BR112014018396B1

BR112014018396B1 - Imunógenos para vacinação contra hiv

Info

Publication number: BR112014018396B1
Application number: BR112014018396-1A
Authority: BR
Inventors: Christian Brander; Beatriz Mothe Pujadas; Anuska Llano
Original assignee: Fundació Privada Institut De Recerca De La Sida - Caixa; Esteve Pharmaceuticals, S.A
Priority date: 2012-01-27
Filing date: 2013-01-28
Publication date: 2023-03-21
Also published as: CN110372798A; CA2862172A1; MX2014009091A; US11325946B2; JP6749357B2; RU2014135053A; US20190055289A1; KR20190085552A; US20210246172A1; JP2015509707A; WO2013110818A3; US20150050310A1; RU2018104969A3; US9988425B2; AU2013213564A1; RU2721274C2; ZA201405204B; IN2014DN06164A; US20180170971A1; AU2018203264B2

Abstract

IMUNÓGENOS PARA VACINAÇÃO CONTRA HIV. A presente invenção refere-se a novos imunógenos baseados em peptídeos sobrepostos (OLPs), e peptídeos deles derivados, úteis para a prevenção e tratamento da AIDS e das doenças oportunistas relacionadas. A invenção refere-se também a ácidos nucleicos isolados, vetores e células hospedeiras que expressam estes imunógenos, bem como vacinas, que incluem os referidos imunógenos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a novos imunógenos baseados em peptídeos sobrepostos (OLPs) e peptídeos deles derivados. Refere-se também a ácidos nucleicos isolados que expressam estes imunógenos, assim como vetores e células que compreendem tais ácidos nucleicos. Os compostos da presente invenção são úteis como vacinas, em particular, para a prevenção e tratamento da AIDS e doenças oportunistas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A infecção pelo HIV induz respostas de células T de HLA de classe I restritas, fortes e praticamente dirigidas, para as quais, os epítopos específicos e alelos de HLA que restringem vem sendo implicados na relação de controle in vivo. Ver Brander C, et al., Current Opinion Immunol. 2006; 18:1-8. Embora a maior parte da resposta de CTL anti-viral pareça estar restrita de HLA-B, a contribuição relativa das regiões virais alvo e moléculas de HLA que restringem, sobre a eficácia destas respostas, permanece obscura. Ver Kiepiela P, et al., Nature 2004; 432:769-775 e Ngumbela K, et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 2008; 24:72-82.

[0003] Além disso, o papel que a sequência de diversidade de HIV desempenha na relevância in vivo de imunidade de células T específicas para o vírus não é clara, como limitações funcionais de variantes de escape, o uso de códon nas posições individuais de proteínas, plasticidade, avidez funcional e potencial reatividade cruzada do receptor de células T (TCR) podem contribuir para a eficácia geral de uma resposta específica das células T. Ver Brockman M, et al., J. Virol. 2007; 81: 12608-12618 e Yerly D, et al., J. Virol. 2008; 82:3147-3153. Há a observação de que as respostas das células T ao HIV Gag foram mais consistentemente associadas com cargas virais reduzidas em ambos, coortes infectado de HIV clados B e C. Ver Zuniga R, et al. , J. Virol. 2006; 80:3122-3125 e Kiepiela P, et al., Nat. Med. 2007; 13:46-53.

[0004] No entanto, nenhuma destas análises avaliou o papel de respostas às regiões mais curtas da(s) proteína (s) alvo(s) que pode induzir respostas particularmente eficazes. Além disso, não está claro se o benefício relativo de Gag é devido a qualquer outra característica específica da presente proteína, tal como os níveis de expressão, a composição em aminoácidos, e inerentemente, maior imunogenicidade. É, assim, possível que as subunidades de proteína exteriores à Gag e dentro desta, regiões curtas específicas ricas em epítopo poderiam ser identificadas por: i) induzir respostas predominantemente observadas em controladores de HIV e ii) que seriam detectáveis em indivíduos com diferentes tipos de HLA, não se limitando aos indivíduos que expressam alelos previamente associados ao controle viral eficaz.

[0005] Enquanto alguns dos estudos anteriores vem sendo, de fato, controlados por um potencial além da representação dos epítopos derivados de Gag apresentados em "bons" alelos HLA de classe I, persistem preocupações de que uma vacina contra o HIV baseada puramente em Gag, pode beneficiar principalmente, as pessoas com um genótipo HLA vantajoso e que não tire proveito de alvos potencialmente benéficos fora da Gag. Ver Kiepiela, 2007, supra e Honeyborne I, et al., J. Virol. 2007; 81:3667-3672. Além disso, estudos de escape de CTL e aptidões virais vem sendo amplamente limitados a epítopos derivados de Gag apresentados no contexto de alelos HLA relativamente protetores, tais como HLA-B57 e B27. Ver Schneidewind A, et al., J. Virol. 2007; 81:12382-12393 e Leslie A, et al., Nat. Med. 2004; 10:282- 289. A informação disponível pode, portanto, não fornecer informações relevantes para as sequências de imunógeno destinadas a proteger a maior parte da diversidade genética da população hospedeira humana.

[0006] Além disso, muitos estudos focaram apenas alvos imunodominantes, apesar de alguns estudos recentes na infecção por HIV e SIV terem demonstrando uma contribuição crucial das respostas subdominantes em controle viral in vivo, entre eles alvos localizados fora de Gag. Ver Frahm N, et al., Nat. Immunol. 2006; 7:173-178 e Friedrich T, et al., J. Virol. 2007; 81:3465-3476. Juntamente, a visão atual sobre o que pode constituir uma resposta imune celular protetora ao HIV é, assim, bastante provável que esteja direcionada a um foco nas respostas imunodominantes e nas respostas restritas pelos alelos HLA de classe I frequentes e alelos HLA associados à evolução da doença superior. Portanto, o desenvolvimento de vacinas contra o HIV é limitado, em parte, pela falta de imunógenos capazes de induzir uma resposta imune ampla. A presente invenção trata do projeto de tais imunógenos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo imunogênico com uma sequência de aminoácidos que compreende as SEQ ID NOs 1-16, ou variantes das referidas SEQ ID NO: 1-16, em que cada uma das referidas variantes possui um comprimento de pelo menos 8 aminoácidos, com a condição de que a referida sequência de aminoácidos não inclua quaisquer trechos de sequências derivados a partir do genoma do HIV, de um comprimento de 8 ou mais aminoácidos, diferentes de uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs 1-16, ou as suas variantes.

[0008] Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo imunogênico com uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOs 1-16, ou uma variante sua, em que a referida variante possui um comprimento de pelo menos 8 aminoácidos, com a condição de que: i) a referida sequência de aminoácidos não inclua quaisquer trechos de sequências derivados a partir do genoma do HIV, de um comprimento de 8 ou mais aminoácidos, diferentes de uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs 1-16; ou uma variante ou um fragmento seu; e ii) quando o imunógeno compreender apenas uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOs 1-16, em seguida, esta sequência não seja selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 3, 5, 6 e 16.

[0009] Em outros aspectos, a invenção refere-se a ácidos nucleicos que codificam para os imunógenos do primeiro aspecto e do segundo aspecto, e para os cassetes de expressão, vetores, vírus e as células que compreendem os referidos ácidos nucleicos.

[0010] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma vacina que compreende um polipeptídeo imunogênico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e um ou mais adjuvantes.

[0011] Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se com o polipeptídeo imunogênico, o ácido nucleico, o cassete de expressão, o vetor de expressão, o vírus ou a célula do terceiro aspecto, ou a composição de vacina para uso na medicina.

[0012] Em outro aspecto, a presente invenção relaciona-se com o polipeptídeo imunogênico, o ácido nucleico, o cassete de expressão, o vetor de expressão, o vírus ou a célula do terceiro aspecto, ou a composição de vacina para utilização na prevenção ou tratamento de uma infecção por HIV, ou uma doença associada a uma infecção por HIV.

[0013] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit que compreende o imunógeno do primeiro e / ou do segundo aspecto, o ácido nucleico, o cassete de expressão, o vetor de expressão, o vírus ou a célula do terceiro aspecto, ou a composição do quarto aspecto.

Depósito de Microrganismos

[0014] O plasmídeo DNA 298H GMCSF-HIVACAT foi depositado em 13 de janeiro de 2012, sob o número de acesso DSM 25555 em DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig, República Federal da Alemanha.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0015] Figura 1. Representação esquemática do gene incluído no plasmídeo de expressão. Pontos identificam os códons de parada e de início.

[0016] Figura 2. Respostas imunes celulares analisadas em esplenócitos unidos por análise de citometria de fluxo. Frequências de respostas interferon gama específicas totais de Gag, Pol, e Nef-Tat-Vif entre os grupos em (a) e distribuição das respostas CD4 e CD8 em (b) são mostradas.

[0017] Figura 3. Respostas para Gag, Pol, NTV e a sequência de imunógeno de células T HIVACAT medidas por ensaio ELISpot de interferon gama em esplenócitos murinos. Os camundongos individuais foram imunizados com os plasmídeos que codificam para o polipeptídeo completo de Gag, Pol e Nef-Tat-Vif. A contribuição das respostas que tem como alvo as regiões incluídas no imunógeno de célula T HIVACAT para a resposta específica Gag-Pol-NTV interferon gama total é mostrada.

[0018] Figura 4. Comparação da amplitude em (a) e magnitude em (b) das respostas de interferon gama que tem como alvo o imunógeno de células T HIVACAT em camundongos imunizados. Os indivíduos foram tratados tanto com plasmídeos que codificam as proteínas completas, como pela sequência de células T mínima.

[0019] Figura 5. Balanço de respostas interferon gama contra Gag, Pol, Nef ou Vif para camundongos imunizados com 20 mg de plasmídeos que codificam o polipeptídeo Gag, Pol, mais Nef-Tat-Vif completo, e o imunógeno de células T HIVACAT. A dominância de respostas específicas de Gag é mostrada no painel (a) para camundongos imunizados com proteínas completas, ao passo que um maior repertório de equilíbrio é visto no painel (b) para os ratos imunizados com o imunógeno de células T HIVACAT.

[0020] Figura 6. A ligação de anticorpos a p24, p37 e p55 detectada por Western blot utilizando extratos de células a partir de células HEK 293 transfectadas com 1 mg dos vetores de expressão de gag e gag-pol (mostrando p55 gag e as subunidades p24, p37 e p55 gag processadas) separados em 12% SDS-PAGE e sondagem das membranas com a) soros humanos de pacientes infectados pelo HIV, b) mistura de soros de camundongos imunizados com doses elevadas de imunógeno e c) mistura de soros de camundongos imunizados com doses baixas do imunógeno (todos a uma diluição de 1:100).

[0021] Figura 7. a) Títulos Endpoint de anticorpo de ligação Gag-p24 específico a partir de camundongos tratados. A determinação foi realizada por ELISA, a partir de amostras de soro misturadas diluídas em série de 4 vezes individuais, b) ELISA gag p55 desenvolvido internamente utilizando a proteína recombinante Gag HIV-1IIIB pr55 (Cat. No. 3276, NIH Reagent Program, Bethesda, MD, US). A determinação foi realizada em soros de camundongos individuais em uma diluição de 1:100.

[0022] Figura 8. a) Representação esquemática de imunizações de camundongos. Grupos de seis camundongos C57BL / 6 foram utilizados para comparar a imunogenicidade das diferentes combinações heterólogas (2xDNA principal vs 3xDNA principal seguido por IxMVA de impulso) usando 100 μg de pDNA-HIVACAT ou 10A6 pfu de MVA-HIVACAT por injeção intramuscular, b) Comparação da amplitude e magnitude das respostas IKNY direcionadas ao imunógeno de células T HIVACAT em camundongos imunizados individuais, c) Distribuição de respostas específicas de Gag, Pol, Nef e Vif em camundongos imunizados individuais, d) Distribuição entre as oito subunidades de proteína incluídas no imunógeno de célula T HIVACAT (Gag p17, Gag p24, Gag p2p7plp6, Pol-Protease, Pol-RT, Pol-integrase, Vif e Nef), em diferentes grupos de imunização é mostrada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0023] A invenção revela vários compostos imunogênicos eficazes para induzir uma resposta imune elevada contra o HIV em uma ampla gama de indivíduos. Em particular, as respostas de células T CD4+ e CD8+ específicas para o HIV para epítopos codificados de HIV chave, foram obtidos com estes compostos.

1. Definições de termos e expressões gerais

[0024] O termo "adjuvante", tal como aqui utilizado, refere-se a um agente que modifica o efeito imunológico de um imunógeno, embora tendo pouco ou nenhum efeito direto quando administrado por si só. É muitas vezes incluído em vacinas para reforçar a resposta imune do receptor a um antígeno fornecido, mantendo o material estranho injetado em um nível mínimo. Os adjuvantes são adicionados às vacinas para estimular a resposta do sistema imunitário ao antígeno alvo, mas não conferem imunidade em si próprios. Exemplos não limitantes de adjuvantes adequados incluem sais minerais, polinucleotídeos, poliargininas, ISCOMs, saponinas, monofosforil lipídeo A, imiquimod, inibidores CCR-5, toxinas, polifosfazenos, citocinas, proteínas imunoreguladoras, proteínas de fusão imunoestimulantes, moléculas co-estimulantes, e combinações dos mesmos. Os sais minerais incluem, mas não estão limitados a AIK(SO4)2. AlNa(SO4)2, AlNH(SO4)2, sílica, alúmen, Al(OH)3, Ca3(PO4)2, caulino, ou carbono. Polinucleotídeos imunoestimulantes úteis incluem, mas não estão limitados a oligonucleotídeos CpG, com ou sem complexos imunes estimulantes (ISCOMs), oligonucleidos CpG, com ou sem poliarginina, ácidos poli IC ou ácidos poli AU. Toxinas incluem a toxina da cólera. As saponinas incluem, mas não estão limitadas a QS21, QS17 ou QS7. Um exemplo de uma proteína de fusão imunoestimulante útil é a proteína de fusão de IL-2 com o fragmento Fc da imunoglobulina. Moléculas imunorreguladoras úteis incluem, mas não estão limitadas aos ligantes CD40L e CD1a. As citocinas úteis como adjuvantes incluem, mas não estão limitadas a IL-1, IL-2, IL-4, GMCSF, IL-12, IL-15, IGF-1, IFN-α, IFN-β, e interferon gama. Além disso, são exemplos de dipeptídeos muramila, N-acetil-muramil-L-treonil-D- isoglutamina (thr-DMP), N-acetil-nornuramil-L-alanil-D- isoglutamina (CGP 11687, também referido como nor-MDP), N- acetilmuramiul-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'2'- dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxfosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, também referido como MTP-PE ), RIBI (MPL + TDM + CWS) em uma emulsão de 2 % de esqualeno / Tween® 80, lipopolissacarídeos e seus diversos derivados, incluindo o lipídio A, adjuvante completo de Freund (FCA), adjuvante incompleto de Freund, Merck Adjuvant 65, polinucleotídeos (por exemplo, ácidos poli IC e poli AU), cera D de Mycobacterium tuberculosis, substâncias encontradas em Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, e membros do gênero Brucella, Titermax, Quil A, ALUN, derivados de lipídio A, derivados da toxina de cólera, derivados HSP, derivados LPS, matrizes de peptídeos sintéticos ou GMDP, Montanide ISA-51 e QS-21, oligonucleotídeo CpG, poli I:C e GMCSF. Ver Osol A., Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA, US, 1980, pp. 1324-1341), Hunter R, US 5,554,372, e Jager E, Knuth A, WO1997028816. As combinações de adjuvantes também podem ser usadas.

[0025] O termo "AIDS", tal como aqui utilizado, refere-se a fase sintomática da infecção pelo HIV, e inclui tanto a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (normalmente conhecida como AIDS) e "ARC", ou Complexo Relacionado à AIDS. Ver Adler M, et al., Brit. Med. J. 1987; 294: 11451147. As manifestações imunológicas e clínicas da AIDS são bem conhecidas na arte e incluem, por exemplo, infecções oportunistas e tipos de câncer resultantes de deficiência imune.

[0026] O termo "ligante de aminoácidos", tal como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de aminoácidos diferente da que aparece em uma posição particular na proteína natural, e é geralmente concebida para ser flexível ou interpor uma estrutura, tal como uma hélice α, entre duas porções de proteína. Um ligante é também referido como um espaçador. O ligante é tipicamente não- antigênico e pode ser essencialmente de qualquer comprimento (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais aminoácidos). O ligante pode também ser uma localização ou sequência em que os mecanismos de processamento do antígeno celular podem iniciar a degradação do polipeptídeo imunogênico, sem destruir potentes epítopos de célula T.

[0027] O termo "local de mutação de resistência antirretroviral", tal como aqui utilizado, refere-se a um local que, quando mudado, confere resistência a um agente antirretroviral. Esses locais podem ser identificados por bancos de dados de exploração conhecidos tal como o banco de dados Stanford University HIV Drug Resistance, onde, por exemplo, sequências e tratamentos de vírus com mutações específicas ou dados de sensibilidade aos medicamentos para os isolados com mutações selecionadas, podem ser recuperados. Os ensaios para testar a resistência ao fármaco de HIV são conhecidos na arte. Ver Dong J, US 20040106136 e Shafer R, Assay for Antiretroviral Resistance, HIV InSite Knowledge Base Chapter (http://hivinsite.ucsf.edu/InSite?page=kb-02-02-03, Janeiro de 2012). Locais de mutação de resistência antirretroviral em HIV já conhecidos são regularmente publicados pela Organização Mundial de Saúde ou pela International Society Antiviral-USA (por exemplo, Johnson V, et al, ISA-USA Topics Antiviral Med. 2011; 19(4): 153-164.

[0028] O termo "resposta imune celular", como aqui utilizado, descreve uma resposta imunitária contra o(s) antígeno (s) externo (s) que é mediada por células T e seus produtos de secreção.

[0029] O termo "sequência de centro da árvore" ou "COT", tal como aqui utilizado, refere-se a uma sequência a partir da qual a distância evolutiva média para cada ponta de um diagrama filogenético de sequências variantes relacionadas foi minimizada. Ver Nickle D, et al, Science 2003; 299, 1515-1517.

[0030] O termo "códon otimizado", como aqui utilizado, refere-se à alteração dos códons em moléculas de ácido nucleico, de modo a refletir o uso do códon típico do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo codificado pelo DNA, para melhorar a expressão. Uma infinidade de métodos e ferramentas de software para otimização de códon foram relatados anteriormente. Ver Narum D, et al., Infect. Immun. 2001; 69(12):7250-7253, Outchkourov N, et al., Protein Expr. Purif. 2002; 24(1):18-24, Feng L, et al., Biochemistry 2000; 39(50):15399-15409, e Humphreys D, et al., Protein Expr. Purif. 2000; 20(2):252-2.

[0031] O termo "compreende" ou "compreendem", tal como aqui utilizado, descreve também "consistindo de" de acordo com a prática da patente geralmente aceita.

[0032] A expressão "doença associada a uma infecção por HIV", tal como aqui utilizado, inclui um estado no qual o indivíduo tenha desenvolvido AIDS, mas também inclui um estado em que o indivíduo infectado com o HIV não mostrou qualquer sinal ou sintoma da doença. Assim, a vacina da referida invenção, quando administrada a um indivíduo que não apresenta sinais clínicos da infecção, pode ter uma atividade preventiva, uma vez que pode evitar o aparecimento da doença. As composições imunogênicas são capazes de impedir ou retardar a infecção e destruição das células T CD4+ saudáveis do referido indivíduo. Também se refere à prevenção e retardamento do aparecimento dos sintomas da doença de imunodeficiência adquirida, como a contagem extremamente baixa de células T CD4+ e repetidas infecções por patógenos oportunistas, tais como Mycobacteria spp., Pneumocystis carinii, e Pneumocystis cryptococcus. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a um aumento na contagem de células T CD4+ absolutas não infectadas (intervalo de 10-3520), um aumento da porcentagem de células T CD4+ sobre as células imunitárias circulantes totais (intervalo de 1-50 %), e / ou um aumento na contagem de células T CD4+ como uma porcentagem do número de células T CD4+ normais em um indivíduo não infectado (intervalo de 1-161 por cento).

[0033] Os termos "variante" ou "fragmento", como aqui utilizados, referem-se a um polipeptídeo derivado de qualquer uma das SEQ ID Nos 1-16 por deleção de um ou mais aminoácidos terminais, no terminal N ou no terminal C de uma SEQ ID NO individual. A variante ou fragmento, de preferência, possui um comprimento de pelo menos 8 aminoácidos ou até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60%, até 70%, até a 80%, até 90%, ou até 99% da respectiva SEQ ID NO.

[0034] O termo "genoma do HIV", tal como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de RNA de aproximadamente 8749 nucleotídeos de comprimento longo fechados pela cápside de HIV, e que codifica os genes gag, pol, env, tat, rev, vif, nef, vpr, vpu, vpx, e opcionalmente, tev. A sequência do genoma do HIV sustenta uma variabilidade elevada, por este motivo, o genoma do HIV referido na invenção não está limitado a qualquer sequência específica. As sequências preferidas são as dos tipos e subtipos de HIV aqui citados.

[0035] O termo "vírus da imunodeficiência humana" ou "HIV", tal como aqui utilizado, refere-se genericamente aos vírus da imunodeficiência humana e inclui HIV do tipo 1 ("HIV- 1"), HIV do tipo 2 ("HIV-2"), ou outros vírus do HIV incluindo, por exemplo, o HIV-1, HIV-2, HIV emergente e outros subtipos e variantes de HIV, tais como variantes geograficamente isoladas ou amplamente dispersas e o vírus da imunodeficiência símia ("SIV"). Por exemplo, uma sequência do gene ancestral viral pode ser determinada para os genes env e gag do HIV-1, tal como para subtipos de HIV- 1 A, B, C, D, E, F, G, H, J e K, e intersubtipos recombinantes como AG, AGI, e para os grupos M, N, O ou para o vírus HIV-2 ou subtipos de HIV-2, A ou B. HIV-1, HIV-2 e SIV incluem, mas não estão limitados às partículas de vírus extracelular e as formas dos vírus associadas com as respectivas células infectadas.

[0036] O termo "resposta imune humoral", tal como aqui utilizado, descreve uma resposta imunitária contra o(s) antígeno (s) externo (s) que é mediada por anticorpos produzidos por células B.

[0037] O termo "composição imunogênica", tal como aqui utilizado, refere-se a uma composição que desencadeia uma resposta imunitária que produz anticorpos ou respostas imunes mediadas por células contra um imunógeno específico.

[0038] O termo "polipeptídeo imunogênico" ou "imunógeno", tal como aqui utilizado, refere-se a um antígeno de polipeptídeo que é capaz de induzir uma resposta imune adaptativa (isto é, uma resposta imune humoral ou mediada por células), em caso de injeção sobre si mesmo ou com um adjuvante.

[0039] O termo "kit", conforme aqui utilizado, refere-se a uma combinação de artigos que facilitam um processo, método ou aplicação. Estes kits fornecem os materiais necessários para realizar a aplicação descrita na presente invenção.

[0040] O termo "operacionalmente ligado", tal como aqui utilizado, pretende significar que a sequência de nucleotídeos de interesse está ligada à(s) sequência(s) reguladora (s) de um modo que permite a expressão da sequência de nucleotídeo (por exemplo, em um sistema in vitro de transcrição / tradução ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na referida célula). Ver Auer H, Nature Biotechnol. 2006; 24: 41-43.

[0041] O termo "marcador de peptídeo" ou "marcador", como aqui se utiliza, refere-se a uma sequência de peptídeo ou aminoácido, que pode ser usada no isolamento ou purificação do referido imunógeno. Assim, o referido marcador é capaz de se ligar a um ou mais ligantes, por exemplo, um ou mais ligantes de uma matriz de afinidade, tais como um suporte de cromatografia ou grânulo com afinidade elevada. Exemplos ilustrativos, não limitativos, de marcadores úteis para isolamento ou purificação de uma proteína incluem Arg-tag, FLAG-tag, His-tag, ou Strep-tag; um epítopo capaz de ser reconhecido por um anticorpo, tal como c-myc-tag (reconhecido por um anticorpo anti-c-myc), SBP-tag, S-tag, peptídeo de ligação a calmodulina, domínio de ligação à celulose, domínio de ligação à quitina, glutationa S- transferase-tag, proteína de ligação a maltose, NusA, TrxA, DsbA ou Avi-tag; uma sequência de aminoácidos, tal como AHGHRP (SEQ ID NO: 96), PIHDHDHPHLVIHS (SEQ ID NO: 97), ou GMTCXXC (SEQ ID NO: 98); ou β-galactosidase. Ver Terpe K, et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003; 60:523-525.

[0042] Os termos "transportador farmaceuticamente aceitável", "diluente farmaceuticamente aceitável " ou "excipiente farmaceuticamente aceitável", ou "veículo farmaceuticamente aceitável", como aqui indiferentemente utilizados, referem-se a um material de encapsulação, sólido, semissólido ou líquido, não tóxico, de enchimento, diluente, ou auxiliar de formulação de qualquer tipo convencional. Um veículo farmaceuticamente aceitável é essencialmente não tóxico para os receptores, nas dosagens e concentrações utilizadas, e é compatível com outros ingredientes da formulação. Por exemplo, o transportador para uma formulação contendo polipeptídeos poderia não incluir normalmente agentes oxidantes e outros compostos conhecidos por serem prejudiciais aos polipeptídeos. Os veículos apropriados incluem, mas não estão limitados a água, dextrose, glicerol, solução salina, etanol, e suas combinações. Os veículos podem conter agentes adicionais, tais como agentes umectantes ou emulsionantes, agentes tamponantes do pH ou adjuvantes que aumentem a eficácia da formulação.

[0043] Os termos "prevenir", "prevenindo" e "prevenção", como aqui utilizados, referem-se à inibição da criação ou diminuição da ocorrência de uma doença em um animal. A prevenção pode ser completa (por exemplo, a ausência total de células patológicas em um indivíduo). A prevenção pode também ser parcial, de tal modo que, por exemplo, a ocorrência de células patológicas em um indivíduo seja inferior à que teria ocorrido sem a presente invenção. Prevenção também se refere à susceptibilidade reduzida a uma condição clínica.

[0044] O termo "peptídeo de sinal de secreção" refere-se a uma sequência de aminoácidos altamente hidrofóbica (por exemplo, de preferência de 15 a 60 aminoácidos de comprimento) de proteínas que deve atravessar membranas para chegar a sua localização celular de funcionamento. Ao ligar-se às partículas de reconhecimento de sinal, estas sequências dirigem complexos de proteína-ribossoma nascentes para uma membrana em que a proteína é inserida durante a tradução. Os peptídeos de sinal dirigem a captação de tradução da proteína por várias membranas (por exemplo, retículo endoplasmático, mitocôndria, cloroplasto, peroxissomo). As sequências de sinal líder em proteínas não membranares são finalmente removidas por peptidases específicas. Alguns peptídeos de sinal utilizados incluem MCP-3 de quimiocina, para promover a secreção e atração de células apresentadoras de antígenos; um peptídeo catenina derivado de catenina(CATE) para o aumento da degradação proteossomal; e a proteína associada lisossomal, LAMP1 para direcionar o compartimento MHC II. Ver Rosati M, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 2009; 106:15831-15836.

[0045] A expressão "administração sequencial", tal como aqui utilizada, significa que a administração não é simultânea, mas uma primeira administração é realizada, seguida por uma ou mais administrações sucessivas.

[0046] A expressão "conserva substancialmente as capacidades imunológicas do polipeptídeo imunogênico", tal como aqui utilizada, significa que a variante apresenta, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% da capacidade do polipeptídeo imunogênico de induzir uma resposta imune adaptativa (isto é, uma resposta imune humoral ou mediada por células), se injetado sobre si mesmo ou com adjuvantes.

[0047] O termo "tratar" ou "tratamento", tal como aqui utilizado, refere-se à administração de uma composição imunogênica da invenção ou de um medicamento contendo a referida composição, para controlar a progressão da doença, antes ou após os sinais clínicos terem aparecido. É compreendido, que o controle da progressão da doença significa os resultados clínicos benéficos ou desejados que incluem, mas não estão limitados à redução dos sintomas, redução da duração da doença, estabilização de estados patológicos (especificamente, para evitar a deterioração adicional), atraso da progressão da doença, melhoria do estado patológico e remissão (quer parcial ou total). O controle da progressão da doença envolve também uma extensão de sobrevivência, em comparação com a sobrevivência esperada se o tratamento não for aplicado.

[0048] O termo "vacina", como aqui utilizado, refere-se a uma substância ou composição que estabelece ou melhora a imunidade a uma doença particular, através da indução de uma resposta imune adaptativa, incluindo uma memória imunológica. Uma vacina geralmente contém um agente que se assemelha a um microrganismo causador de doença ou uma parte do mesmo (por exemplo, um polipeptídeo). As vacinas podem ser profiláticas ou terapêuticas.

[0049] O termo "variante", tal como aqui utilizado, refere- se a todas as sequências de aminoácidos derivadas a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs 1-16, por meio de modificações ou mutações, incluindo substituições, de preferência, substituições conservativas, inserções ou deleções não terminais, que afetam um ou mais aminoácidos e que conservam substancialmente as capacidades imunogênicas do polipeptídeo imunogênico.

[0050] O termo "vetor", como aqui utilizado, refere-se a uma molécula de ácido nucleico, linear ou circular, que compreende um segmento de acordo com o ácido nucleico de interesse, operacionalmente ligado a segmentos adicionais, que proporcionam a sua replicação autônoma em uma célula hospedeira de interesse de acordo com o cassete de expressão de interesse.

2. Polipeptídeos imunogênicos da presente invenção

[0051] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo imunogênico com uma sequência de aminoácidos que compreende as sequências das SEQ ID NOs 1-16 ou variantes das referidas SEQ ID NO :1-16, em que cada uma das referidas variantes possui um comprimento de pelo menos 8 aminoácidos, com a condição de que a referida sequência de aminoácidos não inclua quaisquer trechos de sequências derivadas a partir do genoma do HIV de um comprimento de 8 ou mais aminoácidos diferente de uma sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs 1-16, ou suas variantes.

[0052] Em uma modalidade particular, o polipeptídeo imunogênico do primeiro aspecto possui uma sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO: 49.

[0053] Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo imunogênico com uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs 1-16, ou uma variante sua, ou fragmento, em que o referido fragmento possui um comprimento de pelo menos 8 aminoácidos, com a condição de que: i) a referida sequência de aminoácidos não inclua quaisquer trechos de sequências derivados a partir do genoma do HIV, de um comprimento de 8 ou mais aminoácidos, diferentes de uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs 1-16, ou a sua variante ou fragmento; e ii) quando o imunógeno compreender apenas uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOs 1-16, em seguida, esta sequência não seja selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 3, 5, 6 e 16.

[0054] De preferência, a variante de acordo com o primeiro e segundo aspectos é equivalente à sua sequência relacionada e deriva de uma cepa de HIV diferente, ou é uma sequência de HIV artificial. Equivalente, neste sentido, significa diferente em um ou mais resíduos de aminoácidos, mas que corresponda à mesma sequência (por exemplo, determinada pela posição no genoma ou similaridade de sequência). Em outras palavras, em uma modalidade preferida, a variante é uma "variante de ocorrência natural", que refere-se às sequências de ácidos nucleicos derivadas de um genoma de um vírus HIV, de modo presente ou anteriormente circulante, e pode ser identificada a partir de bases de dados já existentes (por exemplo, bases de dados de sequência GenBank e Los Alamos). A sequência do vírus circulante também pode ser determinada por métodos de biologia molecular. Ver Brown T, “Gene Cloning” (Chapman & Hall, London, GB, 1995); Watson R, et al., “Recombinant DNA”, 2nd Ed. (Scientific American Books, New York, NY, US, 1992); Sambrook J, et al., “Molecular Cloning. A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, US, 1989). De preferência, uma variante de qualquer uma das SEQ ID NOs 1-16 possui uma identidade de sequência de amino ácido de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou, pelo menos, 99% ao seu correspondente (isto é, SEQ ID NOS 1-16). Exemplos de algoritmos apropriados para determinar a porcentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são algoritmos BLAST e BLAST 2.0. Ver Altschul S, et al., Nuc. Acids Res. 1977; 25:3389-3402 e Altschul S, et al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410. Os programas BLAST e BLAST 2.0 podem ser utilizados para determinar a porcentagem de identidade de sequência de ácidos nucleicos e de proteínas da invenção. Software para a realização de análises de BLAST está disponível ao público através do National Center for Biotechnology Information. Ver http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi, Janeiro de 2012.

[0055] As variantes também podem conter um ou mais resíduos de aminoácidos modificados (por exemplo, resíduos que são modificados por meio da ligação dos grupos de substituintes), ou um ou mais aminoácidos não naturais, tais como os aminoácidos beta.

[0056] Os métodos para determinar a extensão da resposta celular são conhecidos na arte. Qualquer método adequado para avaliar a estimulação de células T em resposta a um Ag pode ser usado. Os procedimentos descritos abaixo proporcionam alguns exemplos de métodos adequados: 1) Ensaio imunoabsorvente ligado à enzima(ELISpot): as células não aderentes dos poços de pré-cultura são transferidas para uma placa, que foi revestida com os anticorpos de captura anti-citocina desejados (Abs; por exemplo, anti-IFN, IL-10, -IL-2, IL-4). A revelação é efetuada com Abs secundário biotinilado e os métodos de detecção colorimétricos ou fluorimétricos padrão, tais como Streptavidina-Fosfatase Alcalina e NBT-BCIP, e as colorações contadas. Leituras ELISpot são, então, expressas como células formadoras de “spots” (SFC) / 106 células de entrada; 2) Ensaio de citocina do sobrenadante: citocinas libertadas no sobrenadante de cultura são medidas por diversas técnicas, tais como ensaios imunoenzimáticos (ELISA), matriz do grânulo de citometria BD, ensaio Biorad Bio-Plex, e outros; 3) Tetrâmeros HLA Classe I: com este procedimento, as células T reativas a Ag que reconhecem epítopos peptídicos específicos são detectadas, utilizando reagentes comercialmente disponíveis (por exemplo, MHC Classe I Dexamers, Immudex, Copenhagen, DK) ou os gerados internamente (por exemplo, Novak. E, et al., J. Clin Invest. 1999; 104:R63-R67); 4) tetrâmeros HLA Classe II: com este procedimento, as células T reativas à Ag que reconhecem epítopos peptídicos específicos são detectadas, utilizando reagentes comercialmente disponíveis (por exemplo, MHC Classe II Ultimers™, ProImmune Ltd., Oxford, GB) ou os gerados internamente(por exemplo, Novak, 1991, supra); 5) A supra regulação de marcadores de ativação (por exemplo, CD69, CD25, CD137): com este procedimento, as respostas de células T específicas de Ag são detectadas pela sua expressão diferencial de marcadores de ativação expostos na membrana seguinte ao reconhecimento de Ag; 6) Ensaios de captura de citocinas: Este sistema é uma alternativa válida para o ELISpot para visualizar as células T específicas de Ag de acordo com sua resposta de citocinas (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, DE). Além disso, ele permite a ordenação direta e clonagem das células T de interesse; 7) Ensaio CD154: Este processo é limitado à detecção de células T CD4+ Ag-específicas. Ver Chattopadhyay P, et al., Nat. Med. 2005; 11:1113-11117 e Frentsch M, et al., Nat. Med. 2005; 11:1118-1124; 8) Ensaio CD107: este procedimento permite a visualização de células T CD8+ específicas de Ag com potencial citotóxico. Ver Betts M, et al., J. Immunol. Methods 2003; 281:65-78; 9) Ensaio de diluição CFSE: este processo detecta as células T específicas de Ag (CD4+ e CD8+) de acordo com a sua proliferação após o reconhecimento de Ag. Ver Mannering S, et al., J. Immunol. Methods 2003; 283:173-183.

[0057] Os métodos para determinar a extensão da resposta humoral de uma variante são conhecidos na arte. Qualquer método adequado para avaliar a estimulação de células T em resposta a um Ag pode ser utilizado. Exemplos de métodos adequados incluem, mas não estão limitados à detecção ou quantificação da quantidade relativa de um anticorpo, que reconhece especificamente um agente antigênico ou imunogênico no soro de um indivíduo que tenha sido tratado com um polipeptídeo imunogênico ou variante em relação à quantidade do anticorpo em um indivíduo não tratado. Os títulos de anticorpos podem ser determinados utilizando ensaios convencionais, tais como ensaio imunoenzimático (ELISA), ensaio de Imunodifusão radial único(SRID) ou imunoensaio enzimático (ETA).

[0058] Em uma modalidade preferida, a variante de qualquer uma das SEQ ID NOs 1-16 é um fragmento da(s) referida(s) sequência(s).

[0059] Em modalidades específicas, as sequências virais ancestrais são determinadas para os genes env de HIV-1 subtipos B ou C, ou para os genes gag dos subtipos B e C. Em outras modalidades, a sequência viral ancestral é determinada de outros genes ou polipeptídeos de HIV, tais como pol ou os genes ou polipeptídeos auxiliares. Em ainda outra modalidade, a sequência viral é determinada por técnicas de consenso ou de centro da árvore.

[0060] Em uma modalidade preferida, o HIV é um grupo M do HIV. O grupo M é o grupo do HIV-1 predominante circulante, e foi dividido em subtipos, denotado com letras, e sub- subtipos, denotados com algarismos. Subtipos A1, A2, A3, A4, B, C, D, E, F1, F2, G, H, J, e K são atualmente reconhecidos. Subtipos HIV-1, também chamados clados, são cepas filogeneticamente ligadas de HIV-1, que são aproximadamente da mesma distância genética uma da outra; em alguns casos, subtipos estão também ligados geograficamente ou epidemiologicamente. A variação genética dentro de um subtipo pode ser de 15 a 20 por cento ou mais, enquanto que a variação entre os subtipos divergentes ou membros do mesmo subtipo é geralmente de 25 a 35 por cento. Avanços em sequenciamento do genoma total do HIV levaram à identificação das formas recombinantes circulantes e únicas (CRFs e URFs, respectivamente). Estas são os resultados de recombinação entre os subtipos dentro de uma pessoa duplamente infectada, a partir da qual as formas recombinantes são então passadas para outras pessoas. As progênies recombinantes são classificadas como formas recombinantes circulantes se forem identificadas em três ou mais pessoas sem ligação epidemiológica direta, caso contrário, são descritas como formas recombinantes únicas.

[0061] Em uma modalidade, o referido imunógeno possui uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs 1-16, ou variantes das mesmas, em que a referida condição ii) é a seguinte: quando o imunógeno compreender apenas uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs 1-16, em seguida, esta sequência não é selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs 1-16.

[0062] Em uma modalidade preferida, o referido imunógeno compreende pelo menos dois, pelo menos três, ou pelo menos quatro sequências selecionadas a partir do grupo que consiste nas ID SEQ NOs 1-16 ou as suas variantes, em que a referida condição ii) é a seguinte: quando o imunógeno compreender somente dois, três ou quatro sequências selecionadas a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs 1-16, em seguida, nem todas estas sequências são selecionadas a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 3, 5, 6 e 16. Em outra modalidade, o referido imunógeno tem uma sequência de aminoácidos que compreende, pelo menos, dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez sequências selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs 1-16, ou as suas variantes, em que a referida condição ii) é a seguinte: quando o imunógeno é constituído por apenas duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez sequências selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs 1-16, em seguida, nem todas estas sequências são selecionadas a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs 1-16.

[0063] Em uma modalidade preferida, o imunógeno de acordo com o primeiro aspecto compreende as sequências de acordo com as SEQ ID NOs 1-16, ou as suas variantes na ordem de 116.

[0064] Em uma modalidade, a invenção relaciona-se com o imunógeno do primeiro aspecto, em que pelo menos duas sequências estão ligadas por um ligante de aminoácidos.

[0065] Em uma outra modalidade, a invenção relaciona-se com o imunógeno do segundo aspecto, em que, se o referido imunógeno compreender pelo menos duas sequências selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs 1-16, ou suas variantes, as referidas sequências são ligadas por um aminoácido ligante.

[0066] Em uma modalidade preferida dos imunógenos do primeiro e segundo aspectos, o ligante possui a sequência de aminoácidos A, AA ou AAA. Em uma outra modalidade, quando o resíduo do terminal C da sequência localizada no terminal N em relação ao ligante, ou o resíduo terminal N da sequência localizada no terminal C for um resíduo de alanina, o ligante pode ser encurtado de modo que uma sequência AAA é formada na região de junção entre as sequências adjacentes. Assim, em uma modalidade preferida, se o resíduo terminal C da sequência localizada no terminal N em relação ao ligante for uma alanina, ou se o resíduo terminal N da sequência localizada no terminal C em relação ao ligante for alanina, o ligante tem a sequência AA. Em uma outra modalidade, se o resíduo terminal C da sequência localizada no terminal N em relação ao ligante, e o resíduo terminal N da sequência localizada no terminal C em relação ao ligante forem ambos alanina, em seguida, o ligante é a sequência A.

[0067] Em uma outra modalidade, os referidos imunógenos ainda compreendem um peptídeo de sinal de secreção no terminal N, em que o referido peptídeo de sinal, de preferência, aumenta a secreção do imunógeno a partir de células que expressam o referido imunógeno. Um peptídeo de sinal de secreção preferido é derivado de GMCSF (fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos), de preferência, seguido por uma valina para aumentar a estabilidade. A sequência do peptídeo de sinal de GMCSF é, de preferência: MWLQSLLLLGTVACSIS (SEQ ID NO: 46) ou MWLQSLLLLGTVACSISV (SEQ ID NO: 47).

[0068] Em uma outra modalidade, os referidos imunógenos ainda compreendem opcionalmente um marcador de peptídeo. O marcador de peptídeo pode estar localizado na extremidade terminal N entre o peptídeo de sinal e o polipeptídeo imunogênico ou, de preferência, pode estar localizado no terminal C antes do códon de parada.

[0069] Preferencialmente, o referido marcador é um peptídeo FLAG. O sistema FLAG utiliza um peptídeo de 8 aminoácidos hidrofílico curto, que é fundido com a proteína recombinante de interesse. O peptídeo FLAG inclui o local de ligação para vários anticorpos monoclonais altamente específicos anti-FLAG (M1, M2, M5, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, US), que podem ser utilizados para avaliar a expressão da proteína de interesse no material a partir de células transfectadas. Devido à pequena dimensão do marcador de peptídeo FLAG, este não protege outros epítopos, domínios, ou alteram a função, secreção, ou transporte da proteína de fusão, de modo geral. De preferência, o referido peptídeo FLAG possui a sequência DYKDDDDKL (SEQ ID NO: 48).

[0070] Em uma modalidade preferida, o referido marcador é apenas para análise de expressão e purificação do imunógeno e é removido antes da utilização para induzir uma resposta imune.

[0071] Em uma outra modalidade, a invenção refere-se ao referido imunógeno, em que a referida sequência de aminoácidos compreende pelo menos um local de mutação de resistência antirretroviral.

[0072] A mutação pode ocorrer em qualquer local dentro do genoma viral. De preferência, a mutação ocorre na região que codifica para a integrase, a protease ou os genes da transcriptase reversa.

[0073] Mutantes no âmbito da integrase que conferem resistência aos inibidores da mesma incluem, sem limitação, T66, E92, F121, E138, G140, Y143, S147, Q148, S153, N155, E157 e R263 na SEQ ID NO: 1 e uma combinação destes. Em uma modalidade preferida, a mutação é selecionada a partir do grupo que consiste de mutações E92Q, G 140S, G 140A e Y143R na proteína integrasse, e suas combinações.

[0074] Mutantes no âmbito da protease associada com uma resistência do inibidor de protease (PI) incluem protease principal e protease complementar, de mutações no local de clivagem de protease. Ver Shafer R, et al., AIDS Rev. 2008; 10(2):67-84. Dezessete posições não-polimórficas amplamente são as de significado mais clínico, incluindo L231, L241, D30N, V321, L33F, M461/L, 147/V/A, G48V/M, 150L/V, F53L, 154V/T/A/L/M, G73S/T, L76V, V82A/T/F/S, 184V/A/C, N88D/S, L90M. Mutações da protease complementar incluem as mutações polimórficas L101/V, 113V, K20R/M/I, M36I, D60E, I62V, L63P, A71V/T, V77I, e 193L, e as mutações não- polimórficas L10F/R, V111, E34Q, E35G, K43T, K45I, K55R, Q58E, A71I/L, T74P/A/S, V751, N83D, P79A/S, 185V, L89V, T91 S, Q92K e C95F.

[0075] Em uma outra modalidade, o local da mutação de resistência antirretroviral está localizado na transcriptase reversa, resultando em uma resistência aos inibidores da transcriptase reversa de nucleosídeos (NRTI) ou um inibidor da transcriptase reversa sem nucleosídeo (NNRTI). As mutações de resistência aos NRTIs incluem M184V, mutações análogas da timidina (TAMs), mutações selecionadas por regimes com falta de análogos da timidina (Non-TAMs), e mutações de resistência de multi-nucleosídeos (mutações Multi-NRTIs) e muitas mutações complementares não-polimórficas recentemente descritas. De modo geral, M184V, mutações associadas à falta de análogos da timidina como K65R e L74V, e a mutação de resistência multi- nucleosídeo Q151M agem através da diminuição da incorporação de NRTI. Mutações análogas de timidina, inserções T69 associadas à resistência multi-nucleosídeo, e muitas das mutações complementares facilitam o desbloqueio do primer. Ver Shafer, 20008, supra. M184V é a mutação de resistência ao NRTI que ocorre de modo mais comum. As mutações de aminoácidos resistentes aos medicamentos mais comuns são M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F e K219QE. As mutações mais comuns em pacientes que desenvolveram falência virológica ao receber um análogo não-timidina contendo suporte principal de NRTI (Non-TAMs) incluem M184V sozinho ou M184V em combinação com K65R ou L74V. Outras mutações Non-TAMs incluem K65N, K70E/G, L741, V75T/M, Y115F. As inserções de aminoácidos no códon 69 ocorrem, em geral, na presença de múltiplos TAM, e nesta definição estão associados à resistência intermediária ao 3TC e FTC e alto nível de resistência a cada um dos NRTI restantes. Q151 M é uma mutação 2-pb (CAG.fwdarw.ATG) que é geralmente acompanhada por duas ou mais das seguintes mutações: A62V, V751, F77L, e F116Y. O complexo Q151M provoca resistência de alto nível para ZDV, d4T, ddI, e ABC; e resistência intermediária à TDF, 3TC e FTC. Ver Shafer R, et al., AIDS Rev. 2008; 10(2):67-84

[0076] Mutações de resistência aos NNTRI incluem, sem limitação, as mutações de resistência principais aos NNRTI (K103N/S, V106A/M, Y181C/I/V, Y188L/C/H, e G190A/S/E), as mutações secundárias de resistência aos NNRTI (L1001, K101P, P225H, F227L, M230L, e K238T) e mutações (V179F, F227C e L2341).

[0077] Mutações não-polimórficas menores - A98G, K101 E, V 1081, e 179D/ E são mutações de resistência aos NNRTI comuns que reduzem a suscetibilidade a nevirapina e efavirenz em cerca de 2 vezes a 5 vezes.

[0078] Mutações de resistência ao inibidor da transcriptase reversa não-nucleosídeos misturadas, tais como K101Q, 1135T / M, V1791, e L2831 reduzem a susceptibilidade à nevirapina e efavirenz por cerca de duas vezes e podem agir sinergicamente com mutações primárias de resistência aos NNRTI. Outras mutações tais como L74V, H221Y, K223E / Q, L228H/R, e N3481 são selecionadas principalmente por NRTI, mas também provocam reduções sutis em suscetibilidade ao NNRTI.

[0079] De preferência, o referido local de mutação de resistência antirretroviral é localizado em qualquer uma das SEQ ID Nos 9-11. Mais de preferência, o referido local de mutação de resistência antirretroviral é o resíduo de aminoácido 8 da SEQ ID NO: 9, em que o aminoácido Leu é substituído pelo aminoácido Met.

[0080] Em uma outra modalidade, a variante ou fragmento possui um comprimento de 8 a 40 aminoácidos, mais de preferência, um comprimento de 11 a 27 aminoácidos. De preferência, a referida variante ou fragmento não compreende um ligante de aminoácidos contíguo de qualquer uma das SEQ ID Nos 1-16. Além disso, prefere-se que o aminoácido do terminal C da referida variante ou fragmento não seja G, P, E, D, Q, N, T, S, ou C, uma vez que estes resíduos não formam uma ancoragem do terminal C para os epítopos de células T de HLA classe I restritos, geralmente.

[0081] Em uma modalidade mais preferida, a referida variante, ou fragmento é selecionado a partir do grupo que consiste em peptídeos de acordo com as SEQ ID NO 17-45.

[0082] Além disso, prevê-se que a referida variante ou fragmento é combinado com, ou fundido, com uma proteína de choque térmico. A presente invenção também diz respeito a uma proteína de fusão que compreende a referida variante ou fragmento e uma proteína de choque térmico. Proteínas de choque térmico hsp10 preferidas são, HSP20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96, ou Hsp100.

[0083] Em uma outra modalidade, a variante, ou fragmento é um fragmento ou variante de acordo com o primeiro e segundo aspectos. De preferência, a referida variante ou fragmento não compreende um ligante de aminoácidos contíguo de qualquer uma das SEQ ID Nos 1-16. Além disso, prefere-se que o aminoácido do terminal C da referida variante ou fragmento não seja G, P, E, D, Q, N, T, S, ou C, uma vez que estes resíduos não formam uma ancoragem do terminal C para epítopos de células T HLA classe I restritos, em geral.

[0084] Em uma modalidade mais preferida, a referida variante ou fragmento é selecionado a partir do grupo que consiste em peptídeos de acordo com as SEQ ID NO 17-45.

[0085] Além disso, prevê-se que a referida variante ou fragmento é combinado com, ou fundido, com uma proteína de choque térmico. A presente invenção também diz respeito a uma proteína de fusão que compreende a referida variante ou fragmento e uma proteína de choque térmico. Proteínas de choque térmico preferidas são Hsp10, HSP20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96, ou Hsp100.

3. Ácidos nucleicos, vetores, vírus e células da invenção

[0086] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere- se a um ácido nucleico que codifica para o imunógeno do primeiro aspecto, e um cassete de expressão, um vetor, um vírus e uma célula, que compreende o referido ácido nucleico.

[0087] De preferência, o referido ácido nucleico é um polinucleotídeo que refere-se a polímeros de cadeia simples ou de cadeia dupla de monômeros de nucleotídeos (ácidos nucleicos), incluindo, mas não limitados a, 2'- desoxirribonucleotídeos (DNA) e ribonucleotídeos (RNA) ligados por ligações entre fosfodiéster e internucleotídeos. Os polinucleotídeos da invenção codificam o imunógeno da invenção, sem compreender substancialmente regiões adicionais do genoma do HIV.

[0088] Em uma modalidade, o referido ácido nucleico é otimizado por códon. Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico é otimizado por códon para a expressão em humanos. Ácidos nucleicos otimizados por códon para o uso de acordo com a presente invenção podem ser preparados por substituição dos códons do ácido nucleico que codifica o imunógeno por códons "humanizados" (isto é, os códons são aqueles que aparecem frequentemente em genes humanos altamente expressos). Ver André S, et al., J. Virol. 1998; 72:1497-1503. Em uma modalidade preferida, o referido ácido nucleico otimizado por códon tem a sequência de acordo com SEQ ID NO: 50.

[0089] O ácido nucleico do terceiro aspecto pode exigir o corte com enzimas de restrição de modo que se ligue a um vetor. Este procedimento pode implicar a remoção de vários nucleotídeos terminais (por exemplo, 1, 2, ou 3). Como tal, em uma modalidade, a invenção relaciona-se com o referido ácido nucleico, que foi cortado em cada extremidade com uma enzima de restrição.

[0090] Em uma outra modalidade, a presente invenção refere- se a um cassete de expressão que compreende o ácido nucleico do terceiro aspecto, uma sequência promotora e uma 3'-UTR e, opcionalmente, um marcador de seleção. De preferência, a sequência do promotor é um promotor de citomegalovírus humano (CMV), ou uma sequência de promotor precoce-tardio P7.5. De preferência, a 3'-UTR é um hormônio de crescimento bovino (BGH) poli-A. O marcador de seleção opcional é um gene de resistência a antibióticos (por exemplo, canamicina, ampicilina, tetraciclina, espectinomicina), de preferência.

[0091] Em ainda outra modalidade, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão que compreende o ácido nucleico ou o cassete de expressão do terceiro aspecto.

[0092] Em uma modalidade, o vetor é um vetor de expressão. Assim, os vetores adequados, de acordo com a presente invenção incluem os vetores procarióticos, tais como pUC18, pUC19, e plasmídeos Bluescript, e seus derivados, como os plasmídeos mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl e RP4; vetores de fagos e “shuttle”, vetores tais como pAT28 e pSA3; vetores de expressão em leveduras, como por exemplo vetores tipo plasmídeo 2micron; plasmídeos de integração; vetores YEP; plasmídeos centroméricos e análogos; vetores de expressão em células de insetos, tais como os vetores da série pAC e da série pVL; vetores de expressão em plantas, tais como vetores das séries pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE, e análogos; e vetores de expressão em células eucarióticas superiores, com base em vetores virais (por exemplo, MVA, adenovírus, vírus associados a adenovírus, retrovírus e lentivírus), assim como vetores não virais, tais como os vetores pSilencer 4.1-CMV (Ambion®, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, US), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL e pKSV-10, pBPV-1, pML2d e pTDTl.

[0093] Em uma modalidade particular, o vetor de expressão é um vetor de expressão de mamífero, que compreende um promotor de mamífero e um local de poliadenilação. De preferência, o promotor é o promotor do citomegalovírus humano (CMV). De preferência, o local de poliadenilação é o local de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH). O vetor de expressão de mamífero pode ser modificado para otimizar a replicação do vetor em bactérias. O vetor de expressão de mamífero pode compreender adicionalmente um gene de seleção, por exemplo, um gene que codifica uma proteína que confere resistência a um antibiótico. Em uma modalidade particular, o vetor de expressão de mamífero compreende um gene de resistência à canamicina.

[0094] Em outra modalidade particular, o vetor de expressão é um vetor viral, de preferência, um vetor do vírus vaccinia Ankara modificado (MVA).

[0095] Em uma outra modalidade, a presente invenção refere- se a um vírus que contém o ácido nucleico do terceiro aspecto. Vírus adequados são seguros, possuem baixa toxicidade e são geneticamente estáveis. Exemplos não limitativos são os retrovírus, em particular poxvírus tais como MVA, lentivírus, adenovírus e vírus adeno-associados (AAVs).

[0096] Em uma outra modalidade preferida particular, a presente invenção relaciona-se a um vírus vaccinia Ankara modificado recombinante (MVA), que compreende um polinucleotídeo ou construto de gene que codifica os polipeptídeos imunogênicos da presente invenção. O vírus vaccinia Ankara modificado (MVA) está relacionado ao vírus vaccinia, um membro do gênero Orthopoxvirus na família de Poxviridae. MVA foi gerado por 516 passagens seriais sobre fibroblastos de embrião de galinha da cepa Ankara do vírus vaccínia (CVA). Ver Mayr A, et al., Infection 1975; 3:6-14 e Sutter G, et al., US 6,440,422 e CH 568,392. Vírus MVA estão disponíveis ao público (por exemplo, número de acesso ATCC VR-1508). MVA se distingue pela sua atenuação (por exemplo virulência diminuída e limitada capacidade de reproduzir vírions infecciosos em certas células de mamíferos), mantendo uma boa imunogenicidade e plena capacidade de se replicar e produzir vírions infecciosos em células aviárias. Cepas de MVA adequadas incluem cepas com maior segurança, devido a i) capacidade de replicação reprodutiva in vitro em fibroblastos de embrião de galinha (CEF), mas sem capacidade de replicação reprodutiva na linhagem celular humana, como na linhagem celular de queratinócitos humanos HaCaT, a linhagem celular de rim de embrião humano 293, a linhagem celular de osteossarcoma ósseo humano 143B, e a linhagem celular de adenocarcinoma do colo do útero humano HeLa; ii) falha em replicar-se em um modelo de camundongo que seja incapaz de produzir células B e T maduras e, como tal, é gravemente imunocomprometido e altamente susceptível a um vírus de replicação; e iii) indução de, pelo menos, o mesmo nível de resposta imune específica em impulsionar regimes de impulso / principal do vírus vaccinia quando comparado a regimes de impulso do vírus vaccinia / principal de DNA. Uma cepa de MVA atenuada adequada na cepa referida como MVA-BN. Ver Chaplin P, et al., WO2002042480, ECACC número de acesso V00083008.

[0097] Em uma outra modalidade, a presente invenção refere- se a uma célula que compreende o ácido nucleico, o cassete de expressão, o vetor de expressão, ou o vírus do terceiro aspecto. As células a serem utilizadas podem ser de qualquer tipo de célula, incluindo ambas, as células eucarióticas e células procarióticas. De preferência, as células incluem células procariotas, células de leveduras, ou células de mamíferos. Os exemplos preferidos de células de mamíferos são as células COS, células HeLa, células HEK 293T, ou células isoladas a partir de um paciente (por exemplo, um paciente com HIV).

4. Composições da invenção

[0098] Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende uma variante ou fragmento de acordo com o primeiro e segundo aspectos, e uma proteína de choque térmico. As composições imunogênicas podem ser preparadas, por exemplo, na forma de injetáveis, como soluções líquidas, suspensões e emulsões. As proteínas de choque térmico preferidas são HsplO, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96, ou Hsp100.

[0099] Além disso, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um imunógeno, ácido nucleico, cassete de expressão, vetor ou célula de acordo com a invenção, ou uma composição de acordo com o quarto aspecto e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, as referidas composições farmacêuticas e a composição do quarto aspecto podem ser usadas como uma vacina, tal como estabelecido abaixo.

5. Vacina da invenção

[0100] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma vacina que compreende o imunógeno do primeiro e segundo aspectos, o ácido nucleico, o cassete de expressão, o vetor de expressão, o vírus ou a célula do terceiro aspecto, ou a composição do quarto aspecto.

[0101] Em uma modalidade preferida, a referida vacina é capaz de gerar as respostas celulares e humorais. Mais de preferência, a vacina gera uma resposta das células T citotóxicas. Um ensaio de célula T citotóxica ou de linfócitos T citotóxicos (CTL) pode ser utilizado para monitorar a resposta imune celular seguinte à imunização subgenômica com uma sequência viral contra as cepas de HIV homólogas e heterólogas. Ver Burke S, et al., J. Inf. Dis. 1994; 170:1110-1119 e Tigges M, et al., J. Immunol, 1996; 156:3901-3910. Os ensaios convencionais utilizados para detectar respostas de células T incluem, por exemplo, os ensaios de proliferação, os ensaios de secreção de linfocina, ensaios de citotoxicidade direta e ensaios de diluição limitante. Por exemplo, células apresentadoras de antígenos que foram incubadas com um peptídeo podem ser testadas quanto à sua capacidade para induzir respostas de CTL, em populações de células que respondem. As células apresentadoras de antígenos podem ser células tais como as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou células dendríticas (DCs). Alternativamente, as linhagens celulares de mamíferos não-humanos mutantes, que são deficientes na sua capacidade para carregar as moléculas MHC de classe I com peptídeos processados internamente e que foram transfectadas com o gene humano MHC de classe I, podem ser utilizadas para testar a capacidade de um peptídeo de interesse para induzir respostas in vitro de CTL primárias. PBMCs podem ser usadas como fonte de células de resposta de precursores de CTL. As células que apresentam antígeno adequadas são incubadas com o peptídeo, após o qual as células apresentadoras de antígeno carregadas com proteína são incubadas com a população de células com resposta sob condições de cultura otimizadas. A ativação positiva de CTL pode ser determinada por ensaio da cultura para a presença de CTL, que mata as células alvo marcadas radioativamente, ambos os alvos pulsados com peptídeos específicos, bem como células alvo que expressam formas do antígeno processadas de forma endógena a partir das quais a sequência peptídica foi derivada. Por exemplo, as células alvo podem ser radiomarcadas com 51Cr, e a atividade citotóxica pode ser calculada a partir de radioatividade liberada das células alvo. Outro método adequado permite a quantificação direta de células T específicas de antígeno por coloração com complexos tetraméricos HLA marcados com fluoresceína. Ver Altman J, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:10330-10334 e Altman J, et al., Science 1996; 274:94-96. Outros desenvolvimentos técnicos relativamente recentes incluem coloração para linfocinas intracelulares e ensaios de liberação de interferon ou ensaios ELISpot.

[0102] Em uma modalidade, a vacina do quarto aspecto compreende ainda um ou mais adjuvantes ou proteínas de choque térmico.

[0103] Os adjuvantes são definidos como acima. As proteínas de choque térmico preferidas são Hsp10, proteína Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96, ou Hsp100.

6. Métodos terapêuticos

[0104] Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo imunogênico de acordo com a invenção, o ácido nucleico da invenção, o cassete de expressão da invenção, o vetor de expressão da invenção, o vírus da invenção, a célula da invenção, ou a vacina de acordo com a invenção pode ser utilizada para prevenção ou tratamento de uma infecção por HIV ou de uma doença associada com uma infecção por HIV.

[0105] Assim, em um outro aspecto, a invenção relaciona-se ao polipeptídeo imunogênico de acordo com a invenção, o ácido nucleico da invenção, o cassete de expressão da invenção, o vetor de expressão da invenção, o vírus da invenção, a célula da invenção, ou a vacina de acordo com a invenção, para utilização na prevenção ou tratamento de uma infecção por HIV ou de uma doença associada com uma infecção por HIV.

[0106] Em outro aspecto, a invenção refere-se à utilização do polipeptídeo imunogênico de acordo com a invenção, o ácido nucleico da invenção, o cassete de expressão da invenção, o vetor de expressão da invenção, o vírus da invenção, a célula da invenção, ou a vacina de acordo com a invenção, para a fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma infecção por HIV ou uma doença associada com uma infecção por HIV.

[0107] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para a prevenção ou tratamento de uma infecção por HIV ou de uma doença associada com um HIV em um indivíduo com essa necessidade, que compreende a administração ao referido indivíduo do polipeptídeo imunogênico de acordo com a invenção, o ácido nucleico da invenção, o cassete de expressão da invenção, o vetor de expressão da invenção, o vírus da presente invenção, a célula da invenção ou a vacina de acordo com a invenção, para a fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma infecção por HIV ou uma doença associada a uma infecção por HIV.

[0108] Em uma modalidade particular, o peptídeo imunogênico, o ácido nucleico, o cassete de expressão, o vetor de expressão, o vírus, a célula ou a vacina para utilização de acordo com a invenção, compreende a administração sequencial de: i) um primeiro peptídeo imunogênico de qualquer uma das reivindicações 1-11, o ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 12-14, o cassete de expressão de acordo com a reivindicação 15, vetor de expressão da reivindicação 16, vírus de qualquer uma das reivindicações 17-18, célula da reivindicação 19, ou vacina de acordo com a reivindicação 20 e; ii) um segundo peptídeo imunogênico de qualquer uma das reivindicações 1-11, o ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 12-14, o cassete de expressão de acordo com a reivindicação 15, o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 16, vírus de qualquer uma das reivindicações 17-18, célula de acordo com a reivindicação 19 ou vacina da reivindicação 20.

[0109] Em uma modalidade particular, o primeiro peptídeo imunogênico, ácido nucleico, cassete de expressão, vetor de expressão, vírus, célula ou vacina são diferentes do segundo peptídeo imunogênico, ácido nucleico, cassete de expressão, vetor de expressão, vírus, célula ou vacina. De preferência, é administrado primeiramente um vetor de expressão de acordo com a invenção, seguindo-se a administração de um vírus Vaccinia Ankara modificado de acordo com a invenção.

[0110] Em uma modalidade particular, o primeiro vetor de expressão de acordo com a invenção é administrado pelo menos duas vezes, preferencialmente, pelo menos três vezes.

[0111] O efeito profilático ou terapêutico benéfico da vacina relacionada à infecção por HIV ou sintomas de AIDS inclui, por exemplo, prevenir ou retardar a infecção inicial de uma pessoa exposta ao HIV; reduzir a carga viral em um indivíduo infectado com o HIV; prolongar a fase assintomática da infecção pelo HIV; manter as cargas virais baixas em pacientes infectados pelo HIV, cujo níveis do vírus foram reduzidos através da terapia antirretroviral (ART); aumentar os níveis de células T CD4 ou diminuir o decréscimo de células T CD4, HIV-1 específicos e não- específicos, em pacientes não tratados previamente com fármacos e em pacientes tratados com ART, aumentar a largura, amplitude, avidez e funcionalidade de CTL específico do HIV, aumentar a saúde geral ou qualidade de vida em um indivíduo com AIDS; e prolongar a expectativa de vida de um indivíduo com AIDS. Um clínico pode comparar o efeito da imunização com a condição do paciente antes do tratamento, ou com a condição esperada de um paciente não tratado, para determinar se o tratamento é eficaz na inibição da AIDS.

[0112] Preferencialmente, a referida doença é AIDS, ARC ou uma doença oportunista HIV. Exemplos não limitantes de doenças oportunistas HIV são o linfoma de Burkitt, candidíase nos brônquios, traqueia, pulmões, ou esófago, câncer cervical, coccidioidomicose (disseminada ou fora dos pulmões), criptococose (fora dos pulmões), criptosporidiose (nos intestinos duram por mais de 1 mês), infecção por citomegalovírus (fora do fígado, baço ou linfonodos), retinite por citomegalovírus (com perda de visão), encefalopatia por HIV, lesões de herpes simples com duração de mais de um mês, herpes simples nos brônquios, pulmão, ou esôfago, histoplasmose (disseminada ou fora dos pulmões), linfoma imunoblástico, carcinoma cervical invasivo (câncer), Isosporíase nos intestinos com duração de mais de um mês, sarcoma de Kaposi, linfoma (primário no cérebro), complexo Mycobacterium avium (disseminada ou fora dos pulmões), Mycobacterium kansasii (disseminada ou fora dos pulmões), Mycobacterium tuberculosis (disseminada ou fora dos pulmões), pneumonia por Pneumocystis carinii, pneumonia (recorrente no período de 12 meses), leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), septicemia por salmonelas (recorrente), toxoplasmose (no cérebro), síndromes e qualquer outra doença decorrente de uma infecção facilitada por um sistema imunológico comprometido em um paciente infectado pelo HIV.

[0113] A vacina da invenção pode ser útil para a terapia da infecção por HIV-1. Enquanto todos os animais que podem ser atingidos com o HIV-1, ou os seus equivalentes, podem ser tratados desta maneira (por exemplo, macacos, chimpanzés, babuínos e seres humanos), as composições imunogênicas da invenção são dirigidas particularmente aos seus fins terapêuticos em seres humanos. Muitas vezes, mais do que uma única administração pode ser necessária para provocar o efeito terapêutico desejado; o protocolo exato (dosagem e frequência) pode ser estabelecido através de procedimentos clínicos padrão.

[0114] A presente invenção refere-se ainda a prevenção ou redução dos sintomas associados com a infecção pelo HIV. Estes incluem os sintomas associados com a fase sintomática menor de infecção pelo HIV, incluindo, por exemplo, herpes, erupções cutâneas e infecções de unhas, feridas na boca, infecções recorrentes de nariz e garganta, e perda de peso. Além disso, outros sintomas associados com a grande fase sintomática da infecção pelo HIV incluem, por exemplo, candidíase oral e vaginal (candidíase), diarreia persistente, perda de peso, tosse persistente e tuberculose reativada ou infecções de herpes recorrentes, tais como herpes labial (herpes simples). Outros sintomas da fase mais aguda da AIDS que podem ser tratados de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, diarreia, náuseas e vômitos, aftas e feridas na boca, infecções vaginais recorrentes e câncer cervical, linfadenopatia persistente generalizada (PGL), grave infecções de pele, verrugas e micoses, infecções respiratórias, pneumonia, especialmente pneumonia por Pneumocystis carinii (PCP), herpes zoster (ou cobreiro), problemas no sistema nervoso, tais como dores, dormência ou formigamento nas mãos e nos pés, alterações neurológicas, sarcoma de Kaposi, linfoma, tuberculose ou outras infecções oportunistas semelhantes.

[0115] Os efeitos benéficos da presente invenção incluem, por exemplo, prevenir ou retardar a infecção inicial de uma pessoa exposta ao HIV, reduzir a carga viral em um indivíduo infectado com HIV, prolongar a fase de infecção por HIV assintomática, mantendo baixa a carga viral em pacientes infectados com o HIV, em que os níveis virais tenham sido reduzidos através da terapia antirretroviral (ART), aumentar os níveis de células T CD4 ou redução da diminuição de células T CD4, HIV-1 específico e não específico, em pacientes não tratados previamente com fármacos e em pacientes tratados com ART, aumentar a amplitude, magnitude, avidez e funcionalidade de CTL específico do HIV, aumentar a saúde geral ou qualidade de vida em um indivíduo com AIDS; e prolongar a expectativa de vida de um indivíduo com AIDS. Um clínico pode comparar o efeito da imunização com a condição do paciente antes do tratamento, ou com a condição esperada de um paciente não tratado, para determinar se o tratamento é eficaz na inibição da AIDS.

[0116] As composições imunogênicas podem ser concebidas para introduzir os ácidos nucleicos ou vetores de expressão para um local de ação desejado e soltá-los a uma taxa adequada e controlável. Métodos de preparação de formulações de liberação controlada são conhecidos na arte. Por exemplo, preparações de liberação controlada podem ser produzidas pelo uso de polímeros para o complexo ou absorver o imunógeno ou composição imunogênica. Uma formulação de libertação controlada pode ser preparada utilizando macromoléculas adequadas (por exemplo poliésteres, poliaminoácidos, polivinila, pirrolidona, etilenovinilacetato, metilcelulose, carboximetilcelulose, ou sulfato de protamina) conhecidas para proporcionar as características desejadas de liberação controlada ou perfil de libertação. Outro método possível para controlar a duração da ação por preparações de liberação controlada é a incorporação dos ingredientes ativos em partículas de um material polimérico (por exemplo, poliésteres, poliaminoácidos, hidrogéis, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros destes ácidos, ou copolímeros de etileno acetato de vinila). Em alternativa, em vez de incorporar estes ingredientes ativos em partículas poliméricas, é possível aprisionar estes materiais em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e de polimetilmetacrilato, respectivamente, em sistemas de entrega de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas, nanocápsulas) ou em macroemulsões. Ver em Voller A, et al., Eds., “New Trends and Developments in Vaccines (University Park Press, Baltimore, MD, US, 1978) e Gennaro A, Ed., “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 18th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, PA, US, 1990).

[0117] As dosagens adequadas dos ácidos nucleicos e dos vetores da invenção (coletivamente, os imunógenos) na composição imunogênica de expressão da presente invenção podem ser facilmente determinadas por peritos na arte. Por exemplo, a dosagem dos imunógenos pode variar, dependendo da via de administração e do tamanho do indivíduo. As doses adequadas podem ser determinadas por peritos na arte, por exemplo, medindo a resposta imunitária de um indivíduo, tal como um animal de laboratório, utilizando técnicas imunológicas convencionais, e ajustando as dosagens conforme apropriado. Tais técnicas para medir a resposta imunitária do indivíduo incluem, mas não estão limitadas aos ensaios de liberação de cromo, ensaios de ligação de tetrâmero, ensaios ELIspot de IFN, ensaios ELIspot de IL-2, ensaios de citocinas intracelulares e outros ensaios de detecção imunológicos. Ver Harlow E, Lane D, “Antibodies: A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, US, 1988).

[0118] As composições imunogênicas podem ser administradas usando qualquer método de administração adequado, incluindo, mas não limitados a, intramuscular, intravenoso, intradérmico, transcutâneo, intranasal, mucosa (por exemplo, intraretal, intravaginal, oral), e entrega tópica. Tais técnicas são bem conhecidas na arte. Mais exemplos específicos de métodos de entrega são a injeção intramuscular, injeção intradérmica e subcutânea. No entanto, a entrega não precisa estar limitada a métodos de injeção. Além disso, a entrega de DNA aos tecidos animais vem sendo conseguida por injeção direta de lipossomas catiônicos de DNA puro em tecido muscular animal ou injeção intradérmica de DNA utilizando "pistola de genes" ou tecnologia de eletroporação. Ver Watanabe M, et al., Mol. Reprod. Dev. 1994; 38:268-274, Charnock-Jones D, et al., WO1996020013, Robinson H, et al., Vaccine 1993: 11:957-960, Hoffman S, et al., Vaccine 1994; 12(16):1529-1533; Xiang Z, et al., Virology 1994; 199:132-140, Webster R, et al., Vaccine 1994; 12:1495-1498, Davis H, et al., Vaccine 1994; 12: 1503-1509, Davis H, et al., Hum. Mol. Gen. 1993; 2:1847-1851, e Johnston S, et al., Meth. Cell Biol. 1994; 43:353-365. A entrega também pode ser realizada através de uma superfície mucosa, tal como a mucosa anal, vaginal ou oral.

7. Kit da invenção

[0119] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit que compreende o imunógeno do primeiro aspecto, o peptídeo ou uma variante do segundo aspecto, o ácido nucleico, o cassete de expressão, o vetor de expressão, o vírus ou a célula do quarto aspecto, ou a vacina do quarto aspecto. Estes kits fornecem os materiais necessários para realizar a aplicação descrita na presente invenção. O kit pode também estar na forma de um adesivo.

[0120] Além disso, o kit pode compreender uma embalagem, que permite manter os reagentes dentro dos limites determinados. Os materiais adequados para a preparação de tais embalagens incluem vidro, plástico (por exemplo polietileno, polipropileno, policarbonato), garrafas, frascos, papel, ou sacolas. O kit da invenção pode, adicionalmente, conter instruções para a utilização dos componentes nela contidos, em especial aqueles que constituem o adesivo hemostático da invenção. As referidas instruções podem ser encontradas sob a forma de material impresso ou sob a forma de um suporte eletrônico que pode armazenar instruções, de modo possam ser lidas por um indivíduo, tais como mídias de armazenagem eletrônica (por exemplo, discos magnéticos, fitas) ou mídia visual (por exemplo, CD-ROM, DVD). Os meios de comunicação podem, adicionalmente, ou alternativamente, conter sites de internet que fornecem as referidas instruções.

PROCEDIMENTOS GERAIS 1. Criação de imunógeno de célula T

[0121] A abordagem que se segue foi utilizada para a criação dos OLPs HIV da invenção.

[0122] Um “screening” experimental (interferon gamma ELISpot) de 232 indivíduos infectados pelo HIV não tratados usando um conjunto de peptídeo clado B consenso revelou regiões do proteoma viral que foram predominantemente alvo de indivíduos com maior controle de HIV. Ver Frahm N, et al., J. Virol. 2004; 78:2187-2200; Mothe B, et al., J. Transl. Med. 2011; 9(1):208. O conjunto de peptídeo de teste geral se consistiu de 410 18mer de peptídeos de sobreposição abrangendo todo o proteoma viral. Destes, 26 OLPs foram identificados onde o grupo de OLPs com resposta (p <0,05 não corrigido para comparações múltiplas) teve uma redução significativa de carga viral em comparação com o grupo de OLPs que não responderam (isto é, indivíduos que não reagiram a estes OLPs no ensaio ELIspot gama). Estes OLPs benéficos tiveram uma proporção protetora (PR> 1) e foram localizados na proteína Gag do HIV (n = 10), em Pol (n = 12), e nas proteínas Vif (n = 3) e Nef (n = l) do vírus. Dos 26 OLPs, 15 foram parcialmente sobrepostos. Ver Tabela 1.

*Os valores PR em negrito indicam PR> 1, ou seja, respostas de OLP observadas com mais frequência em indivíduos com cargas virais reduzidas.

[0123] A fim de construir uma sequência de imunógeno contínua, os 26 OLPs foram alinhados e montados para um total de 16 segmentos, que variam de 11-78 aminoácidos de comprimento. As posições iniciais e finais precisas desses segmentos foram baseadas em análise de resíduos acima e abaixo dos 26 OLPs identificados, e em uma série de considerações que foram aplicadas aos diferentes locais de acompanhamento. Essas considerações incluem: 1) dados de imunogenicidade de OLP 2) dados de reatividade de região conservada 3) Extensão ou segmentos de corte para inclusão / exclusão de bons ou maus epítopos conhecidos 4) cobertura do epítopo CD4 5) cobertura de HLA 6) variabilidade de sequência (epítopos definidos consenso 2010 e HBX2) 7) análise de OLP multivariada 8) Criação de novo / próprio epítopo 9) Manutenção da sequência natural apesar de OLP benéfico não incluído 10) Introdução de mudanças para evitar o reconhecimento de epítopo e 11) Impedimento de resíduos proibidos (G, P, E, D, Q, N, T, S ou C)

[0124] Este protocolo resultou na criação da SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO 16, como imunógenos potenciais. 2. Vetores

[0125] As sequências SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 16 foram ligadas aos aminoácidos de alanina únicos, duplos ou triplos entre os segmentos, para garantir uma transformação ótima e para evitar a digestão prematura de epítopo.

[0126] Em seguida, os segmentos ligados foram usados como sequências de imunógeno de células T de HIV para inclusão em vetores de DNA e MVA. Para a entrega dos imunógenos usando somente peptídeos solúveis ou em combinação com proteínas de choque térmico, peptídeos sobrepostos mais curtos (comprimento mediano de 23 resíduos) solúveis foram projetados para abranger os 16 segmentos, não incluindo os ligantes triplos AAA. Estes OLPs foram gerados de um modo que ajudou a evitar resíduos proibidos na extremidade terminal C (importante para apresentação de epítopo ótimo em moléculas HLA de classe I. Ver SEQ ID NO: 17. até a SEQ ID NO: 45, Janeiro 2012). Estes peptídeos sobrepostos variam em comprimento de 11-27 aminoácidos. 3. imunógeno de célula T

[0127] O imunógeno de células T vem sendo concebido como um polipeptídeo e construído a partir de 16 segmentos do genoma do HIV-1 de tamanho variável (entre 11 e 78 aa) unidos por ligantes de alanina triplos. Descrição das regiões incluídas:

Comprimento total:529 (incluindo ligantes A, AA ou AAA)

4. Inclusão de uma sequência líder

[0128] Os peptídeos de sinal são geralmente sequências de aminoácidos altamente hidrofóbicas (15 a 60 aminoácidos de comprimento) de proteínas que devem atravessar membranas para chegar a sua localização celular de funcionamento. Ao ligar-se às partículas de reconhecimento de sinal, estas sequências dirigem complexos de proteína-ribossoma nascentes para uma membrana em que a proteína é inserida durante a tradução. Os peptídeos de sinal dirigem a captação de tradução da proteína por várias membranas (por exemplo, retículo endoplasmático, mitocôndria, cloroplasto, peroxissomo). As sequências de sinal líder em proteínas não membranares são finalmente removidas por peptidases específicas.

[0129] Alguns peptídeos de sinal utilizados incluem quimiocina MCP-3, para promover a secreção e atração de células que apresentam antígenos; um peptídeo derivado de catenina (CATE) para a degradação proteossomal aumentada; e a proteína lisossômica associada, Lampl para direcionar o compartimento MHC II. Ver Rosati M, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009; 106: 15831-15836.

[0130] Neste planejamento, o peptídeo de sinal do GMCSF (fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos) foi introduzido na extremidade amino-terminal do imunógeno, para aumentar a secreção do imunógeno a partir de células que expressam, seguido por uma valina para aumentar a estabilidade. A sequência do peptídeo de sinal do GMCSF é: MWLQSLLLLGTVACSIS (SEQ ID NO: 46)

5. Inclusão de um marcador para experimentos de expressão in vitro

[0131] Para o propósito de avaliar a expressão em células transfectadas, a sequência de imunógeno que primeiramente incluiu um peptídeo FLAG na região de terminal C, antes do códon de parada, foi a seguinte: DYKDDDDKL (SEQ ID NO: 48)

[0132] O sistema FLAG utiliza um peptídeo de 8 aminoácidos hidrofílico curto, que é fundido com a proteína recombinante de interesse. O peptídeo FLAG inclui o local de ligação para vários anticorpos monoclonais ANTI-FLAG altamente específicos (Ml, M2, M5, Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO, US), que podem ser utilizados para avaliar a expressão da proteína de interesse no material, a partir de células transfectadas.

[0133] Devido ao pequeno tamanho do marcador peptídico FLAG, este não protege outros epítopos, domínios, ou alteram a função, secreção, ou transporte da proteína de fusão, em geral. Esta sequência foi depois removida para o ensaio de imunogenicidade em camundongos. O marcador FLAG é removido do imunógeno final (298H) antes da imunização.

6. Descrição do imunógeno de células T

[0134] O imunógeno de célula T possui a seguinte sequência (SEQ ID NO: 49): M W L Q S L L L L G T V A C S I S V (E K I R L R P G G K K K Y K L K H I V W A S R E L E R F A V N P G L L E T S E G C R Q I L G Q L Q P S L Q T G S E E L K S L Y N T V A T L Y C V H Q K I E V)S1 A A A (K A F S P E V I P M F S A L)S2 A A A (G H Q A A M Q M L K E)S3 A A A (I A P G Q M R E P R G S D I A G T T S T L Q E Q I G W M T N N P P I P V G E I Y K R W I I L G L N K I V R M Y S P T S I)S4 A A A (Y V D R F Y K T L R A E Q A)S5 A (A C Q G V G G P G H K A R V L)S6 A A A (C T E R Q A N F L G K I W P S H K G R P G N F L Q S R)S7 A A A (K M I G G I G G F I K V R Q Y D Q I L I E I C G H K A I G T V L V G P T P V N I I G R N L L T Q I G C T L N F)S8 A A A (L V E I C T E M E K E G K I S K I)S9 A A A (L R W G F T T P D K K H Q K E P P F L W M G Y E L H P D K W T V Q P I V L P E K D S W T V N D I Q K L V G K L)S10 A A A (I L K E P V H G V Y Y D P S K D L I A E I Q K Q G Q G Q W T Y Q I Y)S11 A A A (T K E L Q K Q I T K I Q N F R V Y Y R D S R D P L W K G P A K L L W)S12 A A A (K I I R D Y G K Q M A G D D C V A)S13 A A (V K H H M Y I S K K A K G W F Y R H H Y E S T H P R)S14 A A A (V T K L T E D R W N K P Q K T K G H R)S15 A A (A W L E A Q E E E E V G F)S16 D Y K D D D D K L em que, o peptídeo de sinal de GMCSF é mostrado sublinhado, a valina que imediatamente se segue após a sequência de sinal é destacada. Os ligantes únicos, duplos ou triplos A(AAA)são mostrados em negrito, o epítopo FLAG (removido na construção final para estudos in vivo) é mostrado em itálico, e os diferentes segmentos são mostrados entre parêntesis, como se segue.

7. Otimização do códon da sequência de Nucleotídeo

[0135] A sequência de imunógeno de célula T foi traduzida para a sequência de nucleotídeos de RNA/ otimizada por códon para aumentar a expressão e secreção (Mr. Gene GmbH, Regensburg, DE). A otimização por códon foi baseada na introdução de várias alterações de nucleotídeos para destruir o processamento do RNA previamente identificado, sequências inibidoras e instabilidade do RNAm, sem afetar a proteína codificada. Ver Schwartz, S, et al., J. Virol. 1992; 66 (12): 7176-7182. Este processo também pode incluir a eliminação de locais de junção previstos (pontuação> 0,4) a partir de sequências de codificação por mudanças de códons apropriados, para minimizar a possibilidade de splicing.

[0136] Como um resultado das alterações de nucleotídeos acima indicadas, o conteúdo de GC final do imunógeno de células T foi de 63%. A sequência completa de nucleotídeos otimizada por códon do imunógeno é (SEQ ID NO: 50): 1 ATGTGGCTCC AGAGCCTGCT ACTCCTGGGG ACGGTGGCCT GCAGCATCTC GGTCGAGAAG 61 ATCCGGCTGC GGCCAGGCGG AAAGAAGAAG TACAAGCTGA AGCACATCGT CTGGGCCTCG 121 AGGGAGCTGG AGCGGTTCGC GGTGAACCCG GGACTTCTGG AGACGTCGGA GGGGTGCAGG 181 CAGATCCTCG GCCAGCTGCA GCCCTCTCTG CAAACGGGGT CTGAGGAGCT GAAGAGCCTG 241 TACAACACGG TGGCGACCCT CTACTGCGTC CACCAGAAGA TCGAGGTGGC AGCGGCCAAG 301 GCGTTCTCGC CGGAGGTCAT CCCCATGTTC TCGGCGCTGG CAGCTGCCGG ACACCAGGCC 361 GCGATGCAGA TGCTGAAGGA GGCCGCTGCG ATCGCACCGG GCCAGATGAG GGAGCCACGC 421 GGTTCCGACA TCGCGGGAAC CACCTCGACG CTCCAGGAGC AGATCGGATG GATGACGAAC 481 AACCCGCCAA TCCCGGTCGG GGAGATCTAC AAGCGGTGGA TCATCCTCGG GCTGAACAAG 541 ATCGTCCGGA TGTACAGCCC GACGTCGATC GCTGCGGCAT ACGTTGACCG GTTCTACAAG 601 ACCCTGAGGG CCGAGCAGGC AGCGGCCTGC CAGGGGGTCG GTGGACCAGG GCACAAGGCC 661 CGAGTGCTCG CGGCCGCATG CACGGAGCGG CAGGCGAACT TCCTGGGGAA GATCTGGCCG 721 TCGCACAAGG GCCGACCGGG AAACTTCCTC CAGTCTCGCG CAGCGGCTAA GATGATCGGA 781 GGCATCGGAG GCTTCATCAA AGTCCGTCAG TACGACCAGA TCCTCATCGA GATCTGCGGG 841 CACAAGGCGA TCGGAACCGT GCTCGTCGGC CCAACGCCCG TGAACATCAT CGGCCGCAAC 901 CTGTTAACGC AGATCGGCTG CACCCTCAAC TTCGCCGCAC TAGTGGAGAT CTGCACGGAG CTTCACCACG GCTGCACCCG GGTGAACGAC CCACGGGGTG GGGTCAGTGG GAAGATCCAG TGCGAAGCTT CGACGACTGC CTGGTTCTAC GACGGAGGAC GGAGGCTCAG ataa em que a sequência que codifica o peptídeo de sinal de GMCSF está sublinhada, o códon de valina, imediatamente a jusante da sequência que codifica a sequência de sinal é mostrado em destaque, a sequência que codifica o polipeptídeo imunogênico está mostrada em letra padrão, a sequência que codifica o marcador Flag é apresentada em itálico, e os códons de parada Taa e tga são apresentados em letras minúsculas.

8. Estratégia de clonagem

[0137] A célula T otimizada por códon foi clonada no plasmídeo de expressão de mamífero BV5, que consiste de um esqueleto de plasmídeo CMV básico modificado otimizado, para o crescimento em bactérias que abrigam o promotor do citomegalovírus humano (CMV), o local de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH), o gene de resistência à canamicina, sem local de Xho. As etapas de clonagem foram conforme se segue: 1) em uma primeira etapa, uma alteração de um aminoácido de Leu para Met foi introduzida no imunógeno de célula T sintetizado, incluindo o epítopo FLAG na posição RT 41 (segmento 9) para cobrir um dos principais locais de mutações de resistência antirretroviral. O gene imunogênico de células T (do vetor de início) foi clonado em um plasmídeo de resistência a spectomycin. Um segmento gerado de PCR que cobre a mudança RT M41 foi inserido no imunógeno de células T como SpeI / HindIII. As células competentes DH108B foram utilizadas para a transformação e cultivadas em meio LB-spectomycin. O plasmídeo resultante foi denominado HIVACAT RT M41. A inserção da mutação pontual foi confirmada por sequenciação de PCR usando os primers sense e anti-sense que cobrem a sequência de segmento 9. 2) em uma segunda etapa, o gene HIVACAT RT M41 foi inserido no plasmídeo BV5 sem local de Xho no gene de resistência à canamicina como Sall / EcoRI, por ligação do vetor e do fragmento digerido purificado em gel de HIVACAT RT M41. As células competentes DH108B foram utilizadas para a transformação e cultivadas em meio LB-Kan. O plasmídeo resultante foi denominado 297H (GMCSF-HIVACAT-FLAG). A inserção do gene foi confirmada por digestão de restrição e sequenciação de PCR usando os primers sense (a partir do promotor CMV) e anti-sense (da região de polyA BGH). 3) Em uma terceira etapa, o epítopo para o marcador FLAG foi removido do plasmídeo 297H por digestão de BstEII H- EcoRI e inserção dos primers recozidos 298H Plus e 298H Minus 298HPlus GTCACCGGGCGGCTGCATGGCTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGAGGTGGGCTTCtgataa G (SEQ ID NO: 51) 298H Minus aattCttatcaGAAGCCCACCTCCTCCTCCTCCTGAGCCTCCAGCCATGCAGCCGCCCG (SEQ ID NO: 52)

[0138] O plasmídeo resultante foi denominado 298H GMCSF- HIVACAT, número de acesso DSM 25555). Ver Fig. 1. A remoção do marcador FLAG foi confirmada por sequenciação de PCR usando primers anti-sense (da região de polyA BGH).

Exemplo 1 Estudos de expressão in-vitro

[0139] Várias transfecções transitórias foram realizadas para avaliar a expressão, localização e estabilidade do imunógeno HIVACAT de célula T.

[0140] Resumidamente, 293 células humanas 1x106 em DMEM completo mais 10% de soro fetal bovino (FBS) foram semeadas em placas de cultura de 60 milímetros de tecido e deixadas aderir durante a noite. Células HEK 293 foram transfectadas com co-precipitação de DNA CaPhosphate com um total de 7μg de DNA (100ng ou 250ng do DNA de plasmídeo de 297H GMCSF- HIVACAT-FLAG, 50 ng de plasmídeo que expressa GFP pFRED143 aumentado para 7 μg com DNA Bluescript).

[0141] 6 horas após a transfecção, o meio foi substituído com 3 ml de DMEM suplementado com 2% de FCS. Após 24 e 48 horas, as células e os sobrenadantes foram recolhidos em 0.5X RIPA.

[0142] A expressão de proteínas foi analisada por Western immunoblots. 1/250 do total dos extratos celulares e dos sobrenadantes foram carregados. As proteínas foram resolvidas por eletroforese em 10% de géis de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (Nu-Page Bis-Tris, NuPAGE, Invitrogen, Life Technologies Corp, Carlsbad, CA, US) e transferidas para membranas de nitrocelulose.

[0143] O plasmídeo 297H foi detectado por sondagem das membranas com anticorpo monoclonal anti-FLAG com rábano conjugado por peroxidase (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, US) a uma diluição de 1:3.000.

[0144] Bandas foram visualizadas utilizando ECL. As membranas foram fotografadas em um ChemiDoc XRS +.

[0145] Os controles positivos foram usados e incluíram o plasmídeo DNA que codifica para Gag p55 clado B, que também abrigou o marcador FLAG.

[0146] Os extratos celulares a partir de transfecções transientes usando o plasmídeo 298H (que codifica para o imunógeno de células T HIVACAT sem o marcados FLAG) foram sondados com soro humano a partir de um indivíduo infectado pelo HIV-1 a uma diluição de 1:3.000, seguida por um anti- IgG humano com rábano conjugado por peroxidase, diluição de 1: 10.000.

[0147] Os plasmídeos 297H e 298H expressaram, de forma estável (mesmo valor estimado em 24h e 48h), o construto de imunógeno de célula T HIVACAT, que foi visualizado no compartimento do extrato celular. Não houve evidência de secreção do construto.

Exemplo 2 Resposta celular em camundongos

[0148] Um estoque de 1 ml (2mg/ml) de DNA 298H GMCSF- HIVACAT foi produzido “endofree” para estudos in vivo em camundongos.

[0149] A imunogenicidade do imunógeno de células T HIVACAT foi avaliada em camundongos fêmea C57BL / 6 de 6-8 semanas de idade (Charles River Labs, Inc., Frederick, MD, US).

[0150] 20 μg e 5 μg de DNA foram entregues por via intramuscular por eletroporação utilizando o sistema Inovio (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA, US) nos quadríceps esquerdo e direito (20 μg/50 μl por dose, 25 μl por local) na semana 0 e 4. Os camundongos foram sacrificados 2 semanas após a última imunização. Esplenócitos e soro dos camundongos foram colhidos para estudos de imunogenicidade. Os DNAs de controle utilizados foram os seguintes: 1) 114H p55 gag clado B: expressa a proteína gag integral; 2) 132h NTV: expressa uma proteína quimérica de nef, tat e vif; 3) 133H pol: expressa a proteína pol integral; e 4) BV4 CMV-kan-básico: controle SHAM, suporte principal do plasmídeo DNA semelhante, sem qualquer transgene expresso.

[0151] 35 camundongos foram usados na experiência, reunindo 5 camundongos por grupo. A distribuição da imunização por grupo foi como se segue:

[0152] As respostas imunes celulares foram caracterizadas em uma primeira etapa utilizando a coloração de citocina intracelular (ICS) em esplenócitos reunidos (células dos 5 camundongos pertencentes ao grupo) e utilizando um conjunto de peptídeos sobrepostos, abrangendo todas as proteínas gag, pol, nef, tat e vif.

[0153] Resumidamente, os esplenócitos de camundongos isolados reunidos a partir de cada grupo de camundongos foram incubados com uma densidade de 2xl06 células / ml, em 1 ml de co-cultura durante a noite, na presença de conjuntos de peptídeos (15-mers, sobrepostos por 11aa revestindo as sequências gag clado B, pol consenso B e nef NL43, assim como tat e vif, 1 μg / ml de cada peptídeo, total de cerca de 12 horas, 1 hora, sem paragem de Golgi, para evitar a secreção de citocinas). A imunomarcação de superfície foi realizada com CD3-aloficocianina-Cy7, CD4- PerCP, CD8-Pacific Blue (BD Biosciences, Inc., Franklin Lakes, NJ, US). A coloração de citocinas intracelulares foi realizada utilizando o anticorpo gama-FITC interferon (BD Biosciences, Inc., Franklin Lakes, NJ, US) após permeabilização.

[0154] Por uma primeira análise de imunogenicidade, ambos 2 0 μg e 5 μg de DNA em camundongos C57BL / 6 geraram respostas interferon gama - + detectáveis para gag completa, grupos de peptídeos completos gag, pol e nef-tat- vif. Ver a figura. 2a. A distribuição de respostas de CD4 + e CD8 + é mostrada. Ver a figura. 2b.

[0155] Em se tratando de camundongos individuais, as respostas foram desenvolvidas utilizando esplenócitos estimulados congelados com 8 grupos de peptídeos para cobrir as subunidades proteicas compreendidas no imunógeno em um ensaio ELISpot de interferon gama.

[0156] O ensaio ELISpot foi realizado usando o kit de ELISpot interferon gama de camundongos(ALP) (Mabtech AB, Estocolmo, Suécia) seguindo as instruções do fabricante, com pequenas modificações. Para todos os ensaios, os esplenócitos de camundongos foram adicionados a um número de células de entrada de 4xl0 5 células / poço em 140μl de meio de Rosewell Park Memorial Institute 1640 com 10% de soro bovino fetal em placas de 96 poços de polivinilideno (Millipore Corp, Bedford, MA, US) sozinho ou com os grupos de peptídeos HIV-1 específicos (14μg/ml de concentração final para cada peptídeo), para 16 horas a 37°C em 5% de CO2. Oito grupos de peptídeos, cada um contendo entre 2 e 12 peptídeos de 18 aminoácidos, com base na sequência consenso 2001-B, foram agrupados em diferentes subunidades da proteína (gag-P17, gag-p24, gag-p2p7p1p6, pol-RT, pol- protease, pol-integrase, vif e nef) abrangendo os segmentos incluídos no imunógeno de célula T HIVACAT. Ver http://hiv- web.lanl.gov/content/hiv- db/CONSENSUS/M GROUP/Consensus.html, janeiro de 2012.

[0157] Os grupos de peptídeos de HIV utilizados em camundongos imunizados com DNA que expressam as proteínas gag, pol, nef, tat e vif completas, consistiram em peptídeos 18-mers com uma sobreposição de 11 resíduos que abrangem as proteínas completas gag (6 grupos, 11 peptídeos / cada), pol (8 grupos, 16 ou 17 peptídeos / cada), nef (2 grupos, 13 ou 14 peptídeos / cada), tat (1 grupo, 12 peptídeos) e vif (2 grupos, 12 peptídeos / cada).

[0158] Concavalin A (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, US), a 5 mg / ml, foi utilizado como um controle positivo. As placas foram desenvolvidas com uma etapa de 5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato / azul de nitrotetrazólio (BCIP / NBT, Bio-Rad Laboratories, Inc., Irvine, CA, US). Os pontos nas placas foram contados utilizando um sistema de leitura automatizado ELISPOT (CTL Analyzers LLC, Cleveland, OH, US) utilizando o software ImmunoSpot, e a magnitude da resposta foi expressa como células que formam “spots” (SFC) por milhão de esplenócitos de entrada. O limiar para respostas positivas foi definido como pelo menos 5 “spots” por poço, e as respostas que excederam o "número médio de “spots” nos poços de controle negativo mais três desvios padrão dos poços de controle negativo" e "três vezes a média dos poços de controle negativo", qualquer um, foi maior: 1) O domínio de respostas interferon gama desenvolvidas em camundongos imunizados com plasmídeos que codificam para proteínas gag, pol, nef, tat e vif completas foi em direção a regiões de fora dos segmentos cobertos do imunógeno de célula T HIVACAT (a proporção mediana de respostas que visam regiões do imunógeno HIVACAT / gag+pol+nef+tat+vif totais foi de 0,26 (intervalo de 0,17-0,42)) e não diferiu entre os grupos imunizados com uma dose elevada (20 μg) ou de baixa dose (5 μg) de DNA. Ver a figura. 3 2) A largura média das respostas para subunidades da proteína incluídas na sequência de imunógeno de células T HIVACAT foi de 4 (gama 2-5) em camundongos imunizados com 20 μg de HIVACAT vs 2 respostas (intervalo 1-3) em camundongos imunizados com 20 μg de plasmídeos que codificam para proteínas inteiras (ns), sem diferenças significativas na magnitude das respostas. Seis das oito subunidades proteicas foram, pelo menos, uma vez, direcionadas em camundongos imunizados com o imunógeno de células T HIVACAT. Ver Fig. 4.

4) O domínio de respostas em camundongos imunizados com plasmídeos que codificam as proteínas totais gag, pol, nef, tat e vif foi de 89%, sobretudo no sentido de gag, enquanto que nos camundongos imunizados com o imunógeno de células T HIVACAT em doses elevadas, foi mais equilibrado para todos componentes proteicos (gag, pol, vif e nef) contidos no imunógeno. Ver a figura. 5. Exemplo 3 Resposta humoral em camundongos

[0159] Respostas humorais foram analisadas em soros de camundongos agrupados. A ligação de anticorpos para p24, p37 e p55 foram detectadas por Western blot usando extratos celulares a partir de células HEK 293 transfectadas com 1 mg de vetores de expressão de gag separados em 12% SDS-PAGE e sondagem das membranas com soros agrupados de camundongos (a uma diluição de 1:100). Os títulos de anticorpos para p24 gag foram medidos por ELISA. Diluições em série de 4 vezes de amostras de soro agrupadas foram avaliadas, e a absorvância óptica a 450 nm foi determinada (Advanced Bioscience Lab., Inc., Kensington, MD, US). Os títulos de ligação foram relatados como a pontuação positiva mais alta de diluição, com um valor maior do que a média mais 3 desvios padrão obtidos com soros de controle dos camundongos imunizados com DNA SHAM: a) A partir de análises da primeira imunogenicidade humoral, o imunógeno de células T HIVACAT induziu respostas de anticorpos de ligação para gag p55, p37 e p24 detectáveis por Western blot no grupo de camundongos imunizados com 20 μg. Ver a figura 6. b) A ligação de anticorpos a p24 foi quantificada por ELISA. Os títulos de ponto final de anticorpo de ligação gag-p24 específico, a partir dos camundongos que receberam os plasmídeos descritos, foram determinados através de ELISA a partir de amostras de soro agrupadas diluídas em série de 4 vezes individuais. No grupo de dose elevada de camundongos imunizados com imunógeno de células T HIVACAT a um título de 1:4,000, que foram inferiores aos títulos detectados em camundongos imunizados com o construto gag total. Nenhuma ligação de anticorpo a p24 foi mensurável no grupo de baixa dose. Ver a figura 7a. Em um nível de camundongos individual, ELISA gag p55 desenvolvido internamente, utilizando proteína recombinante gag HIV- 1IIIB pr55 (Cat. No. 3276, NIH Reagent program, Bethesda, MD, US) foi realizado com soros de camundongo a 1:100 de diluição. Baixos níveis de anticorpos foram detectados em 2 dos 3 camundongos imunizados com a dose elevada do imunógeno. Ver a figura 7b. Exemplo 4 Imunogenicidade in-vivo de impulso/ heterólogo principal em camundongos

MATERIAL E MÉTODOS Preparação de vacinas pDNA-HIVACAT e MVA-HIVACAT

[0160] O imunógeno de célula T otimizado por códon foi clonado no plasmídeo de expressão de mamífero BV5, que consiste de um suporte principal de plasmídeo CMV básico modificado otimizado para o crescimento em bactérias que abrigam o promotor do citomegalovírus humano (CMV), o local de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH), e o gene de resistência à canamicina, sem local Xho. O plasmídeo DNA para as imunizações em camundongos foi preparado usando o Endo-Free Megaprep (Qiagen) e armazenado a -80°C até a sua utilização.

[0161] Um MVA recombinante que expressa o gene HIVACAT foi feito conforme descrito anteriormente {Letourneau, 2007 #235; Nkolola, 2004 #321}. Resumidamente, células de fibroblastos de embrião de galinha (CEF) cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbeco, suplementado com 10% de FBS, penicilina / estreptomicina e glutamina (DMEM 10) foram infectadas com MVA parental a MOI 1 e transfectadas utilizando Superfectin (Quiagen) com 3ug de pDNA-HIVACAT transportando o gene β-galactosidase como um marcador. Dois dias mais tarde, o vírus total foi colhido e utilizado para infectar novamente as células CEF. MVA foi sujeito a cinco rodadas de purificação das placas, após as quais um estoque de vírus master foi cultivado, purificado sobre 36% de uma almofada de sacarose, titulado e armazenado a -80°C até a sua utilização.

Imunogenicidade in vivo em camundongos C57BL/6.

[0162] Para experimentos de imunogenicidade in-vivo de impulso/ heterólogo principal em camundongos, grupos de cinco fêmeas C57BL / 6 de 6 a 8 semanas de idade, (Harlan Laboratories Ltd., Barcelona, Espanha) foram utilizados. Os camundongos foram sensibilizados intramuscularmente com 100 μg de pDNA-HIVACAT (2 ou 3 doses de vacinação), seguido por 10A6 pfu de impulso MVA-HIVACAT (grupos: 2xDNA, 3xDNA, 2xDNA + 1 MVA e 3xDNA + 1MVA, respectivamente). Todas as vacinações foram separadas por três semanas.

[0163] Todos os camundongos foram sacrificados duas semanas após a última vacinação, em cada experiência. Esplenócitos e soro de camundongos foram colhidos para estudos de imunogenicidade. Os baços foram removidos e pressionados individualmente através de um filtro celular (Falcon), utilizando 5 ml de uma seringa com borracha no êmbolo. Após a lise dos rbc, os esplenócitos foram lavados e ressuspensos em RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS, penicilina / estreptomicina (R10), e congelados até à utilização.

[0164] Todos os procedimentos e cuidados com animais foram aprovados por uma Comissão Científica de Ética local.

Peptídeos Sobrepostos e distribuição de grupos de peptídeos

[0165] Para avaliar a imunogenicidade dos regimes heterólogos foram ADNp ou MVA expressando apenas o imunogénio de células T HIVACAT, e para afastar a imunogenicidade dos epítopos juncionais potenciais, grupo de peptídeo de sobreposição de 147 peptídeos de 15 aminoácidos de comprimento (por sobreposição de 11 resíduos), que abarca todo o imunógeno de células T HIVACAT (incluindo a sequência líder e regiões ligantes), foi sintetizado novamente usando química de 9- Fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc). Os peptídeos foram distribuídos em 18 agrupamentos diferentes, de acordo com subunidades da proteína e segmentos do imunógeno (1 grupo para a sequência do peptídeo de sinal, peptídeos n = 4; 7 grupos para Gag, peptídeos n = 8-ll / cada; 7 grupos para Pol, peptídeos n = 5-ll / cada, 2 grupos para Vif, peptídeos n = 6-8 / cada, e um grupo para Nef, peptídeos n = 2). Os resultados são apresentados agrupados por respostas IFNy específicas para as oito subunidades de proteína (Gag p17, Gag p24, Gag p2p7p1p6, Pol-Protease, Pol-RT, Pol-Integrase, Vif e Nef).

Ensaio ELISPOT INFY Murino

[0166] O ensaio ELISpot foi realizado utilizando o kit ELISpot INFY de camundongo (ALP) (Mabtech AB, Estocolmo, Suécia) seguindo as instruções do fabricante, com pequenas modificações. Para todos os ensaios, os esplenócitos de camundongos congelados foram primeiramente descongelados e descansados durante 5 h a 37°C em R10, antes da utilização. As células foram adicionadas a um número de células de entrada de 4xl05 células / poço em 140μl de R10, em placas de 96 poços de polivinilideno (Millipore Corp., Bedford, MA, US), sozinho ou com os agrupamentos de peptídeos específicos para o HIV-1 (14μg/ml concentração final para cada peptídeo) para 16 horas a 37°C em 5% de CO2. Concavalin A (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, US) a 5 mg / ml foi utilizado como um controle positivo. As placas foram desenvolvidas com uma etapa de 5-bromo-4- cloro-3-indolil fosfato / azul de nitrotetrazólio (BCIP / NBT, Bio-Rad Laboratories, Inc., Irvine, CA, US). Os pontos nas placas foram contados utilizando um sistema automatizado de leitura ELISPOT (CTL Analyzers LLC, Cleveland, OH, US) utilizando o software ImmunoSpot e a magnitude da resposta foi expressa como as células que formam “spots” (SFC) por milhão de esplenócitos de entrada. O limiar para respostas positivas foi definido como pelo menos 5 “spots” por poço e as respostas que excedem o "número médio de “spots” nos poços de controle negativo mais três desvios padrão dos poços de controle negativos" e "três vezes a média dos poços de controle negativo", qualquer um, foi maior.

RESULTADOS

[0167] Nestas experiências, uma vez que nenhum camundongo foi imunizado utilizando plasmídeos que codificam para proteínas completas, um segundo conjunto de peptídeos sobrepostos correspondentes a sequência exata de imunógeno foi sintetizado e utilizado para comparação de imunogenicidade. Três imunizações intramusculares (i.m.) com 100 μg de pDNA-HIVACAT foram capazes de induzir frequências de respostas IFNy em todos os camundongos, que foram comparáveis às frequências das respostas IFNy induzidas por vacinas com o sistema Inovio de eletroporação. No entanto, duas vacinações i.m. de pDNA foram encontradas para ser imunogênicas em apenas três animais (60%) em comparação com 100% dos animais, induzindo uma resposta após três imunizações i.m. de pDNA. Curiosamente, a vacina MVA-HIVACAT conseguiu impulsionar respostas tanto em amplitude como em magnitude (Fig. 8B) nos dois grupos analisados, mas se limitou a aumentar significativamente a magnitude das respostas quando os camundongos foram previamente imunizados com as três doses de pDNA-HIVACAT (Fig. 8B e 8C).Como pode ser visto nas experiências EP anteriores, uma resposta equilibrada e ampla para a maioria de todas as subunidades de proteína incluídas no imunógeno, foi observada em todos os animais, sem um padrão claro de dominância entre eles. Nenhuma resposta específica nef ou gag-P15 foi detectada nos camundongos estudados (Fig. 8D).

[0168] Enquanto a invenção é descrita, em algum detalhe, para efeitos de clareza e compreensão, será apreciado por um perito na arte a partir de uma leitura desta descrição, que várias alterações na forma e detalhe podem ser feitas sem sair do verdadeiro âmbito da invenção e reivindicações.

[0169] Todas as publicações mencionadas acima são aqui incorporadas na sua totalidade por referência.

Claims

1. Polipeptídeo imunogênico caracterizado por consistir em: i) uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de ii) SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de iii SEQ ID NO: 2, ) uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de iv) SEQ ID NO: 3, uma sequência de aminoácidos que tem sequência de v) SEQ ID NO: 4, uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de vi) SEQ ID NO: 5, uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de vii SEQ ID NO: 6, ) uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de vii SEQ ID NO: 7, i) uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de ix) SEQ ID NO: 8, uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de x) SEQ ID NO: 9, uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de xi) SEQ ID NO: 10, uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de xii SEQ ID NO: 11, ) uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de xii SEQ ID NO: 12, i) uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de xiv SEQ ID NO: 13, ) uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de xv) SEQ ID NO: 14, uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de SEQ ID NO: 15, e xvi) uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de SEQ ID NO: 16, em que cada uma das sequências i) a xvi) são ligadas por um ligante de aminoácido.

2. Polipeptídeo imunogênico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido ligante resulta na formação de uma região de sequência A, AA ou AAA na região da junção entre as sequências adjacentes.

3. Polipeptídeo imunogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49.

4. Polipeptídeo imunogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de aminoácidos compreende pelo menos um local de mutação de resistência antiretroviral.

5. Polipeptídeo imunogênico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido local de mutação de resistência anti-retroviral está localizado em qualquer uma das SEQ ID NOs 9-11.

6. Polipeptídeo imunogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado por compreender adicionalmente um peptídeo de sinal no terminal N.

7. Ácido nucleico caracterizado por codificar o polipeptídeo imunogênico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e por ter a sequência de SEQ ID NO 50 ou suas e sequências degeneradas, que codificam o polipeptídeo imunogênico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ter sido otimizado por códon para a expressão em células humanas.

9. Cassete de expressão caracterizado por compreender o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 e 8, uma sequência promotora, uma 3'-UTR e, opcionalmente, um marcador de seleção.

10. Vetor de expressão caracterizado por compreender o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 e 8, ou o cassete de expressão conforme definido na reivindicação 9.

11. Vírus caracterizado por compreender o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 e 8 e por ser um vírus vaccinia Ankara modificado.

12. Célula procariótica caracterizada por compreender o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 e 8, o cassete de expressão conforme definido na reivindicação 9, o vetor de expressão conforme definido na reivindicação 10, ou o vírus conforme definido na reivindicação 11.

13. Vacina caracterizada por compreender um polipeptídeo imunogênico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um ou mais adjuvantes.

14. Peptídeo imunogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 e 8, cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 9, vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 10, vírus, de acordo com a reivindicação 11, célula, de acordo com a reivindicação 12, ou vacina, de acordo com a reivindicação 13, caracterizados por serem para uso em medicina.

15. Peptídeo imunogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 e 8, cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 9, vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 10, vírus de acordo com de acordo com a reivindicação 11, célula, de acordo com a reivindicação 12, ou vacina, de acordo com a reivindicação 13, caracterizados por serem para uso na prevenção ou tratamento de uma infecção por HIV, ou de uma doença associada a uma infecção por HIV.

16. Peptídeo imunogênico, ácido nucleico, cassete de expressão, vetor de expressão, vírus, célula, ou vacina, de acordo com a reivindicação 15, caracterizados pelo fato de que o referido uso compreende a administração sequencial de: i) um primeiro peptídeo imunogênico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7e 8, cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 9, vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 10, vírus, conforme definido de acordo com a reivindicação 11, célula, conforme definida na reivindicação 12, ou vacina, conforme definida na reivindicação 13; e ii) um segundo peptídeo imunogênico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 e 8, cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 9, vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 10, vírus, conforme definido de acordo com a reivindicação 11, célula, conforme definida na reivindicação 12, ou vacina, conforme definida na reivindicação 13.

17. Peptídeo imunogênico, ácido nucleico, cassete de expressão, vetor de expressão, vírus, célula, ou vacina, de acordo com a reivindicação 16, caracterizados pelo fato de que a administração do primeiro vetor de expressão conforme definido na reivindicação 10, é seguida pela administração do segundo vírus, conforme definido na reivindicação 11.

18. Peptídeo imunogênico, ácido nucleico, cassete de expressão, vetor de expressão, vírus, célula, ou vacina, de acordo com a reivindicação 17, caracterizados pelo fato de que o primeiro vetor de expressão conforme definido na reivindicação 10 é administrado pelo menos duas vezes.

19. Kit caracterizado por compreender o peptídeo imunogênico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 e 8, o cassete de expressão conforme definido na reivindicação 9, o vetor de expressão conforme definido na reivindicação 10, o vírus conforme definido na reivindicação 11, a célula conforme definida na reivindicação 12, ou a vacina conforme definida na reivindicação 13.