BR112017009374B1

BR112017009374B1 - Composição e método para preparar uma solução de ramnolipídeos

Info

Publication number: BR112017009374B1
Application number: BR112017009374-0A
Authority: BR
Inventors: Martin Schilling; Jochen Kleinen; Josef Lorenz; Hans Henning Wenk
Original assignee: Evonik Operations Gmbh
Priority date: 2014-11-19
Filing date: 2015-11-09
Publication date: 2021-07-06
Also published as: PL3023431T3; CN107001403B; CN113024618A; KR102473780B1; BR112017009374A2; KR20220031727A; JP2018500293A; KR20170087877A; EP3023431A1; KR102368119B1; JP7055018B2; US20170335238A1; CN107001403A; EP3221326A1; EP3023431B1; WO2016078947A1; EP3221326B1; US10604722B2

Abstract

a invenção fornece composições de ramnolipídeo concentradas e também métodos para a preparação das mesmas.

Description

[001] CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A invenção fornece composições de ramnolipídeo concentradas e também métodos para a preparação das mesmas.

[003] TÉCNICA ANTERIOR

[004] Ramnolipídeos são glicolipídeos ativos de superfície e produtos metabólicos de micro-organismos particulares. Os mesmos têm propriedades de tensoativo particulares, tais como formação de espuma forte, por exemplo, e são de interesse para uma ampla variedade de aplicações técnicas. Ramnolipídeos podem ser preparados com o uso tanto de cepas selvagens quanto de microorganismos geneticamente modificados. Os métodos para a preparação por fermentação e elaboração de ramnolipídeos são descritos em detalhes na técnica anterior, por exemplo, no documento no US20130130319. Os tensoativos incorporados em formulações cosméticas (por exemplo, xampus, loções de limpeza para mãos), loções para limpeza doméstica e também composições para lavagem de louça precisam estar presentes em forma líquida em temperaturas de processamento comuns a fim de garantir processamento através de sistemas de tubulação e bombas no produtor de tais produtos. A viscosidade deve ser baixa, nesse caso, a fim de garantir uma condução simples e confiável. Ao mesmo tempo, no entanto, a concentração de tensoativo mais alta possível é desejada aqui para permitir a preparação de formulações mais ecológicas que têm um baixo teor de água. Ao mesmo tempo, a queda em viscosidade na diluição com água precisa ser mantida tão baixa quanto possível visto que os produtos finais formulados, tais como xampus, loções de limpeza para mãos e detergentes, por exemplo, devem ter uma viscosidade suficiente de modo que os mesmos possam ser melhor manipulados pelo usuário.

[006] Nenhuma composição que contém ramnolipídeo é conhecida a partir da literatura que corresponde a essas exigências.

[007] As formas de produto conhecidas a partir da literatura e disponíveis no mercado são sólidos que foram isolados através de vários métodos em mais ou menos forma pura (por exemplo, remoção de um solvente por secagem), produtos puros que são comercializados em concentrações aquosas baixas e médias (por exemplo, até 25% em peso) ou são produtos líquidos em que o componente (ou componentes) principal é óleo vegetal ou produtos de degradação de óleo vegetal que se originam de fermentação. Portanto, essas são soluções de ramnolipídeo em uma fase de óleo, e os produtos correspondentes têm a desvantagem crítica de que os mesmos fazem apenas pouca espuma e, assim, não são interessantes para aplicações de tensoativo reais.

[008] Uma forma de produto altamente concentrada é conhecida também a partir do documento no DE4237334A1, que pode ser obtida por um método particularmente simples para purificar e concentrar ramnolipídeos. Nesse caso, o RL é precipitado de um caldo de fermentação acidificando-se um pH = 3 e o sólido de RL correspondente pode ser concentrado por centrifugação. Nesse caso, suspensões sólidas ou pastas são obtidas com um alto teor de sólidos de ramnolipídeo de 30 a 40% em peso e uma viscosidade muito alta.

[009] Abdel-Mawgoud et al. em Appl Biochem Biotechnol. 2009 May;157(2):329 a 345 descreve um método similar.

[010] As dispersões sólidas obtidas desse modo são inadequadas para processamento adicional em larga escala industrial, por exemplo, preparação de formulações para xampus e loções para limpeza doméstica, visto que as mesmas não são adequadas para condução com bombas tipicamente usadas devido à sua alta viscosidade e sua não homogeneidade.

[011] O documento no DE102012221519A1 descreve um método para obter ramnolipídeos com excelentes propriedades de formação de espuma, sendo que as soluções de ramnolipídeo aquosas que têm um pH de 7 e uma concentração de ca. De 50% em peso são obtidas. Uma desvantagem dessa forma de produto é a queda muito acentuada indesejada em viscosidade na diluição. Uma desvantagem adicional é a estabilidade microbiológica reduzida no estado neutro.

[012] O objetivo da invenção foi fornecer composições que compreendessem ramnolipídeo altamente concentrado e de baixo- viscosidade. As mesmas também deveriam ter a menor força iônica possível e a diluição com água deveria levar às menores mudanças possíveis na viscosidade.

[013] DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[014] Surpreendentemente constatou-se que as composições que compreendem ramnolipídeos particularmente em alta concentração e ao mesmo tempo de baixo-viscosidade poderiam ser obtidas por uma neutralização parcial de uma suspensão/pasta sólida de ramnolipídeo ácida, altamente viscosa e altamente concentrada. Surpreendentemente, essas composições mostram uma queda menor em viscosidade na diluição com água do que composições completamente neutralizadas. Bases orgânicas e inorgânicas podem ser usadas para a neutralização.

[015] Portanto, a presente invenção fornece composições aquosas que compreendem altas concentrações de ramnolipídeos.

[016] A invenção fornece adicionalmente um método para preparar composições aquosas que compreendem altas concentrações de ramnolipídeos.

[017] Uma vantagem da presente invenção é que a força iônica das composições que compreendem ramnolipídeos pode ser mantida baixa. Como resultado, a flexibilidade apropriada no ajuste subsequente do pH e do teor de sal da formulação final é deixada para o formulador.

[018] Uma vantagem adicional da presente invenção é que as composições têm estabilidade microbiológica aumentada.

[019] Outra vantagem da presente invenção é que as composições podem ser prontamente diluídas.

[020] Uma vantagem adicional da presente invenção é que as composições podem ser completamente misturadas com outros tensoativos.

[021] Outra vantagem da presente invenção é que as composições possibilitam a formulação de formulações finais de tensoativo concentrado ("concentrados").

[022] Uma vantagem adicional da presente invenção é que as composições têm uma tendência de formação de espuma reduzida por conta de sua alta concentração e, portanto, transporte e condução serem simplificados.

[023] Outra vantagem da presente invenção é que as composições permitem incorporação simples de componentes hidrofóbicos, tais como óleos, por exemplo.

[024] Uma vantagem adicional da presente invenção é que as composições têm alta estabilidade de armazenamento.

[025] Outra vantagem da presente invenção é que as composições não apresentam picos extremos em viscosidade na diluição com água.

[026] Uma vantagem adicional da presente invenção é que as composições causam contaminação inferior em tubulações durante a preparação e transporte das mesmas e adicionalmente possibilitam uma limpeza mais simples.

[027] Outra vantagem da presente invenção é que o transporte das composições exige uma exigência de energia menor para o transporte.

[028] Uma composição é reivindicada que compreende

[029] 30% em peso a 70% em peso, preferencialmente, 35% em peso a 60% em peso, particularmente, de preferência, 40% em peso a 50% em peso de pelo menos um ramnolipídeo e

[030] 30% em peso a 70% em peso, preferencialmente, 40% em peso a 65% em peso, particularmente, de preferência, 50% em peso a 60% em peso de água,

[031] em que as porcentagens em peso se referem à composição total, distinguida pelo fato de que o pH da composição a 25 °C é de 5,5 a < 7,0, preferencialmente, de 5,6 a 6,2 e, particularmente, de preferência, de 5,6 a 6,0.

[032] O termo "ramnolipídeo" no contexto da presente invenção se refere a ramnolipídeos que englobam formas protonadas e também particularmente sais das mesmas.

[033] O termo "ramnolipídeo", no contexto da presente invenção, é compreendido particularmente como misturas de compostos da fórmula geral (I) e sais da mesma,

[034] Fórmula (I)

[035] em que

[036] m = 2, 1 ou 0,

[037] n = 1 ou 0,

[038] R1 e R2 = resíduos orgânicos, idênticos ou diferentes, mutuamente independentes que têm 2 a 24, preferencialmente, 5 a 13 átomos de carbono, resíduos de alquila, em particular, opcionalmente, mono-, bi- ou tri-insaturada, opcionalmente insaturada, particularmente, substituída por hidróxi, opcionalmente substituída, em particular, opcionalmente ramificada , preferencialmente, aqueles selecionados a partir do grupo que consiste em pentenila, heptenila, nonenila, undecenila e tridecenila e (CH2)o-CH3 em que o = 1 a 23, preferencialmente, 4 a 12.

[039] Se n = 1, preferencialmente, a ligação glicosídica entre as duas unidades de ramnose está na configuração α. Preferencialmente, os átomos de carbono opcionalmente ativos dos ácidos graxos estão presentes como enantiômeros R (por exemplo, (R)-3-{(R)-3- [2-O-(α-L-ramnopiranosil)-α-L- ramnopiranosil]oxidecanoil}oxidecanoato).

[040] O termo "dirramnolipídeo" no contexto da presente invenção é compreendido como compostos da fórmula geral (I) ou sais da mesma, em que n = 1.

[041] O termo "monorramnolipídeo" no contexto da presente invenção é compreendido como compostos da fórmula geral (I) ou sais da mesma, em que n = 0.

[042] Os ramnolipídeos distintos são abreviados de acordo com a seguinte nomenclatura:

[043] "diRL-CXCY" são compreendidos como dirramnolipídeos da fórmula geral (I), em que um dos resíduos R1 e R2 = (CH2)o-CH3 em que o = X4 e o resíduo restante R1 ou R2 = (CH2)o-CH3 em que o = Y-4.

[044] "monoRL-CXCY" são compreendidos como monorramnolipídeos da fórmula geral (I), em que um dos resíduos R1 e R2 = (CH2)o-CH3 em que o = X4 e o resíduo restante R1 ou R2 = (CH2)o-CH3 em que o = Y-4.

[045] Portanto, a nomenclatura usada não distingue entre "CXCY" e "CYCX".

[046] Para ramnolipídeos em que m = 0, consequentemente, monoRL-CX ou diRL-CX é usado.

[047] Se um dos índices mencionados anteriormente X e/ou Y é dotado de ":Z", isso significa que o resíduo respectivo R1 e/ou R2 é igual a um resíduo de hidrocarboneto não substituído, não ramificado que tem X-3 ou Y-3 átomos de carbono que têm ligações duplas Z.

[048] O “pH” em conexão com a presente invenção é definido como o valor que é medido para a composição relevante a 25 °C depois de agitar por 5 minutos com o uso de um eletrodo de pH calibrado de acordo com ISO 4319 (1977).

[049] Exceto se for declarado de outro modo, todas as porcentagens (%) determinadas são porcentagens em peso.

[050] Para determinar o teor de ramnolipídeos no contexto da presente invenção, apenas a massa do ânion de ramnolipídeo é considerada, isto é, "fórmula geral (I) menos um hidrogênio".

[051] Para determinar o teor de ramnolipídeos no contexto da presente invenção, todos os ramnolipídeos são convertidos por acidificação na forma protonada (consulte a fórmula geral (I)) e quantificados por HPLC.

[052] Os ramnolipídeos presentes nas formulações de acordo com a invenção estão presentes pelo menos parcialmente como sais por conta do pH determinado.

[053] Em composições preferenciais de acordo com a invenção, os cátions dos sais de ramnolipídeo presentes são selecionados a partir do grupo que compreende, preferencialmente, que consiste em Li+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Al3+, NH4+, íons de amônio primários, íons de amônio secundários, íons de amônio terciários e íons de amônio quaternários.

[054] Representantes exemplificativos de íons de amônio adequados são tetrametilamônio, tetraetilamônio, tetrapropilamônio, tetrabutilamônio e [(2- hidroxietil)trimetilamônio] (colina) e também os cátions de 2-aminoetanol (etanolamina, MEA), dietanolamina (DEA), 2,2',2''-nitrilotrietanol (trietanolamina, TEA), 1-aminopropan-2-ol (monoisopropanolamina), etilenodiamina, dietilenotriamina, trietilenotetramina, tetraetilenopentamina, 1,4-dietilenodiamina (piperazina), aminoetilpiperazina e aminoetiletanolamina.

[055] As misturas dos cátions mencionados anteriormente podem estar presentes também como cátions dos sais de ramnolipídeo presentes de acordo com a invenção.

[056] Cátions particularmente preferenciais são selecionados a partir do grupo que compreende, preferencialmente, que consiste em Na+, K+, NH4+ e o cátion de trietanolamônio.

[057] A quantidade total dos cátions mencionados anteriormente, de preferência, contabiliza 70% em peso a 99% em peso, particularmente, de preferência, 80% em peso a 90% em peso de todos os cátions presentes na composição exceto H+ e H3O+.

[058] As composições preferenciais de acordo com a invenção compreendem 50% em peso a 99% em peso, preferencialmente, 70% em peso a 95% em peso, particularmente, de preferência, 85% em peso a 90% em peso de ânions de ramnolipídeo, em que % em peso se refere a todos os ânions exceto OH- presente na composição.

[059] Em composições particularmente preferenciais de acordo com a invenção, a massa seca total compreende 40% em peso a 98% em peso, preferencialmente, 50% em peso a 95% em peso, particularmente, de preferência, 60% em peso a 90% em peso de ramnolipídeos, em que as porcentagens em peso se referem à massa seca total.

[060] O termo "massa seca total" no contexto da presente invenção é compreendido como a porção da composição de acordo com a invenção que permanece - naturalmente e adicionalmente à água - depois de a composição de acordo com a invenção ter sido liberada dos componentes que são líquidos a 25 °C e 0,1 MPa (1 bar).

[061] Em composições preferenciais de acordo com a invenção, pelo menos 60% em peso, preferencialmente, pelo menos 80% em peso, particularmente, de preferência, pelo menos 95% em peso dos ramnolipídeos estão presentes em forma dissolvida, em que a porcentagem em peso se refere à quantidade total de ramnolipídeos.

[062] A mesma é medida por análise de HPLC do ramnolipídeo total antes e depois da filtragem através de um filtro de seringa de 0,2 μm, em que a quantidade de ramnolipídeos no eluato corresponde à quantidade de ramnolipídeos dissolvidos.

[063] É preferível, de acordo com a invenção, que as composições compreendam 51% em peso a 95% em peso, preferencialmente, 70% em peso a 90% em peso, particularmente, de preferência, 75% em peso a 85% em peso de diRL-C10C10, em que as porcentagens em peso se referem à soma total de todos os ramnolipídeos presentes.

[064] É preferível, de acordo com a invenção, que as composições compreendam 0,5% em peso a 9% em peso, preferencialmente, 0,5% em peso a 3% em peso, particularmente, de preferência, 0,5% em peso a 2% em peso de monoRL-C10C10, em que as porcentagens em peso se referem à soma total de todos os ramnolipídeos presentes.

[065] Composições preferenciais de acordo com a invenção são distinguidas em que a razão de peso de todos os dirramnolipídeos presentes em relação a todos os monorramnolipídeos presentes é maior do que 51:49, particularmente maior do que 91:9, preferencialmente, maior do que 97:3, particularmente, de preferência, maior do que 98:2.

[066] É preferível, de acordo com a invenção, que as composições compreendam 0,5 a 25% em peso, preferencialmente, 5% em peso a 15% em peso, particularmente, de preferência, 7% em peso a 12% em peso de diRL- C10C12, em que as porcentagens em peso se referem à soma total de todos os ramnolipídeos presentes.

[067] É preferível, de acordo com a invenção, que as composições compreendam 0,1% em peso a 5% em peso, preferencialmente, 0,5% em peso a 3% em peso, particularmente, de preferência, 0,5% em peso a 2% em peso de monoRL-C10C12 e/ou, preferencialmente, e, 0,1% em peso a 5% em peso, preferencialmente, 0,5% em peso a 3% em peso, particularmente, de preferência, 0,5% em peso a 2% em peso de monoRL-C10C12:1, em que as porcentagens em peso se referem à soma total de todos os ramnolipídeos presentes.

[068] Composições particularmente preferenciais de acordo com a invenção são distinguidas pelo fato de que as mesmas compreendem

[069] 0,5% em peso a 15% em peso, preferencialmente, 3% em peso a 12% em peso, particularmente, de preferência, 5% em peso a 10% em peso de diRL-C10C12:1,

[070] 0,5 a 25% em peso, preferencialmente, 5% em peso a 15% em peso, particularmente, de preferência, 7% em peso a 12% em peso de diRL- C10C12,

[071] 0,1% em peso a 5% em peso, preferencialmente, 0,5% em peso a 3% em peso, particularmente, de preferência, 0,5% em peso a 2% em peso de monoRL-C10C12 e

[072] 0,1% em peso a 5% em peso, preferencialmente, 0,5% em peso a 3% em peso, particularmente, de preferência, 0,5% em peso a 2% em peso de monoRL-C10C12:1,

[073] em que as porcentagens em peso se referem à soma total de todos os ramnolipídeos presentes.

[074] Ademais, é preferível que a composição de acordo com a invenção compreenda apenas pequenas quantidades de ramnolipídeos da fórmula monoRL-CX ou diRL-CX. Em particular, a composição de acordo com a invenção compreende preferencialmente

[075] 0% em peso a 5% em peso, preferencialmente, 0% em peso a 3% em peso, particularmente, de preferência, 0% em peso a 1% em peso de diRLC10, em que as porcentagens em peso se referem à soma total de todos os ramnolipídeos presentes, e o termo "0% em peso" é compreendido como nenhuma quantidade detectável.

[076] É preferível, de acordo com a invenção, que as composições de acordo com a invenção sejam essencialmente livres de óleo graxo (acilgliceróis líquidos a 20 °C) e, portanto, compreendem, particularmente, menos do que 0,5% em peso, em particular, menos do que 0,1% em peso, particularmente, de preferência, nenhuma quantidade detectável, de óleo graxo com base na composição total.

[077] A presente invenção fornece adicionalmente um método para preparar uma solução de ramnolipídeos que compreende as etapas de

[078] a) fornecer uma composição que compreende

[079] 30% em peso a 70% em peso, preferencialmente, 35% em peso a 60% em peso, particularmente, de preferência, 40% em peso a 50% em peso de pelo menos um ramnolipídeo, em que as porcentagens em peso se referem à composição total, e que tem um pH a 25 °C de pH 1 a pH 5, preferencialmente, de pH 2,5 a 4,0, particularmente, de preferência, de pH 3,0 a pH 3,5,

[080] b) ajustar o pH da composição de pH 5,5 a pH < 7,0, preferencialmente, de pH 5,6 a pH 6,2, particularmente, de preferência, de pH 5,6 a pH 6,0, e

[081] c) ajustar o teor de água da composição total para

[082] 30% em peso a 70% em peso, preferencialmente, 40% em peso a 65% em peso, particularmente, de preferência, 50% em peso a 60% em peso de água

[083] e ajustar o teor de ramnolipídeo da composição total para 30% em peso a 70% em peso, preferencialmente, 35% em peso a 60% em peso, particularmente, de preferência, 40% em peso a 50% em peso de ramnolipídeos,

[084] em que as porcentagens em peso se referem à composição total.

[085] Em particular, as composições de acordo com a invenção podem ser preparadas pelo método de acordo com a invenção.

[086] De acordo com a invenção, o ramnolipídeo na composição fornecida na etapa de método a) está presente pelo menos parcialmente disperso.

[087] O termo "presente disperso" no contexto da presente invenção é compreendido como agregados de ramnolipídeo identificáveis visualmente ou através de microscópio de luz que estão presentes, que sedimentam no campo gravitacional da Terra a 10% em peso de ramnolipídeo na diluição com água ao mesmo tempo em que mantém o pH.

[088] Em particular, as composições são fornecidas na etapa de método a) que tem uma viscosidade de 3 a 15, preferencialmente, 5 a 10, particularmente, de preferência, 6 a 8 Pas, medida em um reômetro a uma taxa de cisalhamento de 10 s-1.

[089] Um método preferível de acordo com a invenção é distinguido em que o pH é ajustado na etapa de método b) adicionando-se uma base orgânica ou inorgânica, preferencialmente, em forma concentrada.

[090] O termo "base em forma concentrada" no contexto da presente invenção é compreendido como a base que é adicionada na forma de uma composição que compreende pelo menos 60% em peso, em particular, pelo menos 80% em peso de base, em que as porcentagens em peso se referem à composição total adicionada.

[091] No método de acordo com a invenção, a preferência é dada o uso de bases selecionadas a partir do grupo que compreende, preferencialmente, que consiste em metal alcalino e hidróxidos de metal alcalino terroso tais como NaOH, KOH, Mg(OH)2, Ca(OH)2; Al(OH)3, NH4OH, aminas primárias, aminas secundárias, aminas terciárias e aminas quaternárias.

[092] Os representantes exemplificativos de aminas adequadas são 2- aminoetanol (também etanolamina, MEA), dietanolamina (também DEA), 2,2',2''-nitrilotrietanol (também trietanolamina, TEA), 1-aminopropan-2-ol (também monoisopropanolamina), [(2-hidroxietil)trimetilamônio] (também colina) etilenodiamina, dietilenotriamina, trietilenotetramina, tetraetilenopentamina, 1,4-dietilenodiamina (também piperazina), aminoetilpiperazina, aminoetiletanolamina, hidróxido de tetrametilamônio, hidróxido de tetraetilamônio, hidróxido de tetrapropilamônio, hidróxido de tetrabutilamônio, em que a preferência é dada com o uso de 2-aminoetanol (também etanolamina, MEA), dietanolamina (também DEA), 2,2',2''- nitrilotrietanol (também trietanolamina, TEA), 1-aminopropan-2-ol (também monoisopropanolamina) e (2-hidroxietil)trimetilamônio (também colina).

[093] Bases particularmente preferenciais são NaOH, KOH, NH3, NH4OH e trietanolamina.

[094] É possível também usar misturas das bases mencionadas anteriormente de acordo com a invenção.

[095] Se pastas altamente viscosas que compreendem ramnolipídeos são fornecidas na etapa de método a) no método de acordo com a invenção, o aparelho de misturar, tal como extrusores, por exemplo, podem ser vantajosamente usados na etapa de método b) e/ou c).

[096] Sais de ramnolipídeos inovadores podem ser isolados a partir das formulações de acordo com a invenção e as soluções obteníveis pelo método de acordo com a invenção, por exemplo, por remoção de água.

[097] Ademais, a presente invenção fornece, portanto, sais de pelo menos um ramnolipídeo, distinguidos em que os mesmos compreendem pelo menos um cátion selecionado a partir do grupo que compreende, preferencialmente, que consiste em Li+, K+, Mg2+, Ca2+, Al3+, NH4+, íons de amônio primários, íons de amônio secundários, íons de amônio terciários e íons de amônio quaternários.

[098] Os sais de acordo com a invenção compreendem preferencialmente pelo menos 50% em peso, preferencialmente, pelo menos 70% em peso, particularmente, de preferência, pelo menos 95% em peso do pelo menos um cátion, em que as porcentagens em peso elevam o peso do “cátion mais ânion de ramnolipídeo” de sal total e se referem ao sal total.

[099] Representantes exemplificativos de íons de amônio adequados são tetrametilamônio, tetraetilamônio, tetrapropilamônio, tetrabutilamônio e [(2- hidroxietil)trimetilamônio] (colina) e também os cátions de 2-aminoetanol (etanolamina, MEA), dietanolamina (DEA), 2,2',2''-nitrilotrietanol (trietanolamina, TEA), 1-aminopropan-2-ol (monoisopropanolamina), etilenodiamina, dietilenotriamina, trietilenotetramina, tetraetilenopentamina, 1,4-dietilenodiamina (piperazina), aminoetilpiperazina e aminoetiletanolamina.

[100] Cátions particularmente preferenciais são selecionados a partir do grupo que compreende, preferencialmente, que consiste em Li+, Al3+, NH4+ e o cátion de trietanolamônio.

[101] Em relação à sua composição de ramnolipídeo referente ao teor de mono-, di- e ácido graxo, os sais de ramnolipídeo preferenciais de acordo com a invenção têm os ramnolipídeos citados acima presentes nas composições de acordo com a invenção.

[102] A presente invenção é ilustrativamente descrita nos exemplos listados abaixo sem qualquer intenção de limitar a invenção, cujo escopo é denominado pela descrição e reivindicações inteiras, até as modalidades referidas nos exemplos.

[103] EXEMPLOS:

[104] CARACTERIZAÇÃO DOS PRODUTOS

[105] QUANTIFICAÇÃO DE RAMNOLIPÍDEOS POR CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC)

[106] A quantificação foi conduzida por HPLC. A forma ácida das várias espécies de ramnolipídeo foi usada como calibragem padrão em cada caso e a separação cromatográfica foi realizada de modo similar em condições ácidas. Isso leva a todos os componentes de RL serem quantificados em uma amostra como a forma ácida.

[107] Para a preparação de amostra, 1 ml de acetona foi carregado em um vaso de reação de 2 ml com o uso de uma pipeta de deslocamento positivo (Combitip) e o vaso de reação imediatamente vedado para minimizar evaporação. Isso foi seguido pela adição de 1 ml de amostra que contém ramnolipídeo que foi previamente diluída conforme exigido. Depois de misturar em vórtex, a mistura foi centrifugada por 3 minutos a 13.000 rpm, e 800 μl do sobrenadante transferido para um frasco de HPLC.

[108] Um Detector Evaporativo com Espalhamento de Luz (Modelo Sedex LT-ELSD 85LT) foi usado para a detecção e quantificação de ramnolipídeos. A medição real foi realizada com o uso de Agilent Technologies 1200 Series (Santa Clara, Califórnia) e uma coluna de Resolução Rápida Zorbax SB-C8 (4,6 x 150 mm, 3,5 μm, Agilent). O volume de injeção foi 5 μl e o tempo de execução do método foi 20 minutos. TFA 0,1 % aquoso (ácido trifluoroacético, solução A) e metanol (solução B) foram usados como fase móvel. A temperatura de coluna foi 40 °C. O ELSD (temperatura de detector 60 °C) e o DAD (arranjo de diodo, 210 nm) servem como detectores. O gradiente usado no método foi:

[109] MEDIÇÕES DE VISCOSIDADE

[110] A viscosidade é medida com o uso de um reômetro (MCR 302, Anton Paar Alemanha) em um sistema de medição de placa paralela. A placa superior teve um diâmetro de 40 mm, a distância de vão foi 0,5 mm, temperatura de medição foi 25 °C. A medição foi conduzida na taxa de cisalhamento de 0,1 -100 s-1.

[111] EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO DE RL ALTAMENTE CONCENTRADA:

[112] Uma fermentação foi realizada com o uso de uma cepa de Pseudomonas putidapBBR1MCS2-Plac-rhlABC-T-Ptac-rhlC-T, cuja preparação é descrita no documento no US2014296168, que compreende os genes de biossíntese de ramnolipídeo RhIA, RhIB e RhIC. A pré-cultura foram realizadas em um frasco de agitação conforme descrito no documento no WO2012013554A1. Para a cultura principal, um meio mineral (M9) foi empregado de modo similar. A fermentação foi conduzida em um fermentador de 2 litros de uma maneira com limite de carbono através de uma entrada de alimentação de glicose. A entrada de alimentação de glicose ocorre por referência ao sinal de oxigênio dissolvido. O oxigênio dissolvido foi regulado a 20% de saturação através da velocidade de agitador. O pH é regulado para 7 através de um eletrodo de pH e adição de NH4SO4. Para impedir formação de espuma excessiva do caldo de fermentação, o antiespumante DOW Corning 1500 foi adicionado conforme exigido. A fermentação foi conduzida por 4 dias para uma biomassa seca de 15 g/l. A concentração de ramnolipídeo foi determinada por HPLC e foi 9,8 g/l. Depois de separar as células por meio de centrifugação a 10.000 g, o caldo de fermentação foi ajustado para um pH de 3,1 adicionando-se H2SO4concentrado. Centrifugando-se novamente 500 g, um concentrado sólido tipo pasta foi obtido com uma fração de RL de 45% em peso e uma viscosidade de > 10.000 mPas.

[113] EXEMPLO 2: NEUTRALIZAÇÃO PARCIAL COM KOH:

[114] Uma solução de KOH aquosa de 50% em peso foi adicionada com agitação contínua da suspensão tipo pasta do precipitado de ramnolipídeo concentrado (consulte exemplo anterior) e ajustada a um pH de 5,6. A massa tipo pasta foi liquefeita nesse ponto com uma queda brusca em viscosidade. Uma solução clara surgiu da suspensão. 3 porções foram removidas dessa solução e ajustadas para pH = 6, pH = 7 e pH = 8,5 respectivamente adicionando-se mais KOH. Depois de ajustar o pH das soluções, essas foram ajustadas para 50% em peso, 40% em peso, 30% em peso, 20% em peso e 10% em peso de ramnolipídeo por adição de água e usadas para medição de viscosidade. Os resultados são mostrados na Tabela 1. Foi constatado que foi possível obter um produto essencialmente fino como líquido, mas altamente concentrado através da neutralização parcial. Ao mesmo tempo, uma queda distintivamente inferior ocorreu na diluição das soluções em pH 5,6 e 6 do que em pH 7 e 8,5.

[115] Tabela 1: Viscosidade (Pas, taxa de cisalhamento 10 1/s) de composições de ramnolipídeo como uma função da concentração de ramnolipídeo (% em peso) e do pH. As formulações identificadas por * são inventivas, visto que aqui a viscosidade em alta concentração é baixa e a queda em viscosidade na diluição com água é, de modo similar, a menor de todas (comparar as respectivas viscosidades a 10% e 20%).

[116] EXEMPLO 3: NEUTRALIZAÇÃO PARCIAL COM NAOH:

[117] A neutralização parcial foi realizada analogamente ao exemplo 2, com a exceção de que uma solução de NaOH com 50% em peso foi usada no lugar de KOH.

[118] EXEMPLO 4: NEUTRALIZAÇÃO PARCIAL COM NH4OH:

[119] A suspensão de ramnolipídeo ácido, altamente concentrada obtida no exemplo 1 foi ajustada pela adição de água para um teor de ramnolipídeo de 34,6% em peso, que teve um pH de 3,18. 113 g dessa suspensão foram removidas e 3,64 g de uma solução de NH4OH com 25% em peso foram adicionados com agitação contínua. A solução se liquefez completamente aqui e resultou em um pH de 5,63.

[120] EXEMPLO 5: NEUTRALIZAÇÃO PARCIAL COM CA(OH)2

[121] 2 g de Ca(OH)2 foram adicionados a 101 g de uma suspensão de ramnolipídeo ácida que compreende 34,6% em peso de ramnolipídeo e um pH de 3,18 e a suspensão sólida resultante foi agitada à temperatura ambiente por 2 dias. A solução se liquefez completamente aqui e resultou em um pH de 5,72.

[122] EXEMPLO 6: NEUTRALIZAÇÃO PARCIAL COM MG(OH)2

[123] 1,69 g de Mg(OH)2 foram adicionados a 95 g de uma suspensão de ramnolipídeo ácida que compreende 34,6% em peso de ramnolipídeo e um pH de 3,18 e a suspensão sólida resultante foi agitada à temperatura ambiente durante uma noite. A solução se liquefez completamente aqui e resultou em um pH de 6,06.

[124] EXEMPLO 7: NEUTRALIZAÇÃO PARCIAL COM 2- AMINOETANOL (MEA)

[125] A fermentação e elaboração dos ramnolipídeos foi realizada analogamente ao exemplo 1 com a exceção de que o pH foi apenas acidificado para 3,8 na etapa de precipitação. A suspensão de ramnolipídeo resultante foi ajustada a um teor de ramnolipídeo de 40% em peso pela adição de água e dividida em diversas porções de 50 g. 2,28 g de monoetanolamina (pureza > 99 %) foram adicionados a uma das porções sob agitação contínua, o que liquefez e clarificou a solução. O pH da solução resultante foi 6,0.

[126] EXEMPLO 8: NEUTRALIZAÇÃO PARCIAL COM TRIETANOLAMINA (TEA)

[127] 6,8 g de trietanolamina (pureza > 99%) foram adicionados a 50 g de uma suspensão de ramnolipídeo de 40% em peso, pH 3,8 (consulte o exemplo 7) com agitação contínua. Isso liquefez e clarificou a solução. O pH da solução resultante foi 6,2.

[128] EXEMPLO 9: NEUTRALIZAÇÃO PARCIAL COM MONOISOPROPANOLAMINA (MIPA)

[129] 2,76 g de MIPA (pureza > 99%) foram adicionados a 50 g de uma suspensão de ramnolipídeo com 40% em peso, pH 3,8 (consultar o exemplo 7) com agitação contínua. Isso liquefez e clarificou a solução. O pH da solução resultante foi 6,2.

[130] EXEMPLO 10: NEUTRALIZAÇÃO PARCIAL COM HIDRÓXIDO DE COLINA

[131] 9,4 g de hidróxido de colina (solução de 46% em peso) foram adicionados a 50 g de uma suspensão de ramnolipídeo com 40% em peso, pH 3,8 (consultar o exemplo 7) com agitação contínua. Isso liquefez e clarificou a solução. O pH da solução resultante foi 6,2.

Claims

1. Composição que compreende 30% em peso a 70% em peso, preferencialmente, 35% em peso a 60% em peso, particularmente, de preferência, 40% em peso a 50% em peso de pelo menos um ramnolipídeo e 30% em peso a 70% em peso, preferencialmente, 40% em peso a 65% em peso, particularmente, de preferência, 50% em peso a 60% em peso de água, em que as porcentagens em peso se referem à composição total, sendo que a composição é caracterizada por o pH a 25 °C ser de 5,5 a < 7,0, preferencialmente, de 5,6 a 6,2 e, particularmente, de preferência, de 5,6 a 6,0 em que o termo “ramnolipídeos” engloba ramnolipídeos, suas formas protonadas e sais das mesmas.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a massa seca total compreender 40% em peso a 98% em peso, preferencialmente, 50% em peso a 95% em peso, particularmente, de preferência, 60% em peso a 90% em peso de ramnolipídeos, em que as porcentagens em peso se referem à massa seca total.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por os cátions dos sais de ramnolipídeo presentes serem selecionados a partir do grupo que compreende, preferencialmente, consiste em Li+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Al3+, NH4+, íons de amônio primários, íons de amônio secundários, íons de amônio terciários e íons de amônio quaternários.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a dita composição compreender 50% em peso a 99% em peso, preferencialmente, 70% em peso a 95% em peso, particularmente, de preferência, 85% em peso a 90% em peso de ânions de ramnolipídeo, em que % em peso se refere a todos os ânions exceto OH- presente na composição.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por a dita composição compreender 51% em peso a 95% em peso de diRL-C10C10, em que as porcentagens em peso se referem à soma total de todos os ramnolipídeos presentes.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por a dita composição compreender 0,5% em peso a 9% em peso de monoRL-C10C10, em que as porcentagens em peso se referem à soma total de todos os ramnolipídeos presentes.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por a razão de peso de todos os dirramnolipídeos presentes em relação a todos os monorramnolipídeos presentes é maior do que 51:49, particularmente maior do que 91:9, preferencialmente, maior do que 97:3, particularmente, de preferência, maior do que 98:2.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, sendo que a dita composição é caracterizada por compreender 0,5 a 25% em peso de diRL-C10C12, em que as porcentagens em peso se referem à soma total de todos os ramnolipídeos presentes.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por a dita composição compreender 0,1% em peso a 5% em peso de monoRL-C10C12 e/ou, preferencialmente, e 0,1% em peso a 5% em peso de monoRL-C10C12:1, em que as porcentagens em peso se referem à soma total de todos os ramnolipídeos presentes.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por a dita composição compreender 0,5% em peso a 15% em peso de diRL-C10C12:1, 0,5 a 25% em peso de diRL-C10C12, 0,1% em peso a 5% em peso de monoRL-C10C12 e 0,1% em peso a 5% em peso de monoRL-C10C12:1, em que as porcentagens em peso se referem à soma total de todos os ramnolipídeos presentes.

11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por a dita composição compreender 0% em peso a 5% em peso de diRLC10, em que as porcentagens em peso se referem à soma total de todos os ramnolipídeos presentes.

12. Método para preparar uma solução de ramnolipídeos caracterizado por compreender as etapas de a) fornecer uma composição que compreende 30% em peso a 70% em peso, preferencialmente, 35% em peso a 60% em peso, particularmente, de preferência, 40% em peso a 50% em peso de pelo menos um ramnolipídeo, em que as porcentagens em peso se referem à composição total, e que tem um pH a 25 °C de 1,0 a 5,0; preferencialmente, de 2,5 a 4,0; particularmente, de preferência, de 3,0 a 3,5, b) ajustar o pH da composição para 5,5 a < 7,0, preferencialmente, para 5,6 a 6,2, particularmente, de preferência, para 5,6 a 6,0, e c) ajustar o teor de água da composição total para 30% em peso a 70% em peso, preferencialmente, 40% em peso a 65% em peso, particularmente, de preferência, 50% em peso a 60% em peso de água e ajustar o teor de ramnolipídeo da composição total para 30% em peso a 70% em peso, preferencialmente, 35% em peso a 60% em peso, particularmente, de preferência, 40% em peso a 50% em peso de ramnolipídeos, em que o termo “ramnolipídeos” engloba ramnolipídeos, suas formas protonadas e sais das mesmas.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o ramnolipídeo na composição fornecido na etapa de método a) estar presente pelo menos parcialmente disperso.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado por o pH ser ajustado na etapa de método b) adicionando-se uma base orgânica ou inorgânica, preferencialmente, em forma concentrada.