JPWO2013146540A1 - エタノールの生産方法 - Google Patents

Abstract

酵母を用いて、リグノセルロース系バイオマスから低コストでエタノールを生産する方法を提供する。本発明のリグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産方法は、（１）リグノセルロース系バイオマスを前処理する工程、（２）工程（１）で得られたセルロース画分をセルロース加水分解酵素で処理する工程、（３）工程（２）で得られた糖化バイオマスと酵母とを混合してエタノール発酵する工程、および（４）工程（３）で得られた発酵物を固液分離する工程を含み、工程（１）、（２）、（３）および（４）からなるサイクルを２回以上繰り返し、そして工程（４）で得られた酵母を、次のサイクルの工程（３）の酵母の全部または一部として用いる。

Description

本発明は、エタノールの生産方法に関する。より詳細には、バイオマスからのエタノールの生産方法に関する。

近年、化石燃料の枯渇が危惧される中、その代替燃料の開発が進められている。中でもバイオマスに由来するバイオエタノールが注目されている。バイオマスは、再生可能な資源であり、地球上に大量に存在し、そして使用しても大気中の二酸化炭素が増えず（カーボンニュートラル）、地球温暖化防止に寄与することができるからである。

しかし、現在、生産されているバイオエタノールは、主にトウモロコシやサトウキビを原料としており、食糧との競合が問題となっている。このため、将来的には、食糧と競合しない稲ワラ、麦ワラ、廃材などのリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの生産が求められる。

リグノセルロース系バイオマスは、主にセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの３種類の成分から構成される。このうちセルロースは、加水分解によりグルコースまで分解（糖化）されると、グルコースを資化することができる酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などによるエタノール発酵に利用することができる。

セルロースを加水分解するには、通常、セルラーゼなどのセルロース加水分解酵素が用いられるが、酵素のセルロースへの作用を容易にするために、酵素反応の前にセルロースをバイオマスから分離し、露出させるための前処理が行われる。従来、前処理法としては、水熱分解法、酸処理法、アルカリ処理法が知られている。酸処理法としては、高温（２００℃以上）で希酸を用いる方法と、濃硫酸などを用いる方法とが知られている。しかし、水熱分解法や酸処理法は、過激な条件下でセルロースを部分分解するため、過分解物（副生成物）を生じ、グルコース収率（糖化率）が低いことや、エタノール発酵を阻害する物質をも生じ得ることが問題である。

リグノセルロース系バイオマスの前処理物は酵素処理に供される。酵素処理では、前処理物を構成するセルロース成分やヘミセルロース成分を加水分解し、オリゴ糖や単糖を生成する。しかしながら、糖化に使用する市販の酵素の力価が低いことにより十分な糖化には酵素を大量に必要とするため、コストが高くなるという問題がある。

一方、セルロース、ヘミセルロースなどを本来資化することができない酵母サッカロマイセス・セレビシエなどを、生物工学的手法を用いて改変することにより、バイオマスの前処理物から直接エタノールを生産させる試みがなされている。このような生物工学的手法として細胞表層提示技術が利用されている。例えば、セルロースを加水分解する酵素群、すなわちエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼなどを表層提示した酵母が、細胞表層提示技術によって作製されている（特許文献１）。

国際公開第２０１０／０３２７６２号

工業上の実用性を鑑みると、上記方法を組み合わせることでエタノールの生産性を向上させるための検討が必要である。特に、酵素処理法によりリグノセルロース系バイオマス前処理物の糖化を一定程度進めつつ、セルロース加水分解酵素群を細胞表層提示した酵母を用いてエタノール発酵させる方法が有力技術として検討されている。しかし、この方法では、１回の発酵ごとに酵母を調製および添加する必要があり、酵母の培養コストがエタノール製造コストに大きく影響を及ぼす。

本発明は、酵母を用いて、リグノセルロース系バイオマスから低コストでエタノールを生産する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、固液分離工程の組み合わせを用いて、発酵終了後の発酵物を再利用可能な酵母を効率よく分離することによって、リグノセルロース系バイオマスから低コストでエタノールを生産することができることを見出し、本発明を完成させた。

本発明は、リグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産方法を提供し、該方法は、（１）リグノセルロース系バイオマスを前処理する工程、（２）工程（１）で得られたセルロース画分をセルロース加水分解酵素で処理する工程、（３）工程（２）で得られた糖化バイオマスと酵母とを混合してエタノール発酵する工程、および（４）工程（３）で得られた発酵物を固液分離する工程を含み、工程（１）、（２）、（３）および（４）からなるサイクルを２回以上繰り返し、そして工程（４）で得られた酵母を、次のサイクルの工程（３）の酵母の全部または一部として用いる。

１つの実施態様では、上記工程（４）は、（ａ）発酵物の５質量％から３０質量％の固体部を除去する工程、および（ｂ）工程（ａ）で得られた残部の５質量％から３０質量％の固体部を回収する工程を含む。

１つの実施態様では、上記発酵物中の酵母の菌体濃度は、１０^７個／ｍＬ以上である。

１つの実施態様では、上記酵母が、フェルラ酸エステラーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１または２種の酵素を発現するように形質転換された酵母である。

１つの実施態様では、上記酵素が、表層提示されている。

さらに、本発明は、リグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産のための、酵母を含有する組成物を提供し、上記酵母が、フェルラ酸エステラーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１または２種の酵素を発現するように形質転換されている。

１つの実施態様では、上記酵素が、表層提示されている。

本発明の方法によれば、リグノセルロース系バイオマスのエタノール発酵物から比重の大きい残渣を除去した後の、酵母を含む一定量の残渣を次のサイクルの発酵に用いることによって、酵母の菌体濃度を１０^６個／ｍＬ〜１０^７個／ｍＬ程度から１０^７個／ｍＬ以上までの一定範囲に維持しながら、新たに酵母を供給することなく長期にわたって発酵を繰り返すことが可能になる。酵母は絶えず増殖を繰り返すため、鮮度が低下するという問題も生じない。新たに酵母を調製するためのコストを削減することができるため、低コストでエタノールを生産することができる。また、比重の大きい残渣による発酵阻害も抑制することができる。

稲ワラを原料として、酵母を繰返し再利用してエタノール発酵を行った場合の発酵液中のエタノール濃度および酵母の菌体濃度の経時変化を示すグラフである。 稲ワラを原料として、酵母を繰返し再利用してエタノール発酵を行った場合の発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。 バガスを原料として、酵母を繰返し再利用してエタノール発酵を行った場合の発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。 ネピアグラスを原料として、酵母を繰返し再利用してエタノール発酵を行った場合の発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。 バガスを原料として、ＦａｅＡ形質転換酵母を繰返し再利用してエタノール発酵を行った場合の発酵液中のエタノール濃度および酵母の菌体濃度の経時変化を示すグラフである。 バガスを原料として、ＦａｅＡ形質転換酵母を繰返し再利用してエタノール発酵を行った場合の発酵液中のエタノール濃度および酵母の菌体濃度の経時変化を示すグラフである。

本発明のリグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産方法は、（１）リグノセルロース系バイオマスを前処理する工程、（２）工程（１）で得られたセルロース画分をセルロース加水分解酵素で処理する工程、（３）工程（２）で得られた糖化バイオマスと酵母とを混合してエタノール発酵する工程、および（４）工程（３）で得られた発酵物を固液分離する工程を含む。

（１）リグノセルロース系バイオマスの前処理(工程（１））
バイオマスとは、生物資源に由来する糖質材料をいう。例えば、トウモロコシなどから得られるデンプン、サトウキビなどから得られる糖蜜（廃糖蜜）が挙げられる。リグノセルロース系バイオマスとは、主にセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの３種類の成分から構成されるバイオマスをいう。このうち、セルロースは、β−１，４−グルコシド結合によりグルコピラノース（グルコース）が連なった繊維状高分子であり、加水分解されて得られるグルコースが酵母などの発酵基質として利用される。

リグノセルロース系バイオマスの利用は、食糧と競合しない点で好ましい。リグノセルロース系バイオマスとしては、コメ、ムギ、トウモロコシ、サトウキビ、木材（パルプ）、ネピアグラス、などの生物材料の処理に際して生じる廃棄物などが挙げられる。例えば、稲ワラ、麦ワラ、バガス（サトウキビ搾汁後の残渣）、廃材が挙げられる。

前処理とは、例えば、セルロースをグルコースまで加水分解するために、セルラーゼなどのセルロース加水分解酵素で処理する前に、酵素のセルロースへの作用を容易にするために、酵素反応の前にセルロースをバイオマスから分離し、露出させる処理をいう。前処理法としては、特に限定されない。例えば、水熱分解法ならびに圧搾および蒸煮方法が挙げられる。

水熱分解法では、例えば、リグノセルロース系バイオマスを、必要に応じて粉砕し、例えば、約２０質量％（乾燥質量）の含量となるように水と混合し、この混合物を熱処理する。熱処理は、１２０℃〜３００℃、好ましくは１５０℃〜２８０℃、より好ましくは１８０℃〜２５０℃にて、１５秒間〜１時間行われる。処理温度および時間は用いるバイオマスによって変動し得、処理温度の上昇は処理時間を短縮し得る。なお、熱処理中に加圧してもよい。

圧搾および蒸煮方法では、リグノセルロース系バイオマスの圧搾および蒸煮が行われる。圧搾および蒸煮の順番は特に限定されず、当業者によって適宜設定することができる。圧搾方法としては、特に限定されないが、例えば、油圧式圧搾機、スクリュープレス、採肉機、プレス脱水機、または遠心分離機等によりリグノセルロース系バイオマスを圧搾する方法が挙げられる。蒸煮方法としては、特に限定されないが、例えば、リグノセルロース系バイオマスを高温の水蒸気により蒸煮する方法が挙げられる。蒸煮するための条件としては、特に限定されないが、例えば、リグノセルロース系バイオマスに対して１質量％〜５質量％の硫酸を含浸させて、１．０Ｍｐａ〜１．６Ｍｐａの圧力下、１８０℃〜２００℃にて５分〜３０分間蒸煮する条件が挙げられる。

リグノセルロース系バイオマスを前処理すると、水溶性のヘミセルロース画分と非水溶性のセルロース画分とが分離する。非水溶性のセルロース画分は、固形分として遠心分離法などにより容易に分離することができる。この工程により、リグノセルロース系バイオマスからセルロース画分を得ることができる。セルロース画分が含有する固形分としては、特に限定されないが、好ましくは、１００ｇ乾燥質量／Ｌ以上、より好ましくは、２００ｇ乾燥質量／Ｌ以上である。

（２）工程（１）で得られたセルロース画分のセルロース加水分解酵素による処理(工程（２））
セルロース加水分解酵素は、セルロースのβ−１，４−グルコシド結合を加水分解してグルコースを生成する。この過程を糖化という。セルロース加水分解酵素としては、例えば、エンドβ−１，４−グルカナーゼ（以下、単に「エンドグルカナーゼ」という）、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

エンドグルカナーゼは、セルラーゼと称される酵素であり、セルロースを分子内部から切断し、グルコース、セロビオース、およびセロオリゴ糖（重合度が３以上であり、そして通常、１０以下であるが、これに限定されない）を生じる。エンドグルカナーゼは、非結晶化されたセルロース、可溶性セロオリゴ糖、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性が高いが、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルへの反応性は低い。エンドグルカナーゼは、非晶性セルロースを加水分解する酵素の一つの例である。エンドグルカナーゼとしては、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ（特に、ＥＧＩＩ）が挙げられるが、これに限定されない。

セロビオヒドロラーゼは、セルロースの還元末端または非還元末端のいずれかから分解してセロビオースを遊離する。セロビオヒドロラーゼは、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルのような結晶性セルロースを分解するが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性は低い。セロビオヒドロラーゼは、結晶性セルロースを加水分解する酵素の一つの例である。結晶性セルロースの分子間および分子内の密な水素結合による強固な構造に起因して、セロビオヒドロラーゼによる結晶性セルロースの加水分解は、エンドグルカナーゼによる非晶性セルロースの加水分解に比較して遅い。セロビオヒドロラーゼには２種類あり、それぞれセロビオヒドロラーゼ１およびセロビオヒドロラーゼ２と称される。セロビオヒドロラーゼとしては、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ（特に、ＣＢＨ２）が挙げられるが、これに限定されない。

β−グルコシダーゼは、セルロースにおいては、非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素である。β−グルコシダーゼは、アグリコンまたは糖鎖とβ−Ｄ−グルコースとのβ１，４−グルコシド結合を切断し、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生成する。β−グルコシダーゼは、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解する酵素の一つの例である。β−グルコシダーゼは現在、１種類知られており、β−グルコシダーゼ１と称される。β−グルコシダーゼとしては、例えば、アスペルギルス・アクレアータス由来β−グルコシダーゼ（特に、ＢＧＬ１）挙げられるが、これに限定されない。

セルロース加水分解酵素製剤としては、上記セルロース加水分解酵素を含む製剤であれば、特に限定されない。市販の酵素製剤でもよいし、酵素産生微生物などを培養して調製したものでもよい。セルロース加水分解酵素の活性は、１分間にろ紙（例えば、Ｆｉｌｔｅｒ Ｐａｐａｒ：ワットマン社製Ｎｏ．１フィルター）から１μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量（１ＦＰＵ）で表される。セルロース加水分解酵素の処理濃度としては、特に限定されないが、好ましくは、４ＦＰＵ〜２０ＦＰＵ／ｇセルロース画分である。セルロース加水分解酵素の処理時間としては、特に限定されないが、好ましくは０．５時間〜１０時間、より好ましくは０．５時間〜８時間、さらに好ましくは０．５時間〜６時間である。セルロース加水分解酵素の処理温度は、酵素が働く温度であれば、特に限定されない。好ましくは、４０℃〜８０℃である。

この工程により、セルロース画分から糖化バイオマスを得ることができる。糖化バイオマスとは、糖化処理して得られたバイオマスをいい、例えば、セルロースの加水分解により生成したグルコース（単糖）を主成分として含む。糖化バイオマスの形状としては、特に限定されないが、例えば、スラリー状が挙げられる。

この工程において、酵母の栄養源を添加してもよい。酵母の栄養源としては、特に限定されないが、例えば、ＹＰ（酵母エキス１０ｇ／Ｌおよびポリペプトン２０ｇ／Ｌを含有する）、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）およびこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは、コーンスティープリカーである。コーンスティープリカーは安価であるため、エタノール発酵に要するコストを抑えることができる。酵母の栄養源の添加量としては、特に限定されないが、例えば、ＹＰを添加する場合、１×ＹＰから１０×ＹＰのいずれであってもよく、酵素処理液の全体液量約４８ｍＬに対して、例えば、５ｍＬであり、例えば、コーンスティープリカーを添加する場合、例えばセルロース画分をセルロース加水分解酵素で処理する際に調製される酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対してコーンスティープリカーの含有量は、例えば、０．０５質量％〜２質量％であり、好ましくは、０．０６２５質量％〜１質量％であり、より好ましくは、０．１２５質量％〜０．５質量％である。酵母の栄養源を添加する時期としては、特に限定されないが、セルロース画分をセルロース加水分解酵素で処理する前または後あるいは処理の間であってもよい。

（３）工程（２）で得られた糖化バイオマスと酵母との混合によるエタノール発酵(工程（３））
酵母としては、グルコースを基質としてエタノール発酵し得る限り、特に限定されない。野生株酵母であってもよいし、形質転換酵母であってもよい。形質転換酵母は、当業者が通常用いる方法により適宜作製される。

特に限定されないが、サッカロマイセス属に属する酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビシエがさらに好ましい。サッカロマイセス・セレビシエの菌株としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株（Ｍｏｕｋａｍｎｅｒｄら、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１０年、第８８巻、ｐ．８７−９４）、およびサッカロマイセス・セレビシエＫＦ−７株（Ｔｉｎｇら、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００６年、第４１巻、ｐ．９０９−９１４）が挙げられる。

形質転換酵母は、例えば、工程（２）のセルロース加水分解酵素製剤によるリグノセルロース系バイオマスの糖化を促進するための酵素を発現させた酵母であり得る。このような酵素としては、特に限定されないが、例えば、フェルラ酸エステラーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペクチナーゼ、およびこれらの１または２種の組み合わせが挙げられる。好ましくは、フェルラ酸エステラーゼを発現するように形質転換された酵母である。

フェルラ酸エステラーゼは、フェルラ酸とグリセロールとの間でエステル化反応を生じさせる酵素をいう。フェルラ酸エステラーゼは、リグノセルロース系バイオマス中のリグニンと多糖を繋ぐフェルラ酸を加水分解する作用を示す。この作用によりリグノセルロース系バイオマスの構造が緩む（すなわち、リグノセルロース系バイオマスの構造の一部を分解する）ことにより、セルロース加水分解酵素製剤による糖化を促進することができる。フェルラ酸エステラーゼとしては、特に限定されないが、例えば、アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ））、およびペニシリニウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（例えば、ペニシリニウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、およびタラモマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、タラモマイセス・フニクロサス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｓ））に由来するフェルラ酸エステラーゼが挙げられる。フェルラ酸エステラーゼをコードする遺伝子として、例えば、タラモマイセス・フニクロサス由来遺伝子（ＦａｅＡ：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＪ３１２２９６）が挙げられる。

ペクチナーゼは、高等植物の細胞壁に含まれているペクチン質を分解する酵素群の総称をいう。ペクチナーゼとしては、特に限定されないが、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌類、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｏｓｐｏｒｏｎ）、エンドマイセス属（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ）、エンドマイコプシス属（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア属（Ｐｉｃｈｉa）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンセニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、およびクルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母類、ならびにアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）に属する糸状菌類に由来するペクチナーゼが挙げられる。

β−グルコシダーゼは、上述のβ−グルコシダーゼを用いることができる。

β−ガラクトシダーゼは、ラクトースをガラクトースおよびグルコースに分解させる酵素をいう。β−ガラクトシダーゼはペクチン中のガラクタンを分解し、植物細胞壁の構造を緩める（すなわち、リグノセルロース系バイオマスの構造の一部を分解する）作用を示す。これによってリグノセルロース系バイオマスが軟化され、セルロース加水分解酵素製剤による糖化を促進することが期待される。β−ガラクトシダーゼとしては、特に限定されないが、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ））、およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）(例えば、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚｏｅ））に由来するβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。

上記酵素をコードする遺伝子は、例えば、それらの由来生物から調製したゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、その構造遺伝子の配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅して取得し得る。

上記酵素は、例えば、酵母から分泌するか、または酵母表層に提示するように発現させてもよい。

本発明において、酵素を酵母の細胞表層に提示させる方法は、当業者に公知のものが採用され得、例えば、細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカー（特開平１１−２９００７８号公報）、または糖鎖結合ドメイン（国際公開第０２／０８５９３５号）を利用することができる。これらの方法に用いられる細胞表層局在タンパク質としては、例えば、α−またはａ−アグルチニン（酵母の凝集性タンパク質）、ＦＬＯタンパク質（例えば、ＦＬＯ１、ＦＬＯ２、ＦＬＯ４、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０およびＦＬＯ１１）、およびアルカリホスファターゼが挙げられる。

ＧＰＩアンカーを用いて酵素を細胞表層に提示する方法としては、例えば、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的遺伝子−ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡからなる組換えＤＮＡを用いる方法が挙げられる。この組換えＤＮＡから発現され、細胞膜外に分泌されたグルコアミラーゼはＧＰＩアンカー付着認識シグナルを介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合し得る。ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列としては、例えば、酵母のα−アグルチニンのＣ末端から数えて３２０アミノ酸の配列中に存在するＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が利用され得る。

糖鎖結合ドメインを用いて酵素を細胞表層に提示する方法としては、例えば、酵素を細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）のＮ末端側、Ｃ末端側、またはＮ末端側とＣ末端側との両方に結合させた組換えＤＮＡを用いる方法が挙げられる。この組換えＤＮＡから発現され、細胞膜外に分泌された酵素は糖鎖結合ドメインが有する複数の糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用を行うことによって、細胞表層に留まり得る。凝集機能ドメインとしては、例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位が挙げられ、代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。

組換えＤＮＡに用いられる分泌シグナル配列は、特に限定されず、酵素の分泌シグナルであってもよいし、細胞表層局在タンパク質の分泌シグナル配列であってもよいし、酵素を細胞外へ導くことができる他の分泌シグナル配列であってもよい。酵素活性に影響を及ぼさなければ、細胞表層提示後に分泌シグナル配列およびプロ配列の一部または全部がＮ末端に残っていてもよい。

本発明において、酵素を酵母から分泌させる方法は、例えば、上記分泌シグナル配列をコードするＤＮＡの下流に、目的の酵素をコードする遺伝子を連結させた組換えＤＮＡを酵母に導入することによって行われ得る。

上記組換えＤＮＡの合成および結合は、例えば、当業者が通常用いる方法により行うことができる。

上記組換えＤＮＡは、発現ベクターに組み込まれてもよい。このような発現ベクターは、例えば、プラスミドの形態である。例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製起点（Ｏｒｉ）とＣｏｌＥ１の複製起点とを有するプラスミドが好適に用いられる。プラスミドは、プラスミドの調製および形質転換体の検出を容易にする点で、選択マーカーと大腸菌用の複製遺伝子とを有することが好ましい。選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子、および栄養要求性遺伝子が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、およびカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）が挙げられるが、特に限定されない。栄養要求性遺伝子としては、例えば、Ｎ−（５'−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）遺伝子、リンゴ酸β−イソプロピル脱水素酵素（ＬＥＵ２）遺伝子、イミダゾールグリセロールリン酸脱水素酵素（ＨＩＳ３）遺伝子、ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＩＳ４）遺伝子、ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＵＲＡ１）遺伝子、およびオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）遺伝子が挙げられるが、特に限定されない。酵母用の複製遺伝子は必要に応じて選択される。

発現ベクターは、目的の酵素をコードする遺伝子を酵母で発現させるために適切なプロモーターおよびターミネーターを有することが好ましい。プロモーターおよびターミネーターとしては、例えば、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸脱水素酵素）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＰＹＫ（ピルビン酸キナーゼ）、ＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）のプロモーターおよびターミネーターが挙げられるが、特に限定されない。これらのプロモーターとターミネーターとの間に目的の酵素をコードする遺伝子が挿入される。

酵母に組換えＤＮＡを導入する方法は特に限定されない。例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、およびプロトプラスト法が挙げられる。導入された組換えＤＮＡは、例えば、プラスミドの形態で存在してもよく、または酵母の染色体に挿入された形態あるいは酵母の染色体に相同組換えにより組み込まれた形態で存在してもよい。

組換えＤＮＡが導入された酵母は、選択マーカーで選択され、発現された酵素の活性を測定することにより選択される。目的の酵素が細胞表層に提示されていることは、例えば、当該酵素に対する抗体を用いて確認することができる。

最初の発酵開始時の酵母の菌体濃度は、特に限定されない。好ましくは、２ｇ〜２０ｇ湿重量／Ｌ（１×１０^７個／ｍＬ〜１×１０^８個／ｍＬ）程度である。酵母の培養条件は、特に限定されない。通常、グルコースを基質としてエタノール発酵する際の条件であってよい。培養温度は、例えば、３０℃〜３７℃である。培養ｐＨは、例えば、４〜８である。

本発明の方法では、短時間で発酵を終了させることができるため、培養時間は、通常、２日間〜３日間である。発酵の終了は、例えば、炭酸ガスの発生量が発酵開始時の１０分の１以下になったことなどを目安に判断する。

（４）工程（３）で得られた発酵物の固液分離(工程（４））
発酵終了後の発酵物は、酵母および発酵産物のエタノールのほか、原料に由来するリグニンおよび灰分などの固体も含む。すなわち、固体を含むスラリー状もまた包含される。発酵終了後の発酵物中の酵母の菌体濃度としては、特に限定されないが、例えば、最初の醗酵開始時の菌体濃度が１×１０^７個／ｍＬ〜５×１０^８個／ｍＬ程度の場合、１×１０^７個／ｍＬ〜５×１０^８個／ｍＬ、好ましくは、５×１０^７個／ｍＬ〜５×１０^８個／ｍＬ、より好ましくは、１×１０^８個／ｍＬ〜５×１０^８個／ｍＬである。固液分離工程の組み合わせを用いて、この発酵物から酵母を効率よく回収して再利用する。固液分離工程の組み合わせとしては、特に限定されないが、好ましくは（ａ）発酵物の５質量％〜３０質量％の固体部を除去する工程(工程（４）（ａ））、および（ｂ）当該工程（４）（ａ）で得られた残部の５質量％〜３０質量％の固体部を回収する工程(工程（４）（ｂ））の組み合わせである。

（ａ）発酵物の５質量％〜３０質量％の固体部を除去する工程(工程（４）（ａ））
この工程では、酵母を液体部に回収する。このため、工程（３）で得られた発酵物の５質量％〜３０質量％、好ましくは５質量％〜２０質量％の固体部を除去する。固体部を除去するための手段としては、特に限定されないが、好ましくは１００Ｇ〜１０００Ｇの遠心分離、ハイドラシーブ、およびデカンターが挙げられる。この工程で、固体部としてリグリンおよび灰分の大半が除去される。

（ｂ）工程（４）（ａ）で得られた残部の５質量％〜３０質量％の固体部を回収する工程(工程（４）（ｂ））
この工程では、酵母を固体部に回収する。工程（４）（ａ）で得られた残部の５質量％〜３０質量％、好ましくは２０質量％〜３０質量％の固体部を回収する。固体部を回収するための手段としては、特に限定されないが、好ましくは１２００Ｇ〜５０００Ｇの遠心分離、フィルタープレス、およびオリバーフィルターが挙げられる。この工程で、液体部として発酵産物のエタノールの大半が回収される。

工程（４）の酵母回収率は、特に限定されないが、好ましくは５０％以上である。リグニンおよび灰分などの残渣帯同率は、特に限定されないが、好ましくは１０％以下である。

本発明の方法では、上記工程（１）〜（４）からなるサイクルを２回以上、好ましくは６回以上繰り返す。そして、上記工程（４）で得られた酵母を、次のサイクルの工程（３）の酵母の全部または一部として利用する。次のサイクルの工程（３）で用いる酵母のうち、工程（４）で得られた酵母の割合は、５０質量％〜１００質量％、好ましくは８０質量％〜１００質量％である。

本発明の方法では、発酵に用いる酵母の新たな供給を少量に抑えることができるため、コストを低減することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１：稲ワラを用いたエタノール発酵１）
（工程１：稲ワラの水熱処理）
稲ワラを約２０質量％（乾燥質量）の含量となるように水と混合し、これを水熱処理装置（三菱重工業株式会社製）に入れ、約１８０℃および約３ＭＰａにて５分間〜２０分間処理した。次いで、固形分を分離し、分離した固形分を発酵基質として用いた。

（工程２：酵素処理）
工程１で得られた稲ワラ水熱処理固形分を含む酵素処理液約４８ｍＬを調製した。その組成を表１に示す。

この酵素処理液を５０ｍＬ容量のプラスチック製試験管（コーニング社製）に入れ、サーモブロックローテーター（株式会社日伸理化製ＳＮ−０６ＢＮ）を用いて、５０℃にて３５ｒｐｍの回転速度で酵素処理を行った。

（工程３：エタノール発酵１サイクル目）
発酵には、酵母サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株（Ｍｏｕｋａｍｎｅｒｄら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１０年、第８８巻、ｐ．８７−９４）を用いた。

上記酵母について、５ｍＬのＹＰＤ液体培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ，ポリペプトン２０ｇ／Ｌ，グルコース２０ｇ／Ｌ）を含む試験官で種培養を一晩行い、次いで培養液を５００ｍＬのＹＰＤ液体培地を含むフラスコに移し、本培養を２日間行った。この培養液を遠心分離し（３０００ｒｐｍ，４℃，１０分間）、酵母菌体を滅菌蒸留水により２度洗浄後、１００ｇ湿重量／Ｌの菌体濃度になるように滅菌蒸留水に懸濁した。

工程２の酵素処理開始から２時間経過後、酵素処理液４８ｍＬを８０ｍＬ容量のねじ口瓶（デュラン社製）に移した。さらに、上記酵母懸濁液２ｍＬを添加して、菌体濃度を４ｇ湿重量／Ｌとした。酵母添加後、３７℃にて発酵を開始した。

発酵液中に生産されたエタノール濃度を、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙシステム；株式会社日立ハイテクフィールディング、ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ）により経時的に定量した。ＨＰＬＣの分離用カラムにはＵＬＴＲＯＮ ＰＳ−８０Ｈ（信和化工株式会社，３００ｍｍ（Ｌ）×８ｍｍ（ＩＤ））を用い、移動相には超純水（日本ミリポア株式会社製Ｍｉｌｌｉ−Ｑによる精製水）を用い、そして検出器には屈折率検出器を用いた。ＨＰＬＣの条件は、送液量０．９ｍＬ／分およびカラム温度５０℃とした。また、発酵液中の酵母の菌体濃度を、ＹＰＤ寒天培地（ＹＰＤ液体培地に寒天を２０ｇ／Ｌ加えたもの）に塗布して３０℃にて２日間培養し、コロニー数を計測することによって経時的に定量した。

（工程４：エタノール発酵２サイクル目）
発酵開始から４８時間後、発酵液を回収し、遠心分離機を用いて低回転数（１００Ｇ）にて遠心分離した。２０質量％の沈殿（固体部；リグニンおよび灰分を多量に含む）と８０質量％の上澄み（液体部）とに分離された。次いで、上澄みを回収し、遠心分離機を用いて高回転数（１２００Ｇ）にて遠心分離した。８０質量％の上澄み（液体部；エタノールを含む）と２０質量％の沈殿（固体部；酵母を多量に含む）とに分離された。発酵液の物質収支を表２に示す。

次いで、沈殿を回収し、上記工程２と同様にして得られた酵素処理液４８ｍＬに添加した。酵母の菌体濃度は１．５ｇ湿重量／Ｌ（７．６×１０^６個／ｍＬ：エタノール発酵２サイクル目開始時）であった。酵母添加後、３７℃にて上記工程３と同様にして発酵を開始した。工程３と同様にして、発酵液中のエタノール濃度および酵母の菌体濃度を経時的に定量した。エタノール発酵２サイクル目終了時における酵母の菌体濃度は６．４ｇ湿重量／Ｌ（３．２×１０^７個／ｍＬ）であり、発酵開始時から増加していた。

（工程５：エタノール発酵３〜６サイクル目）
上記工程４を同様にさらに４回繰り返した。発酵液中に生産されたエタノール濃度および酵母の菌体濃度を経時的に定量した結果を図１に示す。

図１から明らかなように、酵母を再利用して４〜６回発酵を繰り返しても問題なくエタノール発酵を継続することができた。別途調製した酵母を追加投入する必要はなかった。各発酵サイクル終了後の酵母を含む固体部を、次のサイクルの発酵液に対し１０質量％〜２０質量％の割合で投入することによって、発酵液中の酵母の菌体濃度を一定（各発酵サイクル開始時に１０^６個／ｍＬ〜１０^７個／ｍＬ程度および終了時に１０^７個／ｍＬ以上）に維持しながら長期間エタノール発酵することができるとわかった。

（実施例２：稲ワラを用いたエタノール発酵２）
実施例１の工程４において、遠心分離機を用いて低回転数（１００Ｇ）にて遠心分離したことに代えてハイドラシーブ（東洋スクリーン工業株式会社製；０．１ｍｍスクリーン）を用いてろ過分離したこと以外は実施例１と同様に実験を行った。回収されたろ液（液体部）は８５質量％であった。

（実施例３：稲ワラを用いたエタノール発酵３）
実施例１の工程４において、遠心分離機を用いて低回転数（１００Ｇ）にて遠心分離したことに代えてマイクロセパレータ（ＴＳＫ−８０バスケット型遠心分離機；Σ：３１ｍ^２，ボウル容量：７Ｌ、ソリッドスペース：４．８Ｌ）を用いて通液量５０Ｌ／Ｈにて遠心分離したこと、および遠心分離機を用いて高回転数（１２００Ｇ）にて遠心分離したことに代えてディスク型遠心分離機（アルファ・ラバル社製ＬＡＰＸ４０４；Σ：５２３０ｍ^２，ボウル容量：２．２Ｌ，ソリッドスペース：１．１Ｌ）を用いて通液量１００Ｌ／Ｈにて遠心分離したこと以外は実施例１と同様に実験を行った。最初の遠心分離で回収された上澄み（液体部）は８３質量％であった。２回目の遠心分離で回収された沈殿（固体部）は２５質量％であった。各画分中の酵母の菌体濃度を表３に示す。

表３から明らかなように、マイクロセパレータから回収された上澄み（液体部）中の酵母の菌体濃度は６．４×１０^６個／ｍＬであり、ディスク型遠心分離機から回収された上澄み（液体部）中に酵母はほとんど存在せず、沈殿（固体部）中に多量の酵母（５．７×１０^７個／ｍＬ）が存在していた。この固体部中の酵母の菌体濃度は、図１から明らかなように、固体部を次のサイクルの発酵液に対し１０質量％〜２０質量％の割合で投入した場合でもエタノール発酵が可能な菌体濃度である。したがって、上記実施例の固液分離方法で分離された酵母を再利用することによって、長期間エタノール発酵することができるとわかった。

（実施例４：稲ワラを用いたエタノール発酵４）
実施例１の工程２において、５．０ｍＬの１０×ＹＰに代えて、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）を酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して０．０６２５質量％になるように添加して酵素処理液を調製したこと以外は、実施例１と同様にしてエタノール発酵を行った。

（実施例５：稲ワラを用いたエタノール発酵５）
コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して０．１２５質量％になるように添加して酵素処理液を調製したこと以外は、実施例４と同様にしてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度を経時的に定量した結果を図２に示す。

（実施例６：稲ワラを用いたエタノール発酵６）
コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して０．２５質量％になるように添加して酵素処理液を調製したこと以外は、実施例４と同様にしてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度を経時的に定量した結果を図２に示す。

（実施例７：稲ワラを用いたエタノール発酵７）
コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して０．５質量％になるように添加して酵素処理液を調製したこと以外は、実施例４と同様にしてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度を経時的に定量した結果を図２に示す。

図２から明らかなように、コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対してそれぞれ０．１２５質量％(実施例５）、０．２５質量％(実施例６）および０．５質量％(実施例７）になるように添加した場合、発酵サイクルを繰り返しても安定してエタノール発酵をすることができた。コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して０．０６２５質量％(実施例４）になるように添加した場合、３回目および４回目の発酵サイクル終了後のエタノール濃度において減少がみられたものの、１回目および２回目の発酵サイクル終了後のエタノール濃度において減少はみられなかった。このことから、ＹＰのように高価な栄養源に代えて、コーンスティープリカーのように安価な栄養源を用いても、充分にエタノール発酵が行われたことがわかる。

（実施例８：バガスを用いたエタノール発酵１）
実施例１の工程１において、原料として稲ワラに代えてバガスを用い、かつ工程２において、酵素処理液中の５．０ｍＬの１０×ＹＰに代えて、コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して０．２５質量％になるように添加して酵素処理液を調製したこと以外は、実施例１と同様にしてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度を経時的に定量した結果を図３に示す。

（実施例９：バガスを用いたエタノール発酵２）
コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して０．５質量％になるように添加して酵素処理液を調製したこと以外は、実施例８と同様にしてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度を経時的に定量した結果を図３に示す。

（実施例１０：バガスを用いたエタノール発酵３）
コーンスティープリカーを酵素処理液の全体液量（ｍＬ）に対して１質量％になるように添加して酵素処理液を調製したこと以外は、実施例８と同様にしてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度を経時的に定量した結果を図３に示す。

図３から明らかなように、バガスを原料として用いた場合においても、実施例４〜７と同様、コーンスティープリカーの添加により、発酵サイクルを繰り返しても安定してエタノール発酵が行われた。したがって、リグノセルロース系バイオマスの種類を問わず、安価なコーンスティープリカーを用いることによって、エタノール生産のコストを抑えることができたことがわかる。なお、稲ワラとバガスとは構成成分が異なるため、実施例４の結果と比較して、同量のコーンスティープリカーを用いてもエタノールの生産量に差異が生じたと考えられる。

（実施例１１〜１４：ネピアグラスを用いたエタノール発酵）
（工程１：ネピアグラスの圧搾および蒸煮）
ネピアグラスを一軸エクストルーダーによって７９．７Ｎ・ｍの条件で圧搾して不要な液体分をあらかじめ取り除き、残渣に対して１質量％の硫酸を含浸させ、１．０Ｍｐａの圧力下、１８０℃にて３０分間蒸煮した。次いで、固形分を分離し、分離した固形分を発酵基質として用いた。

（工程２：酵素処理）
酵素処理液中の栄養源として、１×ＹＰ、コーンスティープリカー１．０質量％または０．１質量％（酵素処理液の全体液量に対する濃度）あるいは水を使用して、工程１で得られたネピアグラスの圧搾および蒸煮固形分を含む４種の酵素処理液約４８ｍＬをそれぞれ調製した（実施例１１〜１４）。その組成を表４に示す。

これらの４種類の酵素処理液をそれぞれ５０ｍＬ容量のプラスチック製試験管（コーニング社製）に入れ、サーモブロックローテーター（株式会社日伸理化製ＳＮ−０６ＢＮ）を用いて、５０℃にて３５ｒｐｍの回転速度で酵素処理を行った。その後、実施例１の工程３〜工程５と同様にしてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度を経時的に定量した結果を図４に示す。

図４から明らかなように、酵素処理液中の栄養源として、１×ＹＰ(実施例１１）、コーンスティープリカー１．０質量％(実施例１２）ならびに０．１質量％(実施例１３）および水(実施例１４）のいずれを用いた場合であっても、同程度のエタノールが生産されていることがわかった。このことから、ネピアグラスを圧搾および蒸煮して得られた固形分を用いた場合、アルコール発酵の発酵サイクル毎に栄養源を添加しなくても、安定してエタノール発酵が行われたことがわかる。

（調製例１：ＦａｅＡ表層提示酵母の作製）
遺伝子発現に必要なプロモーターとターミネーター、および酵母表層提示に必要なα-アグルチニン遺伝子を含むプラスミドとしてｐＧＫ４０６ＡＧ(特開２０１１−１４２８７９号公報)を用いた。ＦａｅＡをクローニングするために、タラモマイセス・フニクロサス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｓ）培養菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列を含むプライマーＳａｌＩ−ｓｓＦａｅＡ−Ｆｗ（配列番号１）と、プライマーＳａｌＩ−ＦａｅＡ−Ｒｖ（配列番号２）とを用いてＰＣＲを行った。これにより得られた遺伝子断片をＳａｌＩで消化し、ｐＧＫ４０６ＡＧのＳａｌＩサイトに挿入することでプラスミドｐＧＫ４０６−ｓｓＦａｅＡ−ＡＧを構築した。

酵母に導入するベクターとして、ｐＡＵＲ１０１（タカラバイオ株式会社製）を用いた。ｐＡＵＲ１０１のＳｐｈＩサイトに上記で構築したｐＧＫ４０６−ｓｓＦａｅＡ−ＡＧのｐＧＫプロモーター、分泌シグナル配列、ＦａｅＡ及びα−アグルチニンのカセットを挿入するために、ｐＧＫ４０６−ｓｓＦａｅＡ−ＡＧを鋳型にしてプライマーｐＡｕＲ１０１−ＳｐｈＩ−Ｆｗ（配列番号３）とプライマーｐＡｕＲ１０１−ＳｐｈＩ−Ｒｖ（配列番号４）とを用いてＰＣＲを行った。この遺伝子断片をＳｐｈＩで切断したｐＡＵＲ１０１にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて挿入し、ＦａｅＡ酵母表層提示用プラスミドｐＡＵＲ１０１−ｐＧＫ−ｓｓＦａｅＡ−ＡＧを構築した。このｐＡＵＲ１０１−ｐＧＫ−ｓｓＦａｅＡ−ＡＧをＳｔｕＩで切断後、ＹＥＡＳＴ ＭＡＫＥＲ酵母形質転換システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用い、酵母（サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株）に形質転換し、オーレオバシジンＡ（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａ）耐性株を取得し、ＦａｅＡ表層提示酵母を得た。得られたＦａｅＡ表層提示酵母を以下の実施例１５および１６に用いた。

（実施例１５：ＦａｅＡ表層提示酵母を用いたエタノール発酵１）
（工程１：バガスの水熱処理）
バガスを約２０質量％（乾燥質量）の含量となるように水と混合し、これを水熱処理装置（三菱重工業株式会社製）に入れ、約１８０℃および約３ＭＰａにて５分間〜２０分間処理した。次いで、固形分を分離し、分離した固形分を発酵基質として用いた。

（工程２：酵素処理）
工程１で得られたバガス水熱処理固形分を含む酵素処理液約４８ｍＬを調製した。その組成を表５に示す。

この酵素処理液を５０ｍＬ容量のプラスチック製試験管（コーニング社製）に入れ、サーモブロックローテーター（株式会社日伸理化製ＳＮ−０６ＢＮ）を用いて、５０℃にて３５ｒｐｍの回転速度で酵素処理を行った。

（工程３：エタノール発酵１サイクル目）
発酵には、調製例１で得られたＦａｅＡ表層提示酵母を用いた。なお、コントロールとして、酵母サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株を用いてエタノール発酵を行った。

上記酵母について、５ｍＬのＹＰＤ液体培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌおよびグルコース２０ｇ／Ｌを含有する液体培地）を含む試験管で種培養を一晩行い、次いで培養液を５００ｍＬのＹＰＤ液体培地を含むフラスコに移し、本培養を２日間行った。この培養液を遠心分離し（３０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）、沈殿した酵母菌体を滅菌蒸留水により２度洗浄した。

工程２の酵素処理開始から２時間経過後、酵素処理液４８ｍＬを８０ｍＬ容量のねじ口瓶（デュラン社製）に移した。さらに、上記酵母を２０ｇ湿重量／Ｌとなるように添加して、３７℃にて発酵を開始した。

発酵液中に生産されたエタノール濃度を、ＨＰＬＣ（株式会社日立ハイテクフィールディング、ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ）により経時的に定量した。ＨＰＬＣの分離用カラムにはＵＬＴＲＯＮ ＰＳ−８０Ｈ（信和化工株式会社，３００ｍｍ（Ｌ）×８ｍｍ（ＩＤ））を用い、移動相には超純水（日本ミリポア株式会社製Ｍｉｌｌｉ−Ｑによる精製水）を用い、そして検出器には屈折率検出器を用いた。ＨＰＬＣの条件は、送液量０．９ｍＬ／分およびカラム温度５０℃とした。また、発酵液中の酵母の菌体濃度を、ＹＰＤ寒天培地（ＹＰＤ液体培地に寒天を２０ｇ／Ｌ加えたもの）に塗布して３０℃にて２日間培養し、コロニー数を計測することによって経時的に定量した。

（工程４：エタノール発酵２サイクル目）
発酵開始から４８時間後、発酵液を回収し、遠心分離機を用いて低回転数（１００Ｇ）にて遠心分離した。２０質量％の沈殿（固体部；リグニンおよび灰分を多量に含む）と８０質量％の上澄み（液体部）とに分離された。次いで、上澄みを回収し、遠心分離機を用いて高回転数（１２００Ｇ）にて遠心分離した。８０質量％の上澄み（液体部；エタノールを含む）と２０質量％の沈殿（固体部；酵母を多量に含む）とに分離した。

次いで、沈殿を回収し、上記工程２と同様にして得られた酵素処理液４８ｍＬに添加した。酵母添加後、３７℃にて上記工程３と同様にして発酵を開始した。工程３と同様にして、発酵液中のエタノール濃度および酵母の菌体濃度を経時的に定量した。

（工程５：エタノール発酵３サイクル〜４サイクル目）
上記工程４を同様にさらに２回繰り返した。発酵液中に生産されたエタノール濃度およびの酵母の菌体濃度を経時的に定量した結果を図５に示す。

（実施例１６：ＦａｅＡ表層提示酵母を用いたエタノール発酵２）
バガスの水熱処理固形分を１５０ｇ／Ｌ（乾燥重量基準）になるように添加して酵素処理液を調製(表５）したこと以外は、実施例１５と同様にして、ＦａｅＡ表層提示酵母およびコントロール（酵母サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株）を用いてエタノール発酵を行った。発酵液中に生産されたエタノール濃度および酵母の菌体濃度を経時的に定量した結果を図６に示す。

図５および６の結果から明らかなように、ＦａｅＡ表層提示酵母を用いた場合、バガス水熱処理物を乾燥重量基準で２００ｇ／Ｌ（実施例１５）および１５０ｇ／Ｌ（実施例１６）用いた場合のいずれにおいても、野生酵母ＴＪ１４株と比較して、より多くのエタノールが安定して生産されていたことがわかる。また、フェルラ酸エステラーゼを表層提示した酵母は、バガス水熱処理物のセルラーゼによる糖化を促進し、野生酵母ＴＪ１４株よりも高いエタノール生産量を示していたことがわかる。さらに、発酵液中の酵母の菌体濃度を一定（各発酵サイクル開始時に１０^６個／ｍＬ〜１０^７個／ｍＬ程度および終了時に１０^７個／ｍＬ以上）に維持しながら長期間エタノール発酵することができたことがわかる。

本発明の方法によれば、リグノセルロース系バイオマスのエタノール発酵物から比重の大きい残渣を除去した後の、酵母を含む一定量の残渣を次のサイクルの発酵に用いることによって、酵母の菌体濃度を１０^６個／ｍＬ〜１０^７個／ｍＬ程度から１０^７個／ｍＬ以上までの一定範囲に維持しながら、新たに酵母を供給することなく長期にわたって発酵を繰り返すことが可能になる。酵母は絶えず増殖を繰り返すため、鮮度が低下するという問題も生じない。新たに酵母を調製するためのコストを削減することができるため、低コストでエタノールを生産することができる。また、比重の大きい残渣による発酵阻害も抑制することができる。

Claims (7)

1. リグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産方法であって、
   （１）リグノセルロース系バイオマスを前処理する工程、
   （２）工程（１）で得られたセルロース画分をセルロース加水分解酵素で処理する工程、
   （３）工程（２）で得られた糖化バイオマスと酵母とを混合してエタノール発酵する工程、および
   （４）工程（３）で得られた発酵物を固液分離する工程
   を含み、
   工程（１）、（２）、（３）および（４）からなるサイクルを２回以上繰り返し、そして
   工程（４）で得られた酵母を、次のサイクルの工程（３）の酵母の全部または一部として用いる、方法。
2. 前記工程（４）が、
   （ａ）前記発酵物の５質量％から３０質量％の固体部を除去する工程、および
   （ｂ）工程（ａ）で得られた残部の５質量％から３０質量％の固体部を回収する工程
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記発酵物中の酵母の菌体濃度が、１０^７個／ｍＬ以上である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記酵母が、フェルラ酸エステラーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１または２種の酵素を発現するように形質転換された酵母である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 前記酵素が、表層提示されている、請求項４に記載の方法。
6. リグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産のための、酵母を含有する組成物であって、
   該酵母が、フェルラ酸エステラーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１または２種の酵素を発現するように形質転換されている、組成物。
7. 前記酵素が、表層提示されている、請求項６に記載の組成物。

Images