JP6306514B2 - Ｈｉｖワクチン接種のための免疫原 - Google Patents

Description

本発明は、オーバーラッピングペプチド（ＯＬＰ）に基づく新規免疫原およびこれらから誘導されるペプチドに関する。さらに、これらの免疫原を発現する単離された核酸、およびこのような核酸を含むベクターおよび細胞に関する。本発明の化合物は、ワクチンとして、特にＡＩＤＳおよび日和見疾患の予防および治療に有用である。

ＨＩＶ感染は、特異的なエピトープおよび制限ＨＬＡ対立遺伝子が相対的なｉｎ ｖｉｖｏ制御に関与している、強力で広範囲を対象とするＨＬＡクラスＩ拘束性Ｔ細胞応答を誘発する。Ｂｒａｎｄｅｒ Ｃら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；１８：１−８を参照。抗ウイルス性ＣＴＬ応答の大部分が、ＨＬＡ−Ｂを抑制すると思われるが、これらの応答の有効性に対する標的ウイルス領域および制限するＨＬＡ分子の相対的な寄与は、はっきりしていない。Ｋｉｅｐｉｅｌａ Ｐら、Ｎａｔｕｒｅ ２００４；４３２：７６９−７７５およびＮｇｕｍｂｅｌａ Ｋら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ２００８；２４：７２−８２を参照。

それに加え、エスケープ変異体の機能的制限、個々のタンパク質位置でのコドンの使用、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の柔軟性および機能親和性、および交差反応の可能性が、すべて、特異的なＴ細胞応答の全体的な有効性に寄与し得るため、ＨＩＶ配列の多様性がウイルス特異的なＴ細胞免疫のｉｎ ｖｉｖｏでの関連性に及ぼす役割は明らかになっていない。Ｂｒｏｃｋｍａｎ Ｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００７；８１：１２６０８−１２６１８およびＹｅｒｌｙ Ｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００８；８２：３１４７−３１５３を参照。注目すべきことに、ＨＩＶ Ｇａｇに対するＴ細胞応答は、ほとんど一貫して、ＨＩＶクレードＢおよびクレードＣに感染したコホート両方でウイルス量の減少に関係があった。Ｚｕｎｉｇａ Ｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００６；８０：３１２２−３１２５およびＫｉｅｐｉｅｌａ Ｐら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００７；１３：４６−５３を参照。

しかしながら、これらの分析で、特に有効な応答を誘発し得る標的タンパク質のうち、もっと短い領域に対する応答の役割を評価したものはなかった。それに加え、Ｇａｇの相対的な利益が、このタンパク質の任意の他の具体的な特徴（例えば、発現レベル、アミノ酸の組成、固有に大きな免疫原性）に起因するか否かは明らかになっていない。Ｇａｇの外側およびこれらの内側のタンパク質サブユニット（特異的な短いエピトープを多く含む領域）を以下のように特定し得ることが実行可能である。（ｉ）ＨＩＶ制御因子で優先的にみられる応答を誘発し、（ｉｉ）多様なＨＬＡ型の個体で検出可能であってもよいが、有効なウイルス制御とすでに関連づけられている対立遺伝子を発現する個体に限定されない。

初期の研究のいくつかは、「良好な」ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に存在するＧａｇから誘導されるエピトープが潜在的に大部分を占めるように実際に制御されてきたが、純粋なＧａｇ系ＨＩＶワクチンが、有利なＨＬＡ遺伝子型を有するヒトにとって主に有益であり、Ｇａｇの外側の潜在的に有益な標的を利用しないという問題が依然として存在する。Ｋｉｅｐｉｅｌａ、２００７（上述）およびＨｏｎｅｙｂｏｒｎｅ Ｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００７；８１：３６６７−３６７２を参照。それに加え、ＣＴＬエスケープおよびウイルスの適応性試験は、主に、比較的保護作用があるＨＬＡ対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ｂ５７およびＨＬＡ−Ｂ２７）という観点で存在するＧａｇから誘導されるエピトープに限定されてきた。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｗｉｎｄ Ａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００７；８１：１２３８２−１２３９３およびＬｅｓｌｉｅ Ａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００４；１０：２８２−２８９を参照。したがって、入手可能な情報は、ヒト宿主個体群の遺伝的に多様な代替数を保護するように設計された免疫原の配列に関連する情報を与えないだろう。

さらに、多くの研究が、優勢な免疫標的にのみ集中しており、ＨＩＶ感染およびＳＩＶ感染に対するいくつかの近年の研究が、ｉｎ ｖｉｖｏウイルス制御における（特に、Ｇａｇの外側に位置する標的の中で）２番目の応答の重要な寄与を示している。Ｆｒａｈｍ Ｎら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；７：１７３−１７８およびＦｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００７；８１：３４６５−３４７６を参照。これと合わせ、したがって、何がＨＩＶに対する予防的な細胞免疫応答を構築し得るかについての現時点での見解は、おそらく、優勢な免疫応答と、高頻度ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子および優れた疾患の転帰と関連するＨＬＡ対立遺伝子拘束性応答に偏って集中していると思われる。従って、ＨＩＶワクチンの開発は、一部には、広範囲の免疫応答を誘発することができる免疫原がないことによって制限される。本発明は、このような免疫原の設計に対処する。

第１の態様では、本発明は、配列番号１〜１６の配列を含むアミノ酸配列または前記配列番号１〜１６の改変体を含むアミノ酸配列を含んでなり、ここで、前記改変体は長さが少なくとも８アミノ酸であり、但し、前記アミノ酸配列は、配列番号１〜１６またはその改変体のいずれかのアミノ酸配列以外の、ＨＩＶゲノムから誘導される長さが８アミノ酸以上の配列を含まないものである、免疫原性ペプチドに関する。

第２の態様では、本発明は、配列番号１〜１６またはその改変体からなる群から選択される少なくとも１種類の配列を含むアミノ酸配列を含み、前記改変体は、長さが少なくとも８アミノ酸であり、但し、
（ｉ）前記免疫原のアミノ酸配列は、配列番号１〜１６またはその改変体またはそのフラグメントのいずれかのアミノ酸配列以外、ＨＩＶゲノムから誘導される長さが８アミノ酸以上の配列を含まず、
（ｉｉ）免疫原が、配列番号１〜１６からなる群から選択される１つの配列のみを含む場合、この配列は、配列番号３、５、６および１６からなる群から選択されない、免疫原性ポリペプチドに関する。

さらなる態様では、本発明は、第１の態様および第２の態様の免疫原をコードする核酸、および前記核酸を含む発現カセット、ベクター、ウイルスおよび細胞に関する。

別の態様では、本発明は、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチドと、１つ以上のアジュバントとを含むワクチンに関する。

別の態様では、本発明は、医薬に使用するための、第３の態様の免疫原性ポリペプチド、核酸、発現カセット、発現ベクター、ウイルスまたは細胞、または組成物ワクチンに関する。

別の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染またはＨＩＶ感染に関連する疾患の予防または治療に使用するための、第３の態様の免疫原性ポリペプチド、核酸、発現カセット、発現ベクター、ウイルスまたは細胞、または組成物ワクチンに関する。

別の態様では、本発明は、第１の態様および／または第２の態様の免疫原、第３の態様の核酸、発現カセット、発現ベクター、ウイルスまたは細胞、または第４の態様の組成物を含むキットに関する。

（微生物の寄託）
プラスミド２９８Ｈ ＧＭＣＳＦ−ＨＩＶＡＣＡＴ ＤＮＡを、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ ７ Ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙで、受託番号ＤＳＭ ２５５５５で２０１２年１月１３日に寄託した。

発現プラスミドに含まれる遺伝子の概略図。点は、開始コドンと終止コドンを特定する。 フローサイトメトリー分析による、プールされた脾細胞内で分析した細胞免疫応答。（Ａ）は、グループの中のＧａｇ、ＰｏｌおよびＮｅｆ−Ｔａｔ−Ｖｉｆに特異的なインターフェロンガンマ応答全体の頻度を示す。 （Ｂ）は、ＣＤ４およびＣＤ８の応答分布を示す。 マウス脾細胞におけるインターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定される、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＮＴＶおよびＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原配列に対する応答。個々のマウスを、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＮｅｆ−Ｔａｔ−Ｖｉｆポリペプチド全体をコードするプラスミドで免疫化した。インターフェロンガンマＧａｇ−Ｐｏｌ−ＮＴＶに特異的な応答全体に対する、ＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原に含まれる領域を標的とする応答の寄与を示す。 免疫化したマウスでのＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原を標的とするインターフェロンガンマ応答の（ａ）幅および（ｂ）大きさの比較。被検体を、全タンパク質をコードするプラスミドまたは最小Ｔ細胞配列で処理した。 Ｇａｇ、ＰｏｌとＮｅｆ−Ｔａｔ−Ｖｉｆポリペプチド全体およびＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原をコードする２０μｇのプラスミドで免疫化したマウスについて、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＶｉｆまたはＮｅｆに対するインターフェロンガンマ応答の均衡。全タンパク質を用いて免疫化されたマウスについて、パネル（ａ）に示すＧａｇ特異的な応答の優勢性。一方、ＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原を用いて免疫化されたマウスについて、パネル（ｂ）でみられるさらなる均衡の態様。 １２％ＳＤＳ−Ｐａｇｅで分離した１ｍｇのｇａｇおよびｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクター（ｐ５５ ｇａｇおよび処理されたｐ２４、ｐ３７およびｐ５５ ｇａｇサブユニットを示す）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３由来の細胞抽出物を用い、（ａ）ＨＩＶ感染した患者のヒト血清、（ｂ）高用量の免疫原で免疫化されたマウスから保存した血清、（ｃ）低用量の免疫原で免疫化されたマウスからプールした血清（すべて１：１００希釈）を用いて膜を探索することによる、ウェスタン免疫ブロットによって検出されたｐ２４、ｐ３７およびｐ５５に対する抗体の結合。 （ａ）治療したマウス由来のＧａｇ−ｐ２４特異的な結合抗体の終点力価。個々の段階的な４倍希釈してプールした血清サンプルからＥＬＩＳＡによって決定した。（ｂ）ＨＩＶ−１ＩＩＩＢ ｐｒ５５ Ｇａｇ組み換えタンパク質（カタログ番号３２７６、ＮＩＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳ）を用いた、社内で開発したｇａｇ ｐ５５ ＥＬＩＳＡ。個々のマウスの血清において、１：１００希釈で決定した。 （Ａ）マウス免疫接種の概略図。１００μｇのｐＤＮＡ−ＨＩＶＡＣＡＴまたは１０^６ｐｆｕのＭＶＡ−ＨＩＶＡＣＡＴのいずれかを筋肉注射によって用い、６グループのＣ５７ＢＬ／６マウスを用い、異なる異種の組み合わせ（２×ＤＮＡプライム 対 ３×ＤＮＡプライムの後、１×ＭＶＡブースト）の免疫原性を比較した。 （Ｂ）個々の免疫化されたマウスのＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原を標的とするＩＦＮγ応答の幅および大きさの比較。 （Ｃ）個々の免疫化されたマウスのＧａｇ、Ｐｏｌ，ＶｉｆおよびＮｅｆ特異的な応答の分布。 図８Ｃ１参照。 （Ｄ）異なる免疫接種グループでのＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原に含まれる８種類のタンパク質サブユニット（Ｇａｇ ｐ１７、Ｇａｇ ｐ２４、Ｇａｇ ｐ２ｐ７ｐ１ｐ６、Ｐｏｌ−プロテアーゼ、Ｐｏｌ−ＲＴ、Ｐｏｌ−インテグラーゼ、ＶｉｆおよびＮｅｆ）の分布を示す。 図８Ｄ１参照。

本発明は、広範囲の被検体のＨＩＶに対し高い免疫応答を誘発するのに有効ないくつかの免疫原性化合物を開示する。特に、鍵となるＨＩＶをコードするエピトープに対するＨＩＶ特異的なＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の応答が、これらの化合物を用いて得られていた。

１．一般的な用語および表現の定義
「アジュバント」という用語は、本明細書で使用する場合、免疫原の影響を変えるが、それ自体を投与するときには、直接的な影響があるにしても影響が少ない免疫学的薬剤を指す。アジュバントは、注入される外来物質を最低限に維持しつつ、供給される抗原に対する受容者の免疫応答を高めるために、ワクチンに含まれることが多い。標的抗原に対する免疫系の応答を刺激するために、アジュバントをワクチンに加えるが、それ自体は免疫を与えない。有用なアジュバントの非限定的な例としては、鉱物塩、ポリヌクレオチド、ポリアルギニン、ＩＳＣＯＭ、サポニン、モノホスホリル脂質Ａ、イミキモド、ＣＣＲ−５阻害剤、毒素、ポリホスファゼン、サイトカイン、免疫調節タンパク質、免疫刺激融合タンパク質、共刺激分子、およびこれらの組み合わせが挙げられる。鉱物塩としては、限定されないが、ＡＩＫ（ＳＯ_４）_２、ＡｌＮａ（ＳＯ_４）_２、ＡｌＮＨ（ＳＯ_４）_２、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）_３、Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２、カオリンまたは炭素が挙げられる。有用な免疫刺激ポリヌクレオチドとしては、限定されないが、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を含むか、または含まないＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリアルギニンを含むか、または含まないＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリＩＣまたはポリＡＵ酸が挙げられる。毒素としては、コレラ毒素が挙げられる。サポニンとしては、限定されないが、ＱＳ２１、ＱＳ１７またはＱＳ７が挙げられる。有用な免疫刺激融合タンパク質の一例は、免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含むＩＬ−２の融合タンパク質である。有益な免疫制御分子としては、限定されないが、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ１ａリガンドが挙げられる。アジュバントとして有用なサイトカインとしては、限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＧＦ−１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびインターフェロンガンマが挙げられる。さらに、この例は、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルヌラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６８７、ノル−ＭＤＰとも呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミウル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも呼ばれる）、２％スクアレン／ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０エマルション中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、リポ多糖およびその種々の誘導体（リピドＡを含む）、完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント、Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のワックスＤ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属のメンバー中に見出される物質、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、Ｑｕｉｌ Ａ、ＡＬＵＮ、リピドＡ誘導体、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチドマトリックスまたはＧＭＤＰ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１およびＱＳ−２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリＩ：ＣおよびＧＭＣＳＦが挙げられる。Ｏｓｏｌ Ａ．編集、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、イーストン、ＰＡ、ＵＳ、１９８０、ｐｐ．１３２４−１３４１）、Ｈｕｎｔｅｒ Ｒ、ＵＳ ５，５５４，３７２およびＪａｇｅｒ Ｅ、Ｋｎｕｔｈ Ａ、ＷＯ１９９７０２８８１６を参照。アジュバント組み合わせを使用することもできる。

「ＡＩＤＳ」という用語は、本明細書で使用する場合、ＨＩＶ感染の発症期を指し、後天性免疫不全症候群（一般にＡＩＤＳとして知られる）および「ＡＲＣ」、すなわち、ＡＩＤＳに関連する合併症の両方を含む。Ａｄｌｅｒ Ｍら、Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．１９８７；２９４：１１４５−１１４７を参照。ＡＩＤＳの免疫学的徴候および臨床的徴候は、当該技術分野でよく知られており、例えば、免疫不全から生じる日和見感染および癌が挙げられる。

「アミノ酸リンカー」という用語は、本明細書で使用する場合、天然タンパク質の特定の位置に現れるアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を指し、一般的に、柔軟性を与えるか、または２個のタンパク質部分の間に構造（例えば、αらせん）を挿入するために設計される。リンカーは、スペーサーとも呼ばれる。リンカーは、典型的には非抗原性であり、本質的に任意の長さであってよい（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはこれより多いアミノ酸）。リンカーは、効力のあるＴ細胞エピトープを破壊することなく、細胞抗原を処理する機構が免疫原性ポリペプチドの分解を開始し得る位置または配列であってもよい。

「抗レトロウイルス薬耐性変異部位」という用語は、本明細書で使用する場合、変異したときに、抗レトロウイルス薬剤への耐性を与える部位に関連する。このような部位は、既知のデータベース、例えば、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＨＩＶ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅを発掘することによって特定することができ、例えば、特定の変異を有するウイルス由来の配列および治療、または選択される変異を含む単離物のための薬物感受性データを検索することができる。ＨＩＶの薬物耐性を試験するためのアッセイは、当該技術分野で知られている。Ｄｏｎｇ Ｊ、ＵＳ ２００４０１０６１３６およびＳｈａｆｅｒ Ｒ、Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＨＩＶ ＩｎＳｉｔｅ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ Ｂａｓｅ Ｃｈａｐｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖｉｎｓｉｔｅ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ＩｎＳｉｔｅ−ｐａｇｅ＝ｋｂ−０２−０２−０３，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１２）を参照。ＨＩＶのすでに知られている抗レトロウイルス薬耐性変異部位は、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎまたはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ−ＵＳＡによって定期的に公開される（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｖら、ＩＳＡ−ＵＳＡ Ｔｏｐｉｃｓ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｍｅｄ． ２０１１；１９（４）：１５３−１６４。

「細胞免疫応答」という表現は、本明細書で使用する場合、Ｔ細胞によって媒介される外来抗原に対する免疫応答およびその分泌産物を記述する。

「樹形中心（ｃｅｎｔｅｒ−ｏｆ−ｔｒｅｅ）配列」または「ＣＯＴ」という用語は、本明細書で使用する場合、関連する改変体配列の系統図のそれぞれの先端に対する平均新化距離が最小である配列を指す。Ｎｉｃｋｌｅ Ｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３；２９９、１５１５−１５１７を参照。

「至適化されたコドン」という用語は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変えることなく、宿主有機物の典型的なコドンの使用を反映し、発現を改良するための核酸分子中のコドンの改変に関連する。コドン至適化のための多くの方法およびソフトウェアツールがすでに報告されている。Ｎａｒｕｍ Ｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００１；６９（１２）：７２５０−７２５３、Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖ Ｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００２；２４（１）：１８−２４、Ｆｅｎｇ Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０００；３９（５０）：１５３９９−１５４０９およびＨｕｍｐｈｒｅｙｓ Ｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ． ２０００；２０（２）：２５２−２を参照。

「を含んでなる」または「含む」という用語は、本明細書で使用する場合、一般的に許容される特許実務に従い「からなる」も開示するものである。

「ＨＩＶ感染に関連する疾患」という表現は、本明細書で使用する場合、被検体が進行したＡＩＤＳを患っている状態を含むが、ＨＩＶに罹患した被検体が、疾患の徴候および症状をなんら示さない状態も含む。したがって、本発明のワクチンは、感染の臨床的な徴候をなんら有さない被検体に投与されると、その疾患の発生を防ぐことができるため、予防的な活性を有しているだろう。免疫原性組成物は、このような被検体で健康なＣＤ４＋Ｔ細胞の感染および破壊を予防するか、または遅らせることができる。これは、後天性免疫不全疾患の症状の発生、例えば、極端に低いＣＤ４＋Ｔ細胞数および日和見病原体（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉおよびＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）による反復感染を予防し、遅らせることも指す。有益な臨床結果または望ましい臨床結果としては、限定されないが、完全にナイーブなＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加（範囲１０〜３５２０）、全循環免疫細胞に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の割合の増加（範囲１〜５０％）、および／または感染していない被検体中の正常ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合としてのＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加（範囲１〜１６１％）が挙げられる。

「改変体」または「フラグメント」という用語は、本明細書で使用する場合、配列番号１〜１６の個々の配列番号の改変体のＮ末端またはＣ末端で１つ以上の末端アミノ酸の欠失によって、配列番号１〜１６のいずれかから誘導されるポリペプチドを指す。改変体またはフラグメントは、好ましくは、長さが、少なくとも８アミノ酸、またはそれぞれの配列番号の１０％まで、２０％まで、３０％まで、４０％まで、５０％まで、６０％まで、７０％まで、８０％まで、９０％まで、または９９％までである。

「ＨＩＶゲノム」という用語は、本明細書で使用する場合、ＨＩＶカプシドによって囲まれた約８７４９ヌクレオチド長であり、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ遺伝子、および場合によりｔｅｖ遺伝子をコードするＲＮＡ配列を指す。ＨＩＶゲノム配列は、高い多様性が根底にあり、この理由のために、本発明で言及するＨＩＶゲノムは、任意の特定の配列に限定されない。好ましい配列は、本明細書に引用するＨＩＶタイプおよびサブタイプの配列である。

「ヒト免疫不全ウイルス」または「ＨＩＶ」という用語は、本明細書で使用する場合、一般的にヒト免疫不全ウイルスを指し、１型ＨＩＶ（「ＨＩＶ−１」）、２型ＨＩＶ（「ＨＩＶ−２」）または他のＨＩＶウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２を含む）、出現するＨＩＶおよび他のＨＩＶサブタイプおよびＨＩＶ改変体、例えば、広く分布するか、または遺伝的に単離された改変体およびサル免疫不全ウイルス（「ＳＩＶ」）を含む。例えば、ＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子およびｇａｇ遺伝子、例えば、ＨＩＶ−１サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＪおよびＫおよびサブタイプ間の組み換え体、例えば、ＡＧ、ＡＧＩ、グループＭ、Ｎ、Ｏ、またはＨＩＶ−２ウイルスまたはＨＩＶ−２サブタイプＡまたはＢについて、先祖のウイルス遺伝子配列を決定することができる。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶとしては、限定されないが、細胞外ウイルス粒子およびこれらそれぞれの感染した細胞に関連するウイルスの形態が挙げられる。

「液性免疫応答」は、本明細書で使用する場合、Ｂ細胞によって産生する抗体によって媒介される外来抗原に対する免疫応答を記述する。

「免疫原性組成物」という用語は、本明細書で使用する場合、抗体を産生する免疫応答、または特定の免疫原に対し、細胞性免疫応答を励起する組成物を指す。

「免疫原性ポリペプチド」または「免疫原」という用語は、本明細書で使用する場合、それ自体が注入されるか、またはアジュバントとともに注入される場合に、獲得免疫応答（すなわち、液性免疫応答または細胞性免疫応答）を誘発することができるポリペプチド抗原を指す。

「キット」という用語は、本明細書で使用する場合、あるプロセス、方法または用途を促進する物品の組み合わせを指す。これらのキットは、本発明に記載する用途を実行するのに必要な材料を提供する。

「作動するように連結した」という用語は、本明細書で使用する場合、目的のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列を発現することができる様式で（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系、またはベクターが宿主細胞に導入されたときは宿主細胞中で）制御配列に接続していることを意味することを意図している。Ａｕｅｒ Ｈ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６；２４：４１−４３を参照。

「ペプチドタグ」または「タグ」という用語は、本明細書で使用する場合、前記免疫原の単離または精製に使用することができるペプチドまたはアミノ酸配列を指す。したがって、前記タグは、１つ以上のリガンド、例えば、アフィニティマトリックス（例えば、高い親和性を有するクロマトグラフィー保持体またはビーズ）の１つ以上のリガンドに結合することができる。タンパク質を単離または精製するのに有用なタグの非限定的な具体例としては、Ａｒｇタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨｉｓタグまたはＳｔｒｅｐタグ；抗体によって認識することが可能なエピトープ、例えば、ｃ−ｍｙｃタグ（抗ｃ−ｍｙｃ抗体によって認識される）、ＳＢＰタグ、Ｓタグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＴｒｘＡ、ＤｓｂＡまたはＡｖｉタグ；アミノ酸配列、例えば、ＡＨＧＨＲＰ（配列番号９６）、ＰＩＨＤＨＤＨＰＨＬＶＩＨＳ（配列番号９７）、またはＧＭＴＣＸＸＣ（配列番号９８）；またはβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。Ｔｅｒｐｅ Ｋら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３；６０：５２３−５２５を参照。

「医薬的に許容され得る担体」、「医薬的に許容され得る希釈剤」または「医薬的に許容され得る賦形剤」または「医薬的に許容され得るビヒクル」は、本明細書で相互に置き換え可能に使用される場合、任意の従来の種類の非毒性の固体、半固体または液体のフィラー、希釈剤、封入材料または配合助剤を指す。医薬的に許容され得る担体は、使用される投与量および濃度で、受容者に対し、本質的に非毒性であり、製剤の他の成分と適合性である。例えば、ポリペプチドを含有する製剤のための担体は、通常、酸化剤や、ポリペプチドにとって有害であることが知られている他の化合物を含まないだろう。適切な担体としては、限定されないが、水、デキストロース、グリセロール、食塩水、エタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられる。担体は、さらなる薬剤、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、または製剤の有効性を高めるアジュバントを含んでいてもよい。

「予防する」、「予防すること」、「予防」という用語は、本明細書で使用する場合、動物において疾患の開始を抑制するか、または疾患の発生を減らすことを指す。予防は、完全であってもよい（例えば、被検体中に病原細胞がまったく存在しない）。予防は、部分的であってもよく、その結果、例えば、被検体中の病原細胞の発生が、本発明を用いないときに発生すると思われるよりも少ない）。予防は、ある臨床状態に対する感受性を下げることも指す。

「分泌シグナルペプチド」という用語は、機能を発揮する細胞位置に到達するために膜を通過しなければならない高度に疎水性のアミノ酸配列（例えば、好ましくは、１５〜６０アミノ酸長）のタンパク質を指す。シグナル認識粒子に結合することによって、これらの配列は、翻訳中にタンパク質が挿入される膜に対する初期のタンパク質−リボソーム複合体を命令する。シグナルペプチドは、種々の膜（例えば、小胞体、ミトコンドリア、葉緑体、ペルオキシソーム）によるタンパク質の翻訳時取り込みを命令する。非膜タンパク質のリーダーシグナル配列は、最終的に、特定のペプチダーゼによって除去される。使用されるある種のシグナルペプチドとしては、抗原提示細胞の分泌および吸引を促進するためのＭＣＰ−３ケモカイン；プロテアソーム分解を増やすためのカテニン（ＣＡＴＥ）から誘導されるペプチド；およびＭＨＣ ＩＩコンパートメントを標的とするための、リソソームに関連するタンパク質ＬＡＭＰ１が挙げられる。Ｒｏｓａｔｉ Ｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００９；１０６：１５８３１−１５８３６を参照。

「連続投与」という表現は、本明細書で使用する場合、投与が同時ではないが、第１の投与が行われた後、１つ以上の連続した投与が行われることを意味する。

「免疫原性ポリペプチドの免疫学的能力を実質的に維持する」という表現は、本明細書で使用する場合、改変体が、それ自体が投入された場合、またはアジュバントとともに投入された場合に、獲得免疫応答（すなわち、液性免疫応答または細胞性免疫応答）を誘発するための免疫原性ポリペプチドの能力の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％を示すことを意味する。

「治療する」または「治療」という用語は、本明細書で使用する場合、臨床的な徴候が現れる前または現れた後に疾患の進行を制御するための本発明の免疫原性組成物またはこれを含有する医薬の投与を指す。疾患の進行の制御は、限定されないが、症状の低減、疾患持続期間の短縮、病的な状態の安定化（具体的には、さらなる悪化を避ける）、疾患の進行を遅らせること、病的な状態を改善すること、および緩解（部分的または全体的の両方）を含む有益な臨床結果または望ましい臨床結果を意味すると理解される。疾患の進行の制御は、治療が行われなかった場合に予想される生存と比較して、生存期間が延びることも含む。

「ワクチン」という用語は、本明細書で使用する場合、免疫記憶を含む獲得免疫応答を誘発することによって、特定の疾患に対する免疫を確立するか、または高める物質または組成物を指す。ワクチンは、典型的には、疾患を引き起こす微生物またはその一部（例えば、ポリペプチド）に似せた薬剤を含む。ワクチンは、予防用であってもよく、または治療用であってもよい。

「改変体」という用語は、本明細書で使用する場合、置換（好ましくは、１つ以上のアミノ酸に行う保存的置換、挿入または非末端欠失を含む）を含む改変または変異によって、配列番号１〜１６のいずれかから誘導され、免疫原性ポリペプチドの免疫原性能を実質的に保持するすべてのアミノ酸配列を指す。

「ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、目的の宿主細胞中で、または目的の発現カセットでの自律複製を与えるさらなるセグメントに作動するように連結した目的の核酸のセグメントを含む直鎖または環状の核酸分子を指す。

２．本発明の免疫原性ポリペプチド
第１の態様では、本発明は、配列番号１〜１６の配列を含むアミノ酸配列または前記配列番号１〜１６の改変体を含み、前記改変体はそれぞれ、長さが少なくとも８アミノ酸であり、但し、前記アミノ酸配列は、配列番号１〜１６またはその改変体のいずれかのアミノ酸配列以外の長さが８アミノ酸以上のＨＩＶゲノムから誘導される配列を含まない、免疫原性ペプチドに関する。

特定の実施形態では、第１の態様の免疫原性ポリペプチドは、配列番号４９を含むアミノ酸配列を有する。

第２の態様では、本発明は、配列番号１〜１６またはその改変体またはそのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１種類の配列を含むアミノ酸配列を有する免疫原性ポリペプチドに関し、前記フラグメントは、長さが少なくとも８アミノ酸であり、但し、
（ｉ）前記アミノ酸配列は、配列番号１〜１６またはその改変体またはそのフラグメントのいずれかのアミノ酸配列以外、ＨＩＶゲノムから誘導される長さが８アミノ酸以上の配列を含まず、
（ｉｉ）免疫原が、配列番号１〜１６からなる群から選択される１つの配列のみを含む場合、この配列は、配列番号３、５、６および１６からなる群から選択されない。

好ましくは、第１の態様および第２の態様の改変体は、その関連する配列と等価であり、異なるＨＩＶ株から誘導されるか、または人工ＨＩＶ配列である。この観点での等価とは、１つ以上のアミノ酸残基が異なるが、同じ配列に対応することを意味する（例えば、ゲノムの位置または配列類似性によって決定される）。言い換えると、好ましい実施形態では、改変体は、「天然で発生する改変体」であり、天然で発生する改変体は、現在または過去の循環ウイルスのＨＩＶゲノムから誘導される核酸配列を指し、既存のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＬｏｓ Ａｌａｍｏｓ配列データベース）から特定することができる。循環ウイルスの配列は、分子生物学的方法によって決定することもできる。Ｂｒｏｗｎ Ｔ、「Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＧＢ、１９９５）；Ｗａｔｓｏｎ Ｒら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、第２版（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳ、１９９２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳ、１９８９）を参照。好ましくは、配列番号１〜１６のいずれかの改変体は、アミノ酸配列同一性が、その対応物（すなわち、配列番号１〜１６）に対し、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である。配列同一性および配列類似性の割合を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９７７；２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０；２１５：４０３−４１０を参照。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＢＬＡＳＴ ２．０プログラムを使用し、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性の割合を決定することができる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公的に入手可能である。ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１２を参照。

改変体は、１つ以上の修飾アミノ酸残基（例えば、置換基の接続によって修飾される残基）、または１つ以上の非天然アミノ酸（例えば、βアミノ酸）も含んでいてもよい。

細胞応答の程度を決定する方法は、当該技術分野で知られている。Ａｇに応答するＴ細胞の刺激を評価するのに適した任意の方法を使用することができる。以下に記載する手順は、数例の適切な方法を与える。

（１）酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）：前培養した非付着性細胞を、望ましい抗サイトカイン捕捉抗体（Ａｂ；例えば、抗ＩＦＮ、−ＩＬ−１０、−ＩＬ−２、−ＩＬ−４）でコーティングしたプレートに移す。ビオチン化二次Ａｂおよび標準的な比色分析法または蛍光検出法、例えば、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよびＮＢＴ−ＢＣＩＰを用い、曝露を行ない、スポットを計測する。ここで、ＥＬＩＳｐｏｔの読みは、入れた細胞（１０^６）あたり、スポットを形成する細胞（ＳＦＣ）としてあらわされる。

（２）上清サイトカインアッセイ：培養上清中に放出されたサイトカインを、異なる技術、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＢＤサイトメトリービーズアレイ、Ｂｉｏｒａｄ Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘアッセイなどによって測定する。

（３）ＨＬＡクラスＩテトラマー：この手順を用い、市販の試薬（例えば、ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｄｅｘａｍｅｒｓ、Ｉｍｍｕｄｅｘ、コペンハーゲン、ＤＫ）を用いるか、または社内で作成した試薬（例えば、Ｎｏｖａｋ Ｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９９；１０４：Ｒ６３−Ｒ６７）を用い、特定のペプチドエピトープを認識するＡｇ反応性Ｔ細胞を検出する。

（４）ＨＬＡクラスＩＩテトラマー：この手順を用い、市販の試薬（例えば、ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｕｌｔｉｍｅｒｓ^ＴＭ、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ Ｌｔｄ、オックスフォード、ＧＢ）を用いるか、または社内で作成した試薬（例えば、Ｎｏｖａｋ、１９９１、前出）を用い、特定のペプチドエピトープを認識するＡｇ反応性Ｔ細胞を検出する。

（５）活性化マーカー（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ１３７）の上方制御：この手順を用い、Ａｇ特異的なＴ細胞応答を、Ａｇ認識後に膜の上に露出する活性化マーカーの異なる発現によって検出する。

（６）サイトカイン捕捉アッセイ：このシステムは、Ａｇ特異的なＴ細胞をそのサイトカイン応答にしたがって視覚化する、ＥＬＩＳｐｏｔの有効な代替法である（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、ベルギッシュグラートバハ、ＤＥ）。それに加え、目的のＴ細胞のダイレクトソーティングおよびクローニングを可能にする。

（７）ＣＤ１５４アッセイ：この手順は、Ａｇ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の検出に限定される。Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ Ｐら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００５；１１：１１１３−１１１１７およびＦｒｅｎｔｓｃｈ Ｍら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００５；１１：１１１８−１１２４を参照。

（８）ＣＤ１０７アッセイ：この手順によって、細胞毒性能を有するＡｇ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の視覚化を可能にする。Ｂｅｔｔｓ Ｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００３；２８１：６５−７８を参照。

（９）ＣＦＳＥ希釈アッセイ：この手順は、Ａｇ認識後の増殖にしたがって、Ａｇ特異的なＴ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）を検出する。Ｍａｎｎｅｒｉｎｇ Ｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００３；２８３：１７３−１８３を参照。

改変体の液性応答の程度を決定する方法は、当該技術分野で知られている。Ａｇに応答したＴ細胞の刺激を評価するのに適した任意の方法を使用することができる。適切な方法の例としては、限定されないが、抗体の相対量を検出するか、または定量することが挙げられ、これによって、未処理の被検体中の抗体の量に対し、免疫原性ポリペプチドまたは改変体で処理された被検体の血清中の抗原性薬剤または免疫原性薬剤を特異的に認識する。抗体価は、標準的なアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、一元放射免疫拡散アッセイ（ＳＲＩＤ）、または酵素免疫アッセイ（ＥＴＡ）を用いて決定することができる。

好ましい実施形態では、配列番号１〜１６のいずれかの改変体は、この配列のフラグメントである。

具体的な実施形態では、ＨＩＶ−１サブタイプＢまたはＣのｅｎｖ遺伝子、またはサブタイプＢまたはＣのｇａｇ遺伝子について、先祖のウイルス配列が決定される。他の実施形態では、他のＨＩＶ遺伝子またはポリペプチド、例えば、ｐｏｌまたは補助遺伝子またはポリペプチドについて、先祖のウイルス配列が決定される。さらに別の実施形態では、コンセンサス技術または樹形中心技術によって、ウイルス配列が決定される。

好ましい実施形態では、ＨＩＶは、ＭグループのＨＩＶである。Ｍグループは、主な循環ＨＩＶ−１グループである。Ｍグループは、文字で示されるサブタイプと、数字で示される副次的なサブタイプを用いて分類されている。サブタイプＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ、Ｈ、ＪおよびＫが、現時点で認識されている。ＨＩＶ−１サブタイプ（クレードとも呼ばれる）は、互いにほぼ同じ遺伝的距離であるＨＩＶ−１の系統発生的に関係がある株であり、ある場合には、サブタイプは、地理的または疫学的にも関係がある。サブタイプ内の遺伝的多様性は、１５〜２０％またはそれより多くてもよく、一方、サブタイプと、同じサブタイプの多様なメンバーとの多様性は、通常は、２５〜３５％である。ＨＩＶの全ゲノム配列の進化によって、循環する固有の組み換え形態（それぞれＣＲＦおよびＵＲＦ）が特定される。これらは、重感染したヒトの中でのサブタイプ間の組み換えの結果であり、次いで、これらから組み換え形態が他のヒトに移動する。組み換え後代は、直接的な疫学的関係のない３人以上のヒトで特定される場合、循環組み換え形態であると分類され、そのように分類されなければ、これらは、固有の組み換え形態であると記載される。

一実施形態では、この免疫原は、配列番号１〜１６またはその改変体からなる群から選択される少なくとも１種類の配列を含むアミノ酸配列を有し、但し、（ｉｉ）免疫原が、配列番号１〜１６からなる群から選択される１個の配列のみを含む場合、この配列は、配列番号１〜１６からなる群から選択されない。

好ましい実施形態では、この免疫原は、配列番号１〜１６またはその改変体からなる群から選択される少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個の配列を含み、但し、（ｉｉ）免疫原が、配列番号１〜１６からなる群から選択される２個、３個、または４個の配列を含む場合、これらの配列すべてが、配列番号３、５、６および１６からなる群から選択されない。別の実施形態では、この免疫原は、配列番号１〜１６またはその改変体からなる群から選択される少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の配列を含むアミノ酸配列を有し、但し、（ｉｉ）免疫原が、配列番号１〜１６からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の配列を含む場合、これらの配列すべてが、配列番号１〜１６からなる群から選択されない。

好ましい実施形態では、第１の態様の免疫原は、配列番号１〜１６の配列またはその改変体を１−１６の順序で含む。

一実施形態では、本発明は、少なくとも２個の配列がアミノ酸リンカーによって接合する第１の態様の免疫原に関する。

別の実施形態では、本発明は、免疫原が配列番号１〜１６またはその改変体からなる群から選択される少なくとも２個の配列を含む場合、この配列がアミノ酸リンカーによって接合する、第２の態様の免疫原に関する。

第１の態様および第２の態様両方の免疫原の好ましい実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列Ａ、ＡＡまたはＡＡＡを含む。別の実施形態では、リンカーに対してＮ末端に位置する配列のＣ末端の残基、またはＣ末端に位置する配列のＮ末端の残基がアラニン残基である場合、ＡＡＡ配列が、結合する配列の間の連結領域に形成されるため、リンカーを短くすることができる。したがって、好ましい実施形態では、リンカーに対してＮ末端に位置する配列のＣ末端の残基がアラニンである場合、またはリンカーに対してＣ末端に位置する配列のＮ末端の残基がアラニンである場合、リンカーは、配列ＡＡを有する。別の実施形態では、リンカーに対してＮ末端に位置する配列のＣ末端の残基と、リンカーに対してＣ末端に位置する配列のＮ末端の残基が両方ともアラニンである場合、リンカーは、配列Ａを有する。

別の実施形態では、この免疫原は、さらに、Ｎ末端に分泌シグナルペプチドを含み、このシグナルペプチドは、好ましくは、免疫原を発現する細胞からの免疫原の分泌を高める。好ましい分泌シグナルペプチドは、ＧＭＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）から誘導され、好ましくは、その後、安定性を高めるためのバリンから誘導される。ＧＭＣＳＦシグナルペプチドの配列は、好ましくは、ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号４６）またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＶ（配列番号４７）である。

別の実施形態では、この免疫原は、さらに、場合によりペプチドタグを含む。ペプチドタグは、シグナルペプチドと免疫原性ポリペプチドとの間のＮ末端に位置していてもよく、または、好ましくは、終止コドンの前に、Ｃ末端に位置していてもよい。

好ましくは、前記タグは、ＦＬＡＧペプチドである。ＦＬＡＧ系は、目的の組み替えタンパク質に融合した短い親水性８アミノ酸ペプチドを利用する。ＦＬＡＧペプチドは、数種類のきわめて特異的な抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、セントルイス、ＭＯ、ＵＳ）のための結合部位を含み、これを利用し、トランスフェクトした細胞に由来する材料での目的のタンパク質の発現を評価することができる。ＦＬＡＧペプチドタグが小さいため、他のエピトープ、ドメインを覆わず、または一般的に、融合タンパク質の機能、分泌および輸送を変えない。好ましくは、このＦＬＡＧペプチドは、配列ＤＹＫＤＤＤＤＫＬ（配列番号４８）を有する。

好ましい実施形態では、前記タグは、免疫原の発現分析および精製だけのためにあり、これを用いて免疫応答を誘発する前に除去される。

別の実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が、少なくとも１種類の抗レトロウイルス薬耐性変異部位を含む免疫原に関する。

ウイルスゲノム内の任意の部位で変異が起こってもよい。好ましくは、インテグラーゼ、プロテアーゼまたは逆転写酵素の遺伝子をコードする領域で変異が起こる。

インテグラーゼ阻害剤への耐性を与えるインテグラーゼ内の変異としては、限定されないが、配列番号１内のＴ６６、Ｅ９２、Ｆ１２１、Ｅ１３８、Ｇ１４０、Ｙ１４３、Ｓ１４７、Ｑ１４８、Ｓ１５３、Ｎ１５５、Ｅ１５７およびＲ２６３、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましい実施形態では、変異は、インテグラーゼタンパク質内のＥ９２Ｑ、Ｇ １４０Ｓ、Ｇ １４０ＡおよびＹ１４３Ｒといった変異、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。

プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）耐性に関連するプロテアーゼ内の変異としては、主要なプロテアーゼ、補助的なプロテアーゼおよびプロテアーゼ開裂部位の変異が挙げられる。Ｓｈａｆｅｒ Ｒら、ＡＩＤＳ Ｒｅｖ．２００８；１０（２）：６７−８４を参照。１７種類の主に多型ではない位置は、ほとんどの臨床的な重要性を有し、Ｌ２３１、Ｌ２４１、Ｄ３０Ｎ、Ｖ３２１、Ｌ３３Ｆ、Ｍ４６１／Ｌ、１４７／Ｖ／Ａ、Ｇ４８Ｖ／Ｍ、１５０Ｌ／Ｖ、Ｆ５３Ｌ、１５４Ｖ／Ｔ／Ａ／Ｌ／Ｍ、Ｇ７３Ｓ／Ｔ、Ｌ７６Ｖ、Ｖ８２Ａ／Ｔ／Ｆ／Ｓ、１８４Ｖ／Ａ／Ｃ、Ｎ８８Ｄ／Ｓ、Ｌ９０Ｍを含む。補助的なプロテアーゼの変異としては、多型変異Ｌ１０１／Ｖ、１１３Ｖ、Ｋ２０Ｒ／Ｍ／Ｉ、Ｍ３６Ｉ、Ｄ６０Ｅ、Ｉ６２Ｖ、Ｌ６３Ｐ、Ａ７１Ｖ／Ｔ、Ｖ７７Ｉおよび１９３Ｌおよび非多型変異Ｌ１０Ｆ／Ｒ、Ｖ１１１、Ｅ３４Ｑ、Ｅ３５Ｇ、Ｋ４３Ｔ、Ｋ４５Ｉ、Ｋ５５Ｒ、Ｑ５８Ｅ、Ａ７１Ｉ／Ｌ、Ｔ７４Ｐ／Ａ／Ｓ、Ｖ７５１、Ｎ８３Ｄ、Ｐ７９Ａ／Ｓ、１８５Ｖ、Ｌ８９Ｖ、Ｔ９１ Ｓ、Ｑ９２ＫおよびＣ９５Ｆが挙げられる。

別の実施形態では、抗レトロウイルス薬耐性変異部位が逆転写酵素内に位置しており、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）または非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）への耐性が生じる。ＮＲＴＩ耐性変異としては、Ｍ１８４Ｖ、チミジン類似体変異（ＴＡＭ）、チミジン類似体を用いないレジメンによって選択される変異（非ＴＡＭ）および複数のヌクレオシド耐性変異（複数のＮＲＴＩ変異）および多くの近年記載された非多型の補助的な変異が挙げられる。結局、Ｍ１８４Ｖ、非チミジン類似体に関連する変異、例えば、Ｋ６５ＲおよびＬ７４Ｖ、および複数のヌクレオシド耐性変異Ｑ１５１Ｍが、ＮＲＴＩ組み込みを減らすことによって作用する。チミジン類似体変異、複数のヌクレオシド耐性に関連するＴ６９挿入、および補助的な変異の多くは、プライマーの抑制解除を促進する。Ｓｈａｆｅｒ、２０００８（前出）を参照。Ｍ１８４Ｖは、最も一般的に発生するＮＲＴＩ耐性変異である。最も一般的な薬物耐性アミノ酸変異は、Ｍ４１Ｌ、Ｄ６７Ｎ、Ｋ７０Ｒ、Ｌ２１０Ｗ、Ｔ２１５Ｙ／ＦおよびＫ２１９ＱＥである。ＮＲＴＩ骨格を含む非チミジン類似体（非ＴＡＭ）を受け入れつつ、ウイルス学的応答の欠如が認められる患者で最も一般的な変異としては、Ｍ１８４Ｖ単独、またはＫ６５ＲまたはＬ７４Ｖと組み合わせたＭ１８４Ｖが挙げられる。他の非ＴＡＭ変異としては、Ｋ６５Ｎ、Ｋ７０Ｅ／Ｇ、Ｌ７４１、Ｖ７５Ｔ／Ｍ、Ｙ１１５Ｆが挙げられる。コドン６９でのアミノ酸挿入は、一般的に、複数のＴＡＭ存在下で起こり、この設定で、３ＴＣおよびＦＴＣに対する中程度の耐性および残ったＮＲＴＩそれぞれに対する高レベルの耐性に関連する。Ｑ１５１ Ｍは、通常は、Ａ６２Ｖ、Ｖ７５１、Ｆ７７ＬおよびＦ１１６Ｙの２つ以上の変異を伴う２ｂｐ変異（ＣＡＧ．ｆｗｄａｒｗ．ＡＴＧ）である。Ｑ１５１Ｍ複合体は、ＺＤＶ、ｄ４Ｔ、ｄｄＩおよびＡＢＣに対する高レベルの耐性、およびＴＤＦ、３ＴＣおよびＦＴＣに対する中程度の耐性を引き起こす。Ｓｈａｆｅｒ Ｒら、ＡＩＤＳ Ｒｅｖ．２００８；１０（２）：６７−８４を参照。

ＮＮＴＲＩ耐性変異としては、限定されないが、一次ＮＮＲＴＩ耐性変異（Ｋ１０３Ｎ／Ｓ、Ｖ１０６Ａ／Ｍ、Ｙ１８１Ｃ／Ｉ／Ｖ、Ｙ１８８Ｌ／Ｃ／ＨおよびＧ１９０Ａ／Ｓ／Ｅ）、ＮＮＲＴＩ耐性二次変異（Ｌ１００１、Ｋ１０１Ｐ、Ｐ２２５Ｈ、Ｆ２２７Ｌ、Ｍ２３０ＬおよびＫ２３８Ｔ）および変異率（Ｖ１７９Ｆ、Ｆ２２７ＣおよびＬ２３４１）が挙げられる。

少数の非多型変異（Ａ９８Ｇ、Ｋ１０１ Ｅ、Ｖ １０８１およびＶ １７９Ｄ／Ｅ）は、ネビラピンおよびエファビレンツに対する感受性を約２〜５倍下げる一般的なＮＮＲＴＩ耐性変異である。

雑多な非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤耐性変異、例えば、Ｋ１０１Ｑ、１１３５Ｔ／Ｍ、Ｖ１７９１およびＬ２８３１は、ネビラピンおよびエファビレンツに対する感受性を約２倍下げ、一次ＮＮＲＴＩ耐性変異と相乗的に作用してもよい。他の変異、例えば、Ｌ７４Ｖ、Ｈ２２１Ｙ、Ｋ２２３Ｅ／Ｑ、Ｌ２２８Ｈ／ＲおよびＮ３４８１は、主にＮＲＴＩによって選択され、これらはＮＮＲＴＩ感受性もわずかに低下させる。

好ましくは、この抗レトロウイルス薬耐性変異部位は、配列番号９〜１１のいずれかに位置する。さらに好ましくは、この抗レトロウイルス薬耐性変異部位は、配列番号９のアミノ酸残基８であり、アミノ酸Ｌｅｕは、アミノ酸Ｍｅｔに置換されている。

別の実施形態では、改変体またはフラグメントは、長さが８〜４０アミノ酸、さらに好ましくは、長さが１１〜２７アミノ酸である。好ましくは、前記改変体またはフラグメントは、配列番号１〜１６のいずれかに接合するアミノ酸リンカーを含まない。さらに、改変体またはフラグメントのＣ−末端アミノ酸が、Ｇ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、ＳまたはＣのいずれでもないことが好ましい。これらの残基が、一般的にＨＬＡクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープのＣ末端結合部を形成しないためである。

最も好ましい実施形態では、前記改変体またはフラグメントは、配列番号１７〜４５のペプチドからなる群から選択される。

さらに、前記改変体またはフラグメントを熱ショックタンパク質と合わせるか、または熱ショックタンパク質に融合することが想定される。本発明は、さらに、前記改変体またはフラグメントと熱ショックタンパク質とを含む融合タンパク質に関する。好ましい熱ショックタンパク質は、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ２０、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、またはＨｓｐ１００である。

別の実施形態では、改変体またはフラグメントは、第１の態様および第２の態様の改変体またはフラグメントである。好ましくは、前記改変体およびフラグメントは、配列番号１〜１６のいずれかに接合するアミノ酸リンカーを含まない。さらに、改変体またはフラグメントのＣ−末端アミノ酸が、Ｇ、Ｐ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、ＳおよびＣのいずれでもないことが好ましい。これらの残基が、一般的にＨＬＡクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープのＣ末端結合部を形成しないためである。

最も好ましい実施形態では、前記改変体またはフラグメントは、配列番号１７〜４５のペプチドからなる群から選択される。

さらに、前記改変体またはフラグメントを熱ショックタンパク質と合わせるか、または熱ショックタンパク質に融合することが想定される。本発明は、さらに、前記改変体またはフラグメントと熱ショックタンパク質とを含む融合タンパク質に関する。好ましい熱ショックタンパク質は、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ２０、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、またはＨｓｐ１００である。

３．本発明の核酸、ベクター、ウイルスおよび細胞
第３の態様では、本発明は、第１の態様の免疫原をコードする核酸、およびこの核酸を含む発現カセット、ベクター、ウイルスおよび細胞に関する。

好ましくは、この核酸は、ポリヌクレオチドであり、ヌクレオチドモノマーの一本鎖または二本鎖のポリマー（核酸）を指し、限定されないが、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合によって連結した２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む。本発明のポリヌクレオチドは、ＨＩＶゲノムのさらなる領域を実質的に含まずに、本発明の免疫原をコードする。

一実施形態では、前記核酸は、至適化されたコドンである。好ましい実施形態では、核酸は、ヒトでの発現のために至適化されたコドンである。本発明で使用するためのコドンが至適化された核酸を、免疫原をコードする核酸のコドンを「ヒト化」コドンと置き換えることによって調製することができる（すなわち、コドンは、非常に多く発現するヒト遺伝子で頻繁に見られるコドンである）。Ａｎｄｒｅ Ｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８；７２：１４９７−１５０３を参照。好ましい実施形態では、前記コドンが至適化された核酸は、配列番号５０の配列を有する。

第３の態様の核酸は、ベクターに結合するために、制限酵素を用いた切断が必要になる場合がある。この手順は、種々の末端ヌクレオチド（例えば、１、２または３）の除去を伴ってもよい。このように、一実施形態では、本発明は、それぞれの末端が制限酵素で切断された核酸に関する。

別の実施形態では、本発明は、第３の態様の核酸、プロモーター配列および３’−ＵＴＲおよび場合により選択マーカーを含む発現カセットに関する。好ましくは、プロモーター配列は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列または初期−後期ｐ７．５プロモーター配列である。好ましくは、３’−ＵＴＲは、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ−Ａである。任意要素の選択マーカーは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子（例えば、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン）である。

さらに別の実施形態では、本発明は、第３の態様の核酸または発現カセットを含む発現ベクターに関する。

一実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。したがって、本発明の適切なベクターとしては、原核生物ベクター、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドおよびその誘導体、例えばｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲｌおよびＲＰ４プラスミド；ファージおよびシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８ベクター；酵母中の発現ベクター、例えば、２−ミクロンプラスミド型ベクター；組み込みプラスミド；ＹＥＰベクター；動原体プラスミドおよび類似体；昆虫細胞中の発現ベクター、例えば、ｐＡＣ群のベクター、ｐＶＬ群のベクター；植物中の発現ベクター、例えば、ｐＩＢＩのベクター、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥ群および類似体；およびウイルスベクターに由来する高等真核細胞中の発現ベクター（例えば、ＭＶＡ、アデノウイルス、アデノウイルスに随伴するウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルス）、および非ウイルス性ベクターに由来する高等真核細胞中の発現ベクター、例えば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴｌのベクターが挙げられる。

特定の実施形態では、発現ベクターは、哺乳動物のプロモーターとポリアデニル化部位とを含む哺乳動物の発現ベクターである。好ましくは、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。好ましくは、ポリアデニル化部位は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位である。微生物中のベクター複製を最適化するために、哺乳動物の発現ベクターを改変してもよい。哺乳動物の発現ベクターは、選択遺伝子、例えば、抗生物質への耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでいてもよい。特定の実施形態では、哺乳動物の発現ベクターは、カナマイシン耐性遺伝子を含む。

他の特定の実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター、好ましくは、修飾ワクチンアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスベクターである。

別の実施形態では、本発明は、第３の態様の核酸を含むウイルスに関する。適切なウイルスは、安全であり、毒性が低く、遺伝的に安定である。非限定例は、レトロウイルス、特に、ポックスウイルス、例えば、ＭＶＡ、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。

さらに特定の好ましい実施形態では、本発明は、本発明の免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子構築物に含まれる組み換え修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関連する。修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスは、ポックスウイルス科のファミリーであるオルソポックスウイルス属のメンバーであるワクシニアウイルスに関する。ＭＶＡは、ワクシニアウイルスのアンカラ株のニワトリ胚線維芽細胞（ＣＶＡ）に対し、５１６回連続した継代によって作られた。Ｍａｙｒ Ａら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ １９７５；３：６−１４およびＳｕｔｔｅｒ Ｇら、ＵＳ ６，４４０，４２２およびＣＨ ５６８，３９２を参照。ＭＶＡウイルスは、公的に入手可能である（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１５０８）。ＭＶＡは、良好な免疫原性と、トリ細胞で感染性ビリオンを複製し、産生する完全な能力を維持しつつ、弱毒化（例えば、病原性が低下し、および特定の哺乳動物細胞の感染性ビリオンを再生する能力が制限されている）によって区別される。適切なＭＶＡ株としては、（ｉ）ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）でのｉｎ ｖｉｔｒｏでの再生的複製の能力を有するが、ヒト角化細胞株ＨａＣａＴ、ヒト胚腎細胞株２９３、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂおよびヒト子宮頸部腺癌細胞ＨｅＬａのようなヒト細胞株での増殖的複製の能力がなく、（ｉｉ）成熟したＢ細胞およびＴ細胞を産生することができず、免疫が酷く傷つけられ、複製ウイルスへの感受性が高いマウスモデルで複製がうまくいかず、（ｉｉｉ）ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブースト法と比較したとき、ワクシニアウイルスのプライム／ワクシニアウイルスのブースト法で、少なくとも同じレベルの特定の免疫応答を誘発することに起因して、安全性が高められた株が挙げられる。ＭＶＡ−ＢＮと呼ばれる株の適切に弱毒化されたＭＶＡ株。Ｃｈａｐｌｉｎ Ｐら、ＷＯ２００２０４２４８０、ＥＣＡＣＣ受託番号Ｖ０００８３００８を参照。

別の実施形態では、本発明は、第３の態様の核酸、発現カセット、発現ベクターまたはウイルスを含む細胞に関する。使用される細胞は、真核細胞および原核生物細胞を含め、任意の細胞型であってもよい。好ましくは、細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。哺乳動物細胞の好ましい例は、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞または患者（例えば、ＨＩＶ患者）から単離した細胞である。

４．本発明による組成物

第４の態様では、本発明は、第１の態様および第２の態様の改変体またはフラグメントと、熱ショックタンパク質とを含む組成物に関する。免疫原性組成物を、例えば、注射可能な、例えば液体の溶液、懸濁物およびエマルションとして調製することができる。好ましい熱ショックタンパク質は、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ２０、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、ｇｐ９６またはＨｓｐ１００である。

さらに、本発明は、本発明の免疫原、核酸、発現カセット、ベクターまたは細胞、または第４の態様の組成物と、医薬的に許容され得る担体とを含む医薬組成物に関する。一実施形態では、前記医薬組成物および第４の態様の組成物を、以下に説明されるように、ワクチンとして使用してもよい。

５．本発明のワクチン
別の態様では、本発明は、第１の態様および第２の態様の免疫原、第３の態様の核酸、発現カセット、発現ベクター、ウイルスまたは細胞、または第４の態様の組成物を含むワクチンに関する。

好ましい実施形態では、前記ワクチンは、細胞性応答および液性応答を作り出すことが可能である。さらに好ましくは、ワクチンは、細胞毒性のＴ細胞応答を作り出す。細胞毒性Ｔ細胞または細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイを使用し、同族および異種のＨＩＶ株に対するウイルス配列を用いたサブゲノム免疫接種の後に、細胞性免疫応答を監視することができる。Ｂｕｒｋｅ Ｓら、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１９９４；１７０：１１１０−１１１９およびＴｉｇｇｅｓ Ｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６；１５６：３９０１−３９１０を参照。Ｔ細胞応答を検出するために用いられる従来のアッセイとしては、例えば、増殖アッセイ、リンホカイン分泌アッセイ、直接的な細胞毒性アッセイおよび限界希釈アッセイが挙げられる。例えば、ペプチドとともにインキュベートされた抗原提示細胞を、応答細胞のＣＴＬ応答を誘発する能力についてアッセイすることができる。抗原提示細胞は、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）または樹状細胞（ＤＣ）のような細胞であってもよい。または、内部で処理されたペプチドを含むＭＨＣクラスＩ分子を保持する能力が不足しており、適切なヒトＭＨＣクラスＩ遺伝子でトランスフェクトされた変異非ヒト哺乳動物細胞株を用い、目的のペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏで一次ＣＴＬ応答を誘発する能力を試験することができる。ＰＢＭＣをＣＴＬ前駆体の応答細胞源として使用することができる。適切な抗原提示細胞をペプチドとともにインキュベートし、その後に、タンパク質が保持された抗原提示細胞を、最適化された培養状件で応答細胞とともにインキュベートする。放射線標識された目的のＴ細胞を殺すＣＴＬの存在について、培養物をアッセイすることによって、特異的なペプチドを定期的に発する標的と、ペプチド配列が誘導される内部で処理された形態の抗原を発現する標的Ｔ細胞の両方について、陽性のＣＴＬ活性化を決定することができる。例えば、標的細胞を、^５１Ｃｒで放射性標識してもよく、標的細胞から放出された放射性活性から、細胞毒性活性を計算することができる。別の適切な方法によって、フルオレセイン標識したＨＬＡテトラマー複合体で染色することによって、抗原特異的なＴ細胞を直接定量することができる。Ａｌｔｍａｎ Ｊら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３；９０：１０３３０−１０３３４およびＡｌｔｍａｎ Ｊら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６；２７４：９４−９６を参照。他の比較的最近の技術の進歩は、細胞内リンホカインの染色およびインターフェロンの放出アッセイまたはＥＬＩＳｐｏｔアッセイを含む。

一つの実施形態では、第４の態様のワクチンは、さらに、１つ以上のアジュバントまたは熱ショックタンパク質を含む。

アジュバントは、上述のように定義される。好ましい熱ショックタンパク質は、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ２０、Ｈｓｐ３０、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、ｇｐ９６、またはＨｓｐ１００である。

６．治療方法
好ましい実施形態では、本発明の免疫原性ポリペプチド、本発明の核酸、本発明の発現カセット、本発明の発現ベクター、本発明のウイルス、本発明の細胞、または本発明のワクチンを、ＨＩＶ感染またはＨＩＶ感染に関連する疾患の予防または治療に使用することができる。

したがって、別の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染またはＨＩＶ感染に関連する疾患の予防または治療に使用するための本発明の免疫原性ポリペプチド、本発明の核酸、本発明の発現カセット、本発明の発現ベクター、本発明のウイルス、本発明の細胞、または本発明のワクチンに関する。

別の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染またはＨＩＶ感染に関連する疾患を予防または治療するための医薬の製造のための本発明の免疫原性ポリペプチド、本発明の核酸、本発明の発現カセット、本発明の発現ベクター、本発明のウイルス、本発明の細胞、または本発明のワクチンの使用に関する。

別の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染またはＨＩＶ感染に関連する疾患を予防または治療するための医薬の製造のための本発明の免疫原性ポリペプチド、本発明の核酸、本発明の発現カセット、本発明の発現ベクター、本発明のウイルス、本発明の細胞、または本発明のワクチンを被検体に投与することを含む、これが必要な被検体のＨＩＶ感染またはＨＩＶ感染に関連する疾患を予防または治療するための方法に関する。

特定の実施形態では、本発明で使用するための免疫原性ペプチド、核酸、発現カセット、発現ベクター、ウイルス、細胞またはワクチンは、
（ｉ）第一の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の核酸、請求項１５に記載の発現カセット、請求項１６に記載の発現ベクター、請求項１７〜１８のいずれか一項に記載のウイルス、請求項１９に記載の細胞、または請求項２０に記載のワクチンと、
（ｉｉ）第２の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の核酸、請求項１５に記載の発現カセット、請求項１６に記載の発現ベクター、請求項１７〜１８のいずれか一項に記載のウイルス、請求項１９に記載の細胞、または請求項２０に記載のワクチン
の連続投与を含んでなる。

特定の実施形態では、第１の免疫原性ペプチド、核酸、発現カセット、発現ベクター、ウイルス、細胞またはワクチンは、第２の免疫原性ペプチド、核酸、発現カセット、発現ベクター、ウイルス、細胞またはワクチンとは異なる。好ましくは、まず、本発明の発現ベクターを投与した後、本発明の改質ワクシニアアンカラウイルスを投与する。

特定の実施形態では、本発明の第１の発現ベクターを少なくとも２回、好ましくは、少なくとも３回投与する。

ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳ症状に関連するワクチンの有益な予防効果または治療効果としては、例えば、ＨＩＶにさらされた個体の初期感染を予防するか、または遅らせること；ＨＩＶに感染した個体のウイルス負荷を下げること；ＨＩＶ感染の発症期を延ばすこと；抗レトロウイルス治療（ＡＲＴ）によってウイルスレベルが低下した、ＨＩＶに感染した患者のウイルス負荷を低い状態に維持すること；薬物を投与していない患者およびＡＲＴで治療した患者において、ＨＩＶ−１に特異的および非特異的の両方のＣＤ４ Ｔ細胞のレベルを上げること、またはＣＤ４ Ｔ細胞の低下を減らすこと、ＨＩＶ特異的なＣＴＬの幅、大きさ、結合力、機能性を上げること、ＡＩＤＳ患者の全体的な健康または生活の質を高めること；ＡＩＤＳ患者の平均余命を延ばすことが挙げられる。臨床医は、免疫接種の影響を、治療前の患者の状態と比較し、または治療しない患者の予想される状態と比較し、ＡＩＤＳの抑制について治療が有効であるか否かを決定することができる。

好ましくは、前記疾患は、ＡＩＤＳ、ＡＲＣまたはＨＩＶ日和見疾患である。ＨＩＶ日和見疾患の非限定例は、バーキットリンパ腫、気管支、気管、肺または食道のカンジダ症、子宮頸癌、コクシジオイデス症（播種性または肺の外側）、クリプトコッカス症（肺の外側）、クリプトスポリジウム症（腸で１ヶ月より長く続く）、サイトメガロウイルス感染（肝臓、脾臓またはリンパ節の外側）、サイトメガロウイルス網膜炎（失明を伴う）、ＨＩＶ脳症、１ヶ月以上続くヘルペス単純病変、気管支、肺または食道での単純ヘルペス、ヒストプラスマ症（播種性または肺の外側）、免疫芽球性リンパ腫、浸潤子宮頸癌、腸で１ヶ月より長く続くイソスポーラ症、カポジ肉腫、リンパ腫（脳で原発性）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ合併症（播種性または肺の外側）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ（播種性または肺の外側）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（播種性または肺の外側）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎、肺炎（１２ヶ月以内に再発）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、サルモネラ敗血症（再発性）、トキソプラズマ症（脳内）、消耗症候群、およびＨＩＶ感染患者における傷いた免疫系によって促進される感染症から生じる任意の他の疾患である。

本発明のワクチンは、ＨＩＶ−１感染の治療に有用であろう。ＨＩＶ−１またはその等価物に罹患し得るすべての動物（例えば、チンパンジー、マカク、ヒヒまたはヒト）をこの様式で治療することができるが、本発明の免疫原性組成物は、特に、ヒトへの治療用途に向けられている。多くは、望ましい治療効果をもたらすために、１回より多い投与が必要であろう。実際のプロトコル（投与量および頻度）は、標準的な臨床手順によって確立することができる。

本発明は、さらに、ＨＩＶ感染に関連する症状を予防または低減することに関する。これらは、例えば、帯状疱疹、皮膚発疹および爪感染、口内炎、再発性の鼻および喉の感染および体重減少を含むＨＩＶ感染の軽度発症期に関連する症状を含む。それに加え、ＨＩＶ感染の重度発症期に関連するさらなる症状としては、例えば、鵞口瘡および膣カンジダ症（カンジダ症）、持続性の下痢、体重減少、持続性の咳および再発性結核または再発性ヘルペス感染、例えば、口唇ヘルペス（単純疱疹）が挙げられる。本発明に従って治療可能な末期のＡＩＤＳの他の症状としては、例えば、下痢、悪心および嘔吐、膣カンジダ症および口内炎、持続性、再発性の膣感染および子宮頸癌、持続性全身性リンパ節腫脹（ＰＧＬ）、重篤な皮膚感染、疣贅および白癬、呼吸器感染、肺炎、特に、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎（ＰＣＰ）、帯状ヘルペス（または帯状疱疹）、神経系の問題、例えば、疼痛、手および足の無感覚または「ピリピリする痺れ」、神経学的異常、カポジ肉腫、リンパ腫、結核または他の同様の日和見感染が挙げられる。

本発明の有益な効果としては、例えば、ＨＩＶにさらされた個体の初期感染を予防するか、または遅らせること、ＨＩＶに感染した個体のウイルス負荷を下げること、ＨＩＶ感染の発症期を延ばすこと、抗レトロウイルス治療（ＡＲＴ）によってウイルスレベルが低下した、ＨＩＶに感染した患者のウイルス負荷を低い状態に維持すること、薬物を投与していない患者およびＡＲＴで治療した患者において、ＨＩＶ−１に特異的および非特異的の両方のＣＤ４ Ｔ細胞のレベルを上げること、またはＣＤ４ Ｔ細胞の低下を減らすこと、ＨＩＶ特異的なＣＴＬの幅、大きさ、結合力、機能性を上げること、ＡＩＤＳ患者の全体的な健康または生活の質を高めること、ＡＩＤＳ患者の平均余命を延ばすことが挙げられる。臨床医は、免疫接種の影響を、治療前の患者の状態と比較し、または治療しない患者の予想される状態と比較するか、または、治療した個体または治療していない個体の臨床試験で比較し、ＡＩＤＳの抑制について治療が有効であるか否かを決定することができる。

免疫原性組成物は、作用の望ましい部位に核酸または発現ベクターを導入し、適切な制御可能な速度で放出するように設計することができる。制御放出製剤を調製する方法は、当該技術分野で知られている。例えば、制御放出調剤薬は、免疫原または免疫原性組成物を複合体化するか、または吸収するポリマーを使用することによって製造することができる。望ましい制御された放出特性または放出プロフィールを与えることが知られている適切な高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはプロタミンサルフェート）を用いることによって、制御放出製剤を調製することができる。制御放出調剤薬による作用持続時間を制御するための別の可能な方法は、ポリマー材料（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、これらの酸のコポリマー、またはエチレンビニルアセテートコポリマー）の粒子に活性成分を組み込むことである。または、これらの活性成分をポリマー粒子に組み込む代わりに、これらの材料を、例えば、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル）またはマイクロエマルションの状態で、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）に取り込むことが可能である。Ｖｏｌｌｅｒ Ａら編集、「Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ、ボルチモア、ＭＤ、ＵＳ、１９７８）およびＧｅｎｎａｒｏ Ａ編集、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳ、１９９０）を参照。

本発明の免疫原性組成物における本発明の核酸および発現ベクター（まとめて免疫原）の適切な投与量は、当業者ならば簡単に決定することができる。例えば、免疫原の投与量は、投与経路および被検体の大きさによって変わってもよい。当業者ならば、従来の免疫学的技術を用い、例えば、被検体（例えば、実験動物）の免疫応答を測定し、投与量を適切に調節することによって、適切な投与量を決定することができる。被検体の免疫応答を測定するためのこのような技術としては、限定されないが、クロム放出アッセイ、テトラマー結合アッセイ、ＩＦＮ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、ＩＬ−２ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞内サイトカインアッセイおよび他の免疫学的検出アッセイが挙げられる。Ｈａｒｌｏｗ Ｅ、Ｌａｎｅ Ｄ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳ、１９８８）を参照。

これに限定されるものではないが、筋肉内、静脈内、皮内、経皮、経鼻、粘膜（例えば、直腸内、膣内、口腔）および局所送達を含む任意の適切な送達方法を用い、免疫原性組成物を投与することができる。このような技術は、当該技術分野でよく知られている。送達方法のさらなる具体例は、筋肉内注射、皮内注射および皮下注射である。しかし、送達は、注射方法に限定される必要はない。さらに、動物組織へのＤＮＡの送達は、動物の筋肉組織への裸のＤＮＡのカチオン性リポソームの直接的な注射によって、または「遺伝子銃」もしくはエレクトロポレーション技術を用いたＤＮＡの皮内注射によって達成された。Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．１９９４；３８：２６８−２７４、Ｃｈａｒｎｏｃｋ−Ｊｏｎｅｓ Ｄら、ＷＯ１９９６０２００１３、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９９３：１１：９５７−９６０、Ｈｏｆｆｍａｎ Ｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９９４；１２（１６）：１５２９−１５３３；Ｘｉａｎｇ Ｚら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９４；１９９：１３２−１４０、Ｗｅｂｓｔｅｒ Ｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９９４；１２：１４９５−１４９８、Ｄａｖｉｓ Ｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９９４；１２：１５０３−１５０９、Ｄａｖｉｓ Ｈら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１９９３；２：１８４７−１８５１およびＪｏｈｎｓｔｏｎ Ｓら、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９４；４３：３５３−３６５を参照。送達は、粘膜表面（例えば、肛門、膣または口腔の粘膜）を介して達成することもできる。

７．本発明のキット
別の態様では、本発明は、第１の態様の免疫原、第２の態様のペプチドまたはその改変体、第４の態様の核酸、発現カセット、発現ベクター、ウイルスまたは細胞、または第４の態様のワクチンを含むキットに関する。これらのキットは、本発明に記載する用途を実行するのに必要な材料を与える。キットは、パッチの形態であってもよい。

それに加え、キットは、決められた境界の中に試薬を保持することができる包装を含んでいてもよい。このような包装を調製するのに適した材料としては、ガラス、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート）、瓶、バイアル、紙または小袋が挙げられる。本発明のキットは、さらに、キットの中に含まれる要素（特に、本発明の止血パッチを構成するもの）を使用するための指示書を含んでいてもよい。この指示は、印刷した材料の形態、または被検体が読むことができるように指示を保存することができる電子的な支援の形態、例えば、電子記憶媒体（例えば、磁性ディスク、テープ）、または光学媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ）の中に見つけることができる。この媒体は、さらに、またはこれに代えて、この指示を与えるインターネットウェブサイトを含んでいてもよい。

一般的な手順
１．Ｔ細胞の免疫原設計
本発明のＨＩＶ ＯＬＰの設計のために、以下の手法にしたがった。

コンセンサスクレードＢペプチド群を用い、２３２例のＨＩＶに感染した未治療の個体の実験的な（インターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔ）スクリーニングから、ＨＩＶを良好に制御している被検体によって優先的に標的となるウイルスプロテオームの領域がわかった。Ｆｒａｈｍ Ｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４；７８：２１８７−２２００；Ｍｏｔｈｅ Ｂら、Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１１；９（１）：２０８を参照。全体的な試験ペプチド群は、全ウイルスプロテオームに広がる４１０種の１８マーオーバーラッピングペプチドからなっていた。これらの中で、ＯＬＰ応答群が、ＯＬＰ非応答群（すなわち、インターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、これらのＯＬＰに反応しなかった個体）と比較して有意に（多重比較について、未補正でｐ＜０．０５）ウイルス負荷を下げた２６種のＯＬＰが特定された。これらの有益なＯＬＰは、保護比率（ＰＲ＞１）を有し、ウイルスのＨＩＶ Ｇａｇタンパク質（ｎ＝１０）、Ｐｏｌ（ｎ＝１２）およびＶｉｆ（ｎ＝３）およびＮｅｆ（ｎ＝１）タンパク質に位置していた。２６種類のＯＬＰの中で、１５種類は、部分的に重複していた。第１表を参照。

連続した免疫原配列を構築するために、この２６種類のＯＬＰを整列させ、長さが１１〜７８アミノ酸の合計１６セグメントになるようにアセンブリングした。これらのセグメントの正確な開始位置および終了位置は、特定した２６種類のＯＬＰの上流および下流にある残基を分析することに基づいており、異なるフランキング部位に適用される多くの考慮事項に基づいていた。これらの考慮事項としては、以下のものが挙げられる。
（１）ＯＬＰ免疫原性データ
（２）保存領域の反応性データ
（３）既知の良好なエピトープまたは不良なエピトープを含める／除外するためのセグメントの伸長または切断
（４）ＣＤ４エピトープの被覆
（５）ＨＬＡの被覆
（６）配列多様性（２０１０種類のコンセンサスおよびＨＢＸ２の定義されたエピトープ）
（７）多変量ＯＬＰ分析
（８）新規エピトープ／自己エピトープの作成
（９）有益なＯＬＰを含まない天然配列の管理
（１０）エピトープ認識を避けるための変更の導入、および
（１１）禁じられている残基（Ｇ，Ｐ，Ｅ，Ｄ，Ｑ，Ｎ，Ｔ，ＳまたはＣ）を避ける。
このプロトコルによって、免疫原候補として、配列番号１〜配列番号１６の設計を得た。

２．ベクター
最適な処理を確保し、早すぎるエピトープ消化を避けるために、配列番号１〜配列番号１６の配列が、セグメント間の１個、２個または３個のアラニンアミノ酸で連結する。

次いで、連結したセグメントを、ＤＮＡおよびＭＶＡベクターを含むためのＨＩＶ Ｔ細胞免疫原配列として使用した。可溶性ペプチドのみ、または熱ショックタンパク質との組み合わせで免疫原を送達するために、１６セグメントに及ぶが、３個のＡＡＡリンカーを含まないもっと短いオーバーラッピングペプチド（長さの中央値が２３残基）を設計した。Ｃ末端で禁じられている残基を避けるのに役立つ様式で、これらのＯＬＰを作成した（ＨＬＡクラスＩ分子に最適なエピトープが存在するのに重要。配列番号１７〜配列番号４５を参照、http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/PEPTGEN/peptgen.html２０１２年１月）。これらのオーバーラッピングペプチドは、長さが１１〜２７アミノ酸の範囲である。

３．Ｔ細胞免疫原
Ｔ細胞免疫原をポリペプチドとして設計し、３個のアラニンリンカーによって統一されたさまざまな大きさ（１１〜７８ａａ）のＨＩＶ−１ゲノムの１６セグメントからアセンブリングした。領域の記述は以下のものを含んでいた。

４．リーダー配列の内包
シグナルペプチドは、一般的に、機能を発揮する細胞位置に到達するために膜を通過しなければならない高度に疎水性のアミノ酸配列（長さが１５〜６０アミノ酸）のタンパク質である。シグナル認識粒子に結合することによって、これらの配列は、翻訳中にタンパク質が挿入される膜に対する初期のタンパク質−リボソーム複合体を支配する。シグナルペプチドは、種々の膜（例えば、小胞体、ミトコンドリア、葉緑体、ペルオキシソーム）によるタンパク質の翻訳時取り込みを指示する。非膜タンパク質のリーダーシグナル配列は、最終的に、特定のペプチダーゼによって除去される。

使用されるある種のシグナルペプチドとしては、抗原提示細胞の分泌および吸引を促進するためのＭＣＰ−３ケモカイン；プロテアソーム分解を亢進させるためのカテニン（ＣＡＴＥ）から誘導されるペプチド；およびＭＨＣ ＩＩコンパートメントを標的とするための、リソソームに関連するタンパク質ＬＡＭＰ１が挙げられる。Ｒｏｓａｔｉ Ｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００９；１０６：１５８３１−１５８３６を参照。

本発明の設計では、ＧＭＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）由来のシグナルペプチドを免疫原のアミノ末端に導入し、発現する細胞からの免疫原の分泌を促進し、その後、安定性を高めるために、バリンを導入した。ＧＭＣＳＦシグナルペプチドの配列は、以下である。
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号４６）

５．ｉｎ−ｖｉｔｒｏ発現実験のためのタグの内包
トランスフェクトした細胞での発現を評価する目的のために、終止コドンより前に、Ｃ末端領域にあるＦＬＡＧペプチドに最初に含まれる免疫原配列は、以下であった。
ＤＹＫＤＤＤＤＫＬ（配列番号４８）

ＦＬＡＧ系は、目的の組み替えタンパク質に融合した短い親水性８アミノ酸ペプチドを利用する。ＦＬＡＧペプチドは、数種類のきわめて特異的な抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、セントルイス、ＭＯ、ＵＳ）のための結合部位を含み、これを利用し、トランスフェクトした細胞に由来する材料での目的のタンパク質の発現を評価することができる。

ＦＬＡＧペプチドタグが小さいため、他のエピトープ、ドメインを覆わず、または一般的に、融合タンパク質の機能、分泌および輸送を変えない。この配列は、マウス免疫原性アッセイのために、後で除去された。ＦＬＡＧタグは、免疫接種の前に、最終的な免疫原（２９８Ｈ）から除去される。

６．Ｔ細胞免疫原の記述
Ｔ細胞免疫原は、以下の配列（配列番号４９）を有している。
ここで、
ＧＭＣＳＦシグナルペプチドは、下線で示され、このシグナル配列のすぐ後にあるバリンは、マーカーで塗られており、１個、２個または３個のＡ（ＡＡＡ）リンカーは太字で示され、ＦＬＡＧエピトープ（ｉｎ−ｖｉｖｏ試験のために最終構築物で除去される）は、イタリックで示され、異なるセグメントは、以下のようにカッコ内に示される。

７．ヌクレオチド配列コドンの至適化
発現および分泌を高めるために、Ｔ細胞免疫原配列をＲＮＡ／コドンが至適化されたヌクレオチド配列に翻訳した（Ｍｒ．Ｇｅｎｅ ＧｍｂＨ、レーゲンスブルク、ＤＥ）。コドンの至適化は、コードされるタンパク質に影響を与えることなく、ｍＲＮＡ中、すでに特定されたＲＮＡを処理する配列、阻害する配列、不安定な配列を破壊するような複数のヌクレオチド変更を導入することに基づいていた。Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９２；６６（１２）：７１７６−７１８２を参照。このプロセスは、適切なコドン変更によって、コード配列から予想されるスプライス部位（スコア＞０．４）を除外し、スプライシングの可能性を最低限にすることを含んでいてもよい。

上に示したヌクレオチド変更の結果として、Ｔ細胞免疫原の最終的なＧＣ含有量は、６３％であった。免疫原のコドンが至適化された完全ヌクレオチド配列は、以下である（配列番号５０）。
ここで、ＧＭＣＳＦシグナルペプチドをコードする配列は、下線で示され、このシグナル配列をコードする配列のすぐ下流にあるバリンコドンは、マーカーで塗られた状態で示されており、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、標準文字で示され、Ｆｌａｇタグをコードする配列は、イタリックで示され、ｔｇａおよびｔａａの終止コドンは、小文字で示される。

８．クローン化戦略
コドンが至適化されたＴ細胞免疫原を、哺乳動物発現プラスミドＢＶ５へクローン化し、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位およびカナマイシン耐性遺伝子（Ｘｈｏ部位がない）を含む微生物中で成長のために最適化された改変ＣＭＶ基本プラスミド骨格からなっていた。このクローン化工程は、以下のとおりであった。

（１）第１の工程では、合成したＴ細胞免疫原に、ＬｅｕからＭｅｔｈへのアミノ酸の変更を導入した。１つは主要な抗レトロウイルス薬耐性変異部位の１つを内包するために、ＲＴ４１位置（セグメント９）にＦＬＡＧエピトープを含む。Ｔ細胞免疫原遺伝子（開始ベクター）を、スペクチノマイシン耐性を有するプラスミドにクローン化した。ＲＴ４１の変更を内包するＰＣＲによって生成するセグメントを、ＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩとしてＴ細胞免疫原に挿入した。コンピテント細胞ＤＨ１０８Ｂを形質転換のために使用し、ＬＢ−スペクチノマイシン媒体で成長させた。得られたプラスミドをＨＩＶＡＣＡＴ ＲＴ Ｍ４１と名付けた。点変異の挿入を、セグメント９配列を内包するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用い、ＰＣＲシークエンシングによって確認した。

（２）第２の工程では、ＨＩＶＡＣＡＴ ＲＴ Ｍ４１遺伝子を、ベクターに結合することによって、カナマイシン耐性遺伝子中にＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩとしてＸｈｏ部位がないＢＶ５プラスミドに挿入し、精製したゲルを消化してＨＩＶＡＣＡＴ ＲＴ Ｍ４１フラグメントにした。コンピテント細胞ＤＨ１０８Ｂを形質転換のために使用し、ＬＢ−Ｋａｎ媒体で成長させた。得られるプラスミドの名称は、２９７Ｈ（ＧＭＣＳＦ−ＨＩＶＡＣＡＴ−ＦＬＡＧ）であった。この遺伝子の挿入を、センスプライマー（ＣＭＶプロモーター由来）およびアンチセンスプライマー（ポリＡ ＢＧＨ領域由来）を用い、制限消化およびＰＣＲシークエンシングによって確認した。

第３の工程では、ＦＬＡＧタグのためのエピトープを、ＢｓｔＥＩＩ−ＥｃｏＲＩ消化によって２９７Ｈプラスミドから除去し、およびアニーリングしたプライマー２９８Ｈ Ｐｌｕｓおよび２９８Ｈ Ｍｉｎｕｓを挿入した。

２９８Ｈ Ｐｌｕｓ
ＧＴＣＡＣＣＧＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＴＴＣｔｇａｔａａＧ（配列番号５１）

２９８Ｈ Ｍｉｎｕｓ
ａａｔｔＣｔｔａｔｃａＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＣＧＣＣＣＧ（配列番号５２）

得られたプラスミドを、２９８Ｈ ＧＭＣＳＦ−ＨＩＶＡＣＡＴ（受託番号ＤＳＭ ２５５５５）と名付けた。図１を参照。ＦＬＡＧタグの除去を、アンチセンスプライマー（ポリＡ ＢＧＨ領域由来）を用いたＰＣＲシークエンシングによって確認した。

実施例１
ｉｎ−ｖｉｔｒｏ発現試験
数種類の一過性トランスフェクションを行い、ＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原の発現、局在化および安定性を評価した。

簡単に述べれば、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む完全ＤＭＥＭ中の１×１０^６ヒト２９３細胞を６０ｍｍ組織培養皿に播種し、一晩かけて接着させた。ＨＥＫ ２９３細胞を、合計７μｇのＤＮＡ（１００ｎｇまたは２５０ｎｇの２９７Ｈ ＧＭＣＳＦ−ＨＩＶＡＣＡＴ−ＦＬＡＧプラスミドＤＮＡ、５０ｎｇのＧＦＰを発現するプラスミドｐＦＲＥＤ１４３に、７μｇまでのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＤＮＡを追加）を用い、リン酸Ｃａ ＤＮＡ共沈殿によってトランスフェクトした。

トランスフェクションから６時間後、培地を、２％のＦＣＳを追加した３ｍｌのＤＭＥＭと交換した。２４時間後および４８時間後に、細胞および上清を０．５×ＲＩＰＡに回集した。

タンパク質の発現をウェスタン免疫ブロットによって分析した。細胞抽出物および上清の合計の１／２５０を入れた。タンパク質を、１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（Ｎｕ−Ｐａｇｅ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＮｕＰＡＧＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳ）での電機映像によって分離し、ニトロセルロース膜に転写した。

この膜をセイヨウワサビペルオキシダーゼが接合した抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、セントルイス、ＭＯ、ＵＳ）で、１：３，０００希釈で探索し、２９７Ｈプラスミドを検出した。

ＥＣＬを用い、バンドを視覚化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋で膜をイメージングした。

ポジティブコントロールを使用し、ポジティブコントロールは、クレードＢ ｐ５５ ＧａｇをコードするプラスミドＤＮＡを含んでおり、ＦＬＡＧタグも含んでいた。

２９８Ｈプラスミド（ＦＬＡＧタグを含まないＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原をコードする）を用いた一過性トランスフェクションからの細胞抽出物を、ＨＩＶ−１に感染した被検体に由来するヒト血清を用い、１：３，０００希釈で探索し、その後、セイヨウワサビペルオキシダーゼが接合したヒト抗ＩｇＧ（希釈度１：１０，０００）で探索した。

２９７Ｈプラスミドおよび２９８Ｈプラスミドは、安定に（２４時間および４８時間で同じ概算量）ＨＩＶＡＣＡＴＴ細胞免疫原構築物を発現し、これを細胞抽出コンパートメントで視覚化した。この構築物の分泌の証拠はなかった。

実施例２
マウスでの細胞応答
１ｍｌ（２ｍｇ／ｍｌ）の２９８Ｈ ＧＭＣＳＦ−ＨＩＶＡＣＡＴ ＤＮＡのストックを、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ試験のためにエンドフリーで製造した。

ＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原の免疫原性を６〜８週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、フレデリック、ＭＤ、ＵＳ）で評価した。

０週目および４週目に、Ｉｎｏｖｉｏシステム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ、ＰＡ、ＵＳ）を用い、２０μｇおよび５μｇのＤＮＡをエレクトロポレーションによって左右の大腿四頭筋（２０μｇ／１投与５０μｌ、部位あたり２５μｌ）に筋肉内から送達した。最後の免疫接種から２週間後に、マウスを屠殺した。免疫原性試験のためにマウスの脾細胞および血清を集めた。使用したコントロールＤＮＡは、以下のとおりであった。
（１）１１４Ｈ ｐ５５ ｇａｇクレードＢ：全ｇａｇタンパク質を発現する；
（２）１３２Ｈ ＮＴＶ：ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆのキメラタンパク質を発現する；
（３）１３３Ｈ ｐｏｌ：全ｐｏｌタンパク質を発現する；
（４）ＢＶ４ ＣＭＶ−ｋａｎ−Ｂａｓｉｃ：ＳＨＡＭコントロール、導入遺伝子を発現しない、類似のＤＮＡプラスミド骨格。

この実験に３５匹のマウスを使用し、１グループあたり５匹のマウスを集めた。グループごとの免疫接種の配分は以下のとおりであった。

プールした脾細胞（グループに属する５匹のマウス由来の細胞）において、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を用い、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆのタンパク質すべてを内包するオーバーラッピングペプチドのプールを用い、第１の工程で細胞免疫応答を特性決定した。

簡単に述べれば、それぞれのグループのマウスに由来するプールした単離マウス脾細胞を、１ｍｌの共培養物中、２×１０^６細胞／ｍｌの密度で、ペプチドプール（１５マー、クレードＢ ｇａｇ、コンセンサスＢ ｐｏｌおよびＮＬ４３ ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆ配列を内包する１１ａａが重複する、１μｇ／各ペプチドのｍｌ数、合計で約１２時間、１時間はサイトカインの分泌を防ぐためのＧｏｌｇｉ ｓｔｏｐを用いない）存在下、一晩インキュベートした。ＣＤ３−アロフィコシアニン−Ｃｙ７、ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ８−Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、フランクリンレイクス、ＮＪ、ＵＳ）を用い、表面免疫染色を行った。透過化の後、インターフェロンγ−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、フランクリンレイクス、ＮＪ、ＵＳ）を用い、細胞内サイトカイン染色を行った。

第１の免疫原性分析から、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、２０μｇおよび５μｇのＤＮＡは、検出可能なインターフェロンガンマと、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ−ｔａｔ−ｖｉｆ全ペプチドプールに対するプラスの応答を示した。図２ａを参照。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答の分布を示す。図２ｂを参照。

個々のマウスのレベルで、インターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔアッセイの免疫原に含まれるタンパク質を内包するために８プールのペプチドを用いて刺激し、凍結した脾細胞を用い、応答を解析した。

製造業者の指示にしたがい、最小限の改変を加えつつ、マウスインターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔキット（ＡＬＰ）（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ、ストックホルム、ＳＥ）を用い、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。すべてのアッセイについて、マウス脾細胞を、９６ウェルポリビニリデンプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、ベッドフォード、ＭＡ、ＵＳ）内で、１０％ウシ胎児血清を含む１４０μｌのＲｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地１６４０中、投入細胞数４×１０^５細胞／ウェルを単独で、またはＨＩＶ−１特異的なペプチドプール（各ペプチドの最終濃度１４μｇ／ｍｌ）とともに、３７℃、５％ ＣＯ_２中で１６時間加えた。８種類のペプチドプール（それぞれ、２００１コンセンサスＢ配列に由来する１８アミノ酸の２〜１２ペプチドを含む）を、ＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原に含まれるセグメントに広がる異なるタンパク質サブユニット（ｇａｇ−ｐ１７、ｇａｇ−ｐ２４、ｇａｇ−ｐ２ｐ７ｐ１ｐ６、ｐｏｌ−ＲＴ、ｐｏｌ−プロテアーゼ、ｐｏｌ−インテグラーゼ、ｖｉｆおよびｎｅｆ）に保存する。ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ／Ｍ＿ＧＲＯＵＰ／Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．ｈｔｍｌ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１２を参照。ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆ全タンパク質を発現するＤＮＡで免疫化したマウスで使用するＨＩＶペプチドプールは、完全なｇａｇ（６プール、１１ペプチド／それぞれ）、ｐｏｌ（８プール、１６または１７ペプチド／それぞれ）、ｎｅｆ（２プール、１３〜１４ペプチド／それぞれ）、ｔａｔ（１プール、１２ペプチド）およびｖｉｆ（２プール、１２ペプチド／それぞれ）のタンパク質に広がる１１残基の重複を含む１８マーペプチドからなっていた。

コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、セントルイス、ＭＯ、ＵＳ）を５ｍｇ／ｍｌでポジティブコントロールとして使用した。このプレートを、１工程の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳ）で進めた。自動化されたＥＬＩＳＰＯＴリーダーシステム（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ ＬＬＣ、クリーブランド、ＯＨ、ＵＳ）で、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔソフトウェアを用い、プレート上のスポットを計測し、応答の大きさを、投入した脾細胞１００万あたり、スポットを形成する細胞（ＳＦＣ）としてあらわした。陽性応答の閾値は、ウェルあたり少なくとも５個のスポットであり、「ネガティブコントロールウェルの平均値と、ネガティブコントロールウェルの３つの標準偏差の和」および「ネガティブコントロールウェルの平均の３倍」のいずれか大きい方を超える応答であると定義された。

（１）ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆ全タンパク質をコードするプラスミドで免疫化されたマウスで進行するインターフェロンガンマ応答の優勢性は、ＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原を内包するセグメントの外側の領域に向けられたものであり（ＨＩＶＡＣＡＴ免疫原領域／ｇａｇ＋ｐｏｌ＋ｎｅｆ＋ｔａｔ＋ｖｉｆ全体を標的とする応答の中央値の比率は０．２６（範囲０．１７〜０．４２）であった）、高用量（２０μｇ）および低用量（５μｇ）のＤＮＡで免疫化された群で差はなかった。図３を参照。

（２）２０μｇのＨＩＶＡＣＡＴで免疫化されたマウスのＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原配列に含まれるタンパク質サブユニットに対する応答の幅の中央値は、４（範囲２〜５）であるのに対し、タンパク質全体（ｎｓ）をコードする２０μｇのプラスミドで免疫化されたマウスの応答が２（範囲１〜３）であり、応答の大きさに有意な差はなかった。マウスがＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原で免疫化されると、８種類のタンパク質サブユニットのうち、６種類が少なくとも1回標的化された。図４を参照。

（４）ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｖｉｆ全タンパク質をコードするプラスミドで免疫化されたマウスにおける応答の優勢性は、８９％がｇａｇに対して主に働き、一方、ＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原を用いて高用量で免疫化されたマウスでは、免疫原に含まれるすべてのタンパク質成分（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆおよびｎｅｆ）に対し、もっと均衡がとれていた。図５を参照。

実施例３
マウスでの液性応答
まず、プールしたマウスの血清で液性応答を分析した。ウェスタン免疫ブロットによって、１２％ ＳＤＳ−Ｐａｇｅで分離した１ｍｇのｇａｇ発現ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３細胞からの細胞抽出物を用い、ｐ２４、ｐ３７およびｐ５５に対する結合抗体を検出し、マウス由来のプールした血清（希釈１：１００）を用い、膜を探索した。ｇａｇ ｐ２４に対する抗体価をＥＬＩＳＡによって測定した。プールした血清サンプルの段階的な４倍希釈物を評価し、４５０ｎｍでの吸光度を決定した（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂ，Ｉｎｃ．、ケンジントン、ＭＤ、ＵＳ）。ＳＨＡＭ ＤＮＡで免疫化したマウスから得たコントロール血清を用いて得られた平均と３つの標準偏差の和より大きな値を有するポジティブ値を示す結合価を最大希釈で報告した。

（ａ）第１の液性免疫原性分析から、ＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原が、２０μｇで免疫化したマウス群で、ウェスタンブロットによって検出可能なｇａｇ ｐ５５、ｐ３７およびｐ２４に対する結合抗体の応答を誘発した。図６を参照。

（ｂ）ｐ２４に対する結合抗体をＥＬＩＳＡによって定量した。記載したプラスミドを受けたマウスから得たｇａｇ−ｐ２４特異的な結合抗体の滴定終点を、個々の段階的に４倍希釈し、プールした血清サンプルを用い、ＥＬＩＳＡによって決定した。ＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原で免疫化したマウスの高用量グループでは、価数１：４，０００であり、全ｇａｇ構築物で免疫化したマウスで検出した価数より小さかった。ｐ２４に対する結合抗体は、低用量グループでは測定することができなかった。図７ａを参照。個々のマウスレベルでは、ＨＩＶ−１ＩＩＩＢ ｐｒ５５ ｇａｇ組み換えタンパク質（カタログ番号３２７６、ＮＩＨ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ、ベセスダ、ＭＤ、ＵＳ）を用いた社内で開発したｇａｇ ｐ５５ ＥＬＩＳＡを、１：１００希釈でマウス血清を用いて行った。高用量の免疫原で免疫化した３匹のマウスのうち、２匹は、低レベルの抗体が検出可能であった。図７ｂを参照。

実施例４
マウスにおける異種プライム／ブーストｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性
材料および方法
ｐＤＮＡ−ＨＩＶＡＣＡＴおよびＭＶＡ−ＨＩＶＡＣＡＴワクチンの調製
コドンが至適化されたＴ細胞免疫原を、哺乳動物発現プラスミドＢＶ５へクローン化し、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位およびカナマイシン耐性遺伝子（Ｘｈｏ部位がない）を含む微生物中で成長のために最適化された改変ＣＭＶ基本プラスミド骨格からなっていた。マウスを免疫接種するためのプラスミドＤＮＡを、Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅ Ｍｅｇａｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製し、使用するまで−８０℃で保存した。

ＨＩＶＡＣＡＴ遺伝子を発現する組み換えＭＶＡを、すでに記載されているように製造した｛Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ、２００７ ＃２３５；Ｎｋｏｌｏｌａ、２００４ ＃３２１｝。簡単に言うと、１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびグルタミン（ＤＭＥＭ １０）を追加したダルベッコ改変イーグル培地中で成長させたニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞を、ＭＯＩ １で、親ＭＶＡで感染させ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をマーカーとして含む３ｕｇのｐＤＮＡ−ＨＩＶＡＣＡＴを含むＳｕｐｅｒｆｅｃｔｉｎ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いてトランスフェクトさせた。２日後に、全ウイルスを収穫し、これを使用し、ＣＥＦ細胞を再び感染させた。ＭＶＡについて、５回のプラーク精製を行い、その後に、マスターウイルスストックを成長させ、３６％スクロースクッション液で精製し、滴定し、使用するまで−８０℃で保存した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性
マウスにおける異種プライム／ブーストｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性実験のために、５グループの６〜８週齢のメスＣ５７ＢＬ／６（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．、バルセロナ、スペイン）を使用した。マウスに対し、１００μｇのｐＤＮＡ−ＨＩＶＡＣＡＴ（２または３回のワクチン接種）を用いて筋肉内からプライミングし、その後、１０^６ｐｆｕのＭＶＡ−ＨＩＶＡＣＡＴブースト（グループ：それぞれ、２×ＤＮＡ、３×ＤＮＡ、２×ＤＮＡ＋１ＭＶＡおよび３×ＤＮＡ＋１ＭＶＡ）を行った。すべてのワクチン接種に３週間の間隔をあけた。

それぞれの実験で、最後のワクチン接種から２週間後にすべてのマウスを屠殺した。免疫原性試験のためにマウスの脾細胞および血清を集めた。脾臓を除去し、細胞濾過器（Ｆａｌｃｏｎ）によって、５ｍｌのシリンジゴムプランジャーを用いて個々に押出濾過した。ｒｂｃ溶解の後、脾細胞を洗浄し、１０％ ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｒ１０）を追加したＲＰＭＩ １６４０に再懸濁させ、使用するまで凍結させておいた。

すべての動物の手順および世話は、現地の倫理委員会（Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｉｔｔｅ）の認可を受けた。

ペプチドプールのオーバーラッピングペプチドおよび分布
ＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原のみを発現するｐＤＮＡまたはＭＶＡである異種治療法の免疫原性を評価するために、また、接合エピトープ候補の免疫原性を除外するために、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を用い、全ＨＩＶＡＣＡＴ Ｔ細胞免疫原に広がる（リーダー配列およびリンカー領域を含む）長さが１５アミノ酸の１４７ペプチドのオーバーラッピングペプチド群（１１残基が重複する）を新しく合成した。免疫原のタンパク質サブユニットおよびセグメントにしたがって、ペプチドが１８種の異なるプールに配分された（シグナルペプチド配列について１プール、ｎ＝４ペプチド；Ｇａｇについて７プール、ｎ＝８〜１１ペプチド／それぞれ；Ｐｏｌについて７プール、ｎ＝５〜１１ペプチド／それぞれ；Ｖｉｆについて２プール、ｎ＝６〜８ペプチド／それぞれ、Ｎｅｆについて１プール、ｎ＝２ペプチド）。８種類のタンパク質サブユニット（Ｇａｇ ｐ１７、Ｇａｇ ｐ２４、Ｇａｇ ｐ２ｐ７ｐ１ｐ６、Ｐｏｌ−プロテアーゼ、Ｐｏｌ−ＲＴ、Ｐｏｌ−インテグラーゼ、ＶｉｆおよびＮｅｆ）に特異的なＩＦＮγ応答によって分け、結果を示す。

マウスＩＮＦγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
製造業者の指示にしたがい、最小限の改変を加えつつ、マウスＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔキット（ＡＬＰ）（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ、ストックホルム、ＳＥ）を用い、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。すべてのアッセイについて、凍結したマウス脾細胞をまず解凍し、使用前に、Ｒ１０に３７℃で５時間放置した。細胞を、９６ウェルポリビニリデンプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、ベッドフォード、ＭＡ、ＵＳ）内で、Ｒ１０の１４０μｌ中、投入細胞数４×１０^５細胞／ウェルを単独で、またはＨＩＶ−１特異的なペプチドプール（各ペプチドの最終濃度１４μｇ／ｍｌ）とともに、３７℃、５％ ＣＯ_２中で１６時間加えた。コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、セントルイス、ＭＯ、ＵＳ）を５ｍｇ／ｍｌでポジティブコントロールとして使用した。このプレートを、１工程の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳ）で現像した。自動化されたＥＬＩＳＰＯＴリーダーシステム（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ ＬＬＣ、クリーブランド、ＯＨ、ＵＳ）で、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔソフトウェアを用い、プレート上のスポットを計測し、応答の大きさを、投入した脾細胞１００万あたり、スポットを形成する細胞（ＳＦＣ）としてあらわした。陽性応答の閾値は、ウェルあたり少なくとも５個のスポットであり、「ネガティブコントロールウェルの平均値と、ネガティブコントロールウェルの３つの標準偏差の和」および「ネガティブコントロールウェルの平均の３倍」のいずれか大きい方を超える応答であると定義された。

結果
全タンパク質をコードするプラスミドを用いてマウスを免疫化しなかったこれらの実験では、実際の免疫原配列と合うオーバーラッピングペプチドの第２群を合成し、免疫原性の比較のために使用した。１００μｇのｐＤＮＡ−ＨＩＶＡＣＡＴを用いた３回の筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫化は、エレクトロポレーションＩｎｏｖｉｏシステムを用いた免疫化によって誘発されるＩＦＮγ応答の頻度に適合したすべてのマウスにおいてＩＦＮγ応答の頻度を誘発することができた。しかし、２回のｐＤＮＡ筋肉内ワクチン接種は、３回のｐＤＮＡ筋肉内免疫接種の後に応答を誘発する動物を１００％として、３匹の動物のみで免疫原性である（６０％）ことがわかった。興味深いことに、ＭＶＡ−ＨＩＶＡＣＡＴワクチンは、分析した２グループにおいて、幅および大きさの両方で応答を促進することができた（図８Ｂ）が、マウスが３回のｐＤＮＡ−ＨＩＶＡＣＡＴの投与ですでにプライミングされていたときに、応答の大きさが顕著に増えた（図８Ｂおよび８Ｃ）。以前のＥＰ実験からわかるように、免疫原に含まれるすべてのタンパク質サブユニットのほとんどに対し、すべての動物において、明確な優性パターンをもたず、均衡の取れた広範囲の応答が観察された。ｎｅｆまたはｇａｇ−ｐ１５に特異的な応答は、試験したマウスでは検出されなかった（図８Ｄ）。

明確にし、理解する目的のために詳細に本発明を記載してきたが、当業者は、本開示を読むことで、形態および詳細のさまざまな変更を、本発明および添付する特許請求の範囲の真の範囲から逸脱することなく行うことができることを理解するだろう。

本明細書で上に述べたあらゆる刊行物は、全体が引用することにより本明細書の開示の一部とされる。

Claims (26)

1. ｉ） 配列番号１の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｉｉ） 配列番号２の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｉｉｉ） 配列番号３の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｉｖ） 配列番号４の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｖ） 配列番号５の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｖｉ） 配列番号６の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｖｉｉ） 配列番号７の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｖｉｉｉ）配列番号８の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｉｘ） 配列番号９の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｘ） 配列番号１０の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｘｉ） 配列番号１１の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｘｉｉ） 配列番号１２の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｘｉｉｉ）配列番号１３の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｘｉｖ） 配列番号１４の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｘｖ） 配列番号１５の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、および
   ｘｖｉ） 配列番号１６の配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列
   を含んでなり、
   前記ｉ）〜ｘｖｉ）の少なくとも２個の配列がアミノ酸リンカーによって接合されてなる、免疫原性ポリペプチド。
2. ｉ） 配列番号１の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｉｉ） 配列番号２の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｉｉｉ） 配列番号３の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｉｖ） 配列番号４の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｖ） 配列番号５の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｖｉ） 配列番号６の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｖｉｉ） 配列番号７の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｖｉｉｉ）配列番号８の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｉｘ） 配列番号９の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｘ） 配列番号１０の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｘｉ） 配列番号１１の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｘｉｉ） 配列番号１２の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｘｉｉｉ）配列番号１３の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｘｉｖ） 配列番号１４の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
   ｘｖ） 配列番号１５の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、および
   ｘｖｉ） 配列番号１６の配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
   を含んでなる、請求項１に記載の免疫原性ポリペプチド。
3. ｉ） 配列番号１のアミノ酸配列、
   ｉｉ） 配列番号２のアミノ酸配列、
   ｉｉｉ） 配列番号３のアミノ酸配列、
   ｉｖ） 配列番号４のアミノ酸配列、
   ｖ） 配列番号５のアミノ酸配列、
   ｖｉ） 配列番号６のアミノ酸配列、
   ｖｉｉ） 配列番号７のアミノ酸配列、
   ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列、
   ｉｘ） 配列番号９のアミノ酸配列、
   ｘ） 配列番号１０のアミノ酸配列、
   ｘｉ） 配列番号１１のアミノ酸配列、
   ｘｉｉ） 配列番号１２のアミノ酸配列、
   ｘｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列、
   ｘｉｖ） 配列番号１４のアミノ酸配列体、
   ｘｖ） 配列番号１５のアミノ酸配列、および
   ｘｖｉ） 配列番号１６のアミノ酸配列
   を含んでなる、請求項２に記載の免疫原性ポリペプチド。
4. 前記リンカーによって、接合された配列の間の連結領域にＡＡＡ配列領域が生成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド。
5. 前記ｉ）〜ｘｖｉ）の配列がアミノ酸リンカーによって接合されてなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド。
6. 前記リンカーによって、接合された配列の間の連結領域にＡＡＡ配列領域が生成する、請求項５に記載の免疫原性ポリペプチド。
7. 配列番号４９のアミノ酸配列を含んでなる、請求項６に記載の免疫原性ポリペプチド。
8. 前記アミノ酸配列が、少なくとも１種類の抗レトロウイルス薬耐性変異部位を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド。
9. 前記抗レトロウイルス薬耐性変異部位が配列番号９〜１１のいずれかに位置する、請求項８に記載の免疫原性ポリペプチド。
10. Ｎ末端にシグナルペプチドをさらに含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド。
11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチドをコードする、核酸。
12. ヒト細胞での発現のために至適化されたコドンである、請求項１１に記載の核酸。
13. 前記核酸が、配列番号５０の配列を有するものである、請求項１２に記載の核酸。
14. 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸と、プロモーター配列と、３’−ＵＴＲと、場合により選択マーカーとを含む、発現カセット。
15. 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸または請求項１４に記載の発現カセットを含んでなる、発現ベクター。
16. 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸を含んでなる、ウイルス。
17. 前記ウイルスが、改質ワクシニアアンカラウイルスである、請求項１６に記載のウイルス。
18. 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸、請求項１４に記載の発現カセット、請求項１５に記載の発現ベクター、または請求項１６または１７に記載のウイルスを含んでなる、細胞。
19. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチドと、１つ以上のアジュバントとを含んでなる、ワクチン。
20. 医薬に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、請求項１１〜１３に記載の核酸、請求項１４に記載の発現カセット、請求項１５に記載の発現ベクター、請求項１６または１７に記載のウイルス、請求項１８に記載の細胞、または請求項１９に記載のワクチン。
21. ＨＩＶ感染またはＨＩＶ感染に関連する疾患の予防または治療に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、請求項１１〜１３に記載の核酸、請求項１４に記載の発現カセット、請求項１５に記載の発現ベクター、請求項１６または１７に記載のウイルス、請求項１８に記載の細胞、または請求項１９に記載のワクチン。
22. 前記使用が、
    （ｉ）第１の、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸、請求項１４に記載の発現カセット、請求項１５に記載の発現ベクター、請求項１６または１７に記載のウイルス、請求項１８に記載の細胞、または請求項１９に記載のワクチンと、
    （ｉｉ）第２の、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸、請求項１４に記載の発現カセット、請求項１５に記載の発現ベクター、請求項１６または１７に記載のウイルス、請求項１８に記載の細胞、または請求項１９に記載のワクチン
    の連続投与を含んでなる、
    請求項２１に記載の使用のための免疫原性ポリペプチド、核酸、発現カセット、発現ベクター、ウイルス、細胞またはワクチン。
23. 第１の免疫原性ポリペプチド、核酸、発現カセット、発現ベクター、ウイルス、細胞またはワクチンが、第２の免疫原性ポリペプチド、核酸、発現カセット、発現ベクター、ウイルス、細胞またはワクチンとは異なるものである、請求項２２に記載の使用のための免疫原性ポリペプチド、核酸、発現カセット、発現ベクター、ウイルス、細胞またはワクチン。
24. 第１の請求項１５に記載の発現ベクターを投与した後、第２の請求項１７に記載のウイルスを投与する、請求項２３に記載の使用のための免疫原性ポリペプチド、核酸、発現カセット、発現ベクター、ウイルス、細胞またはワクチン。
25. 第１の請求項１５に記載の発現ベクターを少なくとも２回投与する、請求項２４に記載の使用のための免疫原性ペプチド、核酸、発現カセット、発現ベクター、ウイルス、細胞またはワクチン。
26. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性ポリペプチド、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸、請求項１４に記載の発現カセット、請求項１５に記載の発現ベクター、請求項１６または１７に記載のウイルス、請求項１８に記載の細胞、または請求項１９に記載のワクチンを含んでなる、キット。