EA004330B1

EA004330B1 - Tat вич-1 или его производные для профилактической и лечебной вакцинации

Info

Publication number: EA004330B1
Application number: EA200000596A
Authority: EA
Inventors: Барбара Энсоли
Original assignee: Иституто Супериоре Ди Санита'
Priority date: 1997-12-01
Filing date: 1998-11-30
Publication date: 2004-04-29
Also published as: WO1999027958A3; CN1283121A; DK1035865T3; EP1698347A2; BR9814725A; DE69838486D1; PL341818A1; DE69838486T2; ITRM970743A1; IL136372A0; AU2412699A; WO1999027958A2; ATE374041T1; US8197820B2; IT1297090B1; AP2000001828A0; CA2311647A1; CU20000126A7; WO1999027958A9; NZ505373A

Abstract

Настоящее изобретение относится к Tat как активной основе профилактической и/или лечебной вакцины против ВИЧ-инфекции, развития ее до СПИДа и развития опухолей и других синдромов и симптомов у субъектов, инфицированных ВИЧ. Tat находится в биологически активной форме, или в виде рекомбинантного белка или пептида, или в виде ДНК. Конкретнее, изобретение относится к вакцине на основе Tat ВИЧ-1 в качестве иммуногена, инокулируемого в виде ДНК и/или рекомбинантного белка или пептидов, одних или в сочетании с другими генами или вирусными генными продуктами (Nef, Rev, Gag) или их частями, или в сочетании с различными иммуномодулирующими цитокинами (IL-12, IL-15), или с геном, кодирующим иммуномодулирующий цитокин или его часть. Tat, Nef, Rev, Gag и иммуномодулирующие цитокины вводят или в виде смеси рекомбинантных белков, пептидов, или составных белков (Tat/Nef, Tat/Rev, Tat/Gag, Tat/IL-12, Tat/IL-15), или в виде плазмидной ДНК.

Description

Настоящее изобретение относится к профилактической и/или лечебной вакцине против ВИЧ, против СПИДа и против опухолей и синдромов, связанных с ВИЧ-инфекцией, в которой в качестве иммуногенов используют белки дикого типа или мутированные белки, пептиды или ДНК Та! ВИЧ, одни или в сочетании с белками, пептидами или ДНК других вирусных продуктов (№Г. Ясу. Сад) или с цитокинами, потенциирующими антивирусную иммунную реакцию.

Изобретение также относится к иммунизации Та! или его производными путем использования аутологичных дендритных клеток, посредством иммунизации через слизистые оболочки или иммунизации ех-νίνο периферических клеток крови, размноженных посредством костимуляции с моноклональными антителами против СИЗ и против СЭ28, и к доставке вышеуказанных иммуногенов с использованием эритроцитов или наночастиц.

Уровень техники

СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) вызывается ВИЧ (вирусом иммунодефицита человека) и характеризуется иммунодефицитом, опухолями, такими как карцинома Капоши (К8) и В-клеточные лимфомы, инфекциями, вызванными условно-патогенными микроорганизмами, и расстройствами центральной нервной системы. Так как СПИД широко распространен в мире и приводит к высокой смертности, одной из наиболее важных задач общественного здравоохранения является разработка профилактической и/или лечебной вакцины против ВИЧ или СПИДа. В большинстве прежних и нынешних разработок в качестве иммуногенов используются оболочка вируса или его субъединицы, но с неудовлетворительными результатами из-за высокой изменчивости оболочки вируса (ссылки 162, 112; в данном описании в круглых скобках указываются разные ссылки, где полнее описывается уровень техники, к которой относится настоящее изобретение; полные библиографические сведения для каждой ссылки приводятся в конце описания непосредственно перед формулой изобретения). Поэтому в качестве альтернативы стерильному иммунитету распространено мнение, что он может быть достаточным для блокирования развития инфекции и начала заболевания. Более того, иммуннозащитные реакции можно получить с использованием в качестве иммуногенов участков ДНК ВИЧ (ссылки 91, 17). Исходя из опубликованных экспериментальных данных, изобретатель полагает, что необходимо получить вакцину, в которой используются иные, чем ет^г, вирусные продукты. В частности, вирусные белки, используемые в качестве иммуногенов, должны быть более консервативными среди изолятов ВИЧ, способными индуцировать эф фективную иммунную реакцию, как гуморальную, так и клеточную, и должны обладать жизненной для вируса функцией. Такие продукты необходимо опробовать на модели приматов, не являющихся людьми (поскольку их иммунная система наиболее схожа с иммунной системой человека по сравнению с системами филогенетически более далеких животных), и у которых после заражения вирусом может развиваться СПИД.

Белок Та! ВИЧ-1 обладает всеми характеристиками, чтобы быть хорошим иммуногеном для целей разработки вакцины: он консервативен, является иммуногенным и важен на ранних стадиях заражения вирусом. Более того, Та! играет ключевую роль не только в репликации вируса, передаче и развитии инфекции, но также в возникновении и развитии связанных со СПИДом опухолей, например, К8, которая является опухолью, наиболее часто связанной со СПИДом, и других синдромов и симптомов, развивающихся после заражения ВИЧ.

Та! представляет собой белок в 86-102 аминокислоты, в зависимости от штамма вируса, кодированный двумя экзонами. Та! продуцируется вскоре после заражения, локализуется в ядре и трансактивирует экспрессию всех генов вируса посредством взаимодействия с чувствительным к Та! элементом (ТАК), присутствующим в ЬТК (ссылка 25). Та! также играет роль в вирулентности ВИЧ (ссылки 63, 113, 60, 84). Продукт первого экзона (аминокислоты 172) является консервативным среди различных вирусных изолятов (ссылка 112) и достаточным для трансактивации продуктов ВИЧ-1 (ссылка 25). Он содержит 4 домена. Кислотный домен (аминокислоты 1-21) важен для взаимодействия Та! с клеточными белками; богатая цистеином область (аминокислоты 22-37) представляет трансактивирующий домен. Эта область наиболее консервативна среди первичных изолятов (ссылка 108) цистеина 22, причем глицин устраняет способность Та! трансактивировать ЬТК ВИЧ (ссылка 166), коровый домен (аминокислоты 38-48) также консервативен и важен для функционирования. Замена лизина 41 на треонин инактивирует трансактивирующую активность Та! в отношении ЬТК ВИЧ (ссылка 70); основной домен (аминокислоты 49-57), богатый аргинином и лизином, необходим для ядерной локализации Та! и специфически связывает его РНК-мишень (ТАК) (ссылка 25). Кроме того, основная область ответственна за связывание внеклеточного Та! с гепарином и с гепарансульфат-протеогликанами (Н8РС) (ссылка 26). Мутации в основной области устраняют такие взаимодействия. Карбоксиконцевая часть Та! не является необходимой для трансактивации ЬТК, но содержит последовательность аргининглицин-аспарагиновая кислота (КСИ), обычно присутствующую в белках внеклеточного матрикса (ЕСМ), ответственную за связывание Та! с интегриновыми рецепторами α₅βι и α_νβ₃. Эти взаимодействия опосредуют действие Та! на связанные со СПИДом опухоли и на иммунную, сосудистую и нервную системы (ссылки 11, 42, 170, 25). Во время острого заражения Т-клеток ВИЧ-1 или после трансфекции гена 1а1 в клетки СО8-1 белок Та! секретируется в остутствие гибели клеток во внеклеточной окружающей среде (ссылки 40, 41, 25). Секреция из инфицированных клеток также происходит ίη νίνο, так как внеклеточный Та! присутствует в сыворотке инфицированных субъектов (ссылка 164) и в СПИД-К8 повреждениях (ссылка 42). После секреции часть белка остается в растворимой форме, а часть связывается с Н8РС ЕСМ. Та!, связанный с Н8РС, можно извлечь в растворимой форме посредством добавления гепарина. Связывание с гепарином происходит благодаря основной области Та!; оно предотвращает действие внеклеточного Та! и защищает белок от окисления. Эта особенность использована авторами изобретения для получения чистого Та! с высокой биологической активностью (ссылка 26). Внеклеточный Та! может быть интернализован клетками, может мигрировать в ядра и трансактивировать экспрессию гена вируса (ссылки 49, 98, 100, 41). Интернализация Та! происходит посредством эндоцитоза, опосредованного связыванием РСЭ-области Та! с α₅βι и α_νβ₃ (ссылка 10, 42, Εηκοΐί е! а1., неопубликованные данные), и/или основной областью, связывающейся с Н8РС.

Та! может активировать репликацию вируса и передачу вируса также через косвенные механизмы, включающие модуляцию экспрессии клеточных генов, играющих ключевую роль в регуляции выживания клеток, и экспрессии цитокинов области воспаления (1С) с воздействием на репликацию вируса (ссылка 25).

Помимо своего значения при репликации вируса, Та! играет важную роль в патогенезе СПИДа. Та! способен модулировать выживание и пролиферацию инфицированных и неинфицированных клеток, вызывая активацию или подавление цитокинов, таких как 1Ь-2 (ссылки 123, 163, 31), или генов, играющих ключевую роль в клеточном цикле (ссылки 145, 169, 164, 173). Анти- и проапоптозное действие Та! зависит от ряда факторов, таких как тип клетки, факта экспрессируется ли Та! клеткой или добавляется к клетке, и от его концентрации (ссылки 40, 41, 171).

Та! является фактором, ответственным за усиленную частоту и агрессивность К8 у инфицированных ВИЧ-1 субъектов (ссылки 43, 33). К8 представляет собой опухоль сосудистого происхождения, и она является наиболее частой неоплазией у ВИЧ-инфицированных индивидуумов. Та! индуцирует клетки К8 и эндотелиальные клетки, активированные 1С, к миграции, экспрессии коллагеназы типа IV, внедрению

ЕСМ и пролиферации, причем такие механизмы необходимы для ангиогенеза и инвазии опухоли (ссылки 40, 41, 42, 2, 46). Такое действие Та! индуцируется 1С, так как они стимулируют экспрессию Та!-рецепторов, α₅βι и α_νβ₃ (ссылка 10). Та! имитирует действие белков ЕСМ, таких как фибронектин и витронектин, и как область РСЭ. так и основная область необходимы для действия внеклеточного Та! на клетки К8, на ангиогенез и на развитие К8. Способность внеклеточного Та! к связыванию ίη νίνο своих рецепторов в СПИД-К8 повреждениях (ссылка 40) подтверждает мысль, что Та! вовлекается в появление и поддержание связанной со СПИДом К8. Более того, у мышей, трансгенных для гена !а!, развитие К8 или других фенотипов зависит от уровня экспрессии трансгена (ссылки 160, 34).

Предполагается, что Та! играет некую роль в явлении гиперпролиферации и в патогенезе Влимфом, часто наблюдаемых у сероположительных субъектов и у !а!-трансгенных мышей (ссылка 157), через механизмы, включающие усиление экспрессии Ьс1-2 и цитокинов (ссылка 122). Другие свидетельства подтверждают возможную роль Та! в онкогенезе (ссылка 72).

Та! также может активировать экспрессию вирусных промоторов, таких как промоторы вируса герпеса и других вирусов, которые реакционноспособны в организмах индивидуумов со СПИДом, промотируя начало и развитие инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами (ссылка 25).

Оказывается, что Та! также способен проявлять нейротоксическое действие как непосредственно (через основную и ВСИ-области), так и косвенно через индукцию 1С, обладающих токсическим действием на нейроны центральной нервной системы или на гематоэнцефалический барьер (ссылка 25). С учетом иммунной реакции на Та!, в некоторых исследованиях предполагается, что антитела против Та! играют защитную роль в регуляции развития болезни ίη νίνο (ссылки 130, 135, 136, 149, 127). Кроме того, антитела против Та! ίη νίΐτο не только подавляют интернализацию, трансцеллюлярную активацию Та! и заражение вирусом (ссылки 41, 127), но также ингибируют пролиферацию и индуцированную Та! миграцию клеток К8 и образование К8-подобных повреждений у мышей (ссылки 40, 41, 42). Наконец, результаты, полученные предварительно авторами изобретения, показывают, что антитела против Та! отсутствуют у субъектов со СПИД-К8, что наводит на мысль, что у таких субъектов не может происходить блокировка активности внеклеточного Та!.

Развитие клеточноопосредованной реакции против Та! в начальной фазе заражения важно для регуляции самого заражения (ссылки 161, 133, 59), и существует обратная зависимость между наличием специфических СТЬ против Та! и развитием болезни (ссылка 156). Такие результаты получены при исследованиях на макаках, инокулированных 81Утае (ссылки 91, 158). Кроме того, данные, полученные в последнее время на мышах разных видов, которым Та! инокулирован или в виде плазмиды, или в виде белка, показывают, что можно индуцировать как гуморальную, так и клеточную реакцию на белок (ссылка 61). Однако среди некоторых видов мышей наблюдается вариабельность, и такие результаты с теми же иммуногенами не воспроизводятся на приматах, не являющихся человеком (ссылка 124). Отсутствие воспроизводимости на такой приматной модели результатов экспериментов с вакциной, выполненных на мышах, часто и вероятно происходит из-за различий в иммунных системах этих двух видов, что может вызвать различные иммунные реакции на один и тот же иммуноген, как показано для белка ВИЧ-Εην. Таким образом, возможные вакцины для людей должны проверяться на приматах, а не только на низших видах.

Изобретатель полагает, что другие вирусные белки или их части можно соединять с Та! для усиления специфической иммунной реакции против ВИЧ, и что такое соединение также будет благоприятным при вакцинации против появления опухолей и других патологий и симптомов, связанных с ВИЧ-инфекцией. Такими продуктами являются белки ВИЧ №£, Вет и Сад.

№Г является еще одним вирусным регуляторным белком, важным для развития болезни (ссылки 3, 48, 58). №Г продуцируется сразу же после заражения, и он секретируется во внеклеточную среду (Εηκοΐί, неопубликованные данные). В системе 81Утае/мака-ка присутствие №Г коррелирует с высокой репликацией вируса и с развитием СПИДа (ссылка 71). №Г более вариабелен, чем Та! (ссылка 112). №Г является иммуногенным белком (ссылки 53, 32, 35, 151) и способен индуцировать СТЬ (ссылки 16, 36). В частности, идентифицирована иммунодоминантная область №Г (область 73-144), распознаваемая СТЬ у большинства ВИЧинфицированных пациентов.

Вет является регуляторным вирусным белком, продуцируемым во время инфекции (ссылки 51, 119), и секретируемым во внеклеточную среду (Εηδοίί. неопубликованные данные). Вет важен для репликации ВИЧ и для развития болезни, и он кодируется двумя экзонами, частично перекрывающими области, кодирующие Та!. Вет является ядерным белком (ссылка 44), необходимым для экспрессии вирусных матричных РНК, кодирующих поздние белки (ссылка 97). Вет является высококонсервативным белком среди различных вирусных изолятов ВИЧ-1 (ссылка 111), и он является иммуногенным. Действительно, этот белок индуцирует продуцирование специфических антител, направленных против двух функциональных доменов бел ка (ссылка 120) в процессе естественного заражения у людей (ссылка 131) и после инокуляции мышам (ссылка 61). Оказывается, что пониженное содержание антител против Вет в сыворотках инфицированных индивидуумов коррелирует с развитием СПИДа (ссылка 131). Вет может индуцировать СТЬ как у человека, так и у обезьяны (ссылки 156, 158), и сообщается, что специфическая реакция СТЬ против Вет, в начальный момент заражения, коррелирует в обратной зависимости с развитием заболевания (ссылки 156, 158).

Другой мишенью вируса является ген дад, который экспрессируется позже во время заражения и кодирует группу высоко иммуногенных структурных белков капсиды (ссылки 18, 147). Титры антител против Сад высоки и стабильны во время асимптоматической фазы заражения и достигают очень низких значений, когда инфекция развивается до полного СПИДа, в сочетании с падением числа (СЭ4+)-лимфоцитов и присутствием вируса в периферической крови (ссылки 174, 73). Белки Сад индуцируют раннюю активность СТЬ во время заражения как у людей, так и у приматов (ссылки 103, 168), и их присутствие существенно соотносится с регуляцией начальной виремии и с развитием болезни (ссылки 175, 6, 134, 167, 92). Наконец, белки р17 и р24 содержат иммунодоминантные эпитопы, которые сохраняются в различных изолятах ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и распознаются СТЬ (ссылки 89, 19, 114, 155, 115).

Изобретатель полагает, что цитокины или их части, такие как 1Ь-2 и ΣΠ-15, или другие иммуномодулирующие цитокины, такие как ΙΡΝα или ΙΡΝβ, или другие белки, усиливающие иммуногенное действие Та!, можно использовать в качестве адъювантов при составлении вакцины против Та!. 1Б-12 является сильным иммуномодулирующим цитокином, продуцируемым антигенпредставляющими клетками (АРС), такими как В-клетки и дендритные клетки (ссылка 154). 1Б-12 продуцируется рано после заражения ВИЧ и обладает противовоспалительным действием, побуждая ΝΚ-клетки и Т-лимфоциты продуцировать ΙΡΝ_γ, который активирует фагоциты и промотирует индукцию Т111 -лимфоцитов. 1Б-12 играет некую фундаментальную роль в сопротивлении ряду инфекций, вызываемых бактериями, грибами, вирусами, и показывает высокую противоопухолевую активность. Некоторые данные наводят на мысль, что вирусы, индуцирующие иммуносупрессию, такие как ВИЧ и вирус кори, также действуют через механизмы, по которым подавляется продуцирование 1Б-12 (ссылки 57, 50, 144).

ΙΠ-15 представляет собой плейотропный цитокин, экспрессируемый нелимфоидными тканями, активированными моноцитами/макрофагами и дендритными клетками (ОС) (ссылки 125, 66). ΙΠ-15 играет важную роль в регуляции ΝΚ-активности, в пролиферации Тлимфоцитов и активности СТБ (ссылки 67, 24). ГБ-15 индуцирует экспрессию СТБ против антигенов ВИЧ в отсутствие 1Б-2 и функциональных (СИ4+)-Т-лимфоцитов (ссылки 68, 1). Кроме того, подобно 1Б-2, 1Б-15 индуцирует экспансию лимфоцитов с цитотоксической активностью (лимфокин-активированные клетки-киллеры, БАК) и стимулирует продуцирование ΙΕΝ_γ в РВМС сероположительных пациентов (ссылка 93). 1Б-15 активирует моноциты для продуцирования хемокинов, участвуя в зарождении воспалительных процессов (ссылка 8).

Последние исследования показали, что костимуляция (СИ4+)-лимфоцитов парамагнитными гранулами, сенсибилизированными моноклональными антителами против СИЗ и против СЭ28. определяет логарифмическую и поликлональную экспансию лимфоцитов от ВИЧинфицированных субъектов (ссылка 82) без активации репликации и передачи вируса. Такая антивирусная активность является следствием как негативной модуляции экспрессии ССК.5 корецептора моноцитотропных штаммов ВИЧ-1 (ссылка 23), так и, в меньшей степени, высокого содержания хемокинов, индуцированных костимуляцией моноклональными антителами против СИЗ и против СИ28 (ссылка 132). Изобретатель полагает, что возможность экспансии аутологичных лимфоцитов от ВИЧ-инфицированных субъектов в отсутствие репликации и передачи вируса позволяет получить эффективную иммунизацию ех νίνο, описанную в примерах, которая может быть весьма полезной при разработке вакцины против Так

В разных системах, нацеленных на получение эффективных антивирусных и противоопухолевых вакцин, как полагает изобретатель, использование дендритных клеток могло стать ключом к индукции иммунной реакции на Так Это происходит вследствие того факта, что такие клетки являются наиболее эффективными в представлении антигена и способны одни стимулировать нативные лимфоциты в отсутствие адъювантов (ссылка 150). Использование дендритных клеток заменяет функцию некоторых адъювантов, участвующих в индукции неспецифической иммунной реакции (природный иммунитет), которая, в свою очередь, генерирует сильную специфическую первичную реакцию в присутствии антигена.

Так как передача ВИЧ-инфекции происходит, главным образом, в слизистых оболочках (в ректальной слизистой и слизистой оболочке половых органов у взрослых, в слизистой оболочке рта у новорожденных), изобретатель полагает, что первоочередной задачей является индукция защитного иммунитета в слизистых оболочках. В последнее время во многих исследованиях показана возможность индуцирования иммунизации в слизистых оболочках - местной и системной. В частности, показано, что назаль ный и пероральный способы являются наиболее эффективными при индуцировании эффективной иммунной реакции в слизистых оболочках, даже в отдаленных участках, таких как слизистая оболочка половых органов (ссылки 138, 118). В частности, изобретатель полагает, что использование бактерий 8. Согбопп и Бас!оЬасШиз, модифицированных для экспрессии вышеуказанных вирусных антигенов, может являться действенной стратегией индуцирования или потенцирования специфической иммунной реакции на уровне слизистых оболочек у обезьян и у человека. Эти бактерии, действительно, способны заселять слизистую оболочку рта и влагалища мыши и индуцировать специфическое - локальное и системное образование антител против гетерологичных антигенов, экспрессированных на поверхности рекомбинантных бактерий (ссылки 116, 104, 106, 121, 117, 139, 105, 107). Наконец, эти бактерии действуют как живые векторы и могут индуцировать пролонгированную стимуляцию иммунной системы. Кроме того, изобретатель полагает, что нереплицирующие и непатогенные рекомбинантные вирусные векторы, такие как вирусы простого герпеса типа 1 (Н8У-1) (ссылка 99), можно использовать для экспрессии вирусных белков для системной (интрадермальной) иммунизации и иммунизации через слизистые оболочки (пероральный, вагинальный и назальный способы). Действительно, эти векторы могут разместить большие экзогенные последовательности (ссылки 52, 64), такие как некоторые гены ВИЧ (регуляторные, добавочные и структурные). Кроме того, векторы герпеса также можно вводить пероральным, назальным или вагинальным способом (ссылки 176, 75).

Изобретатель полагает, что Та! (или в виде белка или в виде ДНК), один или в сочетании с другими иммуногенами, описанными выше, можно инокулировать также с использованием новых систем доставки, таких как эритроциты или наночастицы. В частности, изобретатель полагает, что можно доставлять антигены, связанные с мембраной аутологичных эритроцитов (ссылки 95, 96). Так как такие эритроциты удаляются из крови макрофагами - профессиональными антигенпредставляющими клетками, только через 120 дней, эту особенность можно использовать для целей вакцинации. Наконец, другая стратегия доставки состоит в использовании наночастиц, которые могут нести белки и ДНК (ссылки 27, 172). Наносферы являются полимерными коллоидальными частицами разного химического состава размером 10-1000 нм. Различные вещества (олигонуклеотиды, лекарственные средства, белки, пептиды, ДНК) можно нагрузить на их поверхность или абсорбировать в частице и доставлять в цитоплазму или ядра клеток, из которых они медленно высвобождаются. Это обстоятельство позволяет использовать очень небольшие количества достав ляемого вещества.

Основываясь на результатах, описанных выше, изобретатель полагает, что иммунизация Та!, одним или в сочетании с другими вирусными продуктами или иммуномодулирующими цитокинами или их частями, в присутствии или в отсутствие адъювантов, может блокировать репликацию вируса у субъектов, испытавших воздействие после вакцинации, и у инфицированных субъектов, удерживая инфекцию в абортивной фазе, которую иммунная система может легче контролировать. Поэтому изобретатель полагает, что вакцина на основе Та! должна быть способной индуцировать иммунную реакцию, как гуморальную так и клеточную, достаточную для блокирования или снижения репликации или передачи вируса и, следовательно, должна быть способной к регуляции репликации вируса и блокированию продуктивной инфекции, развития ее до болезни и возникновения опухолей и других связанных со СПИДом синдромов и симптомов. Следовательно, возможно применение вакцины против Та! как в профилактических, так и в лечебных целях. Действительно, гуморальная реакция против Та! может нейтрализовать действие внеклеточного Та!, ослабляя и ограничивая инфекцию, в то время как клеточноиндуцированная реакция против Та!, как и против других вирусных белков, входящих в состав вакцины, может разрушить инфицированные вирусом клетки, что ведет к регулированию заражения. Это предоставит иммунной системе время, необходимое для развития комплексной реакции на все вирусные компоненты инфицирующего вируса в отсутствие необратимых изменений из-за репликации вируса.

Применение Та! в качестве иммуногена описано (\УО 95/31999). Однако описывается применение биологически неактивного белка; кроме того, в этой же заявке на патент не приводятся доказательства биологической активности нативного белка Та!.

Кроме того, существует сильное техническое предубеждение против применения биологически активного белка Та! относительно того, что, как полагают, он усиливает репликацию вируса у инфицированных субъектов и/или осуществляет иммуносупрессию у сероотрицательных или сероположительных индивидуумов (А. ТоиеШ: Λίάδ. ип уассшо рег крегаге. Ьа КериЬЬНса, рад. 10, 24, Ос!., 1988).

Как доказательство вышеописанного, несмотря на предпринятые усилия, эффективная вакцина против ВИЧ на основе Та! пока не разработана.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является белок Та! или пептиды Та! или ДНК Та! для применения в качестве вакцины, причем подразумевается, что Та! должен находиться в биологически активной форме.

Другой целью настоящего изобретения является вакцина для применения к людям, на основе белка или пептида, профилактическая или лечебная, против СПИДа, связанных со СПИДом опухолей и связанных с ВИЧ синдромов и симптомов, и содержащая рекомбинантный белок Та! дикого типа или его мутанты (послед. 1-5), экспрессированные и очищенные так, как описано, или пептиды Та! дикого типа или мутированного (послед. 1-7), вводимые отдельно или в сочетании с Т-хелперным эпитопом столбнячного анатоксина или другими Тхелперными эпитопами.

Другой целью изобретения является вакцина, описанная выше, в сочетании с рекомбинантными белками ВИЧ №Г, Кеу и/или Сад или пептидами №Г, Кеу и Сад, вводимыми в виде слитых белков Та!/№Г, Та!/Кеу, Та!/Сад или в виде частей таких белков.

Другой целью изобретения является вакцина, описанная выше, в сочетании с рекомбинантными белками иммуномодулирующих цитокинов, таких как 1Ь-12, ΣΠ-15, или другими молекулами или их частями, способными усиливать антивирусную иммунную реакцию, или вакцина, состоящая из Та!/1Ь-12, Та!/1Ь-15 или Та! и других составных белков или их частей, способных усиливать антивирусную иммунную реакцию.

Другой целью изобретения является профилактическая или лечебная вакцина на основе ДНК, вводимая людям против СПИДа, связанных со СПИДом опухолей и связанных с ВИЧ синдромов и симптомов, содержащая векторы, кодирующие Та! дикого типа или его мутантов (послед. 1-5), или их части, встроенные в экспрессирующий плазмидный вектор рСУО или другие векторы.

Другой целью изобретения является вакцина на основе ДНК, описанная в п.4, в сочетании с генами ВИЧ геу, пеГ или дад или их частями, встроенными в вектор рСУО, или вакцина на основе ДНК, вводимая в виде вектора, коэкспрессирующего гены !а!/геу, !а!/пеГ, !а!/дад или их части.

Другой целью изобретения является вакцина на основе ДНК, описанная выше, в сочетании с ДНК, кодирующей 1Ь-12 и ΣΠ-15, или другими генами, кодирующими иммуномодулирующие цитокины или их части, встроенными в рСУО или другие векторы, или вакцина на основе ДНК, вводимая в виде вектора, коэкспрессирующего Та!/1Ь-12, Та!/1Ь-15 или Та! и другие молекулы или их части, способные к усилению антивирусной иммунной реакции.

Другой целью изобретения является вакцина против Та!, в виде белка, пептида и/или ДНК, одних или в описанных выше сочетаниях, для иммунизации аутологичными дендритными клетками путем обработки ех νίνο.

Другой целью изобретения является вакцина против Та!, в виде белка, пептида и/или

ДНК, одних или в описанных выше сочетаниях, для иммунизации через слизистые оболочки (назальную, оральную, вагинальную или ректальную).

Другой целью изобретения является вакцина против Та!, в виде белка, пептида и/или ДНК, одних или в описанных выше сочетаниях, для иммунизации ех νίνο клеток периферической крови от инфицированных субъектов, выращенных посредством костимуляции моноклональными антителами против СБ3 и против СБ28. конъюгированными с парамагнитными гранулами, и снова введенными хозяину.

Другой целью изобретения является вакцина против Та!, в виде белка, пептида и/или ДНК, описанная выше, в сочетаниях с ингибиторами репликации вируса.

Другой целью изобретения является уже описанная вакцина против Та! в сочетании с адъювантами, усиливающими иммунную реакцию.

Другой целью изобретения является вакцина против Та!, одна или в уже описанных сочетаниях, вводимая с помощью специфических систем доставки, таких как наночастицы, векторы герпеса, эритроциты, бактерии, или любой другой системы доставки, с помощью которой можно ввести описанную выше вакцину во всех ее сочетаниях.

Другие цели будут очевидны из подробного описания изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг. 1А. Ингибирование поглощения 10 нг/мл родаминированного белка Та! посредством предварительной инкубации активированных цитокином эндотелиальных клеток с антителами против интегрина.

Фиг. 1А, часть А. Клетки, предварительно инкубированные с буфером, инкубированные с В8А.

Фиг. 1А, часть В. Клетки, предварительно инкубированные с буфером, инкубированные с Та!.

Фиг. 1А, часть С. Клетки, предварительно инкубированные с моноклональными антителами С’Б\\'49е и СБ29. инкубированные с Та!.

Фиг. 1А, часть Ό. Клетки, предварительно инкубированные с моноклональными антителами СБ51 и СБ61, инкубированные с Та!.

Фиг. 1А, часть Е. Клетки, предварительно инкубированные с антителами против фактора человека VIII (контрольные антитела), инкубированные с Та!.

Фиг. 1В. Способность очищенного белка Та!-су§22 (Та!22) конкурировать с трансактивирующей активностью белка Та! дикого типа, контролируемая методом са!-анализа.

Фиг. 2А. Специфическое продуцирование 1дС против Та! у обезьян, вакцинированных белком Та!, определенное при помощи иммуноферментного анализа (ЕЬ18А). Результаты получены на двух обезьянах, инокулированных подкожно 10 или 100 мкг рекомбинантного белка Та!, ресуспендированного в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл КГВГ

Фиг. 2В. Специфическое продуцирование 1дС против Та! у обезьян, вакцинированных белком Та!, определенное при помощи иммуноферментного анализа (ЕЫ8А). Результаты получены на контрольной обезьяне (М3).

Фиг. 3. Титрование антител против Та! в плазме от обезьян, инокулированных 100 (М1) и 10 (М2) мкг рекомбинантного белка Та!, описанных на фиг. 2 А и фиг. 2В.

Фиг. 4А. Картирование эпитопов Та!, узнаваемых 1§С против Та! от обезьян, инъецированных 100 (М1) и 10 (М2) мкг рекомбинантного белка Та!, описанным на фиг. 2 А и фиг. 2В. Для каждого пептида приводятся средние результаты при двукратном испытании в плазме, разведенной 1:50.

Фиг. 4В. Картирование в соответствии с фиг. 4А. Приводятся титры антител в плазме, выраженные в виде обратной величины наибольшего разведения, при котором проба все еще положительна.

Фиг. 5. Анализ специфической гуморальной 1дМ-реакции против Та! у обезьян, инокулированных белком Та!, определенной методом ЕЬ18А.

Фиг. 6. Анализ специфического продуцирования 1§С против Та! у обезьян, инокулированных белком Та!, при испытании методом ЕЬ18А.

Фиг. 7. Титрование антител против Та! в плазме обезьян, инокулированных рекомбинантным Та! (10 мкг) в присутствии КГВ1 (М1-3) или А1ит (М4-6), описанных на фиг. 6.

Фиг. 8А. Эпитопы Та!, распознаваемые 1дС против Та! от обезьян, инокулированных в соответствии с описанием фиг. 6. Результаты относятся к образцам, разведенным 1:50, и являются средними результатами, полученными в двух лунках.

Фиг. 8В. Эпитопы Та! в соответствии с фиг. 8А. Результаты относятся к титрованию плазмы, показанному на фиг. 8А, и выражаются в виде обратной величины наибольшего разведения плазмы, при котором проба все еще положительна.

Фиг. 9. Анализ Та!-специфических СТЬ.

Фиг. 10. Анализ реакции замедленной гиперчувствительности к Та! методом кожной пробы.

Фиг. 11 А. Гуморальная 1дС-реакция на Та! у обезьян, вакцинированных ДНК Та!. Приводятся результаты, полученные на двух обезьянах, вакцинированных 200 (М1) и 500 (М2) мкг плазмиды ρСV-Та!.

Фиг. 11В. Гуморальная 1дС-реакция на Та! у обезьян, вакцинированных ДНК Та!. Приводятся результаты для контрольной обезьяны (М3).

Фиг. 12. Титрование антител против Та! в плазме от обезьяны М2, инокулированной ί.ά. 200 мкг рС.’У-Та1.

Фиг. 13. Анализ продуцирования 1дС против Та! у трех обезьян (М9-М11), инокулированных 1 мг рСУ-Та!, и у одной контрольной обезьяны (М12), инокулированной 1 мг контрольного вектора рСУ-0.

Фиг. 14. Кинетика пролиферативной реакции РВМС от Масаса ГахСюЫагБ на костимуляцию моноклональными антителами против СЭ3 и против С.П28 на парамагнитных гранулах (анти-СЭ3/28 гранулы).

Фиг. 15 А. Антивирусное действие костимуляции анти-СЭ3/28 гранулами на РВМС Масаса Га5С1Си1ап5. Обезьяна МК 193.

Фиг. 15В. Антивирусное действие костимуляции анти-СЭ3/28 гранулами на РВМС Масаса Га5С1Си1ап5. Обезьяна МК Ό91.

Фиг. 15С. Антивирусное действие костимуляции анти-СЭ3/28 гранулами на РВМС Масаса Га5С1Си1ап5. Обезьяна МК 9301.

Фиг. 15Ό. Антивирусное действие костимуляции анти-СЭ3/28 гранулами на РВМС Масаса Га5С1Си1ап5. Обезьяна МК 9401.

Фиг. 16 А. Функциональная характеристика дендритных клеток (ОС), полученных из периферической крови обезьяны. ³Н-Тимидин вводят на 4 день выращивания аллогенных смешанных лейкоцитов (АМЬВ).

Фиг. 16В. Функциональная характеристика дендритных клеток, полученных из периферической крови обезьяны. АРС, такие как ОС и М0, полученные так, как описано на фигуре 16 А, заражали Т-лимфоцитами от другой обезьяны.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к Та! как активной основе профилактической и/или лечебной вакцины против ВИЧ-инфекции, развития ее до СПИДа и развития опухолей и других синдромов и симптомов у субъектов, инфицированных ВИЧ. Та!, или Та! дикого типа, находится в своей активной форме, или точнее - в биологически активной форме (как поясняется далее), или в виде рекомбинантного белка или пептида или ДНК. Конкретнее, изобретение относится к вакцине на основе Та! ВИЧ-1 как иммуногена, инокулируемой в виде ДНК и/или рекомбинантного белка, или в виде пептидов, одних или в сочетании с другими генами или вирусными генными продуктами (ИеГ, Ясу. Сад) или их частями, или в сочетании с различными иммуномодулирующими цитокинами (1Ь-12, 1Ь15) или с геном, кодирующим иммуномодулирующий цитокин или его часть. Та!, ИеГ, Ясу. Сад и иммуномодулирующие цитокины вводят как в виде смеси рекомбинантных белков, пептидов или слитых белков (Та1/ИеГ, Та!/Ясу. Та!/Сад, Та!/1Ь-12, Та!ДЬ-15), так и в виде плазмидной ДНК. В настоящем описании Та! дикого типа и Та! в активной форме должны рассматриваться как синонимы выражения биоло гически активный Та!.

В соответствии с настоящим изобретением под биологически активным Та! подразумевается белок, который в пикомолярных или наномолярных концентрациях (от 10 нг/мл или менее до 1 мкг/мл, предпочтительно - от 0,1 нг/мл до 100 нг/мл) способен (ί) проникать и локализоваться в ядрах активированных эндотелиальных клеток или дендритных клеток, как определяется в примере 1А;

(ίί) активировать пролиферацию, миграцию и инвазию клеток саркомы Капоши (К§) и белка активированных цитокином эндотелиальных клеток (ссылки 40, 2);

(ш) активировать репликацию вируса при добавлении к инфицированным клеткам, что определяют а) посредством спасения дефектных по Та! провирусов в клетках НЬМ-1 после добавления экзогенного белка (ссылка 41); Ь) посредством трансактивации экспрессии генов ВИЧ-1 в клетках, трансфицированных промотором ВИЧ-1 и репортерным плазмидным белком (ссылка 41);

(ίν) индуцировать у мышей развитие К§подобных повреждений в присутствии ангиогенных факторов или цитокинов зоны воспаления (ссылка 42).

Изобретатель считает, что в случае биологически активного Та! совершенно необходимо, чтобы подтверждались пункты (1) или (и), предпочтительно, должны подтверждаться оба пункта, предпочтительнее, должны подтверждаться пункт (ί) или (ίί), или оба, в сочетании с пунктом (ш)а) и/или (ш)Ь). Наилучшие результаты получатся, когда подтвердятся все пункты (1)(ίν). Белок Та! или фрагменты Та! с такими свойствами способны индуцировать ίη νίνο цитотоксическую или антивирусную иммунную реакцию. Действительно, биологически активный Та! с указанными выше свойствами способен связываться со специфическими рецепторами клеточной поверхности и поглощаться при помощи этих рецепторов. Поглощение Та! важно для индуцирования цитотоксической реакции.

В исследованиях, проведенных ранее и осуществляемых в настоящее время, относящихся к разработке вакцины на основе Та!, не использовался биологически активный Та! с указанными выше свойствами.

Способ получения и работа с биологически активным Та!, в соответствии с настоящим изобретением, описаны в примере 1.

Также описан способ иммунизации с использованием аутологичных дендритных клеток, обработанных ех νίνο рекомбинантным белком Та! или его пептидами, одними или в смеси с рекомбинантными белками или пептидами (Та!, ИеГ, Ясу. Сад), или белком Та! и одним или несколькими иммуномодулирующими цитокинами или их частями, или трансдуциро ванными эукариотными векторами, содержащими ген !а! один или в сочетании с вирусными генами, кодирующими ΝοΓ. Сад или Кеу, или 1а1 и ген, кодирующий иммуномодулирующий цитокин или его часть.

Способы индукции иммунной реакции в слизистой оболочке также описаны. Та! или его пептиды, одни или в сочетании с вирусными белками и/или цитокинами, инокулируют в слизистую для усиления и индукции локальной иммунной реакции. Белок ВИЧ-1 Та! или его субъединицы также можно использовать для иммунизации ех νίνο (СЭ4+)-лимфоцитов и (СЭ8+)-лимфоцитов, выделенных из периферической крови инфицированных субъектов. Та!антигенспецифические клетки затем можно размножить ίη νί!το посредством костимуляции моноклональными антителами против СИЗ и СЭ28 и ввести снова. Наконец, также описано применение мутантов Та!, идентифицированных в примерах, используемых в качестве иммуногенов, как альтернативы Та! дикого типа. Мутантами Та! являютсятся ί) мутант в области цистеина (су§22) и ίί) мутант в коровой области (1у§41), ίίί) мутант с удаленной последовательностью Κ.6Ό; ίν) двойной мутант с удаленными лизином 41 и Κ.6Ό. С другой стороны, при применении мутантов Та! или пептидов Та! (дикого типа или мутированных в виде белка) в случае лечебной вакцинации вместе с иммуногеном можно использовать ингибиторы репликации вируса.

В этом отношении под ингибиторами репликации вируса подразумеваются все молекулы, известные в настоящее время, или те, которые будут обнаружены в дальнейшем (нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ингибиторы протеаз, антисмысловая РНК и, вообще, все молекулы, способные блокировать экспрессию генов ВИЧ), способные уменьшать или блокировать репликацию ВИЧ. Как указывалось ранее, описываются различные способы иммунизации, при которых используются белок Та!, пептиды и ДНК Та! в сочетании с другими вирусными генами или белками или их частями, или иммуномодулирующими цитокинами или генами, кодирующими иммуномодулирующие цитокины, или их частями. Под его частями подразумеваются сегменты генов или белков, описанных выше, демонстрирующие такую же эффективность индуцирования, как иммуногенное действие полного гена или белка. Кроме того, так как эффективность адъювантов в вакцинах известна, настоящее изобретение относится к применению известных адъювантов и тех адъювантов, которые будут найдены в дальнейшем, вводимых вместе с Та! (белком или ДНК) и с сочетаниями Та! и других генов или вирусных или клеточных белков. Подобным образом, делается предположение об эффективности различных систем доставки Та! (белка или ДНК) и сочета ний Та! и других генов или вирусных или клеточных белков при индуцировании как системной, так и локальной иммунной реакции на Та! (иммунизация через слизистые оболочки).

Результаты, полученные изобретателем (неопубликованные), показывают, что только белок Та!, в своей биологически активной форме, способен связываться со специфическими клеточными рецепторами и проникать в клетку. Эта особенность является основой иммунной реакции А-клеток и, кроме того, иммунокомпетентных клеток вообще, и, согласно изобретателю, имеет фундаментальное значение для индуцирования значительно более сильной иммунной реакции, чем та, которую способен выявить неактивированный белок. В итоге, в отличие от применения в качестве иммуногена неактивированного Та!, предлагаемого рядом исследователей, изобретатель предполагает использовать Та! ВИЧ-1 или его мутанты в их биологически активных формах, для того, чтобы вызвать весьма сильную иммунную реакцию против ВИЧ, способную предотвратить заражение или развитие болезни, и создает возможность для эффективного подхода к лечению индивидуумов, инфицированных ВИЧ-1. Согласно изобретателю, вакцину можно доставлять системными (внутримышечно, ί.ά., подкожно и т.п.) или местными способами (через слизистые оболочки). Последний способ предпочтителен, когда в качестве систем доставки используются бактерии (см. ниже). Вакцину можно получить следующим образом. Та! можно получить согласно примеру 1, его можно лиофилизовать и хранить. В момент применения его можно ресуспендировать в биологически приемлемой жидкости, такой как сыворотка, плазма или их фракции.

Трансформированные клетки, содержащие вектор экспрессии Та! или вектор экспрессии мутанта Та!, или их частей, как описано ранее, и клетки, выращенные для экспрессии белка Та!, которые будут выделены для применения, все они входят в объем настоящей заявки на патент.

Подразумевается, что все варианты Та! (включая все типы и субтипы штаммов ВИЧ) с аналогичной или с большей активностью, чем описано выше, входят в рамки изобретения.

Настоящее изобретение теперь будет описываться с помощью иллюстрирующих, но не ограничивающих его конкретных примеров, в которых будут делаться ссылки на прилагаемые фигуры.

Подробное описание фигур

Фиг. 1А. Ингибирование поглощения 10 нг/мл родаминированного белка Та! посредством предварительной инкубации активированных цитокином эндотелиальных клеток с антителами против интегрина. Активированные цитокином клетки пупочной вены человека (ΗυνΕ), обработанные так, как описано в пояснении к табл. 2А, предварительно инкубируют в бессывороточной среде, содержащей буфер или антитела, а затем инкубируют в течение 15 мин при 37°С с 10 нг/мл родаминированного Та! или родаминированного ΒδΑ.

Часть А: клетки, предварительно инкубированные с буфером, инкубированные с ΒδΑ.

Часть В: клетки, предварительно инкубированные с буфером, инкубированные с Та!.

Часть С: клетки, предварительно инкубированные с моноклональными антителами СО\г49с (против α5) и СЭ29 (против β1, инкубированные с Та!.

Часть Ό: клетки, предварительно инкубированные с моноклональными антителами СЭ51 (против α_ν) и СЭ61 (против β3), инкубированные с Та!.

Часть Е: клетки, предварительно инкубированные с антителами против фактора человека VIII (контрольные антитела), инкубированные с Та!.

Фиг. 1Β. Показана способность очищенного белка Та!-су§22 (Та!22) конкурировать с трансактивирующей активностью белка Та! дикого типа, контролируемая методом са!-анализа. Клетки Н3Т1, содержащие репортерный ген ЬТВ-САТ ВИЧ-1 (ссылка 148), инкубировали с белком Та! дикого типа (100 нг), одним или в присутствии молярного избытка белка Та!-су§22 (1 мкг). Трансактивирующую активность Та! в отношении ЬТВ ВИЧ-1 и способность белка Та!-су§22 конкурировать с Та! дикого типа определяют через 48 ч после трансфекции посредством определения са!-активности в цитоплазматических экстрактах (соответствующих 200 мкг белка), как описано ранее (ссылка 41). Указывается процент (%) ацетилирования ¹⁴Схлорамфеникола.

Фиг. 2. Специфическое продуцирование 1§С против Та! у обезьян, вакцинированных белком Та!, определенное при помощи иммуноферментного анализа (ΕΜδΑ). (А) показывает результаты, полученные на двух обезьянах, инокулированных подкожно 10 или 100 мкг рекомбинантного белка Та!, ресуспендированного в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл ΚΙΒΙ. (В) показывает результаты, полученные на контрольной обезьяне (М3). Обезьян инокулировали в момент времени 0 и через 2, 5, 10, 15, 22, 27, 32 и 37 недель. Антитела против Та! оценивали также на 41 неделе у обезьяны М2, инокулированной 10 мкг белка Та!, и для обезьяны М3.

Присутствие антител против Та! в плазме вакцинированных животных оценивали методом ΕΜδΑ и характеризовали следующим образом. Белок Та! адсорбировали в ПВХ 96луночных планшетах (100 нг/лунку в 200 мкл 0,05 М карбонатного буфера, рН 9,6) в течение 12 ч при 4°С. После 3 промываний ΡΒδ 1х, не содержащим Са и Мд⁺⁺ (ΡΒδ-Α), содержащим твин 20 (0,05%), добавляли плазму, разведенную 1:50 в 200 мкл карбонатного буфера (в две лунки), и планшеты инкубировали при 37°С в течение 90'. Затем лунки промывали ΡΒδ-Α 1х с 0,05% твина, после чего добавляли 100 мкл вторичных антител (разведенных 1:1000 в ΡΒδ-Α с 0,1% твина и 1% ΒδΑ), конъюгированных с пероксидазой из хрена, (и инкубировали) в течение 90' при комнатной температуре. После 5 промываний лунок добавляли 100 мкл субстрата (ΑΒ^, 1 мМ, Αте^8Йат) в течение 30-45' при комнатной температуре. Считывание осуществляли на спектрофотометре (405 нм). Каждый ΕΜδΑ включал кроличью поликлональную сыворотку против Та! (положительный контроль), разведенную 1:200-1:6400, и предиммунную плазму (отрицательный контроль), разведенную 1:50. Предельную критическую величину вычисляли как среднее значение оптической плотности (Ο.Ό.) отрицательной плазмы обезьян + 3 стандартных отклонения (δ.Ό.), полученной во всех экспериментах с предиммунной плазмой. Приведенные результаты являются средними для двойного количества лунок. >2,7 показывает, что величина оптической плотности вышла за рамки шкалы.

Фиг. 3. Титрование антител против Та! в плазме от обезьян, инокулированных 100 (М1) и 10 (М2) мкг рекомбинантного белка Та!, описанных на фиг. 2.

ΕΜδΑ осуществляли так, как описано для фигуры 2, и анализировали плазму (при двукратном повторе) при скалярном разведении от 1:50 до 1:25600.

Величины на ординате представляют обратные величины наибольшего разведения плазмы, при котором проба все еще положительна. Предельную критическую величину вычисляли для каждого разведения и указывали как среднюю Ο.Ό. предиммунной плазмы от всех обезьян во всех экспериментах + 3 δ.Ό.

Фиг. 4. Картирование эпитопов Та!, узнаваемых 1дО против Та! от обезьян, инъецированных 100 (М1) и 10 (М2) мкг рекомбинантного белка Та!, описанным на фиг. 2. ΕΜδΑ в случае картирования эпитопов осуществляли с использованием 8 синтетических пептидов, соответствующих аминокислотам (ак) Та! 1-20, 21-40, 3650, 46-60, 52-72, 56-70, 65-80, 73-86. По 100 мкл каждого пептида (10 мкг/мл в ΡΒδ-Α с 0,1% ΒδΑ) абсорбировали на ПВХ 96-луночных планшетах в течение 12 ч при 4°С. Затем планшеты промывали и инкубировали со 100 мкл ΡΒδ-Α с 3% ΒδΑ в течение 2 ч при 37°С. После инкубации планшеты промывали ΡΒδ-Α 1х с 0,05% твина 20, и затем в каждую лунку добавляли 50 мкл плазмы, разведенной в ΡΒδ-Α с 3% ΒδΑ. Затем ΕΜδΑ продолжали так, как описано для фиг. 2. Плазму получали на 37 неделе после первичной иммунизации. Предельные критические величины, вычисленные для каждого пептида и для каждого разведения плазмы, соответствуют средним значениям оптической плотности (Ο.Ό.), полученным во всех экспериментах с предиммунной плазмой, + 3 8.Ό. (А) показывает средние результаты при разведении плазмы 1:50 для каждого пептида при двукратных испытаниях; (В) показывает титры антител в плазме в случае (А), выраженные в виде обратной величины наибольшего разведения, при котором проба все еще положительна.

Фиг. 5. Анализ специфической 1дМреакции против Та! у обезьян, инокулированных Та!, при определении методом ЕЫ8А. Трех обезьян (М1-3) инокулировали подкожно 10 мкг рекомбинантного Та!, ресуспендированного в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл Κ1ΒΙ; 3 обезьян (М4-6) инокулировали подкожно 10 мкг рекомбинантного белка Та!, ресуспендированного в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл А1ит; 2 контрольных обезьян инокулировали подкожно Κ1ΒΙ (250 мкл и 250 мкл аутологичной сыворотки) (М7) или А1ит (250 мкл и 250 мкл аутологичной сыворотки) (М8). Обезьян инокулировали в момент времени 0 и через 2, 6, 11 и 15 недель. Наличие антител исследовали на 2, 6, 11 и 15 недели. Метод ЕЬ18А описан для фиг. 2. В данном случае плазму животных анализировали (при двукратном повторе) при разведении 1:100, и в качестве вторичных антител использовали козью антиобезьянью 1дМ-сыворотку (разведенную 1:1000), конъюгированную с пероксидазой из хрена.

Предельную критическую величину вычисляли как среднюю величину (+2 δ.Ό.) Ο.Ό. предиммунной плазмы. Результаты представляют средние величины Ο.Ό. (при 405 нм) для двух лунок за вычетом величины снижения (ΑΟ.ϋ. 405).

Фиг. 6. Анализ специфического продуцирования 1дО против Та! у обезьян, инокулированных Та!, при испытании методом ЕЬ18А. Трех обезьян (М1-3) инокулировали 10 мкг рекомбинантного Та!, ресуспендированного в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл Κ1ΒΙ; 3 обезьян (М4-6) инокулировали 10 мкг рекомбинантного Та!, ресуспендированного в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл А1ит; двух контрольных обезьян инокулировали ΚΤΒΙ (250 мкл и 250 мкл аутологичной сыворотки) (М7) или А1ит (250 мкл и 250 мкл аутологичной сыворотки) (М8). Обезьян инокулировали в момент времени 0 и через 2, 6, 11, 15, 21, 28 и 32 недели. На 36 неделе обезьян М1-М6 инокулировали 16 мкг белка Та!, ресуспендированного в 200 мкл 18СОМ и 300 мл ΡΒ8. Антитела определяли также на 40 и 44 недели. Метод ЕЫ8А и определение предельной критической величины описаны в случае фиг. 2. Приведенные результаты относятся к образцам, разведенным 1:50. >2,7 показывает, что величина Ο.Ό. выходит за рамки шкалы.

Фиг. 7. Титрование антител против Та! в плазме от обезьян, инокулированных рекомбинантным Та! (10 мкг) в присутствии ΚΙΒΙ (М1-3) или А1ит (М4-6), описание к фиг. 6. Для каждой плазмы результаты приводятся в виде величин, обратных наибольшему разведению сыворотки, при котором проба все еще положительна.

Фиг. 8. Эпитопы Та!, узнаваемые ΙβΟ против Та! от обезьян, инокулированных рекомбинантным Та! (10 мкг) в присутствии ΚΤΒΙ (М1М3) или А1ит (М4-М6), описание к фиг. 6. Плазму получали на 21 неделе после первичной иммунизации. Метод ЕЫ8А и определение предельной критической величины описаны в случае фиг. 4. Результаты в части (А) относятся к образцам, разведенным 1:50, и являются средними результатами, полученными в лунках при двукратном повторе. Результаты на части (В) относятся к титрованию плазмы, часть (А), и выражены в виде обратной величины наибольшего разведения плазмы, при котором проба все еще положительна.

Фиг. 9. Анализ Та!-специфических СТЬ. Анализ осуществляли так, как описано в табл. 5. Приводятся данные, являющиеся примером состояния на 36-ой неделе для обезьяны М1, получившей подкожно инъекцию 10 мкг Та! и ΚΤΒΙ, как описано в случае фиг. 6. Квадраты (контроль) соответствуют клеткам, инкубированным с клетками-мишенями ΒΕΤΕ; ромбы соответствуют клеткам, инкубированным с клеткамимишенями ΒΕίΤ с добавлением Та! (1 мкг на 250000 клеток).

Фиг. 10. Анализ реакции замедленной гиперчувствительности к Та! методом кожной пробы. Белок Та! (5, 1 и 0,2 мкг), ресуспендированный в 150 мкл ΡΒ8, содержащего 0,1% Β8А, или буфер, в котором ресуспендировали Та!, сразу же инокулировали (ί.ά.) в обритый участок спины животного. Этот участок фотографировали в момент времени 0 и через 24, 48 и 72 ч.

Контрольных обезьян инокулировали только буфером. Приводятся результаты для обезьяны М2 (15 неделя), инокулированной 10 мкг Та! и Κ1ΒΙ, как описано в случае фиг. 6. Положительная реакция на Та! была явной через 48 ч после кожной пробы.

Фиг. 11. Гуморальная ΙβΟ-реакция на Та! у одной обезьяны (М1), инокулированной ί.ά. 200 мкг плазмиды рСУ-Та!, ресуспендированной в 150 мкл ΡΒδ-А, в два места вблизи подмышечных лимфоузлов; одной обезьяне (М2) давали инъекцию 500 мкг рСУ-Та!, ресуспендированной в 250 мкл ΡΒδ-А, внутримышечно, в два места на спине; контрольную обезьяну (М3) не инокулировали ДНК Та!, но проводили, как специфический контроль, повторные кожные пробы с Та!. Обезьянам инъецировали рСУ-Та! в момент времени 0 и через 5, 10, 15, 22, 27, 32 и 37 недель. Наконец, через 42 недели, обезьянам давали повторную инъекцию рекомбинантного белка Та! (16 мкг), ресуспендированного в 200 мкл IδСΟМ и 300 мкл ΡΒδ. Антитела оценивали на 2, 5, 10, 15, 22, 27, 32, 37, 42, 48 и 58 недели. Образование антител против Та! в плазме (разведенной 1:50) анализировали методом ЕЕ-ΙδΛ так, как описано в случае фиг. 2. Результаты представляют средние величины ΘΌ для лунок при двукратном повторе. (А) представляет результаты, полученные на двух обезьянах, вакцинированных 200 (М1) и 500 (М2) мкг плазмиды рСУ-Та! (В) представляет результаты, полученные для контрольной обезьяны (М3).

Фиг. 12. Титрование антител против Та! в плазме от обезьяны М2, инокулированной ί.ά. 200 мкг рСУ-Та!. Метод ЕЫ8А описан для фиг. 2. Результаты на ординате выражены в виде величин, обратных наибольшему разведению, при котором проба все еще положительна.

Фиг. 13. Анализ продуцирования 1дС против Та! у трех обезьян (М9-М11), инокулированных 1 мг рСУ-Та!, и у одной контрольной обезьяны (М12), инокулированной 1 мг контрольного вектора рСУ-О. ДНК ресуспендировали в 1 мл РВ8-А и вводили внутримышечно в два места на спине. Обезьян инокулировали в момент времени 0 и через 6, 11, 15, 21, 28 и 32 недели. На 36-ой неделе обезьянам М9-М11 давали повторную инъекцию 16 мкг рекомбинантного белка Та!, ресуспендированного в 200 мкл 18СОМ и 300 мкл РВ8. Присутствие антител против Та! оценивали на 2, 6, 11, 15, 21, 28, 32, 36, 40 и 44 недели. ЕБ18А и определение предельной критической величины описаны в случае фиг. 2.

Фиг. 14. Кинетика пролиферативной реакции РВМС от Масаса Га5сюи1ап5 на костимуляцию моноклональными антителами против СЭ3 и против С.П28 на парамагнитных гранулах (анти-СО3/28 гранулы). РВМС извлекали из СЭ8положительной субпопуляции иммуномагнитными методами. Впоследствии половину извлеченных лимфоцитов против СЭ8 стимулировали РНА и 1Ь-2 (40 Е/мл), начиная с 3 дня; оставшуюся часть оставляли прилипать к антителам, нанесенным на анти-С'П3/28 гранулы, причем таким образом получали обедненную СП8 и СЭ3/28-положительную популяцию лимфоцитов. К этой клеточной фракции добавляли 1Ь-2 (40 Е/мл), начиная с 10 дня культивирования. Клетки считали и определяли их жизнеспособность каждые 2-3 дня. Соотношение гранулы:клетки поддерживали постоянным. Приводится число клеток в разные моменты времени.

Фиг. 15. Антивирусное действие костимуляции с анти-СЭ.3/28 гранулами на РВМС от Масаса Га5сюи1ап5. Обедненные СП8 и обедненные СП8 СП3+/СЭ28+ лимфоциты, полученные от 4 обезьян (фиг. 15Α-15Ό) методами, описанными в случае фиг. 14, стимулировали так, как описано в примере 7. Две фракции инфицировали ίη νί!το в день 0 0,1 М.О.1. 81Утас251/63М. Стимуляцию осуществляли с РНА и 1Ь-2, добавленными позднее в день 3, и с анти-СЭ.3/28 гранулами без добавления экзогенного 1Ь-2. Вирусные продукты оценивали посредством определения количества р27 (нг/мл) в клеточных супернатантах в дни 6 и 12 после заражения так, как описано в примере 7. (На светло-сером поле РНА⁺1Ь^-2, на темносером поле анти-СЭ.3/28 гранулы на РВМС СЭ8/СЭ3'/СЭ28').

Фиг. 16. Функциональная характеристика дендритных клеток (ЭС), полученных из периферической крови обезьяны. (А) Введение ³Нтимидина в день 4 выращивания аллогенных смешанных лейкоцитов (АМБР) для сравнения антигенпредставляющей функции (АРС, определенной в виде индукции пролиферации аллогенных Т-клеток) ЭС и макрофагов (М0), полученных из РВМС Масаса Га8с1си1ап8, после разделения в градиенте перколла и прилипания к пластику. Неприлипшие клетки удаляли, а прилипшие клетки индуцировали к созреванию до ЭС посредством добавления СМС8Б (200 нг/мл) и 1Ь-4 (200 единиц на мл) каждые 3 дня. Половину культуральной среды (ЕРМ1, 10% БС8) удаляли и заменяли свежей средой каждые 3 дня. Через 6-7 дней наблюдали морфологические изменения цитокининдуцированных клеток, которые приобретали свойства типичного фенотипа СО (утрата адгезии, образование кластеров, отпечатки пальцев), подтвержденные также посредством определения типичных мембранных маркеров (данные не приводятся). Моноциты не были цитокининдуцированными и выращивались в той же среде, которую заменяли каждые 3 дня. Клетки сохраняли свойства моноцитов-макрофагов, такие как адгезия. В день 7 обе клеточные популяции заражали Тлимфоцитами из крови донора-человека, очищенными методом градиента фиколла и перколла и посредством прилипания и последующего замораживания. Анализы пролиферации клеток осуществляли в 48-луночном планшете. Стимулировали 5000 ОС или М0 (отношение Т:АРС = 100:1) 500000 Т-лимфоцитов. Культивирование поддерживали в течение 4 суток, и фиксированные аликвоты клеточной суспензии переносили в 96-луночные планшеты при трехкратном повторе. Затем в течение 16 ч добавляли 1 мкКи ³Н-тимидина, и с помощью счетчика β-частиц определяли число импульсов в минуту (чим) введенного предшественника.

(В) АРС, такие как ОС и М0, полученные так, как описано в случае фиг. 16 А, заражали Тлимфоцитами от другой обезьяны, полученными так, как описано выше в случае донорачеловека. Более высокая способность представлять антиген является типичным свойством ОС при сравнении с М0. К Т-лимфоцитам добавляют АРС в скалярных концентрациях, для того, чтобы оценить пролиферативные реакции при разных соотношениях Т:АРС (ОС или М0).

Приведенные далее примеры следует рассматривать как иллюстративные и не ограничивающие объем изобретения.

Пример 1. Экспрессия, очистка и характеризация белка Та! дикого типа (изолят ΙΙΙΒ), мутированных белков Та! и пептидов Та! дикого типа.

В прошлом встречалось много трудностей при очистке и сохранении биологической активности белка Та! вследствие легкости окисления, агрегации и потери активности. Это происходит из-за большого количества цистеиновых остатков, которые могут образовывать внутри- и межмолекулярные связи, изменяя, таким образом, конформацию нативного белка (ссылки 159, 41). Для экспрессии белка в Е. сой использовали кДНК или ген 1а1 (поел. 1, пример 2), клонированные в векторе рЬ-куи, предоставленном Эг.ТЕ. ЭсБатаПсг и В. А 11с! (С1ахо ΙηδΙίΙιιΙο Бог Мо1еси1аг Вю1оду 8.А., Сппсуга. δνίζζοη).

Для того, чтобы достичь эффективной иммунизации Та! с целью получения вакцины, изобретатель считает основным получение биологически активного белка Та! так, как описано в разделе Подробное описание изобретения. Поэтому в способах получения и очистки Та!, описанных в данном примере и в последующих примерах 1В, 2 и 3, описываются необходимые процедуры и методы контроля для получения биологически активного белка Та!, который является эффективным иммуногеном для защиты от ВИЧ-инфекции, СПИДа или от развития связанных с ВИЧ заболеваний.

Первый способ, который авторы изобретения использовали для получения активного белка, основан на последовательных стадиях жидкостной хроматографии высокого давления и жидкостной и ионообменной хроматографии (ссылки 15, 41). Белок, полученный такими способами, имеет чистоту свыше 95% и является активным (ссылки 41, 42).

Однако не получилось хорошего воспроизведения от партии к партии вследствие окисления белка, которое представляет основную проблему при промышленном получении Та!. Благодаря наблюдениям, что основная область белка Та! обладает сильной аффинностью к гепарину и что гепарин предотвращает его окисление, авторы изобретения использовали гепаринаффинную хроматографию и составили новый протокол очистки Та!, как описано в Сйаид с! аБ (ссылка 26). Клетки (масса 10 г) Е. сой, экспрессирующие Та!, обрабатывали ультразвуком в 40 мл буфера для лизиса (20 мМ динатрийфосфата, рН 7,8; 2,5% глицерина; 0,2 мМ РМ8Б; 5 мМ ЭТТ: 50 мМ маннита; 10 мМ аскорбиновой кислоты; 500 мМ №С1) с использованием жидкостной ультразвуковой установки (модель ХЕ2020, Нса! 8у5!ст 1ис) с тремя разрядами, каждый по 20 с. Лизат центрифугировали при 12000 д в течение 30 мин, и супернатант инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре с 2 мл гепаринсефарозной смолы, предварительно промытой буфером для лизиса. Смолу загружали в стеклянную колонку и промывали буфером для лизиса до тех пор, пока в промывочной среде обнаружить белок не удавалось. Связанный материал элюировали буфером для лизиса, содержащим 2М №1С1. и элюат собирали в фракции по 1 мл. Однородность элюированного белка анализировали методом гельэлектрофореза (δϋδ-РАСЕ). Очищенный белок хранили в лиофилизованном виде при -70°С и перед применением ресуспендировали в обезгаженном буфере.

Биологическую активность очищенного белка Та!, согласно указанной выше схеме, оценивали анализом методом спасения вирусной инфекции в клетках НМЕ-1, полученных из клеток НеЕА-СО4+ , содержащих провирус, дефектный по гену 1а1. полученных и описанных в 8асЕнс с! а1. (ссылка 140). Анализ методом спасения вирусной инфекции, описанный Еикой с! аБ (ссылка 41), заключался в комплементации отсутствия экспрессии Та! в клетках НЕМ-1 (2 х 10⁵) путем добавления экзогенного белка Та! (2 мкг/мл) и путем оценки репликации вируса посредством определения антигена р24, секретированного в культуральную среду через 48 ч после добавления экзогенного Та!, с помощью коммерческих наборов. Результаты экспериментов со спасением, приведенные Сйаид с! а1. (ссылка 26), показывают, что белок Та!, очищенный данным способом, является активным, и что этот способ очистки лучше, проще и дешевле, как в смысле чистоты, так и биологической активности Та!, по сравнению с описанными ранее способами (ссылки 40, 41, 42).

Различными препаратами рекомбинантного Та!, очищенного так, как описано выше, инокулировали в присутствии адъюванта Фрейнда мышей и кроликов, в соответствии со стандартными протоколами (ссылка 4). Результаты по образованию антител, индуцированному иммунизацией, приводятся в табл. 1.

Таблица 1. Анализ образования специфических антител против Та! в сыворотках мышей и кроликов, иммунизированных рекомбинантным Та!

Антитела

против Тае	ОЦ-ЕЫ8А/Га1	Вестерн блоттинг
1:500	1:1000	1:2000
Кролик	0.651	0.400	0.175	+
Мышь	0.502	0.240	0.150	+

Рекомбинантный белок Та!, продуцированный в Е. сой, использовали для иммунизации мышей и кроликов в соответствии со стандартными протоколами иммунизации (ссылка 4). Сыворотки иммунизированных животных анализировали методом ΕΕΙδΑ на наличие антител против Та!, используя три разведения сыворотки (1:500 - 1:2000). Результаты являются средним из результатов считывания при 405 нм для двух кроликов и трех мышей. Кроме того, сыворотки проверяли методом Вестерн-блоттинга с рекомбинантным белком Та! (100 иг).

Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что рекомбинантный Та!, полученный авторами изобретения, способен индуцировать образование антител у обоих видов животных, при испытаниях методами ЕЫ8А и Вестернблоттинга, при котором используется рекомбинатный Та!. Такие антитела были способны ингибировать интернализацию и биологическую активность Та! (ссылки 40, 41, 42). Вектор рЬзуп и схема очистки белка Та! используются для экспрессии и очистки мутантов Та!, описанных в примере 2. Биологическую активность мутированных и очищенных белков Та! измеряют при помощи анализов спасения вирусной инфекции в клетках НЬМ-1, анализов пролиферации клеток К 8 и ίη νίνο на мышах, как описано выше для белка Та! дикого типа. Кроме того, мутированные белки Та! проверяют в присутствии Та! дикого типа (при серийных концентрациях) для подтверждения отрицательного трансдоминантного действия на репликацию вируса. Вектор рЬ-зуп и схему очистки белка Та! используют для экспрессии и очистки составных белков такого типа: Та! (дикого типа или его мутанты) ЛЬ-2 или Та! (дикого типа или его мутанты) ЛЬ-15 или их части, или Та! (дикого типа или его мутанты)/другие молекулы (или их части), способных усиливать иммунную реакцию на один Та! или связанный с другими вирусными продуктами. Составные рекомбинантные молекулы получают посредством использования последовательностей и праймеров, описанных в примерах 2 и 3. Как альтернативу, в качестве иммуногенов используют синтетические пептиды, соответствующие областям Та! или других вирусных продуктов или цитокинов, используемые в сочетании с Та!. Ниже перечислены пептидные последовательности Та!.

Пептид	1.	МЕРУПРКЬЕРИКНРСЗОРКТ	8Е0.	ΙΟ. ΝΟ.	11
Пептид	2.	АСТИСУСККССЕНСОУСПТ	8Ζ0.	Ιϋ.	ΝΟ.	12
Пептид	3.	0νθΡΙΤΚΑΙΛ3Ι8ΥΘΒΚ	8Е0.	Ιϋ.	ΝΟ.	13
Пептид	4.	зускккякоккнрро	8Е0.	ΙΟ.	ΝΟ.	14
Пептид	5.	КРР0С50ТН0У5ЬЗК0	5Е0.	Ιϋ. ΝΟ.	15
Пептид	6.	НОУЗЬЗКОРТЗОЗКОО	8Е0.	ΙΏ.	ΝΟ.	16
Пептид	7.	ртзозкепрторкЕ	8Е0.	ΙΟ. ΝΟ.	17

Пептиды мутантов Та! будут содержать те же замены аминокислот мутированных белков Та!, какие описаны в примере 2. Пептиды будут использоваться в сочетании с пептидом, представляющим универсальный Т-хелперный эпитоп столбнячного анатоксина, или другими пептидами, представляющими Т-хелперные эпитопы (ссылка 77).

Пример 1А. Поглощение пикомолярных концентраций (10-100 нг/мл) биологически активного Та! активированными эндотелиальными клетками опосредуется интегриновыми рецепторами.

Когда нормальные эндотелиальные клетки активируют ίη νίΐτο цитокинами воспалительного инфильтрата, они становятся чувствительны ми к воздействию внеклеточного Та!, и это происходит вследствие индукции интегринов α₅βι и α_νβ₃ (ссылки 9, 10). Подобным образом, цитокины воспалительного инфильтрата (1С) или БЕСЕ увеличивают экспрессию интегрина на эндотелиальных клетках ίη νίνο, и это обстоятельство приводит к синергичному промотированию К8, когда биологически активный Та! инокулируют мышам одновременно с ЬЕСЕ или после него (ссылка 42). Кроме того, 1Сактивированные эндотелиальные клетки приобретают функцию АРС.

В данном примере демонстрируется, что эндотелиальные клетки, активированные 1С, эффективнее поглощают родаминированный биологически активный белок Та!, и что это явление опосредуется интегриновыми рецепторами.

Из-за сложностей при наблюдении интернализации очень малых концентраций немеченного Та! белок метили родамином (ссылка 98). Родаминированный Та! все еще демонстрировал активацию пролиферации клеток К 8 в том же интервале концентраций, что и немеченный Та!, что указывает, что процедура мечения не угрожала его биологической функции. Эксперименты по поглощению Та! осуществляли следующим образом: клетки пупочной вены человека (НИУЕ) выращивали и обрабатывали 1С в течение 5 дней так, как описано ранее (ссылки 9, 4 6). Затем клетки обрабатывали трипсином, высевали в 8-луночные планшеты (Νιιηο 1пс., Напервиль, Иллинойс) в количестве 0,5 х 10⁵ клеток на лунку и инкубировали в течение 18 ч в среде, содержащей 15% сыворотки плода коровы (ЕВ8), в присутствии 1С. Добавляли бессывороточную среду (8Е, ΚΡΜΙ, 1% В8А, 0,1% антибиотиков, фунгизон), и планшеты предварительно инкубировали в течение 2 ч при 4°С. К клеткам добавляли свежую среду, содержащую серийное разведение роламинированного Та!, и клетки инкубировали при 37°С в течение указанного времени. Отрицательным контролем служил родаминированный В8А в том же буфере, что и Та!. Клетки фиксировали в охлажденной льдом смеси ацетона и метанола (1:1), и поглощение и локализацию Та! визуализировали и фотографировали с использованием флуоресцентной микроскопии. Результаты оценивали посредством сравнения с флуоресценцией образцов с отрицательным контролем, и поглощение выражали количественно по шкале от 0 до ++++, не зная предварительно кода образца.

Для того, чтобы исследовать пути, по которым Та! поглощается активированными эндотелиальными клетками, осуществляли эксперименты с использованием активированных клеток НИУЕ с экзогенным Та! в широком интервале концентраций, которые использовались ранее для индукции роста клеток НиУЕ или К8 (10-50 нг/мл), или трансактивации ВИЧ-1 по средством добавления белка к клеткам, содержащим промотор ВИЧ-1 или провирус (0,5-1 мкг/мл).

В этих экспериментах для согласования с экспериментами по ингибированию поглощения (см. ниже) клетки предварительно инкубировали при 4°С в течение 2 ч со средой, лишенной фетальной телячьей сыворотки. Предварительная инкубация не влияет на последующее поглощение родаминированного Та!.

С роламинированным Та! поглощение и транслокация белка в ядре или ядрах активированных клеток НИУЕ становится явной в пределах 15-минутной инкубации с таким небольшим количеством родаминированного Та!, как 10 нг/мл. Плотность поглощенного Та! в клетках возрастала в зависимости от дозы и в зависимости от времени. Родаминированный Та! или буфер не показывали сигналов, и привычно использовались в качестве отрицательного контроля.

Для того, чтобы определить, опосредуется ли поглощение Та! активированными клетками ИИУЕ теми же интегринами, которые, как обнаружено, экспрессировались на клетках КЗ. эксперименты по ингибированию осуществляли посредством предварительной инкубации 1Сактивированных эндотелиальных клеток с немеченным Та! (конкурент), физиологическими лигандами для этих рецепторов, такими как фибронектин (ΕΝ) или витронектин (ΥΝ), или посредством предварительной инкубации клеток с моноклональными антителами против ШЖ-связывающих участков рецепторов α₅βι и α_νβ₃. Вот краткое описание эксперимента. После высевания на 8-луночные планшеты клетки НиУЕ инкубировали со средой, содержащей 15% ЕВ8, в течение 18 ч, а затем инкубировали со средой 8Е, содержащей немеченный Та! (немеченный конкурент) (табл. ΙΑ), ΕΝ, ΥΝ (табл. 1В) или моноклональные антитела против К.СЖсвязывающей последовательности ΕΝ- или ΥΝрецепторов (α₅β! и α_νβ₃, соответственно), или моноклональные антитела против человеческого фактора VIII (контрольные антитела) (фиг. 1А), в течение 2 ч при 4°С. Затем клетки инкубировали с родаминированным Та! в течение указанного времени. Контрольные клетки обрабатывали одной средой 8Е в течение 2 ч при 4°С и инкубировали с родаминированным В 8 А. Клетки фиксировали, визуализировали и фотографировали, и результаты представляли в значениях по шкале, указанной выше.

Таблица 1 А. Ингибирование поглощения 100 нг/мл и 1 мкг/мл родаминированного Та! активированными цитокином клетками НиУЕ посредством предварительной инкубации клеток с 1 мкг/мл немеченного Та!^а

Предварительная инкубация	Родаминированный Та!	Поглощение Та1
Бессывороточная среда	100 нг/мл	+-Н-
1 мкг/мл немеченного Та!	100 нг/мл	+/-
Бессыовороточная среда	1 мкг/мл	++++
1 мкг/мл немеченного Та!	1 мкг/мл	+/-

^а Клетки НиУЕ выращивали так, как описано ранее (ссылка 40). 1С получали из трансформированных Т-лимфотрофным вирусом человека типа II (НТЕУ-П) (СО4⁺)-Т-клеток или стимулированных фито гемагглютинином Тклеток, и использовали супернатанты (1:8) для активации клеток НиУЕ (пассаж 8-14) в течение 5 суток, как описано ранее (ссылки 9, 46). Такой супернатант содержит интерлейкин-1а (1Ь-1а) и -β (1Б-1 β). фактор некроза опухоли α (ΤΝΡ-α) и -β (ΤΝΡ-β) и интерферон-γ (ΙΕΝ-γ) (ссылка 9).

Белок Та! родаминировали по остаткам лизина, по существу, так, как описано ранее (ссылка 98). Коротко, 50 мкг рекомбинантного Та! (2 мг/мл) приводили к рН 9,0 посредством добавления 2,5 мкл 1М раствора Νη₂ΤΌ₃. Добавляли 2,5 мкл раствора ТШТС в диметилсульфоксиде (ДМСО) (1 мг/мл), и проводили реакцию в течение 8 ч при 4°С. Непрореагировавший ТШТС гасили посредством добавления 2,5 мкл 0,5 М раствора ΝΗ₄Ο. снижали рН до 7,0, используя 1М НС1, и родаминированный Та! диализовали против двух замен 50 мМ трисНС1, рН 7,0, 1 мМ дитиотрейтола (ЭТТ) для удаления погашенного ТШТС. В качестве отрицательного контроля использовали В8А или РВЗ, родаминированные таким же способом. Родаминированный Та! проверяли на активность при росте клеток СПИД-КЗ. как описано, чтобы убедиться, что биологическая активность сохранилась (ссылка 40). Клетки НИУЕ предварительно инкубировали в течение 2 ч с бессывороточной средой или 1 мкг/мл немеченного Та! в бессывороточной среде, инкубировали со 100 нг/мл или 1 мкг/мл родаминированного Та! в течение 60 мин, и визуализировали поглощение Та! с помощью флуоресцентной микроскопии. Отрицательный контроль (поглощение +/-) предварительно инкубировали с бессывороточной средой, а затем инкубировали с родаминированным В ЗА.

Таблица 1В. Ингибирование поглощения 10 нг/мл родаминированного Та! клетками НиУЕ, активированными цитокином, посредством предварительной инкубации клеток с избытком ΕΝ или У№

Предварительная инкубация	Поглощение родаминированного Та!
Бессывороточная среда	++++
100 нг/мл ΡΝ	+/-
100 нг/мл ΥΝ	+/-

^а Клетки НиУЕ предварительно инкубировали в течение 2 ч с бессывороточной средой или ΕΝ или νΝ в бессывороточной среде, инкубировали с 10 нг/мл родаминированного Та! в течение 60 мин, и поглощение Та! визуализировали методом флуоресцентной микроскопии. Отрицательный контроль (поглощение +/-) предварительно инкубировали с бессывороточной средой, а затем инкубировали с родаминированным В § А.

Поглощение Та! ингибировалось немеченным Та! (табл. ΙΑ), ΡΝ или νΝ (табл. 1В) или предварительной обработкой клеток моноклональными антителами против ВСЭсвязывающих областей как ΡΝ-рецептора α₅βι, так и νΝ-рецептора α_νβ₃ (фиг. 1А).

Интенсивность флуоресценции в клетках снижалась до уровней, наблюдаемых с отрицательным контролем, и никакого ингибирования не наблюдалось при предварительной инкубации клеток с моноклональными антителами против фактора VIII человека, используемого в качестве отрицательного контроля, что указывает, что ингибирование было специфическим (фиг. 1А).

Поглощение и ядерная локализация 100 нг/мл Та! ингибировались путем предварительной инкубации клеток с моноклональными антителами против ЯСЮ-связываюгцих областей как рецептора α₅βι, так и рецептора α_νβ₃. Однако в обоих случаях ингибирование было неполным. Эти результаты показывают, что поглощение пикомолярных концентраций Та! опосредуется теми же интегринами, которые участвуют в адгезии клеток к Та! (ссылка 10). Однако при более высоких концентрациях внеклеточного Та! (таких как >100 нг/мл) за поглощение некоторой части белка ответственен путь без посредничесва интегринов.

В противоположность этим результатам, показано, что поглощение иодированного Та! линиями лимфоцитов и эпителиальных клеток является линейным и зависит от концентрации Та! в среде, и избыток немеченного Та! составлял ему слабую конкуренцию или не составлял таковой, что указывает на отсутствие участия в процессе рецепторов (ссылка 98). Однако интервал концентраций Та! в среде при этом исследовании составлял приблизительно 1-100 мкг/мл (ссылка 98) - значительно выше, чем необходимо для наблюдения поглощения Та! клетками, чувствительными к его биологической активности, такими как активированные первичные эндотелиальные клетки. Кроме того, иодирование Та! может усложнить его строение и затруднить поглощение клетками, и авторы этой работы не приводят данных по биологической активности иодированного Та!.

Эти результаты, являющиеся неопубликованными, показывают, что поглощение Та! происходит, по меньшей мере, двумя путями, в зависимости от концентрации белка. При низких (10-100 нг/мл) концентрациях Та! его поглощение опосредуется рецепторами α₅β! и α_νβ₃ через взаимодействие с последовательностью КСЮ белка, в то время как при более высоких концентрациях внеклеточного Та! более важен интегриннезависимый путь. Интегринопосредованное поглощение пикомолярных концентраций Та! 1С-активированными эндотелиальными клетками показывает, что полностью активный белок способен проникать в антигенпредставляющие клетки, такие как активированные эндотелиальные клетки и дентдритные клетки, что инициирует иммунную реакцию.

Пример 2. Конструирование и характеризация мутированных генов !а!.

Авторы изобретения получили 19 мутантов в различных участках Та! посредством сайтспецифического мутагенеза или посредством делеции. Последовательность каждой мутированной ДНК проверяли путем секвенирования. кДНК мутированных генов !а! клонировали в сайт РЧ1 вектора рСУО, описанный в примере 3. Каждый мутант котрансфицировали, как описано Εηδοίί е! а1. (ссылка 41), в клетки СО8-1 или в линию Т-клеток Юрката, плазмидой ЬТК-САТ ВИЧ-1, в которой репортерный ген С АТ контролируется ЬТК ВИЧ-1. Неопубликованные результаты этих экспериментов приводятся в табл. 2.

Таблица 2. Действие мутантов Та! на трансактивацию ЬТКСАТ ВИЧ-1 и блокирующее действие (отрицательная трансдоминанта) в отношении активности Та! дикого типа

МУТАНТЫ Трянсактивирующяя	Трансдоминантная
активность ^а	активность¹*
	(% ингибирования)
средн.(слож-) (мин-макс в-ны)	средн.

СУЗ 22	0.09	(0.021-0.22)	21
ТНК 23	0.36	(0.16-1)
ТНК23А	0.30	(0.16-0.78)
Α3Ν24	0.34	(0.34-0.82)
Α3Ν24Α	0.42	(0.45-0.95)
ТУК 26	0.14	(0.08-0.19)
ЬУЗ 28/29	0.52	(0.19-1.04)
СУЗ 30	0.30	(0.045-0.65)
СУЗ 31	0.60	(0.27-1.09)
РНЕ 32	0.31	(0.077-0.097)
ЬУЗ 33	0.04	(0.0027-0.068)	46
оьизэ	0.31	(0.19-0.43)
РНЕ 38	0.05	(0.043-.057)	98
ЬУЗ 41	0.04	(0.025-0.061)	97
ТУК 47	0.58	(0.31-0.8)
57 А	0.35	(0.26-0.44)
ТАТ-КСЮ	0.94	(0.73-1.15)
ТАТ-КОЕ	1.11	(0.67-1.49)
ТАТ такого типа	1	1

^а Результаты приводятся как инкремент активации величин САТ-активности, индуцированной Та! дикого типа (слож. = 1).

^ь Результаты выражены как процент (%) ингибирования активности Та! дикого типа.

Из результатов, представленных в табл.2, очевидно, что для большинства мутантов трансактивирующее действие ЬТК. ВИЧ-1 снижено или отсутствует, за исключением мутанта ЯСЮ, который имел активность, схожую с активностью Та! дикого типа. Авторы выбрали 4 мутанта (су§22, 1у§33, рйе38, 1ук41) с наименьшей (почти нулевой) трансактивирующей активностью и определили отрицательное трансдоминирующее действие на трансактивирующую активность Та! дикого типа. Для этого клетки СО8-1 котрансфицировали каждым вектором, содержащим мутант Та! и вектор рСУ-Та! (в молярном соотношении 10:1), в присутствии вектора ЬТК-САТ ВИЧ-1. Как видно из табл.2, мутанты 1у§41 и !уг47 ингибировали активность Та! почти полностью, в то время как мутанты 1у5.33 и су§22 ингибировали активность Та! частично. Однако рекомбинантный белок су§22 (описанный далее в примере 3) конкурирует с белком Та! дикого типа в отношении трансактивации ЬТК-САТ ВИЧ-1 (фиг. 1В). Были отобраны мутант в цистеиновой области (су§22), мутант в коровой области (1у§41), мутант с делецией последовательности Ш) (ΚΟΌΔ) и двойной мутант, содержащий мутацию по 1у§41 и делению последовательности ВСЮ (1у§41-ΒΟΌΔ).

Последовательности вставки !а! и мутантов, отобранных для вакцинации, приводятся далее. Описывается ряд мутантов, полученных путем 1) замены основания для получения замены аминокислоты и 2) делеции основания для получения делеции соответствующих аминокислот. Замены и делеции получали путем направленного мутагенеза. Последовательности гена !а! дикого типа и мутантов гена !а!, приведенные далее, встраивали в плазмидный вектор рСУО так, как описано выше.

Под 8 Ε(β ГО N 1 подразумевается последовательность гена !а! ВИЧ-1 из клона ВН-10 и его производный белок. Под 8ЕО ГО N 2 подразумевается последовательность мутанта су§22 (и его производный белок), создаваемого посредством замены нуклеотида тимина (Т) в позиции 66, начиная от 5'-конца, на нуклеотид гуанин (С). Эта замена приводит, в полученной аминокислотной последовательности, к замене цистеина (С в однобуквенном коде) в позиции 22 в аминоконце на глицин (С в однобуквенном коде). Под 8Εζ) ГО N 3 подразумевается последовательность мутанта 1x841 (и его производный белок), создаваемого посредством замены нуклеотида тимина (Т) в позиции 123 от 5'-конца на нуклеотид цитозин (С). Эта замена приводит, в полученной аминокислотной последовательности, к замене лизина (К в однобуквенном коде) в позиции 41 от амино конца на треонин (Т в однобуквенном коде). Под 8Εζ) ГО N 4 подразумевается последовательность мутанта КСЮ (и его производный белок), создаваемого посредством делеции из гена !а! дикого типа нуклеотидной последовательности ССАССССАС от нуклеотида 232 до нуклеотида 240, начиная от 5'конца. Это приводит к делеции аминокислот аргинина, глицина и аспарагиновой кислоты (КСЮ в однобуквенном коде) в позициях 78-80 от аминоконца. Под 8ЕО ГО N 5 подразумевается последовательность двойного мутанта 1у§41

ΚΟΌΔ (и его производный белок), создаваемого посредством сочетания описанных выше мутантов.

Нуклеотидная последовательность 1а1 дикого типа 8ЕЦ. ΐά. ΝΟ. 1

5' АТООАСССАОТАОАТССТАОАСТАСАССССТООААОСАТССАССААОТСАОССТААААСТ (ЗСТТаТАССААТТССТАТТСТАААААСТСТТССТТТСАТТаССААСТТТаТТТСАТААСААА АСССТТАООСАТСТССТАТСОСАеОААОААОСаСАСАСАаСОАСбААвАССТССТСААООСА СТСАСАСТСАТСААСТТТСТСТАТСАААОСАССССАССТСССААТСССеАСЮСЮАССССАСА ООСССОААСОААТАО 3'

Аминокислотная последовательность 8Е0. ГО. ΝΟ. 2

Ш2-МЕ₽УЮР1О,Е₽ИКНРС50РКТАСТКСУСККССГНС0УСГ1ТКАЬ(3 15УеККККК0ККНРР(2О30ТН0У8ЬЗК0РТ503КОПРТСРКЕ-СООН

Нуклеотидная последовательность мутанта Сув22 ЗЕО. ГО. ΝΟ. 3

5' АТССАСССАСТАОАТССТАСАСТАОАССССТСОААеСАТССАООААаТСАСССТААААСТ

ОСТвОТАССААТТОСТАЧТОТАААААСТОТТОСТТТСАТТОССААСТТТеТТТСАТААСААА АСССТТАСССАТСТССТАТОССАСвААСААОСОСАОАСАОСОАССААеАССТССТСААСССА СТСАСАСТСАТСААСТТТСТСТАТСАААОСАССССАССТСССААТССССАООООАСССОАСА (ЗСССССААООААТАе 3'

Аминокислотная последовательность 8Е0. ГО. N0. 7

ЫН2-МЕРУПРМ.ЕРИКН₽<330₽КТАвТМСУСККСС?НС07СР1ТКА

ЬОХЗУСКККККОКККРРОСЗОТНОУЗЬЗКОРТЗОЗКООРТОРКЕ-СООН

Нуклеотидная последовательность мутанта Ьув41 8Е0. го. N0. 4

5' АТОСАЗССАОТАСАТССТАСАСТАСАОСССТООААОСАТССАССААСТСАСССТААААСТ

ОСТТСТАССААТТОСТАТТОТАААААОТСТТОСТТТСАТТСССААОТТТОТТТСАТААСААА СаССТТАОССАТСТССТАТООСАООААСААОСОСАОАСАОССАСОААСАССТССТСААСОСА СТСАСАСТСАТСААСТТТСТСТАТСАААаСАОСССАССТСССААТСССОАеООСАССССАСА

ООСССбААССААТАС 3'

Аминокислотная последовательность 8Εζ}. го. N0. 8

ЫН2-МЕРУПРКЪЕРИКНРО30РКТАСТНСУСККССРНС0УСР1ТТАЪе 13УСККККК0КВКРР(2С30ТН0У8Ь8К0РТ303НвОРТ(ЗРКЕ-СООН

Нуклеотидная последовательность мутанта Η<3ϋΔ 8Е0. ГО. N0. 5

5' АТСОАСССАОТАОАТССТАОАСТА(ЗА(ЗС(ХТО<ЗААОСАТССА<ЗОААОТСА<ЗССТААААСТ

ССТТОТАССААТТССТАТТСТАААААСТСТТОСТТТСАТТСССААСТТТСТТТСАТААСААА АаССТТАОССАТСТССТАТОССАССААОААОСССАаАСАОССЗАСОААОАССТССТСААСОСА (ЗТСАОАСТСАТСААСТТТСТСТАТСАААССАОСССАССТСССААТСССССАСАОСССССгААС СААТАС 3'

Аминокислотная последовательность 8Е0. ГО. N0. 9

МН2-МЕРУЮРНЬЕРИКНРО80РКТАСТНСУСККССРНС0УСР1ТКАЬС 18УСККККК0КККРР063СТН0У8Ь8К0РТ805РТе₽КЕ-СООН

Нуклеотидная последовательность мутанта Ьув41-ВСВД 8Е0. го.

N0. 6

5' АТСОАСССАеТАеАТССТАОАСТАОАОСССТССААОСАТССАССААОТСАОССТААААСТ

ОСТТСТАССААТТССТАТТСТАААААОТОТТССТТТСАТТОССААОТТТСТТТСАТААСААА СОССТТАСОСАТСТССТАТХЗССАООААОААОССЮАСАСАСССАССААСАССТССТСААС-ССА ОТСАСАСТСАТСААеТТТСТСТАТСАААССАССССАССТСССААТСССССАСАСССССОААС СААТАС 3'

Аминокислотная последовательность 8Е0. ГО. N0. 10

МН2-МЕРУЛРКЬЕРИКНР(380РКТАСТНСУСККССРНС0УСР1ТТАЬО 18УаККККК0КВКРР0(38аТН0УЗЬ5КОРТ508РТ(ЗРКЕ-СООН

Пример 3. Конструирование и характеризация ДНК-иммуногенов.

Молекулы ДНК для инокуляции животных встраивают в плазмидный вектор рСУО в 6,4 кб (ссылка 5). Эта плазмида содержит две точки начала репликации 8У40, главный поздний промотор аденовируса (АбМЬР) и сплайсингпоследовательности аденовируса и генов мышиного иммуноглобулина, кДНК мышиного дигидрофолатредуктазного гена (с1НГг) и сигнал полиаденилирования 8У40. Сайт для рестриктазы Ρδίΐ локализуется в 3' АбМЬР и представляет сайт, в котором клонируется представляющий интерес экзогенный ген. кДНК гена !а! (261 пара оснований) (послед. 1, пример 2) ВИЧ-1 была получена из клона ВН10 ВИЧ-1 (ссылка 126) и кодировала белок длиной в 86 аминокислот. Вектор рСУ-Та! (ссылка 5) получали посредством клонирования кДНК !а! в сайт рСУО Ρδίΐ, контролируемый АбМЬР. Выбор указанного вектора основан на том, что АбМЬР индуцировал более сильные экспрессию и секрецию Та! по сравнению с другими эукариотными промоторами, такими как, например, промотор немедленно-ранней области цитомегаловируса (СМУ), как показано Εηδοίί е! а1. (ссылка 41) и в табл.З.

Таблица 3. Экспрессия, субклеточная локализация, секреция и активность Та! в клетках СО8-1, трансфицированных рСУ-Та! и СМУ-ТаГ*

Векторы	Экспрессия Та!	Содержание Таг⁰	Активность Та!
Позигнвн ые клетки	Ядра⁰	Цитоплазма (%)	Общее	в клетках <%)	вне клеток (%)	В клетках⁰(крат)	вне клеток' (ч. ими.)
РСУ-Та!	5-10	++ ++	25	63,5	36,5	50	2.478
СМУ-Та!	3-5	++ +	14,6	92,2	7Л	72	2.254
Сопио!	0		0	0	0		1.400

^а Клетки СО8-1 (5х10⁶)трансфицировали посредством электропорации 30 мкг рСУ-Та!, СМУ-Та! или контрольной ДНК.

Через 48 ч после трансфекции экспрессию Та! оценивали методом иммуногистохимии с моноклональными антителами (приведенные величины являются средними процентами показателей положительных клеток) и по локализации ядерного и цитоплазматического Та!. Наличие внутри- и внеклеточного Та! анализировали с помощью радиоиммунопреципитации на клеточных экстрактах (500 мкл) и в культуральных средах (4 мл) и полученных затем результатов по денситометрии (СсКсап ХЬ; Рйапиаша) полос осажденного Та!. Активность внутриклеточного Та! измеряли на клеточных экстрактах клеток СО8-1, котрансфицированных Та!экспрессирующими векторами или контрольным вектором и плазмидой ЬТК-САТ ВИЧ-1; активность внеклеточного Та! в отношении пролиферации клеток СПИД-К8 (определяемую методом анализа с включением ³Н-тимидина) измеряли в культуральной среде (разведенной 1:2 и 1:4) клеток, трансфицированных плазмидами, экспрессирующими Та!, или контрольной плазмидой. Результаты представляют собой среднее результатов пяти независимых экспериментов.

^ь Денситометрический анализ полосы иммунопреципитированного Та!. Величины выражены в показателях условной шкалы, причем общая определяемая минимальная величина (внутри- и внеклеточный Та!) равна 10.

^с - означает, что клетки Та!-отрицательные; + означает, что Та!-положительных клеток 50%; ++ означает, что Та!-положительных клеток 50100%.

³ САТ-активность после 20-минутной инкубации относительно контрольного вектора, показатель активации которого принимается за 1.

^е Рост клеток СПИД-К8 измеряли методом анализа с включением ³[Н]-тимидина (стандартное отклонение (8Ό) 12%). Супернатанты клеток, трансфицированных контрольной ДНК, включали 1400 чим ³[Н]-тимидина (8Ό 11,5%).

Культуральная среда, полученная от активированных Т-лимфоцитов (положительный контроль), включала 2400 чим ³[Н]-тимидина (8Ό 10%).

Табл.З показывает, что в случае клеток, трансфицированных рСУ-Та!, по сравнению с клетками, трансфицированными СМУ-Та!, более высокими являются процент Та!положительных клеток и общее содержание Та!, количество выделившегося Та! значительно выше и соотносится с общим содержанием Та! и содержанием его в цитоплазме, и поэтому выше биологическая активность внеклеточного Та! в отношении роста клеток СПИД-К8. Такие результаты показывают, что вектор рСУ-Та! кодирует биологически активный белок, индуцирует высокие уровни экспрессии гена !а! и может высвободить из клеток значительно большее количество Та!, чем вектор СМУ-Та!.

Вектор рСУО также используют для экспрессии генов ВИЧ-1 ие£, τεν и дад, и генов, кодирующих цитокины 1Ь-12 и 1Ь-15. кДНК генов ие£ (618 пар оснований, штамм ИЪ43) (ссылка 112), τεν (348 пар оснований, штамм ΝΕ43) (ссылка 95) и дад (1500 пар оснований, штамм ИЪ43) (ссылка 95), или кДНК генов 1Ь-12 (ссылка 165) или генов 1Ь-15 (ссылка 56) амплифицируют посредством метода полимеразной цепной реакции (РСК) с использованием специфических праймеров, комплементарных первым 15 нуклеотидам 5'-области (прямые праймеры) (послед. Р1, РЗ, Р5, Р7, Р9) или последним 15 нуклеотидам 3'-области (обратные праймеры) (послед. Р2, Р4, Р6, Р8, РЮ). Кроме того, каждый праймер, как прямой, так и обратный, содержит последовательность рестриктазы РЮ. допускающую клонирование амплифицированного продукта в вектор рСУО. После клонирования последовательность встроенных генов проверяют методом секвенирования ДНК. Вектор рСУО также используют для коэкспрессии Та! с другими генами вируса ВИЧ-1 (τεν, ие£ или дад) или с генами цитокинов 1Ь-12 или 1Ь15. Для этого кДНК гена !а! ВИЧ-1 в 261 пару оснований (послед. 1, пример 2) амплифицируют методом РСК с прямым праймером, включающим последовательность для рестриктазы Ρδΐΐ (послед. Р11), и обратным праймером, комплементарным последним 15 нуклеотидам гена !а! (послед. Р12). Гены вируса (ие£, τεν или дад) или гены, кодирующие цитокины 1Ь-12 или 1Ь15, амплифицируют с помощью прямого праймера, включающего также последовательность 15 оснований, комплементарных 3'-области, позволяющего гену находиться в рамке считывания с геном !а! (послед. Р13, Р14, Р15, Р16, Р17), и обратного праймера, включающего последовательность рестриктазы РЧ1 (послед. Р2, Р4, Р6, Р8, РЮ). Затем осуществляют третью РСК, при которой ДНК-матрица представляется амиплифицированными продуктами гена !а! и нужного гена. Прямой праймер представляется праймером, используемым для амплификации !а! (послед. Р11), а обратный праймер - праймером, используемым при амплификации нужного гена (послед. Р2, Р4, Р6, Р8, РЮ). Амплифицированный продукт 1а(/(нужный ген) очищают в агарозе, расщепляют Ρδίΐ и клонируют в рСУО. После клонирования последовательность встроенных генов проверяют методом секвенирования ДНК, в то время как экспрессию белка определяют с помощью трансфекции, как описано выше (ссылка 41).

Указанными выше праймерами являются

послед. Р1;	прямой	праймер	Κβν:	5'АТСССАССААСААССЗ'
8Е0. ГО. ΝΟ. 18
послед. Р2;	обратный	праймер	Κβν:	5'СТАТТСТТТАОТТССЗ'
8Е0. Ιϋ. ΝΟ. 19
послед. РЗ;	прямой	праймер	Νβί:	5'АТСССТСССААСТССЗ'
8Ες. ΙΟ. ΝΟ. 20
послед. Р4;	обратный	праймер	Νβ£:	5'ТСАССАСТССТТСТАЗ'
8Е0. 10. N0. 21
послед. Р5;	прямой	праймер	Сад:	5'АТСССТСССАСАСССЗ
8Е0. ГО. N0. 22
послед. Р6;	обратный	праймер	Сад:	5'ТТАТТСТСАССАСССЗ
8Е0. ГО. N0. 23
послед. Р7;	прямой	праймер	1Б-12:	5'АТСТОССССССТСССЗ
8Е0. ГО. N0. 24
послед. Р8.	обратный	праймер	ГО-12:	5'ТТАССААССАТТСАСЗ
8Е0. ГО. N0. 25
послед. Р9.	прямой	праймер	ГО-15:	5'АТСАСААТТТССАААЗ
8Е0. ГО. ΝΟ. 26
послед. Р10.	обратный	праймер	ГО-15:	5'ТСААСААСТСТТСАТЗ¹
8Е0. ГО. ΝΟ. 27
послед. Р11.	прямой	праймер	ТаБ:	5'АТССАСССАСТАСАТЗ
8Е(2. ГО. N0. 28
послед. Р12.	обратный	праймер	ТаБ:	5'СТАТТССТТССССССЗ
8Е0. ГО. N0. 29

послед. Р13. прямой праймер ТаБ/Ηβν: 5‘СОССССААССАААТОССА

СКЗААСААОСЗ' 8Е<2. ГО. N0. 30 послед. Р14. прямой праймер ТаБ/Νβί: 5' ОССССОАА6САААТОООТ

ОССААСТООЗ' 8Е0. ГО. N0. 31 послед. Р15. прямой праймер ТаС/Сад: 5'ССССССААССАААТОООТОСС

АОАССОЗ' 3Ες. ГО. N0. 32 послед. Р1б. прямой праймер ТаБ/1Ь-12: 5' ОСССССААССАААТСТССС

ССССТОООЗ' 8Е0. ГО. N0. 33 послед. Р17. прямой праймер ТаБ/1Ъ-15: 5' ООССССААСЮАААТСАОААТ

ТТССАААЗ' 8Е0· ГО. ΝΟ. 34

Пример 4. Инокуляция здоровых Масаса £а8сюи1ап8 вакциной против белка Та!: оценка безопасности, толерантости, специфической иммунной реакции и эффективности защиты от заражения вирусом.

Толерантность, безопасность и способность вызывать специфическую иммунную реакцию (гуморальную и клеточную) и защиту от заражения вирусом вакцины на основе рекомбинантного Та!, полученного описанным способом и очищенного с помощью гепаринаффинных колонок, оценивали на экспериментальной модели собакоподобной (суиото1ди8) обезьяны (Масаса ГазасЫапз). Для того, чтобы индуцировать полиспецифическую иммунную реакцию, авторы использовали фосфат алюминия (А1ит), который проверен на многих моделях, и он один одобрен для применения к людям. Из ряда специфических адъювантов авторы использовали ΚΙΒΙ (относящийся к группе эмульгаторов или состоящий из монофосфорилированного липида А, сйшусоНс 1ге11а8о1е и каркаса бактериальной стенки палочки Кальметта-Герена) (ссылки 7, 109).

В первом пилотном эксперименте оценивали толерантность, безопасность и способность вызывать специфическую иммунную реакцию (гуморальную и клеточную). Так, 3 обезьян инокулировали по следующей схеме: обезьяну 1 (М1) инокулировали рекомбинантным Та! (100 мкг), ресуспендированным в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл ΚΙΒΙ, подкожным методом в одном месте; обезьяну 2 (М2) инокулировали рекомбинантным Та! (10 мкг), ресуспендированным в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл ΚΙΒΙ, подкожным методом в одном месте; и обезьяна 3 (М3) была контрольным животным, инокуляция которой не проводилась. У всех обезьян в дни -42 и -35 перед первой вакцинацией брали по 10 мл крови для определения базовых параметров. Образцы сыворотки и плазмы замораживали при -20°С или -80°С и в дальнейшем использовали для ресуспендирования белкового инокулята. Обезьян 1 и 2 инокулировали в момент времени 0 и через 2, 5, 10, 15, 22, 27, 32 и 37 недель. Иммунизацию прерывали на 37 неделе для обезьяны М1 и на 41 неделе для обезьяны М2. Животных умервщляли, и исследовали иммунологические параметры некоторых органов и тканей (селезенка и лимфоузлы), например, оценивали наличие пролиферативной реакции на Та! и САЕ- и СТЬактивность против Та!. САГ-активность является антивирусной активностью, опосредованной (СБ8+)-лимфоцитами, не ограниченной ГКГС и нецитолитической. В те же дни, когда проводили инокуляцию иммуногена, у каждой обезьяны брали по 10 мл крови для лабораторных испытаний (химико-физические анализы, количественное определение электролитов, лейкоцитов, числа тромбоцитов и гемоглобина), оценки иммунологических параметров, таких как наличие специфических иммуноглобулинов (1дМ, 1дС, 1дА), содержание цитокинов типа ТЫ (1Ь-2, ΙΕΝ?) и типа Т112 (1Ь-4, ΙΓ-10), продуцирование хемокинов (ΚΑΝΤΕδ, М1Р-1ос и ΜΙΡ-1β), лимфоцитарный фенотип (СБ4, СБ8. СВЗ. СБ 14. СБ20, СБ25, СБ56, НЬА-БК, СБ45КА), пролиферативная реакция на Та!, наличие специфической цитотоксической активности (СТЬ), наличие антивирусной активности (САР) и наличие общей антивирусной активности (ТАА), опосредованной РВМС и аутологичной сывороткой. Кроме того, для того, чтобы оценить ίη νίνο наличие клеточноопосредованной иммунной реакции, на всех вакцинированных и контрольных обезьянах проводили кожную пробу на Та!.

Результаты этого эксперимента следующие. Не наблюдали никаких изменений химикофизических, гематологических и поведенческих параметров. У вакцинированных и контрольных обезьян признаков воспаления и неоваскуляризации в местах инокуляции не обнаружено. Эти результаты показывают, что белок Та! хорошо переносился животными и не был токсичным в введенных дозах и при данном способе введения. У обезьян М1 и М2 присутствие антител 1д6 типа, специфического для Та!, обнаруживалось на 5 неделе после первой вакцинации. На 37 неделе 1д6 против Та! можно было обнаружить в плазме, разведенной 1:6400, у обеих обезьян, а на 41 неделе при разведении плазмы 1:12800 у обезьяны М2. Эти результаты приводятся на фиг. 2 и 3. У контрольной обезьяны М3 обнаружены антитела против Та! с очень низкими титрами, подобными тем, какие вызываются повторными инокуляциями малого количества Та!, которое инъецировали данной обезьяне для контроля за специфичностью реакций на кожную пробу. У обезьян М1 и М2 антитела против Та! были направлены, главным образом, против аминоконцевой области (ак 1-20) Та!, с титром 1:3200 (фиг. 4). У обезьяны М2, вакцинированной 10 мкг Та!, также обнаруживались антитела, направленные против ак Та! 36-50 и 44-60, с титрами 1:50 и 1:100, соответственно (фиг. 4). Способность сыворотки обезьян нейтрализовать Та! определяли посредством анализов ίη νίίτο, при которых измеряли ингибирование сохранения репликации ВИЧ-1 в клетках НЬМ-1 после добавления экзогенного Та!, как описано ранее (ссылка 41). Зги анализы показали, что плазма от обезьян М1 и М2 на 27 неделе после первой вакцинации блокировала репликацию вируса, индуцированную экзогенным Та!, что определяли по количеству антигена р24 в культуральных супернатантах. Напротив, предиммунная плазма от тех же обезьян не блокировала активность Та! (табл.4).

Таблица 4. Нейтрализующая активность плазмы обезьян в отношении сохранения репликации вируса, индуцированной внеклеточным Та1^а

Образцы	Ингибирование (%)
Та! (30 нг/мл) + предиммунная М1	0
Та! (30 нг/мл) + предиммунная М2	0
Та! (39/нг/мл) + иммунная М1	79,12
Та! (30 нг/мл) + иммунная М2	100

^а Нейтрализующую активность плазмы определяли в клетках НЬМ-1 (клетки НеЬа-СО4⁺, содержащие интегрированную копию провируса ВИЧ-1, дефектного по гену !а!). Клетки НМЬ-1 высевали в количестве 6 х 10⁵ клеток на лунку в 24-луночные планшеты и инкубировали при 37°С в течение 16 ч. Клетки дважды промывали РВ8, содержащим 0,1% бычьего сывороточного альбумина (В 8 А), и культивировали в течение 48 ч со свежей средой (0,3 мл) в присутствии рекомбинантного белка Та! и равного объема плазмы животного, отобранной в момент времени 0 (предиммунная плазма) или на 27 неделе (иммунная плазма). Отрицательный контроль был представлен клетками, обработанными только пулом предиммунной плазмы, пулом иммунной плазмы или РВ8, содержащим 0,1%

В8А (РВ8 + 0,1% В8А), без Та!. Во всех контрольных образцах не наблюдалось влияния на сохранение репликации вируса. Каждую плазму проверяли дважды. Присутствие вируса, выделенного клетками, анализировали посредством количественного определения антигена Сад р24 с использованием коммерческого набора для ЕЫ8А антигена р24 (ΝΕΝ-Оироп!). Результаты выражены в процентах ингибирования сохранения вируса [измеренного для каждой плазмы в виде среднего показателя для р24 (пг/мл) в двух лунках] иммунной плазмой при сравнении с предиммунной плазмой (ингибирование 0%). Обезьян М1 и М2 вакцинировали рекомбинантным белком Та! (100 мкг и 10 мкг, соответственно), ресупендированным в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл ΡΙΒΙ. и делали подкожную инъекцию в одном месте.

Результаты показывают наличие пролиферативной реакции на Та! на 22 неделе (табл.5) у обезьян, вакцинированных рекомбинантным Та!, причем более сильной у обезьяны М2, получавшей 10 мкг рекомбинантного Та! при каждой повторной иммунизации.

Таблица 5. Пролиферативная реакция на Та1^а

Обезьяна	Стимул	Недели от первичной иммунизации
		15	22	27	32	37
М1	РНА	15.3	13.9	19.9	40.6	3.2
	ТТ	1.2	4.7	2.1	3.8	2
	Та!	0.8	2.4	1.1	1.3	0.6
М2	РНА	8.1	11.6	17.1	16.8	1.7
	ТТ	2	3.8	1.7	1	0.6
	Та!	0.9	3	1.4	1.2	0.6

М3	РНА	5.1	19.9	18.2	6.6	8.1
	ТТ	7.2	6.2	5.5	2.8	5.6
	Та!	2.1	1.4	1.3	0.7	0.9

^а РВМС, выделенные методом градиента плотности фиколла, высевали при концентрации 2x10⁵ клеток на лунку при трехкратном повторе в 96-луночный планшет с плоскодонными лунками, культивировали в ΚΡΜΙ-1640 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (ЕС8) и стимулировали Та! (1 или 5 мкг/мл), РНА (4 мкг/мл) или столбнячным анатоксином (ТТ), против которых вакцинировали обезьян. Нестимулированные контрольные клетки инкубировали в среде ΚΡΜΙ, 10% ЕС8. Усиление клеточной пролиферации измеряли на 5 день методом с включением ³[Н]-тимидина, как описано ранее (ссылки 39, 22). Результаты выражали в виде индекса стимуляции и вычисляли следующим образом: среднее испытываемого образца (чим)/ среднее контроля (чим). Величины свыше 2,5 считали положительными. Обезьян М1 и М2 иммунизировали подкожно 100 мкг или 10 мкг рекомбинантного Та!, ресуспендированного в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл ΚΙΒΙ. М3 представляет контрольную обезьяну.

Как показано в табл. 6, цитотоксическая активность в отношении Та! у обезьян М1 и М2, иммунизированных рекомбинантным Та!, не обнаружена.

Таблица 6. Анализ цитотоксической активности в отношении Та! (СТЬ)^а

Обезьяны	Неделя	Соотношение мишень-эффектор	СТЬ активность
		1:50	1:25	1:12,5	1:6,25	1:3,125	Среды
М1	41	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ
М2	41*	0	0	0	0	0	0
М3	41	0	0	0	0	0	0

^а РВМС, выделенные центрифугированием в градиенте плотности фиколла, ресуспендировали при концентрации 1 х 10⁷ клеток/мл в ΚΡΜΙ-1640 с добавлением 10% термоинактивированной РС8 и высевали в 24-луночный планшет (500 мкл на лунку), и инкубировали в течение 12 ч при 37°С в присутствии 1 мкг Та!. На другой день клетки, инкубированые без Та!, центрифугировали при 1500 об/мин и ресуспендировали в 50 мкл ΚΡΜΙ-1640 с добавлением 10% РС8, инкубировали в течение 3 ч при 37°С с 1 мкг Та!, промывали, ресуспендировали в 500 мкл свежей среды и добавляли в лунку, содержащую предварительно стимулированные РВМС. В день 2 клетки разводили 1 мл среды, содержащей 1Ь-2 (2 МЕ/мл) и культивировали в течение 14 суток. Аутологичные В-лимфоциты, взятые от каждой обезьяны до начала осуществления вакцинации, использовали в качестве клеток-мишеней (ВЕСЬ). С этой целью РВМС, выделенные посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколла, в день 35 высевали, при концентрации 3 х 10⁵ клеток на лунку, в 96-луночный планшет и культивировали в течение 2 или 3 недель в присутствии 50% среды, собранной с клеточной линии, продуцирующей Рароупмк, как описано ранее (ссылка 28). Десять линий В-клеток, полученных для каждого животного, размножали и замораживали. Для проверки токсичности использовали цитотоксический тест ОсНГа (\Уа11ас. Турку, Финляндия), основанный на флуоресценции, разрешенной во времени (ссылки 12, 13, 14). С этой целью ВЕСЬ культивировали при концентрации 1 х 10⁶ клеток на 200 мкл ΚΡΜΙ 1640 с добавлением 10% РС8, содержащей 4 мкг Та!, в течение 12 ч при 37°С. В качестве контроля другую аликвоту аутологичных ВЕСЕ инкубировали с той же средой без Та!. ВБСЕ промывали и ресуспендировали в 1 мл ΚΡΜΙ 1640 с добавлением 10% РС8, содержащей 5 мкл усиливающего флуоресценцию лиганда, и инкубировали в течение 15 мин при 37°С в соответствии с рекомендациями изготовителя. После 5 промываний ВЕСЕ ресуспендировали в концентрации 5 х 10⁴ клеток/мл и сразу же центрифугировали, чтобы собрать супернатант, который использовали для измерения фонового уровня. РВМС (эффекторы) высевали, при двукратном повторе и концентрации 2,5 х 10⁴ клеток на 100 мкл в среде, содержащей 1Б-2. и сразу же разводили в 96-луночном планшете. В каждую лунку добавляли 5 х 10³ клеток-мишеней на 100 мкл (выращенных с Та! или без него). Соотношения мишень-эффектор составляли Е50, Е25, 1:12,5, 1:6,25, 1:3,125. РВМС и клетки-мишени (кратковременно обработанные Та! или необработанные) инкубировали в течение 2 ч при 37°С с ί) 20 мкл 5% тритона, чтобы измерить максимальное высвобождение, п) 100 мкл среды для выращивания для обнаружения спонтанного высвобождения, ίίί) 200 мкл супернатанта от клеток-мишеней для обнаружения фонового уровня. По окончании времени инкубации планшеты центрифугировали. По 20 мкл каждого супернатанта переносили в новый планшет и инкубировали в присутствии 200 мкл Еврораствора, содержащегося в наборе. Флуоресценцию измеряли после 20-минутной инкубации с помощью аппарата для регистрации разрешенной во времени флуоресценции (Ую!ог, \Уа11ас. Турку, Финляндия). Специфическую СТЕ-активность определяли следующим образом: % специфического высвобождения = [(среднее, обнаруженное для образца - фон) - (спонтанное высвобождение -фон)]/ [(максимальное высвобождение фон) - (спонтанное высвобождение - фон)] х 100. Пробу считали положительной, когда Та!специфическое высвобождение превышало 4% при наибольших соотношениях эффектормишень при испытаниях. 4% являются произвольной величиной, установленной на основании предварительных контрольных экспериментов. Νϋ означает, что величины не определены. Обезьяну М2 иммунизировали подкожно 10 мкг рекомбинантного Та!, ресуспендированного в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл ΚΙΒΙ. М3 представляет контрольную обезьяну.

Νϋ означает, что определения не проводились.

* РВМС выделяли из периферических лимфоузлов после умервщления обезьяны М2.

Кроме того, результаты показывают в недели 22, 27 и 37 присутствие растворимой антивирусной активности, опосредованной (СЛ8+)Т-лимфоцитами (САР), измеренной как способность клеточных супернатантов от (СЛ8+)-Тлимфоцитов обезьяны ингибировать острую инфекцию химерного вируса 8Н1У 89.6Р в клетках СЕМх174 или регулировать реактивацию хронической ВИЧ-1-инфекции в клетках ОМ10-1 (табл. 7). При сравнении с контрольными животными у вакцинированных обезьян, как правило, наблюдали САР-активность.

Таблица 7. Анализ присутствия растворимой антивирусной активности, опосредованной (СО8+)-Т-лимфоцитами (САГ)^а

Обезьяна ГО	Неделя после первичной иммунизации	% ингибирования репликации вируса
		Острая инфекция	Хроническая инфекция
М1	22	89.5	ΝΏ
	27	62	61.7
	37	ΝΌ	ΝΌ
М2	22	44	Νϋ
	27	54	27
	37	48	53
М3	22	24	Νϋ
	27	37	22
	37	75	23

^а РВМС от обезьян, вакцинированных 100 мкг (М1) и 10 мкг (М2) рекомбинантного белка Та!, и от контрольной обезьяны (М3), которую не вакцинировали, но повторяли для нее кожные пробы с Та!, выделяли в градиенте плотности фиколла. Культуры, обогащенные (СО8+)Т-лимфоцитами, выделяли из РВМС с помощью магнитных гранул против СО8 (ОупаЬеабк, Оупа1, Норвегия) согласно рекомендациям изготовителя. Чистоту культур контролировали с помощью ЕАС8-анализа с использованием ряда антител, направленных против специфических клеточных маркеров (СОЗ, СО4, СО8). Культуры, обогащенные СО8+, высевали (при двукратном повторе) в количестве 5 х 10⁵ клеток на 500 мкл на лунку в 48-луночные планшеты, предварительно сенсибилизированные моноклональными антителами против СОЗ (2,5 мкг/мл, Вю-8оигсе 1п!ета!юпа1, СатапПо. СА), (и инкубировали) в течение 12 ч при 4°С, и выращивали в ΒΡΜΙ 1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и 1Ь-2 (20 Е/мл). Каждые три дня в течение двух недель собирали 250 мкл среды и заменяли равным объемом свежей среды. Клеточные супернатанты центрифугировали, фильтровали (0,45 мкм) и хранили при -80°С. Клеточные супернатанты, полученные во все указанные моменты времени, за исключением первого, собирали, и проверяли наличие антивирусной активности как их способности ингибировать репликацию вируса в двух системах, представленных острой и хронической инфекцией, соответственно. В случае острой инфекции использовали клеточную линию СЕМ х 174, которая происходит от линии В-клеток человека 721.174, слитой с линией Тклеток человека СЕМ (ссылка 143). Клетки (2 х 10⁵) инкубировали в полипропиленовых пробирках с 200 мкл супернатантов СО8+, полученных так, как описано выше, или без них, в течение 2 ч при 37°С. Клетки промывали 3 раза свежей средой, высевали в количестве 2 х 10⁴клеток на лунку в 96-луночные планшеты и инкубировали в 200 мкл без культуральных супернатантов (необработанные клетки) или с разными объемами (50 мкл, 5 мкл и 0,5 мкл) культуральных супернатантов (обработанные клетки), полученных от (С08+)-Т-лимфоцитов обезьян, инъецированных вакциной, или от контрольной обезьяны. После заражения аликвоты культуральных супернатантов собирали каждые три дня и заменяли равным объемом полной среды, в которую предварительно добавляли культуральный супернатант СЛ8+ от вакцинированных и контрольных обезьян. Результаты, приведенные в таблице, соответствуют 7 дню после заражения и выражены в виде процента (%) ингибирования репликации вируса в клетках, обработанных культуральными супернатантами СЛ8+, полученных от вакцинированных обезьян, по сравнению с необработанными клетками. Репликацию вируса определяли посредством измерения показателей КТ, как описано ранее (ссылка 54), или показателей Сад р27, методом ЕЫ8А, в культуральных супернатантах, собранных в каждый момент времени. В случае хронической инфекции использовали клеточную линию ОМ-10-1 (ссылки 20, 21), которая представляет линию Т-лимфоцитов человека, хронически инфицированного ВИЧ-1. Клетки высевали (при двукратном повторе) в количестве 5 х 10⁴ клеток в 200 мкл на лунку в 96луночные планшеты в присутствии антител против ΤΝΡ? (40 мкг/мл) без клеточных супернатантов или с разными объемами (50 мкл, 5 мкл и 0,5 мкл) клеточных супернатантов (С08+)-Т-лимфоцитов, полученных от вакцинированных или контрольных обезьян. Клетки для пролиферации активировали РМА (10^-7 М). Через 24 ч собирали аликвоты культуральной среды для определения репликации вируса посредством измерения содержания ВТ или Сад р24 методом ЕЫ8А.

Результаты представлены в виде % ингибирования реактивации инфекции в обработанных клетках по сравнению с необработанными клетками. Результаты для острой и хронической инфекции, приведенные в таблице, относятся к клеткам, обработанным 5 мкл супернатанта, полученного от культур клеток СО8+. Νϋ означает, что определения не проводились.

Анализ замедленной гиперчувствительности (ОТН) с помощью кожной пробы показал, что как вакцинированные (М1 и М2), так и контрольная (М3) обезьяны были в этом отношении отрицательными (табл. 8).

Таблица 8. Кожная проба на Та1^а

Недели после первичной иммунизации	Обезьяны
	М1 М М3 2
10	-		-
15	-	-	-
22	-	-	-
27	-	-	-
32	-	-	-
37	-	-	-

^а Та! (1 и 5 мкг) в 150 мкл РВ8-0Д% ΒδΑ или в одном буфере инокулировали интрадер43 мальным способом в предварительно выбритый участок спины вакцинированных и контрольных (контроль специфичности реакции) обезьян в недели 10, 15, 22, 27, 32 и 37 после первой иммунизации. Обезьян М1 и М2 вакцинировали рекомбинантным белком Та! (100 мкг и 10 мкг, соответственно) в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл Я1В1. вводимым подкожным способом в одном месте. Обезьяна М3 является контрольным животным, которое не вакцинировали. Появление узловатой эритемы через 48-72 ч наводило на мысль о реакции замедленной гиперчувствительности (ΌΊΗ): ++ соответствует 0 > 5 мм; + соответствует 0 > 1-4 мм; +/соответствует эритеме без затвердевания; - соответствует 0 < 1 мм.

Результаты пилотного эксперимента показывают, что рекомбинантный Та!, полученный и очищенный по схеме, описанной авторами изобретения, был нетоксичен при дозах 100 и 10 мкг, введенных подкожным способом. Кроме того, белок Та! выявлял специфическую и обширную иммунную реакцию с антивирусными активностями, как гуморальную, так и клеточноопосредованную. Более сильную и специфическую иммунную реакцию против Та! наблюдали у обезьяны М2, вакцинированной 10 мкг рекомбинантного белка. Кроме того, адъювант Я1В1 не показал сколько-нибудь явных признаков токсичности на вакцинированных обезьянах. На основании этих результатов был спланирован второй пилотный эксперимент для того, чтобы определить влияние иммунизации 10 мкг Та! в сочетании с адъювантами Я1В1 или А1ит. Обезьян инъецировали подкожным способом в одном месте по описанной далее схеме. Обезьяны М1-3: 10 мкг рекомбинантного белка Та! в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл Я1В1. Обезьяны М4-6: 10 мкг рекомбинантного белка Та! в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл А1ит. Обезьяна М7: 250 мкл Я1В1 и 250 мкл аутологичной сыворотки (контрольная обезьяна). Обезьяна М8: 250 мкл А1ит и 250 мкл аутологичной сыворотки (контрольная обезьяна). У каждой обезьяны в день -9, предшествующий первой иммунизации, брали по 10 мл крови для осуществления проверок, описанных в предыдущем пилотном эксперименте, и для определения базовых параметров каждого животного. Обезьян инокулировали в момент времени 0 и через 2, 6, 11, 15, 21, 28 и 32 недели. На 36 неделе обезьяны М1-6 получили последнюю инъекцию рекомбинантным белком Та! (16 мкг) в 200 мкл 18СОМ (иммунностимулирующий комплекс) и 300 мкл РВ8. 18СОМ представляет собой адъювант, содержащий квил-А-сапонин, холестерин и фосфолипиды, усиливающий гуморальную и клеточноопосредованную иммунную реакцию (ссылки 109, 90). Обезьянам М7 и М8 в те же моменты времени инъецировали только адъюванты. В каждый момент вакцинации и в недели 40, 44 и 50 у животных брали по 10 мл крови для анализа клинических и иммунологических параметров, описанных в предыдущем пилотном эксперименте. Кроме того, собирали образцы мочи и влагалищные мазки для анализа на присутствие Та!-специфического секреторного 1дА. Для того, чтобы оценить защитное действие иммунизации Та! против инфекции, вакцинированных и контрольных обезьян заражали химерным вирусом иммунодефицита обезьяны/человека (8Ηΐν), штамм 89.6Р, содержащим ген !а! ВИЧ-1, предварительно выращенным и оттитрованным в Масаса Га5Сюи1ап5 (ссылки 128, 129, 69). После заражения у животных контролировали (каждые две недели в первый месяц, каждые четыре недели в следующие три месяца и каждые 8 недель до 6-12 месяцев) вирусологические параметры, такие как антигенимия плазмы на р27 и вирусный груз плазмы и клеток. Для того, чтобы подтвердить, что заражение произошло, также проводился поиск антител против 81У с помощью коммерческого набора, применяемого для обнаружения антител против ВИЧ-2, который распознает также антитела против 8ΐν (набор Е1ау1а АС-АЬ-Ак II, П1адпо8!ю Ра§!еиг, Париж, Франция).

На данный момент результаты второго пилотного эксперимента следующие. Не наблюдалось никаких изменений химико-физических, гематологических и поведенческих параметров. У обезьян не было каких-либо признаков воспаления или неоваскуляризации в месте инокуляции. Наблюдали образование специфических антител (1дМ, 1дС). В 15 неделю титры антител против Та! (1дС) достигли высоких уровней, причем интервал составлял от 1:64000 до 1:25600 (фиг. 5-7). Антитела с титрами от 1:1600 до 1:3200 (фиг. 8) реагировали, по существу, с аминоконцевой областью (ак 1-20) Та!, как видно на 22 неделе. Кроме того, также обнаружены антитела против ак 46-60 Та! с титрами в интервале от 1:100 до 1:200 (фиг. 8). Способность плазмы обезьян нейтрализовать Та!-активность проверяли посредством оценки ингибирования спасения вируса в клетках НЬМ-1, инкубированных с серийными количествами экзогенного Та!, как описано ранее в первом пилотном эксперименте. Результаты этих экспериментов показывают, что иммунная плазма (разведенная 1:2) от обезьян М1-6 на 15 неделе блокировала репликацию вируса, индуцированную 30 нг/мл экзогенного Та!, что определили путем измерения антигена р24, секретированного в культуральную среду. Напротив, предиммунная плазма обезьян М1-6 или плазма контрольных обезьян (М7, М8) не блокировали Та!активность (табл. 9). Кроме того, иммунная плазма (разведенная 1:2) обезьян М1-6, взятая на 21 неделе, блокировала репликацию вируса, индуцированную 60 нг/мл, 120 нг/мл, 240 нг/мл и 500 нг/мл экзогенного Та!. В частности, в этих образцах плазмы определили 10-кратное снижение репликации вируса, индуцированной весьма высокими дозами внеклеточного Та! (240 нг/мл и 500 нг/мл) (табл. 9).

Таблица 9. Нейтрализующая активность иммунной плазмы в отношении спасения репликации вируса, индуцированной внеклеточным Та1^а

Образцы	Ингибирование (%)
Та! (30 нг/мл)+предиммунная М1	0
Та! (30 нг/мл)+предиммунная М2	0
Та! (30 нг/мл)+ предиммунная М3	0
Та! (30 нг/мл)+ предиммунная М4	0
Та! (30 нг/мл)+ предиммунная М5	0
Та! (30 нг/мл)+ предиммунная Мб	0
Та! (30 нг/мл)+ иммунная М1 (15 неделя)	89.8
Та! (30 нг/мл)+ иммунная М2 (15 неделя)	78.7
Та! (30 нг/мл)+ иммунная М3 (15 неделя)	100
Та! (30 нг/мл)+ иммунная М4 (15 неделя)	100
Та! (30 нг/мл)+ иммунная М5 (15 неделя)	70.8
Та! (30 нг/мл)+ иммунная Мб (15 неделя)	94.2
Та! (60 нг/мл)+ предиммунная М1	0
Та! (60 нг/мл )+ предиммунная М2	0
Та! (60 нг/мл)+ предиммунная М3	0
Та! (60 нг/мл)+ предиммунная М4	0
Та! (60 нг/мл)+ предиммунная М5	0
Та! (60 нг/мл)+ предиммунная Мб	0
Та! (60 нг/мл)+ иммунная М1 ( 21 неделя)	96.3
Та! (60 нг/мл)+ иммунная М2 (21 неделя)	100
Та! (60 нг/мл)+ иммунная М3 (21 неделя)	100
Та! (60 нг/мл)+ иммунная М4 (21 неделя)	98.7
Та! (60 нг/мл)+ иммунная М5 (21 неделя)	99

Та! (60 нг/мл)+ иммунная Мб (21 неделя)	98.8
Та! (120 нг/мл)+ пуд предиммунных М1-6	0
Та! (120 нг/мл)+ иммунная М1 (21 неделя)	59.2
Та! (120 нг/мл)+иммунная М2 (21 неделя)	90.4
Та! (120 нг/мл)+ иммунная М3 (21 неделя)	96.8
Та! (120 нг/мл)+ иммунная М4 (21 неделя)	98.3
Та! (120 нг/мл)+ иммунная М5 (21 неделя)	100
Та! (120 нг/мл)+ иммунная Мб (21 неделя)	97.8
Та! (240 нг/мл)+ пул предиммунных М1-6	0
Та! (240 нг/мл)+ иммунная М1 (21 неделя)	26.1
Та! (240 нг/мл)+ иммунная М2 (21 неделя)	49.4
Та! (240 нг/мл)+ иммунная М3 (21 неделя)	70.3
Та! (240 нг/мл)+ иммунная М4 (21 неделя)	91.2
Та! (240 нг/мл)+ иммунная М5 (21 неделя)	94.5
Та! (240 нг/мл )+ иммунная Мб (21 неделя)	86
Та! (500 нг/мл)+ пул предиммунных М1-6	0

Та! (500 нг/мл)+ иммунная М1 (21 неделя)	32.7
Та! (500 нг/мл)+ иммунная М2 (21 неделя)	38.9
Та! (500 нг/мл}!· иммунная М3 (21 неделя)	57.5
Та! (500 нг/мл)+ иммунная М4 (21 неделя)	89.4
Та! (500 нг/мл)+ иммунная М5 (21 неделя)	72
Та! (500 нг/мл)+ иммунная Мб (21 неделя)	71.8

^а Способность плазмы против Та! нейтрализовать Та!-активность определяли на клетках НЬМ-1, как описано в пояснении к табл. 4. Рекомбинантный белок Та! (30 нг/мл, 60 нг/мл, 120 нг/мл, 240 нг/мл и 500 нг/мл) добавляли один или вместе с равным объемом предиммун ной плазмы обезьяны или в 15 или в 21 неделю (иммунная плазма). Обезьян М1-3 вакцинировали 10 мкг Та! в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл ΚΙΒΙ; обезьян М4-6 вакцинировали 10 мкг Та! в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл А1ит; контрольных обезьян инъецировали ΚΙΒΙ (250 мкл и 250 мкл аутологичной сыворотки) (М7) или А1ит (250 мкл и 250 мкл аутологичной сыворотки) (М8). Результаты представлены в таком виде, как описано в пояснении к табл. 4.

Способность плазмы обезьян нейтрализовать активность внеклеточного Та!, секретированного клетками во время острой инфекции, проверяли на клетках СЕМ х 174, инфицированных химерным вирусом 8Н1У 89.6Р. На 7 день после заражения наблюдали репликацию вируса в 50% контрольных клеток, инфицированных §Н1У и культивированных с предиммунной плазмой обезьян М1-6. Напротив, репликации вируса не обнаружили в инфицированных клетках, которые выращивали в присутствии иммунной плазмы, взятой у обезьян М1-6 на 44 неделе (табл. 10).

Таблица 10. Нейтрализующая активность иммунной плазмы в отношении передачи вирусной инфекции³

Образец	р27 (пг/мл)
8ШУ + предиммунная М1	отриц.
δΗΤν + предиммунная М2	отриц.
8ΗΓν + предиммунная М3	1.080
5НГУ + предиммунная М4	0.602
8ШУ + предиммунная М5	1.169
ЗИГУ + предиммунная Мб	отриц.
8НГ/ + иммунная М1	отриц.
8ΗΓν + иммунная М2	отриц.
8ΗΤν + иммунная М3	отриц.
8НГУ + иммунная М4	отриц.
8НГУ + иммунная М5	отриц.
8ШУ + иммунная Мб	отриц.

^а Клетки СЕМ х 174 (3 х 10⁴ клеток на 150 мкл) в 96-луночных планшетах инфицировали химерным вирусом 8ΗΙΥ 89.Р6 (5 х 10'⁵ТСГО₅о/клетку) в течение 2 ч при 37°С в ΒΡΜΙ 1640, содержащей 10% ЕС8. Клетки дважды промывали ΒΡΜΙ 1640 и ресуспендировали в 150 мкл полной среды с добавлением 5% предиммунной плазмы обезьян или иммунной плазмы (44 неделя), полученной от животных, вакцинированных рекомбинантным Та! (10 мкг) и ΚΙΒΙ (М1-3) или А1ит (М4-6). Плазму животных предварительно грели при 56°С в течение 30 мин и анализировали методом ЕЬ18А для контроля за титрами антител против Та!. Каждую сыворотку проверяли дважды. В дни 3, 5 и 7 после заражения собирали 120 мкл культуральной среды и заменяли равным объемом свежей среды, содержащей 5% предиммунной плазмы или иммунной плазмы от обезьян М1-6. Способность плазмы нейтрализовать внеклеточный Та!, секретированный во время острой инфекции, и борьбу с передачей инфекции ίη νίΐτο определяли посредства поиска вирусного Са§ р27 в культуральной среде методом ЕЫ8А (СоиНсг 1п!ета!юпа1, Майами, Флорида). Результаты, представленные в виде количества р27 (пг/мл), соответствуют среднему значению, полученному в двух лунках для каждой сыворотки на 7 день после заражения.

Кроме того, с 11 недели наблюдали пролиферативную реакцию на Та! (табл. 11).

Таблица 11. Пролиферативная реакция на Та1^а

Обезьяна	Стимулятор	Недели после первой иммунизации
		0	11	15	21	28	32	36	40	44	50
М1	РНА	16.9	10.5	15.27	33.8	7.2	51.5	64.3	36.05	24	65.7
	ТТ	6	0	3.01	1.2	1.2	1.3	0.93	1.4	10.0	7.2
	Та!	11.6 9 1.12	1.96 1.55	0.52	1.7	0.8	0.8	0.6	0.7	5 9.27	4.7

М2	РНА ТТ Та!	31.2 7 1.12 1.08	25.7 1.8 3.65	21.28 0.57 6.22	87.1 1.7 14.1 4	25.7 1.15 зл	56 1.6 К8	38.2 4.95 4.1	40.3 1.2 1.9	29.0 1.51 7.67	26 2.9 13.2
М3	РНА	22.4	7.89	16.88	36.3	148.5	42	78.9	27	53.7	Νϋ
	ТТ	2	0.95	1.71	1.25	1.2	1.1	1	1		Νϋ
	Та!	11.4 3 1.65	2.69	18.82	23.5 1	12.03	0.9	1.3	0.5	1.81 23.8 5	Νϋ
М4	РНА	3.88	20.7	15.22	83.7	18.6	35	38.2	45.2	57.4	15.8
	тг	2.85	7	9.07	6.9	15.8	3.7	3.8	5	7	6.6
	Та!	1.29	4.49 3.01	3.24	7.9	10.1	2.6	1.5	3.9	19.7 7 33.6 1	4.7
М5	РНА	6.25	5.74	16.74	72.2	7.45	41	56.5	32.9	33.8	12
	ТТ	2.31	1.07	4.84	3.9	0.9	0.83	1.4	1.24	5	1.95
	Та!	1.80	0.66	1.76	3.6	2.22	0.8	1.14	1.3	10.2 2 1.33	1.4
Мб	РНА	11.9	17.9	2.77	29.4	7.3	25	8.3	6.85	18.0	5.2
	ТГ	6	4	0.13	1.7	10.34	1.3	1.8	1.1	1	0.9
	Та!	4.14 1.37	1.71 1.06	0.П	2.95	9.3	1.13	1.3	1	2.49 5.8	0.3
М7	РНА	21.6	20.3	37.93	17.6	17.9	75	12.9	34.8	41.8	27.5
	ТТ	5	0	0.88	1	0.6	1.04	0.6	0.4	1	1.1
	Та!	0.97 1.78	0.80 0.68	0.73	1	0.42	0.9	0.5	0.8	1.11 1.07	0.4
М8	РНА	26.5	67.0	16.38	14.9	17.2	28.2	18.9	20.6	28.6	13.6
	ТГ	1	9	0.20	1.6	0.62	0.8	5	0.9	1	2.1
	Та!	1.20 1.12	10.7 8 0.00	0.21	1.03	0.57	0.6	1.2 0.5	0.9	1.11 1.04	1

^а Лимфоциты периферической крови выделяли, активировали РНА (4 мкг/мл), столбнячным анатоксином (ТТ) (10 мкг/мл) и Та! (5 мкг/мл), и проводили анализы, как описано в пояснении к табл. 5. Обезьян Μ1-3 инокупировали 10 мкг рекомбинантного белка Та! в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл ΒΙΒΙ: обезьян Μ4-6 инокулировали 10 мкг рекомбинантного Та! в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл А1ит; двух контрольных обезьян инокулировали ΚΙΒΙ (250 мкл и 250 мкл аутологичной сыворотки) (Μ7) и А1ит (250 мкл и 250 мкл аутологичной сыворотки) (Μ8). ΝΌ означает, что определения не проводились.

Сильная цитотоксическая реакция Тклеток (СТЬ) обнаружилась у одной обезьяны, вакцинированной Та! и ΚΙΒΙ (М1), и у двух обезьян, вакцинированных Та! и А1ит (М4 и М5), в то время как у обезьяны Мб, иммунизированной Та! и А1ит, СТЬ-реакция была слабее (фиг. 9 и табл. 12).

Таблица 12. Анализ СТЬ-реакции

Обезьяна	Неделя	Соотношение мишень-эффектор	СТЬ активность
		1:50	1:25	1:12,5	1:6,25	1:3,125	Средняя
М1	28	5.9	4.7	4.1	7.9	5.3	5.5	+
	36	ΝΟ	14.4	8.8	4.9	6.7	8.7	+
М2	28	N0	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ
	36	Νϋ	ю	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ
М3	28	0	0	0	0	0	0
	36	Νϋ	0	0.6	0.5	2.0	0.7
М4	28	0	0	1.1	1.1	2.6	0.9
	36	Νϋ	2.7	8.3	15	1.9	6.9	+
М5	28	4.9	3.9	4.7	5.5	1.7	4.1	+
	36	0	1	0	0	0	0.2

Мб	28	0	2.6	1.1	7.2	7.2	3.6	+/-
	36	Νϋ	0	0	0	0	0
М7	36	0	0	0	0	0	0
М8	36	0	0	0	0	0	0

^а Анализ осуществляли так, как описано для табл. 6. Обезьян М1-3 иммунизировали 10 мкг рекомбинантного Та! в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл Κ1ΒΙ; обезьян М4-6 инокулировали 10 мкг рекомбинантного Та! в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл А1ит; двух контрольных обезьян инокулировали ΚΙΒΙ (250 мкл и 250 мкл аутологичной сыворотки) (М7) и А1ит (250 мкл и 250 мкл аутологичной сыворотки) (М8). ΝΌ означает, что определения не проводились.

На 44 неделе определяли наличие общей антивирусной активности (ТАА). ТАА измеряли как способность РВМС от обезьян, вакцинированных рекомбинантным Та!, выращенных в присутствии аутологичной сыворотки, противостоять заражению 8ΗΙΥ 89.6Р (табл. 13).

Таблица 13. Анализ наличия общей антивирусной активности (ТАА)^а

Обезьяна, N	Дни после заражения
	7	17
	Миним. днфиц. доза (ТСГОя/клетку)	Миним. инфиц. доза (ТСГО$(/клетку)
ΜΙ	Ю*²	10'²
М2	10*	10^
М3	10*	10*
Μ4	10'²	10'²
Μ5	10‘²	10’²
Μ6	10*	10*

М7	10*	10'*
М8	10*	10*

^а РВМС собирали в 44 неделю от обезьян, вакцинированных рекомбинантным белком Та! (10 мкг) и ΚΙΒΙ (МЕЗ) или А1ит (М4-6), и от контрольных обезьян, инокулированных Κ.ΙΒΙ (М7) или А1ит (М8). РВМС, очищенные в градиенте плотности фиколла и высеянные при трехкратном повторе в количестве 5х10⁵ в 200 мкл на лунку в 48-луночные планшеты, выращивали в ΒΡΜΙ 1640, содержащей 10% ЕС8 и 5% аутологичной плазмы, предварительно прогретой при 56°С в течение 30 мин, в присутствии моноклональных антител против СОЗ (5 нг/мл) и 1Ь-2 (2 Е/мл) в течение 48-72 ч при 37°С. Клетки инфицировали серийными разведениями химерного вируса 8Н1У 89.6Р (ΙΟ^-2,10'³, ΙΟ'⁴, 10'⁵ ТСЮ₅о/клетку) в течение 2 ч при 37°С, промывали 3 раза РВ8-А и ресуспендировали в 50% кондиционированной среды и 50% свежей среды при 5х10⁵ клеток/мл/лунку. В дни 3, 7, 10, 14 и 17 после заражения собирали аликвоты культуральной среды и заменяли равными объемами свежей среды. Репликацию вируса определяли в клеточных супернатантах посредством ЕБ18А Сад р27 (СоиИег 1и!ета!юиа1, Майами, Флорида). Результаты приводятся в виде минимальной инфицирующей дозы 8Н1У (ТСГО 50/клетку) в дни 7 и 17 после заражения, способной инфицировать лимфоциты обезьян.

Результаты показывают наличие растворимой антивирусной активности, опосредованной (С08+)-Т-лимфоцитами (САЕ) (табл. 14). Наблюдали общее повышение САЕ-активности у вакцинированных обезьян по сравнению с контрольными животными.

Таблица 14. Анализ присутствия растворимой антивирусной активности, опосредованной (СО8+)-Т-лимфоцитами (САГ)^а

Обузьяна, N	Неделя после первичной иммунизации	% ингибирования репликации вируса
		Острая инфекция	Хроническая инфекция
М1	0	8	30
	32	53	53
М2	0	36	0
	32	60	27
М3	0	0	37
	32	55	29
М4	0	45	0
	32	85	66
М5	0	41	0
	32	ΝΌ	Νϋ
Мб	0	49	18
	32	34	41.4
М7	0	39	39
	32	71	44
М8	0	37	0
	32	76	26.8

Анализ наличия растворимой антивирусной активности, опосредованной (СО8+)-Тлимфоцитами (САЕ) от обезьян, вакцинированных рекомбинантным белком Та! (10 мкг) и ΒΙΒΙ (МЕЗ) или А1иш (М4-6), и от контрольных обезьян, инокулированных ВIВI (М7) или А1иш (М8). Испытания с острой инфекцией проводили на клетках СЕМ х 174, инфицированных 8Н1У 89.6Р. Анализ выполняли так, как описано для табл. 7, а результаты относятся к 7 дню после заражения. Наличие САЕ в системе хронической инфекции проверяли на клеточной линии и 1 (ссылка 47), которая представляет собой линию промоноцитов человека, хронически инфицированного ВИЧ-1. Клетки Ш, высеянные в 96-луночные планшеты в количестве 1 х 10⁴клеток на 200 мкл на лунку, инокулировали РМА (ΙΟ^-5 М), чтобы индуцировать реактивацию инфекции ВИЧ-1, без культуральных супернатантов или с разными объемами (50 мкл, 5 мкл, 0,5 мкл) культуральных супернатантов от (СО8+)-Т-лимфоцитов, полученных от вакцинированных и контрольных обезьян. Через три дня после обработки РМА посредством ВТ-анализа или ЕБ18А Сад р24 определяли наличие ВИЧ-1 в культуральной среде. Результаты приводятся в виде % инигибирования репликации ВИЧ-1 в клетках, обработанных супернатантами (СО8+)Т-клеток, по сравнению с необработанными клетками. Результаты ингибирования острой и хронической инфекции относятся к клеткам, обработанным 5 мкл супернатантов СО8+.

Также определяли продуцирование цитокинов (γΙΕΝ, 1Ь-4, ΤΝΕα) и хемокина ΒΑΝΤΕ8 РВМС обезьян, вакцинированных Та! и ΒΙΒΙ (М1-3) или Та! и А1иш (М4-6), и контрольных обезьян М7 и М8 (табл. 15).

Таблица 15. Анализ продуцирования цитокинов и хемокинов

Обезьяна

Контроль

ΡΗΑ

ΤΤ

γΙΡΝ

П--4

ΤΝΡα

ΚΑΝΤΕ5

γΙΡΝ

Ш-4

ΤΝΡα

ΚΑΝΊΈ8

γΙΡΝ

Ш-4

ΤΝΡα

ΚΑΝΤΕ8

М1

-/-

988/1096

-/-

948/-

1788/2564

-/-

-/3.8

-/-

Νά/Νά

М2

-/-

126/-

-/-

325/280

-/-

244/172

292/284

86/66

-/-

Νά/Νά

М3

Νά/Νά

М4

-/-

426/66

-/·

98/-

-/284

-/-

-/224

Νά/Νά

М5

-/-

48/-

-/-

279/303

-/-

416/-

536/608

-/-

-/·

Νά/Νά

Мб

-/-

246/-

255/137

-/-

1124/268

-/-

-/266

Νά/Νά

М7

-/-

150/169

-/-

40/-

1228/976

-/-

-/4

-/ηά

Νά/Νά

М8

-/-

0/0

20/32

60/-

2160/1588

-/-

-/πά

Νά/Νά

Обезьяна	Таг (1 мкг)	Та! (5 мкг)
	γΙΡΝ	П.-4	ΤΝΡα	ΚΑΝΤΕ8	γΙΡΝ	1Ц-4	ΤΝΡα	ΚΑΝΤΕδ
ΜΙ	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	16/-	-/-
М2	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-
М3	Νά/Νά	Νά/Νά	Νά/Νά	Νά/Νά	Νά/Νά	Νά/Νά	Νά/Νά	Νά/Νά
Μ4	-/-	-/-	378/430	-/-	-/-	-/-	344/352	-/-
Μ5	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-
Μ6	-/-	-/5	-/-	-/-	-/78	-/-	150/-	-/-
Μ7	-/40	-/3-3	84/-	-/-	-/-	-/3.2	-/-	-/-
Μ8	-/-	-/4.8	-/-	-/-	-/-	-/10	-/-	726/528

^а Анализ продуцирования цитокинов и хемокинов через 48 и 96 ч (48/96) в культуре РВМС обезьян, вакцинированных 10 мкг Та! и Κ.ΙΒΙ (М1-3) или А1ит (М4-6). Контрольных обезьян (М7 и М8) инокулировали адъювантами ΚΙΒΙ или А1ит, соответственно.

РВМС, отобранные на 44 неделе и очищенные с помощью градиента плотности фиколла, высевали в 24-луночные планшеты в количестве 1 х 10⁶ клеток/мл на лунку, и выращивали в ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% РС8. РВМС не стимулировали (контроль), чтобы оценить спонтанную секрецию цитокинов и хемокинов, или стимулировали РНА (2 мкг/мл), столбнячным анатоксином (ТТ, 5 мкг/мл) или Та! (1 или 5 мкг/мл). Аликвоты культуральных супернатантов отбирали через 48 и 96 ч после стимуляции, и определяли наличие цитокинов и хемокинов с помощью коммерческих наборов для ЕЫ8А от Вю-8оигсе 1и!ета!юиа1 (СатагШо, Калифорния, США), чтобы оценить продуцирование цитокинов, и от Ρ&Ό 8у51ст5 (АЬсНдбоп, Оксон, Соед. К-во), чтобы оценить продуцирование ΡΑΝΤΕ8. Результаты приводятся как число пг/мл в культуре через 48 и 96 ч (48/96), соответственно. Предельные критические величины составляли (пг/мл) 31,2 для γΙΡΝ; 3,12 для 1Ь-4; 15,6 для ΤΝΡ?; 6,25 для ΚΑΝΤΕ8. Величины (-) были ниже, чем соответствующие предельные критические величины. Νά означает, что измерения не проводились.

Кроме того, на 15 неделе пять обезьян, вакцинированных рекомбинантным белком (М2-6), показали положительную реакцию при кожной пробе на Та! при сильной реакции замедленной чувствительности (табл. 16 и фиг. 19). У обезьян 4 и 5 в последующие недели реакция при кожной пробе была даже сильнее (табл. 16).

Таблица 16. Кожная проба на Та1^а

Обезьяна	Недели от первой иммунизации
	11	15	21	28	32	36	44
ΜΙ	-			-	-	-	-
М2	-	+	+	+/-	+/-	+	+/-
М3	+/-	+	+/-	+/-	-	-	-
Μ4	-	+	++	++	++	++	++
Μ5	+7-	+	++	+	++	++	+
Μ6	-	+	+/-	+/-	-		-
Μ7	Νϋ	ΝΟ	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ
Μ8	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ

^а Та! (1 и 5 мкг) в 150 мкл РВ8-0Д% ΒΞΑ или в одном буфере инокулировали интрадермальным способом в выбритый участок спины вакцинированных обезьян. Контрольным животным в недели 11, 15, 21, 28, 32, 36 и 44 после первой иммунизации инокуляцию не проводили (Νϋ, не проводили). Обезьян МЕЗ вакцинировали 10 мкг рекомбинантного Та! в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл Κ.ΙΒΙ; обезьян М4-6 вакцинировали 10 мкг рекомбинантного Та! в 250 мкл аутологичной сыворотки и 250 мкл А1ит; двух контрольных обезьян инокулировали ΚΙΒΙ (250 мкл и 250 мкл аутологичной сыворотки) (М7) или А1ит (250 мкл и 250 мкл аутологичной сыворотки) (М*). Наличие эритематозного узла через 48-72 ч наводило на мысль о реакции замедленной гиперчувствительности (ОТН): ++ соответствует 0 > 5 мм; ++ соответствует 0 > 1-4 мм; +/- соответствует эритеме без затвердевания; - соответствует 0 < 1 мм.

Результаты, полученные после заражения, показывают, что 4/6 (67%) вакцинированных обезьян были защищены от заражения 10 МГО₅о 8Н1У 89.6Р, как видно из результатов вирусологических анализов (табл. 17). В частности, антиген Сад 1127 не обнаруживался в плазме обезьян М1, М2, М4 и Мб, провирусная ДНК в лимфоцитах этих обезьян методом РСК не обнаружена, и цитовиремия была отрицательной. Обезья ны М3 и М5 были инфицированы, как показали наличие в плазме антигена Сад р27, обнаружение провирусной ДНК в клетках и положительная цитовиремия (табл. 17). Оба контрольных животных (М7 и М8) оказались инфицированными, как показали результаты тех же вирусологических анализов. Для дополнительного контроля за инфективностью дозы вируса, используемой для заражения, к контрольным животным присоединили еще одну исходную обезьяну (М13), и инфицировали ее 2,85 МГО₅₀8Н1У 89.6Р (соответствует дозе вируса в 3,5 раза меньшей, чем доза, использованная для заражения животных по протоколу). В результате, как показали все вирусологические анализы, обезьяна М13 оказалась инфицированной. Для того, чтобы подтвердить, что вирус воздействовал на животных, проводили анализ на присутствие антител против антигенов 81У, кодированных химерным вирусом 8Н1У 89.6Р (Сад, Ро1, КТ, Νεί), так, как уже описано в данном примере. Присутствие антител против 81У у обезьян, отрицательных по вирусологическим параметрам (М1, М2, М4 и Мб), подтверждает, что вирус воздействовал на этих животных, и показывает, что имела место абортивная инфекция 8ΗΙV у этих обезьян. Обезьян с антителами против 81V с низкими титрами исследовали на продуцирование ίη νίίτο специфического антивирусного 1дС (IVАР) (ссылки 177, 178), как описано далее. РВМС (2 х 10⁶/лунку) высевали в 24-луночные планшеты и стимулировали Р\УМ (2 мкг/мл, 81дша, Сент-Луис, США). После 7 дней инкубации (при 37°С в присутствии 5% СО₂ и 95% влажности) культуральные супернатанты собирали и анализировали на продуцирование антител против ВИЧ с помощью коммерческого набора для ЕЫ8А для обнаружения антител против ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (АЬЬоИ, ЮУ-1/ШУ-2 ΕΙΑ Τΐύτά Сеиегайои Ииз). В результате все зараженные обезьяны оказались положительными в отношении продуцирования антител против ВИЧ Εην, так как Εην ВИЧ-1 присутствует в 8Н1У 89.6Р.

Таблица 17. Анализ вирусологических параметров

Обезьяна

Дни после заражения 8ШУ89.6Р

15

30

60

р27* (пг/мл)

ПЦРДНК (коп./ мкг)^ь

Цитовиремия^с

1^0 против 3ΐν

р27 (пг/мл)

ПЦРДНК (коп./ мкг)

Цитовиремия

Ι8Ο против 81У

р27 (пг/мл)

ПЦРДНК (коп./ мкг)

ЦитовиреМш

ДО против 81У

М1

<20

<1

отриц

1:2

<20

<1

отриц

1:2

<20

<1

отриц

1:2

М2

<20

<1

отриц

1:2

<20

<1

отриц

Г.2

<20

<1

отриц

1:2

М3

73.3

855

707.3

отриц

26.22

959

74.95

отриц

<20

71

<1

1:10

М4

<20

<1

отриц

1:2

<20

<1

отриц

1:2

<20

<1

отриц

1:2

М5

964

1147

>2818.3

отриц

20.8

78

1:2

<20

65

44.6

1:10

Мб

<20

<1

отриц

1:8

<20

<1

отриц

1:8

<20

<1

отриц

1:6

М7

287.8

838

707.9

>1:50

65.2

858

354.8

>1:50

<20

439

11.2

1:6400

М8

106.7

376

707.9

1:2

<20

311

44.6

1:5

<20

56

2.8

1:6400

М13

1876

+/

+е

ΝΟ

<20

+/

Νϋ

1:1600

<20

43

ΝΟ

1:3200

Анализ вирусологических параметров после заражения обезьян, вакцинированных 10 мкг рекомбинантного Та! и ΚΙΒΙ (МПЗ) или А1иш (М4-6). Контрольных обезьян (М7 и М8) инокулировали ΚΙΒΙ или А1иш, соответственно. Обезьяна М13 была исходным животным, инфицированным 2,85 МШ₅₀ 8Н1У89.6Р.

^а Антигенимию плазмы оценивали методом ЕБ18А Сад р27 (1ппо-дспсОс5. Бельгия), и выражали ее в количестве р27 (пкг/мл). Отр соответствует величинам ниже соответствующей предельной критической величины (18 пкг/мл).

^ь ДНК выделяли из цельной крови с использованием набора ΟΙΑιηρ Ыоос! (Аидюдеи СшЫ1 апб О|адсп 1пс., НПбеп, Германия). Качество ДНК регулировали посредством РСКамплификации β-глобинового гена, как описано ранее (ссылка 141). Присутствие провирусной ДНК анализировали методом полуколичественной РСК- амплификации дад 81У. РСК осуществляли с 1 мкг клеточной ДНК с использованием праймеров 8С1096Мдад (соответствует нуклеотидам 1096-1119 генома 81Ушас251; 8Εζ) Ш N 35, 5'ТТАСССТАССАССССС СССАААСАЗ') и

8С1592СдадО (картируется по нуклеотидам 1569-1592 генома 81Ушас251; 8Εζ) Ш N 36, 5'АТАСССССТССАСССТТСТСАСАСЗ'), которые амплифицируют фрагмент гена дад 8Н1У в 496 пар оснований, как описано ранее (ссылка 153). Для того, чтобы количественно определить число копий провирусной ДНК, в каждом эксперименте получали стандартную кривую с использованием в качестве матричной ДНК плазмиды рСМКП-Ддад (с делецией в 100 пар оснований в гене дад 81Ушас251) и праймеров, описанных выше, аплифицирующих фрагмент ДНК в 396 пар оснований. Продукты РСК анализировали методом электрофореза и устанавливали количество с помощью денситометрического анализа (иИгазсаи ЬХ Еийапсет Ьазет, ЬКВ, Бромма, Швеция). Соотношение между величинами Οϋ и числом молекул плазмиды дад коррелировали методом линейного регрессионного анализа (8!а!дгарЫс8, Машд1811С8, 1ис. СашЬпбдс. Миннесота). Величины Οϋ оставались линейными до 1000 молекул (коэффициент корреляции = 0,954 ± 0,026). Число копий провирусной ДНК 8Н1У на мкг клеточной ДНК опре делили посредством интерполяции величин ОЭ каждого образца к стандартной кривой. Чувствительность анализа составляла 1 копию провируса на мкг ДНК.

^с Цитовиремию определяли при анализах методом сокультивирования. С этой целью 1 х 10⁴ клеток СЕМ х 174 культивировали в присутствии серийных разведений РВМС, обедненных СО-8, при исследовании (всего 12 разведений от 1 х 10⁶ до 3,9 х 10³ клеток на лунку) в 96луночных планшетах. В дни 3, 7 и 10 после заражения извлекали 150 мкл для анализа на присутствие Сад р27 методом ЕБ18А (1пподспсОс5. Бельгия) и заменяли равным объемом свежей среды. Результаты анализировали с помощью формулы Весе! и Миепсй для определения числа продуктивно инфицированных РВМС на миллион всех клеток.

^н Наличие антител против 8НIV определяли на серийных разведениях плазмы животных при двукратном повторе с использованием набора ΕΙηνίη Ас-АЬ-Ак II (О1адио811с Ра§!еш, Париж, Франция) согласно рекомендациям изготовителя. Показано наибольшее разведение, при котором величины для плазмы выше, чем предельная критическая величина.

^е В случае обезьяны М13 вместо цитовиремии осуществляли изоляцию вируса. С этой Таблица 18. ЕАС8-анализ

Обезьяна	Дни после заражения 5ΗΙΥ89.6Ρ
	0	15	30	60
	% (клетки/мкл)		% (клетки/мкл)		% (клетки/мкл)			% (клетки/мкл)
	С1М+	СО8+	СО4+/ ϋϋ8+	СО4+	0ϋ8+	СО4+/ СО8+	СШ+	Οϋ8+	СО4+/ Οϋ8+	СО4+	СО8+	СО4+/ СО8+
М1	32.1 (1490)	53 ¢2460)	0.6	ΝΟ	Νϋ	Νϋ	30.8 (2420)	57.3 (4500)	0.54	30.6 (2460)	57.9 (4670)	0.53
М2	27.7 (1550)	45.3 (2530)	0.6	Νϋ	Νϋ	Νϋ	35.5 (2120)	43.7 (2610)	0.81	29.6 (2000)	42.4 (2870)	0.7
М3	33 (1120)	39.3 (1340)	0.84	Νϋ	Νϋ	Νϋ	3.1 ¢190)	75.6 (4660)	0.04	6.2 (240)	70 (2750)	0.09
М4	16.6 (670)	68.3 (2740)	0.24	ΝΟ	Νϋ	Νϋ	17.25 (2050)	68.7 (8180)	0.25	15.5 (1520)	75 (7350)	0.21
М5	36.3 (2770)	43.9 (3350)	0.83	Νϋ	Νϋ	Νϋ	1.1 (90)	82.3 (1300)	0.01	4.1 (480)	75.5 (8730)	0.05
Мб	35.3 (1210)	43.4 (1490)	0.81	ΝΟ	Νϋ	Νϋ	35.9 (1240)	45.5 (1570)	0.79	37.8 (3700)	43.7 (4280)	0.86
М7	36.1 (1610)	31.3 (1400)	1.15	Νϋ	Νϋ	Νϋ	7.4 (480)	66.1 (4260)	0.11	13.7 (860)	56.7 (3550)	0.24
М8	25.7 (850)	51.3 (1710)	0.5	Νϋ	Νϋ	Νϋ	3.3 (2Ю)	76.2 (4840)	0.04	8.1 (590)	64.9 (4670)	0.13
М13	40.5 (2590)	39.7 (2544)	1.01	38.4 (434)	33.6 (380)	1.14	35.1 (1721)	32.2 (1479)	1.16	3.1 (111)	62.3 (2225)	0.05

^а ЕАС8-анализ (СО4+)- и (СО8+)лимфоцитов от обезьян, вакцинированных 10 мкг рекомбинантного Та! и Κ.ΙΒΙ (МЕЗ) или А1ит (М4-6). Контрольных обезьян (М7 и М8) инокулировали только адъювантами Κ.ΙΒΙ или А1ит, соответственно. Обезьяна М13 была исходным животным, инфицированным 2,85 МГО₅₀ 8Н1У 89.6Р. Анализ осуществляли методом возбужденной флуоресценции сортирован целью РВМС (3 х 10⁶) от обезьян, инфицированных разными дозами 8Н1У 89.6Р, очищенных в фиколле, культивировали с клетками СЕМ х 174 (1 х 10⁶) в 1 мл среды, содержащей 10% ЕС8. Через 24 ч клетки разводили до 1 х 10⁶ на мл и культивировали в течение 3 суток. Затем отбирали 2 мл среды, и клетки повторно высевали в количестве 3 х 10⁵/мл в 7 мл. Избыток клеток отбрасывали. Эту процедуру повторяли дважды в неделю в течение 4 недель. Присутствие вируса определяли методом ЕБ18А Сад р27 Цплодеиейск, Бельгия), а затем методом ВТ-анализа. Изоляцию вируса считали положительной (+), когда оба анализа (р27 и ВТ) 3 последовательных образцов были положительными.

В противном случае изоляцию вируса считали отрицательной (-).

^г Для обезьяны М13 осуществляли количественную РСК ДНК.

Вирусологические данные перекрывают абсолютное число С04-лимфоцитов, которое в результате драматически снижалось у инфицированных обезьян (М3, М5, М7, М8) и было высоким и устойчивым у вирусотрицательных животных (М1, М2, М4, Мб), как видно из табл. 18.

)- и (С08+)-лимфоцитов^а ных клеток (ЕАС8), как описано ранее (ссылка 137), с использованием меченных моноклональных антител (аи!1-СО4-Е1ТС, Вю8оигсе; аийСО8-РегСр, ВесЮп-Оюкткои). Νϋ означает, что анализ не проводился.

Результаты, полученные до заражения, показывают, что Та! как иммуноген, как и ΚΙΒΙ и А1ит как адъюванты (или 18СОМ, который использовали в качестве адъюванта при последней инъекции), хорошо переносились животными и были нетоксичными, что подтверждает результаты относительно безопасности и толерантности иммунизации Та!, полученные в первом пилотном эксперименте. Кроме того, эти данные подтверждают наблюдения в первом пилотном эксперименте, дополнительно проясняя тот факт, что рекомбинантный белок Та! выявляет сильную гуморальную и клеточную реакцию, специфическую к Та!, с антивирусным действием ίη νίίτο и ίη νίνο. Результаты, полученные после заражения (4 защищенных обезьяны из 6), подтверждают ожидаемые результаты ίη νίίτο и показывают, что вакцина против Та! индуцирует защиту от инфекции и, следовательно, от болезни. Контроль за двумя вакцинированными и инфицированными обезьянами прояснит действие вакцинации на развитие болезни.

Пример 5. Инокуляция Масаса Га8сюи1ап8 вакциной против Та! на основе ДНК: анализ безопасности, толерантности, специфической иммунной реакции и эффективности защиты от заражения вирусом.

Предполагается прямая инокуляция ДНК плазмиды ρθν-Та!, содержащей кДНК гена !а!, и плазмиды ρί'νο в качестве контрольной ДНК. Плазмидные ДНК, которые вводят животным, амплифицируют в Е. отН (штамм ΌΗ5) в соответствии со стандартными процедурами (ссылка 110) и протоколами, утвержденными Еигореап А де псу Γογ (Не еνа1иаί^οη οΓ шеШса1 ргобис!^ Ηитаη МеФсше Ενа1иа!^οη υηί! (техническое сообщение, серия № 17, январь, 1997), очищают в двух градиентах С§С1 и диализуют в течение 48-72 ч против 100 объемов РВ8. Затем ДНК контролируют посредством расщепления рестриктазами. Функциональность плазмидной ДНК проверяют с помощью трансфекции 5-10 мкг ДНК, с использованием кальцийфосфатного метода (ссылка 110), в клетки Н3Т1 (1 х 10⁶), содержащие интегрированную копию репортерной плазмиды ЬТВ-САТ ВИЧ-1, и, спустя 48 ч, посредством анализа САТ-активности (ссылка 55). Толерантность, безопасность, способность выявлять специфическую иммунную реакцию (как гуморальную, так и клеточную) и эффективность защиты от заражения вирусом после иммунизации плазмидной ДНК ρСV-Та! оценивали на собакоподобных обезьянах (Масаса Га§с1си1ап5). В первом пилотном эксперименте трех обезьян иммунизировали по следующей схеме: обезьяну М1 инокулировали 200 мкг ρθν-Та! в 300 мкл РВ8 ί.ά. способом в 2 места на спине вблизи подмышечных лимфоузлов (150 мкл на место); обезьяну М2 инокулировали 500 мкг ρθν-Та! в 500 мкл РВ8 1.ш. способом в 2 места на спине (250 мкл на место). В 1 и 5 дни до 1.ш. инокуляции в два предварительно отмеченных места, в которые должна быть инокулирована плазмидная ДНК, инъецировали 250 мкл физиологического раствора, содержащего 0,5% бупивацина и 0,1% метилпарабена. Это делали для того, чтобы повысить поглощение и экспрессию ДНК в мышце (ссылки 37, 45). Обезьяну МЗ не инокулировали и использовали в качестве контрольного животного. Однако, начиная с 10 недели, эту обезьяну инокулировали ί.ά. 6 мкг (5+1 мкг) Та! как контроля в случае кожных проб. У всех обезьян в 42 и 35 дни, предшествующие первой инокуляции, брали по 10 мл крови для анализа базовых параметров. Обезьян инокулировали в момент времени 0 и через 5, 10, 15, 22, 27, 32 и 37 недель. Наконец, на 42 неделе животные получали последнюю инъекцию рекомбинантного белка Та! (16 мкг) в 200 мкл 18СОМ и 300 мкл РВ8. За животными наблюдали ежедневно для оценки клинических параметров, как описано в примере 4. Кроме того, по 10 мкл крови отбирали в тот же день, когда проводили инокуляцию, как описано в примере 4. Защитное действие вакцинации определяли после заражения обезьян 10 МГО₅₀ 8НШ89.6Р, которую инъецировали внутривенно на 65 неделе. Продолжали наблюдение после заражения, как описано в примере 4. Результаты эксперимента следующие. У двух вакцинированных обезьян и у контрольной обезьяны не наблюдалось никаких изменений клинических, гематологических и поведенческих параматров. Не обнаружено признаков воспаления или неоваскуляризации в местах инъекций. Эти результаты показывают, что ДНК ρСV-Та! хорошо переносилась животными и не была токсичной при дозах и способах введения, использованных в эксперименте. У обезьяны М1, вакцинированной 200 мкг ДНК ί.ά. способом, с 32 недели развивались Та!специфические антитела 1дС (фиг. 11). Титры антител (с 32 недели по 58 неделю) колебались от 1:100 до 1:800 (фиг. 12). На 37 неделе анализ картирования эпитопов (осуществленный так, как описано в пояснении к фиг. 4) показал, что эти антитела направлены против специфических областей Та!, с картированием в ак 1-20, ак 4660 и 65-80 с титрами 1:200, 1:100 и 1:50, соответственно (данные не приводятся). У обезьяны М2, вакцинированной 500 мкг ДНК 1.ш. способом, антитела против Та! едва обнаруживались (с титром 1:50, не показано) на протяжении всего периода исследования. Результаты показаны на фиг. 11. Способность плазмы обезьяны М1, вакцинированной 200 мкг ДНК ί.ά. способом, нейтрализовать Та!-активность проверяли путем анализа ингибирования сохранения репликации вируса в клетках НЬМ1, инкубированных с экзогенным Та!, как описано в примере 4. Этот анализ показал, что плазма обезьяны М1, разведенная 1:2 и полученная на 37 неделе, снижала репликацию вируса, индуцированную 30 нг/мл экзогенного Та!. Напротив, плазма той же обезьяны, полученная в момент времени 0 (предиммунная) не блокировала внеклеточный Та! (табл. 19).

Таблица 19. Нейтрализующая активность плазмы в отношении сохранения вирусной инфекции, индуцированной вне59 клеточным Та!^а

Образцы

Та! + предиммунная М1

Та! + иммунная М1

Ингибирование

О ^а Способность антител против Та! нейтрализовать Та!-активность определяли путем добавления 30 нг/мл рекомбинантного Та! к клеткам НЬМ1, предварительно инкубированным с равным объемом плазмы, полученной в момент времени 0 (предиммунная) или на 37 неделе (иммунная) от обезьяны М1, вакцинированной 200 мкг плазмидной ДНК рСУ-Та! ί.ά. способом. Анализ осуществляли и результаты выражали так, как описано в пояснении к табл. 4.

Результаты, приведенные в табл.20, показывают наличие пролиферативной реакции на Та! на 42 неделе у обезьяны М1, иммунизированной 200 мкг ДНК ί.ά. способом, в то время как у обезьяны М2 клеточной реакции такого типа не обнаружено.

Таблица 20. Пролиферативная реакция на Та1^а

Обезьяна	Стимул	Недели после первичной иммунизации
		15	22	27	32	37	42	48	58
М1	РНА	32,9	45	89,3	40,5	3,1	13,3	Νϋ	13,1
	ТТ	0,8	2,7	1,5	1,3	0,6	9	1,2	1,6
	Та!	0,9	1,7	1,2	1.1	1,1	5,9	1	1
М2	РНА	11.7	18,5	21,8	32,2	1,1	6,2	7	18,9
	ТТ	0,9	1,8	0,8	1,1	1	1,5	1,1	1
	Та!	0,8	1,4	0,9	1.1	1,1	1.3	1.1	1

М3	РНА	5,1	19,9	18,2	6,6	8,1	77,8	Νϋ	2,1
	ТТ	7,2	6,2	5,5	2,8	5,6	36,8	1	2,1
	Та!	2,1	1,4	2,2	0.7	1,5	2,8	0,8	0,9

^а РВМС выделяли, стимулировали РНА (4 мкг/мл), столбнячным анатоксином (ТТ) и Та! (1 или 5 мкг/мл), и проводили испытания так, как описано в пояснении к табл. 5. Обезьян вакцинировали 200 мкг (М1) рСУ-Та! ί.ά. способом или 500 мкг (М2) рСУ-Та! 1.т. способом. Обезьяну (М3) не вакцинировали, но после 10 недели инокулировали ί.ά. 6 мкг (5+1 мкг) Та! как контроль в случае кожных проб. ΝΌ означает, что определения не проводились.

Цитотоксическую активность против Та! (СТЬ) обнаружили у обезьяны М1 на 42 и 48 неделе и у обезьяны М2 на 48 неделе. Кроме того, на неделе 48 наблюдали положительную СТЬ-реакцию у обезьяны М3, которую иноку лировали только после недели 10 6 мкг Та! как контроль в случае кожных проб (табл. 21).

Таблица 21. Анализ Та!-специфической цитотоксической активности (СТЬ)^а

Обезьяна	Неделя	Соотношение мишень-эффектор	СТЬ активно СТЬ
1:50	1:25	1:12,5	1:6,25	1:3,125	Ме61а
М1	42	27,4	27,8	17,1	9,8	3,9	17,2	⁺
	48	Νϋ	Νϋ	21,3	0	11,7	11	+
М2	42	1.2	5,9	2,4	1	0	2,1
	48	Νϋ	Νϋ	Νϋ	57	25,1	41	+
М3	42	0	0	0	1,2	0	0,6
	48	Νϋ	12.4	4.2	0	0	0	⁺

^а Анализ осуществляли так, как описано в пояснении к табл. 6. Обезьян вакцинировали 200 мкг (М1) рСУ-Та! ί.ά. способом или 500 мкг (М2) рСУ-Та! 1.т. способом. Обезьяну (М3) не вакцинировали, но после 10 недели инокулировали ί.ά. 6 мкг (5 + 1 мкг) Та! как контроль в случае кожных проб. ΝΌ означает, что определения не проводились.

Результаты, приведенные в табл.22, показывают на 52 неделе наличие общей антивирусной активности (ТАА) у обеих обезьян, вакцинированных 200 и 500 мкг ДНК.

Таблица 22. Анализ общей антивирусной активности (ТАА)^а

Обезьяна	Дни после заражения
	7	17
	Минимальная инфицирующая доза (ТСШбо/клетку)	Минимальная инфицирующая доза (ТСГО5о/клетку)
М1	10“*	Ю⁴
М2	10*	10^
М3	кг⁵	иР

^а Анализ осуществляли так, как описано в пояснении к табл.

13. Обезьян инокулировали 200 мкг (М1) рСУТа! ί.ά. способом или 500 мкг (М2) рСУ-Та! 1.т. способом. Обезьяну (М3) не вакцинировали, но после 10 недели давали ί.ά. 6 мкг (5+1 мкг) Та! как контроль в случае кожных проб. РВМС собирали на 52 неделе от первичной иммунизации и когда инфицировали 8Н1У 89.6Р (ΙΟ^-2, 10'⁴, ΙΟ'⁶, 10'⁸ ТС10₅о/клетку). Результаты представлены в виде минимальных инфицирующих доз 8Н1У (ТСГО₅₀/клетку), которые еще способны инфицировать клетки.

Результаты, приведенные в табл. 23, показывают наличие на неделе 22 и 27 растворимой антивирусной активности (САР), опосредованной (С04+)-Т-лимфоцитами, у обеих вакцинированных обезьян. Эта активность у контрольной обезьяны была ниже.

Таблица 23. Анализ опосредованной клетками СЭ8+ растворимой антивирусной активности (САГ)^а

Обезьяна	Недели после первич. иммунизации	% ингибирования репликации вируса
		Острая инфекция	Хроническая инфекция
М1	22	62	27
	27	56	25
М2	22	74	Νϋ
	27	28	Νϋ
М3	22	24	Νϋ
	27	37	22

^а Анализ наличия растворимой антивирусной активности, продуцированной (СО8+)-Тлимфоцитами (САР), полученными от обезьян, инокулированных 200 мкг (М1) и 500 мкг (М2), и от обезьяны (М3). Антивирусную активность анализировали при острой и хронической инфекции в клетках СЕМ х 174, инфицированных 8Н1У 89.6Р, и в клетках ОМ-10-1, хронически инфицированных ВИЧ-1, как описано в пояснении к табл. 7. Результаты представлены в виде процента (%) ингибирования репликации вируса в клетках, обработанных супернатантами от (С08+)-Т-лимфоцитов, по сравнению с необработанными клетками. Результаты по острой и хронической инфекции, приведенные в таблице, относятся к образцам, обработанным 5 мкг супернатантов культур СО8+. ΝΌ означает, что определения не проводились.

Результаты, приведенные в табл. 24, показывают, что у обезьяны М1, инокулированной 200 мкг ДНК ί.ά. способом, кожная проба на Та! положительна на 22 неделе.

Таблица 24. Кожная проба на Та1^а

Недели после иммунизации	Обезьяна
	М1	М2	М3
10
15			-
22	+		-
27			-
32
37
42
48
52
58

^а Та! (1 и 5 мкг) в 150 мкл РВ8-0,1% В8А или в одном буфере (контроль) инокулировали ί.ά. в предварительно подготовленную (Ιΐιποίιοίοιηίζεά) область верхней части спины вакцинированных животных и контрольной обезьяны (контроль на специфичность реакции) в недели 10, 15, 22, 27, 32, 37, 42, 48, 52 и 58 от первичной иммунизации. Обезьяну М1 инокулировали ί.ά. 200 мкг ДНК плазмиды рСУ-Та!, в то время как макака М2 получала 500 мкг той же плазмиды ί.πι.. Обезьяну М3 (контроль) не вакцинировали, но после 10 недели она получала ί.ά. 6 мкг (5 + 1 мкг) Та! как контроль в случае кожных проб. Появление эритематозного узла через 48 и 72 ч показало наличие гиперчувствительности замедленного типа (ЭТИ): ++ соответствует 0 > 5 мм; + соответствует 0 1-4 мм; ± соответствует эритеме без затвердевания; + соответствует 0 < 1 мм.

Эти результаты показывают, что плазмида рСУТа! (ДНК рСУТа!) хорошо переносилась и была безопасна как при внутрикожном, так и при внутримышечном введении в данных дозах. Кроме того, эти результаты показывают, что иммунизация ДНК рСУТа! индуцирует как гуморальную (хотя и более слабую, чем индуцируемая посредством иммунизации рекомби нантным белком Та!), так и клеточную иммунную реакцию против Та! с противовирусным действием. Что касается эффективности защиты после заражения (осуществленного на 65 неделе от первичной иммунизации), то вирулогические данные, в том числе, измерения антигенимии и цитовиремии, и определение числа копий провирусной ДНК (ДНК-РСК) в РВМС, показывают, что обезьяна М2, иммунизированная ί.ιη. ДНК Та!, защищена от заражения 10 МГО₅₀8Н1У-89.6.Р, в то время как макака М1, иммунизированная ί.ά. меньшей дозой ДНК Та! (200 мкг), оказалась зараженной, что наводит на мысль, что, относительно иммунизации ДНК, 1.ш. способ более эффективен, чем ί.ά. инокуляция. Контрольная обезьяна, в результате, также резистентна к инфекции. Однако, как описано ранее, эта обезьяна, в отличие от контрольных животных в других схемах экспериментов, получала повторные кожные пробы на Та! для того, чтобы проверить специфичность теста (табл. 24), и антитела против Та!, хотя с низкими титрами (1:100), обнаруживались с 32 недели от начала иммунизации (данные не приводятся). Кроме того, пролиферативная реакция на Та! у этой обезьяны показала слабую и спорадическую реактивность на антиген (табл. 20). Наконец, обезьяна М3 показала наличие специфических СТЬ против Та! (табл. 21). Хотя и предварительно, эти данные показывают, что повторная ί.ά. инъекция 6 мкг Та! могла привести к иммунизации животного и к защите от заражения. Таким образом, обезьяна М3 будет считаться вакцинированной ί.ά. белком Та! и исследоваться как таковая.

Оценка методом ЕАС8 процента и абсолютного числа копий СЭ4- и С08-лимфоцитов подтвердила вирусологические данные, показав четкое снижение (приблизительно в 4 раза) числа С04-лимфоцитов у зараженной обезьяны уже при первом анализе после заражения (30 день) и позднее (60 день) (табл. 25).

Таблица 25. Анализ вирусологических параметров

Обезьяна

Дни после заражения 5ΗΙΥ89.6Ρ

15

30

60

р27^а (пг/мл)

ПЦР ДНК (коп./ мкг)^ь

Циговиремия'

1§С против

Р27 (пг/мл)

ПЦР ДНК (коп./ мкг)^ь

Цитовиремия'

1§О против 5ΐν

р27 (£11/νΚ)

ПЦР ДНК (коп./ мкг)^ь

Цитовиремия'

1«О против 5ΐν

М1

1796

1278

>2818.3

1:10

68.6

1048

353-9

1:50

<20

8

21.3

1:800

М2

<20

<1

отр ИЦ.

1:10

<20

<1

отриц.

1:50

<20

<1

отриц.

1:10

М3

<20

<1

отриц.

>1:50

<20

<1

отриц.

>1:50

<20

<1

отриц.

1:100

Обезьяна М1 иммунизирована ί.ά. 200 мкг рСУТа!, обезьяна М2 - 500 мкг рСУТа! ί.ιη.. Макаке М3 несколько раз делали инъекции 6 мкг белка Та!, интрадермально, для того, чтобы контролировать специфичность кожной пробы. Поэтому со времени заражения макаку М3 рассматривали, как вакцинированную обезьяну. Вирусологические параметры оценивали так, как описано в пояснении к табл. 17.

Оценка методом ЕАС8 процента и абсолютного числа копий СЛ4- и С08-лимфоцитов подтвердила вирусологические данные, показав четкое снижение (приблизительно в 4 раза) числа С04-лимфоцитов у зараженной обезьяны уже при первом анализе после заражения (30 день) и позднее (60 день) (табл. 26).

Таблица 26. РАС8- анализ подмножеств СО4 и СО8

Обезьяна	Дни после заражения вирусом 8Н1У89.6Р
	0	15	30	60
		% (клетки/мкл)			% (клетки/мкл)		% (клсггкн/мкл)			% (клетки/мкл)
	СЕ)4+	СО8+	СО4+/СО8+	С1М+	Οϋδ+	СО4+/СО8+	С1Э4+	СО8+	СО4+/СО8+	Οϋ4+	СО8+	СО4+/С08+
М1	27.5 (940)	40.7 (1390)	0.68	ΝΟ	Νϋ	Νϋ	8.1 (250)	56.5 (1780)	0.14	9.5 (360)	69.7 (2650)	0.14
М2	22.2 (490)	36.8 (810)	0.6	Νϋ	Νϋ	Νϋ	16.4 (580)	42.4(1500)	0.39	10.9 (940)	52.7 (4560)	0.21
М3	28.7(1170)	41.1(1680)	0.7	Νϋ	Νϋ	Νϋ	19.5 (970)	48.7 (2430)	0.4	17.9 ¢900)	52.2 2620)	0.34

Анализ осуществляли так, как указывается в пояснении к табл. 18. Обезьяна М1 иммунизирована ί.ά. 200 мкг плазмидной ДНК рСУТа!, обезьяна М2 - 500 мкг рСУТа! ί.ητ.. Макака М3 вакцинирована 6 мкг белка Та! интрадермально.

На основании этих результатов планировали второй эксперимент, при котором оценивали действие иммунизации ДНК рСУТа! на 3 обезьянах (М9-11) при сравнении с контрольной обезьяной (М12), которая получала ДНК рСУО. Всех животных инокулировали ΐ.ιη. в 2 места на спине в целом 1 мг рСУТа! (М9-11) или рСУО (М12). За 1 или 5 дней до вакцинации в два отмеченных места, в которые затем должна быть инъецирована плазмида, инъецировали 250 мкл физиологического раствора, содержащего 0,5% бупивацина и 0,1% метилпарабена. Макак вакцинировали в момент времени 0 и в недели 6, 11, 15, 21, 28 и 32. Последнюю повторную инъекцию осуществляли на 36 неделе рекомбинантным белком Та! (16 мкг), ресуспендированным в 200 мкл 18 СОМ и 300 мкл РВ8. Животных проверяли каждый день на клинические параметры, как описано в примере 4. Кроме того, за 9 дней до первичной иммунизации и при каждой иммунизации брали 10 мл крови, как описано в примере 4. Для того, чтобы оценить защитное действие вакцинации, обезьян заражали на 50 неделе от начала иммунизации путем внутривенной (ί.ν.) инъекции 10 МТО₅₀8Н1У-89.6Р. Наблюдение продолжали и осуществляли и после заражения так, как описано в примере 4.

Результаты этого эксперимента следующие. Не отмечено никаких изменений в поведении, клинических параметрах и химическом составе крови как у вакцинированных, так и у контрольных животных. В местах инъекций не обнаружено никаких признаков воспаления или новых сосудистых образований. Эти результаты подтверждают, что плазмида ДНК рСУТа!, инъецированная ί.ητ. в количестве 1 мг, хорошо переносилась и не была токсичной. 1дС против Та! обнаруживали с 15 недели (фиг. 13), причем титры колебались от 1:50 до 1:100 (данные не приводятся). Кроме того, у одной обезьяны (М11) вскоре (на 2 неделе) обнаружили пролиферативную реакцию на Та! (табл. 27).

Таблица 27. Пролиферативная реакция на Та!^а

Обезья-	Стимул	Недели после первичной иммунизации
		2	6	11	15	21	28	32	36	40	44	50
Μ9	РНА	8.9	9.2	17.1	58.2	18	47.1	43.4	3.1	72.6	64.6	7
	ТТ	2.9	1.7	0.9	1	1.8	0.7	1.1	0.8	1	7	2.7
	Та!	0.4	0.5	0.6	1.5	1.6	0.9	1	0.7	1.1	7	1.9
М10	РНА	8.5	18	19.8	Νϋ	10.1	2.2	14.7	15.2	4.4	8.4	Νϋ
	ТТ	2.4	0.3	0.8	Νϋ	1.1	0.6	1	0.9	0.6	6.4	Νϋ
	Та!	1	0.3	0.7	Νϋ	1.1	0.5	1	0.9	0.7	4.2	Νϋ
М11	РНА	25.7	43.3		12.1	27.8	3.4	21.3	14.1	15.9	25.8	Νϋ
	ТТ	4.2	1.9	1.3	0.9	1.1	3.6	1.2	0.8	0.3	1.8	Νϋ
	Та!	5.1	0.8	1.6	0.7	1.1	1.1	1.2	0.7	0.7	3	Νϋ
М12	РНА	28.7	30.9	41	50.7	30.8	7.6	43	22.6	34.6	19.9	55.1
	ТТ	3.2	1.6	0.9	5.2	1.6	1.6	1.3	1.1	1	0.7	3.1
	Та!	3.2	1.4	0.8	1.3	1	1.6	¹	0.8	¹	1.6	1.3

^а РВМС выделяли, стимулировали РНА (4 мкг/мл), столбнячным анатоксином (ТТ, 10 мкг/мл) или Та! (1 или 5 мкг/мл) и анализировали так, как описано в пояснении к табл. 5. Обезьян инъецировали ΐ.ιη. 1 мг или рСУТа! (М9-М11) или рСУО (М12, контроль). Νϋ означает, что определения не проводились.

СТЬ против Та! определялили на 32 неделе после иммунизации (табл.28).

Таблица 28. Анализ цитотоксической активности против Та! (СТЬ)^а

Обезьяна	Неделя	Соотношение мишень-эффектор	СП. активн.
1:50	1:25	1:12,5	1.6,25	1:3,125	Среда
Μ9	32	0	0	0	0	0	0

	50	4,2	0	0	0	0,9	1
мю	32	0	0	9,9	2,7	0	2,5
	50	3,5	0	2.3	0	0	1.1
М11	32	0	10,5	8,9	3.5	0,9	4,7	⁺
	50	0	0	0	3,8	0,3	0,8
М12	32	0	0	0	0	0	0
	50	0	0	0	0	0	0

^а Анализ осуществляли так, как описано в пояснении к табл. 6. Макак инъецировали ΐ.ιη. 1 мг или рСУТа! (М9-М11) или рСУО (М12, контроль).

РВМС, полученные от обезьяны М11 на 44 неделе, оказались резистентными к заражению ίη νίίτο серийными разведениями химерного вируса 8Н1У-89.6Р при анализе методом, описанным ранее, при котором обнаруживается наличие общей антивирусной активности (ТАА). Фактически, ТАА оценивается как способность РВМС от обезьян, вакцинированных ДНК рСУТа!, выращенных в присутствии аутологичной сыворотки, сопротивляться заражению серийными разведениями вируса (табл. 29).

Таблица 29. Анализ общей антивирусной активности (ТАА)^а

Обезьяна	Дни после инфицирования
	7	17
	Миним.инфиц.доза (ТСШда'клетку)	Миним.инфиц.доза (ТСГОм/клетку)
М9	10²	>10² **
М10	10²	10’²
М11	>10² *	>10’² *
М12	10'²

^а Анализ осуществляли так, как описано в пояснении к табл. 13. Макак инъецировали ί.τη. 1 мг или рСУТа! (М9-М11) или рСУО (М12, контроль). РВМС отбирали на 44 неделе от первой иммунизации и инфицировали ΐη νΐίτο ΙΟ'², ΙΟ'³, ΙΟ'⁴, ΙΟ'⁵ ТСШ₅₀ 8Н1У-89.6Р. Результаты выражены в виде минимальной инфицирующей дозы 8Н1У (ТСШ₅₀/клетку), еще способной инфицировать клетки.

* Нет культуры, инфицированной при наибольшей концентрации 8Н1У, использованной при анализе (10‘² ТСГО5о/клетку). ** Культуры стали отрицательными на 17 день после заражения.

Результаты, приведенные в табл. 30, показывают наличие растворимой противовирусной активности (САР), опосредованной (СП8+)-Тлимфоцитами, у вакцинированных обезьян и у контрольной обезьяны (М12), инъецированной пустым вектором (рСУО).

Таблица 30. Анализ растворимой антивирусной активности, опосредованной (С08+)-Т-лимфоцитами (САЕ)^а

Обезьяна	Недели после первичной иммунизации	% ингибирования репликации вируса
		Острая инфекция	Хронич. ифекция
М9	0	21	14.6
	36	77	2.6
М10	0	40	13.8
	36	67	25
МИ	0	49	19
	36	42	14
М12	0	65	23
	36	62	14

^а Анализ наличия растворимой антивирусной активности, опосредованной (СП8+)-Тлимфоцитами (САР). РВМС получены от трех обезьян (М9-М11), инъецированных 1 мг рСУТар и от контрольной обезьяны (М12), инокулированной 1 мг рСУО. Анализ острой инфекци осуществляли в клетках СЕМ х 174, инфицированных 8РПУ-89.6Р, как описано в пояснении к табл. 14. Анализ хронической инфекциии осуществляли в клетках 1Л, хронически инфицированных ВИЧ-1, как описано в пояснении к табл. 14. Результаты выражены в виде процента (%) ингибирования репликации вируса в клетках, выращенных в отсутствие (контроль) или в присутствии 5 мкл супернатантов от (СП8+)-Т-клеток.

Продуцирование цитокинов (γΙΡΝ, ΙΕ-4, ΤΝΡα) и хемокинов ΚΑΝΤΕ8 оценивали в 44 неделю в РВМС как вакцинированных, так и контрольных обезьян (табл. 31).

Таблица 31. Анализ продуцирования цитокинов и ΚΑΝΤΕ8^Η

Обезьяна

Контроль

ΡΗΑ

ΊΤ

γΙΡΝ

Ш-4

ΤΝΡ α

ΚΑΝΤΕ 5

γΙΡΝ

Ш-4

ΤΝΡ α

ΚΑΝΤΕ8

γΙΡΝ

Ш-4

ΤΝΡα

ΚΑΝΤΕ8

М9

-/-

-/3.5

-/-

312/204

-/-

250/-

536/2288

-/-

ηά/ηά

М10

ηά/ηά

Νά/η ά

ηά/ηά

МИ

-/-

420/183

-/-

388/-

4336/3124

-/-

-/ηά

ηά/ηά

М12

-/-

-/3.2

-/-

430/932

-/-

1936/2576

-/-

218/ηά

ηά/ηά

Обезья- на	Та1 (1 мкг)	Та1 (5 мкг)
	γΙΡΝ	Ш-4	ΤΝΡα	ΚΑΝΤΕ8	γΙΡΝ	Ш-4	ΤΝΡα	ΚΑΝΤΕ8
Μ9	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-
Μ10	ηά/ηά	ηά/ηά	ηά/ηά	ηά/ηά	ηά/ηά	ηά/ηά	ηά/ηά	ηά/ηά
Μ11	-/-	-/4	-/-	544/368	-/-	-/3.5	-/-	2124/-
Μ12	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-

^а Анализ осуществляли так, как описано в пояснении к табл. 15. Макак инъецировали ί.τη. 1 мг или рСУТа! (М9-М11) или рСУО (М12, контроль). РВМС отбирали на 44 неделе после первичной иммунизации. Результаты приводятся в виде пкг/мл цитокинов и ΚΑΝΤΕ8, обнару женных через 48 и 96 ч, соответственно. (-) означает, что величины ниже величины снижения. Предельные критические величины (пкг/мл) составляли 31,2 для γΙΡΝ, 3,12 для 1Ь-4; 15,6 для ΤΝΡα; 62,5 для ΚΑΝΤΕ8. ηά означает, что определение не проводилось.

Результаты показывают наличие слабой реактивности на кожные пробы с Та! у одной обезьяны (М9) на 11 неделе (табл. 32).

Таблица 32. Кожная проба на Та!^а

Недели после первичной иммунизации
Обезьяна	11	15	21	28	32	36	44
М9	+/-	-	-		-	-	-
М10		-				-
МП			-	-		-
М12	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ	Νϋ

^а Та! (1 и 5 мкг) в 150 мкл РВ8-0Д% ΒδΑ или в одном буфере (контроль) инокулировали ί.ά. в предварительно подготовленную (ίΐιποίιοίοππζεά) область верхней части спины вакцинированных животных, кроме контрольной обезьяны, в недели 11, 15, 21, 28, 32, 36 и 44 от первичной иммунизации. Макакам инъецировали ί.ητ. 1 мг или рСУТа! (М9-М11) или рСУ0 (М12, контроль). Появление эритематозного узла через 48-72 ч указывало на наличие гиперчувствительности замедленного типа (ЭТИ) : ++ соответствует 0 > 5 мм; + соответствует 0 1-4 мм; ± соответствует эритеме без затвердевания; - соответствует 0 < 1 мм.

Результаты, полученные после заражения, показывают, что все вакцинированные животные защищены от инфекции 10 МШ₅₀ 8Н1У89.6Р, как показали вирулогические пробы (антигенимия плазмы, определение числа копий провирусной ДНК, цитовиремия), которые все оказались отрицательными (табл. 33). Кроме того, наличие антител против 81У у обезьяны М11 показало воздействие вируса или абортивную инфекцию. В противоположность этому, они не обнаружены у остальных обезьян, на основании чего авторы решили осуществить анализ на продуцирование антител ίη νίΐτο (IVАР), а также на лимфопролиферативную реакцию на δΐν-антигены. Эти анализы и предварительные результаты показывают наличие Εην антител против ВИЧ у всех обезьян, инокулированных ДНК. Макаки будут инокулированы большей дозой вируса, так как даже контрольное животное М12 оказалось резистентным к инфекции. Эта обезьяна была вакцинирована пустым вектором рСУО. Последние литературные данные показывают роль адъюванта, исполняемую некоторыми последовательностями ДНК, встречающимися в бактериях чаще, чем в эукариотных клетках, и что они, подобно ЬР8 и маннозе, представляют сильный стимул для естественного иммунитета (ссылка 179). Таким образом, можно представить, что защита, наблюдаемая у обезьяны М12, может иметь место вследствие индукции неспецифического антивирусного иммунитета такими бактериальными последовательностями, такого как продуцирование ΙΕΝα, ΙΕΝβ, 1Б-12 и 1Б-18, которые, как известно, проявляют иммуномодулирующие и антивирусные функции. К такому предположению энергично приводит наличие у этой макаки антивирусных ТАА-активности (табл. 29) и САЕ-активности (табл. 30) при отсутствии специфического против Та! гуморального и клеточного иммунитета. Действительно, эти анализы также определяют неантигенспецифические антивирусные активности. Исходная обезьяна М13, иноку лированная дозой вируса в 3,5 раза меньшей, чем доза, инъецированная макаке М12, оказалась зараженной. Эти результаты подтверждают, что доза заражения 10 МГО₅₀, инокулированная обезьяне М12, была инфицирующей (табл. 33). На основании такого результата изобретатель намеревается использовать вектор рСУО или его части в качестве адъюванта.

Таблица 33. Анализ вирусологических параметров

Дни после заражения вирусом 8ΥΙΥ89.6Ρ

Обезьяна
	15	30
	ρ27· (пг/мл)	ПЦРДНК (коп/ мкг)⁶	циговиремия^с	180· против ЗГУ	р27 (пг/мл)	ПЦРДНК (коп./мкг)	шло вир ем ил	1вС против 5ГУ
Μ9	<20	<1	отриц.	ОТриц.	<20	<1	отриц.	отриц.
ΜΙ0	<20	<1	отриц.	отрга.	<20	<’	отриц.	отриц.
ΜΙ 1	<20	<1	отриц.	1:2	<20	<1	отриц.	1.2
Μ12	<20	О	отркц.	отриц.	<20	<1	отриц.	отриц.
Μ13	1876	*/	**	Νϋ	<20	·»/	ΝΟ	1:1600

а, ь, с, <1 д_нализы осуществляли так, как описывается в пояснении к табл. 17. Макак инъецировали 1.ш. 1 мг или рСУТа! (М9-М11) или рСУО (М12, контроль). Обезьяна М13 являлась исходным животным, инфицированным 2,85 МЮ₅₀ 8Н1У89.6Р.

^е Вместо цитовиремии осуществляли изоляцию вирусов, результат положительный.

^г РСК ДНК неколичественная, результат положительный.

ЕАС8-анализ популяций СЭ4 и СЭ8 (табл.34) подтвердил вирусологические данные.

Действительно, существенное падение процентного отношения и абсолютного числа С04-лимфоцитов наблюдали в 15 и 60 дни после заражения только у исходной обезьяны М13, в итоге инфицированной, как показано положительной антигенимией плазмы, провирусной ДНК и выделением вируса (табл. 34).

Таблица 34. ЕАС8 анализ лимфоцитов СЭ4 и СЭ8.

Обезь -яна	Дни после заражения 8НГУ89.6Р
	0	15	30	60
	% (клетки/мкл)	% (клетки/мкл)	% (клетки/мкл)	% (клетки/мкл)
	С1Э4+	СО8+	СО4+/СО8+	С134+	Οϋ8+	СО4+/СО8+	СО4+	СО8+	СО4+/СО8+	СО4+	СО8+	СО4+/СО8+
М9	21.5 (1500)	37.6 (2630)	0.57	ΝΟ	Νϋ	ΝΟ	26.4 (1340)	51.6 (2610)	0.51	30.6 (2000)	45.5 (2980)	0.67
М10	39.5 (1050)	36.3 (960)	1.1	Νϋ	Νϋ	ΝΟ	34.8 (1730)	41.8 (2080)	0.83	31.6 (3760)	52.2 (6200)	0.61
М11	35.8 (1080)	37.7 (1140)	0.95	Νϋ	Νϋ	ΝΟ	28.7 (1330)	36.7 (1710)	0.78	24.5 (890)	48.7 (1770)	0.5
М12	30.9 (1860)	46 (2760)	0.67	N0	Νϋ	ΝΟ	26.7 (1300)	49.6 (2420)	0.54	23.7 (2620)	52.1 (5760)	0.45
М13	40.5 (2590)	39.7 (2544)	1.01	38.4 (434)	33.6 (380)	1.14	35.1 (1721)	32.2 (1479)	1.16	3.1 (111)	62.3 (2225)	0.05

Анализ осуществляли так, как указывается в пояснении к табл. 18. Макакам давали инъекции ΐ.ιη. 1 мг или рСУТа! (М9-М11), или рСУО (М12, контроль). Макака М13 является исходным животным, инфицированным 2,85 ΜΙϋ₅₀8Н1У89.6Р.

Эти результаты показывают, что вакцинация плазмидой рСУТа! хорошо переносилась и не была токсичной, и подтверждают результаты по безопасности и толерантности вакцинации ДНК, полученные в первом пилотном исследовании. Кроме того, эти данные ясно показывают, что плазмида ДНК рСУТа! индуцирует как специфическую гуморальную (хотя и более слабую, чем индуцируемая рекомбинантным Та!), так и клеточную иммунную реакцию с противовирусным действием, часть которых может иметь место благодаря определенным последовательностям ДНК, присутствующим в векторе рСУО, которые могут функционировать как адъюванты.

Предстоит оценить протоколы иммунизации, включающие сочетания ДНК, кодирующей другие гены ВИЧ-1 и цитокинов, описанные в примере 3. В этих экспериментах будет использоваться 8Н1У, содержащий гены ВИЧ !а!, τεν и пе£ (ссылки 146, 85, 142, 65, 94, 129).

Плазмиды рСУО и рСУТа! будут инокулироваться животным с использованием других систем доставки, которые могут усилить эффективность иммунизации, таких как липосомы, наночастицы, эритроциты, генная пушка, или ДНК Та! будет доставляться с использованием герпесных векторов, как описано далее в примерах 9 и 10.

Пример 6. Лечебная вакцина.

Составлен протокол вакцинации на основе как белка Та!, так и ДНК Та!, для того, чтобы оценить безопасность и токсичность вакцины против Та! для уже инфицированных индивидуумов. Эксперимент осуществляли на обезья нах, инфицированных снижающимися дозами 8Н1У89.6Р, и в иммунодефицитным состоянии (СПИД). Вирусный штамм, использованный для заражения, получали из селезенки и лимфоузлов собакоподобной обезьяны, инфицированной 14 днями раньше. Лимфоциты, очищенные посредством механического разделения, разделили на две аликвоты (каждая по 1,5 х 10⁶ клеток/мл). Одну аликвоту обеднили (СП8+)-Т-клетками, используя иммуномагнитные гранулы (Эупа1, Норвегия). Обе культуры стимулировали РНА (1 мкг/мл) в течение трех суток и высевали в концентрации 1 х 10⁶ клеток/мл в присутствии 50 Е/мл ΙΕ-2. Репликацию вируса определяли по наличию обратной транскриптазы (КТ) в культуральной среде, собранной через трое суток. Перед испытанием супернатант осветляли и подвергали ультрацентрифугированию при 4°С при 100000 об/мин в течение 11 мин (ультрацентрифуга Весктап ТБ-100), и осадок лизировали. Добавляли 30 мкл суспензии к реакционной смеси (трис-НС1, 1 М, рН 8; 0,5 М М§С1₂; 1 М КС1; 1 мг/мл поли-А; 100 мкг/мл олиго-άΤ 1218; 0,02 М ЭТТ; 1 мКи/мл 1,2-³[Н]-метилтимидинтрифосфата) и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. Реакцию прекращали посредством добавления 500 мкл раствора пирофосфата Ыа, 0,1М, рН 5, и 600 мкл 20% трихлоруксусной кислоты (ТСА), и образец наносили в виде капель на фильтр 0,45 мкм (МйНроге), и затем, после добавления 0,5 мл сцинтилляционной смеси (Ей!ег Соип!, Раскагб), снимали показания с помощью счетчика β-частиц.

Культуральные среды, содержащие свыше 20000 ч.им, центрифугировали и добавляли 10% сыворотки АВ человека. Вирус концентрировали посредством ультрацентрифугирования при 30000 об/мин (90 мин при 4°С), ресуспендировали в ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% сыворотки человека (группа АВ), и затем хранили в небольших аликвотах в жидком азоте. Вирусный штамм титровали ίη νίΐτο на клеточных линиях человека СЕМ х 174 и С8166 (3 х 10³ТСЮ5о/клетку) и ίη νίνο на собакоподобных обезьянах (3,17 х 10^5,69 МЮ₅₀/мл).

Первый пилотный эксперимент осуществили на 7 обезьянах, инфицированных ί.ά. 8Н1У89.6Р, полученным так, как описано выше. Каждая обезьяна получила 1 мл 8Н1У, разведенного в солевом буфере с добавлением 2% сыворотки человека (АВ, Р11-). по следующей схеме. Одну обезьяну (ΙΜ1) инокулировали вирусным разведением 1:500; две обезьяны (ΙΜ2, ΙΜ3) получили разведение 1:5000; двух обезьян (ΙΜ4, ΙΜ5) инокулировали вирусом 1:50000; обезьяна ΙΜ6 получила разведение 1:500000; последняя обезьяна (ΙΜ7) получила разведение 1:5000000. У каждой обезьяны брали кровь в день 7 до заражения 8ΗΙV для определения базовых параметров. Образцы сыворотки и плазмы замораживали при -20°С или при -80°С, и затем использовали для ресуспендирования белкового инокулума. В момент времени 0 всех обезьян инокулировали 8Н1У89.6Р. Обезьян контролировали ежедневно. Кроме того, в день 0 и через 2 и 4 недели у них брали кровь, и 10 мл крови использовали для гематохимических определений (химико-клинический анализ, электролиты, число лейкоцитов и эритроцитов, гемоглобин) и вирусологического и иммунологического анализа (т.е., определения Ад р27 в плазме и вирусного груза в плазме и клетках). На 4 неделе после заражения 6 обезьян (ΙΜ1-6) были инфицированными. Обезьяна ΙΜ7, получившая наименьшее разведение вируса (1:5000000), была 8Н1У-отрицательной (табл. 35).

Таблица 35. Обнаружение наличия 8Н1У89.6Р у обезьян, инфицированных серийными разведениями вируса

Обезьяна	Разведение 8Н1У 89.6Р	Недели после заражения
		0	2	4
		Изоляция вируса*	ρ27 (пг/мл)⁶	Изоляция вируса	_Ρ27 (пг/мл)⁶	Изоляция вируса	ρ27 (пг/мл )^ь
ΙΜ1	1:500	Νϋ	Νϋ	⁺	>450	+	47
ΙΜ2	1:5.000	Νϋ	Νϋ	⁺	>450	⁺	161.8
ГМЗ	1:5.000	Νϋ	Νϋ	+	>450	+	6.67
ΙΜ4	1:50.000	Νϋ	Νϋ	*	<20	+	>450
ΙΜ5	1:50.000	Νϋ	Νϋ	+	>450	⁺	166.7
ΙΜ6	1:500.000	Νϋ	Νϋ	+	>450	+	0
ΙΜ7	1:5.000.000	ΝΟ	Νϋ		0		0

^а Изоляцию вируса и ^ь Ад р27 в плазме (пкг/мл) определяли так, как описано в пояснении к табл. 17. Обезьян инокулировали ί.ν. серийными разведениями вирусного штамма, как описано в тексте.

Через 7 недель после заражения всех животных, показавших серьезные симптомы иммунодефицита, вакцинировали как белком Та!, так и ДНК плазмиды рСУТа! согласно следующему протоколу. Обезьяны ΙΜ1, ΙΜ3, ΙΜ5 и ΙΜ6 получили белок Та! (20 мкг), растворенный в 250 мкл РВ8-А с добавлением 0,1% В8А и 20% аутологичной плазмы и затем добавленный к 250 мкл адъюванта А1ит. Инокуляцию белка осуществляли подкожно в одном месте верхней части спины обезьяны, или в другое место на спине инъецировали ί.ιη. плазмиду рСУТа! (1 мг), ресуспендированную в 1 мл РВ8-А. Обезьянам ΙΜ2 и ΙΜ4 (контрольные животные) инъецировали 250 мкл А1ит и 250 мкл РВ8-А-0,1% В8А и 20% аутологичной плазмы, подкожно, в место в верхней части спины, и рСУ-0 (1 мг), ресуспендированный в 1 мл РВ8-А, ί.ιη., в другое место в верхней части спины, отличное от первого. Неинфицированную обезьяну ΙΜ7 не вакцинировали. Схема вакцинации включала момент времени 0, соответствующий 7 неделям после заражения 8Н1У. и последующие 1, 4, 5, 10, 11, 13, 14, 17, 18 недель. Для того, чтобы оценить действие такой вакцинации на развитие болезни, каждую макаку проверяли ежедневно на наличие признаков болезни, и в момент времени 0 и через 3, 8, 12, 16 и 21 неделю отбирали по 10 мл крови для лабораторных исследований (химико-клинический анализ, электролиты, число лейкоцитов и эритроцитов, гемоглобин), для оценки иммунологического статуса (наличие специфических иммуноглобулинов, количество Т111 и Т112 цитокинов, продуцирование хемокинов), для характеризации лимфоцитов при помощи ЕАС8-анализа (СО4, СО8, СО40, СО86, СО20, СО2, СО26 и СО20), и, наконец, для оценки вирусологических параметров (обнаружение провирусной ДНК с помощью полуколичественной РСК, вирусного груза плазмы с помощью конкурентной КТ-РСК, антигена Сад р27 в плазме с помощью ЕЫ8А и наличия антител против 8Н1У, как описано ранее). Другие повторные инъекции будут делаться на основе результатов иммунологического, вирусологического и клинического анализов.

После последней инокуляции схема контроля будет ежемесячной, и при появлении клинических изменений образцы РВМС, сыворотки, плазмы и мочи будут замораживаться в каждый момент времени для последующих испытаний, как описано ранее.

Описываются результаты, уже доступные из эксперимента, полученные на 8 неделе после иммунизации. Как у вакцинированных бессимптомных, так и у контрольных обезьян не наблюдалось никаких признаков воспаления и образования новых сосудов в местах инокуляции или общих симптомов болезни. У обезьян, у которых симптомы уже были, не было явных изменений клинического статуса. Кроме того, не обнаруживалось активации или репликации вируса. Все вместе эти результаты указывают на отсутствие токсичности или возросшей репликации вируса у обезьян, вакцинированных биологически активным белком Та! или ДНК (табл. 36).

Таблица 36. Анализ вирусологических параметров

Обезьяна	Недели от начала вакцинации
	0	3	8
	Р27 (пг/мл)	ПЦРДНК копнЙ/мкг	р27 (пг/мл)	ПЦРДНК копий/мкг	р27 (пг/мл)	ПЦРДНК копий/мкг
ΙΜ1	12.3	68	17.3	52	141	41
1МЗ	0	61	0	48	0	71
ΙΜ5	97.1	20	21.7	15	23.6	95
Мб	0	43	0	55	0	24
ΙΜ2	21.2	ΝΟ	36.6	53	27.4	78
ΙΜ4	81	195	22	288	15.4	135
ΙΜ7	ΝΟ	№	Ж	Ж	0	>1

и ΙΜ6 инъецировали 8.с. белок Та! (20 мкг) и адъювант А1ит пгт. рСУТа! (1 мг). Обезьянам ΙΜ2 и ΙΜ4 (контрольные инфицированные животные) инъецировали з.с. адъювант А1ит и и гт. рСУО (1 мг). ΙΜ7 была неинфицированной исходной обезьяной.

РАС 8-анализы показывают, что после вакцинации не наблюдается изменений в количестве (СП4+)- и (СП8+)-Т-лимфоцитов (табл. 37).

Испытания проводили так, как описано в пояснении к табл. 17. Обезьянам ΙΜ1, ΙΜ3, ΙΜ5

Таблица 37. РАС8 анализ СП4+ и СП8+ лимфоцитов

Обезьяна	Время 0	Недели от начала вакцинации
		0	3	8
	% (клеток/мкл)	% (клеток/мкл)	% (клеток/мкл)	% (клеток/мкл)
	СО4+	СО8+	СИ4/СО8	СО4+	СИ8+	СО4/ СО8	СШ	СИ8	СО4/СИ8	СИ4	СО8	СО4/СИ8
ΙΜ1	25.39 (1264)	36.8 (1831)	0.69	3.3 (101)	64.16 (1963)	0.05	2.32 (52)	63.34 1431)	0.04	3.41 (96)	55.41 (1559)	0.06
ΙΜ3	19.26 (869)	26.45 (1193)	0.73	2.84 (74)	58.22 (1526)	0.05	3.21 (92)	58.16 (1663)	0.05	3.18 (91)	50.12 (1434)	0.06
ΙΜ5	24.75 (580)	58.04 (1361)	0.42	2.28 (38)	57.3 (946)	0.04	2.89 (48)	55.6 (917)	0.05	2.15 (60)	54.3 (1527)	0.04
ΙΜ6	40.46 (2590)	39.74 (2544)	1.01	3.12 (111)	62.3 (2225)	0.05	2.75 (138)	65.40 (3290)	0.04	2.3 (73)	52.18 (1659)	0.04
ΙΜ2	42 (1787)	34.7 (1476)	1.21	2.41 (68)	58.12 (1632)	0.03	2.7 (121)	57.6 (2580)	0.05	1.89 (66)	50.6 (1763)	0.04
ΙΜ4	30.72 (1589)	27.76 (1680)	1.10	2.12 (ИЗ)	61.13 (3248)	0.03	1.92 (90)	60.3 (2828)	0.03	3.12 (164)	53.12 (2790)	0.06
ΙΜ7	17.02 (871)	55.8 (2857)	0.30	ΝΟ	ΝΟ	Νϋ	20.26 (770)	51.40 (1957)	0.39	24.1 (868)	50.43 (1842)	0.48

РАС 8-анализ осуществляли так, как указывается в пояснении к табл. 18. Макакам ΙΜ1, ΙΜ3, ΙΜ5, ΙΜ6 делали инъекции белка Та! (20 мкг) и адъюванта А1ит, 8. с, и рСУТа! (1 мг), ϊ.γπ.. Макакам ΙΜ2 и ΙΜ4 (инфицированные контрольные животные) вводили адъювант А1ит, 8.с, и рСУО (1 мг), ί.πτ. ΙΜ7 являлись инфицированной исходной обезьяной.

Эти данные подтверждают, что как белок Та!, так и плазмида РСУТа! в использованных дозах и способах инокуляции, переносились хорошо и без токсического воздействия на вакцинированных обезьян, и, кроме того, они не повышали репликации вируса или не снижали числа СП4-Т-клеток у инфицированных животных.

Пример 7. Костимуляция очищенных (СП4+)-лимфоцитов от 81У-инфицированных обезьян с гранулами с анти-СПЗ/28 покрытием приводит к логарифмическому росту числа клеток без существенной репликации и передачи вируса.

Мононуклеарные клетки периферической крови обедняли популяцией клеток СП8+, используя анти-СПЗ/28 иммуномагнитные гранулы (Пупа1, Осло; ПупаЬеабз М-450 Οϋ8). Степень очистки оценивали с помощью ЕАС8анализа и считали приемлемой, если она пре вышает 95%. Обедненные Οϋ8 клетки (названные СП8'РВМС) выращивали в присутствии РИА (2 мкг/мл) и 1Ь-2 (40 Е/мл) или иммуномагнитных гранул, предварительно сенсибилизированных двумя моноклональными антителами - против Οϋ3 (клон ΕΝ18, ВюЗоигсе) и антигенами СП28 (клон 9.3) (анти-СПЗ/28 гранулы). Для улучшения связи анти-СПЗ/28 гранул с клетками-мишенями осуществляли инкубацию на устройстве с вращающимся колесом (го!айп§ м4зее1 б18ро8а1). Затем присоединенные клетки (названные СП8-СПЗ+СП28+) отбирали с помощью магнита и высевали для культивирования. Три раза в неделю концентрацию клеток доводили до исходного уровня, и при необходимости добавляли 1Ь-2; кроме того, что касается клеток, стимулированных анти-СПЗ/28 гранулами, то предварительные результаты наводят на мысль, что режим непрерывной стимуляции в сочетании с постоянным регулированием соотношения гранулы:клетки, подгоняемым в каждый момент времени, является высокоэффективным при индукции пролиферативной реакции. Предварительные исследования авторов изобретения показали, что в отсутствие экзогенного 1Ь-2 популяция клеток СП8СПЗ+СП28+ пролиферирует лучше, чем СП8РВМС, стимулированные анти-СПЗ/28 гранула ми. Кроме того, добавление экзогенного 1Ь-2 (40 Е/мл, три раза в неделю) существенно повышает кинетику пролиферации как в отношении числа клеток, так и в отношении длительности действия (фиг. 14).

Для того, чтобы оценить антивирусную активность такой стимуляции, очищенные клетки ί.Ό8-ί.Ό3+ί.Ό28+ от 4 неинфицированных обезьян инфицировали в день 0 0,1 Μ.Ο.Ι. 81У, и затем культивировали в условиях непрерывной стимуляции. СО8-РВМС. стимулированные РНА и 1Ь-2, были контрольными при этом эксперименте. Заражения вирусом заканчивалось обнаружением антигена Сад р27 в культуральном супернатанте с помощью коммерческого набора для ЕЫ8А (СоиЙег, Н1а1еай, ЕЬ). Содержание антигена Сад р27 (нг/мл) измеряли в день 6 и 12 после заражения. Как показано на фиг. 15, существует значительное различие в заражении при двух режимах стимуляции. Действительно, в 6 день после заражения антигена р27 в культурах, стимулированных СЭ3/28 гранулами, было на 40-80% меньше, чем в культурах, стимулированных РНА с добавлением 1Ь-2, и на 12 день это различие возросло у 2 обезьян из 4. Это наводит на мысль о снижении чувствительности вирусной инфекции. Только в одном случае (МК 9401) наблюдали размножение вируса при обоих режимах стимуляции.

Результаты, описанные здесь, показывают, что Масаса £а8С1си1аг18 является хорошей моделью для размножения ех νίνο субпопуляции лимфоцитов посредством костимуляции антиСЭ3/28 гранулами без репликации вируса. Это является причиной предложения авторами лечебной вакцины для ВИЧ-инфицированных индивидуумов, в основе которой размножение и реинфузия аутологичных антивирусных специфических лимфоцитов.

Пример 8. Применение для вакцинации дендритных клеток.

Дендритные клетки (ИС) и макрофаги в меньшей степени способны эффективно представлять антигены Т-лимфоцитам и индуцировать, в данной клеточной популяции, пролиферацию или приобретение специфических цитотоксических активностей. Эти клетки называются антигенпредставляющими клетками (АРС) и могут вызвать иммунную реакцию. Таким образом, ЭС можно использовать в протоколах иммунизации ех νίνο. По этой причине предшественников ЭС из периферической крови Масаса £а8С1си1ап8 выделяли путем культивирования ίη νίίτο прилипающих клеток после 7 суток стимуляции с СМ-С8Е и 1Ь-2. С другой стороны, клетки С.П34+ очищали с помощью иммуномагнитных гранул и затем культивировали ίη νίίτο с ОМ-С8Е и ΤΝΕ-α в течение 14 суток. Для того, чтобы подтвердить, что ЭС выделены, осуществляли морфологический анализ и характеризацию фенотипов (ЕАС8-анализ и иммуногистохимия). Функциональный анализ основывался на уникальной способности ЭС индуцировать пролиферацию аллогенных лимфоцитов.

Полученные результаты полностью подтверждают эффективность очистки и функциональную характеризацию ЭС. Подробно, для того, чтобы выделить предшественников ЭС, РВМС, полученные посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколла, снова расслаивали в ступенчатом градиенте перколла (50% и 42,5%). Клеточная фракция, которая после центрифугирования при 500 д в течение 30 мин находилась между двумя градиентами, состояла, главным образом, из моноцитов (что подтвердил ЕАС 8-анализ, данные не приводятся). Эти клетки выдерживали при 4°С, чтобы избежать прилипания клеток к пластиковым пробиркам, затем собирали, промывали, считали и высевали для выращивания при 37°С. На другой день неприлипшие клетки вымывали путем 4-кратной осторожной промывки. Для того, чтобы индуцировать дифференциацию в ЭС, к прилипающим клеткам добавляли полную среду с добавлением СМ-С8Е (200 нг/мл, Ьеисотах, Баибо/, Милан, Италия) и 1Ь-4 (200 Е/мл, Рерго 1ес1т Лондон, Англия). В качестве контроля добавляли полную среду без цитокинов, чтобы индуцировать нормальную дифференциацию моноцитов в линии дифференциации макрофагов. Дважды в неделю половину супернатанта заменяли свежей средой, идентичной среде, использованной в день 0. Созревание ЭС в клетках, обработанных цитокинами, определяли по типичным морфологически изменениям, подобным образованию кластеров, потери адгезии и разрастанию клеток в стороны. Прилипающие моноциты/макрофаги, выращенные без цитокинов, отделяли посредством обработки ЭДТК (0,5 М в РВ8-А), дважды промывали, считали и ресуспендировали в свежей среде при разных концентрациях, в зависимости от выполняемого эксперимента. Для реакций аллогенных смешанных лейкоцитов (АМЬЕ) полученные АРС (ЭС или макрофаги) проверяли с фиксированным количеством аллогенных Т-лимфоцитов, очищенных с помощью градиентов фиколла и перколла и прилипания, и затем замороженных. АМЬЕ осуществляли в 48-луночных планшетах с 0,5 х 10⁶ Т-лимфоцитов и серийными разведениями АРС. На 4 день культивирования фиксированное количество клеточной суспензии высевали в 96-луночный планшет при трехкратном повторе. В каждую лунку добавляли 1 мКи ³Нтимидина, и затем планшет инкубировали при 37°С в течение 16 ч. По окончании инкубации с помощью счетчика β-частиц определяли количество ³Н-тимидина, поглощенное клетками, и выражали его в числе импульсов в минуту (чим). Результаты показывают, что полученные ЭС являются сильными АРС, как показала более высокая индукция пролиферации в аллогенных лимфоцитах человека по сравнению с мак рофаговой стимуляцией, и способность индуцировать пролиферацию Т-лимфоцитов у обезьян при всех использованных концентрациях (фиг. 16В).

Для применения при вакцинации БС будут ресуспендированы в концентрации 1 х 10⁵ клеток/100 мкл в КРМ1 1640 с добавлением 5% аутологичной сыворотки, 10 мМ буфера Через, 100 Е/мл пенициллина или стрептомицина, 0,5 мг/мл амфотерицина В и 0,03% глутамина, и затем инкубированы в течение 2 ч при 37°С в присутствии белка Та! или пептидов Та!, или сочетания Та!, Вес, №£, Сад, и/или цитокинов. Затем обработанные БС будут инокулированы внутривенно два раза или более в течение 2-4 недель после первой инъекции. С другой стороны, БС будут трансдуцированы с содержащими ген !а! векторами, одними или в сочетании с другими векторами, указанными выше, и затем инъецированы внутривенно.

Пример 9, перспективный.

Описанные иммуногены будут использованы для индукции и/или потенциирования специфической иммунной реакции в слизистых оболочках. Один из подходов основан на применении бактерий (δ. Οοτάοηίί и Ьас!оЬасШиз), преобразованных для экспрессии вирусных антигенов, указанных выше. Эти бактерии располагаются в слизистых рта и влагалища мыши и индуцируют специфическое, как локальное, так и системное, образование антител против гетерологичных антигенов, экспрессируемых на поверхности рекомбинантных бактерий (ссылки 116, 104, 106, 121, 117, 139, 105, 107). Эти бактерии могут работать как живые векторы вакцин и вносят преимущество вызывания пролонгированной стимуляции иммунной системы. Кроме того, авторы будут оценивать возможность коэкспрессии на поверхности бактерий вирусных антигенов и молекул, участвующих в иммунной реакции, таких как В-субъединица термочувствительного токсина Е. сой или цитокины. Получение рекомбинантных штаммов δ. Οοτάοηίί будет осуществлено так, как описано ранее (ссылка 116). Коротко, осуществляют (ί) хромосомную интеграцию молекул рекомбинантной ДНК; (ίί) транскрипционное слияние с сильными хромосомными промоторами; (ίίί) транскрипционное слияние с геном, кодирующим белок М6 - поверхностный белок δΙίΌρΙοтоссиз. Рекомбинантные штаммы δ. Οοτάοηίί будут использоваться для заселения слизистой оболочки влагалища обезьяны. Показано, что рекомбинантные штаммы δ. Οοτάοηίί, экспрессирующие область ν3 др120 ВИЧ-1 и белок Е7 ΗΡν-16, постоянно образуют колонии в слизистой оболочке влагалища мыши после одной инокуляции, индуцируя как локальное, так и системное образование антигенспецифических антител. Системная реакция состоит в преобладании антител 1дО2а, что предполагает реакцию типа Т111 (ссылки 105, 106). Авторы будут вы бирать штаммы ЬасЮЬасШиз из влагалища человека, которые способны образовывать колонии в слизистой оболочке влагалища обезьяны. Затем будет использована уже разработанная генетическая система, допускающая экспрессию гетерологичных генов на поверхности ЬасЮЬасШиз (Кизй, 1997). Такая стратегия основана на (ί) клонировании генетических гибридов (етт6/гетерологичный ген) в инсерционные векторы, несущие гомологию с конъюгативным транспозоном Тп916; (ίί) трансформации векторов в бактериальных штаммах, работающих как промежуточный хозяин (ВасШиз διιόΐί^); (ίίί) конъюгативной мобилизации рекомбинантных транспозонов из В. зиЬ!Шз в БасЮЬасШиз. Рекомбинантные штаммы ЬасЮЬасШиз будут использоваться для заселения слизистой оболочки влагалища обезьяны.

Вагинальные образцы будут получены с использованием специальных поглощающих фильтров (ссылки 38, 105, 106). Колонизация будет оцениваться посредством высевания вагинальных образцов на селективные планшеты, а экспрессия ВИЧ-антигенов ίη νίνο будет контролироваться с помощью иммунофлуоресценции при вагинальных обменах (ссылка 105). С использованием уже стандартизованных методов (ссылка 38) вагинальный обмен будет использоваться в случае (ί) метода Папаниколау, в случае вакцинации через слизистую оболочку влагалища; (ίί) присутствия антигенов вакцины в клетках; (ίίί) фенотипической характеризации клеток посредством цитофлуорометрического анализа (СБ1, СБ2, СБ4, СБ5, СБ8, СБ11с, СБ 14, СБ20, СБ28, СБ40, СБ25, НЬА-БЯ); ίν) оценки продуцирования цитокинов (1Ь-2, ΙΕΝγ, ΊΝΕα, 1Ь-4, 1Б-10, Ш-15, полуколичественная КТ-РСК), определения присутствия цитокинов и ?-хемокинов в жидкостях слизистых оболочек методом ЕЬША; ν) дозировки общих и специфических иммуноглобулинов (1дА и 1дО) в жидкости слизистой методом ЕЬША [Б1 £аЬю е! а1., Vасс^ηе, 15: 1 (1997)]. Через месяц после последней инокуляции иммуногена обезьяны будут инфицированы внутривенно или через слизистые оболочки δΗΐν 89.6Р. Контроль за обезьянами будет осуществляться так, как описано в примере 4.

Будут взяты образцы крови для того, чтобы осуществить обычные лабораторные проверки, оценку иммунологических параметров, как гуморальных, так и клеточных, как описано в примере 4. Изобретатель полагает, что данный способ можно с успехом использовать для индукции специфической иммунизации у обезьян с использованием пути через слизистую оболочку влагалища. С другой стороны, иммунитет слизистых оболочек можно индуцировать посредством введения белковых иммуногенов, описанных выше, прямо в слизистые оболочки, в присутствии адъювантов, таких как термочув

Ί9 ствительный токсин Е. со11 и холероген, или с использованием других бактериальных и небактериальных систем доставки, таких как цитофектины и липосомы, или посредством инокуляции другими способами, позволяющими индуцировать наиболее эффективную и защитную иммунную реакцию (ссылки 83, 81, 62).

Кроме того, изобретатель полагает, что рекомбинантные герпесные векторы, экспрессирующие указанные выше вирусные белки, могут являться прекрасными системами для индуцирования эффективной иммунной реакции в слизистых оболочках. Рекомбинантные вирусные векторы из вируса простого герпеса типа 1 (Н8У-1) будут использоваться для экспрессии вирусных белков для индукции системной (иммунизация через кожу, ί.ά.) реакции и реакции в слизистых оболочках (пероральным, вагинальным или назальным путем). Не будут использоваться ни патогенные, ни репликативные векторы герпеса (ссылка 99) из-за их способности включать большие экзогенные последовательности, не влияя на эффективность инфекции (ссылки 52, 64). Следовательно, будут сконструированы векторы, способные содержать несколько генов ВИЧ (добавочный, регуляторный и структурный). Иммунитет слизистых оболочек можно индуцировать пероральной, вагинальной или назальной вакциной. При таких подходах к вакцине можно использовать герпесные векторы, так как Н8У-1 можно вводить непосредственно через слизистые оболочки (ссылки 176, 75). Рекомбинантные вирусы будут конструироваться с использованием двухстадийного способа, который облегчает встраивание экзогенных последовательностей в вирусный геном. Первая стадия требует встраивания экспрессионной кассеты с репортерным геном (β-галактозидаза, Ьас2), клонированным в сайте рестрикции Рас1, отсутствующем в геноме Н8У1, фланкированный нужной последовательностью-мишенью Н8У-1, с использованием стандартной процедуры для гомологичной рекомбинации, чтобы прервать ген Н8У-1. Рекомбинатный вирус отбирают посредством образования бляшек с синим фенотипом, с использованием окрашивания х-да1. Расщепление вирусной ДНК Рас1 высвобождает маркерный ген и генерирует два крупных фрагмента вирусной ДНК, неспособных продуцировать инфицирующие частицы вируса. Вторая стадия состоит в котрансфекции вирусной ДНК, расщепленной той же плазмидой, которая использована для образования делеции, где репортерный ген замещен нужным геном. Рекомбинантные вирусы будут идентифицированы посредством отбора бляшек с белым фенотипом после окрашивания х-да1. Такая рекомбинация приведет к удалению сайтов Рас1, что позволит использовать этот способ для встраивания многих генов в различные локусы генома Н8У-1 (ссылка 74). Посредством скрещивания различных векторов, содержащих отдельные гены, авторы изобретения смогут создать все различные генетические комбинации. Вектор, содержащий все нужные гены, будет выделен посредством скрининга с различными маркерами, фенотипами, и селективно выращен на компетентных клетках. Все комбинации будут созданы путем изменения трансфекций ДНК и вирусных рекомбинаций.

Векторы, экспрессирующие отдельные гены 1а1. гсх. пе£ или дад, будут сконструированы с использованием, в качестве базового вектора, вектора, содержащего мутации в генах 4-/22/27-/41, что предпочтительнее для низкой токсичности и сильной экспрессии экзогенного гена, по сравнению с другими нерепликативными векторами Н8У-1. Будут использоваться конститутивные промоторы, такие как промоторы из НСМУ (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека), или как 1СРО 1ер (немедленно-ранний промотор белка инфицированной клетки) и вирус мышиного лейкоза Мелони ЬТК, для индуцирования экспрессии вышеуказанных генов. Будут сконструированы нерепликативные векторы Н8У-1, экспрессирующие ВИЧ-белки в различных сочетаниях. Продуцирование таких вирусов, содержащих больше разных генов, будет достигаться путем генетического скрещивания векторов, содержащих отдельные гены, описанные в предыдущем пункте. Будут созданы двойные, тройные и четверные векторы. Векторы будут инокулироваться обезьянам ί.ά. или через слизистые оболочки (рта, влагалища или носа), причем особое внимание будет уделено последнему типу введения (ссылки 176, 101, 102). Схема вакцинации включает множество инъекций в разные моменты времени, которые должны определяться в зависимости от иммуногена или сочетания иммуногенов. Во время иммунизации животные будут контролироваться с целью оценки гематохимических и иммунологических параметров, как описано в примере 4. Образцы из влагалища будут браться уже стандартизованными способами и будут исследоваться так, как описано ранее в данном примере.

Пример 10, перспективный.

Системы доставки.

Та! (белок и/или ДНК), один или в сочетании (как описано выше), будет инокулирован с использованием новых систем доставки, таких как эритроциты или наночастицы. Система доставки, включающая использование эритроцитов, основана на возможности доставки антигена, связанного с аутологичными эритроцитами. В действительности, эритроциты в конце своего жизненного цикла (у человека примерно 120 дней) удаляются из кровотока макрофагами, являющимися, как известно, профессиональными антигенпредставляющими клетками. Это свойство можно использовать для вакцин. Таким образом, антигены будут присоединены к эритроцитам определенным способом (ссылки

95, 96), позволяющим сохранить иммуногенные свойства антигена (ссылки 29, 30). При этой процедуре можно осуществить биотинилирование эритроцитов при отсутствии существенных изменений их свойств и жизненного цикла (ссылка 95). Фагоцитоз старых эритроцитов клетками-макрофагами запустит иммунную реакцию. Опсонизация антител эритроцитов, несущих антиген, поможет вывести антиген из кровотока. Основными преимуществами такой методологии являются 1) небольшое количество антигена, необходимое для индуцирования гуморальной и клеточной иммунной реакции, 2) длительная иммунизация вследствие длительного присутствия антигенов, которые несут эритроциты на периферии, 3) функции адъюванта, обеспеченные самой системой.

Действительно, при исследованиях на животных показано, что введение антигенов, связанных с мембранами аутологичных эритроцитов, индуцирует иммунную реакцию, подобную или более сильную, чем иммунная реакция, полученная с тем же антигеном, введенным с адъювантом Фрейнда (ссылка 29). Эти свойства очень полезны для разработки вакцины против ВИЧ, в частности, когда требуется повысить иммуногенность антигена и доступность антигена, и когда требуется малое число иммунизаций. Кроме того, такой подход можно применить, когда адъюванты не включены в протокол иммунизации. Действительно, на мышиной модели показано, что антигены, введенные с помощью аутологичных эритроцитов, индуцируют иммунные реакции схожие или более сильные, если сравнивать с иммунными реакциями, вызванными тем же антигеном, введенным с адъювантом Фрейнда, известным как самый сильный адъювант, доступный коммерчески (ссылка 29), хотя он и не одобрен для исследований на людях из-за существенных побочных действий. Таким образом, эффект адъюванта у эритроцитов, несущих белок Та!, один или в сочетании с другими иммуногенами, описанными ранее, будет проанализирован на приматах, но не на людях. Будет осуществлено сравнение полученных при этом данных и данных, полученных при введении белка Та! в присутствии А1ит, Κ.ΙΒΙ или 1БСОМ.

Применение наночастиц может представлять еще один подход к доставке. Функциональные наночастицы представляют важную систему для переноса и секреции белков и ДНК (ссылки 27, 172). Наносферы представляют собой коллоидные полимерные частицы разного химического состава с диаметром в широком диапзоне от 10 до 1000 нм. На поверхности или внутри наносфер могут адсорбироваться самые разные вещества (олигонуклеотиды, лекарственные средства, белки, пептиды, ДНК), которые затем переносятся в цитоплазму или в ядра клеток, где они постепенно высвобождаются. Кроме того, вследствие свойств наносфер тре буется небольшое количество доставляемого иммуногена. Наночастицы являются хорошей системой доставки, особенно, в случае молекул с низкой устойчивостью в окружающей клетки среде, или когда доставка направлена на специфическую клетку-мишень.

Изобретатель полагает, что наносферы можно использовать для доставки описанных выше вирусных антигенов. Можно получить и охарактеризовать три типа наносфер, создаваемых для доставки и регулирования высвобождения ДНК (наносферы типа 1 и 2) и белков (наносферы типа 3).

Для доставки ДНК пригодны два типа наносфер (наносферы типа 1 и 2). Первый тип наносфер (наносферы типа 1) имеет трехслойную структуру с наружным слоем из полиоксиэтиленгликоля (РЕО). Последние сообщения на основе исследований скрытых систем (ссылки 180, 78) показывают, что РЕО делает наносферы невидимыми для клеток Купфера. Напротив, лежащий глубже слой изготовляют из мономеров с тензиоактивными свойствами, содержащих группы четвертичного аммония, которые обратимо адсорбируют ДНК через механизм ионного обмена, а внутреннее ядро изготовляют на основе мономера метилметакрилата. Такие наносферы получают посредством полимеризации в микроэмульсии, включающей полимеризацию винилового или винилиденового мономера в присутствии смеси тензиоактивных реагентов. Таким образом, эти реагенты способны полимеризовать мономер. Один из них содержит группу четвертичного аммония, взаимодействующую с олигонуклеотидами, а другой содержит длинную цепь РЕО.

Второй тип системы доставки ДНК получают из функциональных нано- и микросфер (наносферы типа 2) со свойствами гидрогеля.

Такие наносферы должны изготовляться в присутствии ДНК, чтобы захватить ее во внутренней части системы доставки. Наносферы ядро-оболочка требуются для доставки белков (наносферы типа 3). Они содержат внутреннюю часть (ядро) из полиметилметакрилата и наружную часть (оболочку) из водорастворимого статистического сополимера акриловой кислоты и метилметакрилата, который, как известно, обладает высокой степенью сродства к белкам (ссылки 79, 80). Этот сополимер доступен коммерчески (ΕυΌΚΑΟΙΤ), и его получают при разных процентных соотношениях двух сомономеров. Способ получения, ведущий к изготовлению наносфер второго типа, включает полимеризацию в дисперсии. Синтез включает радикальную полимеризацию винилового или винилиденового мономера в присутствии ΕυΌΚΑΟΙΤ, обладающего пространственными стабилизирующими функциями. После образования ядер наносфер ΕυΌΚΑΟΙΤ упорядочивает внешнюю сторону частиц. Таким образом, изменяя концентрацию инициатора радикальной полимеризации, соотношение мономера и ЕИОВЛШТ и время реакции, получают множество образцов наносфер с различными морфологическими и химическими характеристиками.

Таким образом, можно оценить, будет ли доставка белка Та! или ДНК Та!, одних или в сочетании с указанными выше иммуногенами (или белком или ДНК), индуцировать иммунную реакцию против ВИЧ. В частности, на обезьяней модели будут оцениваться гуморальные и клеточноопосредованные иммунные реакции и сравниваться с реакциями, вызываемыми недоставленными иммуногенами.

Изобретатель полагает, что информация, полученная при данных исследованиях, может быть полезна для разработки вакцины против ВИЧ. Кроме того, информация, полученная при данном протоколе эксперимента, будет учитываться также при исследованиях других вакцин, в частности, исследованиях вакцин с рекомбинантными белками или пептидами с низкой иммуногенностью. Возможность разработки вакцины, требующей только одного введения, приведет к огромным выгодам в смысле эффективности вакцины и снижения стоимости программ, связанных с вакцинами.

Ссылки

Адо8!1ш е! а1., Βίοοά 90:1115 (1997).

А1Ыш е! а1., Ргос. Асай. ЗсЕ ИЗА

92:4838 (1995).

А11ап е! а1., Зс1епсе 230:813 (1985).

ΛηΙίόο^δ - А ΙηόοηΙοΓν тапиа1, Εάδ. Наг1ο\ν Е., Ьаие Ό., С'.о1й Зргтд Нат^г ΕαόοηΙοΓν (1988).

Агуа е! а1., Зс1епсе 229:69 (1985).

А^зЫ е! а1., АГОЗ 9:555 (1995).

Аий1Ьей е! а1., Iттиηο1. Шйау 14:281 (193).

Ва^аЮ е! а1., Βίοοά 90:2804 (1997).

Вап11ап е! а1., к Iттиηο1. 149:3727 (1992).

Вап11ап е! а1., Ргос. №!1. Асай. ЗсЕ ИЗА 90:7941 (1993).

Вап11ап е! а1., Ргос. №!1. Асай. ЗсЕ ИЗА 149:3727 (1993).

ВШтЬегд е! а1., к ^тишк Ме11юйз 160:2734 (1993).

ВШтЬегд е! а1., к Iттиηο1. Ме11юйз 168:267-273 (1994).

ВШтЬегд е! а1., к ^тишк Ме11юйз 193: 199-206 (1996).

ΒοНаη е! а1., Сене Ехрг. 2:391 (1992).

Βοи^даи1! е! а1., к У1го1. 66:75 (1992).

Βοуе^ е! а1., №1Шге Мей. 3:526 (1997). Вгшз!еп е! а1., к Шес!. Όίδ. 166:620 (1992). Визеупе е! а1., к У1го1. 67:694 (1993). Ви!ега е! а1., к У1то1. 65:4645 (1991). Ви!ега е! а1., к У1то1. 68:2726 (1994).

СаГаго е! а1., АГОЗ Вез. Нит. Ве!гот. 7:204 (1991).

Сагго1 е! а1., Заепсе. 276: 273-276, (1997).

ΡαΐΈοη е! а1., к С1ш. Штез!. 99:937 (1997). СНапд е! а1., к Вютей. ЗсЕ 2:189 (1995).

СНапд е! а1., АГОЗ 11: 1421 (1997). СНатапу е! а1., РНаг. Вез. 9: 441 (1994). СНеп е! а1., к Iттипο1. 149:4060 (1992). СЫагапйш е! а1., Уассте 15: 276 (1997). ΟΗίηΓηηΙίηί е а!., С1т. Э1ад. ЬаЬ. Iттипο1. 5: 235 (1998).

СЫгти1е е! а1., к У1го1. 69:492 (1995). С^ррт е! а1., к Iттипο1. 147:569 (1991). ί.’οη11ίηί е! а1., Сапсег Вез. 53: 1 (1993). ί.’οη11ίηί е! а1., Сапсег Вез, 53: 5569 (1993). Си1тап е! а1., к Iттипο1. 146:1560 (1991). ^шИт е! а1., I Ехр. Мей. 180:1129 (1994). ΌαηΕο е! а1., Уассте 12:1499 (1994). Όί РаЬю е! а1., Уассте 15: 1 (1997).

Ει^οΗ е! а1., ГУ !п1егпа1юпа1 СопГегепсе οη АГОЗ, ЗШскМт, 1:241 (1988).

ЕшюН е! а1., №11иге 345:84 (1990).

ΕπόΗ е! а1., I У1то1. 67:277 (1993). ЕшюН е! а1., №11иге 371:674 (1994).

Εΐ'^οΗ е! а1., АГОЗ Ирйа!ез, Εйз. У. Эе У1!а, к., Не11тап 8., ΒοзепЬе^д 8.А., Оррт^!! кВ., РЫ1айе1рШа; 7: 1 (1994).

Ре1Ьег е! а1., Ргос. №!1. Асай. ЗсЕ 86:1495 (1989).

Рте е! а1., Апп. Р1аз!. Зигд. 20:6 (1988). Рют-еШ е! а1., к С1т. Штез!. 95:1723 (1995). ΡοΒ^ е! а1., Заепсе 238:800 (1987). РгапсЫш е! а1., УпюШду 155:593 (1986). Ргапке1 е! а1., Се11 55:1189 (1988). Рид1ег-УМег е! а1, к Εxр. Мей. 186: 813 (1997).

Сай е! а1., Тгепйз ВюсНет. ЗсЕ 18:255 (1993).

Ώοτΐοδο е! а1., Апп. Вет. МюгоЬю1. 49:675 (1995).

^Ьей е! а1., УпюШду 176:458 (1990). Οο1&ί!1 е! а1., к У1го1. 69:2540 (1995). Οοπηηη е! а1., Мο1. Се11. Вю1. 2:1044 (1982). СгаЬз!ет е! а1., Зс1епсе 264:965 (1994). Сгоз)еап е! а1., к Εxр. Мей. 186: 801 (1997). Сиу е! а1., Хайле 330:266 (1987).

Наггег е! а1., АГОЗ Вез. Нит. Ве!гот. 12:585 (1996).

НагпсН е! а1., ΕМΒΟ к 16:6 (1997). Нтки1а е! а1., к У1го1. 71:5528 (1997). ^пепЬ-ид е! а1., ШГесЕ Iттип. 62:15 (1994).

Ниапд е! а1., ΕМΒΟ к 13:2886 (1994). Ниагй е! а1., Сепе ТНег. 2:385 (1995). Ι^-ήβΙ е! а1., АГОЗ Вез. Нит. Ве!гот. 10:1021 (1994).

Шпикк е! а1., к Iттипο1. 158:2610 (1997). ШШеп е! а1., к ^тиюк 158:800 (1997). Капа1 е! а1., к Iттипο1. 157:3681 (1996). КагШззет е! а1., к У1то1. 71:4218 (1997). КазЫапсЫ е! а1., к У1то1. 70:5503 (1996). КезИег е! а1., Зскпсе 248:1109 (1991). К1т е! а1., Оютдепе 7: 1525 (1992). Клир е! а1., к У1то1. 68:4650 (1994). Кпзку е! а1., Сепе ТЫег. 4:1120 (1997). Кик1т е! а1., к У1то1. 240:245 (1998). Ьапйез, Аизйп, р. 107 (1997).

^аηζатесск^а. 8с1епсе 260: 937 (1993).

Ьак1с е! а1., Скеписа1 Кет1е\\'к 95: 2601 (1995).

Ьаик е! а1., Ро1утег 37: 343 (1996).

Ьаик е! а1., Ро1утегк Гог Айт. Тескп. 7: 548 (1996).

Ьекпеп е! а1., Уассте Кекеагск 1:319 (1992).

Ьетте е! а1., 8аепсе. 272: 1939-1943 (1996). Ье\\лк е! а1., Уассте Ргекк, Ей. КоЬткоп, Еаггаг, ΧνίΝίπ; Нитап Ргекк, То!оиа, Хеи 1егкеу (1996).

Ь1 е! а1., Ргос. Ха!1. Асай. 8ск И8А 94:8116 (1997).

Ь1 е! а1., I. АГО8 5:639 (1992).

Ь1 е! а1., 8с1епсе 268:229 (1995).

Ь1 е! а1., Ргос. Ха!1. Асай. 8ск И8А 94:8116 (1997).

ЫрртсоИ ГВ., 8!оскко1т, 8\\'ейеп, Мау 31Ьпе 3 (1997).

ЬШаиа е! а1. , I. У1го1. 65:40 (1991).

Ьотдгеп е! а1., Уассте 14:753 (1996).

Ьи е! а1., I. Уйо1. 70:3978 (1996).

ЬиЬак е! а1., I. 1пГес!. ϋΐδ. 175:1360 (1997).

Ьисеу е! а1., С1т. О1адп. ЬаЬ. 1ттипо1. 4:43 (1997).

Ьиспу е! а1., Ргос. Ха!1. Асай. 8ск 92:7490 (1995).

Мадпаш е! а1., Вю!еск. Арр1. Вюскет. 16: 188 (1992).

Мадпаш е! а1. , Вю!еск. Арр1. Вюскет. 20: 335 (1994).

Макт е! а1., Ха!иге 338:254 (1989).

Мапп е! а1., ЕМВО I. 10:1733 (1991).

Магсош е! а1., Ргос. Хай. Асай. 8с1 93:11319 (1996).

Магси/71 е! а1., I. У1го1. 66:4228 (1992).

МсЬеап е! а1., I. 1пГес!. Όίδ. 66:341 (1994).

МсЬеап е! а1., Уассте 14:987 (1996).

МсГаг1апй е! а1., I. 1пГ. ϋΐδ. 170:766 (1994).

МейадНш е! а1., Ргос. Хай. Асай. 8ск И8А 92: 6868 (1995).

Мейадйш е! а1., Вю!еск. Аппи. Кет. 3:297 (1997).

Мейадйш е! а1., Уассте 15:1330 (1997).

Мейадйш е! а1., Ат. I. Кергой. 1ттипо1. 39:199 (1998).

Меуегкапк е! а1., Се11 58:901 (1989).

Могет е! а1., АЮ8 Кек. Нит. Ке!гот. 810:8109 (1994).

Мо1еси1аг с1ошпд - А 1аЬога!огу тапиа1; Ейк. Матайк Т., Егйкск Е.Е., 8атЬгоок I., Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1й 8рппд НагЬог, Хеи Уогк (1992).

Муегк е! а1., Нитап КеПоткикек апй АЮ8: А сотрйайоп апй апа1ук1к оГ пис1ек ас1й апй атпо ас1й кедиепсек, Ьок А1аток ЬаЬога!огу, Ьок А1аток, ХМ р.1 (1993).

Муегк е! а1., Нитап Ке1гот1гикек апй АЮ8. ТкеогеРса1 Вю1оду апй Вюркукюк Сгоир. Ьок А1аток, ХН (1995).

Хейте! е! а1., I. У1го1. 70:5572 (1996).

Х1еШе1й е! а1., I. 1ттипо1. 154:2189 (1995).

Х1хоп е! а1., Ха!иге 336:484 (1988).

Оддюш е! а1., Уассте 13:775 (1995).

Оддюш, е! а1., Сепе 169:85 (1996).

О'Надап е! а1., Хоте1 ОеНтегу 8ук!етк Гог Ога1 Уасстек, Ейк. О'Надап, Э.Т. СкС Ргекк Воса Ка!оп, ЕЬ, р. 176 (1994).

Рагк1ои, Нитап Ке!гот1гикек, Ей. В.К. Си11еп, 1КЬ ргекк, ОхЕогй, Епд1апй, р. 101 (1993).

Р11ктд!оп е! а1., Мо1. 1ттипо1. 33:439 (1996).

Ро/ζί е! а1., т Сгат-рокйгте Ьас!епа ак тассте текШек Гог тисока1 ^ттишζайοη, ейк. Рοζζ^ С. & ^е11к, ЕМ. - Ьапйек, Аикйп, р. 35 (1997).

Рип е! а1., Сапсег Кек., 52:3787 (1992).

Рип е! а1., АГО8 Кек. 11:31 (1995).

Оиекайа-Ко1апйег е! а1., АВ8 6-81, 2пй Еигореап СопЕегепсе оп Ехрептеп!а1 АЮ8 Кекеагск, 8!оскко1т, 8иеейеп, Мау 31-Л.те3 (1997).

Отпп е! а1., Вюскет. Вюркук. Кек. Соттип. 239:6 (1997).

Ка!пег е! а1., Ха!иге 313:277 (1985).

Ке е! а1., I. Асдтг. 1ттип. ЬеПс. 8упйг. 10:408 (1995).

Ке1тапп е! а1., I. У1го1. 70:3189 (1996).

Ке1тапп е! а1., I. У1го1. 70:6922 (1996). Ке1кк е! а1., I. Мей У1го1. 30:163 (1990).

Ке1кк е! а1., АГО8 Кек. Нит. Ке1гот. 5:621 (1989).

Кйеу е! а1., Пттипо1. 158: 5545-5553, (1997).

К1па1йо е! а1., АЮ8 Кек. Нит. Ке1гот. 11:481 (1995).

Кша1йо е! а1., I. У1го1., 69:5838 (1995).

Койтап е! а1., Ргос. Ха!1. Асай. 8ск И8А 90:7719 (1993).

Койтап е! а1., I. Ехр. Мей. 175:1247 (1992).

КокепЬегд е! а1., 1п!. 1ттипо1. 9 (5):703 (1997).

Кокеп!ка1 е! а1., 8еттагк т 1ттипо1оду 9:303 (1997).

Кикк, е! а1., ш Сгат-рокйгте Ьас!епа ак тассте текю1ек Гог тисока1 ^ттишζайοη, ейк. Рοζζ^ С. & ^е11к, ЕМ. - Ьапйек, Аикйп, р. 107 (1997).

8айа1е е! а1., Хее Вю1. 2:479 (1990).

8а1к1 е! а1., 8с1епсе 230:1350 (1985).

8акигад1 е! а1., I. Сеп. У1го1. 73:2983 (1992). 8а1!ег е! а1., 1ттиподепейск 21:235 (1985).

8скпогг е! а1., Ргос. Ха!1. Асай. 8ск И8А. 94: 5326 (1997).

8кагта е! а1., Вюскет. Вюркук. Кек. Со. 208:704 (1995).

8ЫЬа!а е! а1., I. Уйо1. 65:314 (1991).

81ркак е! а1., I. Скп. 1птек!. 99:752 (1997). 8ойгокк1 е! а1., 8с1епсе 227:171 (1985) 8!етаа е! а1., Агск. У1го1. 139:263 (1994). 8!еттап К.М., Ехр. Нета!о1. 24: 859 (1996).

Такйпеп е! а1., У1го1оду 187:156 (1992).

Ткеогекса1 Вю1оду апй Вюркукюк, Ьок

А1аток, ΝΗ, (1995).

ТйЕ е! а1., Се11. РЬагтасоЕ ΑΙΌ8 3:123 (1996).

ТппсЫегг Сигг. Θρίη. Нета!о1. 4:59 (1997).

νΗη Ваа1еп е! а1., 1. Сеп. УйоЬ 77:1659 (1996).

νΗη Ваа1еп е! а1., 1. Сеп. Уйо1. 78:1913 (1997).

Vе11иί^ш е! а1., ΑΙΌ8 Кек. Нит. Ке1гоу. 11:21 (1995).

Vеηе! е! а1., 1. 1ттипо1. 148:2899 (1992). νίκαάί е! а1., 8с1епсе 246:1606 (1989).

Уоде1 е! а1., Уинге 335: 601 (1988). ^кк е! а1., ^го1оду 208:770 (1995).

\ат-НоЬкоп, Сигг. Орт. Сепе!. Ьеу. 3:878 (1993).

\ек!епбогр е! а1., 1. νΐΐΌ1. 68:4177 (1994).

\ек!епбогр е! а1., №1иге 375:497 (1995). \о1Г е! а1., 1. 1ттипо1. 146:3074 (1991). Уапд е! а1., 1. νΐΐΌ1. 70:4576 (1996). Уапд е! а1., 1. νΐΐΌ1. 70:5799 (1996). Уаки!от1 е! а1., 1. νΐΓΌ1. 70:678 (1996).

2аи11 е! а1., В1ооб 86:3823 (1995). 2аи11 е! а1., В1ооб 80:3036 (1996). Ζηπ1ϊ е! а1., ЫттипоЕ 157:2216 (1996).

2оЬе1 е! а1., АпЕкепке ШсШс Ас1б Эгид 1)е\. 7: 483 (1997).

СФеШш е! а1., В1ооб 89:1654 (1997).

Ваиег е! а1., 1. 1пГес!. Όίκ. 165:419 (1992). К1ет е! а1., 1. Ехр. Меб. 181:1365 (1995). Во\геп е! а1., Кек. νΐΐΌ1. 143:269 (1992).

Ζ;·ιιη;·ιΐΌ1ιί е! а1., ΑΙΌ8 Кек. Нитап Ве1гоу. 9:1139 (1993).

Йоге е! а1., ΑΙΌ8 5:1034 (1992).

Котап е! а1., №11иге Меб. 3:849 (1997).

А11еп е! а1., ВтсЫт. ВтрЫк. Ас!а 1237:99 (1995).

Claims

1. Биологически активный изолированный белок Та!, имеющий последовательность, определенную в 8ЕО ΙΌ N 2, способный 1) проникать в активированные эндотелиальные клетки или дендритные клетки в концентрациях до 10 нМ и 2) осуществлять по меньшей мере одно действие, выбранное из группы, состоящей из следующих действий: ί) активация пролиферации, миграции и инвазии клеток саркомы Капоши (К8) или цитокинактивированных эндотелиальных клеток; ίί) активация репликации вируса при добавлении к инфицированным клеткам при измерении: а) методом сохранения дефектных по Та! провирусов в клетках НЬМ-1 после добавления экзогенного белка и/или б) методом трансактивации экспрессии гена ВИЧ1 в клетках, трансфицированных промотором ВИЧ-1 - репортерной плазмидой; и ίίί) индукция у мышей развития К8-подобных повреждений в присутствии ангиогенных факторов или цитокинов зоны воспаления.

2. Изолированная ДНК, определенная в по следовательности 8ЕО ΙΌ N 1, кодирующая белок Та! по п.1, который способен 1) проникать в активированные эндотелиальные клетки или дендритные клетки в концентрациях до 10 нМ и 2) осуществлять по меньшей мере одно действие, выбранное из группы, состоящей из следующих действий: ί) активация пролиферации, миграции и инвазии клеток саркомы Капоши (К8) или цитокинактивированных эндотелиальных клеток; ίί) активация репликации вируса при добавлении к инфицированным клеткам при измерении: а) методом сохранения дефектных по Та! провирусов в клетках НЬМ-1 после добавления экзогенного белка и/или б) методом трансактивации экспрессии гена ВИЧ-1 в клетках, трансфицированных промотором ВИЧ-1 репортерной плазмидой; и ίίί) индукция у мышей развития К8-подобных повреждений в присутствии ангиогенных факторов или цитокинов зоны воспаления.

3. Биологически активный изолированный фрагмент белка Та! по п.1, имеющий последовательность, выбранную из группы следующих последовательностей: 8ЕО ΙΌ N 11, 8ЕО ΙΌ N 12, 8ЕО ΙΌ N 13, 8 ЕС) ΙΌ N 14, 8 ЕС) ΙΌ N 15, 8ЕО ΙΌ N 16, 8ЕО ΙΌ N 17 и способный: 1) проникать в активированные эндотелиальные клетки или дендритные клетки в концентрациях до 10 нМ и 2) осуществлять по меньшей мере одно действие, выбранное из группы, состоящей из следующих действий: ί) активация пролиферации, миграции и инвазии клеток саркомы Капоши (К8) или цитокинактивированных эндотелиальных клеток; ίί) активация репликации вируса при добавлении к инфицированным клеткам при измерении: а) методом сохранения дефектных по Та! провирусов в клетках НЬМ-1 после добавления экзогенного белка и/или б) методом трансактивации экспрессии гена ВИЧ1 в клетках, трансфицированных промотором ВИЧ-1 - репортерной плазмидой; и ίίί) индукция у мышей развития К8-подобных повреждений в присутствии ангиогенных факторов или цитокинов зоны воспаления.

4. Биологически активный изолированный мутант белка Та! по п.1, имеющий последовательность, выбранную из группы последовательностей: аминокислотная последовательность сук22, определенная в 8ЕО ΙΌ N 7, аминокислотная последовательность 1ук41, определенная в 8ЕО ΙΌ N 8, аминокислотная последовательность КСОД, определенная в 8ЕО ΙΌ N 9, аминокислотная последовательность 1ук41КСОД, определенная в 8ЕО ΙΌ N 10, способный: 1) проникать в активированные эндотелиальные клетки или дендритные клетки в концентрациях до 10 нМ и 2) осуществлять по меньшей мере одно действие, выбранное из группы, состоящей из следующих действий: ί) активация пролиферации, миграции и инвазии клеток саркомы Капоши (К8) или цитокинакти вированных эндотелиальных клеток; ίί) активация репликации вируса при добавлении к инфицированным клеткам при измерении: а) методом сохранения дефектных по Та! провирусов в клетках НЬМ-1 после добавления экзогенного белка и/или б) методом трансактивации экспрессии гена ВИЧ-1 в клетках, трансфицированных промотором ВИЧ-1 - репортерной плазмидой; и ϊϊΐ) индукция у мышей развития Κδподобных повреждений в присутствии ангиогенных факторов или цитокинов зоны воспаления.

5. Изолированная ДНК, кодирующая биологически активный изолированный мутант белка Та!, который способен: 1) проникать в активированные эндотелиальные клетки или дендритные клетки в концентрациях до 10 нМ и 2) осуществлять по меньшей мере одно действие, выбранное из группы, состоящей из следующих действий: 1) активация пролиферации, миграции и инвазии клеток саркомы Капоши (Κδ) или цитокинактивированных эндотелиальных клеток; ίί) активация репликации вируса при добавлении к инфицированным клеткам при измерении: а) методом сохранения дефектных по Та! провирусов в клетках НЬМ-1 после добавления экзогенного белка и/или б) методом трансактивации экспрессии гена ВИЧ-1 в клетках, трансфицированных промотором ВИЧ-1 репортерной плазмидой; и ш) индукция у мышей развития Κδ-подобных повреждений в присутствии ангиогенных факторов или цитокинов зоны воспаления, причем указанная последовательность, является последовательностью, представляющей нуклеотидную последовательность мутанта су§22, определенную в δΕΟ ΙΌ N 3, или нуклеотидную последовательность 1у§41, определенную в δΕΟ ΙΌ N 4, или нуклеотидную последовательность ΚΟΌΔ, определенную в δΕΟ ГО N 5, или нуклеотидную последовательность 1ν541-Ε6ΩΔ. определенную в δΕΟ ΙΌ N 6.

6. Биологически активный изолированный белок Та!, его фрагмент и/или мутант, и/или ДНК Та! по пп.1-5, полезные при профилактике и/или лечении СПИДа, опухолей, синдромов и симптомов, связанных с ВИЧ-инфекцией.

7. Вакцина профилактическая и/или лечебная против СПИДа, опухолей, синдромов и симптомов, связанных с ВИЧ-инфекцией, на основе биологически активного изолированного белка Та!, его фрагмента и/или мутанта, и/или ДНК Та! по пп.1-5.

8. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активной основы биологически активный выделенный белок Та!, его фрагменты и/или мутанты, и/или ДНК Та! по любому из пп.1-5 в сочетании с подходящими эксципиентами и/или разбавителями (для профилактики и/или лечения СПИДа, опухолей, синдромов и симптомов, связанных с ВИЧ-инфекцией).

9. Фармацевтическая композиция по п.8 для профилактики и/или лечения СПИДа, опухолей, синдромов и симптомов, связанных с ВИЧ-инфекцией.

10. Фармацевтическая композиция по п.8, которая представляет собой вакцину для профилактики и/или лечения СПИДа, опухолей, синдромов и симптомов, связанных с ВИЧинфекцией.

11. Фармацевтическая композиция по п.8, в которой Та! представлен в очищенной неагрегированной и неокисленной форме, причем он лиофилизирован для хранения и ресуспендируем в биологически приемлемой жидкости при применении.

12. Фармацевтическая композиция по пп.811, выполненная в форме, подходящей для введения, выбранного из группы, состоящей из введения в слизистую оболочку, назального, перорального, вагинального, ректального, внутримышечного, подкожного, интрадермального, системного и местного введения.

13. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активной основы биологически активный выделенный белок Та!, его фрагмент и/или мутант и/или Та! ДНК в сочетании с подходящими эксципиентами и/или разбавителями, причем указанный Та! получен способом, включающим стадию очистки, осуществляемую в условиях, предотвращающих его окисление и агрегацию.

14. Фармацевтическая композиция по п.13, где указанную стадию очистки осуществляют методом гепаринаффинной хроматографии.

15. Фармацевтическая композиция по п.13, где за указанной стадией очистки следует хранение белка Та! в лиофилизированной форме и его ресуспендирование в буфере, лишенном газа.

16. Фармацевтическая композиция по п.13, причем указанная композиция представляет собой вакцину для профилактики и/или лечения СПИДа, опухолей, синдромов и симптомов, связанных с ВИЧ-инфекцией.

17. Фармацевтическая композиция по п.13, в которой Та! кодирован ДНК, имеющей последовательность, идентифицированную как δΕΟ ΙΌ N 1.

18. Фармацевтическая композиция по п.13, в которой Та! имеет последовательность δΕΟ ГО N 2.

19. Фармацевтическая композиция по пп.13-16, в которой мутант выбран из группы мутантов, имеющих перечисленные далее нуклеотидные последовательности или часть их: нуклеотидная последовательность мутанта су§22, идентифицированная как δΕΟ ΙΌ N 3; нуклеотидная последовательность мутанта 1у§41, идентифицированная как δΕΟ ΙΌ N 4; нуклеотидная последовательность мутанта ΚΟΌΔ, идентифицированная как δΕΟ ΙΌ N 5; нуклеотидная последовательность мутанта

1γ841-ΚΟΌΔ, идентифицированная как 8ЕЦ ΙΌ N 6.

20. Фармацевтическая композиция по пп.13-16, в которой мутант выбран из группы мутантов, имеющих перечисленные далее аминокислотные последовательности или часть их: аминокислотная последовательность мутанта суз22, идентифицированная как 8ЕЦ ГО N 7; аминокислотная последовательность мутанта 1уз41, идентифицированная как 8ЕЦ ΙΌ N 8; аминокислотная последовательность мутанта Κ.ΟΌΔ, идентифицированная как 8ЕЦ ΙΌ N 9; аминокислотная последовательность мутанта 1\·541-ΕΟΌΔ. идентифицированная как 8ЕЦ ΙΌ N 10.

21. Фармацевтическая композиция по пп.13-16, в которой фрагмент Та! выбран из группы пептидов, имеющих последовательности, идентифицированные как 8ЕЦ ГО N 11, 5ЕО ГО N 12, 5ЕО ГО N 13, 8Ер ГО N 14, 8Ер ГО N 15, 5ЕЕ) ГО N 16, 5ЕЕ) ГО N 17.

22. Фармацевтическая композиция по пп.13-21, выполненная в форме, подходящей для введения, выбранного из группы, состоящей из введения в слизистую оболочку, назального, перорального, вагинального, ректального, внутримышечного, подкожного, интрадермального, системного и местного введения.

23. Фармацевтическая композиция по пп.822, содержащая белки или пептиды, конъюгированные с универсальным хелперным эпитопом столбнячного анатоксина или любыми Тхелперными эпитопами.

24. Фармацевтическая композиция по пп.822 в сочетании с рекомбинантными белками или пептидами ВИЧ N01, Ксу или Сад или частью из них.

25. Фармацевтическая композиция по пп.822, содержащая слитые белки Та! (дикого типа или его мутанты)/№Г, Та! (дикого типа или его мутанты)/К.еу или Та! (дикого типа или его мутанты)/Сад или часть из них.

26. Фармацевтическая композиция по пп.825 в сочетании с рекомбинантными иммуномодулирующими цитокинами, или другими молекулами, или частью из них, усиливающими антивирусную иммунную реакцию.

27. Фармацевтическая композиция по п.26, в которой цитокины представляют собой Ш-12, и/или ΙΠ-15, или а-ШИ, или β-ΣΕΚ

28. Фармацевтическая композиция по пп.822, в которой белки Та! представляют собой слитые белки Та! (дикого типа или его мутанты)/иммуномодулирующие цитокины, Та! (дикого типа или его мутанты)/Ш-12, Та! (дикого типа или его мутанты)/Ш-15, Та! (дикого типа или его мутанты)/другие молекулы или часть их, усиливающие антивирусную иммунную реакцию.

29. Фармацевтическая композиция по пп.822, содержащая ДНК, кодирующую Та! дикого типа, или его мутанты, или часть их, встроенную в экспрессирующие векторы.

30. Фармацевтическая композиция по пп.822, дополнительно содержащая в сочетании с ним экспрессирующий вектор, включающий гены ВИЧ геу, пеГ и дад или часть из них.

31. Фармацевтическая композиция по п.27 или 30, в которой вектор представляет собой плазмиду, коэкспрессирующую !а! (дикого типа или его мутанты)/геу, !а! (дикого типа или его мутанты)/пеГ, !а! (дикого типа или его мутанты)/дад или часть из них.

32. Фармацевтическая композиция по пп.822 в сочетании с молекулой ДНК, встроенной в экспрессирующий вектор, кодирующий иммуномодулирующие цитокины или другие иммуномодулирующие молекулы, или часть их, усиливающую противовирусную иммунную реакцию.

33. Фармацевтическая композиция по п.32, в которой цитокином является Ш-12 и/или ГО15.

34. Фармацевтическая композиция по п.32 или 33, в которой вектор представляет собой плазмиду, коэкспрессирующую !а! (дикого типа или его мутанты)/ГО-12, !а! (дикого типа или его мутанты)/ГО-15, !а! (дикого типа или его мутанты)/другие молекулы или часть их, способную усиливать антивирусную иммунную реакцию.

35. Фармацевтическая композиция по пп.29-34, в которой вектором является рСУ0.

36. Фармацевтическая композиция по пп.8-

35, дополнительно содержащая аутологичные дендритные клетки.

37. Фармацевтическая композиция по пп.8-

36, дополнительно содержащая адъювант, выбранный из группы, состоящей из А1ит, КСОМ, ΚΙΒΙ и/или парамагнитных гранул, покрытых моноклональными антителами против СГО3 и против СЭ28, и их смесей.

38. Фармацевтическая композиция по пп.8-

37, дополнительно содержащая систему для доставки.

39. Фармацевтическая композиция по п.38, в которой систему для доставки выбирают среди наночастиц, герпесных векторов, эритроцитов, бактерий и их сочетаний.

40. Фармацевтическая композиция по п.39, в которой бактерии выбирают среди 8!гер!ососси8 догбопл и Ьас!оЬасШц8.

41. Фармацевтическая композиция по пп.39 и 40, в которой бактерии модифицируют для экспрессии вирусных антигенов.

42. Фармацевтическая композиция по пп.841 для иммунизации клеток периферической крови от инфицированных индивидуумов, выращенных посредством костимуляции с магнитными гранулами, сенсибилизированными антителами против СГО3 и против СГО28.

43. Фармацевтическая композиция по пп.8-42 в сочетании с ингибиторами репликации вируса.

44. Фармацевтическая композиция по пп.8

43, в которой активную основу вводят без адъювантов интрадермально в количестве 1-6 мкг.

45. Применение белка Та!, его фрагментов, и/или мутантов, и/или Та! ДНК по пи. 1-5 в их неокисленной и неагрегированной форме при лечении (СПИДа, связанных со СПИДом опухолей, синдромов и симптомов, связанных с ВИЧ-инфекцией).

46. Применение белка Та!, его фрагмента, варианта или ДНК по пи. 1-5 для приготовления вакцины на основе белка, или пептида, или ДНК, профилактической и/или лечебной, против СПИДа, связанных со СПИДом опухолей, синдромов и симптомов, связанных ВИЧинфекцией.

47. Применение лиофилизованного Та! для приготовления вакцины по и. 46, причем указанный лиофилизованный Та! для введения ресуспендируют в биологически приемлемой жидкости.

48. Экспрессионный вектор, экспрессирующий биологически активный белок Та!, его фрагмент и /или мутант по пи. 1-5.

49. Экспрессионный вектор по п.48, представляющий собой рСУО.

50. Экспрессионный вектор по пп.48-49, дополнительно содержащий последовательность ДНК, кодирующую ген, выбранный среди 1а(. τεν, ηεί, §а§, 1Б-12,1Б-15 и их сочетаний.

51. Линия прокариотических и/или эукариотических клеток, содержащих вектор по пп.48-50.

52. Применение вектора рСУО, модифицированного по пи.49-50, для приготовления профилактической и/или лечебной вакцины против СПИДа, связанных со СПИДом опухолей, синдромов и симптомов, связанных с ВИЧинфекцией.