BR112016029730B1 - Microrganismo do gênero corynebacterium que tem a aptidão de produzir l-arginina e um método para a produção de l-arginina utilizando o mesmo - Google Patents
Microrganismo do gênero corynebacterium que tem a aptidão de produzir l-arginina e um método para a produção de l-arginina utilizando o mesmo Download PDFInfo
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Abstract
MICRORGANISMO DO GÉNERO CORYNEBACTERIUM QUE TEM A APTIDÃO DE PRODUZIR L-ARGININA E UM MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE L-ARGININA UTILIZANDO O MESMO. A presente invenção diz respeito a um microrganismo do género Corynebacterium que tem a aptidão para produzir L-arginina e a um método para a produção de L-arginina utilizando o mesmo.
Description
[001] Campo técnico
[002] A presente invenção diz respeito a um microrganismo do gênero Corynebacterium que tem a aptidão para produzir L-arginina e a um método para a produção de L-arginina utilizando o mesmo.
[003] Técnica anterior
[004] A L-arginina é um aminoácido amplamente utilizado em suplementos de aminoácidos, fármacos, alimentos etc., e tem existido uma procura pelo desenvolvimento de uma produção eficaz de L-arginina nas indústrias associadas.
[005] O método para a produção de L-arginina através de um método de fermentação biológica convencional é um método para produzir L-arginina diretamente a partir de fontes de carbono e de azoto, e foram descritos vários métodos, incluindo o método utilizando uma estirpe induzida modificada proveniente de um microrganismo do gênero Brevibacterium ou Corynebacterium, um método utilizando um linhagem celular bacteriana desenvolvida de modo a ter uma aptidão produtora de aminoácidos aumentada por fusão celular, etc.. Recentemente, foi descrito um método de utilização de uma estirpe recombinante genética, em que um gene que inibe a expressão do operão de biossintetização de arginina argR foi inativado (patente de invenção norte-americana n°. 7 160 705) e um método de utilização da sobre-expressão de argF num operão de arginina (patente de invenção coreana n°. 10-0854234), etc.. Em particular, a supressão em argR, que controla o operão de arginina, foi considerada um fator importante na produção de arginina.
[006] De acordo com os factos conhecidos até agora, num microrganismo de Corynebacterium, o gene argCJBDFR, que está envolvido na biossíntese de arginina, é constituído na forma de um operão e é submetido à inibição por resposta através de arginina intracelular (Vehary Sakanyan, et al., Microbiology, 142:9-108, 1996), impondo assim uma limitação à sua produção de L-arginina de elevado rendimento.
[007] Descrição
[008] Problema técnico
[009] Assim sendo, as requerentes, enquanto se esforçavam para aumentar a rendimento de produção de L-arginina, concluíram que a L-arginina pode ser produzida com um rendimento elevado em comparação com a estirpe parental produtora de L-arginina, aumentando as atividades do operão de arginina e ornitina-carbamoíl-transferase, sem qualquer supressão no repressor de arginina (argR), que era convencionalmente conhecido como um fator importante, completando assim a presente invenção.
[0010] Solução técnica
[0011] Um objeto da presente invenção consiste em proporcionar um microrganismo do gênero Corynebacterium que tem a aptidão para produzir L- arginina.
[0012] Outro objeto da presente invenção consiste em proporcionar um método para a produção de L-arginina utilizando o microrganismo do gênero Corynebacterium.
[0013] Efeito vantajoso
[0014] A L-arginina pode ser produzida com um rendimento elevado utilizando um microrganismo produtor de L-arginina do gênero Corynebacterium com atividade aumentada de um operão de arginina e de ornitina-carbamoíl- transferase (ArgF ou ArgF2), de acordo com a presente invenção. Além disso, a L-arginina produzida com um rendimento elevado pode ser utilizada eficazmente nas indústrias farmacêutica e farmacológica humanas.
[0015] Melhor forma de realização da invenção
[0016] De acordo com um aspecto para se alcançar os objetos supra identificados, a presente invenção proporciona um microrganismo do gênero Corynebacterium capaz de produzir L-arginina com atividade aumentada de um operão de arginina e de ornitina-carbamoíl-transferase.
[0017] De acordo com a presente invenção, o operão de arginina é um operão constituído por enzimas envolvidas no mecanismo de biossíntese de L- arginina e, em particular, o operão de arginina é constituído por enzimas que constituem os passos cíclicos da biossíntese de L-arginina. Especificamente, o operão de arginina é constituído por N-acetilglutamil fosfato reductase (ArgC), glutamato N-acetiltransferase (ArgJ), N-acetilglutamato cinase (ArgB), acetlornitina aminotransferase (ArgD), ornitina carbamoíl-transferase (ArgF) e repressor de arginina (ArgR), e estas enzimas estão envolvidas nas reações enzimáticas contínuas de biossíntese de L-arginina.
[0018] Estas enzimas que constituem o operão de arginina estão envolvidas na biossíntese final de L-arginina utilizando L-glutamato como precursor. A glutamato-N-acetiltransferase (ArgJ) sintetiza N-acetilglutamato utilizando L- glutamato como precursor, e pode ser um codificado pelo gene argJ. Em particular, o grupo acetilo é obtido por decomposição de N-acetilornitina em L- ornitina. Sabe-se que a glutamato N-acetiltransferase está envolvida na reação de reciclagem para a biossíntese de L-arginina em microrganismos que pertencem ao gênero Corynebacterium.
[0019] O N-acetilglutamato produzido é sintetizado em N-acetilglutamil- fosfato por N-acetilglutamato-cinase (ArgB), ADP é produzido por consumo de ATP como co-enzima e pode ser um codificado pelo gene argB. Uma vez que se sabe que é submetido à inibição por resposta pelo produto final, L-arginina, as modificações que libertam a inibição por resposta através de L-arginina são já conhecidas e existem descrições que referem que a produtividade em L-arginina pode ser melhora utilizando a mesma (patente chinesa n°. 102021154 e Amino Acids. 2012 Jul; 43(1): 255-66. doi: 10.1007/s00726-011-1069-x. Epub 2011 Sep 8).
[0020] A N-acetilglutamil-fosfato-reductase (ArgC)é também designada acetilglutamato semi-aldeído desidrogena em E. coli ou leveduras e pode ser codificada pelo gene argC. O N-acetilglutamil-fosfato é convertido em N- acetilglutamato-5-semi-aldeído por esta enzima. A NADPH é utilizada como co- enzima para fornecer energia. O N-acetilglutamato-5-semialdeído produzido é convertido em N-acetilornitina utilizando L-glutamato como dador de aminoácido e esta reação é mediada pela acetilornitina aminotransferase (ArgD). A acetilornitina aminotransferase pode ser codificada pelo gene argD. A N-acetil- ornitina convertida transporta o seu grupo acetilo para L-glutamato através da reação de reciclagem de glutamato N-acetiltransferase (ArgJ), e reagem como L-ornitina.
[0021] A ornitina carbamoiltransferase (ArgF)é normalmente designada ornitina carbamoílase e pode ser codificada pelos genes argF ou argF2. A L- ornitina liga-se a carbamoíl-fosfato para formar L-citrulina e um fosfato é produzido como produto de reação secundário. Por último, a L-citrulina produzida é sintetizada em L-arginina pelas reações enzimáticas de ácido arginino-succíncio-sntase (ArgG) e ácido arginino-sucínico-liase (ArgH), as quais estão presentes separadas do operão de arginina, referido antes. A L-arginina é sintetizada por um total de 8 passos biossintéticos e, na presente invenção, o aumento de produtividade em L-arginina foi induzido por fortalecimento da atividade do operão de arginina (argCJBDFR).
[0022] As enzimas que constituem o operão de arginina podem ser incluídas no âmbito da presente invenção, desde que possuam as atividades descritas antes, e, especificamente, as enzimas podem ser proteínas obtidas a partir de um microrganismo do gênero Corynebacterium. Mais especificamente, a glutamato-N-acetil-transferase (ArgJ) pode incluir a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 ou uma sequência de aminoácidos que tenha uma homologia com a sequência de pelo menos 70%, especificamente, 80% e, mais especificamente, 90% ou superior. A N-acetilglutamato-cinase (ArgB) pode incluir a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 ou uma sequência de aminoácidos que tenha uma homologia com a sequência de pelo menos 70%, especificamente, 80% e, mais especificamente, 90% ou superior. Além disso, no caso da enzima correspondente, podem ser introduzidas modificações conhecidas na especialidade para libertar a inibição por resposta por arginina. A N-acetilglutamil-fosfato-reductase (ArgC) pode incluir a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23 ou uma sequência de aminoácidos que tenha uma homologia com a sequência de pelo menos 70%, especificamente, 80% e, mais especificamente, 90% ou superior. A acetilornitina aminotransferase (ArgD) pode incluir a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 25 ou uma sequência de aminoácidos que tenha uma homologia com a sequência de pelo menos 70%, especificamente, 80% e, mais especificamente, 90% ou superior. A ornitina carbamoíl-transferase (ArgF) pode incluir uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 o da SEQ ID NO: 3 ou pode incluir uma sequência de aminoácidos que tenha uma homologia com a sequência de pelo menos 70% com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 3. Especificamente, a ornitina carbamoíl-transferase (ArgF) pode incluir uma sequência de aminoácidos que tenha uma homologia de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou superior com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 3. Além disso, é óbvio que as sequências de aminoácidos que incluem uma supressão, modificação ou adição em um ou mais resíduos aminoácidos estão compreendidas no âmbito da presente invenção, desde que possuam a homologia com as proteínas referidas antes e tenham substancialmente a mesma ou uma atividade biológica correspondente à das proteínas anteriores.
[0023] Tal como aqui utilizado, o termo “homologia” diz respeito ao grau de similaridade entre duas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleótidos para comparação e a sua homologia pode ser determinada por comparação à vista desarmada ou utilizando um algoritmo bioinformático, que proporciona resultados de análise de um grau de homologia por alinhamento de sequências para comparação. A homologia entre duas sequências de aminoácidos pode ser indicada em percentagens. Os algoritmos automatizados úteis podem ser utilizados em módulos de aplicações para computador GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA do conjunto de aplicações informáticas da Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, WI, EUA). Outros algoritmos e determinações de homologia úteis após alinhamento são já automatizados em aplicações informáticas, tais como FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST e CLUSTAL W.
[0024] De acordo com a presente invenção, o aumento de atividade do operão de arginina pode dizer respeito ao aumento de atividade em pelo menos uma enzima entre as enzimas presentes no operão de arginina, no entanto, não inclui o aumento individual do gene argR por si só. Por exemplo, o aumento da atividade do operão de arginina pode dizer respeito ao aumento das atividades de todas as enzimas presentes no operão de arginina e, especificamente, pode dizer respeito ao aumento de atividade da totalidade do operão por aumento do promotor para a N-acetilglutamil fosfato reductase. Além disso, de acordo com a presente invenção, o aumento na expressão de um gene que codifica pelo menos uma enzima entre as enzimas que constituem o operão de arginina também pode ser considerado como aumento da atividade do operão de arginina.
[0025] Tal como aqui utilizado, o termo “aumento” da atividade diz respeito à provisão de um microrganismo sem uma atividade particular de uma proteína com a atividade da proteína ou aumento da atividade intracelular no microrganismo que possui a atividade da proteína, etc., e diz respeito ao aumento da atividade intracelular da proteína em compactação com a atividade intrínseca da proteína. Tal como aqui utilizado, o termo atividade intrínseca diz respeito ao estado cativo que a enzima possui no estado natural ou pré- modificado pelo microrganismo que pertence ao gênero Corynebacterium.
[0026] Para potenciar ou aumentar a atividade da enzima, há diversos métodos conhecidos na especialidade que podem ser aplicados. Como exemplos de métodos, embora não sejam limitados a estes, é possível referir um método para aumentar o número de cópias de sequências de nucleótidos que codificam enzimas através da inserção de um polinucleótido que inclui uma sequência de nucleótidos que codifica a enzima correspondente num cromossoma ou a introdução do polinucleótido num sistema vector, etc., um método de substituir promotores de enzima com promotores fortes e, especificamente, pode incluir um método de introdução de uma modificação nos promotores e um método de modificação da enzima numa com atividade forte através de modificação genética.
[0027] Exemplos específicos na presente invenção podem incluir um método de modificação do promotor de enzima presente no operão de arginina para um promotor que é forte em comparação com o promotor endógeno, através de modificação ou substituição do promotor. Um promotor melhorado ou um promotor heterogéneo com uma modificação ou substituição de nucleótido pode ser ligado em vez do promotor para a enzima endógena e como exemplos de promotores heterogéneos é possível referir o promotor pcj7 (patente de invenção coreana n°. 10-0620092), promotor lysCPI (patente de invenção coreana n°. 100930203), promotor EF-Tu, promotor groEL, promotor aceA, promotor aceB, etc., embora não limitados a estes.
[0028] Tal como aqui utilizado, o termo “promotor” diz respeito a uma sequência de ácidos nucleicos não codificada a montante de uma região de codificação, que inclui uma região de ligação a polimerase e tem uma atividade de início de transcrição em mARN de um gene a jusante do promotor, isto é, a região do ADN em que a polimerase de liga e inicia a transcrição do gene, e está localizado na região 5’ da região de início da transcrição de mARN.
[0029] De acordo com a presente invenção, o aumento da atividade de ornitina carbamoíl-transferase pode ser efetuado utilizando vários métodos bem conhecidos na especialidade e são idênticos aos descritos antes. Especificamente, o aumento pode ser alcançado por transformação de um vector de expressão incluindo um polinucleótido que codifica a ornitina carbamoíl- transferase numa estirpe bacteriana, mas sem que isso constitua qualquer limitação.
[0030] Tal como aqui utilizado, o termo “transformação” diz respeito a uma introdução de ADN num hospedeiro, tornando assim o ADN inserido replicável como fator extracromossómico ou por integração cromossómica. Especificamente, o transformante da presente invenção pode ser inserido num cromossoma através de recombinação homóloga entre a sequência de uma molécula de ácido nucleico, que tem atividade de promotor dentro de um vector após a transformação do vector, incluindo o ADN anterior numa célula hospedeira, e a sequência na região promotora do gene alvo endógeno ou pode ser mantido sob a forma de um plasmídeo.
[0031] O método de transformação de vector da presente invenção pode incluir qualquer método que possa introduzir um ácido nucleico numa célula e qualquer tecnologia padrão adequada conhecida na especialidade pode ser selecionada e executada de acordo com cada célula hospedeira. Por exemplo, é possível utilizar electroporação, precipitação com fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação com cloreto de cálcio (CaCl2), micro-injecção, um método com polietileno-glicol (PEG), um método com DEAE-dextrano, um método com lipossomas catiónicos, um método com acetato de lítio/DMSO, etc., mas sem estar limitado a estes.
[0032] Tal como aqui utilizado, o termo “um microrganismo do gênero Corynebacterium (Corynebacterium sp.)” pode dizer respeito a todas as estirpes que pertencem ao gênero Corynebacterium que tenham aptidão para produzir L- arginina, v.g., Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium fermentum, etc., mas sem que isso constitua qualquer limitação. Especificamente, é possível utilizar Corynebacterium glutamicum, mas o microrganismo não está limitado a este.
[0033] De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a produção de L-arginina, incluindo a cultura de um microrganismo produto de L-arginina do gênero Corynebacterium num meio de cultura adequado.
[0034] De acordo com a presente invenção, a cultura de microrganismo pode ser efetuada de acordo com métodos amplamente conhecidos na especialidade e as condições de temperatura da cultura, horas de cultura, pH do meio de cultura, etc., podem ser ajustados de um modo adequado. Os métodos de cultura conhecidos encontram-se descritos mais minuciosamente em referências (Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) e Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)). Além disso, os métodos de cultura podem incluir uma cultura em banho, uma cultura contínua e uma cultura de alimentação-lote e, especificamente, as culturas podem ser efetuadas de um modo contínuo através de um processo de lote ou de um processo de alimentação-lote ou processo de alimentação-lote repetido, embora não esteja limitada a estes.
[0035] O meio de cultura utilizado deverá satisfazer de um modo adequado às condições requeridas de uma estirpe particular. Os meios de cultura utilizados para vários microrganismos são já conhecidos (v.g., “Manual of Methods for General Bacteriology” da American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). As fontes de carbono que irão estar contidas no meio podem incluir sacáridos e hidratos de carbono (v.g., glicose, sacarose, lactose, fructose, maltose, melaço, amido e celulose), óleos e gorduras (v.g., óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos gordos (v.g., ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcoois (v.g., glicerol e etanol), ácidos orgânicos (v.g., ácido acético), etc.. Estes materiais podem ser utilizados individualmente ou como uma mistura, mas sem que isso constitua qualquer limitação. As fontes de azoto podem estar contidas no meio e podem incluir compostos orgânicos que contêm azoto (v.g., peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, extrato solúvel de milho, farinha de soja triturada e ureia) e compostos inorgânicos (v.g., sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio e nitrato de amónio) e estes materiais também podem ser utilizados individualmente ou como uma mistura, mas sem que isso constitua qualquer limitação. As fontes de fósforo podem estar contidas no meio e podem incluir di-hidrogeno-fosfato de potássio ou hidrogeno- fosfato dipotássico ou um seu sal equivalente que contenha sódio, mas sem que isso constitua qualquer limitação. O meio de cultura pode conter sais metálicos essenciais para o crescimento (v.g., sulfato de magnésio ou sulfato de ferro) e é possível utilizar materiais promotores do crescimento essenciais, tais como aminoácidos e vitaminas, para além dos materiais descritos antes. Além disso, pode ainda ser adicionado um precursor adequado ao meio de cultura. Os materiais a fornecer descritos antes podem ser adicionados ao meio de uma só vez ou, adequadamente, durante a cultura.
[0036] O pH do meio de cultura pode ser ajustado de um modo adequado utilizando um composto básico (v.g., hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amónia) ou um composto acídico (v.g., ácido fosfórico ou ácido sulfúrico).
[0037] A formação de espuma pode ser ajustada utilizando um agente anti- espuma, tal como um estes poliglicólico de ácido gordo. Pode ser mantida uma condição aeróbica por meio da introdução de oxigénio ou de uma mistura gasosa que contém oxigénio, por exemplo, ar, no meio de cultura. A temperatura da cultura pode estar compreendida entre 20°C e 45°C e, especificamente, entre 25°C e 40°C. A cultura pode ser continuada até ser obtida uma quantidade máxima da produção de L-aminoácido desejada e, especificamente, durante 10 horas a 160 horas. A L-arginina pode ser libertada no meio de cultura ou permanecer contida na célula.
[0038] Entretanto, o método para a produção de L-arginina da presente invenção, incluindo a cultura do microrganismo descrito antes, pode ainda incluir um passo de recuperação de L-arginina durante a cultura. Isto é, o método para a produção de L-arginina da presente invenção pode incluir a cultura de um microrganismo do gênero Corynebacterium no meio de cultura e a recuperação de L-arginina a partir do microrganismo e do meio de cultura. O passo de recuperação de arginina pode significar a separação de arginina de células ou do meio de cultura utilizando um método de recuperação de arginina bem conhecido na especialidade. Os métodos de recuperação de L-arginina podem incluir centrifugação, filtração, extração, pulverização, secagem, evaporação, precipitação, cristalização, electroforese, dissolução fraccional, cromatografia (v.g., cromatografia de permuta iónica, de afinidade, de hidrofobicidade, de exclusão por tamanhos e cromatografia líquida de elevado rendimento), etc., mas sem que isso constitua qualquer limitação.
[0039] Forma de realização da invenção
[0040] Doravante, a presente invenção será descrita mais minuciosamente com referem aos exemplos seguintes. No entanto, estes exemplos são apenas apresentados com fins ilustrativos e não se pretende que a invenção esteja limitada por estes exemplos.
[0041 ] Exemplo 1: construção de um vector com um operão de arginina aumentado
[0042] Para aumentar o operão de arginina no cromossoma de um microrganismo, construiu-se um vector em que o auto-promotor para N- acetilglutamil fosfato reductase (ArgC) foi suprimido e substituído com um promotor diferente. Como promotor de substituição, utilizou-se lysCP1 (SEQ ID NO: 18, descrita na patente de invenção coreana n°. 10-0930203), que tem uma forte atividade indutora de expressão.
[0043] Em primeiro lugar, amplificaram-se fragmentos de ADN através de uma reação de cadeia de polimerase primária (PCR) utilizando o ADN cromossómico de uma estirpe de tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum (n°. de adesão: ATCC13869) como matriz de referência, em conjunto com um par iniciador de SEQ ID NO: 13 (iniciador de infusão SF_pargC_PR_pDC; 5'- CGAGCTCGGTACCCGGGCAAAGAATACGGCTTCCTTGGC-3') e SEQ ID NO: 14 (iniciador de infusão/enzima de restrição SR_pargC_PR_XbaI-XhoI-BamHI; 5'-CTGGATCCTCGAGTCTAGAGACGGGTTAGACATGCAAAA-3') e um par iniciador de SEQ ID NO: 15 (iniciador de infusão/enzima de restrição SF_pargC_PR_SpeI-ScaI-BamHI; 5'- GACTCGAGGATCCAGTACTAGTATGATAATCAAGGTTGCAAT-3') e SEQ ID NO: 16 (iniciador de infusão SR_pargC_PR_pDC; 5'- TGCAGGTCGACTCTAGGGTAACGCCTTCTTTCAAAG-3'). As condições específicas para a reação de PCR foram as seguintes: a reação de PCR foi efetuada por desnaturação a 95°C durante 10 minutos, cozimento a 55°C durante 30 segundos e alongamento a 72°C durante 1 minuto, utilizando um dispositivo de PCR (Bio-rad C1000 thermal cycler) e Pfu polimerase (Macrogen), e repetiu-se durante 28 ciclos.
[0044] Os fragmentos de PCR primários assim obtidos foram purificados utilizando um estojo de purificação de fragmentos de ADN (GeneAll) e depois três fragmentos foram ligados por mistura destes com um vector pD, que tinha sido já preparado por digestão com enzimas de restrição XmaI-XbaI. Os fragmentos de ADN ligados foram submetidos a uma reação a 50°C durante 10 minutos utilizando o estojo de clonagem In-fusion (Clontech) e, assim, foi construído um vector pD-RargC_PR.
[0045] A inserção do promotor de substituição foi efetuada de um modo tal que o promotor lysCP1 foi amplificado utilizando pDZ-lysCP1 (patente de invenção coreana n°. 10-0930203) como matriz, em conjunto com um par iniciador de SEQ ID NO: 5 (iniciador de infusão SF_PlysCP1_XhoI-XbaI; 5'- CCGTCTCTAGACTCGAGCCATCTTTTGGGGTGCGG-3') e SEQ ID NO: 6 (iniciador de infusão SR_PlysCP1_SpeI; 5'- TTGATTATCATACTAGTCTTTGTGCACCTTTCGAT-3'), e foi ligado por mistura destes com um vector pD-PargC_PR, que tinha sido já preparado por digestão com enzimas de restrição XhoI-SpeI. Os métodos de PCR e clonagem In-fusion são os mesmos que foram descritos antes e, por último, foi construído um vector pD-PargC::lysCP1 através destes métodos.
[0046] Exemplo 2: construção de um vector com ornitina carbamoíl- transferase aumentada
[0047] Para aumentar a ornitina carbamoíl-transferase, uma das enzimas da biossíntese de arginina, construiu-se um vector de expressão recombinante. Utilizou-se p117-cj7-GFP (patente de invenção coreana n°. 10-0620092) como vector de matriz, removeu-se a sequência de nucleótidos que codifica GFP no vector de matriz por tratamento com enzimas de restrição EcoRV-Xba I e inseriu- se com argF, proveniente de uma estirpe de tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, e argF2(patente de invenção coreana n°. 100830290).
[0048] Os fragmentos de ADN do gene argF foram amplificados via PCR utilizando o ADN cromossómico de uma estirpe de tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum (n°. de adesão: ATCC13869) como matriz, em conjunto com um par iniciador de SEQ ID NO: 7 (iniciador de infusão SF_argF_EcoRV; 5'- ACGAAAGGAAACACTCGATATCATGACTTCACAACCACAGGT-3') e SEQ ID NO: 8 (iniciador de infusão SR_argF_XbaI; 5'- GCCAAAACAGCTCTAGATTACCTCGGCTGGTGGGCCA-3'). A reação de PCR foi efetuada por desnaturação a 95°C durante 10 minutos, cozimento a 55°C durante 30 segundos e alongamento a 72°C durante 2 minutos utilizando Pfu polimerase, e repetiu-se durante 28 ciclos. Os fragmentos de PCR assim obtidos foram purificados e misturados com p117-cj7-GFP, que tinha sido já tratado com enzimas de restrição EcoRV-XbaI, foram ligados pelo método de clonagem Infusion, tendo-se assim construído um vector de expressão recombinante, p117- Pcj7-argF.
[0049] O gene argF2 foi amplificado por PCR utilizando o ADN cromossómico de uma estirpe de tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum (n°. de adesão: ATCC13032) como matriz, em conjunto com um par iniciador de SEQ ID NO: 9 (iniciador de infusão F_argF2_EcoRV; 5'- ACGAAAGGAAACACTCGATATCATGGCCAGAAAACATCTGCT-3') e SEQ ID NO: 10 (iniciador de infusão SR_argF2_XbaI; 5'- GCCAAAACAGCTCTAGACTACGCATTGATCGACCGAG-3') e Pfu polimerase (Macrogen), através de PCR, por desnaturação a 95°C durante 10 minutos, cozimento a 55°C durante 30 segundos e alongamento a 72°C durante 2 minutos utilizando Pfu polimerase, tendo-se repetido durante 28 ciclos. Os fragmentos de PCR assim obtidos foram purificados e misturados com p117-cj7-GFP, que tinha sido já tratado com enzimas de restrição EcoRV-XbaI, foram ligados pelo estojo de clonagem In-fusion, tendo-se assim construído um vector de expressão recombinante, p117-Pcj7-argF2.
[0050] Além disso, foi construído um vector de expressão recombinante que pode ser expresso em simultâneo nos genes argF e argF2. O vector de expressão assim construído, p117-Pcj7-argF, foi tratado com NotI e depois foi inserido neste p117-Pcj7-argF2. Especificamente, a reação de PCR foi efetuada utilizando o plasmídeo recombinante, p117-Pcj7-argF2, como matriz, em conjunto com os iniciadores de SEQ ID NO: 11 (iniciador de infusão SF_Pcj7_argF2_NotI; 5'- CCTTTTTGCGGCGGCCGCAGAAACATCCCAGCGCTACT-3') e de SEQ ID NO: 12 (iniciador de infusão SR_argF2_NotI; 5'- CACCGCGGTGGCGGCCGCCGCAAAAAGGCCATCCGTCA-3') e Pfu polimerase, por desnaturação a 95°C durante 10 minutos, cozimento a 55°C durante 30 segundos e alongamento a 72°C durante 2,5 minutos, e foi repetido durante 28 ciclos. Os fragmentos de PCR assim obtidos foram purificados e misturados com p117-Pcj7-argF, que tinha sido já tratado com enzima de restrição NotI, foram ligados pelo estojo de clonagem In-fusion e, por último, foi construído um vector de expressão recombinante, p117-Pcj7-argF/Pcj7-argF2.
[0051 ] Exemplo 3: construção de uma estirpe que tem um vector recombinante inserido nesta
[0052] 3-1. Inserção de um vector com um operão de arginina aumentado
[0053] Para se substituir um auto-promotor de um operão de arginina no cromossoma de Corynebacterium, pD-PargC::lysCP1, transformou-se o vector recombinante, construído no exemplo 1, numa estirpe existente de Corynebacterium produtora de arginina e, assim, construiu-se uma estirpe de Corynebacterium inserida com um vector recombinante. Especificamente, inseriu-se a sequência promotora lysCP1 no cromossoma por transformação de pD-PargC::lysCP1, o vector recombinante construído no exemplo 1, em estirpes produtoras de arginina existentes de KCCM10741P (patente de invenção coreana n°. 10-07916590) e ATCC21831, substituindo assim a sequência auto- promotora que a estirpe original possuía por uma sequência promotora do vector via recombinação homóloga.
[0054] Durante a realização da transformação, o vector recombinante foi inserido, em primeiro lugar, em KCCM10741P e ATCC21831 através de um método de pulso eléctrico (Appl Microbiol Biotechnol. 1999 Oct; 52(4): 541-5) e as estirpes com as inserções no seu cromossoma por recombinação de sequências homólogas foram selecionadas em meio que contém 25 mg/L canamicina. As estirpes primárias selecionadas foram submetidas a cruzamento e, assim, foram selecionadas as sequências em que os promotores foram substituídos pelo promotor lysCP1 e o vector foi removido. A presença da substituição de promotor nas estirpes transformadas finais foi confirmada por PCR, utilizando um par iniciador de SEQ ID NO: 5 e de SEQ ID NO: 6, e as estirpes foram nomeadas KCCM10741P_?PargC::lysCP1 e ATCC21831_?PargC::lysCP1.
[0055] 3-2. Inserção de um vector com ornitina carbamoíl-transferase aumentada
[0056] Os vectores de expressão, p117-Pcj7-argF, p117-Pcj7-argF2 e p117- Pcj7-argF/Pcj7-argF2, construídos no exemplo 2, foram inseridos na estirpe KCCM10741P_?PargC::lysCP1 e ATCC21831_?PargC::lysCP1 pelo método de pulso eléctrico, selecionados em meio contendo 25 mg/L de canamicina e as estirpes que ainda expressavam argF, argF2 e argF/argF2 foram, por último, construídas. As estirpes foram nomeadas
[0057] KCCM10741 P_?PargC::lysCP1_Pcj7-argF,
[0058] KCCM10741 P_?PargC::lysCP1_Pcj7-argF2,
[0059] KCCM10741 P_?PargC::lysCP1_Pcj7-argFPcj7-argF2,
[0060] ATCC21831_?PargC::lysCP1_Pcj7-argF,
[0061] ATCC21831_?PargC::lysCP1_Pcj7-argF2 e
[0062] ATCC21831_?PargC::lysCP1_Pcj7-argFPcj7-argF2,
[0063] e, entre elas, KCCM10741P_?PargC::lysCP1_Pcj7-argF2 for renomeada como CA06-2044, e foi depositada no ‘Korean Culture Center of Microorganisms’ (KCCM) sob o tratado de Budapeste a 9 de Dezembro de 2013, com o número de adesão KCCM11498P.
[0064] Exemplo 4: avaliação das estirpes construídas
[0065] Para se examinar o efeito do aumento do operão de arginina e de ornitina carbamoíl-transferase sobre a aptidão para produzir arginina utilizando Corynebacterium glutamicum KCCM10741P_?PargC::lysCP1, KCCM10741P_?PargC::lysCP1_Pcj7-argF, KCCM10741P_?PargC::lysCP1_Pcj7-argF2, KCCM10741P_?PargC::lysCP1_Pcj7-argF/Pcj7-argF2, ATCC21831_?PargC::lysCP1, ATCC21831_?PargC::lysCP1_Pcj7-argF, ATCC21831_?PargC::lysCP1_Pcj7-argF2 e ATCC21831_?PargC::lysCP1_Pcj7-argF/Pcj7-argF2, que são estirpes produtoras de arginina construídas no exemplo 3, estas foram desenvolvidas em cultura tal como a seguir apresentado. Em particular, Corynebacterium glutamicum KCCM10741P e ATCC21831, que são as estirpes originais, foram utilizadas como controlo, e um arco de platina para as estirpes foi inoculado, respectivamente, num frasco de 250 mL deflector nos cantos que contém 25 mL (6% de glicose, 3% de sulfato de amónio, 0,1% de fosfato de potássio, 0,2% de hepat-hidrato de sulfato de magnésio, 1,5% de extrato solúvel de milho (CSL), 1% de NaCl, 0,5% de extrato de levedura e 100 µg/L de biotina, pH 7,2) de um meio de produção, e manteve-se a incubar a 30°C a 200 r.p.m. durante 48 horas. Depois de se completar a cultura, mediu-se a quantidade de produção de L- arginina por HPLC e os resultados são apresentados no quadro 1 seguinte.
[0066] Quadro 1
[0067] Confirmação das aptidões de produção de arginina da estirpe original e das estirpes recombinantes
[0068] Tal como apresentado no quadro 1 anterior, as estirpes, em que os genes que codificam o operão de arginina e ornitina carbamoíl-transferase foram simultaneamente aumentados, apresentaram um máximo de aumento de 50% na aptidão de produção de arginina em comparação com o do controlo. Além disso, os aumentos na concentração em arginina e na concentração ornitina, apresentados no aumento do operão de arginina por si só (KCCM10741P_?PargC::lysCP1 e ATCC21831_?PargC::lysCP1), foram resolvidos pela introdução de argF, argF2 ou argF e argF2 e, eventualmente, mostram o resultado do aumento na concentração em arginina.
[0069] Com base no referido antes, um especialista na matéria à qual a presente invenção pertence será capaz de entender que a presente invenção pode ter outras variantes sob outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente invenção. Neste sentido, as variantes exemplificativas aqui descritas servem apenas propósitos ilustrativos e não deverão ser consideradas como limitativas do âmbito da presente invenção. Pelo contrário, a presente invenção pretende cobrir não só as variantes exemplificativas mas também várias alternativas, modificações, equivalentes e outros variantes que possam ser incluídas no espírito e âmbito da presente invenção, conforme definidos pelas reivindicações anexas.
Claims (2)
1. Microrganismo modificado do gênero Corynebacterium caracterizado porter a aptidão para produzir L-arginina, em que o microrganismo é modificado para aumentar as atividades de um operão de arginina e aumentar as atividades da ornitina-carbamoíl-transferase, em comparação com as atividades de cada um em uma cepa parental de Corynebacterium produtora de L-arginina, em que o operão da arginina é argCJBDFR, em que a atividade aumentada do operão de arginina é alcançada por um ou mais métodos selecionados do grupo que consiste em: i) aumentar o número de cópias de sequências de nucleotídeos que codificam as enzimas presentes no operão de arginina inserindo ainda um polinucleotídeo incluindo sequências de nucleotídeos que codificam as enzimas presentes no operão de arginina em um cromossomo ou introduzindo o polinucleotídeo em um sistema vetorial; e ii) substituição do promotor nativo do operão de arginina por um promotor forte; em que a atividade aumentada da ornitina-carbamoíl-transferase é alcançada por um ou mais métodos selecionados do grupo que consiste em: i) aumentar o número de cópias de uma sequência de nucleotídeos que codifica a ornitina-carbamoíl-transferase inserindo ainda um polinucleotídeo incluindo a sequência de nucleotídeos que codifica a ornitina-carbamoíl- transferase em um cromossomo ou introduzindo o polinucleotídeo em um sistema de vetor; e ii) substituição do promotor nativo da ornitina-carbamoíl-transferase por um promotor forte; em que o operão arginina compreende um repressor de arginina, em que o gene repressor da arginina é ArgR, em que a ornitina-carbamoíl-transferase consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, e em que o microrganismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium glutamicum.
2. Método para a produção de L-arginina, caracterizado por compreender os passos que consistem em: desenvolver em cultura o microrganismo do gênero Corynebacterium, conforme definido na reivindicação 1, em um meio de cultura; e recuperar a L-arginina a partir do microrganismo ou do meio.
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