遺伝子は必要に応じて選択される。
　発現ベクターは、目的の酵素をコードする遺伝子を酵母で発現させるために適切なプロモーターおよびターミネーターを有することが好ましい。プロモーターおよびターミネーターとしては、例えば、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’－リン酸脱水素酵素）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＰＹＫ（ピルビン酸キナーゼ）、ＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）のプロモーターおよびターミネーターが挙げられるが、特に限定されない。これらのプロモーターとターミネーターとの間に目的の酵素をコードする遺伝子が挿入される。
　酵母に組換えＤＮＡを導入する方法は特に限定されない。例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、およびプロトプラスト法が挙げられる。導入された組換えＤＮＡは、例えば、プラスミドの形態で存在してもよく、または酵母の染色体に挿入された形態あるいは酵母の染色体に相同組換えにより組み込まれた形態で存在してもよい。
　組換えＤＮＡが導入された酵母は、選択マーカーで選択され、発現された酵素の活性を測定することにより選択される。目的の酵素が細胞表層に提示されていることは、例えば、当該酵素に対する抗体を用いて確認することができる。
　最初の発酵開始時の酵母の菌体濃度は、特に限定されない。好ましくは、２ｇ～２０ｇ湿重量／Ｌ（１×１０７個／ｍＬ～１×１０８個／ｍＬ）程度である。酵母の培養条件は、特に限定されない。通常、グルコースを基質としてエタノール発酵する際の条件であってよい。培養温度は、例えば、３０℃～３７℃である。培養ｐＨは、例えば、４～８である。
　本発明の方法では、短時間で発酵を終了させることができるため、培養時間は、通常、２日間～３日間である。発酵の終了は、例えば、炭酸ガスの発生量が発酵開始時の１０分の１以下になったことなどを目安に判断する。
　（４）工程（３）で得られた発酵物の固液分離(工程（４））
　発酵終了後の発酵物は、酵母および発酵産物のエタノールのほか、原料に由来するリグニンおよび灰分などの固体も含む。すなわち、固体を含むスラリー状もまた包含される。発酵終了後の発酵物中の酵母の菌体濃度としては、特に限定されないが、例えば、最初の醗酵開始時の菌体濃度が１×１０７個／ｍＬ～５×１０８個／ｍＬ程度の場合、１×１０７個／ｍＬ～５×１０８個／ｍＬ、好ましくは、５×１０７個／ｍＬ～５×１０８個／ｍＬ、より好ましくは、１×１０８個／ｍＬ～５×１０８個／ｍＬである。固液分離工程の組み合わせを用いて、この発酵物から酵母を効率よく回収して再利用する。固液分離工程の組み合わせとしては、特に限定されないが、好ましくは（ａ）発酵物の５質量％～３０質量％の固体部を除去する工程(工程（４）（ａ））、および（ｂ）当該工程（４）（ａ）で得られた残部の５質量％～３０質量％の固体部を回収する工程(工程（４）（ｂ））の組み合わせである。
　（ａ）発酵物の５質量％～３０質量％の固体部を除去する工程(工程（４）（ａ））
　この工程では、酵母を液体部に回収する。このため、工程（３）で得られた発酵物の５質量％～３０質量％、好ましくは５質量％～２０質量％の固体部を除去する。固体部を除去するための手段としては、特に限定されないが、好ましくは１００Ｇ～１０００Ｇの遠心分離、ハイドラシーブ、およびデカンターが挙げられる。この工程で、固体部としてリグリンおよび灰分の大半が除去される。
　（ｂ）工程（４）（ａ）で得られた残部の５質量％～３０質量％の固体部を回収する工程(工程（４）（ｂ））
　この工程では、酵母を固体部に回収する。工程（４）（ａ）で得られた残部の５質量％～３０質量％、好ましくは２０質量％～３０質量％の固体部を回収する。固体部を回収するための手段としては、特に限定されないが、好ましくは１２００Ｇ～５０００Ｇの遠心分離、フィルタープレス、およびオリバーフィルターが挙げられる。この工程で、液体部として発酵産物のエタノールの大半が回収される。
　工程（４）の酵母回収率は、特に限定されないが、好ましくは５０％以上である。リグニンおよび灰分などの残渣帯同率は、特に限定されないが、好ましくは１０％以下である。
　本発明の方法では、上記工程（１）～（４）からなるサイクルを２回以上、好ましくは６回以上繰り返す。そして、上記工程（４）で得られた酵母を、次のサイクルの工程（３）の酵母の全部または一部として利用する。次のサイクルの工程（３）で用いる酵母のうち、工程（４）で得られた酵母の割合は、５０質量％～１００質量％、好ましくは８０質量％～１００質量％である。
　本発明の方法では、発酵に用いる酵母の新たな供給を少量に抑えることができるため、コストを低減することができる。
　以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　（実施例１：稲ワラを用いたエタノール発酵１）
　（工程１：稲ワラの水熱処理）
　稲ワラを約２０質量％（乾燥質量）の含量となるように水と混合し、これを水熱処理装置（三菱重工業株式会社製）に入れ、約１８０℃および約３ＭＰａにて５分間～２０分間処理した。次いで、固形分を分離し、分離した固形分を発酵基質として用いた。
　（工程２：酵素処理）
　工程１で得られた稲ワラ水熱処理固形分を含む酵素処理液約４８ｍＬを調製した。その組成を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　この酵素処理液を５０ｍＬ容量のプラスチック製試験管（コーニング社製）に入れ、サーモブロックローテーター（株式会社日伸理化製ＳＮ－０６ＢＮ）を用いて、５０℃にて３５ｒｐｍの回転速度で酵素処理を行った。
　（工程３：エタノール発酵１サイクル目）
　発酵には、酵母サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株（Ｍｏｕｋａｍｎｅｒｄら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１０年、第８８巻、ｐ．８７－９４）を用いた。
　上記酵母について、５ｍＬのＹＰＤ液体培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ，ポリペプトン２０ｇ／Ｌ，グルコース２０ｇ／Ｌ）を含む試験官で種培養を一晩行い、次いで培養液を５００ｍＬのＹＰＤ液体培地を含むフラスコに移し、本培養を２日間行った。この培養液を遠心分離し（３０００ｒｐｍ，４℃，１０分間）、酵母菌体を滅菌蒸留水により２度洗浄後、１００ｇ湿重量／Ｌの菌体濃度になるように滅菌蒸留水に懸濁した。
　工程２の酵素処理開始から２時間経過後、酵素処理液４８ｍＬを８０ｍＬ容量のねじ口瓶（デュラン社製）に移した。さらに、上記酵母懸濁液２ｍＬを添加して、菌体濃度を４ｇ湿重量／Ｌとした。酵母添加後、３７℃にて発酵を開始した。
　発酵液中に生産されたエタノール濃度を、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙシステム；株式会社日立ハイテクフィールディング、ＬａＣｈｒｏｍ　Ｅｌｉｔｅ）により経時的に定量した。ＨＰＬＣの分離用カラムにはＵＬＴＲＯＮ　ＰＳ－８０Ｈ（信和化工株式会社，３００ｍｍ（Ｌ）×８ｍｍ（ＩＤ））を用い、移動相には超純水（日本ミリポア株式会社製Ｍｉｌｌｉ－Ｑによる精製水）を用い、そして検出器には屈折率検出器を用いた。ＨＰＬＣの条件は、送液量０．９ｍＬ／分およびカラム温度５０℃とした。また、発酵液中の酵母の菌体濃度を、ＹＰＤ寒天培地（ＹＰＤ液体培地に寒天を２０ｇ／Ｌ加えたもの）に塗布して３０℃にて２日間培養し、コロニー数を計測することによって経時的に定量した。
　（工程４：エタノール発酵２サイクル目）
　発酵開始から４８時間後、発酵液を回収し、遠心分離機を用いて低回転数（１００Ｇ）にて遠心分離した。２０質量％の沈殿（固体部；リグニンおよび灰分を多量に含む）と８０質量％の上澄み（液体部）とに分離された。次いで、上澄みを回収し、遠心分離機を用いて高回転数（１２００Ｇ）にて遠心分離した。８０質量％の上澄み（液体部；エタノールを含む）と２０質量％の沈殿（固体部；酵母を多量に含む）とに分離された。発酵液の物質収支を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　次いで、沈殿を回収し、上記工程２と同様にして得られた酵素処理液４８ｍＬに添加した。酵母の菌体濃度は１．５ｇ湿重量／Ｌ（７．６×１０６個／ｍＬ：エタノール発酵２サイクル目開始時）であった。酵母添加後、３７℃にて上記工程３と同様にして発酵を開始した。工程３と同様にして、発酵液中のエタノール濃度および酵母の菌体濃度を経時的に定量した。エタノール発酵２サイクル目終了時における酵母の菌体濃度は６．４ｇ湿重量／Ｌ（３．２×１０７個／ｍＬ）であり、発酵開始時から増加していた。
　（工程５：エタノール発酵３～６サイクル目）
　上記工程４を同様にさらに４回繰り返した。発酵液中に生産されたエタノール濃度および酵母の菌体濃度を経時的に定量した結果を図１に示す。
　図１から明らかなように、酵母を再利用して４～６回発酵を繰り返しても問題なくエタノール発酵を継続することができた。別途調製した酵母を追加投入する必要はなかった。各発酵サイクル終了後の酵母を含む固体部を、次のサイクルの発酵液に対し１０質量％～２０質量％の割合で投入することによって、発酵液中の酵母の菌体濃度を一定（各発酵サイクル開始時に１０６個／ｍＬ～１０７個／ｍＬ程度および終了時に１０７個／ｍＬ以上）に維持しながら長期間エタノール発酵することができるとわかった。
　（実施例２：稲ワラを用いたエタノール発酵２）
　実施例１の工程４において、遠心分離機を用いて低回転数（１００Ｇ）にて遠心分離したことに代えてハイドラシーブ（東洋スクリーン工業株式会社製；０．１ｍｍスクリーン）を用いてろ過分離したこと以外は実施例１と同様に実験を行った。回収されたろ液（液体部）は８５質量％であった。
　（実施例３：稲ワラを用いたエタノール発酵３）
　実施例１の工程４において、遠心分離機を用いて低回転数（１００Ｇ）にて遠心分離したことに代えてマイクロセパレータ（ＴＳＫ－８０バスケット型遠心分離機；Σ：３１ｍ２，ボウル容量：７Ｌ、ソリッドスペース：４．８Ｌ）を用いて通液量５０Ｌ／Ｈにて遠心分離したこと、および遠心分離機を用いて高回転数（１２００Ｇ）にて遠心分離したことに代えてディスク型遠心分離機（アルファ・ラバル社製ＬＡＰＸ４０４；Σ：５２３０ｍ２，ボウル容量：２．２Ｌ，ソリッドスペース：１．１Ｌ）を用いて通液量１００Ｌ／Ｈにて遠心分離したこと以外は実施例１と同様に実験を行った。最初の遠心分離で回収された上澄み（液体部）は８３質量％であった。２回目の遠心分離で回収された沈殿（固体部）は２５質量％であった。各画分中の酵母の菌体濃度を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３から明らかなように、マイクロセパレータから回収された上澄み（液体部）中の酵母の菌体濃度は６．４×１０６個／ｍＬであり、ディスク型遠心分離機から回収された上澄み（液体部）中に酵母はほとんど存在せず、沈殿（固体部）中に多量の酵母（５．７×１０７個／ｍＬ）が存在していた。この固体部中の酵母の菌体濃度は、図１から明らかなように、固体部を次のサイクルの発酵液に対し１０質量％～２０質量％の割合で投入した場合でもエタノール発酵が可能な菌体濃度である。したがって、上記実施例の固液分離方法で分離された酵母を再利用することによって、長期間エタノール発酵することができるとわかった。
　（実施例４：稲ワラを用いたエタノール発酵４）
　実施例１の工程２において、５．０ｍＬの１０×ＹＰに代えて、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）を酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して０．０６２５質量％になるように添加して酵素処理液を調製したこと以外は、実施例１と同様にしてエタノール発酵を行った。
　（実施例５：稲ワラを用いたエタノール発酵５）
　コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して０．１２５質量％になるように添加して酵素処理液を調製したこと以外は、実施例４と同様にしてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度を経時的に定量した結果を図２に示す。
　（実施例６：稲ワラを用いたエタノール発酵６）
　コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して０．２５質量％になるように添加して酵素処理液を調製したこと以外は、実施例４と同様にしてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度を経時的に定量した結果を図２に示す。
　（実施例７：稲ワラを用いたエタノール発酵７）
　コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して０．５質量％になるように添加して酵素処理液を調製したこと以外は、実施例４と同様にしてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度を経時的に定量した結果を図２に示す。
　図２から明らかなように、コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対してそれぞれ０．１２５質量％(実施例５）、０．２５質量％(実施例６）および０．５質量％(実施例７）になるように添加した場合、発酵サイクルを繰り返しても安定してエタノール発酵をすることができた。コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して０．０６２５質量％(実施例４）になるように添加した場合、３回目および４回目の発酵サイクル終了後のエタノール濃度において減少がみられたものの、１回目および２回目の発酵サイクル終了後のエタノール濃度において減少はみられなかった。このことから、ＹＰのように高価な栄養源に代えて、コーンスティープリカーのように安価な栄養源を用いても、充分にエタノール発酵が行われたことがわかる。
　（実施例８：バガスを用いたエタノール発酵１）
　実施例１の工程１において、原料として稲ワラに代えてバガスを用い、かつ工程２において、酵素処理液中の５．０ｍＬの１０×ＹＰに代えて、コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して０．２５質量％になるように添加して酵素処理液を調製したこと以外は、実施例１と同様にしてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度を経時的に定量した結果を図３に示す。
　（実施例９：バガスを用いたエタノール発酵２）
　コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して０．５質量％になるように添加して酵素処理液を調製したこと以外は、実施例８と同様にしてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度を経時的に定量した結果を図３に示す。
　（実施例１０：バガスを用いたエタノール発酵３）
　コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して１質量％になるように添加して酵素処理液を調製したこと以外は、実施例８と同様にしてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度を経時的に定量した結果を図３に示す。
　図３から明らかなように、バガスを原料として用いた場合においても、実施例４～７と同様、コーンスティープリカーの添加により、発酵サイクルを繰り返しても安定してエタノール発酵が行われた。したがって、リグノセルロース系バイオマスの種類を問わず、安価なコーンスティープリカーを用いることによって、エタノール生産のコストを抑えることができたことがわかる。なお、稲ワラとバガスとは構成成分が異なるため、実施例４の結果と比較して、同量のコーンスティープリカーを用いてもエタノールの生産量に差異が生じたと考えられる。
　（実施例１１～１４：ネピアグラスを用いたエタノール発酵）
　（工程１：ネピアグラスの圧搾および蒸煮）
ネピアグラスを一軸エクストルーダーによって７９．７Ｎ・ｍの条件で圧搾して不要な液体分をあらかじめ取り除き、残渣に対して１質量％の硫酸を含浸させ、１．０Ｍｐａの圧力下、１８０℃にて３０分間蒸煮した。次いで、固形分を分離し、分離した固形分を発酵基質として用いた。
　（工程２：酵素処理）
　酵素処理液中の栄養源として、１×ＹＰ、コーンスティープリカー１．０質量％または０．１質量％（酵素処理液の全体液量に対する濃度）あるいは水を使用して、工程１で得られたネピアグラスの圧搾および蒸煮固形分を含む４種の酵素処理液約４８ｍＬをそれぞれ調製した（実施例１１～１４）。その組成を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　これらの４種類の酵素処理液をそれぞれ５０ｍＬ容量のプラスチック製試験管（コーニング社製）に入れ、サーモブロックローテーター（株式会社日伸理化製ＳＮ－０６ＢＮ）を用いて、５０℃にて３５ｒｐｍの回転速度で酵素処理を行った。その後、実施例１の工程３～工程５と同様にしてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度を経時的に定量した結果を図４に示す。
　図４から明らかなように、酵素処理液中の栄養源として、１×ＹＰ(実施例１１）、コーンスティープリカー１．０質量％(実施例１２）ならびに０．１質量％(実施例１３）および水(実施例１４）のいずれを用いた場合であっても、同程度のエタノールが生産されていることがわかった。このことから、ネピアグラスを圧搾および蒸煮して得られた固形分を用いた場合、アルコール発酵の発酵サイクル毎に栄養源を添加しなくても、安定してエタノール発酵が行われたことがわかる。
　（調製例１：ＦａｅＡ表層提示酵母の作製）
　遺伝子発現に必要なプロモーターとターミネーター、および酵母表層提示に必要なα-アグルチニン遺伝子を含むプラスミドとしてｐＧＫ４０６ＡＧ(特開２０１１－１４２８７９号公報)を用いた。ＦａｅＡをクローニングするために、タラモマイセス・フニクロサス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｓ）培養菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列を含むプライマーＳａｌＩ－ｓｓＦａｅＡ－Ｆｗ（配列番号１）と、プライマーＳａｌＩ－ＦａｅＡ－Ｒｖ（配列番号２）とを用いてＰＣＲを行った。これにより得られた遺伝子断片をＳａｌＩで消化し、ｐＧＫ４０６ＡＧのＳａｌＩサイトに挿入することでプラスミドｐＧＫ４０６－ｓｓＦａｅＡ－ＡＧを構築した。
　酵母に導入するベクターとして、ｐＡＵＲ１０１（タカラバイオ株式会社製）を用いた。ｐＡＵＲ１０１のＳｐｈＩサイトに上記で構築したｐＧＫ４０６－ｓｓＦａｅＡ－ＡＧのｐＧＫプロモーター、分泌シグナル配列、ＦａｅＡ及びα－アグルチニンのカセットを挿入するために、ｐＧＫ４０６－ｓｓＦａｅＡ－ＡＧを鋳型にしてプライマーｐＡｕＲ１０１－ＳｐｈＩ－Ｆｗ（配列番号３）とプライマーｐＡｕＲ１０１－ＳｐｈＩ－Ｒｖ（配列番号４）とを用いてＰＣＲを行った。この遺伝子断片をＳｐｈＩで切断したｐＡＵＲ１０１にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて挿入し、ＦａｅＡ酵母表層提示用プラスミドｐＡＵＲ１０１－ｐＧＫ－ｓｓＦａｅＡ－ＡＧを構築した。このｐＡＵＲ１０１－ｐＧＫ－ｓｓＦａｅＡ－ＡＧをＳｔｕＩで切断後、ＹＥＡＳＴ　ＭＡＫＥＲ酵母形質転換システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用い、酵母（サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株）に形質転換し、オーレオバシジンＡ（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ　Ａ）耐性株を取得し、ＦａｅＡ表層提示酵母を得た。得られたＦａｅＡ表層提示酵母を以下の実施例１５および１６に用いた。
　（実施例１５：ＦａｅＡ表層提示酵母を用いたエタノール発酵１）
　（工程１：バガスの水熱処理）
　バガスを約２０質量％（乾燥質量）の含量となるように水と混合し、これを水熱処理装置（三菱重工業株式会社製）に入れ、約１８０℃および約３ＭＰａにて５分間～２０分間処理した。次いで、固形分を分離し、分離した固形分を発酵基質として用いた。
　（工程２：酵素処理）
　工程１で得られたバガス水熱処理固形分を含む酵素処理液約４８ｍＬを調製した。その組成を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　この酵素処理液を５０ｍＬ容量のプラスチック製試験管（コーニング社製）に入れ、サーモブロックローテーター（株式会社日伸理化製ＳＮ－０６ＢＮ）を用いて、５０℃にて３５ｒｐｍの回転速度で酵素処理を行った。
　（工程３：エタノール発酵１サイクル目）
　発酵には、調製例１で得られたＦａｅＡ表層提示酵母を用いた。なお、コントロールとして、酵母サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株を用いてエタノール発酵を行った。
　上記酵母について、５ｍＬのＹＰＤ液体培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌおよびグルコース２０ｇ／Ｌを含有する液体培地）を含む試験管で種培養を一晩行い、次いで培養液を５００ｍＬのＹＰＤ液体培地を含むフラスコに移し、本培養を２日間行った。この培養液を遠心分離し（３０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）、沈殿した酵母菌体を滅菌蒸留水により２度洗浄した。
　工程２の酵素処理開始から２時間経過後、酵素処理液４８ｍＬを８０ｍＬ容量のねじ口瓶（デュラン社製）に移した。さらに、上記酵母を２０ｇ湿重量／Ｌとなるように添加して、３７℃にて発酵を開始した。
　発酵液中に生産されたエタノール濃度を、ＨＰＬＣ（株式会社日立ハイテクフィールディング、ＬａＣｈｒｏｍ　Ｅｌｉｔｅ）により経時的に定量した。ＨＰＬＣの分離用カラムにはＵＬＴＲＯＮ　ＰＳ－８０Ｈ（信和化工株式会社，３００ｍｍ（Ｌ）×８ｍｍ（ＩＤ））を用い、移動相には超純水（日本ミリポア株式会社製Ｍｉｌｌｉ－Ｑによる精製水）を用い、そして検出器には屈折率検出器を用いた。ＨＰＬＣの条件は、送液量０．９ｍＬ／分およびカラム温度５０℃とした。また、発酵液中の酵母の菌体濃度を、ＹＰＤ寒天培地（ＹＰＤ液体培地に寒天を２０ｇ／Ｌ加えたもの）に塗布して３０℃にて２日間培養し、コロニー数を計測することによって経時的に定量した。
　（工程４：エタノール発酵２サイクル目）
　発酵開始から４８時間後、発酵液を回収し、遠心分離機を用いて低回転数（１００Ｇ）にて遠心分離した。２０質量％の沈殿（固体部；リグニンおよび灰分を多量に含む）と８０質量％の上澄み（液体部）とに分離された。次いで、上澄みを回収し、遠心分離機を用いて高回転数（１２００Ｇ）にて遠心分離した。８０質量％の上澄み（液体部；エタノールを含む）と２０質量％の沈殿（固体部；酵母を多量に含む）とに分離した。
　次いで、沈殿を回収し、上記工程２と同様にして得られた酵素処理液４８ｍＬに添加した。酵母添加後、３７℃にて上記工程３と同様にして発酵を開始した。工程３と同様にして、発酵液中のエタノール濃度および酵母の菌体濃度を経時的に定量した。
　（工程５：エタノール発酵３サイクル～４サイクル目）
　上記工程４を同様にさらに２回繰り返した。発酵液中に生産されたエタノール濃度およびの酵母の菌体濃度を経時的に定量した結果を図５に示す。
　（実施例１６：ＦａｅＡ表層提示酵母を用いたエタノール発酵２）
　バガスの水熱処理固形分を１５０ｇ／Ｌ（乾燥重量基準）になるように添加して酵素処理液を調製(表５）したこと以外は、実施例１５と同様にして、ＦａｅＡ表層提示酵母およびコントロール（酵母サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株）を用いてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度および酵母の菌体濃度を経時的に定量した結果を図６に示す。
　図５および６の結果から明らかなように、ＦａｅＡ表層提示酵母を用いた場合、バガス水熱処理物を乾燥重量基準で２００ｇ／Ｌ（実施例１５）および１５０ｇ／Ｌ（実施例１６）用いた場合のいずれにおいても、野生酵母ＴＪ１４株と比較して、より多くのエタノールが安定して生産されていたことがわかる。また、フェルラ酸エステラーゼを表層提示した酵母は、バガス水熱処理物のセルラーゼによる糖化を促進し、野生酵母ＴＪ１４株よりも高いエタノール生産量を示していたことがわかる。さらに、発酵液中の酵母の菌体濃度を一定（各発酵サイクル開始時に１０６個／ｍＬ～１０７個／ｍＬ程度および終了時に１０７個／ｍＬ以上）に維持しながら長期間エタノール発酵することができたことがわかる。
　本発明の方法によれば、リグノセルロース系バイオマスのエタノール発酵物から比重の大きい残渣を除去した後の、酵母を含む一定量の残渣を次のサイクルの発酵に用いることによって、酵母の菌体濃度を１０６個／ｍＬ～１０７個／ｍＬ程度から１０７個／ｍＬ以上までの一定範囲に維持しながら、新たに酵母を供給することなく長期にわたって発酵を繰り返すことが可能になる。酵母は絶えず増殖を繰り返すため、鮮度が低下するという問題も生じない。新たに酵母を調製するためのコストを削減することができるため、低コストでエタノールを生産することができる。また、比重の大きい残渣による発酵阻害も抑制することができる。

Claims (7)

  1. 　リグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産方法であって、
    　（１）リグノセルロース系バイオマスを前処理する工程、
    　（２）工程（１）で得られたセルロース画分をセルロース加水分解酵素で処理する工程、
    　（３）工程（２）で得られた糖化バイオマスと酵母とを混合してエタノール発酵する工程、および
    　（４）工程（３）で得られた発酵物を固液分離する工程
    を含み、
    　工程（１）、（２）、（３）および（４）からなるサイクルを２回以上繰り返し、そして
    　工程（４）で得られた酵母を、次のサイクルの工程（３）の酵母の全部または一部として用いる、方法。
  2. 　前記工程（４）が、
    　（ａ）前記発酵物の５質量％から３０質量％の固体部を除去する工程、および
    　（ｂ）工程（ａ）で得られた残部の５質量％から３０質量％の固体部を回収する工程
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記発酵物中の酵母の菌体濃度が、１０７個／ｍＬ以上である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記酵母が、フェルラ酸エステラーゼ、β－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１または２種の酵素を発現するように形質転換された酵母である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記酵素が、表層提示されている、請求項４に記載の方法。
  6. 　リグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産のための、酵母を含有する組成物であって、
    　該酵母が、フェルラ酸エステラーゼ、β－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１または２種の酵素を発現するように形質転換されている、組成物。
  7. 　前記酵素が、表層提示されている、請求項６に記載の組成物。
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