PT1035865E - Tat do hiv-1 ou respectivos derivados para vacinação profiláctica e terapêutica - Google Patents

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Description

1
DESCRIÇÃO "TAT DO HIV-1 OU RESPECTIVOS DERIVADOS PARA VACINAÇÃO PROFILÁCTICA E TERAPÊUTICA" Área da invenção A presente invenção refere-se a uma vacina profiláctica e/ou terapêutica anti-HlV, anti-SlDA e contra tumores e síndromas associados à infecção com o HIV, que utiliza como imunogenes Tat do HIV, isoladamente ou associada a proteínas, péptidos ou DNA ou outros produtos virais (Nef, Rev, Gag) ou citoquinas que potenciam a resposta imunológica antiviral. A invenção também se refere à imunização com Tat como definida nas reivindicações, utilizando imunização ao nível das mucosas, ou imunização ex vivo de células do sangue periférico expandidas por co-estimulação com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28, e à distribuição dos imunogenes acima mencionados utilizando eritrócitos ou nanopartículas.
Contexto da invenção A SIDA (síndroma da imunodeficiência adquirida) é causada pelo HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana) e caracteriza-se por imunodeficiência, tumores, como sarcoma de Kaposi (KS) e linfomas de células B, infecções oportunistas e perturbações do sistema nervoso central. Uma vez que a SIDA está disseminada em todo o mundo e tem mortalidade elevada, um dos objectivos mais importantes da Saúde Pública é desenvolver uma vacina profiláctica e/ou terapêutica contra o HIV ou SIDA. A maior parte das estratégias passadas e presentes utilizaram como imunogenes 2 o envelope virai ou suas subunidades, mas com resultados insatisfatórios devido à variabilidade elevada do envelope virai (ref. 162, 112 - ao longo desta especificação, várias referências são mencionadas entre parênteses para descrever mais completamente a técnica actual à qual pertence a presente invenção; a informação bibliográfica completa para cada citação encontra-se no final da especificação, imediatamente antes das reivindicações) . Em consequência, como alternativa à imunidade por esterilização, é opinião comum que poderia ser suficiente bloquear a progressão da infecção e aparecimento da doença. Além disso, podem obter-se respostas de protecção imunológica utilizando como imunogenes regiões de DNA do HIV (ref. 91, 17) . Devido aos dados experimentais publicados, o inventor crê ser necessário produzir uma vacina que utilize produtos virais diferentes de env. Em particular, as proteínas virais a serem utilizadas como imunogenes devem estar mais conservadas entre isolados do HIV, devem ser capazes de induzir uma resposta imunológica eficaz, humoral e celular, e devem ter uma função vital para o vírus. Esses produtos devem ser experimentados no modelo de primatas não humanos (porque o seu sistema imunológico é mais semelhante ao dos humanos em comparação com animais filogeneticamente mais distantes) e no qual se pode desenvolver SIDA após infecção com o vírus. A proteína Tat do HIV-1 tem todas as características para ser um bom imunogene para fins de vacinas: está conservada, é imunogénica e essencial nas fases iniciais da infecção virai. Além disso, a Tat desempenha um papel chave não só na replicação virai, transmissão e progressão da infecção, mas também no aparecimento e progressão de tumores associados à SIDA, por exemplo, KS, que é o tumor 3 mais frequente associado à SIDA, e de outras síndromas e sintomas que se desenvolvem após infecção com o HIV. A Tat é uma proteína com 86 - 102 aminoácidos,
dependendo da estirpe virai, codificada por dois exões. A Tat é produzida logo após a infecção, localiza-se no núcleo e procede à transactivação da expressão de todos os genes virais ao interagir com o "elemento que responde à Tat" (TAR) presente na LTR (Ref. 25). A Tat também desempenha um papel na virulência do HIV (Ref. 63, 113, 60, 84). O produto do primeiro exão (aminoácidos 1 - 72) está conservado entre diferentes isolados virais (Ref. 112) e é suficiente para a transactivação dos produtos do HIV-1 (Ref. 25). Contém 4 domínios. O domínio acídico (aminoácidos 1 - 21) é importante para a interacção da Tat com proteínas celulares; a região rica em cisteína (aminoácidos 22 - 37) representa o domínio de transactivação. Esta região é a mais conservada entre os isolados primários (Ref. 108) de cisteína 22 com uma glicina abole a capacidade da Tat para proceder à transactivação da LTR do HIV (Ref. 166) o domínio do "core" (aminoácidos 38 - 48) também está conservado e é importante para a função. A substituição de lisina 41 por uma treonina inactiva a actividade de transactivação da Tat na LTR do HIV (Ref. 70); o domínio básico (aminoácidos 49 - 57), rico em arginina e lisina, é necessário para a localização nuclear da Tat e liga-se especificamente ao seu alvo de RNA (TAR) (Ref. 25). Além disso, a região básica é responsável pela ligação de Tat extracelular a heparina e a proteoglicanos sulfato de heparano (HSPG) (Ref. 26). Mutações na região básica abolem essas interacções. A porção carboxi-terminal da Tat não é necessária para a transactivação da LTR, mas contém uma sequência arginina- 4 glicina-ácido aspártico (RGD), habitualmente presente nas proteínas da matriz extracelular (ECM), que é responsável pela ligação da Tat aos receptores integrinas α5βι e ανβ3. Estas interacções medeiam os efeitos da Tat em tumores associados a SIDA e nos sistemas imunológico, vascular e nervoso (Ref. 11, 42, 170, 25). Durante a infecção aguda de células T com o HIV-1, ou após a transfecção do gene tat em células COS-1, a proteína Tat é libertada na ausência de morte celular no ambiente extracelular (Ref. 40, 41, 25) . Também ocorre libertação in vivo de Tat a partir de células infectadas, pois a Tat extracelular está presente no soro de sujeitos infectados (Ref. 164) e em lesões de KS associado a SIDA (Ref. 42) . Após a libertação, parte da proteína permanece numa forma solúvel e parte liga-se aos HSPGs da ECM. A Tat ligada aos HSPGs pode ser recuperada numa forma solúvel por adição de heparina. A ligação à heparina deve-se à região básica da Tat; previne os efeitos da Tat extracelular e protege a proteína de oxidação. Esta característica foi por nós utilizada para purificar Tat com actividade biológica elevada (Ref. 26) . A Tat extracelular pode ser interiorizada por células, pode migrar para o núcleo e proceder à transactivação da expressão de genes virais (Ref. 49, 98, 100, 41). A interiorização da Tat ocorre por endocitose mediada pela ligação da região RGD da Tat a (Χδβι e ανβ3 (Ref. 10, 42, Ensoli et ai., dados não publicados) e/ou pela região básica que se liga aos HSPGs. A Tat pode activar a replicação virai e transmissão do vírus também por mecanismos indirectos, envolvendo a modulação da expressão de genes celulares que desempenham um papel chave no controlo da sobrevivência celular, e na expressão de citoquinas inflamatórias (IC) com um efeito na replicação virai (Ref. 25). 5
Para além da sua importância na replicação virai, a Tat desempenha um papel importante na patogénese da SIDA. A Tat é capaz de modular a sobrevivência e proliferação de células infectadas e não infectadas causando activação ou repressão de citoquinas, como IL-2 (Ref. 123, 163, 31), ou de genes que desempenham um papel chave no ciclo celular (Ref. 145, 169, 164, 173). Os efeitos anti- ou pró-apoptóticos da Tat dependem de alguns factores, como o tipo de célula, o facto da Tat ser expressa pela célula ou adicionada à célula e a sua concentração (Ref. 40, 41, 171) . A Tat é o factor responsável pela frequência e agressividade aumentadas de KS em sujeitos infectados com o HIV-1 (Ref. 43, 33). O KS é um tumor de origem vascular e é a neoplasia mais frequente em indivíduos infectados com o HIV. A Tat induz células de KS e células endoteliais activadas por ICs a migrarem, a expressarem a colagenase de tipo IV, a invadirem a ECM e a proliferarem, em que esses mecanismos são necessários para a angiogénese e invasão tumoral (Ref. 40, 41, 42, 2, 46). Esses efeitos da Tat são induzidos por ICs, uma vez que estimulam a expressão dos receptores da Tat, α5βι e ανβ3 (Ref. 10). A Tat imita o efeito de proteínas da ECM, como fibronectina e vitronectina, e tanto a região RGD como a região básica são necessárias para os efeitos da Tat extracelular em células de KS, na angiogénese e na progressão do KS. A capacidade da Tat extracelular para se ligar in vivo aos seus receptores nas lesões de KS associado a SIDA (Ref. 40) suporta a ideia de que a Tat está envolvida no aparecimento e manutenção de KS associado a SIDA. Além disso, ratinhos transgénicos para o gene tat desenvolvem KS ou outros 6 fenótipos, dependendo do nível de expressão do transgene (Ref. 160, 34).
Foi sugerido que a Tat desempenha um papel nos fenómenos hiperproliferativos e na patogénese dos linfomas B, frequentemente observados em sujeitos seropositivos e em ratinhos tat-transgénicos (Ref. 157), através de mecanismos que envolvem o aumento da expressão de bcl-2 e de citoquinas (Ref. 122). Outras evidências confirmam um papel provável da Tat na oncogénese (Ref. 72). A Tat também consegue activar a expressão de promotores virais, como os dos vírus herpes e de outros vírus que são reactivados em indivíduos com SIDA, promovendo o aparecimento e progressão de infecções oportunistas (Ref. 25). A Tat também aparenta ser capaz de exercer efeitos neurotóxicos, directos (através das regiões básica e RGD) e indirectos, por indução de ICs que exercem um efeito tóxico nos neurónios do sistema nervoso central ou na barreira hematoencefálica (Ref. 25). No que se refere à resposta imunológica à Tat, alguns estudos sugerem que anticorpos anti-Tat desempenham um papel protector no controlo da evolução da doença in vivo (Ref. 130, 135, 136, 149, 127). Além disso, in vitro, anticorpos anti-Tat não só suprimem a interiorização, a activação transcelular da Tat e infecção virai (Ref. 41, 127), mas também inibem a proliferação e migração induzida pela Tat de células de KS e a formação de lesões do tipo KS em ratinhos (Ref. 40, 41, 42). Por fim, os nossos resultados preliminares demonstram que anticorpos anti-Tat estão ausentes em sujeitos com KS associado a 7 SIDA, sugerindo que esses sujeitos não conseguem bloquear a actividade da Tat extracelular. 0 desenvolvimento de uma resposta anti-Tat mediada por células na fase inicial da infecção é importante para o controlo da própria infecção (Ref. 161, 133, 59) e há uma correlação inversa entre a presença de CTLs anti-Tat específicos e progressão da doença (Ref. 156) . Esses resultados foram obtidos em estudos em macacos inoculados com SlVmac (Ref. 91, 158) . Além disso, dados recentes em ratinhos de diferentes espécies nos quais a Tat foi inoculada, quer como plasmídeo quer como proteína, mostraram que é possível induzir uma resposta humoral e celular à proteína (Ref. 61). No entanto, foi observada variabilidade entre várias espécies de ratinhos, e esses resultados não foram reproduzidos com os mesmos imunogenes em primatas não humanos (Ref. 124) . A falta de reprodutibilidade, no modelo de primata não humano, dos resultados de experiências de vacinas realizadas em ratinhos é frequente e possivelmente deve-se aos diferentes sistemas imunológicos destas duas espécies que conseguem induzir respostas imunológicas diferentes com o mesmo imunogene, como demonstrado para a proteína Env do HIV. Assim, os candidatos a vacinas para humanos devem ser testados em primatas não humanos e não só em espécies inferiores. 0 inventor crê que outras proteínas virais, ou partes destas, poderão ser associadas à Tat para intensificar uma resposta imunológica específica contra o HIV e também poderão ser benéficas na vacinação contra o aparecimento de tumores e de outras patologias e sintomas associados à 8 infecção com o HIV. Esses produtos são as proteínas Nef,
Rev e Gag do HIV. A Nef é outra proteína reguladora virai importante para o desenvolvimento de doença (Ref. 3, 48, 58). A Nef é produzida logo após a infecção e é libertada no ambiente extracelular (Ensoli, dados não publicados). No sistema
SlVmac/macaco, a presença da Nef está correlacionada com elevada replicação virai e com progressão para SIDA (Ref. 71). A Nef é mais variável do que a Tat (Ref. 112) . A Nef é uma proteína imunogénica (Ref. 53, 32, 35, 151) e é capaz de induzir CTLs (Ref. 16, 36). Em particular, foi identificada uma região imunodominante da Nef (região 73 -144) que é reconhecida por CTLs na maior parte dos pacientes infectados com o HIV. A Rev é uma proteína reguladora virai produzida inicialmente durante a infecção (Ref. 51, 119) e é libertada no ambiente extracelular (Ensoli et al., dados não publicados). A Rev é essencial para a replicação do HIV e para a progressão da doença e é codificada por dois exões, que se sobrepõem parcialmente a regiões codificadoras da Tat. A Rev é uma proteína nuclear (Ref. 44) necessária para a expressão dos RNAs mensageiros virais que codificam para as proteínas tardias (Ref. 97). A Rev é uma proteína altamente conservada entre os vários isolados virais do HIV-1 (Ref. 111) e é imunogénica. De facto, induz a produção de anticorpos específicos dirigidos contra os dois domínios funcionais da proteína (Ref. 120) durante a infecção natural no homem (Ref. 131) e após inoculação em ratinhos (Ref. 61). Níveis mais baixos de anticorpos anti-
Rev no soro de indivíduos infectados parecem estar
correlacionados com a progressão para SIDA (Ref. 131). A 9
Rev consegue induzir CTLs no homem e no macaco (Ref. 156, 158), e foi relatado que uma resposta de CTLs anti-Rev especifica, inicialmente durante a infecção, está inversamente correlacionada com a progressão da doença (Ref. 156, 158).
Outro alvo virai é o gene gag, que é expresso tardiamente durante a infecção e codifica para um grupo de proteínas estruturais altamente imunogénicas do capsídeo (Ref. 18, 147) . Os títulos do anticorpo anti-Gag são elevados e estáveis durante a fase assintomática da infecção e atingem níveis muito baixos quando a infecção progride para SIDA completamente desenvolvida, em combinação com a queda de linfócitos CD4+ e na presença do vírus no sangue periférico (Ref. 174, 73). As proteínas Gag induzem actividade de CTLs inicialmente durante a infecção, no homem e em primatas (Ref. 103, 168), e a sua presença está significativamente relacionada com o controlo da viremia inicial e com progressão da doença (Ref. 175, 6, 134, 167, 92) . Por fim, as proteínas pl7 e p24 contêm epítopos imunodominantes que são mantidos em diferentes isolados do HIV-1 e HIV-2 e que são reconhecidos por CTLs (Ref. 89, 19, 114, 155, 115). O inventor crê que citoquinas ou partes destas, como IL-12 e IL-15, ou outras citoquinas imunomoduladoras, como IFNa ou IFNp, ou outras proteínas que aumentam o efeito imunogénico da Tat, podem ser utilizadas como adjuvantes na formulação da vacina anti-Tat. A IL-12 é uma citoquina de forte regulação imunológica produzida por células apresentadoras de antigenes (APC), como células B e dendríticas (Ref. 154) . A IL-12 é produzida logo após infecção pelo HIV e tem uma acção pró-inflamatória que 10 induz células NK e linfócitos T a produzirem IFNy, que activa fagócitos e promove a indução de linfócitos Thl. A IL-12 desempenha um papel fundamental na resistência a algumas infecções causadas por bactérias, fungos, virus, e exibe elevada actividade antitumoral. Várias evidências sugerem que virus que induzem supressão imunológica, como HIV e virus do sarampo, também actuam por mecanismos que suprimem a produção de IL-12 (Ref. 57, 50, 144). A IL-15 é uma citoquina pleiotrópica expressa por tecidos não linfóides, por monócitos/macrófagos activados e por células dendriticas (DC) (Ref. 125, 66). A IL-15 desempenha um papel importante na regulação da actividade de NKs, na proliferação de linfócitos T e na actividade de CTLs (Ref. 67, 24). A IL-15 induz a expressão de CTLs contra antigenes do HIV, na ausência de IL-2 e linfócitos T CD4+ funcionais (Ref. 68, 1) . Além disso, de modo semelhante à IL-2, a IL-15 induz a expansão de linfócitos com actividade citotóxica ("agressores activados por linfoquinas", LAK) e estimula a produção de IFNy em PBMCs de pacientes seropositivos (Ref. 93). A IL-15 activa monócitos para produzirem quimioquinas, desempenhando um papel no aparecimento de processos inflamatórios (Ref. 8).
Estudos recentes mostraram que a co-estimulação de linfócitos CD4+ com esférulas paramagnéticas, revestidas com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28, determina uma expansão logarítmica e policlonal de linfócitos de sujeitos infectados com o HIV (Ref. 82) sem activar a replicação e transmissão do vírus. Essa actividade antiviral é uma consequência da modulação negativa da expressão de CCR5, o co-receptor de estirpes monocitotrópicas do HIV-1 (referência 23) , e, em menor 11 extensão, dos níveis elevados de quimioquinas induzidos pela co-estimulação com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 (Ref. 132). 0 inventor crê que a possibilidade de expandir linfócitos autólogos de sujeitos infectados com o HIV na ausência de replicação/transmissão virai permite obter uma imunização ex vivo eficaz, descrita nos exemplos, que pode ajudar muito a desenvolver uma vacina anti-Tat.
No contexto dos diferentes sistemas com a finalidade de gerar vacinas antivirais e antitumorais eficazes, o inventor crê que a utilização de células dendríticas poderá ser chave para induzir uma resposta imunológica para a Tat. Isto deve-se ao facto destas células serem as mais eficientes na apresentação do antigene e de serem as únicas capazes de estimular linfócitos virgens na ausência de adjuvantes (Ref. 150). A utilização de células dendríticas substitui a função de vários adjuvantes que consiste na indução de uma resposta imunológica inespecífica (imunidade natural) que, por sua vez, gera uma forte resposta específica primária na presença do antigene.
Uma vez que a transmissão da infecção pelo HIV ocorre maioritariamente ao nível das mucosas (genitais e rectais no adulto, orais no recém-nascido), o inventor crê que a indução de imunidade protectora ao nível das mucosas é um objectivo primário. Muitos estudos mostraram recentemente a possibilidade de induzir imunização ao nível das mucosas, local e sistémica. Em particular, verificou-se que as vias nasal e oral são as mais eficientes na indução de uma resposta imunológica eficaz ao nível das mucosas, mesmo em sítios distantes, como as mucosas genitais (Ref. 138, 118). Em particular, o inventor crê que a utilização de bactérias S. Gordonii e Lactobacillus, modificadas para expressarem 12 os antigenes virais acima mencionados, poderá ser uma estratégia válida para induzir ou potenciar uma resposta imunológica especifica ao nivel das mucosas em macacos e no homem. De facto, estas bactérias são capazes de colonizar as mucosas orais e vaginais do ratinho e de induzir uma resposta de anticorpos especifica, local e sistémica, contra antigenes heterólogos expressos na superfície de bactérias recombinantes (Ref. 116, 104, 106, 121, 117, 139, 105, 107) . Por fim, estas bactérias actuam como vectores vivos e podem induzir uma estimulação prolongada do sistema imunológico. Além disso, o inventor crê que vectores virais recombinantes que não se replicam e não são patogénicos, como vírus herpes simplex do tipo 1 (HSV-1) (Ref. 99), podem ser utilizados para expressar proteínas virais para imunização sistémica (intradérmica) e ao nível das mucosas (vias oral, vaginal e nasal). De facto, estes vectores conseguem acomodar grandes sequências exógenas (Ref. 52, 64), tais como vários genes do HIV (regulador, acessório e estrutural). Suplementarmente, também podem administrar-se vectores de herpes pela via oral, nasal ou vaginal (Ref. 176, 75). O inventor crê que a Tat (na forma de proteína ou DNA), isoladamente ou em combinação com os outros imunogenes descritos acima, também pode ser inoculada utilizando novos sistemas de distribuição, como eritrócitos ou nanopartículas. Em particular, o inventor crê que é possível distribuir antigenes ligados à membrana de eritrócitos autólogos (Ref. 95, 96). Uma vez que estes eritrócitos são removidos do sangue por macrófagos, células apresentadoras de antigenes profissionais, passados apenas 120 dias, esta característica pode ser utilizada para fins de vacinas. Por fim, outra estratégia de distribuição 13 consiste na utilização de nanoparticulas que conseguem transportar proteínas e DNA (Ref. 27, 172). As nanoesferas são partículas coloidais poliméricas com composição química diversa, variáveis entre 10 - 1000 nm. Diferentes substâncias (oligonucleótidos, fármacos, proteínas, péptidos, DNA) podem ser carregadas na sua superfície ou absorvidas na partícula e distribuídas no citoplasma ou no núcleo das células, de onde são lentamente libertadas. Isto permite a utilização de quantidades muito pequenas da substância a ser distribuída.
Com base nos resultados descritos acima, o inventor crê que a imunização com Tat, isoladamente ou em combinação com outros produtos virais ou citoquinas imunomoduladoras, ou partes destes, na presença ou não de adjuvantes, poderá bloquear a replicação virai em sujeitos expostos após vacinação e nos sujeitos infectados, mantendo a infecção numa fase abortiva que pode ser mais facilmente controlada pelo sistema imunológico. Em consequência, o inventor crê que uma vacina à base da Tat deverá ser capaz de induzir uma resposta imunológica, humoral e celular, suficiente para bloquear ou reduzir a replicação ou a transmissão do vírus e, assim, capaz de controlar a replicação do vírus e de bloquear uma infecção produtiva, progressão para doença e o aparecimento de tumores e de outras síndromas e sintomas associados a SIDA. Em consequência, é possível utilizar a vacina anti-Tat para fins preventivos e terapêuticos. De facto, uma resposta humoral contra a Tat poderá neutralizar os efeitos da Tat extracelular reduzindo e limitando a infecção, ao passo que a resposta induzida por células contra a Tat, bem como contra outras proteínas virais compreendidas na formulação de vacina, poderá destruir as células infectadas com o vírus, conduzindo ao 14 controlo da infecção. Isto dá ao sistema imunológico o período de tempo necessário para desenvolver uma resposta completa contra todos os componentes virais do vírus infeccioso na ausência de danos irreversíveis devido à replicação virai.
Foi descrita a utilização da Tat como imunogene (WO 95/31999). No entanto, é revelada a utilização de uma proteína biologicamente inactiva; além disso, na mesma candidatura de patente, não são apresentadas evidências da actividade biológica da proteína Tat "nativa". A patente WO 9415634 refere-se a oligopéptidos sintéticos homólogos às sequências de sinal das proteínas Tat e Rev que podem ser utilizados no tratamento de infecções pelo HIV. Contudo, não são apresentadas indicações da preparação nem testes para demonstrar a eficácia das proteínas reveladas.
Hinkula et ai., Vaccine, Volume 15, 8, 874-878 (1997), revelam testes de vacinações em ratinhos baseados em vacinas que contêm Tat, mas os resultados aí obtidos em espécies inferiores não podem ser directamente traduzidos para primatas não humanos.
Adicionalmente, há um forte preconceito técnico contra a utilização de uma proteína Tat biologicamente activa, pois crê-se que intensifica a replicação virai em sujeitos infectados e/ou conduz a supressão imunológica em indivíduos seronegativos ou seropositivos (A. Tonelli "Aids, un vaccino per sperare" La Republica, página 10, 24 de Outubro de 1998). 15
Como é evidente do que foi exposto acima, apesar dos esforços feitos ainda não foi desenvolvida uma vacina anti-HIV eficaz baseada na Tat.
Resumo da invenção
Um objectivo da presente invenção consiste em proporcionar uma proteína Tat para utilização como vacina como definido nas reivindicações.
Outro objectivo da invenção é uma proteína ou vacina a ser utilizada em humanos, de forma profiláctica ou terapêutica, contra a SIDA, tumores associados a SIDA e síndromas e sintomas associados ao HIV, compreendida pela proteína Tat de tipo selvagem recombinante (ID Seq. 1), expressa e purificada como descrito, administrada isoladamente ou conjugada com o epítopo do toxóide tetânico de auxiliadoras T ou outros epítopos de auxiliadoras T.
Outro objectivo da invenção é uma vacina como descrita acima em combinação com proteínas Nef, Rev e/ou Gag do HIV ou péptidos de Nef, Rev e Gag, administrada como proteínas de fusão Tat/Nef, Tat/Rev, Tat/Gag ou como partes destas proteínas.
Outro objectivo da invenção é uma vacina como descrita acima em combinação com proteínas recombinantes de citoquinas imunomoduladoras, como IL-12, IL-15 ou outras moléculas ou partes destas, capazes de aumentar a resposta imunológica antiviral, ou uma vacina constituída por proteínas de fusão Tat/IL-12, Tat/IL-15 ou Tat/outras, ou partes destas, capazes de aumentar a resposta imunológica antiviral. 16
Outro objectivo da invenção é uma vacina anti-Tat, na forma de uma proteína, isoladamente ou combinada como descrito acima, para imunização com células dendríticas autólogas por tratamento ex vivo.
Outro objectivo da invenção é uma vacina anti-Tat, na forma de uma proteína, isoladamente ou combinada como descrito acima, para imunização ao nível das mucosas (nasal, oral, vaginal ou rectal).
Outro objectivo da invenção é uma vacina anti-Tat, na forma de uma proteína, isoladamente ou combinada como descrito acima, para imunização ex vivo de células do sangue periférico de sujeitos infectados, expandidas por co-estimulação com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 conjugados a esférulas paramagnéticas, e novamente infundidas no hospedeiro.
Outro objectivo da invenção é uma vacina anti-Tat, na forma de uma proteína como descrito acima, combinada com inibidores da replicação virai.
Outro objectivo da invenção é uma vacina anti-Tat como já descrita em combinação com adjuvantes que aumentam a resposta imunológica.
Outro objectivo da invenção é uma vacina anti-Tat, isoladamente ou em combinação como já descrito, administrada por sistemas de distribuição específicos, como nanopartículas, vectores de herpes, glóbulos vermelhos, bactérias ou qualquer outro sistema de distribuição, pelos quais a vacina acima descrita, em todas as suas combinações, pode ser administrada. 17
Outros objectivos serão evidentes a partir da descrição pormenorizada da invenção.
Descrição breve das figuras FIG. IA. Inibição da captação de proteína Tat etiquetada com rodamina 10 ng/mL por pré-incubação de células endoteliais activadas com citoquinas com anticorpos anti-integrina. FIG. IA. Painel A. Células pré-incubadas com tampão, incubadas com BSA. FIG. IA. Painel B. Células pré-incubadas com tampão, incubadas com Tat. FIG. IA. Painel C. Células pré-incubadas com anticorpos monoclonais CDw49e e CD29, incubadas com Tat. FIG. IA. Painel D. Células pré-incubadas com anticorpos monoclonais CD51 e CD61, incubadas com Tat. FIG. IA. Painel E. Células pré-incubadas com anticorpos anti-factor VIII humano (anticorpos de controlo), incubadas com Tat. FIG. 1B. Capacidade da proteína Tat-cys22 (Tat22) purificada para competir com a actividade de transactivação da proteína Tat de tipo selvagem, monitorizada por ensaios de CAT. FIG. 2A. Produção de IgG específica anti-Tat em macacos vacinados com a proteína Tat, determinada por ensaio imunoenzimático (ELISA). Resultados obtidos em dois macacos inoculados subcutaneamente com 10 ou 100 μρ de proteína Tat recombinante novamente suspensa em 250 μΤ de soro autólogo e 250 μΤ de RIBI. FIG. 2B. Produção de IgG específica anti-Tat em macacos vacinados com a proteína Tat, determinada por 18 ensaio imunoenzimático (ELISA). Resultados para o macaco de controlo (M3). FIG. 3. Titulação de anticorpos anti-Tat em plasma de macacos inoculados com 100 (Ml) e 10 (M2) pg de proteína
Tat recombinante, descritos nas Fig. 2A e Fig. 2B. FIG. 4A. Mapeamento dos epítopos da Tat reconhecidos pela IgG anti-Tat de macacos injectados com 100 (Ml) e 10 (M2) pg de proteína Tat recombinante, descritos na Fig. 2A e Fig. 2B. Apresentam-se os resultados médios de plasma diluído 1:50 para cada péptido testado em duplicado. FIG. 4B. Mapeamento de acordo com a Fig. 4A. Apresentam-se os títulos do anticorpo no plasma, expressos como o recíproco da diluição mais elevada à qual o teste ainda foi positivo. FIG. 5. Anál ise da resposta de IgM humoral anti-Tat específica em macacos inoculados com proteína Tat, determinada por ELISA. FIG. 6. Análise da produção de IgG anti-Tat específica em macacos inoculados com proteína Tat, testada por ELISA. FIG. 7. Titulação de anticorpos anti-Tat no plasma dos macacos inoculados com Tat recombinante (10 pg) na presença de RIBI (Ml-3) ou Alum (M4-6) descritos na Figura 6. FIG. 8A. Epítopos da Tat reconhecidos por IgG anti-Tat de macacos inoculados como descrito na Figura 6. Os resultados referem-se a amostras diluídas 1:50 e são a média de cavidades duplicadas. FIG. 8B. Epítopos da Tat de acordo com a Fig. 8A. Os resultados referem-se à titulação do plasma apresentado na Fig. 8A e estão expressos como a diluição recíproca mais elevada de plasma à qual o teste ainda foi positivo. FIG. 9. Análise de CTLs específicas para Tat. 19 FIG. 10. Análise da resposta de hipersensibilidade retardada à Tat por teste na pele. FIG. 11A. Resposta de IgG humoral à Tat em macacos vacinados com DNA da Tat. Apresentam-se os resultados obtidos de dois macacos vacinados com 200 (Ml) e 500 (M2) μς de plasmideo pCV-Tat. FIG. 11B. Resposta de IgG humoral à Tat em macacos vacinados com DNA da Tat. Resultados para o macaco de controlo (M3). FIG. 12. Titulação de anticorpos anti-Tat no plasma do macaco M2 inoculado i.d. com 200 μρ de pCV-Tat. FIG. 13. Análise da produção de IgG anti-Tat em três macacos (M9 até Mil) inoculados com 1 mg de pCV-Tat, e num macaco de controlo (M12) inoculado com 1 mg de vector de controlo pCV-0. FIG. 14. Cinética da resposta proliferativa de PBMCs de Macaca fascicularis à co-estimulação com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 em esférulas paramagnéticas (esférulas anti-CD3/28). FIG. 15A. Efeito antiviral da co-estimulação com esférulas anti-CD3/28 em PBMCs de Macaca fascicularis. Macaco MK 193. FIG. 15B. Efeito antiviral da co-estimulação com esférulas anti-CD3/28 em PBMCs de Macaca fascicularis. Macaco MK D91. FIG. 15C. Efeito antiviral da co-estimulação com esférulas anti-CD3/28 em PBMCS de Macaca fascicularis. Macaco MK 9301. FIG. 15D. Efeito antiviral da co-estimulação com esférulas anti-CD3/28 em PBMCs de Macaca fascicularis. Macaco MK 9401. FIG. 16A. Caracterização funcional de células dendriticas (DC) obtidas do sangue periférico do macaco. 20
Incorporação de 3H-timidina no dia 4 da cultura de leucócitos misturados alogeneicos (AMLR). FIG. 16B. Caracterização funcional de células dendriticas (DC) obtidas do sangue periférico do macaco. APCs, tais como Dcs e Mo, obtidas como relatado na Figura 16A, foram provocadas com linfócitos T de outro macaco.
Descrição pormenorizada da invenção A presente invenção refere-se à Tat como definida nas reivindicações como principio activo para uma vacina profiláctica e/ou terapêutica contra infecção pelo HIV, progressão para SIDA e desenvolvimento de tumores e outras síndromas e sintomas em sujeitos infectados com o HIV. A Tat, ou Tat de tipo selvagem, é, na sua forma activa ou, mais correctamente, na sua forma biologicamente activa (como aqui explicado abaixo), uma proteína recombinante. Mais particularmente, a invenção refere-se a uma vacina baseada na Tat do HIV-1 como imunogene, inoculada como uma proteína recombinante, isoladamente ou em combinação com outros genes ou produtos de genes virais (Nef, Rev, Gag) ou partes destes, ou em combinação com várias citoquinas imunomoduladoras (IL-12, IL-15) ou com o gene que codifica para uma citoquina imunomoduladora ou respectiva parte. A Tat, Nef, Rev, Gag e as citoquinas imunomoduladoras são administradas como uma mistura de proteínas recombinantes, péptidos ou proteínas de fusão (Tat/Nef, Tat/Rev, Tat/Gag, Tat/IL-12, Tat/IL-15) ou como DNA plasmídico.
Na presente descrição, "Tat de tipo selvagem" e "Tat na sua forma activa" devem ser considerados sinónimos de "Tat biologicamente activa". 21
Pretende-se que "Tat biologicamente activa" se refira à proteína que, em concentrações picomolares até nanomolares (desde 10 ng/mL ou menos até 1 pg/mL, preferivelmente 0,1 ng/mL até 100 ng/mL), é capaz de: (i) entrar e localizar-se nos núcleos de células endoteliais ou células dendríticas activadas, como medido no Exemplo IA; (ii) activar a proliferação, migração e invasão de células do sarcoma de Kaposi (KS) e proteína de células endoteliais activadas por citoquinas (Ref. 40, 2); (iii) activar a replicação do vírus quando adicionada a células infectadas, medido a) pelo resgate de pró-vírus deficientes em Tat em células HLM-1 após a adição de proteína exógena (Ref. 41), b) pela transactivação da expressão do gene do HIV-1 em células transfectadas com uma proteína plasmídica promotor-repórter do HIV-1 (Ref. 41); (iv) induzir em ratinhos o desenvolvimento de lesões do tipo KS na presença de factores angiogénicos ou citoquinas inflamatórias (Ref. 42) . O inventor considera ser fundamental que se verifique um dos pontos (i) ou (ii) para a Tat biologicamente activa, preferivelmente devem verificar-se os dois, mais preferivelmente devem verificar-se o ponto (i) ou ponto (ii) ou ambos em combinação com o ponto (iii) a) e/ou (iii) b) . Obter-se-ão os melhores resultados quando se verificarem todos os pontos (i) até (iv). Uma proteína Tat com estas características é capaz de induzir in vivo uma resposta imunológica citotóxica e antiviral. De facto, uma Tat biologicamente activa com as características mencionadas acima é capaz de se ligar a receptores específicos da superfície celular e é recolhida via estes 22 receptores. A captação da Tat é essencial para induzir uma resposta citotóxica.
Estudos prévios ou a decorrer, relacionados com o desenvolvimento de uma vacina baseada na Tat, não utilizaram uma proteína Tat biologicamente activa com as características mencionadas acima.
Um método para obter e para manipular uma Tat biologicamente activa de acordo com a presente invenção é descrito no Exemplo 1.
Também é descrito um método de imunização que utiliza células dendríticas autólogas tratadas ex vivo com a proteína Tat recombinante, ou respectivos péptidos, isoladamente ou com uma mistura de proteínas recombinantes ou péptidos (Tat, Nef, Rev, Gag) ou com a proteína Tat e uma ou mais citoquinas imunomoduladoras, ou partes destas, ou transduzidas com vectores eucarióticos contendo o gene tat isoladamente ou em combinação com genes virais que codificam para Nef, Gag ou Rev, ou tat e o gene que codifica para uma citoquina imunomoduladora, ou respectiva parte.
Também são descritas estratégias para induzir uma resposta imunológica ao nível das mucosas. A Tat, isoladamente ou em combinação com proteínas virais e/ou citoquinas, é inoculada ao nível das mucosas para intensificar e induzir a resposta imunológica local. A proteína Tat do HIV-1 também será utilizada para a imunização ex vivo de linfócitos CD4+ e CD8+ isolados do sangue periférico de sujeitos infectados. As células específicas para o antigene Tat serão seguidamente 23 expandidas in vitro por co-estimulação com anticorpos monoclonais dirigidos contra CD3 e CD28 e serão novamente infundidas. Por fim, também é descrita a utilização de mutantes da Tat, identificados nos exemplos, a serem utilizados como imunogenes, como alternativa à Tat de tipo selvagem. Os mutantes da Tat i) estão localizados na região de cisteina (cys22) e ii) na região do "core" (lys41), são iii) o mutante deletado na sequência RGD, iv) o mutante duplo deletado na lisina 41 e na RGD. Alternativamente à utilização de mutantes da Tat ou péptidos da Tat (de tipo selvagem ou mutados, como a proteína) no caso de vacinação terapêutica, inibidores da replicação virai serão utilizados juntamente com o imunogene. A este respeito, com "inibidores da replicação virai" pretende-se designar todas as moléculas presentemente conhecidas, ou aquelas que serão posteriormente descobertas (inibidores nucleosídicos e não nucleosídicos da transcriptase reversa, inibidores de proteases, RNA anti-sentido e, em geral, todas as moléculas capazes de bloquear a expressão de genes do HIV), capazes de reduzir ou bloquear a replicação do HIV. Tal como foi previamente referido, são descritos diferentes métodos de imunização que utilizam a proteina Tat, péptidos e DNA da Tat em associação com outros genes ou proteínas virais, ou respectivas partes, ou citoquinas imunomoduladoras ou genes que codificam para citoquinas imunomoduladoras, ou respectivas partes. Com "respectiva parte" pretende-se designar segmentos de genes ou de proteínas, descritos acima, cuja eficácia para induzir os mesmos efeitos imunogénicos do gene ou proteína completa está demonstrada. Além disso, uma vez que a eficácia de adjuvantes em estratégias de vacinas é conhecida, a presente invenção 24 refere-se à utilização de adjuvantes conhecidos e daqueles que serão posteriormente descobertos, administrados juntamente com a Tat (proteína ou DNA) e com combinações de Tat e outros genes ou proteínas virais ou celulares. De modo semelhante, pressupõe-se a eficácia de diferentes sistemas de distribuição da Tat (proteína ou DNA) e combinações de Tat e outros genes ou proteínas virais ou celulares na indução de uma resposta imunológica sistémica e local à Tat (imunização ao nível das mucosas).
Resultados obtidos pelo inventor (não publicados) indicam que apenas a proteína Tat, na sua forma biologicamente activa, é capaz de se ligar a receptores celulares específicos e de entrar na célula. Esta característica subjaz à resposta imunológica de células acessórias e das células imunológicas mais em geral e, de acordo com o inventor, tem importância fundamental na indução de uma resposta imunológica muito mais forte do que a proteína inactivada é capaz de induzir. Em conclusão, ao contrário da utilização de Tat inactivada como imunogene, proposta por alguns cientistas, o inventor pretende utilizar a Tat do HIV-1 na sua forma biologicamente activa para induzir uma resposta imunológica muito forte contra o HIV, capaz de prevenir a infecção ou o desenvolvimento da doença e de permitir estratégias terapêuticas eficientes em indivíduos infectados com o HIV-1. De acordo com o inventor, a vacina pode ser distribuída pelas vias sistémica (intramuscular, i.d., subcutânea, etc.) ou local (mucosas). É preferida a última via quando se utilizam bactérias (ver abaixo) como sistemas de distribuição. A vacina pode ser produzida do modo seguinte. A Tat pode ser preparada de acordo com o Exemplo 1, pode ser liofilizada e armazenada. No momento da utilização, pode ser novamente 25 suspensa num fluido biologicamente aceitável, como soro, plasma ou suas fracções. Células transformadas, compreendendo um vector que expressa a Tat, ou respectivas partes, como previamente descrito, e células que são cultivadas para expressarem a proteína Tat, que será isolada para ser utilizada, estão incluídas no âmbito da presente patente.
Pretende-se que estejam incluídas nesta invenção todas as variantes da Tat (incluindo todos os tipos e subtipos de estirpes do HIV) com actividade análoga ou superior à acima descrita. A presente invenção será agora descrita por intermédio dos seus exemplos específicos ilustrativos e não restritivos, nos quais se fará referência às figuras adjuntas.
Descrição pormenorizada das figuras FIG. IA. Inibição da captação de proteína Tat etiquetada com rodamina 10 ng/mL por pré-incubação de células endoteliais activadas com citoquinas com anticorpos anti-integrina. Células da veia umbilical humana (HUVE) activadas com citoquinas, tratadas como descrito na legenda da Tabela 2A, foram pré-incubadas em meio sem soro contendo tampão ou anticorpos e depois foram incubadas, durante 15 minutos a 37 °C, com Tat etiquetada com rodamina ou BSA etiquetada com rodamina 10 ng/mL.
Painel A. Células pré-incubadas com tampão, incubadas com BSA. 26
Painel B. Células pré-incubadas com tampão, incubadas com Tat.
Painel C. Células pré-incubadas com os anticorpos monoclonais CDw49e (anti-a5) e CD29 (anti-βΐ), incubadas com Tat.
Painel D. Células pré-incubadas com os anticorpos monoclonais CD51 (anti-αν) e CD61 (anti~P3), incubadas com Tat.
Painel E. Células pré-incubadas com anticorpos anti-factor VIII humano (anticorpos de controlo), incubadas com Tat. FIG. 1B. Apresenta-se a capacidade da proteína Tat-cys22 (Tat22) purificada para competir com a actividade de transactivação da proteína Tat de tipo selvagem, monitorizada por ensaios de CAT. Células H3T1, contendo o gene repórter LTR-CAT do HIV-1 (Ref. 148), foram incubadas com proteína Tat de tipo selvagem (100 ng), isoladamente ou na presença de um excesso molar de proteína Tat-cys22 (1 μς). A actividade de transactivação da LTR do HIV-1 da Tat e a capacidade da proteína Tat-cys22 para competir com a Tat de tipo selvagem foram determinadas às 48 horas após a transfecção, determinando a actividade de CAT em extractos citoplasmáticos (correspondente a 200 μρ de proteína) como descrito (Ref. 41) . Indicam-se as percentagens ( %) de acetilaçâo de 14C-cloranfenicol. FIG. 2. Produção de IgG específica anti-Tat em macacos vacinados com a proteína Tat, determinada por ensaio imunoenzimático (ELISA). (A) Mostra os resultados obtidos em dois macacos inoculados subcutaneamente com 10 ou 100 μρ de proteína Tat recombinante novamente suspensa em 250 μΐ 27 de soro autólogo e 250 μΐ de RIBI. (B) Mostra os resultados para o macaco de controlo (M3). Os macacos foram inoculados no instante 0 e após 2, 5, 10, 15, 22, 27, 32 e 37 semanas. Também se avaliaram anticorpos anti-Tat na semana 41 no macaco M2, inoculado com 10 μς de proteína Tat, e para o macaco M3. A presença dos anticorpos anti-Tat no plasma dos animais vacinados foi avaliada por ELISA, preparada e caracterizada do modo seguinte. A proteína Tat foi adsorvida em placas de PVC de 96 cavidades (100 ng/cavidade em 200 μΐ de tampão de carbonato 0,05 M pH 9,6) durante 12 horas a 4 °C. Após 3 lavagens com PBS lx sem Ca++ nem Mg++ (PBS-A) contendo Tween 20 (0,05 %), adicionou-se (em duplicado) plasma diluído 1:50 em 200 μΐ de tampão de carbonato e incubaram-se as placas a 37 °C durante 90'. Em seguida, as cavidades foram lavadas com PBS-A lx/Tween 0,05 %, seguido da adição de 100 μΐ do anticorpo secundário (diluído 1:1000 em PBS-A lx/Tween 0,1 % BSA 1 %) conjugado com peroxidase de rábano bravo, durante 90' à temperatura ambiente. Após 5 lavagens das cavidades adicionaram-se 100 μΐ de substrato (ABTS 1 mM, Amersham) durante 30 - 45' à temperatura ambiente. Efectuou-se a leitura no espectrofotómetro (405 nm) . Cada ELISA incluiu um soro policlonal de coelho anti-Tat (controlo positivo) diluído 1:200 até 1:6400, e o plasma pré-imunológico (controlo negativo) diluído 1:50. Calculou-se o valor limite na forma da média das densidades ópticas (O.D.) de plasma de macaco negativo + 3 desvios-padrão (D.P.), obtidas em todas as experiências com o plasma pré-imunológico. Os resultados apresentados são a média de cavidades duplicadas. > 2,7 indica que os valores da densidade óptica saíram da escala. 28 FIG. 3. Titulação de anticorpos anti-Tat em plasma de macacos inoculados com 100 (Ml) e 10 (M2) μς de proteína Tat recombinante, descritos na Fig. 2.
Realizou-se ELISA como descrito na Figura 2 e avaliou-se o plasma (em duplicado) em diluições escalares desde 1:50 até 1:25 600.
Os valores das ordenadas representam o inverso da diluição do plasma mais elevada à qual o teste ainda foi positivo. Calculou-se o valor limite para cada diluição, tendo correspondido à O.D. média de plasma pré-imunológico de todos os macacos em todas as experiências, + 3 D.P. FIG. 4. Mapeamento dos epítopos da Tat reconhecidos pela IgG anti-Tat de macacos injectados com 100 (Ml) e 10 (M2) μg de proteína Tat recombinante, descritos na Fig. 2. Para o mapeamento de epítopos realizou-se Elisa utilizando 8 péptidos sintéticos correspondentes aos aminoácidos (aa) da Tat 1-20, 21-40, 36-50, 46-60, 52-72, 56-70, 65-80, 73-86. Cem microlitros de cada péptido (10 μg/mL em PBS-A/BSA 0,1 %) foram absorvidos numa placa de PVC de 96 cavidades durante 12 horas a 4 °C. Em seguida, as placas foram lavadas e incubadas com 100 μΐ de PBS-A/BSA 3 % durante 2 horas a 37 °C. Após a incubação, as placas foram lavadas com PBS-A/Tween 20 0,05 % e depois adicionaram-se a cada cavidade 50 μΐ de plasma, diluído em PBS-A e BSA 3 %. Depois continuou-se Elisa como descrito na Figura 2. Obteve-se plasma na semana 37 após a imunização primária. Os valores limite, calculados para cada péptido e para cada diluição do plasma, corresponderam à O.D. média do plasma pré-imunológico em todas as experiências + 3 D.P. (A) 29
Apresenta os resultados médios de plasma diluído 1:50 para cada péptido testado em duplicado. (B) Apresenta os títulos do anticorpo no plasma apresentado em (A), expressos como o recíproco da diluição mais elevada à qual o teste ainda foi positivo. FIG. 5. Análise da resposta de IgM anti-Tat específica em macacos inoculados com Tat, determinada por ELISA. Três macacos (Ml-3) foram inoculados subcutaneamente com 10 μς de proteína Tat recombinante novamente suspensa em 250 μΒ de soro autólogo e 250 μΒ de RIBI; 3 macacos (M4-6) foram inoculados subcutaneamente com 10 μg de proteína Tat recombinante novamente suspensa em 250 μΒ de soro autólogo e 250 μΒ de Alum; 2 macacos de controlo foram inoculados subcutaneamente com RIBI (250 μΒ e 250 μΒ de soro autólogo) (M7) ou com Alum (250 μΒ e 250 μΒ de soro autólogo) (M8) . Os macacos foram inoculados no instante 0 e após 2, 6, 11 e 15 semanas. Investigou-se a presença de anticorpos às 2, 6, 11 e 15 semanas. O método de ELISA é descrito na Fig. 2. Neste caso, testou-se o plasma dos animais (em duplicado) a uma diluição 1:100 e utilizou-se como anticorpo secundário um soro de IgM de cabra anti-macaco (diluído 1:1000) conjugado com peroxidase de rábano bravo.
Calculou-se o valor limite como a média (+ 2 D.P.) dos valores O.D. do plasma pré-imunológico. Os resultados são a média dos valores O.D. (a 405 nm) de duas cavidades subtraídos do valor limite (Δ O.D. 405). FIG. 6. Análise da produção de IgG anti-Tat específica em macacos inoculados com Tat, testada por ELISA. Três macacos (Ml-3) foram inoculados com 10 μρ de proteína Tat 30 recombinante novamente suspensa em 250 pL de soro autólogo e 250 pL de RIBI; 3 macacos (M4-6) foram inoculados com 10 pg de proteína Tat recombinante novamente suspensa em 250 pL de soro autólogo e 250 pL de Alum; 2 macacos de controlo foram inoculados com RIBI (250 pL e 250 pL de soro autólogo) (M7) ou com Alum (250 pL e 250 pL de soro autólogo) (M8). Os macacos foram inoculados no instante 0 e após 2, 6, 11, 15, 21, 28 e 32 semanas. Na semana 36, os macacos Ml até M6 foram inoculados com 16 pg de proteína Tat novamente suspensa em 200 pL de ISCOMs e 300 pL de PBS. Os anticorpos também foram avaliados na semana 40 e 44. O método de ELISA e a determinação do valor limite estão descritos na Fig. 2. Os resultados apresentados referem-se a amostras diluídas 1:50. > 2,7 indica que o valor O.D. saiu da escala. FIG. 7. Titulação de anticorpos anti-Tat no plasma dos macacos inoculados com Tat recombinante (10 pg) na presença de RIBI (Ml-3) ou Alum (M4-6) descritos na Figura 6. Apresentam-se os resultados para cada plasma na forma do inverso da diluição do soro mais elevada à qual o teste ainda foi positivo. FIG. 8. Epítopos da Tat reconhecidos por IgG anti-Tat de macacos inoculados com proteína Tat recombinante (10 pg) na presença de RIBI (Ml até M3) ou Alum (M4 até M6), descritos na Figura 6. Obteve-se plasma na semana 21 após a imunização primária. O método de ELISA e a determinação do valor limite estão descritos na Figura 4. Os resultados em (A) referem-se a amostras diluídas 1:50 e são a média de cavidades duplicadas. Os resultados em (B) referem-se à 31 titulação do plasma apresentado em (A) e estão expressos como a diluição reciproca mais elevada de plasma à qual o teste ainda foi positivo. FIG. 9. Análise de CTLs específicos para Tat. 0 ensaio foi realizado como descrito na Tabela 5. Apresenta-se um exemplo na 36a semana para o macaco Ml, injectado subcutaneamente com 10 pg de Tat e RIBI, como descrito na Figura 6. Os quadrados (controlo) correspondem às células incubadas com células-alvo BLCL não submetidas a impulsos; os losangos correspondem às células incubadas com as células-alvo BLCL submetidas a impulsos com Tat (1 pg/250 000 células). FIG. 10. Análise da resposta de hipersensibilidade retardada à Tat por teste na pele. A proteína Tat (5, 1 e 0,2 pg) , novamente suspensa em 150 pL de PBS contendo BSA 0,1 % ou o tampão onde a Tat foi novamente suspensa, foi inoculada intradermicamente (i.d.) numa área rapada do dorso do animal. A área foi fotografada no instante 0 e após 24, 48 e 72 horas. Os macacos de controlo foram inoculados apenas com tampão. Apresenta-se um exemplo do macaco M2 (semana 15) , inoculado com 10 pg de Tat e RIBI, descrito na Fig. 6. A reacção positiva à Tat foi evidente às 48 horas após o teste na pele. FIG. 11. Resposta de IgG humoral à Tat num macaco (Ml) inoculado i.d. com 200 pg do plasmídeo pCV-Tat novamente suspenso em 150 pL de PBS-A, em dois sítios próximos dos nodos linfáticos axilares; um macaco (M2) foi injectado com 500 pg de pCV-Tat, novamente suspenso em 250 pL de PBS-A, intramuscularmente em dois sítios do dorso; o macaco de 32 controlo (M3) não foi inoculado com DNA de Tat mas recebeu, como controlo da especificidade, testes repetidos na pele com Tat. Os macacos foram injectados com pCV-Tat no instante 0 e após 5, 10, 15, 22, 27, 32 e 37 semanas. Por fim, passadas 42 semanas, os macacos receberam um reforço de proteína Tat recombinante (16 pg) novamente suspensa em 200 μΤ de ISCOMs e 300 μΤ de PBS. Avaliaram-se os anticorpos nas semanas 2, 5, 10, 15, 22, 27, 32, 37, 42, 48 e 58. A resposta de anticorpos anti-Tat no plasma (diluído 1:50) foi analisada por Elisa como descrito na Figura 2. Os resultados são a média de ODs de cavidades duplicadas. (A) Apresenta os resultados obtidos dos dois macacos vacinados com 200 (Ml) e 500 (M2) pg de plasmídeo pCV-Tat. (B) Apresenta os resultados do macaco de controlo (M3). FIG. 12. Titulação de anticorpos anti-Tat no plasma do macaco M2 inoculado i.d. com 200 pg de pCV-Tat. O ensaio Elisa é descrito na Figura 2. Os resultados nas ordenadas estão expressos como o recíproco da diluição mais elevada à qual o teste ainda foi positivo. FIG. 13. Análise da produção de IgG anti-Tat em três macacos (M9 até Mil) inoculados com 1 mg de pCV-Tat, e num macaco de controlo (M12) inoculado com 1 mg do vector de controlo pCV-0. O DNA foi novamente suspenso em 1 ml de PBS-A e foi injectado intramuscularmente em dois sítios do dorso. Os macacos foram inoculados no instante 0 e após 6, 11, 15, 21, 28 e 32 semanas. Na 36a semana, os macacos M9 até Mil receberam um reforço de 16 pg de proteína Tat recombinante novamente suspensa em 200 pL de ISCOMs e 300 pL de PBS. Avaliou-se a presença de anticorpos anti-Tat nas semanas 2, 6, 11, 15, 21, 28, 32, 36, 40 e 44. O ensaio 33
Elisa e a determinação do valor limite estão descritos na Figura 2. FIG. 14. Cinética da resposta proliferativa de PBMCs de Macaca fascicularis à co-estimulação com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 em esférulas paramagnéticas (esférulas anti-CD3/28). As PBMCs foram depletadas da subpopulação positiva para CD8 por métodos imunomagnéticos. Em seguida, metade dos linfócitos depletados anti-CD8 foi estimulada com PHA e IL-2 (40 U/mL) começando no dia 3; deixou-se a parte restante aderir aos anticorpos em esférulas revestidas anti-CD3/28, obtendo-se assim uma população de linfócitos positivos para CD3/28 e depletados em CD8. Adicionou-se IL-2 (40 U/mL) a esta fracção celular começando no dia 10 da cultura. Contaram-se as células e determinou-se a sua viabilidade em cada 2-3 dias. Manteve-se constante a razão esférulas: células. Apresenta-se o número de células em diferentes instantes. FIG. 15. Efeito antiviral da co-estimulação com esférulas anti-CD3/28 em PBMCs de Macaca fascicularis. Os linfócitos depletados em CD8 e CD3+/CD28+ depletados em CD8, obtidos de 4 macacos (Figuras 15A até 15D) pelos métodos descritos na Figura 14, foram estimulados como descrito no Exemplo 7. As duas fracções foram infectadas in vitro no dia 0 com 0,1 M.O.I. de SIVmac251/63M. A estimulação foi efectuada com PHA e IL-2, adicionados desde o dia 3, e com as esférulas anti-CD3/28 sem a adição de IL-2 exógena. Avaliou-se a produção virai determinando os níveis de p27 (ng/mL) nos sobrenadantes celulares nos dias 6 e 12 após a infecção, como descrito no Exemplo 7. (Em cinzento-claro PHA+IL~2, em cinzento-escuro Esférulas anti-CD3/28 em PBMCs CD8'/CD3+/CD28+.) 34 FIG. 16. Caracterização funcional de células dendríticas (DC) obtidas do sangue periférico do macaco. (A) Incorporação de 3H-timidina no dia 4 da cultura de leucócitos misturados alogeneicos (AMLR), para comparar a função apresentadora de antigenes (APC, determinada como a indução da proliferação de células T alogeneicas) de DCs e macrófagos (Mo) obtidos de PBMCs de Macaca fascicularis após separação em gradiente de Percoll e aderência em plástico. As células não aderentes foram removidas e as células aderentes foram induzidas para sofrerem maturação em DCs por adição de GMCSF (200 ng/mL) e IL-4 (200 unidades/mL) de 3 em 3 dias. Metade do meio de cultura (RPMI, FCS 10 %) foi removido e substituído por meio fresco de 3 em 3 dias. Após 6-7 dias observou-se uma alteração morfológica de células induzidas por citoquina, que adquiriram um fenótipo de DC típico (perda de aderência, formação de agregados, protuberâncias), também verificado determinando marcadores membranares típicos (dados não mostrados). Os monócitos não foram induzidos por citoquina e foram cultivados no mesmo meio, que foi substituído de 3 em 3 dias. As células mantiveram as características de monócitos-macrófagos, tais como a aderência. No dia 7, ambas as populações celulares foram provocadas com linfócitos T de um dador de sangue humano, purificados por gradiente de Ficoll e Percoll e por aderência, e depois foram congeladas. Realizaram-se ensaios de proliferação celular numa placa de 48 cavidades. Quinhentos mil linfócitos T foram estimulados com 5000 DCs ou Mos (razão T:APC = 100:1). Manteve-se a cultura durante 4 dias e transferiram-se alíquotas fixas da suspensão celular para placas de 96 cavidades, em triplicado. Depois adicionou-se 1 pCi de 3H-Timidina durante 16 horas e determinaram-se as 35 contagens por minuto (cpm) do precursor incorporado com um contador β. (B) APCs, tais como Dcs e Mos, obtidas como relatado na Figura 16A, foram provocadas com linfócitos T de outro macaco, obtidos como descrito acima para o dador humano. A maior capacidade para apresentar o antigene é uma caracteristica típica das DCs em comparação com Mos. As APCs foram adicionadas, em concentrações escalares, a linfócitos T para avaliar as respostas proliferativas obtidas a diferentes razões T:APCs (DCs ou Mos).
Os exemplos seguintes devem ser considerados ilustrativos e não limitativos do âmbito da invenção.
Exemplo 1. Expressão, purificação e caracterização da proteína Tat de tipo selvagem (isolado IIIB), proteínas Tat mutadas e péptidos da Tat de tipo selvagem
No passado encontraram-se muitas dificuldades para purificar e manter a actividade biológica da proteína Tat devido à facilidade em sofrer oxidação, agregar-se e perder actividade. Isto deve-se à grande quantidade de resíduos cisteína que podem formar ligações intra e intermoleculares, modificando assim a conformação da proteína nativa (Ref. 159, 41). Para a expressão da proteína em E. coli utilizou-se o cDNA ou o gene tat (Seq. 1, Exemplo 2) , que foi clonado no vector pL-syn, fornecido por Dr. J. F. DeLamarter e B. Allet (Glaxo Institute for Molecular Biology S.A., Genebra, Suiça).
Para se obter uma imunização eficiente com Tat para fins de vacinas, o inventor considera fundamental obter uma 36 proteína Tat biologicamente activa como descrito na secção "Descrição pormenorizada da invenção". Em consequência, os métodos de produção e purificação da Tat, descritos neste exemplo e nos Exemplos seguintes 1B, 2 e 3, descrevem procedimentos e controlos necessários para obter uma proteína Tat biologicamente activa, que é um imunogene eficaz para proteger de infecção com o HIV, SIDA ou do desenvolvimento de doenças relacionadas com o HIV.
Um primeiro método que utilizámos para obter uma proteína activa baseou-se em passos sucessivos de cromatografia líquida de alta pressão e cromatografia líquida e de permuta iónica (Ref. 15, 41). A proteína obtida por estes métodos é mais de 95 % pura e é activa (Ref. 41, 42).
No entanto, não se obteve boa reprodutibilidade de lote para lote devido à oxidação da proteína, que é o principal problema das preparações comerciais de Tat. Devido às nossas observações de que a região básica da proteína Tat tem afinidade forte para heparina e de que a heparina previne a sua oxidação, utilizámos a cromatografia de afinidade com heparina e definimos um novo protocolo de purificação da Tat, como descrito por Chang et al. (Ref. 26) . Células (100 g de peso) de E. coli que expressam a Tat foram sonicadas em 40 mL de tampão de lise (fosfato dissódico 20 mM, pH 7,8; glicerol a 2,5 %; PMSF 0,2 mM; DTT 5 mM; manitol 50 mM; ácido ascórbico 10 mM; NaCl 500 mM) utilizando um Processador Líquido Ultrasonic (Modelo XL2020, Heat System Inc.) com três descargas, cada uma de 20 segundos. O lisato foi centrifugado a 12 000 g durante 30 minutos e o sobrenadante foi incubado durante uma hora à temperatura ambiente com 2 mL de resina heparina sefarose, 37 pré-lavada com o tampão de lise. A resina foi carregada numa coluna de vidro e foi lavada com o tampão de lise até a proteína ser indetectável no meio de lavagem. 0 material ligado eluiu com tampão de lise contendo NaCl 2 M e recolheu-se o eluato em fracções de 1 mL. Analisou-se a homogeneidade da proteína eluída por electroforese em gel (SDS-PAGE). A proteína purificada foi armazenada liofilizada a -70 °C e foi novamente suspensa num tampão desgaseifiçado antes da utilização.
Avaliou-se a actividade biológica da proteína Tat purificada, de acordo o protocolo acima, por um ensaio de "resgate" de infecção virai em células HLM-1, derivadas de células HeLa-CD4+, contendo pró-vírus deficientes no gene tat, obtidos e descritos por Sadaie et al. (Ref. 140). O ensaio de "resgate" de infecção virai, descrito por Ensoli et al. (Ref. 41), consistiu em complementar a ausência de expressão da Tat em células HLM-1 (2 x 105) com a adição de proteína Tat exógena (2 μρ/πΛ) e avaliando a replicação virai determinando o antigene p24 libertado no meio de cultura 48 horas após a adição da proteína Tat exógena utilizando estojos comerciais. Os resultados das experiências de "resgate", descritos por Chang et al. (Ref. 26), demonstram que a proteína Tat, purificada com este método, é activa e que este método de purificação é melhor, mais fácil e menos dispendioso, quanto à pureza e à actividade biológica da Tat, quando comparado com os métodos previamente descritos (Ref. 40, 41, 42).
Diferentes preparações de Tat recombinante, purificada como descrito acima, foram inoculadas, na presença de adjuvante de Freund, em ratinhos e coelhos de acordo com protocolos comuns (Ref. 4) . Apresentam-se na Tabela 1 os 38 resultados da resposta de anticorpos induzida pela imunização. TABELA 1.
Análise da resposta de anticorpos específicos anti-Tat em soros de ratinhos e coelhos imunizados com a proteína Tat recombinante.
Anticorpo OD-ELISA/Tat Coloração anti-Tat 1:500 1:1000 1:2000 "Western" Coelho 0, 651 0,400 0,175 + Ratinho 0,502 0,240 0,150 + A proteína Tat recombinante produzida em E. coli foi utilizada para imunizar ratinhos e coelhos de acordo com protocolos de imunização comuns (Ref. 4) . Analisaram-se os soros dos animais imunizados por ELISA quanto à presença de anticorpos anti-Tat utilizando três diluições do soro (1:500 até 1:2000). Os resultados são a média das leituras a 405 nm de dois coelhos e três ratinhos. Além disso, testaram-se os soros por coloração "Western" com a proteína Tat recombinante (100 ng) .
Os resultados da Tabela 1 demonstram que a Tat recombinante, preparada por nós, conseguiu induzir uma resposta de anticorpos em ambas as espécies animais, como testado por ELISA e coloração "Western" que utiliza a proteina Tat recombinante. Esses anticorpos conseguiram inibir a interiorização e as actividades biológicas da Tat (Ref. 40, 41, 42). O vector pL-syn e o protocolo de purificação da proteina Tat são utilizados para expressar e purificar os mutantes da Tat descritos no Exemplo 2. A actividade biológica das proteínas Tat mutadas e purificadas é medida por ensaios de "resgate" de infecção virai em células HLM-1, ensaios de proliferação de células de KS e in vivo em ratinhos, como descrito acima para a proteina Tat de tipo selvagem. Além disso, as proteínas Tat 39 mutadas são testadas na presença de Tat de tipo selvagem (em concentrações em série), para verificar o efeito transdominante negativo na replicação virai. 0 vector pL-syn e o protocolo de purificação são utilizados para expressar e purificar proteínas de fusão deste tipo: Tat (tipo selvagem ou respectivos mutantes)/IL-12 ou Tat (tipo selvagem ou respectivos mutantes)/IL-15 ou respectivas partes ou Tat (tipo selvagem ou respectivos mutantes)/outras moléculas (ou respectivas partes), capazes de intensificar a resposta imunológica à Tat isoladamente ou associadas a outros produtos virais. Preparam-se moléculas recombinantes de fusão utilizando as sequências e os "primers" descritos nos Exemplos 2 e 3. Alternativamente, utilizam-se como imunogenes péptidos sintéticos correspondentes a regiões da Tat ou de outros produtos virais ou de citoquinas a serem utilizados em combinação com a Tat. As sequências dos péptidos da Tat são: Pép. 1. MEPVOPELEPWKHP6SQPKT (id SEQ NO: 11) Pép. 2. AGTNGYCKKCCFHCQVCFtT (id SEQ NO: 12) Pép. 3. QVCFITKALGISYGRK (id SEQ NO: 13) Pép. 4. SYGRKKRRQRRRPPQ (ID SEQ NO: 14) Pép. 5. RPPQGSQTHQVSLSKQ (ID SEQ NO: 15) Pép. 6. HQVSLSKQPTSQSRGD (ID SEQ NO: 16) Pép. 7. PTSQSRGDPTGPKE (id SEQ NO: 17)
Os péptidos mutantes da Tat conterão as mesmas substituições de aminoácidos das proteínas Tat mutadas, descritas no Exemplo 2. Os péptidos serão utilizados em combinação com o péptido que representa o epítopo de auxiliadora T universal do toxóide tetânico ou com outros 40 péptidos que representam epítopos de auxiliadoras T (Ref. 77) .
Exemplo IA. A captação de concentrações picomolares (10 até 100 ng/mL) de Tat biologicamente activa por células endoteliais activadas é mediada por receptores integrinas
Quando células endoteliais normais são activadas in vitro com citoquinas inflamatórias, passam a responder aos efeitos da Tat extracelular, e isto deve-se à indução das integrinas α5βι e avp3 (Ref. 9, 10) . De modo semelhante, citoquinas inflamatórias (IC) ou bFGF aumentam a expressão de integrinas em células endoteliais in vivo, e isto conduz a um efeito promotor de KS sinergético quando uma Tat biologicamente activa é inoculada em ratinhos simultaneamente ou após bFGF (Ref. 42) . Adicionalmente, células endoteliais activadas por ICs adquirem a função de APCs .
Neste exemplo mostra-se que células endoteliais activadas com ICs recolhem mais eficientemente proteína Tat biologicamente activa etiquetada com rodamina e que este processo é mediado pelos receptores integrinas.
Devido à dificuldade em observar a interiorização de concentrações muito baixas de Tat fria, a proteína foi etiquetada com rodamina (Ref. 98). A Tat etiquetada com rodamina ainda exibiu activação da proliferação de células de KS na mesma gama de concentrações da Tat não etiquetada, indicando que o procedimento de etiquetagem não comprometeu a sua função biológica. Realizaram-se do modo seguinte experiências de captação da Tat. Células da veia umbilical humana (HUVE) cresceram e foram tratadas durante 5 dias com ICs como descrito (Ref. 9, 46). Em seguida, as células 41 foram submetidas a tripsinação, plaqueadas em lâminas de 8 cavidades (Nunc Inc., Naperville, IL) , a 0,5 x 105 células por cavidade, e foram incubadas durante 18 horas em meio que continha soro fetal de bovino (FBS) 15 % na presença de ICs. Adicionaram-se meios sem soro (SF, RPMI, BSA 1 %, antibióticos 0,1 %, fungizona) e as lâminas foram pré-incubadas durante 2 horas a 4 °C. Adicionou-se às células meio fresco, contendo diluições em série de Tat etiquetada com rodamina, e incubaram-se as células a 37 °C durante o periodo de tempo indicado. Os controlos negativos consistiram em BSA etiquetada com rodamina no mesmo tampão da Tat. As células foram fixadas em acetona - metanol (1:1) gelado e a captação e localização da Tat foram visualizadas e fotografadas utilizando microscopia de fluorescência. Avaliaram-se os resultados comparando a fluorescência de amostras com o controlo negativo, tendo sido pontuados desde 0 até ++++ quanto à quantidade de captação sem conhecimento prévio do código da amostra.
Para investigar as vias pelas quais a Tat é recolhida por células endoteliais activadas realizaram-se experiências utilizando células HUVE activadas com uma gama ampla de concentrações de Tat exógena, como as previamente utilizadas para induzir o crescimento de células HUVE ou de KS (10 - 50 ng/mL), ou transactivação do HIV-1 por adição da proteína a células contendo o promotor ou o pró-vírus do HIV-1 (0,5 até 1 pg/mL).
Nestas experiências, por motivos de consistência com as experiências de inibição da captação (ver abaixo), as células foram pré-incubadas a 4 °C durante 2 horas com meio sem soro fetal de vitelo. Esta pré-incubação não afecta a captação subsequente de Tat etiquetada com rodamina. 42
Com Tat etiquetada com rodamina, a captação e mudança de localização da proteína para o núcleo ou nucléolos de células HUVE activadas começam a ser evidentes num período de 15 minutos de incubação com Tat etiquetada com rodamina a uma concentração pequena de 10 ng/mL. A densidade da Tat captada nas células aumentou de uma forma dependente da dose e dependente do tempo. BSA ou tampão etiquetado com rodamina não exibiram sinais e foram utilizados rotineiramente como controlos negativos.
Para determinar se a captação da Tat por células HUVE activadas foi mediada pelas mesmas integrinas que se verificou serem expressas em células de KS realizaram-se experiências de inibição por pré-incubação de células endoteliais activadas com ICs com Tat fria (competidor), os ligandos fisiológicos para estes receptores, como fibronectina (FN) ou vitronectina (VN), ou por pré-incubação das células com anticorpos monoclonais dirigidos contra as regiões de ligação RGD dos receptores α5β1 e ανβ3. Apresenta-se brevemente o procedimento experimental. Após plaqueamento em lâminas de 8 cavidades, as células HUVE foram incubadas com meio que continha FBS 15 % durante 18 horas, e depois foram incubadas com meio SF que continha Tat não etiquetada (competidor frio) (Tabela IA), FN, VN (Tabela 1B) , ou anticorpos monoclonais dirigidos contra a sequência de ligação RGD dos receptores da FN ou VN (α5βι e ανβ3, respectivamente), ou anticorpos monoclonais dirigidos contra o factor VIII humano (anticorpos de controlo) (Fig. IA) durante 2 horas a 4 °C. Em seguida, as células foram incubadas com Tat etiquetada com rodamina durante os períodos de tempo indicados. O controlo consistiu em células tratadas com meio SF isoladamente, durante 2 horas 43a 4 °C, e incubadas com BSA etiquetada com rodamina. As células foram fixadas, visualizadas e fotografadas e os resultados foram pontuados como indicado acima.
TABELA IA
Inibição da captação de 100 ng/mL e 1 pg/mL de Tat etiquetada com rodamina por HUVE activadas com citoquinas por pré-incubação das células com 1 μg/mL de Tat não etiquetada.a
Pré-incubação Tat etiquetada com rodamina Captação da Tat Meio Sem Soro 100 ng/mL +++ 1 μg/mL de Tat não etiquetada 100 ng/mL +/- Meio Sem Soro 1 μg/mL ++++ 1 μg/mL de Tat não etiquetada 1 μg/mL +/- a Células HUVE foram cultivadas como previamente descrito (Ref. 40) . Obtiveram-se ICs de células T CD4+ transformadas com vírus linfotrópico T humano de tipo II (HTLV-II) ou células T estimuladas com fito-hemaglutinina e utilizaram-se os sobrenadantes (1:8) para activar células HUVE (passagens 8 - 14) durante 5 dias, como previamente descrito (Ref. 9, 46) . Este sobrenadante contém interleuquina-ΐα (IL-la) e β (IL-Ιβ), factor de necrose tumoral-α (TNF-a) e β (TNF-β) e interferão-γ (IFN-γ) (Ref. 9) . A proteína Tat foi etiquetada com rodamina em resíduos Usina essencialmente como descrito (Ref. 98) . Em resumo, 50 pg de Tat recombinante (2 mg/mL) foram ajustados para pH 9,0 por adição de 2,5 pL de Na2C0s 1 M. Adicionaram-se 2,5 pL de TRITC 1 mg/mL em dímetílsulfóxido (DMSO) e deixou-se a reacção prosseguir durante 8 horas a 4 °C. 0 TRITC que não reagiu foi rapidamente arrefecido por adição de 2,5 pL de NH4C1 0,5 M, diminuiu-se o pH para 7,0 utilizando HC1 1 M e a Tat etiquetada com rodamina foi dialisada contra duas mudanças de Tris-HCl 50 mM, pH 7,0, ditiotreitol (DTT) 1 mM, para remover o TRITC rapidamente arrefecido. Utilizaram-se como controlos negativos BSA ou PBS, etiquetados com rodamina da mesma forma. Testou-se a Tat etiquetada com rodamina quanto à actividade de crescimento de células de KS associado a SIDA como descrito, para assegurar a manutenção da actividade biológica (Ref. 40). 44 44 Células HUVE foram pré-Incubadas durante 2 horas com meio sem soro ou 1 μς/mL de Tat não etiquetada em meio sem soro, foram incubadas com 100 ng/mL ou 1 μρ/mL de Tat etiquetada com rodamina durante 60 minutos e visualizou-se a captação da Tat por microscopia de fluorescência. Os controlos negativos (+/captação) consistiram em pré-incubação com meio sem soro, seguida de incubação com BSA etiquetada com rodamina.
TABELA 1B excesso de FN ou VN.a Pré-incubação Captação de Tat Etiquetada com Rodamina Meio Sem Soro ++++ 100 ng/mL de FN +/- 100 ng/mL de VN +/-
Inibição da captação de 10 ng/mL de Tat etiquetada com rodamina por HUVE activadas com citoquinas por pré-incubação das células com um a Células HUVE foram pré-incubadas durante 2 horas com meio sem soro ou FN ou VN em meio sem soro, foram incubadas com 10 ng/mL de Tat etiquetada com rodamina durante 60 minutos e visualizou-se a captação da Tat por microscopia de fluorescência. Os controlos negativos (+/captação) consistiram em pré-incubação com meio sem soro, seguida de incubação com BSA etiquetada com rodamina. A captação da Tat foi inibida por Tat fria (Tabela IA), por FN ou VN (Tabela 1B) ou por tratamento prévio das células com anticorpos monoclonais dirigidos contra as regiões de ligação RGD do receptor da FN, α5βι, e do receptor da VN, ανβ3 (Fig. IA) . A intensidade da fluorescência em células foi reduzida para níveis observados com o controlo negativo e não se observou inibição por incubação prévia das células com anticorpos monoclonais dirigidos contra o factor VIII humano, utilizado como controlo negativo, indicando que a inibição foi especifica (Fig. IA). 45 A captação e localização nuclear de 100 ng/mL de Tat foram inibidas por pré-incubação das células com os anticorpos monoclonais dirigidos contra a região de ligação RGD do receptor α5βι e do receptor ανβ3· No entanto, em ambos os casos, a inibição não foi completa. Estes resultados indicam que a captação de concentrações picomolares de Tat é mediada pelas mesmas integrinas envolvidas na adesão celular à Tat (Ref. 10). Todavia, a uma concentração mais elevada de Tat extracelular (tal como > 100 ng/mL), uma via não mediada por integrinas é responsável pela captação de alguma quantidade da proteina.
Em contraste com estes resultados, verificou-se que a captação de Tat iodada com linhas de células linfociticas e epiteliais é linear e é uma função da concentração da Tat no meio, e um excesso de Tat fria competiu de forma nula ou fraca, indicativo da ausência do envolvimento dos receptores (Ref. 98). Contudo, a gama de concentrações da Tat no meio nesse estudo foi aproximadamente 1 - 100 μg/mL (Ref. 98), muito mais elevada do que as necessárias para se observar captação de Tat por células que respondem à sua actividade biológica, como células endoteliais primárias activadas. Adicionalmente, a iodação da Tat pode dificultar a sua estrutura e a sua captação pelas células, e esses autores não apresentaram resultados da actividade biológica da Tat iodada.
Estes resultados, que não estão publicados, demonstram que a captação da Tat ocorre pelo menos por duas vias, dependendo da concentração da proteina. As concentrações baixas da Tat (10 - 100 ng/mL), a captação da Tat é mediada pelos receptores α5βι e ανβ3 através da interacção com a 46 sequência RGD da proteína, ao passo que a concentrações mais elevadas de Tat extracelular é mais importante uma via independente de integrinas. A captação mediada por integrinas de concentrações picomolares de Tat por células endoteliais activadas por ICs indica uma proteína completamente activa capaz de entrar em células apresentadoras de antigenes, como células endoteliais e células dendríticas activadas, que iniciam a resposta imunológica.
Exemplo 2. Construção e caracterização de genes tat mutados (não reivindicado)
Produzimos 19 mutantes em diferentes regiões da Tat por mutagénese específica para sítios ou por deleção. A sequência de cada DNA mutado foi controlada por sequenciação. Os cDNAs dos genes tat mutados foram clonados no sítio PstI do vector pCVO, descrito no Exemplo 3. Cada mutante foi co-transfectado, como descrito por Ensoli et al. (Ref. 41), em células COS-1 ou na linha de células T Jurkat com o plasmídeo LTR-CAT do HIV-1, no qual o gene repórter CAT é conduzido pela LTR do HIV-1. Os resultados destas experiências, não publicados, estão apresentados na Tabela 2. 47 TABELA 2
Efeito de mutantes da Tat na transactivação de LTR-CAT do HIV-1 e efeito bloqueador (transdominante negativo) na actividade de tipo selvagem da Tat MUTANTES Actividade de transactivação3 Média (vezes) Actividade transdominanteb ( % de inibição) (valores mín-máx) Média CYS 22 0,09 (0,021-0,22) 21 THR 23 0,36 (0,16-1) THR 23A 0,30 oo r- o 1 to τ—1 O ASN 24 0,34 (0,34-0,82) ASN 24A 0,42 (0,45-0,95) TYR 2 6 0,14 (0,08-0,19) LYS 28/29 0,52 o τ—1 1 Oh τ—1 o CYS 30 0,30 (0,045-0,65) CYS 31 0, 60 (0,27-1,09) PHE 32 0,31 (0,077-0,097) LYS 33 0,04 (0,0027-0,068) 46 GLU 35 0,31 (0,19-0,43) PHE 38 0,05 (0,043-.057) 98 LYS 41 0,04 (0,025-0,061) 97 TYR 47 0,58 (0,31-0,8) 57 A 0,35 (0,26-0,44) TAT- RGD 0,94 (0,73-1,15) TAT- KGE 1,11 (0,67-1,49) TAT wild- type 1 1 a Os resultados estão apresentados como o incremento da activação dos valores da actividade de CAT induzidos pela Tat de tipo selvagem (Número de vezes = 1). b Os resultados estão expressos como percentagem ( %) da inibição da actividade da Tat de tipo selvagem.
Dos resultados apresentados na Tabela 2 é evidente que, para a maioria dos mutantes, o efeito de transactivação da LTR do HIV-1 foi reduzido ou nulo, exceptuando o mutante em RGD, que tinha uma actividade semelhante à da Tat de tipo selvagem. Seleccionámos os 4 mutantes (cys22, lys33, phe38, lys41) com a actividade de 48 transactivação mais baixa (quase zero) e determinámos o efeito transdominante negativo na actividade de transactivação da Tat de tipo selvagem. Para esta finalidade, células COS-1 foram co-transfectadas com cada vector contendo um mutante da Tat e o vector pCV-Tat (numa razão molar 10:1) na presença do vector LTR-CAT do HIV-1. Como mostrado na Tabela 2, os mutantes lys41 e phe38 inibiram quase completamente a actividade da Tat, ao passo que os mutantes lys33 e cys22 inibiram parcialmente a actividade da Tat. No entanto, a proteina recombinante cys22 (descrita no Exemplo 3 seguinte) competiu com a proteina Tat de tipo selvagem na transactivação do LTR-CAT do HIV-1 (Fig. 1B) . Seleccionaram-se um mutante na região de cisteina (cys22), um na região do "core" (lys41), um com a sequência RGD deletada (RGDA) e um mutante duplo que continha a mutação em lys41 e a deleção da sequência RGD (Iys41-RGDA).
Apresenta-se aqui a seguir a sequência da inserção de tat e dos mutantes seleccionados para a vacinação. Descreve-se uma série de mutantes de tat, preparados por 1) substituição de uma base para se obter uma substituição de aminoácidos e 2) deleção de uma base para se obter uma deleção dos aminoácidos correspondentes. As substituições e deleções foram obtidas por mutagénese dirigida a sítios. As sequências do gene tat de tipo selvagem e dos mutantes do gene tat, aqui apresentadas a seguir, foram inseridas no vector plasmídico pCVO como descrito acima. A Seq. 1 apresenta a sequência do gene tat do HIV-1, do clone BH-10, e sua proteína derivada. A Seq. 2 apresenta a sequência do mutante cys22 (e sua proteína derivada), representada por uma substituição do nucleótido Timina (T) 49 na posição 64, partindo da extremidade 5', pelo nucleótido Guanina (G) . Na sequência de aminoácidos derivada, esta substituição origina uma substituição de uma Cisteina (C no código de uma letra) na posição 22 na extremidade amino-terminal por uma Glicina (G no código de uma letra). A Seq. 3 apresenta a sequência do mutante lys41 (e sua proteina derivada), representada por uma substituição do nucleótido Adenina (A) na posição 122, a partir da extremidade 5', por um nucleótido Citosina (C) . Na sequência de aminoácidos derivada, esta substituição origina uma substituição de uma Lisina (K no código de uma letra) na posição 41 a partir da extremidade amino-terminal por uma Treonina (T no código de uma letra). A Seq. 4 apresenta uma sequência do mutante em RGD (e sua proteina derivada), representada pela deleção da sequência de nucleótidos CGAGGGGAC desde o nucleótido 232 até ao nucleótido 240, partindo da extremidade 5' do gene tat de tipo selvagem. Isto origina uma deleção dos aminoácidos Arginina-Glicina-Ácido aspártico (RGD no código de uma letra) nas posições 78-80 desde a extremidade amino-terminal. A Seq. 5 apresenta uma sequência do mutante duplo Iys41-RGDA (e sua proteina derivada) originada pela combinação dos mutantes acima descritos.
Sequência de nucleótidos de tat de tipo selvagem (Seq. 1) (ID SEQ NO: 1) AG 3' 50
Sequência de aminoácidos (ID SEQ NO: 2)
NHS-MEFVDPRLgPWKHPOSQPKTACTNCVCKKCCFHCQVCFITKALG
ISYGRKKRRaRRRPPOGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTaPKE-CÒOH
Sequência de nucleótidos do mutante Cys22 (Seq. 2) (ID SEQ NO: 3) 5'ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGMGTCA GCCTAAAACT GCTBGTACCAATTGCTAT7 GTAAAAAGTGTT G CTTTCATTGCC A AGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCGTATGGCAGGAAGAAGC GG AGACAGGGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTAT CAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAAT ag â*
Sequência de aminoácidos (ID SEQ NO: 4)
NH2~M£PVDPRLEPVVKHP6SQPKTAGTNCYCKKCGFHCGVGFITKA
LGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHOVSLSKQPTSGSRGDPTÔPKE-COOH
Sequência de nucleótidos de Lys41 (Seq. 3) (ID SEQ NO: 5) 5ΆΤ GGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGC ATCCAGGAAGTCA GCCTAAAACTõCTTGTACCAArrGCTATTõTAAAAAGTGTTGCTTrCATTGCGA AGTTT GTTTCATAACAACAGCCTTAGGCATCTCCTAT GGC AGGAAGAAGCGG agacagcgacgaagacctcctcmggcagtcagactcatcaagtttctctat CAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAÇGCÇCGMeGAAT AG 3*
Sequência de aminoácidos (ID SEQ NO: 6)
NH2-MEPVDPR1EPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCGVCFJTTALG s$ygrkkhrgrrrfpgg$gthqvsískoptsqsrgoptcspke-cooh
Sequência de nucleótidos do mutante RGDA (Seq. 4) (ID SEQ NO: 7) 51
S^TÔÔAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGMÕCATCCAeGAAGTCA
GCCTAAAACTGCTTGTACCMTTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCA
AGnTGTTTCATMCAAMGCGTTAGGCATCTCCTATGGCAÔGMÔAAGCGG
AGACAGCÕACGAAGACCTCCTGMGGCAGTCAGACTCATCMGTTTCTCTAT CAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3>
Sequência de aminoácidos (ID SEQ NO: 8)
NHa-MEPVDPRlEPWKHPGSQFKTACTNCYCKKCCFHCQVCFÍTKAlG
ISYGRKKRRORRRPPGGSaTHQVStSKQPTSQSFTGPKE^COOH
Sequência de nucleótidos do mutante Lys41-RGDA (Seq. 5) (ID SEQ NO: 9)
SATGGAGCCAGTAGATCCTAeACTAGAGCOCTGGMGCATÇCAeGMGTCA
GCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAMGTGTTGCTTTCATrGGCA agtttgtttgataacaacaggcttaggcatctcctatggcaggaagaagcgg AGAÇAGCGACGAAGACCTCCTCMGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTAT CMAGCAGCCCACCTC0CAATCCCCGACA6GCCCGAAGGAATAG 3’
Sequência de aminoácidos (ID SEQ NO: 10)
NK2-MEPVDPRLEPWKHPGSOPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFÍTTAIG
{SYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQFTSGSPTaPKE-COOH
Exemplo 3. Construção e caracterização dos imunogenes de DNA
As moléculas de DNA para a inoculação dos animais são inseridas no vector plasmidico pCVO de 6,4 kb (Ref. 5). Este plasmideo compreende duas origens da replicação do SV40, o promotor tardio principal do adenovirus (AdMLP) e as sequências de processamento do adenovirus e dos genes de imunoglobulina de ratinhos, o cDNA do gene da di-hidrofolato redutase de ratinhos (dhfr) e o sinal de poliadenilação do SV40. O sitio para a enzima de restrição 52
Psti está localizado a 3' do AdMLP e representa o sítio onde é clonado o gene exógeno de interesse. 0 cDNA do gene tat (261 pares de bases) (Seq. 1, exemplo 2) do HIV-1 foi derivado do clone BH10 do HIV-1 (Ref. 126) e codifica para uma proteína com 86 aminoácidos de comprimento. 0 vector pCV-Tat (Ref. 5) foi obtido por clonagem do cDNA de tat no sítio Psti de pCVO, conduzido pelo AdMLP. A escolha deste vector baseia-se no facto do AdMLP ter induzido uma maior expressão e libertação de Tat relativamente a outros promotores eucarióticos, tais como, por exemplo, o promotor da região inicial imediata do citomegalovírus (CMV), como demonstrado por Ensoli et al. (Ref. 41) e apresentado na Tabela 3. TABELA 3. Expressão, localização subcelular, libertação e actividade da Tat em células COS-1 transfectadas com pCV-
Tat e CMV-Tata
Vectores Expressão da Tat Teor da Tatc Actividade da Tat Células Positi vas Núcleo0 ( %) Cito plasma Total Intracel ( %) Extracel ( %) Intracel3 (vezes) Extracel0 (cpm) PCV-Tat 5-10 ++ ++ 25 63,5 36,5 50 2,478 CMV-Tat 3-5 ++ + 14,6 92,2 7,8 72 2,254 Controlo 0 - - 0 0 0 1 1,400 ~ Células COS-1 (5 x 106) foram transfectadas por electroporação com 30 μς de pCV-Tat, CMV-Tat ou um DNA de controlo. Após 48 horas da transfecção, avaliou-se a expressão da Tat por imuno-histoquimica com anticorpos monoclonais anti-Tat (os valores apresentados são a média dos valores percentuais de células positivas) e por localização de Tat nuclear e citoplasmática. Analisou-se a presença de Tat intra e extracelular por radioimuno-precipitação nos extractos celulares (500 μΐ) e nos meios de cultura (4 mL) e leitura densitométrica subsequente 53 (Gelscan XL; Pharmacia) das bandas de Tat precipitada. Mediu-se a actividade da Tat intracelular em extractos celulares de células COS-1 co-transfectadas com vectores que expressam a Tat, ou o vector de controlo, e o plasmídeo LTR-CAT HIV-1; mediu-se a actividade da Tat extracelular na proliferação de células de KS associado a SIDA (determinada por ensaio de incorporação de 3H-timidina) no meio de cultura (diluído 1:2 e 1:4) das células transfectadas com plasmídeos que expressam a Tat ou o plasmídeo de controlo. Os resultados são a média de cinco experiências independentes. b Análise densitométrica da banda da proteína Tat imunoprecipitada. Os valores estão expressos numa escala arbitrária, em que o valor mínimo detectado total (Tat intra e extracelular) é 10. c -, negativo; + , 50 % de células positivas para Tat; ++, 50-100 % de células positivas para Tat. d Actividade de CAT após 20 minutos de incubação relativamente ao vector de controlo, cujo valor de activação é considerado 1. e Crescimento de células de KS associado a SIDA medido por um ensaio de incorporação de 3[H]-timidina (desvio padrão, D.P.: 12 %). Os sobrenadantes das células transfectadas com o DNA de controlo exibiram uma incorporação de 3[H]~ timidina de 1 400 cpm (D.P.: 11,5 %) . 0 meio de cultura derivado de linfócitos T activados (controlo positivo) exibiu uma incorporação de 3 [H] -timidina de 2 400 cpm (D.P. : 10 %) A Tabela 3 mostra que, nas células transfectadas com pCV-Tat em comparação com as células transfectadas com CMV-Tat, a percentagem de células positivas para Tat e o teor total de Tat são mais elevados, a quantidade de Tat 54 libertada é muito maior e está relacionada com o teor total e citoplasmático de Tat; em consequência, a actividade biológica da Tat extracelular no crescimento de células de KS associado a SIDA é mais elevada. Esses resultados mostram que o vector pCV-Tat codifica para uma proteína biologicamente activa, induz níveis elevados de expressão do gene tat e consegue libertar das células quantidades de Tat muito mais elevadas do que o vector CMV-Tat.
Também se utiliza o vector pCVO para a expressão dos genes nef, rev e gag do HIV-1 e dos genes que codificam para as citoquinas IL-12 e IL-15. Os cDNAs dos genes nef (618 pares de bases, estirpe NL43) (Ref. 112), rev (348 pares de bases, estirpe NL43) (Ref. 95) e gag (1500 pares de bases, estirpe NL43) (Ref. 95), ou os cDNAs dos genes da IL-12 (Ref. 165) ou IL-15 (Ref. 56) são amplificados pela técnica de reacção em cadeia de polimerase (PCR) utilizando "primers" específicos complementares aos primeiros 15 nucleótidos da região 5' ("primer" directo) (Seq. Pl, P3, P5, P7, P9) ou aos últimos 15 nucleótidos da região 3' do gene ("primer" reverso) (Seq. P2, P4, P6, P8, PIO) . Além disso, cada "primer", directo e reverso, compreende a sequência para a enzima de restrição PstI consentir a clonagem do produto amplificado no vector pCVO. Após a clonagem, a sequência dos genes inseridos é controlada por sequenciação de DNA. O vector pCVO também é utilizado para a co-expressão da Tat com outros genes virais do HIV-1 (rev, nef ou gag) ou com os genes codificadores das citoquinas IL-12 ou IL-15. Para esta finalidade, o cDNA do gene tat do HIV-1 de 261 pares de bases (Seq. 1, exemplo 2) é amplificado por PCR com um "primer" directo que inclui a sequência para a enzima de restrição PstI (Seq. Pll) e um "primer" reverso complementar aos últimos 15 nucleótidos do 55 gene tat (Seq. P12). Os genes virais (nef, rev ou gag) ou os genes que codificam para as citoquinas IL-12 ou IL-15 são amplificados por um "primer" directo que também inclui uma sequência de 15 bases complementar à região 3' do tat, permitindo que o gene se situe na estrutura com o gene tat (Seq. P13, P14, P15, P16, P17) e um "primer" reverso incluindo a sequência para a enzima de restrição PstI (Seq. P2, P4, Ρβ, P8, PIO) . Em seguida efectua-se uma terceira reacção de PCR na qual o modelo de DNA é representado pelos produtos amplificados do gene tat e do gene de interesse. 0 "primer" directo é representado pelo "primer" utilizado para amplificar tat (Seq. Pll) e o "primer" reverso pelo utilizado na amplificação do gene de interesse (Seq. P2, P4, P6, P8, PIO). 0 tat/gene de interesse amplificado é purificado com gel de agarose, digerido com PstI e clonado em pCVO. Após a clonagem, a sequência dos genes inseridos é controlada por sequenciação de DNA, ao passo que a expressão da proteina é determinada por intermédio de transfecção, como descrito acima (Ref. 41).
As sequências dos "primers" acima mencionados são:
Seq. PI. "Primer" directo Rev: S'ÂTG(stwÁy»W\ÂG (ID SEQ NO: 18) Seq. P2 . "Primer" reverso Rev: S'CTATT'CTTTAGTTGC3’ (id seq NO: 19) Seq. P3 . "Primer" directo Nef: S! AT GG GTGGG AAGTGG3’ (ID SEQ NO: 20) Seq. P4 . "Primer" reverso Nef: 5T0AGCAGTGCTTGTA3" ID SEQ NO: 21) Seq. P5 . "Primer" directo Gag: S'A TGgGTGGGAGAtíCGâ (ID SEQ NO: 22) Seq. P6 . "Primer" reverso Gag: 57T ATTGTGAC GAGGG3' (ID SEQ NO: 23) Seq. P7 . "Primer" directo IL-12: 5WTGTGGCGCCCTGGG3' (ID SEQ NO: 24) Seq. P8 . "Primer" reverso il-12: 5TTAGGAAGCATTGAG3' (id seq no: 25) Seq. P9 . "Primer" directo il-15 : 5‘ATGAGAATTTCôAAA. 1 (ID SEQ NO: 26) Seq. PIO "Primer " reverso il-15: STCAAGAAG TGTTGAT 3: (ID SEQ NO: 27) Seq. Pll "Primer " directo Tat: S;'ATGGAGC CAGTÂG AT3 (ID SEQ NO: 28) Seq. P12 "Primer " reverso Tat: 5'CTATTCCTTCGGGCC3' (ID SEQ NO: 29) 56
Seq. P13. "Primer" directo Tat/Rev: 5<jQCCCGAA(àGAAATGGOA GGAÂG.AACiC3 (ID SEQ NO: 30)
Seq. P14. "Primer" directo Tat/Nef: 5 ^GCGtfGAAGGAÂÂTGGGTGGCÂAGTGGd (id seq no: 31)
Seq. P15. "Primer" directo Tat/Gag: 5' GGCCCGAAGGÂAATGGGTGCGAGAGCG3' (id seq NO: 32)
Seq. P16. "Primer" directo Tat/IL-12: B WlaLGutiAAGGAAATGTGGC CCUCTGGG35 (ID SEQ NO: 33)
Seq. P17. "Primer" directo Tat/IL-15: 5’GGCGCGAAGGAMTGAGAATTTGGAAA3·' (id seq no: 34)
Exemplo 4. Inoculação em Macaca fascicularis saudável de uma vacina anti-proteína Tat: avaliação da segurança, tolerabilidade, resposta imunológica específica e eficácia protectora contra provocação com o vírus
Avaliou-se, no modelo experimental do macaco cynomolgus (Macaca fascicularis), a tolerabilidade, segurança e a capacidade para induzir uma resposta imunológica específica (humoral e celular) e protecção contra provocação com vírus da vacina de proteína Tat recombinante, produzida pelo método acima descrito e purificada por colunas de afinidade com heparina. Para induzir uma resposta imunológica ampla utilizámos fosfato de alumínio (Alum), que foi testado em numerosos modelos e é o único aprovado para utilização humana. Entre adjuvantes em partículas utilizámos RIBI (pertencente ao grupo dos emulsionantes ou composto por monofosforil-lípido A, dimicolato de trealose e esqueleto da parede bacteriana do bacilo Calmette-Guerin) (Ref. 7, 109).
Na primeira experiência-piloto avaliámos a tolerabilidade, a segurança e a capacidade para induzir uma resposta imunológica específica (humoral e celular) . Assim, 3 macacos foram inoculados de acordo com a calendarização 57 seguinte: o macaco 1 (Ml) foi inoculado com a proteína Tat recombinante (100 μς) , novamente suspensa em 250 μΐ de soro autólogo e 250 μΐ de RIBI, pela via subcutânea num sítio; o macaco 2 (M2) foi inoculado com a proteína Tat recombinante (10 μρ) , novamente suspensa em 250 μΐ de soro autólogo e 250 μΐ de RIBI, pela via subcutânea num sítio, e o macaco 3 (M3) foi o macaco de controlo não inoculado. Recolheram-se de todos os macacos 10 ml de sangue nos dias -42 e -35 que precederam a primeira inoculação da vacina, para determinar os parâmetros basais. Amostras de soro e plasma foram congeladas a -20 °C ou -80 °C e foram utilizadas posteriormente para suspender novamente a inoculação de proteína. Os macacos 1 e 2 foram inoculados no instante 0 e após 2, 5, 10, 15, 22, 27, 32 e 37 semanas. O calendário de imunização foi interrompido na semana 37 para o macaco Ml e na semana 41 para o macaco M2. Sacrificaram-se os animais para estudar os parâmetros imunológicos em vários órgãos e tecidos (baço e nodos linfáticos), tal como a avaliação da presença de uma resposta proliferativa à Tat e de actividades CAF e de CTLs contra a Tat. A actividade CAF é a actividade antiviral mediada por linfócitos CD8+, não restringidos a MHC nem citolíticos. Nos mesmos dias da inoculação do imunogene recolheram-se 10 mL de sangue de cada animal, para a realização de testes laboratoriais (análises físico-químicas, electrólitos, leucócitos, contagens de plaquetas e quantificação da hemoglobina), avaliação dos parâmetros imunológicos, como a presença de imunoglobulinas específicas (IgM, IgG, IgA), os níveis de citoquinas do tipo Thl (IL-2, IFNy) e tipo Th2 (IL-4, IL-10), a produção de quimioquinas (RANTES, ΜΙΡ-Ια e MIP-Ιβ), o fenótipo linfocítico (CD4, CD8, CD3, CD14, CD20, CD25, CD56, HLA-DR, CD45RA) , a resposta proliferativa à Tat, a 58 presença de actividade citotóxica específica (CTL), a presença de actividade antiviral (CAF) e a presença de actividade antiviral total (TAA) mediada por PBMCs e por soro autólogo. Além disso, para avaliar a presença in vivo de uma resposta imunológica mediada por células, todos os macacos vacinados e de controlo foram submetidos a um teste na pele para a Tat.
Os resultados desta experiência são os seguintes. Não se observaram alterações dos parâmetros físico-químicos, hematológicos e comportamentais. Nos macacos vacinados e de controlo não se detectaram sinais de inflamação nem neovascularização nos sítios da inoculação. Estes resultados indicam que a proteína Tat foi bem tolerada pelos animais e que não foi tóxica às doses administradas e com a via de inoculação determinada. Nos macacos Ml e M2 detectou-se a presença de anticorpos do tipo IgG específicos para a Tat na semana 5 após a primeira inoculação. Na semana 37 eram detectáveis IgGs anti-Tat até à diluição do plasma 1:6400 em ambos os macacos e, na semana 41, até à diluição do plasma 1:12 800 no macaco M2. Os resultados estão apresentados nas Figuras 2 e 3. No macaco de controlo M3 detectaram-se anticorpos anti-Tat com títulos baixos, provavelmente induzidos pelas inoculações repetidas de uma pequena quantidade de Tat, que foi injectada neste macaco para controlar a especificidade das reacções ao teste na pele. Nos macacos Ml e M2, os anticorpos anti-Tat foram maioritariamente dirigidos contra a região amino-terminal (aminoácidos 1-20) da Tat, com um título de 1:3200 (Figura 4).
No macaco M2, vacinado com 10 pg de Tat, também se detectaram anticorpos dirigidos contra os aminoácidos 36-50 59 e 46-60 da Tat, com títulos de 1:50 e 1:100, respectivamente (Figura 4) . Determinou-se a capacidade do soro dos macacos para neutralizar a Tat por intermédio de ensaios in vitro que mediram a inibição do resgate da replicação do HIV-1 em células HLM-1 após a adição de proteína Tat exógena, como previamente descrito (Ref. 41). Estes ensaios demonstraram que o plasma dos macacos Ml e M2, na semana 27 após a primeira inoculação, bloqueou a replicação do vírus induzida por Tat exógena, como determinado pela quantificação do antigene p24 nos sobrenadantes da cultura. Inversamente, plasma pré-imunológico dos mesmos macacos não bloqueou a actividade da Tat (Tabela 4). TABELA 4
Actividade neutralizadora do plasma dos macacos no resgate da replicação do vírus induzida por Tat extracelulara Amostras Inibição (%) Tat (30 ng/mL) + Ml Pré-imunológico 0 Tat (30 ng/mL) + M2 Pré-imunológico 0 Tat (39 ng/mL) + Ml Imunológico 79,12 Tat (30 ng/mL) + M2 Imunológico 100 a Determinou-se a actividade neutralizadora do plasma em células HLM-1 (células HeLa-CD4+ que contêm uma cópia integrada de um pró-vírus do HIV-1 deficiente no gene tat) . As células HLM-1 foram semeadas, a 6 x 105 células/cavidade, em placas de 24 cavidades e foram incubadas a 37 °C durante 16 horas. As células foram lavadas duas vezes com PBS, que continha 0,1 % de albumina do soro bovino (BSA), foram cultivadas durante 48 horas com meio fresco (0,3 mL) na presença de proteína Tat recombinante e um volume igual do plasma do animal e foram 60 recolhidas no instante 0 (plasma pré-imunológico) ou na semana 21 (plasma imunológico). Os controlos negativos foram representados por células tratadas apenas com o plasma pré-imunológico reunido, com o plasma imunológico reunido ou com PBS contendo BSA 0,1 % (PBS + BSA 0,1 %), sem Tat. Em todas as amostras de controlo não se observaram efeitos no resgate da replicação do vírus. Cada plasma foi testado em duplicado. Avaliou-se a presença de vírus libertado pelas células por quantificação do antigene Gag p24, utilizando um estojo ELISA comercial de captura do antigene p24 (NEN-Dupont). Os resultados estão expressos como percentagem da inibição do resgate do vírus [medida para cada plasma como o valor médio de p24 (pg/mL) em duas cavidades] pelo plasma imunológico em comparação com o plasma pré-imunológico (0 % de inibição). Os macacos Ml e M2 foram vacinados com a proteína Tat recombinante (100 //g e 10 μρ, respectivamente), foi novamente suspensa em 250 μΐ de soro autólogo e 250 //L de RIBI e injectada pela via subcutânea num sítio.
Os resultados indicam a presença de uma resposta proliferativa à Tat na semana 22 (Tabela 5) em macacos vacinados com a proteína Tat recombinante, que foi mais elevada no macaco M2 que recebeu 10 μς de proteína Tat recombinante em cada reforço. 61 Tabela 5
Resposta proliferativa à Tata Macaco Estímulo Semanas desde a imunização primária 15 22 27 32 37 Ml PHA 15,3 13,9 19, 9 40,6 3,2 TT 1,2 4,7 2,1 3,8 2 Tat 0,8 2,4 1,1 1,3 0,6 M2 PHA 8,1 11,6 17,1 16,8 1,7 TT 2 3,8 1,7 1 0,6 Tat 0,9 3 1,4 1,2 0,6 M3 PHA 5,1 19,9 18,2 6, 6 8,1 TT 7,2 6,2 5, 5 2,8 5, 6 Tat 2,1 1,4 1,3 0,7 0,9 a PBMCs isoladas por gradiente de densidade de Ficoll foram plaqueadas, a uma concentração de 2 x 105 células/cavidade em triplicado, numa placa de 96 cavidades de fundo plano, foram cultivadas em RPMI-1640 suplementado como soro fetal de vitelo (FCS) 10 % e estimuladas com Tat (1 ou 5 μς/mL), PHA (4 μς/mL) ou Toxóide Tetânico (TT) para os quais os macacos foram vacinados. Os controlos não estimulados foram incubados em meio RPMI, FCS 10 %. Mediu-se o aumento da proliferação celular no dia 5 por incorporação de 3 [H] -timidina como previamente descrito (Ref. 39, 22) . Os resultados estão expressos em índice de estimulação e foram calculados do modo seguinte: média da amostra de teste (cpm)/média do controlo (cpm). Valores superiores a 2,5 foram considerados positivos. Os macacos Ml e M2 foram imunizados subcutaneamente com 100 μς ou 10 //g de Tat recombinante novamente suspensa em 250 μ!> de soro autólogo e 250 μί de RIBI. M3 representa um macaco de controlo. Como mostrado na Tabela 6, não se detectou actividade citotóxica para a Tat nos macacos Ml e M2 imunizados com Tat recombinante. 62 TABELA 6 Análise da actividade citotóxica para a Tat (CTL)a Maca co Sema na Razão Alvo:Efector Actividade de CTLs 1:50 1:25 1:12,5 1:6,25 1:3,125 Meio Ml 41 ND ND ND ND ND ND ND M2 41* 0 0 0 0 0 0 - M3 41 0 0 0 0 0 0 - a PBMCs isoladas por centrifugação em densidade de Ficoll foram novamente suspensas a uma concentração de 1 x 107 células/mL em RPMI 1640 suplementado com FCS inactivado pelo calor 10 % e foram semeadas numa placa de 24 cavidades (500 pL por cavidade), durante 12 horas a 37 °C, na presença de 1 pg de Tat. Um dia depois, as células incubadas sem Tat foram centrifugadas a 1500 rpm e foram novamente suspensas em 50 pL de RPMI 1640 suplementado com FCS 10 %, foram incubadas durante 3 horas a 37 °C com 1 pg de Tat, foram lavadas, novamente suspensas em 500 pL de meio fresco e adicionadas à cavidade que continha as PBMCs previamente estimuladas. No dia 2, as células foram diluídas com 1 mL de meio contendo IL-2 (2 iu/mf) e foram cultivadas durante 14 dias. Utilizaram-se como células-alvo linfócitos B autólogos isolados de cada macaco antes do protocolo da vacina (BLCL). Para esta finalidade, PBMCs isoladas por centrifugação em densidade de Ficoll no dia 35 foram semeadas, a uma concentração de 3 x 105 células/cavidade, numa placa de 96 cavidades e foram cultivadas durante 2 ou 3 semanas na presença de 50 % de um meio recolhido de uma linha de células que produz Papiovírus, como previamente descrito (Ref. 28). Dez linhas de células B obtidas para cada animal foram expandidas e congeladas. Para testar a toxicidade 63 utilizou-se o Teste Citotóxico Delfia (Wallac, Turku, Finlândia), baseado na fluorescência resolvida no tempo (Ref. 12, 13, 14). Para esta finalidade cultivaram-se BLCLs a uma concentração de 1 x 106 células/200 μί de RPMI 1640 suplementado com FCS 10 % contendo 4 μς de Tat, durante 12 horas a 37 °C. Como controlo incubou-se outra alíquota de BLCLs autólogas com o mesmo meio sem Tat. As BLCLs foram lavadas e novamente suspensas em 1 mL de RPMI 1640 suplementado com FCS 10 %, contendo 5 pL de ligando intensificador da fluorescência, e foram incubadas durante 15 minutos a 37 °C de acordo com as instruções do fabricante. Após 5 lavagens, as BLCLs foram novamente suspensas, a uma concentração de 5 x 104 células/mL, e foram imediatamente centrifugadas para recolher o sobrenadante, que foi utilizado para medir o nível de fundo. PBMCs (Efectoras) foram semeadas em duplicado, a uma concentração de 2,5 x 104 células/100 pL, em meio que continha IL-2 e foram apropriadamente diluídas numa placa de 96 cavidades. Adicionaram-se a cada cavidade 5 χ 103 de células-alvo/100 μΕ (cultivadas com ou sem Tat). As razões Alvo:Efector foram 1:50, 1:25, 1:12,5, 1:6,25, 1:3,125. As PBMCs e células-alvo (com ou sem impulsos de Tat) foram incubadas durante 2 horas a 37 °C com i) 20 μΕ de Triton 5 % para medir a libertação máxima, ii) 100 pL de meio de crescimento para detectar a libertação espontânea, iii) 200 μΕ de sobrenadante de células-alvo para detectar o nível de fundo. No final do período de incubação, as placas foram centrifugadas e transferiram-se 20 pL de cada sobrenadante para uma nova placa, que foram incubados na presença de 200 pL de uma solução de Európio incluída no estojo. Mediu-se a fluorescência após 64 20 minutos de incubação com um leitor de fluorescência resolvida no tempo (Victor, Wallac, Turku, Finlândia). Mediu-se a actividade específica de CTLs do modo seguinte: % libertação específica = [ (média da detecção da amostra - fundo) - (libertação espontânea fundo)]/[(Libertação máxima - fundo) - (libertação espontânea - fundo)] x 100. 0 teste foi considerado positivo quando a libertação específica de Tat foi superior a 4 % na maior parte das razões Efector:Alvo testadas. 0 valor 4 % é arbitrário, estabelecido com base em experiências de controlo prévias. ND, não determinado. 0 macaco M2 foi imunizado subcutaneamente com 10 pg de Tat recombinante novamente suspensa em 250 pL de soro autólogo e 250 pL de RIBI. M3 representa um macaco de controlo. ND: não realizado. PBMCs foram isoladas de nodos linfáticos periféricos quando M2 foi sacrificado. Além disso, os resultados demonstram, nas semanas 22, 27 e 37, a presença de actividade antiviral solúvel mediada por linfócitos T CD8+ (CAF), medida como a capacidade de sobrenadantes de células de linfócitos T CD8+ de macacos para inibir infecção aguda do vírus quimérico SHIV 89.6P em células CEMxl74, ou para controlar a reactivação de infecção crónica pelo HIV-1 em células OM-10-1 (Tabela 7). A actividade CAF foi geralmente observada em macacos vacinados, em comparação com animais de controlo. 65 TABELA 7
Análise da presença de actividade antiviral solúvel mediada por linfócitos T CD8+ (CAF)a id do Macaco Semana após a imunização primária % de inibição da replicação virai Infecção aguda Infecção crónica Ml 22 89,5 ND 27 62 61,7 37 ND ND M2 22 44 ND 27 54 27 37 48 53 M3 22 24 ND 27 37 22 37 75 23 a PBMCs de macacos vacinados com 100 pg (Ml) e 10 pg (M2) de proteína Tat recombinante e de um macaco de controlo (M3) que não foi vacinado, mas que tinha sido submetido a repetidos testes na pele com Tat, foram isoladas por gradiente de densidade de Ficoll. Culturas enriquecidas em linfócitos T CD8+ foram isoladas de PBMCs por esférulas magnéticas anti-CDQ (Dynabeads, Dynal, Noruega) de acordo com as instruções do fabricante. A pureza das culturas foi controlada por análise FACS utilizando uma série de anticorpos dirigidos contra marcadores celulares específicos (CD3, CD4, CD8). Culturas enriquecidas em CD8+ foram semeadas (em duplicado), a 5 x 105 células/500 pL por cavidade, em placas de 48 cavidades previamente revestidas com um anticorpo monoclonal anti-CD3 (2,5 pg/mL, BioSource International, Camarillo, CA) durante 12 horas a 4 °C, e cresceram em RPMI 1640 que continha soro fetal de bovino 10 % e IL-2 (20 U/mL). Recolheram-se 250 μΐ de meio de três em três dias, durante duas semanas, tendo sido substituídos por um volume igual de meio fresco. Os sobrenadantes celulares foram centrifugados, filtrados (0,45 pm) e 66 armazenados a -80 °C. Reuniram-se os sobrenadantes celulares derivados de todos os instantes, exceptuando o primeiro,· e testou-se a presença de actividade antiviral na forma da sua capacidade para inibir a replicação virai em dois sistemas, representados por infecção aguda e crónica, respectivamente. Para o sistema de infecção aguda utilizou-se a linha de células CEM x 174, que deriva da linha de células B humanas 721.174 fundida à linha de células T humanas CEM (Ref. 143). As células (2 x IO5) foram incubadas em tubos de polipropileno com ou sem 200 pL de sobrenadantes CD8+, preparados como descrito acima, durante 2 horas a 37 °C. As células foram lavadas 3 vezes com meio fresco, foram semeadas a 2 x 104 células por cavidade, em placas de 96 cavidades, e incubadas em 200 pL com (células tratadas) ou sem (células não tratadas) diferentes volumes (50 pL, 5 pL e 0,5 pL) de sobrenadantes de cultura derivados de linfócitos T CD8+ de macacos injectados com a vacina ou o macaco de controlo. Após a infecção, recolheram-se alíquotas dos sobrenadantes da cultura de três em três dias, tendo sido substituídas por um volume igual de meio completo ao qual se adicionou previamente o sobrenadante de cultura CD8+ de macacos vacinados e de controlo. Os resultados apresentados na Tabela correspondem ao dia 7 após a infecção e estão expressos como percentagem ( %) da inibição da replicação virai de células tratadas com sobrenadantes de cultura CD8+ derivadas de macacos vacinados, em comparação com células não tratadas. Determinou-se a replicação virai medindo os valores RT, como descrito (Ref. 54), ou os valores de Gag p27 por ELISA, nos sobrenadantes celulares recolhidos em cada instante. Para o sistema de infecção crónica utilizou-se a linha de células OM-lO-1 (Ref. 20, 21), que representa uma 67 linha linfocítica T humana cronicamente infectada com o HIV-1. As células foram semeadas (em duplicado), a 5 x 104 células/200 μΐ por cavidadef em placas de 96 cavidades, na presença de anticorpos anti-TNFfi (40 μς/mL), com ou sem diferentes volumes (50 μΐ, 5 μΐ, 0,5 μΐ) de sobrenadante celular de linfócitos T CD8+ derivados de macacos vacinados ou de controlo. As células foram activadas para proliferarem por PMA (10~7 M) . Passadas 24 horas recolheram-se alíquotas do meio de cultura para determinar a replicação virai, medindo os níveis de RT ou Gag p24 por ELISA. Os resultados estão representados como % de inibição da reactivação da infecção em células tratadas, comparado com células não tratadas. Os resultados de infecção aguda e crónica apresentados na Tabela referem-se a células tratadas com 5 μΐ de sobrenadante derivado de culturas de células CD8+. ND: não realizado. A análise da hipersensibilidade retardada (DTH) por intermédio de um teste na pele mostrou que os macacos vacinados (Ml e M2) e de controlo (M3) eram negativos (Tabela 8). 68 TABELA 8 Teste na pele para a Tata Semanas após a imunização primária Macacos Ml M2 M3 lõ 1 : 1 15 ” _ ” 22 1 1 1 27 ” _ - 32 1 : 1 37 1 1 : a Tat (1 e 5 μς) em 150 pL de PBS - BSA 0,1 % ou o tampão isoladamente foi inoculada pela via intradérmica numa área dorsal previamente rapada dos macacos vacinados e de controlo (controlo da especificidade da resposta), nas semanas 10, 15, 22, 21, 32 e 37 após a primeira imunização. Os macacos Ml e M2 foram vacinados com proteína Tat recombinante (100 μς e 10 μς, respectivamente) em 250 μΕ de soro autólogo e 250 μΕ de RIBI, injectada pela via subcutânea num sítio. 0 macaco M3 é um macaco de controlo que não foi vacinado. 0 aparecimento de um eritema nodular após 48-12 horas era sugestivo de uma reacção de hipersensibilidade retardada (DTE) : ++, 0^5 mm; +,0^1-4 mm; +/-, eritema sem endurecimento; -, 0 < 1 mm.
Os resultados desta experiência-piloto indicam que a proteína Tat recombinante, produzida e purificada de acordo com um protocolo descrito por nós, não foi tóxica às doses de 100 e 10 pg administradas pela via subcutânea. Adicionalmente, a proteína Tat induziu uma resposta imunológica específica e ampla com actividades antivirais, humorais e mediadas por células. Observou-se uma resposta imunológica anti-Tat mais forte e específica no macaco M2, 69 vacinado com 10 μς de proteína recombinante. Além disso, o adjuvante RIBI não exibiu nenhum sinal aparente de toxicidade nos macacos vacinados.
Com base nestes resultados concebeu-se uma segunda experiência-piloto para determinar os efeitos da imunização com 10 pg de Tat combinada com o adjuvante RIBI ou Alum. Os macacos foram injectados pela via subcutânea num sitio de acordo com a calendarização seguinte. Macacos Ml-3: 10 μg de proteína Tat recombinante em 250 pL de soro autólogo e 250 pL de RIBI. Macacos M4-6: 10 pg de proteína Tat recombinante em 250 μΐ de soro autólogo e 250 μΐ de Alum. Macaco M7: 250 pL de RIBI e 250 pL de soro autólogo (macaco de controlo). Macaco M8: 250 μΐ de Alum e 250 pL de soro autólogo (macaco de controlo). Recolheram-se 10 mL de sangue de cada macaco no dia -9 antes da primeira imunização, para efectuar os exames descritos na experiência-piloto anterior e para determinar os parâmetros basais de cada animal. Os macacos foram inoculados no instante 0 e após 2, 6, 11, 15, 21, 28 e 32 semanas. Na semana 36, os macacos Ml-6 receberam o último reforço de proteína Tat recombinante (16 μρ) em 200 μΐ de ISCOM (complexo de estimulação imunológica) e 300 μΐ de PBS. O ISCOM é um adjuvante que consiste em quil A saponina, colesterol e fosfolípidos, que aumenta a resposta imunológica humoral e mediada por células (Ref. 109, 90). Os macacos M7 e M8 foram injectados nos mesmos instantes apenas com adjuvantes. Em cada altura da vacinação e nas semanas 40, 44 e 50 recolheram-se dos animais 10 mL de sangue, para analisar os parâmetros clínicos e imunológicos descritos na experiência-piloto anterior. Além disso, 70 recolheram-se amostras de urina e esfregaços vaginais para analisar a presença de IgA secretora específica para Tat. Para avaliar o efeito protector da imunização com Tat contra a infecção, os macacos vacinados e de controlo foram provocados com o "vírus da imunodeficiência símia/humana" (SHIV) quimérico, estirpe 89.6P, contendo o gene tat do HIV-1, que previamente cresceu e foi titulado em Macaca fascicularis (Ref. 128, 129, 69) . Após a provocação, os animais foram monitorizados (de duas em duas semanas durante o primeiro mês, de quatro em quatro semanas durante os três meses seguintes e de 8 em 8 semanas até aos 6-12 meses) quanto a parâmetros virológicos, como antigenemia de p27 no plasma e carga virai no plasma e celular. Para confirmar que ocorreu infecção, também se pesquisaram anticorpos anti-SIV por intermédio de um estojo comercial utilizado para a detecção de anticorpos anti-HIV-2 que também reconhece anticorpos anti-SIV (estojo Elavia Ac-Ab-Ak II, Diagnostic Pasteur, Paris, França).
Presentemente, os resultados das segundas experiências-piloto são os seguintes. Não se observaram alterações nos parâmetros físico-químicos, hematológicos e comportamentais. Os macacos não exibiram nenhum sinal inflamatório ou de neovascularização no sítio da inoculação. Observou-se uma resposta de anticorpos específica (IgM, IgG) . Na semana 15, os títulos do anticorpo anti-Tat (IgG) atingiram níveis elevados, que variaram desde 1:6400 até 1:25600 (Figuras 5-7). Os anticorpos reagiram essencialmente com a região amino-terminal (aminoácidos 1-20) da Tat, com títulos que variaram desde 1:1600 até 1:3200 (Figura 8), como se verificou na semana 22. Além disso, também se detectaram anticorpos dirigidos contra os aminoácidos 46-60 da Tat, 71 com títulos que variaram desde 1:100 até 1:200 (Figura 8). Testou-se a capacidade do plasma dos macacos para neutralizar a actividade da Tat avaliando a inibição do resgate virai em células HLM-1 incubadas com quantidades em série de Tat exógena, como previamente descrito na primeira experiência-piloto. Os resultados destas experiências mostraram que o plasma imunológico (diluído 1:2) dos macacos Ml-6 na semana 15 bloqueou a replicação virai induzida por 30 ng/mL de Tat exógena, como determinado pela medição do antigene p24 libertado para o meio de cultura. Inversamente, o plasma pré-imunológico dos macacos Ml-6 ou plasma de macacos de controlo (M7, M8) não bloqueou a actividade da Tat (Tabela 9) . Além disso, plasma imunológico (diluído 1:2) dos macacos Ml-6, recolhido na semana 21, bloqueou a replicação do vírus induzida por 60 ng/mL, 120 ng/mL, 240 ng/mL e 500 ng/mL de Tat exógena. Em particular, estes plasmas determinaram uma redução de 10 vezes da replicação do vírus induzida por doses muito elevadas de Tat extracelular (240 ng/mL e 500 ng/mL) (Tabela 9) . 72 TABELA 9
Actívídade neutralízadora de plasma ímunológíco no resgate da replícação do vírus induzida por Tat extracelulara Amostras Inibição (%) Tat (30 ng/mL) + Ml Pré-imunológico 0 Tat (30 ng/mL) + M2 Pré-imunológico 0 Tat (30 ng/mL) + M3 Pré-imunológico 0 Tat (30 ng/mL) + M4 Pré-imunológico 0 Tat (30 ng/mL) + M5 Pré-imunológico 0 Tat (30 ng/mL) + M6 Pré-imunológico 0 Tat (30 ng/mL) + Ml ímunológíco (semana 15) 89,8 Tat (30 ng/mL) + M2 ímunológíco (semana 15) 78,7 Tat (30 ng/mL) + M3 ímunológíco (semana 15) 100 Tat (30 ng/mL) + M4 ímunológíco (semana 15) 100 Tat (30 ng/mL) + M5 ímunológíco (semana 15) 70,8 Tat (30 ng/mL) + M6 ímunológíco (semana 15) 94,2 Tat (60 ng/mL) + Ml Pré-imunológico 0 Tat (60 ng/mL) + M2 Pré-imunológico 0 Tat (60 ng/mL) + M3 Pré-imunológico 0 Tat (60 ng/mL) + M4 Pré-imunológico 0 Tat (60 ng/mL) + M5 Pré-imunológico 0 Tat (60 ng/mL) + M6 Pré-imunológico 0 Tat (60 ng/mL) + Ml ímunológíco (semana 21) 96,3 Tat (60 ng/mL) + M2 ímunológíco (semana 21) 100 Tat (60 ng/mL) + M3 ímunológíco (semana 21) 100 Tat (60 ng/mL) + M4 ímunológíco (semana 21) 98,7 Tat (60 ng/mL) + M5 ímunológíco (semana 21) 99 Tat (60 ng/mL) + M6 ímunológíco (semana 21) 98,8 Tat (120 ng/mL) + Reunião de Ml-6 Pré-imunológico 0 Tat (120 ng/mL) + Ml ímunológíco (semana 21) 59,2 Tat (120 ng/mL) + M2 ímunológíco (semana 21) 90,4 Tat (120 ng/mL) + M3 ímunológíco (semana 21) 96,8 Tat (120 ng/mL) + M4 ímunológíco (semana 21) 98,3 Tat (120 ng/mL) + M5 ímunológíco (semana 21) 100 Tat (120 ng/mL) + M6 ímunológíco (semana 21) 97,8 Tat (240 ng/mL) + Reunião de Ml-6 Pré-imunológico 0 Tat (240 ng/mL) + Ml ímunológíco (semana 21) 26,1 73 (Continuação)
Actividade neutralizadora de plasma imunológico no resgate da replicação do vírus induzida por Tat extracelulara Amostras Inibição (%) Tat (240 ng/mL) + M2 Imunológico (semana 21) 49,4 Tat (240 ng/mL) + M3 Imunológico (semana 21) 70,3 Tat (240 ng/mL) + M4 Imunológico (semana 21) 91,2 Tat (240 ng/mL) + M5 Imunológico (semana 21) 94,5 Tat (240 ng/mL) + M6 Imunológico (semana 21) 86 Tat (500 ng/mL) + Reunião de Ml-6 Pré-imunológico 0 Tat (500 ng/mL) + Ml Imunológico (semana 21) 32,7 Tat (500 ng/mL) + M2 Imunológico (semana 21) 38,9 Tat (500 ng/mL) + M3 Imunológico (semana 21) 57,5 Tat (500 ng/mL) + M4 Imunológico (semana 21) 89,4 Tat (500 ng/mL) + M5 Imunológico (semana 21) 72 Tat (500 ng/mL) + M6 Imunológico (semana 21) 71,8 a Determinou-se a capacidade de plasma anti-Tat para neutralizar a actividade da Tat em células HLM-1, como descrito na legenda da Tabela 4. A proteína Tat recombinante (30 ng/mL, 60 ng/mL, 120 ng/mL, 240 ng/mL e 500 ng/mL) foi adicionada isoladamente ou em conjunto com um volume igual de plasma pré-imunológico de macaco ou na semana 15 ou 21 (plasma imunológico). Os macacos Ml-3 foram vacinados com 10 pg de Tat em 250 μΣ de soro autólogo e 250 μΣ de RIBI; os macacos M4-6 foram vacinados com 10 //g de Tat em 250 μΣ de soro autólogo e 250 μΣ de Alum; dois macacos de controlo foram injectados com RIBI (250 μΣ e 250 μΣ de soro autólogo) (M7) ou com Alum (250 μΣ e 250 μΣ de soro autólogo) (M8). Os resultados estão representados como descrito na legenda da Tabela 4.
Testou-se a capacidade do plasma de macaco para neutralizar a actividade da Tat extracelular libertada pelas células, durante infecção aguda, em células CEM x 174 infectadas com o vírus quimérico SHIV 89.6P. No dia 7 após 74 a infecção observou-se replicação do vírus em 50 % de células de controlo infectadas com SHIV e cultivadas com o plasma pré-imunológico dos macacos Ml-6. Inversamente, não se detectou replicação do vírus em células infectadas que cresceram na presença do plasma imunológico dos macacos Ml-6 recolhido na semana 44 (Tabela 10). TABELA 10 Actividade neutralizadora do plasma imunológico na transmissão da infecção com o vírusa_ Amostra p27 (pg/mL) SHIV + Ml Pré-imunológico Neg SHIV + M2 Pré-imunológico Neg SHIV + M3 Pré-imunológico 1,080 SHIV + M4 Pré-imunológico 0,602 SHIV + M5 Pré-imunológico 1,169 SHIV + M6 Pré-imunológico Neg SHIV + Ml Imunológico Neg SHIV + M2 Imunológico Neg SHIV + M3 Imunológico Neg SHIV + M4 Imunológico Neg SHIV + M5 Imunológico Neg SHIV + M6 Imunológico Neg a Células CEM x 174 (3 x 104 células/150 μΐ) em placas de 96 cavidades foram infectadas com o vírus SHIV 89. 6P quimérico (5 x 10~5 TCID50/célula), durante 2 horas a 37 °C, em RPMI 1640 que continha FCS 10 %. As células foram lavadas duas vezes com RPMI 1640 e foram novamente suspensas em 150 μΐ de meio completo ao qual se tinha adicionado 5 % do plasma pré-imunológico ou plasma imunológico de macaco (semana 44) de animais vacinados com Tat recombinante (10 μς) e RIBI (Ml-3) ou Alum (M4-6) . Os plasmas dos animais foram previamente aquecidos a 56 °C durante 30 minutos e foram analisados por ELISA para controlar os títulos dos anticorpos anti-Tat. Cada soro foi testado em duplicado. Nos dias 3, 5 e 7 após a infecção, 120 μ! do meio de cultura foram recolhidos e substituídos por um volume igual de meio fresco que continha 5 % do 75 plasma pré-imunológico ou imunológico dos macacos Ml-6. Determinou-se a capacidade do plasma para neutralizar a Tat extracelular, libertada durante infecção aguda, e para controlar a transmissão da infecção in vitro detectando o p27 de Gag virai no meio de cultura por ELISA (Coulter International, Miami, FL). Os resultados, representados como valores de p27 (pg/mL), correspondem ao valor médio de duas cavidades para cada soro no dia 7 após a infecção.
Além disso, observou-se uma resposta proliferativa à Tat desde a semana 11 (Tabela 11). 76 TABELA 11 £ Resposta proliferativa á Tat Macaco Estimulo Semanas desde a imunização primária 0 11 15 21 28 32 36 40 44 50 PHA 16,96 10,50 15,27 33,8 7,2 51,5 64,3 36,05 24 65,7 Ml TT 11,69 1,96 3,01 1,2 1,2 1,3 0,93 1,4 10,05 7,2 Tat 1,2 1,5 0,52 1,7 0,8 0,8 0,6 0,7 9,27 4,7 PHA 31,27 25,75 21,28 87,1 25,7 56 38,2 40.3 29,03 26 N2 TT 1,12 1,8 0,57 1,7 1,15 1,6 4,95 1,2 1,51 2,9 Tat 1,08 3,65 6,22 14,14 3,5 1,8 4,1 1,9 7,67 13,2 PHA 22,42 7,89 16,88 36,3 148,5 42 78,9 27 53,71 ND NB TT 11,43 0,95 1,71 125 12 1,1 1 1 1.81 ND Tat 1.65 269 18.82 2351 1203 0.9 1.3 0.5 23.85 ND PHA 3,88 20,77 15,22 83,7 18,6 35 38,2 45,2 57,47 15,8 M4 TT 2,85 4,49 9,07 6,9 15,8 3,7 3,8 5 19,77 6, 6 Tat 1,29 3,01 3,24 7,9 10,1 2,6 1,5 3,9 33,61 4,7 PHA 6,25 5,74 16,74 72,2 7,45 41 56,5 32,9 33,85 12 M5 TT 2,31 1,07 4,84 3,9 0,9 0,83 1,4 1,24 10,22 1,95 Tat 1,80 0,66 1,76 3,6 2,22 0,8 1,14 1,3 1,33 1,4 PHA 11,96 17,94 2,77 29,4 7,3 25 8,3 6,85 18,01 5,2 M6 TT 4,14 1,71 0,13 1,7 10,34 1,3 1,8 1,1 2,49 0,9 Tat 1,37 1,06 0,11 2, 95 9,3 1,13 1,3 1 1,8 0,3 PHA 21,65 20,30 37,93 17,6 17,9 75 12,9 34,8 41,81 27,5 M7 TT 0,97 0,80 0,88 1 0,6 1,04 0,6 0,4 1,11 1,1 Tat 1,78 0,68 0,73 1 0,42 0,9 0,5 0,8 1,07 0,4 PHA 26,51 67,09 16,38 14,9 17,2 28,2 18,95 20,6 28,61 13,6 MS TT 1,20 10,78 0,20 1,6 0,62 0,8 1,2 0,9 1,11 2,1 Tat 1,12 0,00 0,21 1,03 0,57 0,6 0,5 0,9 1,04 1 3 Linfócitos do sangue periférico foram isolados, activados com PH A (4 μς/mL) , o toxóide tetânico (TT) (10 μς/mL) e Tat (5 μς/mL) e foram avaliados como descrito na legenda da Tabela 5. Os macacos Ml-3 foram inoculados com 10 μς de proteína Tat recombinante em 250 μΣ de soro autólogo e 250 μΣ de RIBI; os macacos M4- -6 foram inoculados com 10 μς de Tat recombinante em 250 μΣ de soro autólogo e 250 μΣ de AI um; dois macacos de controlo foram inoculados com RIBI (250 μΣ e 250 μΣ de soro autólogo) (M7) e com Alum (250 μΣ e 250 μΣ de soro autólogo) (M8). ND, não realizado. 77
Detectou-se uma forte resposta de células T citotóxicas (CTL) num macaco vacinado com a proteína Tat e RIBI (Ml) e em dois macacos vacinados com a proteína Tat e Alum (M4 e M5), ao passo que se observou uma resposta mais fraca de CTLs no macaco M6 imunizado com Tat e Alum (Figura 9 e Tabela 12).
Análise da resposta de CTLs Macaco Semana Razão alvo:Efector activ. CTL 1:50 1:25 1:12,5 1:6,25 1:3,125 Média Ml 28 5,9 4,7 4,1 7,9 5,3 5,5 + 36 ND 14,4 8,8 4,9 6,7 8,7 + M2 28 ND ND ND ND ND ND ND 36 ND ND ND ND ND ND ND M3 28 0 0 0 0 0 0 - 36 ND 0 0,6 0,5 2,0 0,7 - M4 28 0 0 1,1 1,1 2,6 0,9 - 36 ND 2,7 8,3 15 1,9 6,9 + M5 28 4,9 3,9 4,7 5,5 1,7 4,1 + 36 0 1 0 0 0 0,2 - M6 28 0 2,6 1,1 7,2 7,2 3,6 +/- 36 ND 0 0 0 0 0 - M7 36 0 0 0 0 0 0 - M8 36 0 0 0 0 0 0 - 3 0 ensaio foi realizado como descrito na Tabela 6. Os macacos Ml- 3 foram imunizados com 10 //g de Tat recombinante em 250 μΐ de soro autólogo e 250 μ! de RIBI; os macacos M4- 6 foram inoculados com 10 μg de Tat recombinante em 250 μΐ de soro autólogo e 250 μΐ de Alum; dois macacos de controlo foram inoculados com RIBI (250 μΐ e 250 μΐ de soro autólogo) (ΜΊ) e AI um (250 μ! e 250 μΐ de soro autólogo) (M8) . ND, não realizado
Na semana 44 determinou-se a presença da actividade antiviral total (TAA). Mediu-se a TAA pela capacidade de 78 PBMCs de macacos vacinados com proteína Tat recombinante, cultivadas na presença de soro autólogo, para serem resistentes à infecção com o SHIV 89.6P (Tabela 13). TABELA 13
Análise da presença de actividade antiviral total (TAA)a ID Macaco Dias após a infecção 7 17 Dose infecciosa mínima (TCID50/célula) Dose infecciosa mínima (TCIDso/célula) Ml IO-2 IO-2 M2 IO'4 ΚΓ4 M3 IO-3 IO-3 M4 IO-2 IO-2 M5 IO-2 IO-2 M6 IO-3 IO-3 M7 10"3 10"3 M8 10"4 10"3 a Recolheram-se PBMCs, na semana 44, de macacos vacinados com a proteína Tat recombinante (10 μς) e RIBI (Ml-3) ou Alum (M4-6) e de macacos de controlo inoculados com RIBI (M7) ou Alum (M8). As PBMCs, purificadas por gradiente de Ficoll e semeadas em triplicado, a 5 x 105/200 pL por cavidade, em placas de 48 cavidades, cresceram em RPMI 1640 contendo FCS 10 % e 5 % de plasma autólogo previamente aquecido a 56 °C durante 30 minutos, na presença de um anticorpo monoclonal anti-CD3 (5 ng/mL) e IL-2 (2 U/mL), durante 48 - 72 horas a 37 °C. As células foram infectadas com diluições em série do vírus quimérico SHIV 89.6P (10~2, 10~3, 10~4, 10~5 TCID50/célula) durante 2 horas a 37 °C, foram lavadas 3 vezes com PBS-A e novamente suspensas em 50 % de meio condicionado e 50 % de meio fresco a 5 x 105 células/ mL/cavidade. Nos dias 3, 7, 10, 14 e 17 após a infecção, alíquotas do meio de cultura foram recolhidas e substituídas por volumes iguais de meio 79 fresco. Determinou-se a replicação do vírus em sobrenadantes celulares por ELISA para Gag p27 (Coulter International, Miami, FL) . Os resultados estão apresentados como a dose infecciosa mínima de SHIV (TCIDsó/célula), nos dias 7 e 17 após a infecção, capaz de infectar linfócitos de macaco.
Os resultados demonstram a presença de actividade antiviral solúvel mediada por linfócitos T CD8+ (CAF) (Tabela 14). Observou-se um aumento global da actividade CAF em macacos vacinados, em comparação com animais de controlo. TABELA 14
Análise da presença de actividade antiviral solúvel mediada por linfócitos T CD8+ (CÂF)a ID Macaco Semanas após a imunizarão primária % de inibirão da replicarão virai Infecção aguda Infecção crónica M1 0 s 30 32 53 53 M2 0 36 0 32 60 27 M3 0 0 37 32 65 29 M4 0 45 0 32 85 66 M5 0 41 0 32 ND ND MS 0 49 18 32 34 41.4 M7 0 3S 3S 32 71 44 MS o 37 0 32 76 26,8 a Análise da presença de actividade antiviral solúvel mediada por linfócitos T CD8+ (CAF) de macacos vacinados 80 com proteína Tat recombinante (10 μς) e RIBI (Ml-3) ou Alum (M4-6) e de macacos de controlo inoculados com RIBI (M7) ou Alum (M8). Testou-se a infecção aguda em células CEM x 174 infectadas com SHIV 89. 6P. O ensaio foi realizado como descrito na Tabela 7, e os resultados referem-se ao dia 7 após a infecção. Testou-se a presença de CAF no sistema de infecção crónica na linha de células UI (Ref. 47), que é uma linha de células humanas promonocíticas cronicamente infectadas com o HIV-1. As células Ulf semeadas a x 104 células/200 μΐ por cavidade em placas de 96 cavidades, foram incubadas com PMA (10~8 M) para induzir reactivação da infecção pelo HIV-1, com ou sem diferentes volumes (50 μΐ, 5 μΐ, 0,5 μΐ) de sobrenadantes da cultura de linfócitos T CD8+ derivados de macacos vacinados e de controlo. Três dias após o tratamento com PMA determinou-se a presença do HIV-1 no meio de cultura por ensaio de RT ou ELISA para Gag p24. Os resultados estão apresentados como % de inibição da replicação do HIV-1 em células tratadas com sobrenadantes de células T CD8+ em comparação com células não tratadas. Os resultados da inibição da infecção aguda e crónica referem-se a células tratadas com 5 μΐ de sobrenadantes CD8+.
Também se determinou a produção de citoquinas (ylFN, IL-4, TNFa) e da quimioquina RANTES de PBMCs de macacos vacinados com Tat e RIBI (Ml-3) ou Tat e Alum (M4 — 6) e macacos de controlo M7 e M8 (Tabela 15). 81
82 a Análise da produção de citoquinas e quimioquinas após 48 e 96 horas de cultura (48/96) de PBMCs de macacos vacinados com 10 μς de Tat e RIBI (Ml-3) ou Alum (M4-6) . Os macacos de controlo (M7 e M8) foram inoculados com o adjuvante RIBI ou Alum, respectivamente. As PBMCs, recolhidas na semana 44 e purificadas por gradiente de Ficoll, foram semeadas a 1 x 106 células/mL por cavidade em placas de 24 cavidades e cresceram em RPMI 1640 que continha FCS 10 %. As PBMCs não foram estimuladas (controlo), para avaliar a libertação espontânea de citoquinas e quimioquinas, ou foram estimuladas com PHA (2 μς/mL), o toxóide tetânico (TT, 5 μς/mL) ou Tat (1 ou 5 μς/mL). Recolheram-se alíquotas dos sobrenadantes da cultura 48 e 96 horas após a estimulação para determinar a presença de citoquinas e quimioquinas, por intermédio de estojos de ELISA comerciais da BioSource International (Camarillo, CA, E.U.A.) para avaliar a produção de citoquinas, e da R&D Systems (Abdigdon, Oxon, R.U.) para avaliar a produção de RANTES. Os resultados estão apresentados em pg/mL às 48 e 96 horas da cultura (48/96), respectivamente. Os valores limite foram (pg/mL): ylFN, 31,2; IL-4, 3,12; TNFa, 15,6; RANTES, 6,25. Os valores (-) foram inferiores aos valores-limite correspondentes. Nd: não realizado.
Além disso, na semana 15, cinco macacos vacinados com a proteína recombinante (M2-6) exibiram uma reacção positiva no teste na pele para a Tat, com uma forte reacção de hipersensibilidade retardada (Tabela 16 e Figura 19) . Nos macacos 4 e 5, a reacção do teste na pele foi ainda mais forte nas semanas seguintes (Tabela 16). 83 TABELA 16
Teste na pele para a Tat a
Macaco Semanas desde a imunização primária 11 15 21 28 32 36 44 Ml - - - - - - - M2 - + + +/- +/- + +/- M3 +/- + +/- +/- - - - M4 - + ++ ++ ++ ++ ++ M5 +/- + ++ + ++ ++ + M6 - + +/- +/- - - - M7 ND ND ND ND ND ND ND M8 ND ND ND ND ND ND ND a Tat (1 e 5 μς), em 150 μΣ de PBS-BSA 0,1 % ou no tampão
Os resultados pós-provocação indicam que 4/6 (67 %) dos macacos vacinados ficaram protegidos contra infecção com 10 MID50 de SHIV 89.6P, como mostrado pelos resultados dos ensaios virológicos (Tabela 17). Em particular, o antigene Gag p27 não foi detectado no plasma dos macacos Ml, M2, M4 e M6, não se encontrou DNA pró-viral, por PCR, em linfócitos destes macacos e a citoviremia foi negativa. Os macacos M3 e M5 ficaram infectados, como mostrado pela presença do antigene Gag p27 no plasma, por detecção de DNA isoladamente, foi inoculada pela via intradérmica numa área rapada do dorso de macacos vacinados. Os animais de controlo não foram inoculados (ND, não realizado) nas semanas 11, 15, 21, 28, 32, 36 e 44 após a primeira imunização. Os macacos Ml-3 foram vacinados com 10 μς de proteína Tat recombinante em 250 μΣ de autólogo e 250 μΣ de RIBI; os macacos M4-6 foram vacinados com 10 μς de proteína Tat recombinante em 250 μΣ de soro autólogo e 250 μΣ de Alum; dois macacos de controlo foram inoculados com RIBI (250 μΣ e 250 μΣ de soro autólogo) (M7) ou Alum (250 μΣ e 250 μΣ de soro autólogo) (M8) . A presença de um nódulo eritematoso após 48 - 72 horas era sugestivo de uma reacção de hipersensibilidade retardada (DTH): ++, 0^5 mm; +,0½ 1-4 mm; +/+, eritema sem endurecimento; -, 0 < 1 mm. 84
pró-viral nas células e por uma citoviremia positiva (Tabela 17) . Ambos os controlos (M7 e M8) ficaram infectados, com base nos mesmos ensaios virológicos. Para controlar suplementarmente a infectividade da dose virai utilizada para a provocação, adicionou-se aos animais de controlo outro macaco não manipulado (M13) , que foi infectado com 2,85 MID50 de SHIV 89.6P (correspondente a uma dose do virus 3,5 vezes mais baixa do que a dose utilizada no protocolo para a provocação dos animais). 0 macaco M 13 ficou infectado, com base em todos os ensaios virológicos. Para confirmar que os animais tinham sido expostos ao virus analisou-se a presença de anticorpos contra antigenes SIV codificados pelo vírus quimérico SHIV 89.6P (Gag, Pol, RT, Nef), como já descrito neste Exemplo. A presença de anticorpos anti-SIV nos macacos negativos para os parâmetros virológicos (Ml, M2, M4 e M6) confirma que estes animais foram expostos ao virus e indica que ocorreu nestes macacos uma infecção abortiva do SHIV. Os macacos que exibiram títulos baixos de anticorpos anti-SIV foram estudados quanto à produção in vitro de igG antiviral específica (IVAP) (Ref. 177, 178) de acordo com o método seguinte. Semearam-se PBMCs (2 x 106/cavidade) em placas de 24 cavidades, tendo sido estimuladas com PWM (2 pg/mL,
Sigma, St. Louis, E.U.A.). Após 7 dias de incubação (a 37 °C na presença de 5 % de CO2 e 95 % de humidade) recolheram-se sobrenadantes da cultura para avaliar a produção de anticorpos anti-Ηΐν com um estojo de Elisa comercial para a detecção de anticorpos para o HIV-1 e HIV-2 (Abbott, HIV-l/HIV-2 EIA Third Generation Plus). Todos os macacos provocados foram positivos quanto à produção de anticorpos anti-Env do HIV, uma vez que o Env do HIV-1 está presente no SHIV 89.6P. 85 0 υ ’8ι "0 •"Η 0 3 Ώ 0 4J U Ό U α <ϋ 01 μ -nj r Dias após provocação com SHIVS9.6P (£· 1 H ΰ μ > t) í H h os ín ÍN 1:2 c- ÍN 1:10 <o 1 1 8 M tf \ OS H I 5 0 u O P •Η -H L> > I I V 1 ÍC 3 I S3 ÍN O z n “ S £ * &< Ω *0 < u V V K V 1 V S 8 'T &| § V V 8 V 8 V s V V 8 V 8 V * V R 1 H O P > & tí H H (C Ώ ÍN I ÍN ÍN 32 R A ΙΛ § ?-ι< OU •H l g 0 11 P u •Η -H D > I I g íj I o3 I X i e· -í tí O Z Ώ o; ·=) 'h .... υ s a Oh G -.Q — u V V £ CR V 1 Λ V s 55 *T3 >v. + ÍA. S= ín Ci g o ÍN V ei ín V o V 32 ú ei ín V íN g O V ÍN V - η·π O P > tn d h h os ín ÍN ÍN i Z Cl $ z ® R λ Cl □ z u (tí •H i g 0 11 P u •Η -H u > ÍS ÍS 1 N- O I fid 1 í? <& N- O N- O Γ1- + n . os ní ή -$... u B as &H A U V V l-fí (Λ iv V l·- £ V 1 Φ !N. Γ··,; P., + «5 “ ÍV. p R V R V K R V 1 R V n ÍA. d O <12 N- 9j 0 u OU u ¢3 E 2 ?N Έ s i U2 1 £ 1 i 86 Análise dos parâmetros virológicos após provocação de macacos vacinados com 10 pg de proteína Tat recombinante e RIBI (Ml-3) ou Alum (M4-6) . Os macacos de controlo (M7 e M8) foram inoculados com RIBI ou Alum, respectivamente. 0 macaco M13 era um animal não manipulado infectado com 2,85 MID50 de SHIV 89. 6P. a Avaliou-se a antigenemia no plasma por ELISA para Gag p27 (Innogenetics, Bélgica), e está expressa como valores de p27 (pg/mL) . Neg, o valor foi inferior ao valor limite correspondente (18 pg/mL). b 0 DNA foi purificado por sangue completo utilizando o estojo de sangue QlAamp (Angiogen Gmbh and Qiagen Inc., Hilden, Alemanha). Controlou-se a qualidade do DNA por amplificação por PCR do gene da β-globina, como previamente descrito (Ref. 141). Analisou-se a presença de DNA pró-viral por amplificação por PCR semi-quantitativa de gag de SIV. Realizou-se PCR em 1 pg de DNA celular utilizando os "primers" SG 1096Ngag (correspondente aos nucleótidos 1096-1119 do genoma de SIVmac251: 5 'TTAGGCTACGACCCGGCGGAAAGA3') (ID SEQ NO: 35) e SG1592CgagD (mapeamento nos nucleótidos 1569-1592 do genoma de SIVmac251: 5'ATAGGGGGTGCAGCCTTCTGACA G3') (ID SEQ NO: 36), que amplificam um fragmento de 496 pares de bases do gene gag de SHIV, como descrito (Ref. 153). Para quantificar o número de cópias de DNA pró-viral, em cada experiência preparou-se uma curva padrão utilizando como DNA modelo o plasmídeo pCMRII-Agag (contendo uma deleção de 100 pares de bases no gene gag de SIVmac251) e os "primers" descritos acima, que amplificam um fragmento de DNA de 396 pares de bases. Os produtos de PCR foram 87 analisados por electroforese e foram quantificados por análise densitométrica (Ultrascan LX Enhancer Laser, LKB, Bromma, Suécia). A relação entre os valores O.D. e o número de moléculas do plasmídeo Agag foi correlacionada por análise de regressão linear (Statgraphics, Manugistics, Inc., Cambridge, MA). Os valores O.D. foram lineares até 1000 moléculas (coeficiente de correlação = 0,954 ± 0,026). Determinou-se o número de cópias de DNA pró-viral do εΗΐν/μρ de DNA celular por interpolação dos valores O.D. de cada amostra para a curva padrão. A sensibilidade do ensaio foi 1 cópia de pró-vírus///g de DNA. c Determinou-se a citoviremia em ensaios de co-cultura. Para esta finalidade, 1 x 104 células CEM x 174 foram cultivadas na presença de diluições em série de PBMCs depletadas de CD-8 em estudo (um total de 12 diluições, desde 1 x 106 até 3,9 x 103 células por cavidade) em placas de 96 cavidades. Nos dias 3, 7 e 10 após a infecção removeram-se 150 μΕ para avaliar a presença de Gag p27 por ELISA (Innogenetics, Bélgica), que foram substituídos por um volume igual de meio fresco. Os resultados foram analisados por intermédio da fórmula de Reed e Muench para determinar o número de PBMCs infectadas de forma produtiva por milhão de células totais. d Determinou-se a presença de anticorpos contra o SHIV em diluições em série de plasma de animal testado em duplicado utilizando o estojo Elavia Ac-7\b-Ak II (Diagnostic Pasteur, Paris, França), de acordo com as instruções do fabricante. Apresenta-se a diluição mais elevada à qual os valores no plasma foram superiores ao valor limite. 88 e Para o macaco M13 efectuou-se isolamento do vírus em vez de citoviremia. Para esta finalidade, PBMCs (3 x 106) de macacos infectados com diferentes doses de SHIV 89. 6P, purificadas por Ficoll, foram cultivadas com células CEM x 174 (1 x 106) em 1 mL de meio contendo FCS 10 %. Após 24 horas, as células foram diluídas a 1 x 106/mL e foram cultivadas durante três dias. Depois recolheram-se 2 mL de meio e as células foram novamente semeadas a 3 x 105/mL em 7 mL. Deitou-se fora o excesso de células. Repetiu-se este procedimento duas vezes por semana durante 4 semanas. Determinou-se a presença do vírus por ELISA para Gag p27 (Innogenetics, Bélgica) e depois por ensaio de RT. 0 isolamento do vírus foi considerado positivo (+) quando ambos os ensaios (p27 e RT) foram positivos em 3 amostras sequenciais. Caso contrário, o isolamento do vírus foi considerado negativo (-) . f Realizou-se um PCR de DNA qualitativo para o macaco M13.
Os dados virológicos sobrepõem-se ao número absoluto de linfócitos CD4, que foi dramaticamente reduzido em macacos infectados (M3, M5, M7, M8) e permaneceu elevado e estável nos animais negativos para o virus (Ml, M2, M4, M6), como mostrado na Tabela 18. 89 + 00 δ 11 + *3* 8 Ώ 0 -υ 'Μ υ '0 Ή S Ή 1 α 8 Ε U ϊ] Μ Ί 'U ϋ 1¾ σι οο > Μ ta εη 5 □ υ 0 !0 Ε* ¢3 υ D > □ ίι 6 I η Ό Ρ, η ου •Η ΰ § Ί. * ΐ •Η ρ —1 υ υ -Ç- 8 ο ΐ 3 u Ο [Vv q Ο oj 2? !Λ wí 8 1 o o £ ó ÍiO o d & Ω ο σ; ;···' . «S Ιλ 3 & 3¾ S U3 ;g ον 8 !ί b s- bO 03 í? s . ~ s_.' s- r· ·- cd Tf b K § i S & SI 8' 00 Γ··; o E -V 3 ϋ Φ $ ή Ê ο íC ® ® μ .-, f ί\ £3 ν_· £ tf) í*i à £ -1 fT - o X; C) is }Ν·. Λ'·( 00 ·-_·, N- S" si !?0 W £ 1 0 | (d Ή 2 «Η "11 υ + 3 □ S C3 5 ο 3 Ο •Λ C3 o C« o O s o ¢3 ·+ 3 ϋ ο 00 C? f*":· !i$ >.? ,1-, ο Ν- 'τ- ?ι. 0" ^ SS 8 2 ^ν, ν'1. 5j Ú “ O 00 o s Z o ι·Λ K •Λ "t 8, á b Cn ^ g b 'X: Cn N Ú l· 4 "t Ct ϋ 8' SCS ίΝ s 3 8' :.Γ; ίΝ 8 Β - i s 1’ íf §. 21 8' crc ^ w « oo d. ^ & 8 s. S’ 00 ΤΗ a - g tf.· ! ' « C- kiO ~± -<· ' ¢3 Ή 3 —I -υ υ 1 •Vs ·+ 3 ϋ Ω Ζ CS ζ r"; Q Q 21 Q Q o z t i ο G ζ Ω ζ ο ζ G z G z □ z □ z G z <3 O Sk e + 3 ϋ Ω Ζ □ ζ £3 Ζ Cl 2 Cl D D C1”' ^7 s§ s. νΓ: — * 8 Η Ρ ι—1 "11 υ τ □ ο ί 3 ϋ 8 φ s iS 3 £3 5 £3 5} b i-:0 ϊ-:0 d δ + 8 ϋ b i£t s â 0 $ ΕΝ Ο ί^ϊ -·_· O ^ T ^ ·-.· b 5P3 ίΛ ? 1 b ^ Q « J t5- \_.s 8" oo o s 3. >b" S 8- « b -ί- 3 ϋ τ- § ε\ί £ η -....· S £ ÍÍ5 Ν 3· I γο ΣΙ ν_Λ tf; O S φ o o< ^ s§ b b ÍT3 T- u'j Σ: oo ·._-,· o í! :-v .5' sl iS 0 υ οο υ (β Β *5 g I 1 CIO N·- 1 00 1 90 90 a Análise FACS de linfócitos CD4+ e CD8+ de macacos vacinados com 10 pg de proteína Tat recombinante e RIBI (Ml-3) ou Alum (M4-6). Os macacos de controlo (M7 e M8) foram inoculados apenas com adjuvante RIBI ou Alum, respectivamente. O macaco M13 era um animal não manipulado infectado com 2,85 MID50 de SHIV 89.6P. A análise foi realizada por triagem de células activadas por fluorescência (FACS) como descrito (Ref. 137), utilizando anticorpos monoclonais etiquetados (FITC anti-CD4, BioSource; PerCp anti-CD8, Becton-Dickinson) . ND, não realizado.
Os resultados antes da provocação indicam que o imunogene Tat, bem como os adjuvantes RIBI e Alum (ou ISCOM, que foi utilizado como adjuvante no último reforço) foram bem tolerados pelos animais e não foram tóxicos, confirmando os resultados de segurança e tolerabilidade da imunização com Tat obtidos na primeira experiência-piloto. Além disso, estes dados confirmam as observações da primeira experiência-piloto, conferindo evidências adicionais para o facto da proteína Tat recombinante induzir uma forte resposta humoral e celular específica para a Tat, com efeitos antivirais in vitro e in vivo. Os resultados pós-provocação (4/6 macacos protegidos) confirmam o que se esperava dos resultados in vitro e indicam que uma vacina anti-Tat induz protecção contra a infecção e, em consequência, contra a doença. O seguimento dos dois macacos vacinados e infectados irá clarificar os efeitos da vacinação na progressão da doença.
Exemplo 5. Inoculação em Macaca fascicularis de uma vacina de DNA anti-Tat: análise da segurança, tolerabilidade, 91 resposta imunológica da espécie e eficácia da protecção contra provocação virai (não reivindicado) É proposta a inoculação directa de DNA do plasmideo pCV-Tat, que contém o cDNA do gene tat, e do plasmideo pCVO como DNA de controlo. Os DNAs plasmidicos a serem administrados a animais são amplificados em E. coli (estirpe DH5) de acordo com procedimentos comuns (Ref. 110) e com protocolos estabelecidos pela European Agency for the evaluation of medicai products; Human Medicine Evaluation Unit (Relatório Técnico N° de Série 17, Janeiro de 1997), purificados por dois gradientes de CsCl e dialisados durante 48 - 72 horas contra 100 volumes de PBS. Em seguida, os DNAs são verificados por digestão com enzimas de restrição. A funcionalidade do DNA plasmidico é controlada por transfecção de 5 - 10 pg de DNA utilizando técnicas de fosfato de cálcio (Ref. 110) em células H3T1 (1 x 106) , que contêm uma cópia integrada do plasmideo repórter LTR-CAT do HIV-1, e, 48 horas mais tarde, por análise da actividade de CAT (Ref. 55). Avaliaram-se a tolerabilidade, a segurança, a capacidade para induzir uma resposta imunológica especifica (humoral e celular) e a eficácia da protecção contra a provocação com o virus após imunização com DNA plasmidico pCV-Tat em macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) . Numa primeira experiência-piloto, três macacos foram imunizados de acordo com a calendarização seguinte: o macaco Ml foi inoculado com 200 pg de pCV-Tat em 300 pL de PBS pela via i.d. em 2 sítios do dorso, perto dos nodos linfáticos axilares (150 μΐ/είΐίο); o macaco M2 foi inoculado com 500 pg de pCV-Tat em 500 pL de PBS pela via i.m. em 2 sítios do dorso (250 pL/sítio). Nos dias 1 ou 5 antes da inoculação i.m., 250 μΐ de solução fisiológica, que continha bupivacaína 0,5 % e metilparabeno 92 0. 1 %, foram injectados nos dois sítios, previamente marcados, onde seria inoculado o DNA plasmídico. Isto foi feito para aumentar a captação e expressão do DNA no músculo (Ref. 37, 45). O macaco M3 não foi inoculado e foi utilizado como animal de controlo. No entanto, começando na semana 10, este macaco foi inoculado com 6 μς (5 + 1 μς) 1. d. de Tat como controlo para testes na pele. Recolheram-se 10 mL de sangue de todos os macacos 42 e 35 dias antes da primeira inoculação, para análise dos parâmetros basais. Os macacos foram inoculados no instante 0 e após 5, 10, 15, 22, 27, 32 e 37 semanas. Por fim, na semana 42, os animais receberam o último reforço de proteína Tat recombinante (16 μς) em 200 μΐ de ISCOM e 300 μΐ de PBS. Os animais foram observados diariamente quanto a parâmetros clínicos como descrito no Exemplo 4. Além disso, recolheram-se 10 mL de sangue no mesmo dia da inoculação, como descrito no Exemplo 4. Determinou-se o efeito protector da vacinação após provocação dos macacos com 10 MID50 de SHIV89.6P, que foram injectados pela via intravenosa na semana 65. O seguimento pós-provocação, ainda a decorrer, foi realizado como descrito no Exemplo 4. Os resultados desta experiência são os seguintes. Em dois macacos vacinados e no macaco de controlo não se observaram alterações de parâmetros clínicos, hematológicos e comportamentais. Não se observaram sinais inflamatórios ou neovascularização no sítio da injecção. Estes resultados indicam que o DNA de pCV-Tat foi bem tolerado pelos animais e não foi tóxico às doses e vias de inoculação utilizadas na experiência. O macaco Ml, vacinado com 200 μρ de DNA pela via i.d., desenvolveu anticorpos IgG específicos para a Tat desde a semana 32 (Figura 11) . os títulos dos anticorpos (desde a semana 32 até à semana 58) variaram entre 1:100 e 1:800 93 (Figura 12) . Na semana 37, a análise de mapeamento de epitopos (realizada como descrito na legenda da Figura 4) mostrou que estes anticorpos foram dirigidos contra regiões especificas da Tat, com mapeamento nos aminoácidos 1 - 20, aminoácidos 46 - 60 e aminoácidos 65 - 80, com títulos de 1:200, 1:100 e 1:50, respectivamente (dados não mostrados). No macaco M2, vacinado com 500 μρ de DNA pela via i.m., mal se detectaram anticorpos anti-Tat (com um título de 1:50, não mostrado) durante todo o período do estudo. Os resultados estão apresentados na Figura 11. Testou-se a capacidade do plasma do macaco Ml, vacinado com 200 μρ de DNA pela via i.d., para neutralizar a actividade da Tat avaliando a inibição do resgate da replicação virai em células HLM1 incubadas com proteína Tat exógena, como descrito no Exemplo 4. Este ensaio mostrou que o plasma do macaco Ml, diluído 1:2 e obtido na semana 37, reduziu a replicação virai induzida por 30 ng/mL de Tat exógena. Inversamente, o plasma do mesmo macaco obtido no instante 0 (pré-imunológico) não bloqueou a Tat extracelular (Tabela 19) . TABELA 19
Actividade neutralizadora do plasma no resgate de infecção virai induzida por Tat extracelulara
Amostras Inibição Tat + Ml pré-imunológico 0 Tat + Ml imunológico 51 94 â Determinou-se a capacidade de anticorpos anti-Tat para neutralizar a actividade da Tat em células HLMl por adição de 30 ng/mL de proteína Tat recombinante, previamente incubadas com um volume igual de plasma obtido no instante 0 (pré-imunológico) ou na semana 37 (imunológico) do macaco Ml, vacinado com 200 μg de DNA plasmídico pCV-Tat pela via i.d. 0 ensaio foi realizado e os resultados estão expressos como descrito na Tabela 4.
Os resultados apresentados na Tabela 20 demonstram a presença de uma resposta proliferativa para a Tat na semana 42 no macaco Ml imunizado com 200 μς de DNA pela via i.d., ao passo que não se detectou este tipo de resposta celular no macaco M2.
Resposta proliferativa à Tat;
Macaco Estimulo
Semanas após a imunização primária 15 22 27 32 37 42 48 48 PHA 32, 9 45 89,3 40,5 3,1 13,3 ND 13,1 Ml TT 0,8 2,7 1,5 1,3 0, 6 9 1,2 1,6 Tat 0, 9 1,7 1,2 1,1 1,1 5,9 1 1 PHA 11,7 18,5 21,8 32,2 1,1 6,2 7 18, 9 M3 TT 0, 9 1,8 0,8 1,1 1 1,5 1,1 1 Tat 0,8 1,4 0, 9 1,1 1,1 1,3 1,1 1 PHA 5,1 19, 9 18,2 6, 6 8,1 77,8 ND 2,1 M3 TT 7,2 6,2 5,5 2,8 5, 6 36,8 1 2,1 Tat 2,1 1,4 2,2 0,7 1,5 2,8 0, 8 0, 9 3 PBMCs foram isoladas, estimuladas com PHA (4 μg/mL), toxóide tetânico (TT) e Tat (1 ou 5 pg/mL) e foram testadas como descrito na Tabela 5. Os macacos foram vacinados com 200 μg (Ml) de pCV-Tat pela via i.d. ou com 500 pg (M2) de pCV-Tat pela via i.m. O macaco M3 não foi vacinado mas foi inoculado desde a semana 10 com 6 pg (5 + 1 pg) i.d. de Tat, como controlo para testes na pele. ND: não realizado. 95
Detectou-se a actividade citotóxica anti-Tat (CTL) no macaco Ml nas semanas 42 e 48 e no macaco M2 na semana 48. Além disso, observou-se uma resposta de CTLs positiva na semana 48 no macaco M3, que foi inoculado desde a semana 10 com 6 μς de Tat como controlo para testes na pele (Tabela 21) . TABELA 21 Aíiãiise da actividade citotóxica específica para Tat (CTL)3 Actividade de CTLs Macaco Semana Razão Alvo:Efector 1 ;S0 1:25 1:12,5 1 .:5,25 1:3,125 Meio (Vil 42 274 27.8 17,1 9,8 3,9 17,2 + 48 ND ND 21,8 0 II ,7 11 + Μ2 42 1,2 5,9 2,4 1 0 2,1 - 48 ND ND ND iy , 25,1 41 + m 42 0 0 Q 12 0 0,6 - 48 ND 12.4 4.2 0 0 0 +· a O ensaio foi realizado como descrito na Tabela 6. Os macacos foram vacinados com 200 //g (Ml) de pCV-Tat pela via i.d. ou com 500 μς (M2) de pCV-Tat pela via i.m. c. macaco M3 não foi vacinado mas foi inoculado desde a semana 10 com 6 μς (5 + 1 μς) i.d. de Tat, como controlo para testes na pele. ND: não realizado.
Os resultados apresentados na Tabela 22 indicam, na semana 52, a presença de actividade antiviral total (TAA) em ambos os macacos vacinados com 200 e 500 μς de DNA. 96 TABELA 22 Análise da actividade antiviral total (TAA)a Macaco Dias pós- -infecção 7 17 Dose infecciosa minima Dose infecciosa minima (TCID50/célula) (TCID50/célula) Ml 1CT4 IO-4 M2 IO-4 IO-4 M3 IO-8 IO-8 a 0 ensaio foi realizado como descrito na Tabela 13. Os macacos foram inoculados com 200 μς (Ml) de pCV-Tat pela via i.d. ou com 500 μς de pCV-Tat pela via i.m. 0 macaco M3 não foi inoculado mas recebeu, desde a semana 10, 6 μς (5 + 1 μς) i.d. de Tat, como controlo para testes na pele. As PBMCs foram recolhidas na semana 52 desde a imunização primária e foram infectadas com SHIV 89. 6P (10~2, 10~4, 10~6, 10~8 TCID50/célula) . os resultados estão representados como a dose infecciosa mínima de SHIV (TCID5o/célula) que ainda conseguiu infectar as células.
Os resultados apresentados na Tabela 23 indicam a presença de actividade antiviral solúvel (CAF) mediada por linfócitos T CD8 + , nas semanas 22 e 27, em ambos os macacos vacinados. Esta actividade foi inferior no macaco de controlo. TABELA 23 Análise da actividade antiviral solúvel mediada por células CD8+ (CAF)° Macaco Semanas desde a imunização primária % de inibição da replicação virai Infecção aguda Infecção crónica Ml 22 62 27 27 56 25 M2 22 74 ND 27 28 ND M3 22 24 ND 27 37 22 a Análise da presença de actividade antiviral solúvel 97 produzida por linfócitos T CD8+ (CAF) derivados de macacos inoculados com 200 μς (Ml) e 500 μς (M2) de pCV-Tat e do macaco M3. Avaliou-se a actividade antiviral na infecção aguda e crónica em células CEM x 174 infectadas com SHIV 89. 6P e em células OM-lO-1 cronicamente infectadas com o HIV-1, como descrito na Tabela 7. Os resultados estão representados como percentagem (%) de inibição da replicação virai em células tratadas com sobrenadantes de linfócitos T CD8+ em comparação com células não tratadas. Os resultados das infecções aguda e crónica apresentados na tabela referem-se a amostras tratadas com 5 μΕ de sobrenadantes da cultura de CD8+. ND, não realizado.
Os resultados apresentados na Tabela 24 demonstram que o macaco Ml, inoculado com 200 μς de DNA pela via i.d., teve um teste na pele positivo para a Tat na semana 22. TABELA 24 Teste na pele para a Tata Semanas pós-imunização Macaco Ml M2 M3 10 - - - 15 - - - 22 + - - 27 - - - 32 - - - 37 - - - 42 - - - 48 - - - 52 - - - 58 - - - a Tat (1 e 5 μg) em 150 μΕ de PBS - BSA 0,1 % ou o tampão isoladamente (controlo) foi inoculada i.d. numa área previamente tricotomizada do dorso superior dos animais vacinados e no macaco de controlo (controlo da especificidade da resposta) nas semanas 10, 15, 22 , 27, 32, 37, 42, 48, 52 e 58 desde a imunização primária. 0 macaco 98 98 Ml foi inoculado i.d. com 200 μς de DNA do plasmídeo pCV-Tat, ao passo que o macaco M2 recebeu 500 μς do mesmo plasmídeo i.m. 0 macaco M3 (controlo) não foi vacinado mas, desde a semana 10, recebeu 6 μς (5 + 1 μς) i.d. de Tat, como controlo para testes na pele. 0 aparecimento de um nódulo eritematoso, 48 até 72 horas depois, indicou a presença de hipersensibilidade do tipo retardado (DTE) : ++, 0 2 5 mm; +, 0 > 1 - 4 mm; ±, eritema sem endurecimento; -, 0 < 1 mm.
Estes resultados indicam que o plasmídeo pCVTat (DNA pCVTat) foi bem tolerado e seguro intradermicamente e intramuscularmente às doses apresentadas. Além disso, estes resultados demonstram que a imunização com o DNA pCVTat induz uma resposta imunológica anti-Tat humoral (apesar de inferior à induzida pela imunização com a proteína Tat recombinante) e celular, com efeitos antivirais. No que se refere à eficácia protectora após a provocação (realizada na semana 65 desde a imunização inicial), os dados virológicos, incluindo medições de antigenemia e citoviremia, e determinação do número de cópias de DNA pró-viral (PCR para DNA) em PBMCs indicam que o macaco M2, imunizado i.m. com DNA de Tat, ficou protegido por provocação com 10 MID50 de SHIV-89.6P, ao passo que o
macaco Ml, imunizado i.d. com uma dose mais pequena de DNA de Tat (200 μρ), ficou infectado, sugerindo que, relativamente à imunização com DNA, a via i.m. é mais eficaz do que a inoculação i.d. O macaco de controlo M3 também foi resistente à infecção. No entanto, como previamente descrito, este macaco, ao contrário dos controlos dos outros protocolos experimentais, recebeu testes repetidos na pele para a Tat para controlar a 99 especificidade do teste (Tabela 24), e detectaram-se anticorpos anti-Tat, apesar de em títulos baixos (1:100), desde a semana 32 a contar do inicio da imunização (dados não mostrados). Além disso, a resposta proliferativa à Tat neste macaco revelou uma reactividade fraca e esporádica ao antigene (Tabela 20). Por fim, o macaco M3 revelou a presença de CTLs anti-Tat específicas (Tabela 21) . Apesar de serem preliminares, estes dados indicam que as injecções i.d. repetidas de 6 μς de Tat poderão imunizar o animal e proteger da provocação. Assim, o macaco M3 será considerado vacinado i.d. com a proteína Tat e estudado como tal. 100 1 Η ίΖί Ο ϋ ν > 33 Τ- tf) & β Μ 1_ Η os ϊη I Η ϋ > os ?·\ Γ-Ε ϋ Η _; ϋ: *Ι> Ρ Β ί\ Ζ Η υ U © οι a =< -Η -¾. CJ £ a Β 33 Τ7 7” a ο,ο 1 ~ç. Ο ο ·\ SP y 'y V &Η i_L '.£ι σι Η Ο Ο ο CO ο u > k>·! > & β Η — τ- Λ Η Μ tfi Η OS tfi Β I Η υ υ > os σ> _ _ 0 Η 22 'i □ U Β tf) ζ ζθ5 Η υ ΓΓ' Ln U os ϋ 0 ν\' 01 > 0 a Η - φ μ υ S α σ: Τ7 7Γ “ a a «,□ ϋ 1 ϋ η -Ο & Γλ _ 01 b © í^S Ο os d 03 ί£> V Η r\ i-i- ΰ ο hH P > ο ο CG & β Η τ— τ- 0 Η 0S til υ 'Μ tn | "0 •Η υ ί > os _ 0 0 •Η 5’ Ρ Β ap ζ '0 •Η (U -S υ U CG 0 01 (C <ϋ ιΐ CJ -3] Η ^ £ a çs »3 - V Μ Hj a ο -ϋ υ - a CG h·-- Ç. ts< CS £3 0 J Γ'·· \ .· α U CG ο 0 ,ΓΗ υ •"Η (S "Ό □ Η os ίτ; Ε 101 101 O macaco Ml tinha sido imunizado i.d. com 200 μς de pCVTat, o macaco M2 com 500 μς de pCVTat, i.m. O macaco M3 foi injectado várias vezes com 6 pg de proteína Tat, intradermicamente, para controlar a especificidade dos testes na pele. Em consequência, a partir do instante da provocação, o macaco M3 é considerado um macaco vacinado. Avaliaram-se os parâmetros virológicos como descrito na legenda da Tabela 17. A avaliação por FACS da percentagem e do número absoluto dos linfócitos CD4 e CD8 confirmou os dados virológicos, com uma redução clara (de aproximadamente 4 vezes) dos linfócitos CD4 no macaco infectado, logo na primeira análise pós-provocação (dia 30) e confirmada posteriormente (dia 60) (Tabela 26). 102 03 8 U τν 8 ώ 0 4J £ 0 υ 3 VI U α ΰ 5 υ & 'D σι CO > Η W ΙΩ 3 Η > □ Β ϋ U 0 ζο3 ϋ* ο3 υ □ > ϋ U a I η -ο a η 03 •Η G § 1 s5: £ ι—1 3 ι—1 -0J □ § + 3 ϋ 0.14 C5 S C-i I 1- ¢-5 11 si I 1 2 1 I ΙΛ © 1 0¾ Ο 1 )Τ; K ^ Β >—I 2 >—ι MU υ Β ο + □ ο ο <Τ5 Ο ττ ο si “· 1 S £ ^ ο §! J» :·-. 1 ^ β. + 1 ί ££ 50 1 τ ώ &' Γ*-· 'Ti u> !θ3 * S ι—1 3 ι—1 -OJ ϋ Ω Ζ d Ζ Ω Ζ § ο ο ζ Ω Ζ □ ζ I ζ Ζ 9 CS SL * Β >—ι 3 >—I '11 υ 1 1 § ΰ3 Ò ό I fv. θ' ο 8 τ- 02- ο τ w3 Ο ÍN ! 31 ^ £ ® £ 0 μ υ "Η 03 "Hj υ « m -1- £ ρ Η Έ Ζ 103 A análise foi efectuada como indicado na legenda da Tabela 18. 0 macaco Ml tinha sido imunizado i d. com 200 μς de DNA plasmídico pCVTat, 0 macaco M2 com 500 μς de DNA pCVTat, i.m. 0 macaco M3 foi vacinado intradermicamente com 6 μς de proteína Tat.
Com base nestes resultados concebeu-se uma segunda experiência na qual se avaliaram os efeitos da imunização com o DNA pCVTat em 3 macacos (M9-M11) , em comparação com o macaco de controlo (M12) que recebeu o DNA pCVO. Todos os animais foram inoculados i.m., em 2 sitios do dorso, com um total de 1 mg de pCVTat (M9-M11) ou de pCVO (M12) . Um ou 5 dias antes da vacinação, 250 pL de solução salina que continha 0,5 % de bupivacaina e 0,1 % de metilparabeno foram inoculados nos dois sitios marcados onde, sucessivamente, seria injectado o plasmideo. Os macacos foram vacinados no instante 0 e na semana 6, 11, 15, 21, 28 e 32. Administrou-se um reforço final na semana 36 com a proteína Tat recombinante (16 μg) novamente suspensa em 200 μΐ de ISCOM e 300 μΐ de PBS. Os animais foram controlados todos os dias quanto a parâmetros clínicos como descrito no Exemplo 4. Além disso, recolheram-se 10 mL de sangue 9 dias antes da imunização primária e em cada imunização, como descrito no Exemplo 4. Para avaliar os efeitos protectores da vacinação, os macacos foram provocados na semana 50 desde o início da imunização por injecção intravenosa (i.v.) de 10 MID50 de SHIV-89.6P. O seguimento pós-provocação ainda está a decorrer e é efectuado como descrito no Exemplo 4. 104
Os resultados desta experiência são os seguintes. Não se notaram modificações em termos do comportamento, parâmetros clínicos e química do sangue nos animais vacinados e nos de controlo. Não se detectaram sinais de inflamação ou neoformações vasculares nos sítios das injecções. Estes resultados confirmam que 1 mg do DNA plasmídico pCVTat, injectado i.m., foi bem tolerado e não foi tóxico. Detectou-se igG anti-Tat desde a semana 15 (Figura 13), com títulos que variaram desde 1:50 até 1:100 (dados não mostrados). Além disso, detectou-se num macaco (Mil) uma resposta proliferativa à Tat logo na semana 2 (Tabela 27).
Resposta proliferativa à Tata Macaco Estimulo Semanas após a imunização primária 2 6 11 15 21 28 32 36 40 44 50 8,9 9,2 17,1 58,2 18 47,1 43,4 3,1 72,6 64,6 7 M9 2,9 1,7 0,9 1 1,8 0,7 1,1 0,8 1 7 2,7 0,4 0,5 0,5 1,5 1,6 0,9 1 0,7 1,1 7 1,9 M10 TABELA 27
Resposta proliferativa à Tata Hacaco Estímulo Semanas desde a imunização primária 6 11 15 21 2-3 32 38 40 44 50 M9 PHA 8.0 9.2 17.1 58.2 IS 47.1 43.4 3.1 72.6 64.6 7 TT .2.0 1.7 fj.Q 1 1.8 0,7 1.1 os 1 7 Λ *7 i. 4 Tat 0.4 0.5 '16 1.5 1.5 0,9 1 0.7 1.1 7 1.9 PHA 8.5 18 19.8 ND 10.1 2.2 14.7 15.2 4.4 8.4 ND TT 2.4 0.3 0.8 ND 1.1 0,6 1 0.9 o_e 6.4 ND Tat 1 0,3 0.7 ND 1.1 0.5 1 O.S 0.7 4.2 ND 1411 SI II l/A 2S.7 43.3 12.1 27 3.4 21.3 14.1 15.9 25.8 ND TT 4.2 1.9 1.3 0.9 1.1 3.5 1.2 0.8 0.3 ts ND Tat 5.1 0.8 1.6 0.7 1.1 1.1 1.2 0.7 0.7 3 ND M12 PHA 2S.7 30,9 41 50.7 30,8 f .6 43 22,5 34,6 18.9 55.1 TT O i.e 0.9 5.2 1.5 1.5 f.3 1.1 1 0.7 3.1 Tat n 1.4 0.8 1.3 1 1.6 f 0.8 1 1.6 1.3 105 105 a PBMCs foram isoladas, estimuladas com PHA (4 μς/mL) ou toxóide tetânico (TT, 10 μg/mL) ou Tat (1 e 5 μς/mL) e foram avaliadas como descrito na Tabela 5. Os macacos foram injectados i.m. com 1 mg de pCVTat (M9-M11) ou pCVO (M12, controlo) . ND, não determinado.
Detectaram-se CTLs anti-Tat na semana 32 pós-imunização (Tabela 28). TABELA 28
Análise da actividade citotÓKica anti- -Tat (CTLs jd Macaco Semana Razão Alvo:Efector Actividade de CTLs 1:50 1:25 1:12.5 1:6r£5 1:3.125 Heio 32 tj 0 0 0 0 0 50 4,2 0 0 0 0.0 1 * Μ1Θ 32 tj 0 ci,y 9 7 0 2.5 - 50 3,5 0 ».*, Λ, 0 O 11 - M11 5") HL· 0 10,5 5,9 3.5 Qg 4.7 + 50 0 0 0 3,8 0,3 0,6 - M12 7>1 0 tj 0 0 0 0 - 50 0 0 0 0 u 0 - 3 0 ensaio foi realizado como descrito na Tabela 6. Os macacos foram injectados i.m. com 1 mg de pCVTat (M9-M11) ou pCVO (Ml2, controlo).
As PBMCs obtidas do macaco Mil na semana 44 foram resistentes a infecção in vitro com diluições em série do virus SHIV-89.6P quimérico num ensaio descrito previamente que detecta a presença de actividade antiviral total (TAA). De facto, avalia-se a TAA como a capacidade de PBMCs de macacos vacinados com DNA pCVTat, que cresceram na presença de soro autólogo, para resistir à infecção com diluições em série do virus (Tabela 29). 106 TABELA 29
Análise da actividade antiviral total (TAA) Macaco Dias pós- -infecção 7 17 Dose infecciosa mínima Dose infecciosa mínima (TCID50/célula) (TCID50/célula) M9 10"3 > IO"3** M10 IO'3 10“3 Mil > 10~3‘ > 10"2* Ml 2 W2 > 10~3** a O ensaio foi realizado como descrito na Tabela 13. Os macacos foram injectados i.m. com 1 mg de pCVTat (M9-M11) ou pCVO (Ml2, controlo) . As PBMCs foram recolhidas na semana 44 desde a primeira imunização e foram infectadas in vitro com 10~2, 10~3 , 10~4, 10~5 TCID50 de SHIV-89.6P. Os resultados estão expressos como dose infecciosa mínima do SHIV (TCID5o/célula) ainda capaz de infectar as células. Nenhuma cultura ficou infectada à concentração mais elevada de SHIV utilizada no ensaio (10~2 TCID50/célula) . As culturas tornaram-se negativas no dia 17 pós-infecção.
Os resultados apresentados na Tabela 30 demonstram a presença da actividade antiviral solúvel (CAF) mediada pelos linfócitos T CD8+ nos macacos vacinados e no macaco de controlo (M12) injectado com o vector vazio (pCVO). 107 TABELA 30
Análise da actividade antiviral solúvel (CAF) mediada pelos linfócitos T CD8+ (CAF) a Macaco Semanas desde a imunização primária % de inibição da replicação virai Infecção aguda Infecção crónica M9 0 21 14,6 36 77 2,6 M10 0 40 13,8 36 67 25 Mil 0 49 19 36 42 14 M12 0 65 23 36 62 14 a Análise da presença da actividade antiviral solúvel mediada pelos linfócitos T CD8+ (CAF) . As PBMCs foram obtidas de três macacos (M9-M11) injectados com 1 mg de pCVTat e do macaco de controlo (M12) inoculado com 1 mg de pCVO. 0 ensaio de infecção aguda foi realizado em células CEMxl74 infectadas com o SHIV-89.6P, como descrito na Tabela 14. 0 ensaio de infecção crónica foi realizado em células UI cronicamente infectadas com o HIV-1, como descrito na Tabela 14. Os resultados estão expressos em percentagem ( %) de inibição da replicação virai em células cultivadas na presença ou na ausência (controlo) de 5 μΒ de sobrenadantes de células T CD8+.
Avaliou-se a produção de citoquinas (ylFN, IL-4, TNFa) e da quimioquina RANTES na semana 44 em PBMCs dos macacos vacinados e de controlo (Tabela 31). 108
109 a O ensaio foi realizado como descrito na Tabela 15. Os macacos foram injectados i.m. com 1 mg de PCVTat (M9-M11) ou pCVO (Ml2, controlo) . Recolheram-se PBMCs na semana 44 após a primeira imunização. Os resultados estão apresentados em pg/mL de citoquinas e RANTES detectados às 48 e 96 horas (48/96), respectivamente. (-), os valores foram inferiores ao valor limite. Os valores limite (pg/mL) foram: ylFN: 31,2; IL-4: 3,12; TNF-a: 15,6; RANTES: 62,5. ND: não realizado.
Os resultados mostram a presença de reactividade fraca aos testes na pele com Tat num macaco (M9) na semana 11 (Tabela 32) .
Os resultados mostram a presença de reactividade fraca aos testes na pele com Tat num macaco (M9) na semana 11 (Tabela 32). TABELA 32
Teste na pele para a Tat a Semanas desde a imunização primária Macaco 11 15 21 28 32 36 44 M9 +/- - - - - - ~ M10 - - - - - - - Mil - - - - - - - M12 ND ND ND ND ND ND ND a Tat (1 e 5 //g) em 150 μΕ de PBS- -A, BSA 0,1 % OU 0 tampão isoladamente (controlo) foi inoculada i .d. numa área previamente tricotomizada do dorso superior dos animais vacinados, mas não nos macacos de controlo, nas semanas 11, 15, 21, 28, 32, 36 e 44 desde 3 imunização inicial. Os 110 110 macacos foram injectados i.m. com 1 mg de pCVTat (M9-M11) ou pCVO (M12, controlo) . O aparecimento, 48 até 12 horas depois, de um nódulo eritematoso indicou a presença de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH): ++, 0^5 mm; +, 0 1 - 4 mm; ±, eritema sem endurecimento; -, 0 < 1 mm.
Os resultados pós-provocação indicam que todos os animais vacinados ficaram protegidos da infecção com 10 MID50 do SHIV-89.6P, como indicado pelos testes virológicos (antigenemia no plasma, determinação do número de cópias do DNA pró-viral, citoviremia), que foram todos negativos (Tabela 33) . Além disso, a presença de anticorpos anti-SIV no macaco Mil indicou exposição ao vírus ou uma infecção abortiva. Pelo contrário, não foram detectados nos restantes macacos e, assim, decidimos realizar o ensaio de produção de anticorpos in vitro (IVAP) e a resposta proliferativa a antigenes do SIV. Estes ensaios estão a decorrer; dados preliminares indicam a presença de anticorpos anti-Env do HIV em todos os macacos inoculados com o DNA. Os macacos serão inoculados com uma dose mais elevada do vírus, uma vez que mesmo o animal de controlo M12 foi resistente à infecção. Este macaco tinha sido vacinado com o vector vazio pCVO. Dados recentes da literatura demonstraram o papel adjuvante desempenhado por certas sequências de DNA que são muito mais frequentes em bactérias do que em células eucarióticas e que, de modo semelhante a LPS e manose, representam um estímulo forte para a imunidade natural (Ref. 179) . Assim, é concebível que a protecção observada no macaco M12 possa dever-se à indução de uma imunidade antiviral inespecífica por estas sequências bacterianas, como a produção de IFNa, IFNp, IL-12 e IL-18, que se sabe exercerem funções imunomoduladoras e antivirais. Isto é fortemente sugerido pela presença, 111 neste macaco, das actividades antivirais TAA (Tabela 29) e CAF (Tabela 30) na ausência de imunidade humoral e celular especifica anti-Tat. De facto, estes ensaios também medem actividades antivirais não especificas para antigenes. O macaco não manipulado M13, inoculado com uma dose do virus 3,5 vezes mais baixa do que a injectada no macaco M12, ficou infectado. Estes resultados confirmam que a dose de provocação de 10 MID50 que foi inoculada no macaco Ml2 foi infecciosa (Tabela 33) . Com base neste resultado, o inventor planeia utilizar o vector pCVO, ou partes deste, como adjuvante. 112
Análise dos parâmetros virológicos Hl Ch CO > H E CO 01 u SH > Q g 0 D 0 να 0 cd u 0 > 0 Li a 1 oi SQ a 01 Hl •H Q 60 -H íiJ -P > ín fi H Η β ÍQ rm _di rrri íb ,s !TTi ,s ro íí> 1 H > «D 0 -r| P £ -H m U H CTi d) cn ,0,- cn ,aj ,5? O Dl Hl oí C -η -a-u 5 aj pj Q \0 ^ υ - V u u V CO f·- E C\l xa.- £3 v n H 0 -μ > bi a H H od m TC Γ75 _TC <N Γ7ί o 1 H > Hl 0 -rl p £ -H m u n jjS'' _φ G 2 01 pí < .5 — ft Q ,o -t ϋ V V TJ V 1- f·' É cL'& íd o lN L\Í ín O lN t-D -ηβ 0 -P > tn C H Η β 31 _TC Γ55 jU TnI M Q 22 1 H U > Hl 0 -H -p g -H 0) u U Γ™Γι TC “71 _TC Ç5> _TC 01 + 01 d Ph ^ -r| u s a a q '•o d. u V - - τ + ra "£ t>> e c\| rfj >ãi C;-l V »rj C\J (•LO r-·· :i2. 0 Ό Hl Ό Hl E tf? o - :a ít; 113 113 a'b'c'd õs ensaios foram realizados como descrito na Tabela 17. Os macacos foram injectados i.m. com 1 mg de pCVTat (M9-M11) ou pCVO (M12, controlo) . 0 macaco M13 era um animal não manipulado infectado com 2,85 MID50 de SHIV89.6P. e Efectuou-se isolamento virai em vez de citoviremia, e deu positivo. f PCR de DNA não foi quantitativo e deu positivo. A análise FACS dos subconjuntos CD4 e CD8 (Tabela 34) confirmou os dados virológicos.
De facto, observou-se um decréscimo significativo da percentagem e número absoluto dos linfócitos CD4 aos 15 e 60 dias pós-provocação apenas para o macaco não manipulado M13, que ficou infectado, como indicado pelo resultado positivo da antigenemia no plasma, DNA pró-viral e isolamento do virus (Tabela 33) . 114 q 0 O H ílj C ST 1 a Tj B f) 11 +j 0 C! Tj ΐι E-h D E-h 0 3 a, oí D flj CQ S 0 ÍH IX -¾ 0 H 0 +J bi q h υ % 0 ’ΐ) « 0 O 0 s u 0 ΐ) 0 Cl υ u fel 0 0 1 £ Í0 u Ή 0 N 0 ΐ) q u 0 0 0 N "CJ u q nj 0 q -w 0 d u ΐι ΐ) 0 0 EI 0 Γη 0 +0 U u Ή Ή 0 0 V q q 0 £í Hj H 0 E EI "Ί 0 Ή "a 0 fl El q 0 o t> 0 q 0 υ Hj ÍJ a, a, q O υ EI nj 3 0 1 S 0 s e» Q: u 'fi" o ¢1 ó *í—j: 6 -fc £ Γ1: © Xf. (Λ u: 1¾ © <a 1-4 'g C; tu KO &, ÍD P> H £ tfi g g Ò 0 m 0* g ϋ Q > g Li a 1 ÍQ •;g Ps q d Ή p o ij v Aí Hi 3 Γ”ϊ íí + d D + pj 0,67 ££· o‘ kt> l=T >. O 4.0 O λ O +· «o D O ·-, 9 § ^ 'Ή rt B « p 9. p' i£ L __i '‘,rt': Γι SS>' Γ-4 }r-. π Φ C--Í VÊ 'o V4 + \c o o ‘H S O (Vl V-v1 'D £> Γ· <;.· n v\' q. s ^ st fN 0} 9 í'; fs g VA ,--s E. ί V* ’& : ^ & Ν£ί y + XO Cí £j> 4' SP í‘ $ CD ΓΛ- θ' a> r-v. o' 5> o' ÍE3 o' + $£< □ o Ό ί—1 .'Ό *Λ .rOj <q § -1 r\ í--. ^ S L q, eí a ::> Tf í'.' 14 -v s 1 ςι-1-ι + \f o v>-;. r- ι s— qg S £ '-, 9 co q μ çs & S l—1 τΓ cn ^ v& 1 v ° ’ν l—Ϊ >j r-í '"fi }'£ + O O ΐ '"t o o D: “0· D Q O V.J* + £0 SP o Lj Q D ‘v>>‘ D Ό cn φ C-ι .¾ + *$ íjí Q Q C1*^ Q Viv .'X·, L_í 'f 00 0'·ϊ fT, ['“S v* & Aí »x H sfi5 t? ê Li 4 O K L.C< CD ί—1 1 1 ir> o> □ ϊ\· ^£> o' l—1 0 1 1 4 àO D O q 9 £i fj 0Ί Q ; cn [-. O ΝϊΛ' Q iD ") Os 4.0 + ^ι- ο o ^ o ^ V Γ-l ^ ‘Λ S' oT cn o ιχί. 8 Cl '£r o· 9 o '.q ^ i 0 0 «j Ό m £ 1 o f'íx ώ. sq* Mwl í'4 r>0 X" 115
Estes resultados demonstram que a vacinação com o plasmídeo pCVTat foi bem tolerada e não foi tóxica e confirmam os resultados respeitantes à segurança e tolerabilidade da vacinação com DNA, obtidos no primeiro estudo piloto. Adicionalmente, estes dados fornecem evidências de que o plasmídeo de DNA pCVTat induz uma resposta imunológica específica humoral (se bem que mais fraca do que a induzida pela proteína Tat) e celular com efeitos antivirais, parte dos quais se pode dever a sequências de DNA particulares presentes no vector pCVO que podem funcionar como adjuvantes. Serão avaliados protocolos de imunização que incluirão combinações do DNA que codifica para outros genes do HIV-1 e de citoquinas descritos no Exemplo 3. Nestas experiências utilizar-se-á SHIV contendo os genes tat, rev e nef do HIV (Ref. 146, 85, 142, 65, 94, 129).
Os plasmídeos pCVO e pCVTat serão inoculados nos animais utilizando outros sistemas de distribuição que poderão melhorar a eficácia da imunização, como lipossomas, nanopartículas, eritrócitos, distribuição com canhão de genes, ou DNA da Tat será distribuído utilizando vectores de herpes, como descrito nos Exemplos de previsão 9 e 10.
Exemplo 6. Vacina terapêutica
Concebeu-se um protocolo de vacinação, baseado na proteína Tat e DNA da Tat, para avaliar a segurança e toxicidade de uma vacina anti-Tat em indivíduos já infectados. A experiência foi realizada em macacos infectados com doses decrescentes de SHIV89.6P e com doença de imunodeficiência (SIDA). O lote virai utilizado para a infecção foi obtido do baço e nodos linfáticos de um macaco cynomolgus infectado 14 dias antes. Os linfócitos, purificados por separação mecânica, foram divididos em duas alíquotas (1,5 x 106 células/mL cada). Uma alíquota foi 116 depletada de células T CD8+ utilizando esférulas imunomagnéticas (Dynal, Noruega). Ambas as culturas foram estimuladas com PHA (1 μg/mL) durante três dias e foram semeadas à concentração de 1 x 106 células/mL na presença de 50 U/mL de IL-2. Detectou-se a replicação virai pela presença de transcriptase reversa (RT) no meio de cultura recolhido passados três dias. Antes da realização do teste, o sobrenadante foi clarificado e ultracentrifugado a 100 000 rpm, durante 11 minutos a +4 °C (aparelho de ultracentrifugação Beckman TL-100), e o grânulo foi submetido a lise. Adicionaram-se 30 μΤ da suspensão à mistura reaccional (TRIS HC1 1 M, pH 8; MgCl2, 0,5 M; KC1, 1 M; Poli A 1 mg/mL; oligo-dT 12-18 100 μς/πΟ,; DTT 0,02 M; Trifosfato de 1,2-3[H]-metil-timidina 1 mCi/mL) e incubou-se o sistema a 37 °C durante 60 minutos. A reacção foi terminada por adição de 500 μΙ, de Pirofosfato de Na 0,1 M pH 5 e 600 μΐϋ de ácido tricloroacético (TCA) 20 %, e a amostra foi colocada num filtro de 0,45 μιη (Millipore) e depois foi lida com um contador β após a adição de 5 mL de "cocktail" de cintilações (Filter Count, Packard).
Os meios de cultura que continham mais de 20 000 cpm foram centrifugados e suplementados com soro humano AB 10 %. O vírus foi concentrado por ultracentrifugação a 30 000 rpm (90 minutos a 4 °C), foi novamente suspenso em RPMI 1640 contendo 10 % de soro humano (grupo AB) e depois foi armazenado em pequenas alíquotas em azoto líquido. O lote virai foi titulado in vitro nas linhas de células humanas CEMxl74 e C8166 (3 x 103 TCID50/célula) e in vivo em macacos cynomolgus (3,17 x 105'69 MID50/mL) . 117
Realizou-se uma primeira experiência-piloto em 7 macacos infectados i.v. com SHIV89.6P, preparado como descrito acima. Cada macaco recebeu 1 mL de SHIV diluído em tampão salino suplementado com 2 % de soro humano (AB, Rh-) de acordo com o protocolo seguinte. Um macaco (IM1) foi inoculado com 1:500 de diluição virai; dois macacos (IM2, IM3) receberam a diluição 1:5 000; dois macacos (IM4, IM5) foram inoculados com 1:50 000; o macaco IM6 recebeu a diluição 1:500 000; o último macaco (IM7) recebeu a diluição 1:5 000 000. Cada macaco foi sangrado no dia 7 antes da infecção com SHIV, para a determinação dos parâmetros basais. Amostras do soro e do plasma foram congeladas a -20 °C ou -80 °C e depois foram utilizadas para suspender novamente a inoculação da proteína. No instante 0, todos os macacos foram inoculados com SHIV89.6P. Os macacos foram verificados diariamente. Além disso, no dia 0 e após 2 e 4 semanas, foram sangrados e utilizaram-se 10 mL de sangue para determinações hemato-químicas (análise química-clínica, electrólitos, glóbulos brancos e contagens de plaquetas, hemoglobina) e análise virológica e imunológica (isto é, determinação de Ag p27 no plasma e carga virai no plasma e células). Na semana 4 pós-infecção, 6 macacos (IMl-6) ficaram infectados. O macaco IM7, que recebeu a diluição virai mais baixa (1:5 000 000), foi negativo para o SHIV (Tabela 35). 118 118 TABELA 35 Detecção da presença do SHIV89.6P em macacos infectados com diluições virais em série Macaco Diluição do SHIV 89.6P Semanas pós-infecção 0 2 4 Isolamento viraia p27 (pg/ml)l> Isolamento virai p27 (pg/ml>b Isolamento virai p27 fpg/mt)b llvfl 1:500 ND MD + >450 4 47 IMS 1:5.000 ND MD + >4S0 4 151.8 IM3 1::5.000 ND MD + >450 4 6.67 \m 1:50.000 ND MD + <20 4 >450 IMS 1:: 50.000 ND MD + >450 4 160.7 IM6 1:500.000 MD MD + >45% 4 0 IM7 1::5.000.0-00 MD MD 0 - 0 Ί 0 isolamento dõ vírus ê Έ Ag p27 no plasma (pg/mL) foram realizados como descrito na legenda da Tabela 17. Os macacos foram inoculados i.v. com diluições em série do lote do vírus, como descrito no texto.
Após 7 semanas da infecção, todos os animais que exibiram sintomas graves de imunodeficiência foram vacinados com a proteína Tat e DNA do plasmídeo pCVTat de acordo com o protocolo seguinte. Os macacos IM1, IM3, IMS e IM6 receberam a proteína Tat (20 μρ), dissolvida em 250 μΙ* de PBS-A suplementado com BSA 0,1 % e 20 % de plasma autólogo e depois adicionada a 250 μ!3 de adjuvante Alum. A inoculação da proteína foi efectuada subcutaneamente num único sítio do dorso superior dos macacos, ao passo que o plasmídeo pCVTat (1 mg), novamente suspenso em 1 mL de PBS-A, foi injectado i.m. num sítio diferente do dorso. Os macacos IM2 e IM4 (controlos) foram injectados com 250 μΐ de Alum e 250 μΐ de PBS-A, BSA 0,1 %, plasma autólogo 20 %, s.c., num sítio do dorso superior, e com pCV-0 (1 mg) novamente suspenso em 1 mL de PBS-A, i.m., num sítio do dorso superior diferente do anterior. O macaco não infectado IM7 não foi vacinado. A calendarização da 119 vacinação consistiu no instante 0, correspondente a 7 semanas após infecção com o SHIV, e 1, 4, 5, 10, 11, 13, 14, 17, 18 semanas seguintes. Para avaliar os efeitos desta vacinação na progressão da doença, cada macaco foi verificado diariamente quanto à presença ou sinais da doença, e no instante 0 e após 3, 8, 12, 16 e 21 semanas recolheram-se 10 mL de sangue para a realização de testes laboratoriais (análise quimica-clinica, electrólitos, glóbulos brancos e contagens de plaquetas, hemoglobina), com a finalidade de avaliar o estado imunológico (presença de imunoglobulinas especificas, medição de citoquinas Thl e Th2, produção de quimioquinas), para a caracterização de linfócitos por análise FACS (CD4, CD8, CD28, CD40, CD86, CD20, CD2, CD26 e CD20) e, por fim, para avaliar parâmetros virológicos (detecção de DNA pró-viral por PCR semi-quantitativa, carga virai no plasma por RT-PCR competitiva, antigene Gag p27 no plasma por ELISA e presença de Ab anti-SHIV, como previamente descrito) . Administrar-se-ão outros reforços com base nos resultados imunológicos, virológicos e clínicos.
Após a última inoculação, a monitorização será feita mensalmente e na altura do aparecimento de modificações clínicas. Amostras de PBMCs, soros, plasma e urina serão congeladas em cada instante para a realização de testes futuros, como previamente descrito.
Descrevem-se os resultados já disponíveis desta experiência, obtidos na semana 8 após a imunização. Nos macacos assintomáticos vacinados e de controlo não se observaram sinais de inflamação nem de neo-angiogénese nos sítios da inoculação nem sintomas gerais de doença. Não eram evidentes modificações do estado clínico nos macacos 120 já sintomáticos. Além disso, não se detectou nenhuma activação da replicação virai. Considerados em conjunto, estes resultados indicam ausência de toxicidade ou de replicação virai acrescida nos macacos vacinados com uma proteína Tat biologicamente activa ou DNA (Tabela 36). TABELA 36
Análise de parâmetros vlrológlcos Macaco Semanas desde o inicio da vacinação 0 O V1 8 p27 tpg/ml > PCR DNA Cópiasí^g p2í (pg/ml) PCR DNA Cópia síjACj p27 (pg/ml) PCR DNA Cópias/μίΐ liVJI 12.3 66 17.3 141 41 im 0 61 0 43 O 71 IMS 97.1 20 21.7 15 23.6 SS IM6 0 43 0 55 0 24 IM2 21.2 ND 3o. o £0 27.4 i § 11714 61 195 *7*3 283 15.4 135 IM7 ND ND ND ND 0 >1
Os testes foram realizados como descrito na Tabela 17. Os macacos IM1, IM3, IM5 e IM6 foram injectados com proteína Tat (20 μς) e adjuvante Alum s.c. e com pCVTat (1 mg) i.m. Os macacos IM2 e IM4 (controlos infectados) foram injectados com adjuvante Alum s.c. e pCVO (1 mg) i.m. O animal IM7 era um macaco não manipulado não infectado.
As análises FACS indicam que não se observaram modificações em linfócitos T CD4 + e CD8+ após a vacinação (Tabela 37). 121
Análise FACS de linfóeitos CD4+ e CD8 + □ ϊ> 0 ΰ ι-Ι υ cd > cd 73 0 H u ->-1 H □ 0 -d [fj 0 73 0 íd C cd £ 0 U2 1¾ cd i—1 d I-1 X0 υ CD4.CD8 íf? b." □ [·»“! O □ O θ' 7$ o'- Tf O o'- m 0 o" 03 ½ o" co Ω o T- /*Λ I W-' ty> >Λ ^ ^i 73. N 'νϊ >" crç 0' ^ w iv :¾ •o ly ^ ÉO Γ--1 <s> •O T-x i£ Çt'l 1—Γ *N Q "7. GS Cl h' Ό Cbl C© cu' 0 >* v-l ^ a Q -½ Jí; cn ' íO ---- 2- á £ ® f-í' & m CN b S SS’ 1—1 bí,-' ΟΊ ^ l£i <Tl T- <e 2 1 CO 0 0 i—1 3 l—1 ^0 υ -_j 9?; LJ y ác í- .l o a o' o' tfl q □ on wl Q on O o" Cft o" □ O Tf « 55 on τ* 'O r- vi2· όΛ 00 >Λ Φ K" íí £ Ί" S"; iOA Cvl vo q, c 0 ^r. ΟΠ [--. |sí'| Ό -tsl ,’v'< ® " í. rvj ° s D k" Ί- fc.fj >0) •O /£,. ^r Q O 8 í? r. ÍN v—' i\l qj r. C\* Xl — 0. · ·;Ρ Γ· Tyf ÍN ---.1 ^ S* Γ'“Ρ r'! Γ--1 K· ·ϋ“ p. <N ÍN t— ÍN ST' S! i-í í£> ví-(\j p d R fs| ' Cl ¢0 Ω τΐ Ω ϋ L£> 0' í<7· 0 0' '.J' θ' l;.j"i o" q or' o" □ 0 (d H “a 0.? u^- rt·:· + 00 Ω V.N»' <£> rç ^ èi Ό t*" í'i « l J oj 00' k* w~-, q ís?' Pi 2 £í-> til - ^-J 13 s. í!-:l q T” ,;.·-) κΓ ^ « í© M) rO □ Z + 3f ί-ϊ-Ι o rS*. *“ ' fs cn 1“ ^ τΐ'1 ®i K ÍN --- cí 'M ÍN C-j yjjj π Ί* Oj ÍN '·— c-i q·· r-í q. Ω 0 t! d μ c H Ω <') .¾. ’ΓΤ Ω ;5> ÍJL> θ' cn r-~ o‘ <N Ί Ο' O o'- ?NJ 1 1 0 11 η-ϊ· or‘ 0 íd i—1 0 ^ u- rto + o o CO .v% $ '£ v—.·' ιΛ -¾ sO ^ Γ--1 33 Ί- O ° 1X1 ;.2 >Λ C·· b. ^ - l! ^ Tf ίΊ >1 tiíí n r > cg [-: CN ^.. b £ ^1 oh ^ ¢. ·+ 2 ® Tf-* 0^5 .£. v\ í\| fl >“ <r> — N g Cl· $J 1—1 V.v' í-.o r·' q. ÇO (.!-< Γ-l ^ (£ -fi" rr &, i S fC' CNJ 'oVj h> 65s l· - cd θ' ».Q cn Γ--Ι --- r% T-1“p. f-v t q.. 0 υ <d D 0 S í© w Φ OJ <V7 1 K. 122
Realizou-se análise FACS como descrito na legenda da Tabela 18. Os macacos IM1, IM3 , IM5 e IM6 foram injectados com proteína Tat (20 μg) e adjuvante Alum 3.c. e com pCVTat (1 mg) i. m. Os macacos IM2 e IM4 (controlos infectados) foram injectados com adjuvante Alum s.c. e pCVO (1 mg) i.m. 0 animal IM7 era um macaco não manipulado não infectado.
Estes dados confirmam que a proteína Tat e o plasmídeo pCVTat, às doses e vias de inoculação utilizadas, foram bem tolerados e não tiveram qualquer efeito tóxico nos macacos vacinados e, além disso, não aumentaram a replicação virai nem o decréscimo de células T CD4 em animais infectados.
Exemplo 7. A co-estimulação de linfócitos CD4+ purificados, de macacos infectados com SIV, com esférulas revestidas anti-CD3/28 resulta em expansão logarítmica do número de células sem replicação nem transmissão virais significativas Células mononucleares do sangue periférico foram depletadas da população de células CD8+ utilizando esférulas imunomagnéticas anti-CD8 (Dynal, Oslo; Dynabeads M-450 CD8). Avaliou-se o grau de purificação por análise FACS; foi considerado aceitável quando superior a 95 %. As células depletadas de CD8 (denominadas PBMCs CD8-) cresceram na presença de PHA (2 μρ/ηΛ) e IL-2 (40 U/mL) ou esférulas imunomagnéticas previamente revestidas com dois anticorpos monoclonais contra os antigenes CD3 (Clone FN18, BioSource) e o CD28 (Clone 9.3) (esférulas anti-CD3/28). Para melhorar a ligação das esférulas anti-CD3/28 às células-alvo, a incubação foi realizada num rotor. Em 123 seguida, as células ligadas (denominadas CD8-CD3+CD28+) foram seleccionadas com um iman e semeadas em cultura. Três vezes por semana, ajustaram-se as concentrações celulares ao nivel de partida e adicionou-se IL-2 quando indicado; além disso, relativamente às células estimuladas com esférulas anti-CD3/28, resultados preliminares sugerem que o regime de estimulação continua acoplado a um controlo constante da razão célula:esférula, ajustada em cada instante, é altamente eficaz na indução da resposta proliferativa. Os nossos estudos prévios mostraram que, na ausência de IL-2 exógena, a população de células CD8-CD3+CD28+ prolifera melhor do que PBMCs CD8- estimuladas com esférulas anti-CD3/28. Além disso, a adição de IL-2 exógena (40 U/mL, três vezes por semana) aumenta significativamente a cinética da proliferação, em termos do número de células e duração do efeito (Figura 14) .
Para avaliar a actividade antiviral desta estimulação, células purificadas CD8-CD3+CD28+ de 4 macacos não infectados foram infectadas no dia 0 com 0,1 M.O.I. de SIV e depois foram cultivadas com estimulação continua. O controlo da experiência consistiu em PBMCs CD8- estimuladas com PHA e IL-2. Seguiu-se a infecçâo virai por detecçâo do antigene Gag p27 no sobrenadante da cultura por um ELISA comercial (Coufter, Hialeah, FL) . Mediram-se os níveis do antigene Gag p27 (ng/mL) no dia 6 e 12 após a infecçâo. Como mostrado na Figura 15, há uma diferença significativa na infecçâo com os dois regimes de estimulação. De facto, no dia 6 após a infecçâo, o antigene p27 nas culturas estimuladas com esférulas para CD3/28 foi 40 % até 87 % mais baixo do que em culturas estimuladas com PHA mais IL-2, e no dia 12 esta diferença aumentou em 2 de 4 macacos. Isto sugere uma redução da susceptibilidade à infecçâo 124 virai. Só num caso (MK 9401) é que observámos uma propagação virai em ambos os regimes de estimulação.
Os resultados descritos aqui demonstram que Macaca fascicularis é um bom modelo para a expansão ex vivo de subpopulações de linfócitos por co-estimulação com esférulas anti-CD3/28, sem replicação virai. Isto representa a base fundamentada para a vacina terapêutica que propomos, com base na expansão e nova infusão de linfócitos autólogos específicos anti-virais em indivíduos infectados com o HIV.
Exemplo 8. Utilização de células dendríticas para vacinação (não reivindicado)
As células dendríticas (DC) e macrófagos, em menor extensão, são capazes de apresentar eficazmente antigenes aos linfócitos T e induzir, neste subconjunto de células, proliferação ou aquisição de actividades citotóxicas específicas. Estas células são denominadas "células apresentadoras de antigenes" (APCs) e podem iniciar a resposta imunológica. Assim, podem utilizar-se DCs em protocolos de imunização ex vivo. Por este motivo isolaram-se precursores de DCs do sangue periférico de Macaca fascicularis, por cultura in vitro de células aderentes após sete dias de estimulação com GM-CSF e IL -2. Alternativamente, células CD34 + foram purificadas com esférulas imunomagnéticas e depois cultivadas in vitro com GM-CSF e TNF-a durante 14 dias. Para confirmar 0 isolamento das DCs realizou-se análise morfológica e caracterização fenotípica (análise FACS e imuno-histoquímica). A análise funcional baseou-se na capacidade 125 única das DCs para induzirem proliferação de linfócitos alogeneicos.
Os resultados obtidos confirmam totalmente a eficácia da purificação e a caracterização funcional de DCs. Em pormenor, para isolar precursores de DCs, PBMCs, obtidas por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll, foram novamente estratificadas em gradiente descontinuo de Percoll (50 % e 42,5 %) . Após centrifugação a 500 g durante 30 minutos, a fracção celular situada entre os dois gradientes era maioritariamente constituída por monócitos (como confirmado por análise FACS, dados não mostrados). Estas células foram mantidas a 4 °C, para evitar a adesão das células aos tubos de plástico, depois foram recolhidas, lavadas, contadas e semeadas em cultura a 37 °C. No dia seguinte, as células não aderentes foram removidas por lavagem com 4 lavagens suaves. Para induzir diferenciação em DCs adicionou-se às células aderentes um meio completo suplementado com GM-CSF (200 ng/mL, Leucomax, Sandoz, Milão, Itália) e IL-4 (200 U/mL, Pepro tech, Londres, Inglaterra). Como controlo adicionou-se um meio completo sem citoquinas, para induzir a diferenciação normal de monócitos na linhagem de macrófagos. Duas vezes por semana, metade do sobrenadante foi substituído por meio fresco idêntico ao utilizado no dia 0. Detectou-se a maturação de DCs nas cavidades tratadas com citoquinas por alterações morfológicas típicas, como agregação, perda de aderência e desenvolvimento de apófises celulares. As células aderentes monócitos/macrófagos que cresceram sem citoquinas foram separadas por tratamento com EDTA (0,5 mM em PBS-A), foram lavadas duas vezes, contadas e novamente suspensas em meio fresco a diferentes concentrações, dependendo da experiência realizada. Para as reacções de leucócitos 126 misturados alogeneicos (AMLR), testaram-se as APCs obtidas (DCs ou macrófagos) com uma quantidade fixa de linfócitos T alogeneicos, purificados por gradientes de Ficoll e Percoll e adesão, e depois foram congeladas. A AMLR foi realizada em placas de 48 cavidades com 0,5 x 106 linfócitos T e diluições em série de APCs. No dia 4 da cultura, uma quantidade fixa da suspensão celular foi semeada numa placa de 96 cavidades em triplicado. Adicionou-se a cada cavidade 1 pCi de 3H-timidina e seguidamente incubou-se a placa a 37 °C durante 16 horas. No final da incubação mediu-se a quantidade de 3H-timidina incorporada pelas células com um contador β, tendo sido expressa em contagens por minuto (cpm) . Os resultados indicam que as DCs obtidas são APCs potentes, como demonstrado pela maior indução da proliferação em linfócitos humanos alogeneicos em comparação com a estimulação de macrófagos, e pela capacidade para induzir proliferação de linfócitos T em macacos a todas as concentrações utilizadas (Figura 16B) .
Para utilização em vacinação, DCs serão novamente suspensas, à concentração de 1 x 105 células/100 pL, em RPMI 1640 suplementado com 5 % de soro autólogo, tampão Hepes 10 mM, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina, 0,5 mg/mL de anfotericina Be 0,03 % de glutamina, e depois serão incubadas durante 2 horas a 37 °C na presença de proteína Tat ou péptidos da Tat ou combinação de Tat, Rev, Nef, Gag e/ou citoquinas. Em seguida, estas DCs tratadas serão inoculadas duas vezes ou mais, num período de 2 - 4 semanas desde a primeira injecção, intravenosamente. Alternativamente, DCs serão transduzidas com vectores que contêm o gene tat, isoladamente ou associados a outros 127 vectores mencionados acima, e depois serão injectadas intravenosamente.
Exemplo de previsão 9
Os imunogenes descritos serão utilizados para induzir e/ou potenciar uma resposta imunológica especifica ao nível das mucosas. Uma das abordagens baseia-se na utilização de bactérias (S. Gordonii e Lactobacillus) "manipuladas" para expressarem os antigenes virais mencionados acima. Estas bactérias colonizam as mucosas orais e vaginais de ratinhos e induzem uma resposta de anticorpos específica, local e sistémica, contra antigenes heterólogos expressos na superfície de bactérias recombinantes (Ref. 116, 104, 106, 121, 117, 139, 105, 107). Estas bactérias podem funcionar como vectores vivos de vacinas e têm a vantagem de causarem uma estimulação prolongada do sistema imunológico. Além disso, avaliaremos a possibilidade de co-expressar, na superfície bacteriana, antigenes virais e moléculas envolvidas na resposta imunológica, como a subunidade B da toxina sensível à temperatura de E. coli ou citoquinas. A preparação das estirpes recombinantes de S. Gordonii será efectuada como previamente descrito (Ref. 116). Em resumo, (i) integração cromossómica de moléculas de DNA recombinante; (ii) fusões de transcrição com promotores cromossómicos fortes; (iii) fusões de transcrição com o gene que codifica para a proteína M6, uma proteína de superfície de Streptococcus. As estirpes recombinantes de S. Gordonii serão utilizadas para colonizar a mucosa vaginal dos macacos. Foi demonstrado que as estirpes recombinantes de S. Gordonii que expressam a região V3 da gpl20 do HIV-1 e a proteína E7 do HPV-16 colonizam permanentemente a mucosa vaginal do ratinho após uma única inoculação, induzindo uma resposta de anticorpos específica 128 para antigenes local e sistémica. A resposta sistémica é predominantemente composta por anticorpos IgG2a, o que sugere uma resposta do tipo Thl (Ref. 105, 106). Seleccionaremos estirpes vaginais humanas de Lactobacillus, que são capazes de colonizar a mucosa vaginal dos macacos. Seguidamente utilizar-se-á um sistema genético já desenvolvido que permite expressar antigenes heterólogos na superfície de Lactobacillus (Rush, 1997) . Esta estratégia baseia-se na: (i) clonagem de fusões genéticas (gene emm6/heterólogo) em vectores de inserção que contêm homologias com o transposão conjugativo Tn916; (ii) transformação dos vectores em estirpes bacterianas que funcionam como hospedeiro intermediário (Bacillus Subtilis); (iii) mobilização conjugativa dos transposões recombinantes de B. subtilis para Lactobacillus. As estirpes recombinantes de Lactobacillus serão utilizadas para colonizar a mucosa vaginal dos macacos.
Obter-se-ão amostras vaginais utilizando filtros absorventes especiais (Ref. 38, 105, 106) . A colonização será avaliada plaqueando as amostras vaginais em placas selectivas e a expressão de antigenes do HIV in vivo será monitorizada por imunofluorescência em esfregaços vaginais (Ref. 105). Utilizando métodos já padronizados (Ref. 38), os esfregaços vaginais serão utilizados para i) teste de Papanicolau, no caso de vacinação vaginal; ii) presença nas células de antigenes da vacina; iii) caracterização fenotípica de células por análise citofluorométrica (CD1, CD2, CD4, CD5, CD8, CDllc, CD14, CD20, CD28, CD40, CD25, HLA-DR); iv) avaliação da produção de citoquinas (IL—2, IFNy, TNFa, IL-4, IL-10, IL-15, RT-PCR semi-quantitativa), determinação da presença de citoquinas e β-quimioquinas nos fluidos das mucosas, por ensaios Elisa; v) dosagem de 129 imunoglobulinas totais e específicas (IgA e IgG) nos fluidos das mucosas por Elisa [Di Fabio et al., Vaccine 15: 1 (1997)]. Um mês após a última inoculação do imunogene, os macacos serão infectados com o SHIV 89.6P intravenosamente ou pela via das mucosas, os macacos serão seguidos como descrito no Exemplo 4. Obter-se-ão amostras de sangue para realizar os exames laboratoriais de rotina, a avaliação de parâmetros imunológicos, humorais e celulares, como descrito no Exemplo 4. 0 inventor crê que este método pode ser utilizado com êxito para induzir imunização específica em macacos utilizando a via vaginal. Alternativamente, pode induzir-se imunidade ao nível das mucosas administrando os imunogenes proteicos, descritos acima, directamente pela via das mucosas na presença de adjuvantes, como a toxina sensível à temperatura de E. coli e a toxina da cólera, ou utilizando outros sistemas de distribuição bacterianos e não bacterianos, como citofectinas e lipossomas, ou por inoculação por outras vias que sejam capazes de induzir a resposta imunológica mais eficiente e protectora (Ref. 83, 81, 62) .
Além disso, o inventor crê que vectores de herpes recombinantes, que expressam as proteínas virais acima descritas, podem ser excelentes sistemas para induzir uma resposta imunológica eficaz ao nível das mucosas. Vectores virais recombinantes do vírus herpes simplex do tipo 1 (HSV-1) serão utilizados para expressar proteínas virais para induzir uma resposta sistémica (por imunização cutânea, i.d.) e ao nível das mucosas (pela via oral, vaginal ou nasal). Utilizar-se-ão vectores de herpes não patogénicos e não replicativos (Ref. 99) pela sua capacidade para incluírem grandes sequências exógenas sem interferirem na eficácia da infecção (Ref. 52, 64). Assim, 130 construir-se-ão vectores capazes de conter mais do que um gene do HIV (acessório, regulador e estrutural). A imunidade ao nivel das mucosas pode ser induzida com uma vacina oral, vaginal ou nasal. Os vectores de herpes podem ser utilizados nestas abordagens de vacinas, uma vez que o HSV-1 pode ser administrado directamente pela via mucosa (Ref. 176, 75). Os vírus recombinantes serão construídos utilizando um método em dois passos que facilita a inserção de sequências exógenas no genoma virai. O primeiro passo requer a inserção de uma cassete de expressão com um gene repórter (β-galactosidase, LacZ) clonado no sítio de restrição PacI, que não está presente no genoma do HSV-1, com flanqueamento pela sequência-alvo desejada do HSV-1, utilizando o procedimento comum para a recombinação homóloga para interromper o gene do HSV-1. Selecciona-se o vírus recombinante por formação de placas com um fenótipo azul utilizando "coloração com x-gal". A digestão do DNA virai com PacI liberta o gene marcador e gera dois fragmentos grandes de DNA virai que não são capazes de produzir partículas virais infecciosas. O segundo passo consiste numa co-transfecção do DNA virai, digerido com o mesmo plasmídeo utilizado para criar a deleção, em que o gene repórter é substituído pelo gene desejado. Os vírus recombinantes seerão identificados por selecção de placas com um fenótipo branco após "coloração com x-gal". Esta recombinação conduzirá à eliminação de sítios PacI, o que permite utilizar este método para inserir muitos genes em diferentes loci do genoma do HSV-1 (Ref. 74). Ao cruzar os diferentes vectores contendo os genes isolados poderemos ser capazes de criar todas as diferentes combinações genéticas. O vector que contém todos os genes desejados será isolado por rastreio com diferentes marcadores, fenótipos e crescimento selectivo em células competentes. 131
Serão criadas todas as combinações alternando transfecções de DNA e recombinações virais.
Serão construídos vectores que expressam os genes isolados tat, rev, nef ou gag utilizando, como vector básico, aquele que contém as mutações nos genes 4-/22-/27-/41, que é melhor para a baixa toxicidade e para a expressão forte do gene exógeno, em comparação com os outros vectores nãi replicativos do HSV-1. Utilizar-se-ão promotores constitutivos, tais como os do HCMV (promotor inicial imediato do citomegalovírus humano), ou ICPO lep (promotor inicial imediato de proteína celular infectada) e a LTR do vírus da Leucemia Murina de Moloney, para induzir a expressão dos genes acima mencionados. Serão construídos vectores do HSV-1 não replicativos que expressam proteínas do HIV em diferentes combinações. Produzir-se-ão estes vírus que contêm mais genes diferentes por cruzamento genético dos vectores que contêm os genes isolados descritos no ponto anterior. Serão criados vectores duplos, triplos e quádruplos. Os vectores serão inoculados nos macacos i.d. ou pela via das mucosas (oral, vaginal ou nasal), com atenção particular a este último tipo de administração (Ref. 176, 101, 102). A calendarização da vacinação consiste em múltiplas inoculações em diferentes instantes, que devem ser determinadas relativamente ao imunogene ou à combinação de imunogenes. Durante a imunização, os animais serão monitorizados para avaliar parâmetros hemato-químicos e imunológicos, como descrito no Exemplo 4. Com métodos já padronizados obter-se-ão amostras vaginais que serão estudadas como previamente descrito neste Exemplo. 132
Exemplo de previsão 10
Sistemas de distribuição A Tat (proteína e/ou DNA), isoladamente ou em combinação (como descrito acima), será inoculada utilizando novos sistemas de distribuição, como eritrócitos ou nanopartículas. O sistema de distribuição que envolve a utilização de eritrócitos baseia-se na possibilidade de distribuir o antigene ligado a eritrócitos autólogos. De facto, os eritrócitos, no final do seu tempo de vida (cerca de 120 dias em humanos), são removidos da circulação pelos macrófagos, que se sabe terem a função de células apresentadoras de antigenes profissionais. Esta propriedade pode ser utilizada para estratégias de vacinas. Assim, antigenes serão ligados aos eritrócitos com uma técnica particular (Ref. 95, 96) que permite a preservação das propriedades imunogénicas do antigene (Ref. 29, 30). Com este procedimento pode efectuar-se a biotinilação de eritrócitos na ausência de modificações significativas das suas propriedades e tempo de vida (Ref. 95) . A fagocitose de eritrócitos velhos por células de macrófagos iniciará uma resposta imunológica. A opsonização por anticorpos de eritrócitos contendo o antigene ajudará a remover o antigene da circulação. As principais vantagens desta metodologia são: 1) pequena quantidade de antigene necessária para induzir uma resposta imunológica humoral e celular, 2) imunização de duração prolongada devido à presença demonstrada de antigenes transportados pelos erotrócitos na periferia, 3) funções adjuvantes proporcionadas pelo próprio sistema. 133
De facto, foi mostrado em estudos animais que a administração de antigenes ligados à membrana de eritrócitos autólogos induz uma resposta imunológica semelhante ou mais elevada em comparação com a resposta imunológica obtida com o mesmo antigene administrado com adjuvante de Freund (Ref. 29). Estas propriedades são muito úteis para desenvolver uma vacina anti-HIV, em particular quando é necessário aumentar a imunogenicidade do antigene e a disponibilidade do antigene e quando é requerido um número pequeno de imunizações. Adicionalmente, esta estratégia pode ser utilizada quando não se incluem adjuvantes no protocolo de vacinação. De facto, foi mostrado no modelo de ratinho que antigenes administrados por eritrócitos autólogos induzem respostas imunológicas semelhantes ou mais elevadas em comparação com as obtidas com o mesmo antigene administrado com adjuvante de Freund, conhecido como sendo o adjuvante mais poderoso comercialmente disponível (Ref. 29), apesar de não estar aprovado para estudos em humanos devido aos importantes efeitos secundários. Assim, o efeito adjuvante de eritrócitos contendo a proteína Tat, isoladamente ou em combinação com outros imunogenes previamente descritos, será analisado em primatas não humanos. Serão efectuadas comparações entre estes dados e os obtidos com a administração da proteína Tat na presença de Alum, RIBI ou ISCOM. A utilização de nanopartículas poderá representar uma estratégia de distribuição adicional. As nanopartículas funcionais representam um sistema importante para o transporte e libertação de proteínas e DNA (Ref. 27, 172). As nanoesferas são partículas poliméricas coloidais de diferente composição química, com uma gama ampla de 134 diâmetros desde 10 até 1000 nm. É possível adsorver diferentes tipos de substâncias na superfície ou no interior das nanoesferas (oligonucleótidos, fármacos, proteínas, péptidos, DNA), que então são conduzidas para o citoplasma ou para o núcleo de células, onde são lentamente libertadas. Adicionalmente, é necessário distribuir uma pequena quantidade do imunogene, devido às características das nanoesferas. As nanopartículas são um bom sistema de distribuição especialmente para moléculas com fraca estabilidade no ambiente extracelular ou quando a distribuição é dirigida a uma célula-alvo específica. O inventor crê que se podem utilizar nanoesferas para distribuir os antigenes virais descritos acima. É possível preparar e caracterizar três tipos de nanoesferas concebidas para a distribuição e libertação controlada de DNA (nanoesferas do tipo 1 e 2) e proteínas (nanoesferas do tipo 3).
Para distribuir DNA estão disponíveis dois tipos de nanoesferas (nanoesferas do tipo 1 e 2). O primeiro tipo de nanoesferas (nanoesferas do tipo 1) tem uma estrutura em camadas tripla com uma camada externa de polioxietilenoglicol (PEG) . Relatos recentes baseados em estudos de sistemas "Stealth" (Ref. 180, 78) mostram que o PEG torna as nanoesferas invisíveis para células de Kupfer. Em contraste, a camada mais interna é constituída por monómeros com características tensioactivas, que contêm grupos de amónio quaternário que adsorvem reversivelmente o DNA por um mecanismo de permuta iónica, e um núcleo interno constituído por monómeros de metacrilato de metilo. Estas nanoesferas são obtidas por polimerização em microemulsão, que envolve a polimerização de um monómero de vinilo ou 135 vinilideno na presença de uma mistura de reagentes tensioactivos. Assim, estes reagentes são capazes de polimerizar o monómero. Destes, um tem um grupo de amónio quaternário que interage com oligonucleótidos e o outro tem uma cadeia longa de PEG. 0 segundo tipo de sistema de distribuição de DNA é constituído por nano- e microesferas funcionais (nanoesferas do tipo 2) com características de hidrogel. Estas nanoesferas devem ser preparadas na presença de DNA, para encerrá-lo dentro do sistema de distribuição. São necessárias nanoesferas encapsuladas para distribuir proteínas (nanoesferas do tipo 3). São constituídas por um núcleo interno de poli-metacrilato de metilo e um invólucro externo de copolímero estatístico solúvel em água de ácido acrílico e metacrilato de metilo, que se sabe ter um grau elevado de afinidade para proteínas (Ref. 79, 80) . Este copolímero está comercialmente disponível (EUDRAGIT) e é obtido com diferentes percentagens dos dois co-monómeros. O processo de preparação que conduz ao fabrico deste segundo tipo de nanosferas envolve polimerização em dispersão. A síntese envolve a polimerização de radicais de um monómero de vinilo ou vinilideno na presença de EUDRAGIT com funções de estabilização estérica. Após a nucleação das nanoesferas, o EUDRAGIT dispõe-se fora das partículas. Assim, modificando a concentração do iniciador radical, a razão entre o monómero e EUDRAGIT e o tempo reaccional obtêm-se numerosas amostras de nanoesferas com diferentes características morfológicas e químicas.
Assim, pode avaliar-se se a distribuição da proteína Tat ou DNA da Tat por nanopartícuias, isoladamente ou em combinação com os imunogenes mencionados acima (proteína ou 136 DNA), irá induzir uma resposta imunológica contra o HIV. Em particular, as respostas imunológicas humoral ou mediada por células será avaliada e comparada com as obtidas com os imunogenes não distribuídos no modelo de macaco. 0 inventor crê que as informações derivadas destes estudos podem ser úteis para desenvolver uma vacina anti-HIV. Adicionalmente, as informações derivadas deste protocolo experimental também serão transferidas para estudos de outras vacinas, em particular para aqueles estudos respeitantes a proteínas recombinantes ou péptidos com baixa imunogenicidade. A possibilidade de desenvolver uma vacina apenas com uma administração conduzirá a enormes vantagens em termos da eficácia da vacina e diminuição de custos de gestão de programas de vacinas.
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Lisboa, 27 de Novembro de 2007

Claims (37)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Vacina para utilização como medicamento num humano, em que a referida vacina compreende uma proteína Tat isolada, em que a referida proteína Tat isolada está na sua forma não oxidada.
2. Vacina de acordo com a Reivindicação 1, em que a referida proteína Tat isolada é uma proteína Tat de tipo selvagem.
3. Vacina de acordo com a Reivindicação 2, em que a referida proteína Tat de tipo selvagem compreende uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos ID SEQ NO: 1.
4. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-3, em que a referida proteína Tat isolada está em combinação com um antigene do HIV que é Nef, Rev, Gag ou parte destes.
5. Vacina de acordo com a Reivindicação 4, em que a referida combinação é uma proteína de fusão Tat/Nef, Tat/Rev ou Tat/Gag.
6. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-5, em que a referida proteína Tat isolada está em combinação com uma citoquina imunomoduladora.
7. Vacina de acordo com a Reivindicação 6, em que a referida citoquina imunomoduladora é IL-12 ou IL-15. 2
8. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-7, em que a referida proteina Tat isolada está conjugada a um epitopo de auxiliadoras T.
9. Vacina de acordo com a Reivindicação 8, em que o referido epitopo de auxiliadoras T é um epitopo de auxiliadoras T do toxóide tetânico.
10. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-9, em que a referida vacina é formulada para distribuição no humano por administração nas mucosas, nasal, oral, vaginal, rectal, intramuscular, subcutânea, intradérmica, sistémica ou local.
11. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações Ι-ΙΟ, em que o referido humano está infectado com o HIV.
12. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-11, em que a referida proteína Tat isolada está purificada.
13. Vacina de acordo com a Reivindicação 12, em que a referida proteína Tat isolada é purificada por um método que compreende realizar cromatografia de afinidade com heparina.
14. Vacina de acordo com a Reivindicação 13, em que, à realização do passo referido, se seguem os passos de (a) liofilizar a referida proteina Tat isolada e (b) suspender novamente a proteina Tat liofilizada num tampão desgaseifiçado.
15. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-14, em que a referida proteina Tat isolada está presente 3 numa quantidade desde cerca de 10 ng/mL até cerca de 1 pg/mL.
16. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-15, em que a referida proteína Tat isolada está numa forma liofilizada.
17. Vacina de acordo com a Reivindicação 13, em que, à realização do passo referido, se seguem os passos de (a) liofilizar a referida proteína Tat isolada e (b) suspender novamente a proteína Tat liofilizada num fluido biologicamente aceitável.
18. Vacina de acordo com a Reivindicação 17, em que o fluido biologicamente aceitável é soro, plasma ou uma fracção destes.
19. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-18, em que a referida proteína Tat isolada está contida num fluido biologicamente aceitável.
20. Vacina de acordo com a Reivindicação 19, em que o referido fluido biologicamente aceitável é soro, plasma ou uma fracção destes.
21. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-20, que também compreende um adjuvante.
22. Vacina de acordo com a Reivindicação 21, em que o referido adjuvante é Alum, RIBI, ISCOM ou uma mistura destes. 4
23. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1- 22, que também compreende um inibidor da replicação virai.
24. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1- 23, que também compreende um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
25. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1- 24, em que a referida proteina Tat isolada é formulada para administração por um sistema de distribuição.
26. Vacina de acordo com a Reivindicação 25, em que o referido sistema de distribuição é um eritrócito, nanoparticula ou bactéria.
27. Vacina de acordo com a Reivindicação 26, em que o referido sistema de distribuição é uma bactéria que é Streptococcus gordonii ou Lactobacillus.
28. Vacina de acordo com a Reivindicação 26, em que o referido sistema de distribuição é uma bactéria que é modificada para expressar um antigene virai.
29. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1- 28, em que a referida proteina Tat isolada se destina a ser administrada intradermicamente a 1 - 6 pg sem adjuvantes.
30. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1- 29, em que a referida proteina Tat isolada é administrada nas mucosas. 5
31. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações Ι-ΒΟ para utilização na indução de uma resposta imunológica especifica no humano.
32. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações Ι-ΒΟ para utilização na imunização de células do sangue periférico de um sujeito infectado com o HIV expandidas por co-estimulação com esférulas magnéticas revestidas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28.
33. Vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações Ι-ΒΟ para utilização no tratamento terapêutico e/ou profiláctico de um tumor associado a infecção com o HIV, uma sindroma associada a infecção com o HIV, um sintoma associado a infecção com o HIV ou SIDA.
34. Processo de preparação da vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-30, que compreende liofilizar e suspender novamente a referida proteína Tat isolada num fluido biologicamente aceitável.
35. Processo de acordo com a Reivindicação 34, em que o referido fluido biologicamente aceitável é soro, plasma ou uma fracção destes.
36. Processo de preparação da vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-30, que compreende (a) purificar a referida proteína Tat isolada por um método que compreende realizar cromatografia de afinidade com heparina, (b) liofilizar a referida proteína Tat isolada e (c) suspender novamente a referida proteína Tat liofilizada num tampão desgaseifiçado. 6
37. Utilização de uma vacina de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-33 para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento terapêutico e/ou profiláctico de um tumor associado a infecção com o HIV, uma sindroma associada a infecção com o HIV, um sintoma associado a infecção com o HIV ou SIDA. Lisboa, 27 de Novembro de 2007
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