ES2932407T3 - Inmunógenos para vacunación contra VIH - Google Patents

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IrsiCaixa Institut de Recerca de la Sida
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Abstract

La presente invención se refiere a nuevos inmunógenos basados en péptidos superpuestos (OLP) y péptidos derivados de los mismos útiles para la prevención y el tratamiento del SIDA y sus enfermedades oportunistas relacionadas. La invención también se refiere a ácidos nucleicos aislados, vectores y células huésped que expresan estos inmunógenos así como vacunas que incluyen dichos inmunógenos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunógenos para vacunación contra VIH
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a nuevos inmunógenos basados en péptidos solapantes (OLP, por sus siglas en inglés) y péptidos derivados de los mismos. También se refiere a ácidos nucleicos aislados que expresan estos inmunógenos así como a virus y células que comprenden tales ácidos nucleicos. Los compuestos de la presente invención son útiles como vacunas, particularmente para la prevención y tratamiento del SIDA y enfermedades oportunistas.
Antecedentes de la Invención
La infección por el VIH induce respuestas de células T restringidas por HLA de clase I, fuertes y ampliamente dirigidas, para las que se han implicado epítopos específicos y alelos de HLA restrictivos en el control relativo in vivo. Véase, Brander C, et al., Current Opinión Immunol. 2006; 18:1-8. Mientras que el grueso de la respuesta de LTC antivírica parece estar restringida por HLA-B, la contribución relativa de regiones víricas diana y moléculas de HLA restrictivas en la eficacia de estas respuestas permanece oscura. Véase, Kiepiela P, et al., Nature 2004; 432:769-775 y Ngumbela K, et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 2008; 24:72-82.
Además, el papel que la diversidad de secuencia del VIH desempeña en la relevancia in vivo de la inmunidad de células T específica de virus no está claro, ya que las restricciones funcionales de las variantes de escape, el uso de codones en posiciones de proteínas individuales, plasticidad y avidez funcional del receptor de células T (TCR) y la potencial reactividad cruzada pueden contribuir todos a la eficacia global de una respuesta de células T específica. Véase, Brockman M, et al., J. Virol. 2007; 81: 12608-12618 y Yerly D, et al., J. Virol. 2008; 82:3147-3153. De importancia, las respuestas de células T a Gag de VIH se han asociado más consistentemente con cargas víricas reducidas en cohortes infectadas tanto por el clado B como por el clado C del VIH. Véase, Zuñiga R, et al., J. Virol. 2006; 80:3122-3125 y Kiepiela P, et al., Nat. Med. 2007; 13:46-53.
Sin embargo, ninguno de estos análisis evaluaba el papel de respuestas a regiones más cortas de la(s) proteína(s) objetivo que pueden inducir respuestas particularmente eficaces. Además, no está claro si el beneficio relativo de Gag es debido a cualquier otra característica específica de esta proteína, tal como los niveles de expresión, composición de aminoácidos e inmunogenicidad inherentemente mayor. Por tanto, es factible que se pudieran identificar subunidades de proteínas fuera de Gag y dentro de estas, regiones ricas en epítopos, cortas, específicas que: i) inducen respuestas predominantemente vistas en controladores de VIH y ii) que serían detectables en individuos de diversos tipos de HLA, no limitadas a individuos que expresan alelos previamente asociados con control vírico eficaz.
Mientras que algunos de los estudios anteriores han controlado de hecho una potencial sobrerrepresentación de epítopos derivados de Gag presentados en alelos de HLA de clase I “buenos”, permanecen las preocupaciones de que vacunas contra el VIH basadas puramente en Gag podrían beneficiar principalmente a aquellas personas con un genotipo de HLA ventajoso y no aprovecharía dianas potencialmente beneficiosas fuera de Gag. Véase, Kiepiela, 2007, anteriormente y Honeyborne I, et al., J. Virol. 2007; 81:3667-3672. Además, los estudios de escape de LTC e idoneidad vírica se han limitado en gran parte a epítopos derivados de Gag presentados en el contexto de alelos de HLA relativamente protectores tales como HLA-B57 y -B27. Véase, Schneidewind A, et al., J. Virol. 2007; 81:12382-12393 y Leslie A, et al., Nat. Med. 2004; 10:282-289. La información disponible puede, por tanto, no proporcionar información relevante para secuencias inmunógenas diseñadas para proteger a la mayoría genéticamente diversa de la población hospedante humana.
Además, muchos estudios se han enfocado en las dianas inmunodominantes solo, a pesar de algunos estudios recientes en infección por VIH y VIS que demuestran una contribución crucial de respuestas subdominantes en el control vírico in vivo, entre ellas dianas situadas fuera de Gag. Véase, Frahm N, et al., Nat. Immunol.
2006; 7:173-178 y Friedrich T, et al., J. Virol. 2007; 81:3465-3476. La solicitud de patente WO2006/010106 describe una vacuna de ADN que comprende epítopos unidos de gag, env, pol, nef, tat y vif. En conjunto, la visión actual sobre qué puede constituir un respuesta inmunitaria celular protectora contra el VIH está por tanto bastante probablemente sesgada hacia un enfoque en las respuestas inmunodominantes y en respuestas restringidas por alelos de HLA de clase I frecuentes y alelos de HLA asociados con desenlace de enfermedad superior. Por tanto, el desarrollo de vacunas contra el VIH está limitado en parte por la falta de inmunógenos capaces de inducir una respuesta inmunitaria amplia. La presente invención aborda el diseño de tales inmunógenos.
Sumario de la Invención
En un primer aspecto, la invención se refiere a un polipéptido inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 1-16 con la condición de que el polipéptido inmunógeno no comprenda ningún tramo de secuencia de aminoácidos derivado del genoma del VIH de una longitud de 8 o más aminoácidos diferente de una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NO 1-16 y en donde al menos dos de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO 1-16 están unidas por un enlazador de aminoácidos en el polipéptido inmunógeno.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido inmunógeno del primer aspecto, y a virus y células que comprenden dicho polinucleótido.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una vacuna que comprende un polipéptido inmunógeno según el primer aspecto de la invención y uno o más adyuvantes.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al polipéptido inmunógeno del primer aspecto, el polinucleótido, el virus o la célula del segundo aspecto, o la vacuna del tercer aspecto para usar en medicina.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al polipéptido inmunógeno del primer aspecto, el polinucleótido, el virus o la célula del segundo aspecto, o la vacuna del tercer aspecto para usar en la prevención o el tratamiento de una infección por el VIH.
También se describe un kit que comprende el polipéptido inmunógeno del primer aspecto, el polinucleótido, el virus o la célula del segundo aspecto, o la vacuna del tercer aspecto.
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere al compuesto, las composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para usar en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
Depósito de Microorganismos
El plásmido 298H GMCSF-HIVACAT DNA se depositó el 13 de enero, 2012, con el número de acceso DSM 25555 en la DSMZ-Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, InhoffenstralJe 7 B, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania.
Breve Descripción de las Figuras
Figura 1. Representación esquemática del gen incluido en el plásmido de expresión. Los puntos identifican los codones de inicio y terminación.
Figura 2. Respuestas inmunitarias celulares analizadas en mezclas de esplenocitos por análisis de citometría de flujo. Se muestran la frecuencia de respuestas de interferón gamma específicas de Gag, Pol y Nef-Tat-Vif totales entre los grupos en (a) y la distribución de respuestas CD4 y CD8 en (b).
Figura 3. Respuestas a Gag, Pol, NTV y la secuencia de inmunógeno de células T HIVACAT medidas por ensayo ELISpot de interferón gamma en esplenocitos murinos. Los ratones individuales se inmunizaron con los plásmidos que codifican Gag, Pol completas y el polipéptido Nef-Tat-Vif. Se muestra la contribución de las respuestas que se dirigen a las regiones incluidas en el inmunógeno de células T HIVACAT respecto a la respuesta específica a Gag-Pol-NTV de interferón gamma total.
Figura 4. Comparación de la amplitud en (a) y magnitud en (b) de las respuestas de interferón gamma que se dirigen al inmunógeno de células T HIVACAT en ratones inmunizados. Los sujetos se trataron con los plásmidos que codifican las proteínas completas o la secuencia de células T mínima.
Figura 5. Equilibrio de respuestas de interferón gamma contra Gag, Pol, Vif o Nef para ratones inmunizados con 20 |ig de plásmidos que codifican Gag, Pol enteras más polipéptido Nef-Tat-Vif e inmunógeno de células T HIVACAT. El dominio de las respuestas específicas de Gag se muestra en el panel (a) para ratones inmunizados con proteínas completas mientras que se ve un repertorio más equilibrado en el panel (b) para ratones inmunizados con el inmunógeno de células T HIVACAT.
Figura 6. Anticuerpos de unión a p24, p37 y p55 detectados por inmunotransferencia Western usando extractos celulares de células HEK 293 transfectadas con 1 mg de los vectores de expresión de gag y gag-pol (muestra p55 gag y las subunidades de gag p24, p37 y p55 procesadas) separadas en SDS-PAGE al 12% y ensayando las membranas con a) suero humano de un paciente infectado por VIH, b) mezcla de sueros de ratones inmunizados con altas dosis del inmunógeno y c) mezcla de sueros de ratones inmunizados con bajas dosis del inmunógeno (todos a una dilución 1:100).
Figura 7. a) Títulos finales de anticuerpo de unión específico de Gag-p24 de ratones tratados. La determinación se realizó mediante ELISA de muestras individuales de mezclas de suero diluidos 4 veces en serie. b) ELISA de gag p55 desarrollado internamente usando la proteína recombinante VIH-1IIIB pr55 Gag (N° de catálogo 3276, NIH Reagent Program, Bethesda, MD, EE. UU.). La determinación se realizó en sueros de ratones individuales a una dilución 1:100.
Figura 8. a) Representación esquemática de inmunizaciones de ratones. Se usaron grupos de seis ratones C57BL/6 para comparar la inmunogenicidad de diferentes combinaciones heterólogas (sensibilización de 2xADN frente a sensibilización de 3xADN seguido por refuerzo delxMVA) usando bien 100 |jg de pDNA-HIVACAT o 10A6 ufp de MVA-HIVACAT mediante inyección intramuscular. b) Comparación de la amplitud y magnitud de las respuestas de IFNy dirigidas al inmunógeno de células T HIVACAT en ratones inmunizados individuales. c) Distribución de las respuestas específicas a Gag, Pol, Vif y Nef en ratones inmunizados individuales. d) Se muestra la distribución entre las 8 subunidades de proteína incluidas en el inmunógeno de células T HIVACAT (Gag p17, Gag p24, Gag p2p7p1p6, Pol-proteasa, Pol-RT, Pol-integrasa, Vif y Nef) en diferentes grupos de inmunización
Descripción detallada de la invención
La invención describe varios compuestos inmunógenos eficaces para inducir una respuesta inmunitaria alta contra el VIH en una amplia gama de sujetos. En particular, se han obtenido respuestas de células T CD4+ y CD8+ específicas del VIH para epítopos clave codificados por el VIH con estos compuestos.
1. Definiciones de términos y expresiones generales
El término “adyuvante”, como se usa en el presente documento, se refiere a un agente inmunológico que modifica el efecto de un inmunógeno, mientras que tiene pocos, si tiene alguno, efectos directos cuando se administra por sí mismo. Con frecuencia se incluye en vacunas para aumentar la respuesta inmunitaria del receptor al antígeno suministrado, a la vez que mantiene el material exógeno inyectado a un mínimo. Los adyuvantes se añaden a las vacunas para estimular la respuesta del sistema inmunitario al antígeno diana, pero no confieren inmunidad por sí mismos. Ejemplos no limitantes de adyuvantes útiles incluyen sales minerales, polinucleótidos, poliargininas, ISCOM, saponinas, monofosforil lípido A, imiquimod, inhibidores de CCR-5, toxinas, polifosfacenos, citoquinas, proteínas inmunorreguladoras, proteínas de fusión inmunoestimuladoras, moléculas coestimuladoras y combinaciones de los mismos. Las sales minerales incluyen, pero no se limitan a, AIK(SO4)2 , AlNa(SO4)2 , AlNH(SO4)2 , sílice, alumbre, Al(OH)3 , Ca3(PO4)2 , caolín o carbono. Los polinucleótidos inmunoestimuladores útiles incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos de CpG con o sin complejos inmunoestimuladores (ISCOM), oligonucleótidos de CpG con o sin poliarginina, ácidos poli IC o poli AU. Las toxinas incluyen toxina del cólera. Las saponinas incluyen, pero no se limitan a, QS21, QS17 o QS7. Un ejemplo de una proteína de fusión inmunoestimuladora útil es la proteína de fusión de IL-2 con el fragmento Fc de inmunoglobulina. Las moléculas inmunorreguladoras útiles incluyen, pero se limitan a CD40L y ligando CD1a. Las citoquinas útiles como adyuvantes incluyen, pero no se limitan a IL-1, IL-2, IL-4, GMCSF, IL-12, IL-15, IGF-1, IFN-a, IFN-p e interferón gamma. Además, ejemplos de dipéptidos muramilo, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, también denominado nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'2'-dipalmitoil-snglicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, también denominado MTP- PE), RIBI (MPL+TDM+CWS) en una emulsión al 2 por ciento de escualeno/TWEEN® 80, lipopolisacáridos y sus varios derivados, incluyendo lípido A, adyuvante completo de Freund (FCA), adyuvante incompleto de Freund, Adyuvante 65 de Merck, polinucleótidos (por ejemplo, ácidos poli IC y poli AU), cera D de Mycobacterium tuberculosis, sustancias encontradas en Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, y miembros del género Brucella, Titermax, Quil A, ALUN, derivados de lípido A, derivados de la toxina del cólera, derivados de HSP, derivados de LPS, matrices de péptidos sintéticos o GMDP, Montanide ISA-51 y QS-21, oligonucleótido CpG, poli I:C y GMCSF. Véase, Osol A., Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA, EE. UU., 1980, pp. 1324-1341), Hunter R, US 5.554.372 y Jager E, Knuth A, WO1997028816. También se pueden usar combinaciones de adyuvantes.
El término “SIDA”, como se usa en el presente documento, se refiere a la fase sintomática de la infección por el VIH, e incluye tanto el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (comúnmente conocido como SIDA) como “ARC”, o complejo relacionado con SIDA. Véase, Adler M, et al., Brit. Med. J. 1987; 294: 1145-1147. Las manifestaciones inmunológicas y clínicas del SIDA se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, infecciones oportunistas y cánceres que resultan de la inmunodeficiencia.
La expresión “enlazador de aminoácidos”, como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos diferente de la que aparece en una posición particular en la proteína natural y en general se diseña para ser flexible o para interponer una estructura, tal como una hélice a, entre dos grupos proteicos. Un enlazador también se denomina un espaciador. El enlazador es típicamente no antigénico y puede tener esencialmente cualquier longitud (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos). El enlazador también puede ser una localización o secuencia donde la maquinaria de procesamiento de antígenos celular pueda iniciar la degradación del polipéptido inmunógeno sin destruir epítopos de células T potentes).
La expresión “sitio de mutación de resistencia antirretroviral”, como se usa en el presente documento, se refiere a un sitio que, cuando muta, confiere resistencia a un agente antirretroviral. Tales sitios se pueden identificar buscando en bases de datos conocidas tal como la base de datos de resistencia a fármacos del VIH de la Universidad de Stanford, donde, por ejemplo, se pueden recuperar secuencias y tratamientos de virus con mutaciones específicas o datos de susceptibilidad a fármacos para aislados con mutaciones seleccionadas. Se conocen en la técnica ensayos para probar la resistencia a fármacos del VIH. Véase, Dong J, US 20040106136 y Shafer R, Assay for Antiretroviral Resistance, HIV InSite Knowledge Base Chapter (http://hivinsite.ucsf.edu/InSite?page=kb-02-02-03, Enero 2012). Los sitios de resistencia antirretroviral ya conocidos en el VIH son publicados regularmente por la Organización Mundial de la Salud o la Sociedad Antivírica Internacional-USA (por ejemplo, Johnson V, et al., ISA-USA Topics Antiviral Med. 2011; 19(4): 153­ 164.
La expresión “respuesta inmunitaria celular”, como se usa en el presente documento, describe una respuesta inmunitaria contra antígeno(s) exógeno(s) que está mediada por células T y sus productos de secreción.
La expresión “secuencia centro del árbol” o “COT”, como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia desde la que la distancia evolutiva media a cada punta de un diagrama filogenético de secuencias variantes relacionadas se ha minimizado. Véase, Nickle D, et al., Science 2003; 299, 1515-1517.
La expresión “codón optimizado”, como se usa en el presente documento, se refiere a la alteración de codones en moléculas de ácido nucleico para reflejar el uso de codones típico del organismo hospedante sin cambiar el polipéptido codificado por el ADN, para mejorar la expresión. Se han descrito previamente una plétora de métodos y herramientas informáticas para la optimización de codones. Véase, Narum D, et al., Infect. Immun.
2001; 69(12):7250-7253, Outchkourov N, et al., Protein Expr. Purif. 2002; 24(1):18-24, Feng L, et al., Biochemistry 2000; 39(50):15399-15409, y Humphreys D, et al., Protein Expr. Purif. 2000; 20(2):252-2.
El término “comprender” o “comprende”, como se usa en el presente documento, describe también “consistir en” según la práctica de patente generalmente aceptada.
La expresión “enfermedad asociada con una infección por VIH”, como se usa en el presente documento, incluye un estado en el que el sujeto ha desarrollado SIDA, pero también incluye un estado en el que el sujeto infectado con VIH no ha mostrado ningún signo o síntoma de la enfermedad. Por tanto, la vacuna de la invención cuando se administra a un sujeto que no tiene signos clínicos de la infección puede tener actividad preventiva, ya que puede prevenir el inicio de la enfermedad. Las composiciones inmunogénicas son capaces de prevenir o retrasar la infección y destrucción de células T CD4+ sanas en dicho sujeto. También se refiere a la prevención y retraso del inicio de los síntomas de la enfermedad de inmunodeficiencia adquirida tales como recuento de células T CD4+ extremadamente bajo e infecciones repetidas por patógenos oportunistas tales como Mycobacteria spp., Pneumocystis carinii, y Pneumocystis cryptococcus. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a un aumento en el recuento de células T CD4+ indiferenciadas absoluto (intervalo 10-3520), un aumento en el porcentaje de células T CD4+ frente a las células inmunitarias circulantes totales (intervalo 1-50 por ciento) y/o un aumento en el recuento de células T CD4+ como porcentaje del recuento de células T CD4+ normales en un sujeto sin infectar (intervalo 1-161 por ciento).
Los términos “variante” o “fragmento”, como se usan en el presente documento, se refieren a un polipéptido derivado de cualquiera de las SEQ ID NO 1-16 por deleción de uno o más aminoácidos terminales en el extremo N o en el extremo C de una SEQ ID NO individual. Las variantes o fragmentos preferiblemente tienen una longitud de al menos 8 aminoácidos o de hasta 10%, hasta 20%, hasta 30%, hasta 40%, hasta 50%, hasta 60%, hasta 70%, hasta 80%, hasta 90% o hasta 99% de su respectiva SEQ ID NO.
El término “genoma del VIH” como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ARN de aproximadamente 8749 nucleótidos de longitud encerrado por la cápside de VIH y que codifica los genes gag, pol, env, tat, rev, vif, nef, vpr, vpu, vpx, y opcionalmente tev. La secuencia genómica del VIH subyace a una alta variabilidad, por esta razón, el genoma del VIH al que se hace referencia en la presente invención no está limitado a ninguna secuencia específica. Las secuencias preferidas son las de los tipos y subtipos de VIH citados en el presente documento.
La expresión “virus de la inmunodeficiencia humana” o “VIH”, como se usa en el presente documento, se refiere a virus de la inmunodeficiencia humana genéricamente e incluye VIH de tipo 1 (“VIH-1”), VIH de tipo 2 (“VIH-2”) u otros virus VIH, incluyendo, por ejemplo, el VIH-1, VIH-2, VIH emergente y otros subtipos de VIH y variantes de VIH, tales como variantes ampliamente dispersadas o geográficamente aisladas y virus de la inmunodeficiencia simia (“VIS”). Por ejemplo, se puede determinar una secuencia génica vírica ancestral para los genes env y gag de VIH-1, tal como los subtipos de VIH-1, A, B, C, D, E, F, G, H, J y K y recombinantes intersubtipo tales como AG, AGI y para grupos M, N, O, o para virus VIH-2 o subtipos de VIH-2 A o B. VIH-1, VIH-2 y VIS incluyen, pero no se limitan a partículas víricas extracelulares y las formas de los virus asociadas con sus células infectadas respectivas.
La “respuesta inmunitaria humoral”, como se usa en el presente documento, describe una respuesta inmunitaria contra antígeno(s) exógeno(s) que está mediada por anticuerpos producidos por células B.
La expresión “composición inmunogénica”, como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que induce una respuesta inmunitaria en un sujeto que produce anticuerpos o respuestas inmunitarias celulares contra un inmunógeno específico.
La expresión “polipéptido inmunógeno” o “inmunógeno”, como se usa en el presente documento, se refiere a un antígeno polipéptido que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria adaptativa (es decir, una respuesta inmunitaria humoral o celular) si se inyecta por sí mismo o con un adyuvante.
El término “kit”, como se usa en el presente documento, se refiere a una combinación de artículos que facilita un procedimiento, método o aplicación. Estos kits proporcionan los materiales necesarios para llevar a cabo la aplicación descrita en la presente invención.
La expresión “operativamente unido”, como se usa en el presente documento, significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a secuencia(s) reguladora(s) de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedante cuando el vector se introduce en la célula hospedante). Véase, Auer H, Nature Biotechnol. 2006; 24: 41-43.
La expresión “etiqueta peptídica” o “etiqueta”, como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido o secuencia de aminoácidos, que se puede usar en el aislamiento o purificación de dicho inmunógeno. Por tanto, dicha etiqueta es capaz de unirse a uno o más ligandos, por ejemplo, uno o más ligandos de una matriz de afinidad tal como un soporte de cromatografía o perla con alta afinidad. Ejemplo ilustrativos, no limitantes de etiquetas útiles para el aislamiento o purificación de una proteína incluyen la etiqueta Arg, la etiqueta FLAG, la etiqueta His o la etiqueta Strep; un epítopo capaz de ser reconocido por un anticuerpo, tal como una etiqueta c-myc (reconocida por un anticuerpo anti-c-myc), etiqueta SBP, etiqueta S, péptido de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa, dominio de unión a quitina, etiqueta de glutatión S-transferasa, proteína de unión a maltosa, NusA, TrxA, DsbA o etiqueta Avi; una secuencia de aminoácidos, tal como AHGHRP (SEQ ID NO: 53), PIHDHDHPHLVIHS (SEQ ID NO: 54), o GMTCXXC (SEQ ID NO: 55); o p-galactosidasa. Véase, Terpe K, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003; 60:523-525.
Las expresiones “soporte farmacéuticamente aceptable”, “diluyente farmacéuticamente aceptable”, “excipiente farmacéuticamente aceptable” o “vehículo farmacéuticamente aceptable”, usados de forma intercambiable en el presente documento, se refieren a una carga, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo convencional sólido, semisólido o líquido no tóxico. Un soporte farmacéuticamente aceptable es esencialmente no tóxico para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, el soporte para una formulación que contiene polipéptidos normalmente no incluiría agentes oxidantes y otros compuestos que se sabe son perjudiciales para los polipéptidos. Los soportes adecuados incluyen, pero no se limitan a agua, dextrosa, glicerol, solución salina, etanol y combinaciones de los mismos. El soporte puede contener agentes adicionales tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores del pH o adyuvantes que aumenten la eficacia de la formulación.
Los términos “prevenir” y “prevención”, como se usan en el presente documento, se refieren a inhibir el comienzo o disminuir la aparición de una enfermedad en un animal. La prevención puede ser completa (por ejemplo, la ausencia total de células patológicas en un sujeto). La prevención también puede ser parcial, de modo que por ejemplo la aparición de células patológicas en un sujeto sea menor de la que se hubiera producido sin la presente invención. Prevención también se refiere a susceptibilidad reducida a una afección clínica.
La expresión “péptido señal de secreción” se refiere a una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, preferiblemente de 15 a 60 aminoácidos de longitud) muy hidrofóbica de proteínas que deben cruzar a través de membranas para llegar a su localización celular de funcionamiento. Uniéndose a partículas de reconocimiento de señales, estas secuencias dirigen complejos proteína naciente-ribosoma a una membrana donde la proteína se inserta durante la traducción. Los péptidos señal dirigen la captación traduccional de la proteína por varias membranas (por ejemplo, retículo endoplásmico, mitocondria, cloroplasto, peroxisoma). Las secuencias señal líder en proteínas no de membrana son eliminadas finalmente por peptidasas específicas. Algunos péptidos señal usados incluyen quimioquina MCP-3, para fomentar la secreción y atracción de células presentadoras de antígeno; un péptido derivado de catenina (CATE) para degradación proteosómica aumentada; y la proteína lisosomal asociada, LAMP1 para dirigirse al compartimento de MHC II. Véase, Rosati M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009; 106:15831-15836.
La expresión “administración secuencial”, como se usa en el presente documento, significa que la administración no es simultánea, sino que se realiza una primera administración, seguida por una o más administraciones sucesivas.
La expresión “conserva sustancialmente las capacidades inmunológicas del polipéptido inmunógeno”, como se usa en el presente documento, significa que la variante muestra al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o 100% de la capacidad del polipéptido inmunógeno para inducir una respuesta inmunitaria adaptativa (es decir, una respuesta inmunitaria humoral o celular), si se inyecta por sí mismo o con adyuvantes.
El término “tratar” o “tratamiento”, como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de una composición inmunogénica de la invención o de un medicamento que la contiene para controlar la evolución de la enfermedad antes o después de que hayan aparecido signos clínicos. Se entiende que control de la evolución de la enfermedad significa los resultados clínicos beneficiosos o deseados que incluyen, pero no están limitados a, reducción de los síntomas, reducción de la duración de la enfermedad, estabilización de estados patológicos (específicamente para evitar deterioro adicional), retraso de la evolución de la enfermedad, mejora del estado patológico y remisión (tanto parcial como total). El control de la evolución de la enfermedad también implica una extensión de la supervivencia, comparada con la supervivencia esperada si no se aplicara el tratamiento.
El término “vacuna”, como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia o composición que establece o mejora la inmunidad hacia una enfermedad particular induciendo una respuesta inmunitaria adaptativa que incluye una memoria inmunológica. Una vacuna típicamente contiene un agente que se parece a un microorganismo causante de la enfermedad o a una parte del mismo (por ejemplo, un polipéptido). Las vacunas pueden ser profilácticas o terapéuticas.
El término “variante”, como se usa en el presente documento, se refiere a todas esas secuencias de aminoácidos derivadas de cualquiera de las SEQ ID NO 1-16 por medio de modificaciones o mutaciones, incluyendo sustituciones, preferiblemente sustituciones conservadoras, inserciones o deleciones no terminales, que afectan a uno o más aminoácidos y que sustancialmente conservan las capacidades inmunogénicas del polipéptido inmunógeno.
El término “vector”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico lineal o circular, que comprende un segmento según el ácido nucleico de interés, operativamente unido a segmentos adicionales que aseguran su replicación autónoma en una célula hospedante de interés o según el casete de expresión de interés.
2. Polipéptidos inmunógenos de la invención
En un primer aspecto, la invención se refiere a un polipéptido inmunógeno que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO 1-16, con la condición de que el péptido inmunógeno no comprenda ningún tramo de secuencia de aminoácidos derivado del genoma del VIH de una longitud de 8 o más aminoácidos diferente de una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NO 1-16, y en donde al menos dos de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO 1-16 están unidas por un enlazador de aminoácidos en el polipéptido inmunógeno.
En una descripción particular, el polipéptido inmunógeno del primer aspecto tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 49.
También se describe un polipéptido inmunógeno que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1-16 o variantes de las mismas o un fragmento de las mismas, en donde dicho fragmento tiene una longitud de al menos 8 aminoácidos, con la condición de que:
i) dicha secuencia de aminoácidos no comprenda ningún tramo de secuencia derivado del genoma del VIH de una longitud de 8 o más aminoácidos diferente de una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NOs 1-16 o una variante o un fragmento de las mismas, y
ii) cuando el inmunógeno comprende solo una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs 1-16, entonces esta secuencia no se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 5, 6 y 16.
Preferiblemente, la variante es equivalente a su secuencia relacionada y deriva de una cepa de VIH diferente o es una secuencia de VIH artificial. Equivalente a este respecto significa diferente en uno o más restos de aminoácidos, pero correspondiente a la misma secuencia (por ejemplo, determinada por la posición en el genoma o similitud de secuencia). En otras palabras, la variante es una “variante natural”, que se refiere a secuencias de ácido nucleico derivadas de un genoma de VIH de un virus circulante actualmente o en el pasado y que se puede identificar de bases de datos existentes (por ejemplo, bases de datos de secuencias GenBank y Los Alamos). Las secuencias de virus circulantes también se pueden determinar por metodologías de biología molecular. Véase, Brown T, “Gene Cloning” (Chapman & Hall, London, GB, 1995); Watson R, et al., “Recombinant DNA”, 2a Ed. (Scientific American Books, Nueva York, NY, EE UU, 1992); Sambrook J, et al., “Molecular Cloning. A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE UU, 1989). Preferiblemente, una variante de cualquiera de las SEQ ID NOs 1-16 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% con su correspondiente (es decir, SEQ ID NOs 1-16). Los ejemplos de algoritmos adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0. Véase, Altschul S, et al., Nuc. Acids Res. 1977; 25:3389-3402 y Altschul S, et al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410. Los programas BLAST y BLAST 2.0 se pueden usar para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los ácidos nucleicos y proteínas de la invención. El software para realizar análisis por BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional para Información Biotecnológica. Véase, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi, Enero 2012.
Las variantes también pueden contener uno o más restos de aminoácidos modificados (por ejemplo, restos que se modifican mediante la unión de grupos sustituyentes) o uno o más aminoácidos no naturales tales como beta aminoácidos.
Los métodos para determinar el grado de la respuesta celular se conocen en la técnica. Se puede usar cualquier método adecuado para evaluar la estimulación de células T en respuesta a un Ag. Los procedimientos descritos a continuación proporcionan unos pocos ejemplos de métodos adecuados:
1) Inmunospot unido a enzima (ELISpot): se transfieren células no adherentes de pocillos de precultivo a una placa, que se ha recubierto con los anticuerpos de captura anti-citoquina deseados (Ac; por ejemplo, anti-IFN, -IL-10, -IL-2, -IL-4). El revelado se lleva a cabo con Ac secundarios biotinilados y métodos de detección colorimétrica o fluorimétrica estándar tales como estreptavidina-fosfatasa alcalina y NBT-BCIP y se cuentan las manchas. Las lecturas del ELISpot se expresan luego como células formadoras de manchas (SFC)/106 células iniciales.
2) Ensayo de citoquina en líquido sobrenadante: se miden las citoquinas liberadas en el líquido sobrenadante del cultivo por diferentes técnicas, tales como enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), matriz de perlas citométrica BD, ensayo Bio-Plex de Biorad y otros.
3) Tetrámeros de HLA de clase I: con este procedimiento, se detectan células T reactivas a Ag que reconocen epítopos peptídicos específicos, usando reactivos comercialmente disponibles (por ejemplo, dexámeros de MHC de clase I, Immudex, Copenhague, DK) o generados internamente (por ejemplo, Novak E, et al., J. Clin. Invest. 1999; 104:R63-R67).
4) Tetrámeros de HLA de clase II: con este procedimiento, se detectan células T reactivas a Ag que reconocen epítopos peptídicos específicos, usando reactivos comercialmente disponibles (por ejemplo, Ultimers™ de MHC de clase II, ProImmune Ltd, Oxford, GB) o generados internamente (por ejemplo, Novak, 1991, véase antes).
5) Regulación por aumento de marcadores de activación (por ejemplo, CD69, CD25, CD137): con este procedimiento, se detectan respuestas de células T específicas de Ag por su expresión diferencial de marcadores de activación expuestos en la membrana después de reconocimiento del Ag.
6) Ensayos de captura de citoquinas: este sistema es una alternativa válida al ELISpot para visualizar células T específicas de Ag según sus respuestas a citoquinas (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, DE). Además, permite la separación y clonación directa de células T de interés.
7) Ensayo de CD154: este procedimiento está limitado a la detección de células T CD4+ específicas de Ag. Véase, Chattopadhyay P, et al., Nat. Med. 2005; 11:1113-11117 y Frentsch M, et al., Nat. Med. 2005; 11:1118-1124.
8) Ensayo de CD107: este procedimiento permite la visualización de células T CD8+ específicas de Ag con potencial citotóxico. Véase, Betts M, et al., J. Immunol. Methods 2003; 281:65-78.
9) Ensayo de dilución de CFSE: este procedimiento detecta células T (CD4+ y CD8+) específicas de Ag según su proliferación después del reconocimiento de Ag. Véase, Mannering S, et al., J. Immunol. Methods 2003; 283:173-183.
Los métodos para determinar el nivel de la respuesta humoral de una variante se conocen en la técnica. Se puede usar cualquier método adecuado para evaluar la estimulación de células T en respuesta a un Ag. Los ejemplos de métodos adecuados incluyen, pero no se limitan a detectar o cuantificar la cantidad relativa de un anticuerpo, que reconoce específicamente un agente antigénico o inmunogénico en el suero de un sujeto que se ha tratado con un polipéptido inmunógeno o variante en relación con la cantidad del anticuerpo en un sujeto sin tratar. Se pueden determinar los títulos de los anticuerpos usando ensayos estándar tales como enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), ensayo de inmunodifusión radial simple (SRID) o inmunoensayo enzimático (ETA).
En una descripción, la variante de cualquiera de las SEQ ID NOs 1-16 es un fragmento de dicha(s) secuencia(s).
En realizaciones específicas, se determinan secuencias víricas ancestrales para los genes env de los subtipos B o C del VIH-1, o para los genes gag de los subtipos B o C. En otras realizaciones, se determina la secuencia del virus ancestral para otros genes o polipéptidos del VIH, tales como pol o los genes o polipéptidos auxiliares. En otra realización más, se determina la secuencia vírica por consenso o técnicas de centro del árbol.
En una de realización preferida, el VIH es un VIH del grupo M. El grupo M es el grupo del VIH-1 circulante predominante. Se ha dividido en subtipos, indicados con letras, y sub-subtipos, indicados con cifras. Los subtipos A1, A2, A3, A4, B, C, D, E, F1, F2, G, H, J y K se reconocen actualmente. Los subtipos del VIH-1, también llamados clados, son cepas filogenéticamente unidas del VIH-1 que están aproximadamente a la misma distancia genética entre sí; en algunos casos, los subtipos también están unidos geográfica o epidemiológicamente. La variación genética en un subtipo puede ser de 15 a 20 por ciento o más, mientras que la variación entre subtipos o miembros divergentes del mismo subtipo habitualmente es de 25 a 35 por ciento. Los avances en la secuenciación del genoma completo del VIH han llevado a la identificación de formas circulantes recombinantes y únicas (CFR y UFR, respectivamente). Estas son el resultado de recombinación entre subtipos en una persona doblemente infectada, de la que las formas recombinantes pasan después a otras personas. La progenie recombinante se clasifica como formas recombinantes circulantes si se identifican en tres o más personas sin conexión epidemiológica directa; de otra forma se describen como formas recombinantes únicas.
En una realización de la descripción, dicho inmunógeno tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs 1-16 o variantes de las mismas, en donde dicha condición ii) es: cuando el inmunógeno comprende solo una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs 1-16, entonces esta secuencia no se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs 1-16.
También se describe que dicho inmunógeno comprende al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs 1-16 o variantes de las mismas, en donde dicha condición ii) es: cuando el inmunógeno comprende solo dos, tres o cuatro secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs 1-16, entonces no todas de estas secuencias se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 5, 6 y 16. En otra descripción, dicho inmunógeno tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos diez secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs 1-16 o variantes de las mismas, en donde dicha condición ii) es: cuando el inmunógeno comprende solo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs 1-16, entonces no todas de estas secuencias se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NOs 1-16.
También se describe un inmunógeno según el primer aspecto que comprende las secuencias según las SEQ ID NOs 1-16 o variantes de las mismas, en el orden 1-16.
En una realización, la invención se refiere al inmunógeno del primer aspecto, en donde al menos dos secuencias se unen por un enlazador aminoacídico.
También se describe un inmunógeno como se describe en el presente documento, en donde, si dicho inmunógeno comprende al menos dos secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO 1­ 16 o variantes de las mismas, dichas secuencias están unidas por un enlazador de aminoácidos.
En una realización preferida del inmunógeno del primer aspecto, el enlazador tiene la secuencia de aminoácidos A, AA o AAA. En otra realización, cuando el resto C-terminal de la secuencia localizada N-terminalmente con respecto al enlazador o el resto N-terminal de la secuencia localizada C-terminalmente es un resto de alanina, el enlazador se pude acortar de modo que se forme una secuencia AAA en la región de unión entre secuencias contiguas. Por tanto, en una realización preferida, si el resto C-terminal de la secuencia localizada N-terminalmente con respecto al enlazador es una alanina o si el resto N-terminal de la secuencia localizada C-terminalmente con respecto al enlazador es alanina, el enlazador tiene la secuencia AA. En otra forma de realización, si el resto C-terminal de la secuencia localizada N-terminalmente con respecto al enlazador y el resto N-terminal de la secuencia localizada C-terminalmente con respecto al enlazador son ambos alanina, entonces el enlazador tiene la secuencia A.
En otra realización, dicho inmunógeno comprende además un péptido señal de secreción en el extremo N, en donde dicho péptido señal preferiblemente aumenta la secreción del inmunógeno de las células que expresan dicho inmunógeno. Un péptido señal de secreción preferido deriva del GMCSF (factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos), preferiblemente seguido por una valina para aumentar la estabilidad. La secuencia del péptido señal del GMCSF es preferiblemente MWLQSLLLLGTVACSIS (SEQ ID NO: 46) o MWLQSLLLLGTVACSISV (SEQ ID NO: 47).
En otra realización, dicho inmunógeno comprende además opcionalmente una etiqueta peptídica. La etiqueta peptídica puede estar localizada en el extremo N entre el péptido señal y el polipéptido inmunógeno o, preferiblemente, puede estar localizada en el extremo C antes del codón de terminación.
Preferiblemente, dicha etiqueta es un péptido FLAG. El sistema FLAG utiliza un péptido corto, hidrofílico de 8 aminoácidos, que se fusiona a la proteína recombinante de interés. El péptido FLAG incluye el sitio de unión para varios anticuerpos monoclonales ANTI-FLAG muy específicos (M1, M2, M5; Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, EE. UU.), que se pueden usar para evaluar la expresión de la proteína de interés en material de células transfectadas. Debido al pequeño tamaño de la etiqueta peptídica FLAG, no cubre otros epítopos, dominios, o altera la función, secreción o transporte de la proteína de fusión en general. Preferiblemente, dicho péptido FLAG tiene la secuencia DYKDDDDKL (SEQ ID NO: 48).
En una realización preferida, dicha etiqueta es solo para el análisis de expresión y purificación del inmunógeno y se elimina antes de usarlo para provocar una respuesta inmunitaria.
También se describen inmunógenos, en donde dicha secuencia de aminoácidos comprende al menos un sitio de mutación de resistencia antirretroviral.
La mutación se puede producir en cualquier sitio del genoma vírico. Preferiblemente, la mutación se produce en la región que codifica los genes de la integrasa, la proteasa o la transcriptasa inversa.
Los mutantes en la integrasa que confieren resistencia a inhibidores de integrasa incluyen, sin limitación, T66, E92, F121, E138, G140, Y143, S147, Q148, S153, N155, E157 y R263 en la SEQ ID NO: 1 y una combinación de las mismas. En una realización preferida, la mutación se selecciona del grupo que consiste en las mutaciones E92Q, G140S, G140A y Y143R en la proteína integrasa y sus combinaciones.
Los mutantes en la proteasa asociada con resistencia al inhibidor de proteasa (IP) incluyen mutaciones en la proteasa principal, proteasa auxiliar y en el sitio de corte de proteasas. Véase, Shafer R, et al., AIDS Rev. 2008; 10(2):67-84. Diecisiete posiciones en gran parte no polimórficas son de la mayor significancia clínica, incluyendo L231, L241, D30N, V321, L33F, M461/L, 147/V/A, G48V/M, 150L/V, F53L, 154V/T/A/L/M, G73S/T, L76V, V82A/T/F/S, 184V/A/C, N88D/S, L90M. Las mutaciones en la proteasa auxiliar incluyen las mutaciones polimórficas L101/V, 113V, K20R/M/I, M36I, D60E, I62V, L63P, A71V/T, V77I y 193L y las mutaciones no polimórficas L10F/R, V111, E34Q, E35G, K43T, K45I, K55R, Q58E, A71I/L, T74P/A/S, V751, N83D, P79A/S, 185V, L89V, T91S, Q92K y C95F.
En otra realización, el sitio de mutación de resistencia antirretroviral está localizado en la transcriptasa inversa, que produce una resistencia a inhibidores de la transcriptasa inversa nucleosídicos (NRTI) o inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleosídicos (NNRTI). Las mutaciones de resistencia a NRTI incluyen M184V, mutaciones de análogos de timidina (TAM), mutaciones seleccionadas por pautas que carecen de análogos de timidina (No-TAM), y mutaciones de resistencia multinucleosídica (mutaciones multi-NRTI) y muchas mutaciones auxiliares no polimórficas recientemente descritas. En conjunto, M184V, mutaciones asociadas a no análogos de timidina tales como K65R y L74V, y la mutación de resistencia multinucleosídica Q151M actúan disminuyendo la incorporación de NRTI. Las mutaciones de análogos de timidina, las inserciones en T69 asociadas con resistencia multinucleosídica y muchas de las mutaciones accesorias facilitan el desbloqueo del cebador. Véase, Shafer, 2008, anteriormente. M184V es la mutación de resistencia NRTI que se produce más comúnmente. Las mutaciones de aminoácidos resistentes a fármacos más comunes son M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F y K219QE. Las mutaciones más comunes en pacientes que desarrollan insuficiencia virológica mientras reciben un esqueleto NRTI que contiene no análogos de timidina (No-TAM) incluyen M184V sola o M184V en combinación con K65R o L74V. Otras mutaciones no-TAM incluyen K65N, K70E/G, L741, V75T/M, Y115F. Las inserciones de aminoácidos en el codón 69 en general se producen en presencia de múltiples TAM, y en este marco se asocian con resistencia intermedia a 3TC y FTC y resistencia de alto nivel a cada uno de los NRTI restantes. Q151M es una mutación de 2 pb (CAGfwdarwATG) que habitualmente está acompañada de dos o más de las siguientes mutaciones: A62V, V751, F77L y F116Y. El complejo Q151M causa resistencia de alto nivel a ZDV, d4T, ddIy ABC, y resistencia intermedia a TDF, 3TC y FTC. Véase, Shafer R, et al., AIDS Rev. 2008; 10(2):67-84.
Las mutaciones de resistencia a NNTRI incluyen, sin limitación, las mutaciones primarias de resistencia a NNTRI (K103N/S, V106A/M, Y181C/I/V, Y188L/C/H y G190A/S/E), las mutaciones secundarias de resistencia a NNRTI (L1001, K101P, P225H, F227L, M230L y K238T) y mutaciones raras (V179F, F227C y L2341).
Las mutaciones no polimórficas menores --A98G, K101 E, V 1081 y V 179D/E son mutaciones de resistencia a NNRTI comunes que reducen la susceptibilidad a nevirapina y efavirenz aproximadamente de 2 veces a 5 veces.
Las mutaciones de resistencia a inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleosídicos mezcla, tales como K101Q, 1135T/M, V1791 y L2831, reducen la susceptibilidad a nevirapina y efavirenz en aproximadamente dos veces y pueden actuar sinérgicamente con mutaciones de resistencia a NNRTI primarias. Otras mutaciones como L74V, H221Y, K223E/Q, L228H/R y N3481 son seleccionadas principalmente por NRTI, aunque también producen reducciones sutiles en susceptibilidad a NNRTI.
Preferiblemente, dicho sitio de mutación de resistencia antirretroviral está localizado en cualquiera de las SEQ ID NOs 9-11. Más preferiblemente, dicho sitio de mutación de resistencia antirretroviral es el resto de aminoácido 8 de la SEQ ID NO: 9. en donde el aminoácido Leu se sustituye por el aminoácido Met.
En otra descripción, la variante o fragmento tiene una longitud de 8 a 40 aminoácidos, más preferiblemente una longitud de 11 a 27 aminoácidos. Preferiblemente, dicha variante o fragmento no comprende un enlazador de aminoácidos que se una a cualquiera de las SEQ ID NOs 1-16. Además, se prefiere que el aminoácido C-terminal de dicha variante o fragmento no sea G, P, E, D, Q, N, T, S ni C, ya que estos restos no forman un anclaje C-terminal para epítopos de células T restringidos por HLA de clase I en general.
En una descripción, dicha variante o fragmento se selecciona del grupo que consiste en los péptidos según las SEQ ID NOs 17-45.
Además, se prevé que dicha variante o fragmento se combine con o fusione a una proteína de choque térmico. El presente documento también se refiere a una proteína de fusión que comprende dicha variante o fragmento y una proteína de choque térmico. Las proteínas de choque térmico preferidas son Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96 o Hsp100.
En otra descripción, la variante o fragmento es una variante o fragmento según el primer y segundo aspectos. Preferiblemente, dicha variante o fragmento no comprende un enlazador aminoacídico que une cualquiera de las SEQ ID NOs 1-16. Además, se prefiere que el aminoácido C-terminal de dicha variante o fragmento no sea G, P, E, D, Q, N, T, S ni C, ya que estos restos no forman un anclaje C-terminal para epítopos de células T restringidos por HLA de clase I en general.
En una descripción, dicha variante o fragmento se selecciona del grupo que consiste en los péptidos según las SEQ ID NOs 17-45.
Además, se prevé que dicha variante o fragmento se combine con o fusione a una proteína de choque térmico. El presente documento también se refiere a una proteína de fusión que comprende dicha variante o fragmento y una proteína de choque térmico. Las proteínas de choque térmico preferidas son Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96 o Hsp100.
3. Ácidos nucleicos, vectores, virus y células de la invención
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido inmunógeno del primer aspecto, y a un virus y una célula que comprenden dicho polinucleótido.
Preferiblemente, dicho ácido nucleico es un polinucleótido, refiriéndose a polímeros monocatenarios o bicatenarios de monómeros nucleotídicos (ácidos nucleicos), incluyendo, pero no limitado a, 2'-desoxirribonucleótidos (ADN) y ribonucleótidos (ARN) unidos por enlaces fosfodiéster internucleótidos. El polinucleótido de la invención codifica el inmunógeno de la invención sin comprender sustancialmente regiones adicionales del genoma del VIH.
En una realización, dicho ácido nucleico tiene codones optimizados. En una realización preferida, el ácido nucleico tiene codones optimizados para la expresión en seres humanos. Se pueden preparar ácidos nucleicos con codones optimizados para su uso según la presente invención cambiando los codones del ácido nucleico que codifica el inmunógeno por codones “humanizados” (es decir, los codones son los que aparecen frecuentemente en genes muy expresados en seres humanos). Véase, Andre S, et al., J. Virol. 1998; 72:1497-1503. En una realización preferida, dicho ácido nucleico con codones optimizados tiene la secuencia según la SEQ ID NO: 50.
El ácido nucleico puede requerir cortar con enzimas de restricción para ligarlo a un vector. Este procedimiento podría suponer la eliminación de varios nucleótidos terminales (por ejemplo, 1, 2 o 3). Así pues, en una realización, la invención se refiere a dicho ácido nucleico, en donde se ha cortado en cada extremo con una enzima de restricción.
En otra descripción, el presente documento se refiere a un casete de expresión que comprende el ácido nucleico del segundo aspecto, una secuencia promotora y una 3'-UTR y opcionalmente un marcador de selección. Preferiblemente, la secuencia promotora es un promotor de citomegalovirus (CMV) humano o una secuencia promotora temprana-tardía p7.5. Preferiblemente, la 3'-UTR es un poli-A de la hormona de crecimiento bovina (BGH). El marcador de selección opcional es un gen de resistencia a antibiótico (por ejemplo, kanamicina, ampicilina, tetraciclina, espectinomicina), preferiblemente.
En otra descripción más, el presente documento se refiere a un vector de expresión que comprende el ácido nucleico o el casete de expresión del tercer aspecto.
En una descripción, el vector es un vector de expresión. Por tanto, los vectores adecuados según la presente invención incluyen vectores procariotas, tales como plásmidos pUC18, pUC19 y pBluescript y derivados de los mismos, como los plásmidos mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCRl y RP4; fagos y vectores lanzadera, tales como los vectores pSA3 y pAT28; vectores de expresión en levaduras, tales como vectores de tipo plásmido de 2-micrómetros; plásmidos de integración; vectores YEP; plásmidos centroméricos y análogos; vectores de expresión en células de insecto, tal como los vectores de la serie pAC y de la serie pVL; vectores de expresión en plantas, tales como los vectores de las series pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y análogos; y vectores de expresión en células eucariotas superiores basados en vectores víricos (por ejemplo, MVA, adenovirus, virus asociados a adenovirus, retrovirus y lentivirus) así como vectores no víricos, tales como los vectores pSilencer 4.1-CMV (Ambion®, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, EE. UU.), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, pZeoSV2, pCI, pSVL y pKSV-10, pBPV-1, pML2d y pTDT1.
En una descripción particular, el vector de expresión es un vector de expresión de mamífero que comprende un promotor y un sitio de poliadenilación de mamífero. Preferiblemente, el promotor es el promotor del citomegalovirus (CMV) humano. Preferiblemente, el sitio de poliadenilación es el sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH). El vector de expresión de mamífero se puede modificar para optimizar la replicación del vector en bacterias. El vector de expresión de mamífero puede comprender además un gen de selección, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a un antibiótico. En una descripción particular, el vector de expresión de mamífero comprende un gen de resistencia a kanamicina.
En otra descripción particular, el vector de expresión es un vector vírico, preferiblemente el vector del virus vaccinia Ankara modificado (MVA).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un virus que comprende el polinucleótido del segundo aspecto. Los virus adecuados son seguros, tienen baja toxicidad y son genéticamente estables. Los ejemplos no limitantes son retrovirus, particularmente poxvirus tales como MVA, lentivirus, adenovirus y virus adenoasociados (AAV).
En una realización preferida particular adicional, la presente invención se refiere a un virus vaccinia Ankara modificado (MVA) recombinante que comprende un polinucleótido o construcción génica que codifica los polipéptidos inmunógenos de la invención. El virus vaccinia Ankara modificado (MVA) es un virus relacionado con el virus vaccinia, un miembro del género ortopoxvirus en la familia poxviridae. MVA se ha generado por 516 pases en serie en fibroblastos embrionarios de pollo de la cepa de Ankara del virus vaccinia (CVA). Véase, Mayr A, et al., Infection 1975; 3:6-14 y Sutter G, et al., US 6.440.422 y CH 568.392. Los virus MVA están públicamente disponibles (por ejemplo, número de acceso de ATCC VR-1508). MVA se distingue por su atenuación (por ejemplo, virulencia disminuida y capacidad limitada para reproducir viriones infecciosos en ciertas células de mamífero), mientras que mantiene buena inmunogenicidad y capacidad total de replicarse y producir viriones infecciosos en células aviares. Las cepas de MVA adecuadas incluyen cepas con seguridad aumentada debido a i) la capacidad de replicación reproductora in vitro en fibroblastos embrionarios de pollo (CFE), pero sin capacidad de replicación reproductora en una línea celular humana, como en la línea celular de queratinocitos humanos HaCaT, la línea de células de riñón embrionario humano 293, la línea celular de osteosarcoma humano 143B y la línea celular de adenocarcinoma cervical humano HeLa; ii) ausencia de replicación en un modelo de ratón que es incapaz de producir células B y T maduras y como tal está gravemente inmunocomprometido y es muy susceptible a virus replicantes; y iii) inducción de al menos el mismo nivel de respuesta inmunitaria específica en pautas de sensibilización con virus vaccinia/refuerzo con virus vaccinia cuando se compara con pautas de sensibilización con ADN/refuerzo con virus vaccinia. Una cepa de MVA atenuada adecuada es la cepa denominada MVA-BN. Véase, Chaplin P, et al., WO2002042480, número de acceso de ECACC V00083008.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula que comprende el ácido nucleico o el virus del segundo aspecto. Las células que se van a usar pueden ser de cualquier tipo celular, incluyendo tanto células eucariotas como células procariotas. Preferiblemente, las células incluyen células procariotas, células de levadura o células de mamífero. Los ejemplos preferidos de células de mamífero son células COS, células HeLa, células HEK 293T o células aisladas de un paciente (por ejemplo, un paciente con VIH).
4. Composiciones de la invención
En una descripción, el presente documento se refiere a una composición que comprende una variante o fragmento según el primer aspecto y una proteína de choque térmico. Las composiciones inmunogénicas se pueden preparar, por ejemplo, como inyectables tal como soluciones, suspensiones y emulsiones líquidas. Las proteínas de choque térmico preferidas son Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96 o Hsp100.
Además, el presente documento se refiere a una composición farmacéutica que comprende un inmunógeno, ácido nucleico, casete de expresión, vector o célula según la invención o una composición según el cuarto aspecto y soporte farmacéuticamente aceptable. En una descripción, dichas composiciones farmacéuticas y la composición del cuarto aspecto se pueden usar como una vacuna, como se explica posteriormente.
5. Vacuna de la invención
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una vacuna que comprende el polipéptido inmunógeno del primer aspecto.
En una realización preferida, dicha vacuna es capaz de generar respuestas celulares y humorales. Más preferiblemente, la vacuna genera una respuesta de células T citotóxicas. Se puede usar un ensayo de células T citotóxicas o linfocitos T citotóxicos (LCT) para seguir la respuesta inmunitaria celular que sigue a la inmunización subgenómica con una secuencia vírica contra cepas de VIH homólogas y heterólogas. Véase, Burke S, et al., J. Inf. Dis. 1994; 170:1110-1119 y Tigges M, et al., J. Immunol, 1996; 156:3901-3910. Los ensayos convencionales utilizados para detectar respuestas de células T incluyen, por ejemplo, ensayos de proliferación, ensayos de secreción de linfoquinas, ensayos de citotoxicidad directa y ensayos de dilución limitante. Por ejemplo, se puede evaluar la capacidad de células presentadoras de antígeno que se han incubado con un péptido, para inducir respuestas de LTC en poblaciones de células que responden. Las células presentadoras de antígeno pueden ser células tales como células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o células dendríticas (CD). De forma alternativa, se pueden usar líneas celulares de mamífero no humanas mutantes que son deficientes en su capacidad para cargar moléculas de MHC de clase I con péptidos procesados internamente y que se han transfectado con el gen de MHC de clase I humano apropiado, para probar la capacidad de un péptido de interés para inducir in vitro respuestas de LTC primarias. Las PBMC se pueden usar como la fuente de células que responden de precursores de LTC. Las células presentadoras de antígeno apropiadas se incuban con el péptido después de lo cual las células presentadoras de antígeno cargadas con proteína se incuban con la población de células que responden en condiciones de cultivo optimizadas. La activación de LTC positivos se puede determinar evaluando en el cultivo la presencia de LTC que matan células diana radiomarcadas, tanto dianas pulsadas con péptidos específicos como células dianas que expresan formas procesadas endógenamente del antígeno del que deriva la secuencia del péptido. Por ejemplo, las células diana se pueden radiomarcar con 51Cr y se puede calcular la actividad citotóxica a partir de la radioactividad liberada de las células diana. Otro método adecuado permite la cuantificación directa de células T específicas de antígeno tiñendo con complejos tetraméricos de HLA marcados con fluoresceína. Véase, Altman J, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:10330-10334 y Altman J, et al., Science 1996; 274:94-96. Otros desarrollos técnicos relativamente recientes incluyen tinción para linfoquinas intracelulares y ensayos de liberación de interferón o ensayos ELISpot.
En una realización, la vacuna del tercer aspecto comprende además uno o más adyuvantes o proteínas de choque térmico.
Los adyuvantes se han definido anteriormente. Las proteínas de choque térmico preferidas son Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96 o Hsp100.
6. Métodos terapéuticos
En una descripción, el polipéptido inmunógeno según la invención, el ácido nucleico de la invención, el casete de expresión de la invención, el vector de expresión de la invención, el virus de la invención, la célula de la invención o la vacuna según la invención se pueden usar en la prevención o tratamiento de una infección por VIH o una enfermedad asociada a una infección por VIH.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere al polipéptido inmunógeno según la invención, el polinucleótido de la invención, el virus de la invención, la célula de la invención o la vacuna según la invención para usar en la prevención o tratamiento de un infección por VIH.
En otra descripción, el presente documento se refiere al uso del polipéptido inmunógeno según la invención, el ácido nucleico de la invención, el casete de expresión de la invención, el vector de expresión de la invención, el virus de la invención, la célula de la invención o la vacuna según la invención para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una infección por el VIH o una enfermedad asociada con una infección por el VIH.
En otra descripción, el presente documento se refiere a un método para la prevención o tratamiento de una infección por el VIH o una enfermedad asociada con un VIH en un sujeto que lo necesite, que comprende la administración a dicho sujeto del polipéptido inmunógeno según la invención, el ácido nucleico de la invención, el casete de expresión de la invención, el vector de expresión de la invención, el virus de la invención, la célula de la invención o la vacuna según la invención para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de un infección por el VIH o una enfermedad asociada a una infección por el VIH.
En una realización particular, el polipéptido inmunógeno, , el virus, la célula o la vacuna para su uso según la invención, comprende la administración secuencial de:
i) un primer polipéptido inmunógeno virus, célula o vacuna de la invención
ii) un segundo polipéptido inmunógeno, virus, célula o vacuna de la invención.
En una realización particular, el primer polipéptido inmunógeno, virus, célula o vacuna son diferentes del segundo polipéptido inmunógeno, virus, célula o vacuna.
El efecto profiláctico o terapéutico beneficioso de la vacuna respecto a la infección por VIH o síntomas de SIDA incluye, por ejemplo, prevenir o retrasar la infección inicial de un individuo expuesto al VIH; reducir la carga vírica en un individuo infectado con el VIH; prolongar la fase asintomática de la infección por el VIH; mantener cargas víricas bajas en pacientes infectados con el VIH cuyos niveles de virus han disminuido mediante terapia antirretroviral (ART); aumentar los niveles de células T CD4 o mitigar la disminución en células T CD4, tanto específicas como no específicas de VIH-1, en pacientes sin tratamiento farmacológico previo y en pacientes tratados con ART, aumentar la amplitud, magnitud, avidez y funcionalidad de LTC específicos del VIH, aumentar la salud global o calidad de vida en un individuo con SIDA; y prolongar la esperanza de vida de un individuo con SIDA. Un médico puede comparar el efecto de la inmunización con el estado del paciente antes del tratamiento, o con el estado esperado de un paciente sin tratar, para determinar si el tratamiento es eficaz en la inhibición del SIDA.
Preferiblemente, dicha enfermedad es SIDA, ARC o una enfermedad oportunista del VIH. Ejemplos no limitantes de enfermedades oportunistas del VIH son linfoma de Burkitt, candidiasis en los bronquios, tráquea, pulmones o esófago, cáncer de cuello uterino, coccidioidomicosis (diseminada o fuera de los pulmones), criptococosis (fuera de los pulmones), criptosporidiosis (en los intestinos que duran más de 1 mes), infección por citomegalovirus (fuera del hígado, bazo o ganglios linfáticos), retinitis por citomegalovirus (con pérdida de visión), encefalopatía por VIH, lesiones por herpes simple que duran más de un mes, herpes simple en los bronquios, pulmones o esófago, histoplasmosis (diseminada o fuera de los pulmones), linfoma inmunoblástico, carcinoma (cáncer) de cuello uterino invasivo, isosporiasis en los intestinos que dura más de un mes, sarcoma de Kaposi, linfoma (primario en el cerebro), complejo Mycobacterium avium (diseminado o fuera de los pulmones), Mycobacterium kansasii (diseminado o fuera de los pulmones), Mycobacterium tuberculosis (diseminado o fuera de los pulmones), neumonía por Pneumocystis carinii, neumonía (recurrente en un periodo de 12 meses), leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML), septicemia por salmonella (recurrente), toxoplasmosis (en el cerebro), síndrome consuntivo y cualquier otra enfermedad resultante de una infección facilitada por un sistema inmunitario comprometido en un paciente infectado por el VIH.
La vacuna de la invención puede ser útil para la terapia de la infección por el VIH-1. Aunque todos los animales que puedan estar afectados con el VIH-1 o sus equivalentes se pueden tratar de esta manera (por ejemplo, chimpancés, macacos, babuinos o seres humanos), las composiciones inmunogénicas de la invención se dirigen particularmente a sus usos terapéuticos en seres humanos. Con frecuencia, se puede requerir más de una administración para producir el efecto terapéutico deseado; el protocolo exacto (dosis y frecuencia) se puede establecer por procedimientos clínicos estándar.
La presente invención se refiere además a prevenir o reducir síntomas asociados con la infección por el VIH. Estos incluyen síntomas asociados con la fase sintomática secundaria de la infección por el VIH, incluyendo, por ejemplo, culebrilla, erupción cutánea e infección de la uñas, llagas en la boca, infección recurrente en nariz y garganta y pérdida de peso. Además, síntomas adicionales asociados con la fase sintomática principal de la infección por el VIH incluyen, por ejemplo, candidiasis oral y vaginal, diarrea persistente, pérdida de peso, tos persistente y tuberculosis reactivada o infecciones de herpes recurrentes, tales como calenturas (herpes simple). Otros síntomas del SIDA completo que se pueden tratar según la presente invención incluyen, por ejemplo, diarrea, náuseas y vómitos, candidiasis y llagas bucales, infecciones vaginales persistentes, recurrentes y cáncer de cuello uterino, linfoadenopatía generalizada persistente (PGL), infecciones graves de la piel, verrugas y tiña, infecciones respiratorias, neumonía, especialmente neumonía por Pneumocystis carinii (PCP), herpes zoster (o culebrilla), problemas del sistema nervioso, tales como dolores, entumecimiento u hormigueo en manos y pies, anomalías neurológicas, sarcoma de Kaposi, linfoma, tuberculosis u otras infecciones oportunistas similares.
Los efectos beneficiosos de la invención incluyen, por ejemplo, prevenir o retrasar la infección inicial de un individuo expuesto al VIH; reducir la carga vírica en un individuo infectado con el VIH; prolongar la fase asintomática de la infección por el VIH; mantener cargas víricas bajas en pacientes infectados con el VIH cuyos niveles de virus han disminuido mediante terapia antirretroviral (ART); aumentar los niveles de células T CD4 o mitigar la disminución en células T CD4, tanto específicas como no específicas del VIH-1, en pacientes sin tratamiento farmacológico previo y en pacientes tratados con ART, aumentar la amplitud, magnitud, avidez y funcionalidad de los LTC específicos del VIH, aumentar la salud global o calidad de vida en un individuo con SIDA; y prolongar la esperanza de vida de un individuo con SIDA. Un médico puede comparar el efecto de la inmunización con el estado del paciente antes del tratamiento, o con el estado esperado de un paciente sin tratar, para determinar si el tratamiento es eficaz en la inhibición del SIDA.
Las composiciones inmunogénicas se pueden diseñar para introducir los ácidos nucleicos o vectores de expresión en un sitio de acción deseado y liberarlo a una velocidad apropiada y controlable. Los métodos para preparar formulaciones de liberación controlada se conocen en la técnica. Por ejemplo, se pueden producir preparaciones de liberación controlada mediante el uso de polímeros para acomplejar o absorber el inmunógeno o composición inmunogénica. Se puede preparar una formulación de liberación controlada usando macromoléculas apropiadas (por ejemplo, poliésteres, poliaminoácidos, polivinilo, pirrolidona, acetato de etilenvinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o sulfato de protamina), que se sabe que proporcionan las característica deseadas de liberación controlada o perfil de liberación. Otro método posible para controlar la duración de la acción por una preparación de liberación controlada es incorporar los ingredientes activos en partículas de un material polimérico (por ejemplo, poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), copolímeros de estos ácidos, o copolímeros de etileno y acetato de vinilo). De forma alternativa, en lugar de incorporar estos ingredientes activos en partículas poliméricas, es posible atrapar estos materiales en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, nanocápsulas) o en macroemulsiones. Véase en Voller A, et al., Eds., “New Trends and Developments in Vaccines (University Park Press, Baltimore, MD, EE. UU., 1978) y Gennaro A, Ed., “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 18a Ed. (Mack Publishing Co., Easton, PA, EE. UU., 1990).
Las dosis adecuadas de los ácidos nucleicos y vectores de expresión (colectivamente, los inmunógenos) en la composición inmunogénica las pueden determinar fácilmente los expertos en la materia. Por ejemplo, la dosis de los inmunógenos puede variar dependiendo de la vía de administración y el tamaño del sujeto. Los expertos en la materia pueden determinar las dosis adecuadas, por ejemplo, midiendo la respuesta inmunitaria de un sujeto, tal como un animal de laboratorio, usando técnicas inmunológicas convencionales, y ajustando la dosis según sea apropiado. Tales técnicas para medir la respuesta inmunitaria del sujeto incluyen, pero no se limitan a, ensayos de liberación de cromo, ensayos de unión de tetrámeros, ensayos ELISPOT de IFN, ensayos ELISPOT de IL-2, ensayos de citoquinas intracelulares y otros ensayos de detección inmunológica. Véase, Harlow E, Lane D, “Antibodies: A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU., 1988).
Las composiciones inmunogénicas se pueden administrar usando cualquier método de administración adecuado incluyendo, pero no limitado a, administración intramuscular, intravenosa, intradérmica, transcutánea, intranasal, mucosa (por ejemplo, intrarrectal, intravaginal, oral) y tópica. Tales métodos se conocen bien en la técnica. Ejemplos más específicos de métodos de administración son inyección intramuscular, inyección intradérmica e inyección subcutánea. Sin embargo, la administración no necesita limitarse a métodos de inyección. Además, la administración de ADN a tejido animal se ha logrado por inyección directa de liposomas catiónicos de ADN desnudo en tejido muscular animal o inyección intradérmica de ADN usando tecnología de “cañones de genes” o electroporación. Véase, Watanabe M, et al., Mol. Reprod. Dev.
1994; 38:268-274, Charnock-Jones D, et al., publicación internacional WO1996020013, Robinson H, et al., Vaccine 1993: 11:957-960, Hoffman S, et al., Vaccine 1994; 12(16):1529-1533; Xiang Z, et al., Virology 1994; 199:132-140, Webster R, et al., Vaccine 1994; 12:1495-1498, Davis H, et al., Vaccine 1994; 12: 1503-1509, Davis H, et al., Hum. Mol. Gen. 1993; 2:1847-1851, y Johnston S, et al., Meth. Cell Biol. 1994; 43:353-365. La administración también se puede llevar a cabo a través de una superficie de mucosa tal como la mucosa anal, vaginal u oral.
7. Kit de la invención
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende el inmunógeno del primer aspecto, el polinucleótido, el virus o la célula del segundo aspecto, o la vacuna del tercer aspecto. Estos kits proporcionan los materiales necesarios para llevar a cabo la aplicación descrita en la presente invención. El kit también podría estar en forma de un parche.
Además, el kit puede comprender un envase, que permite mantener los reactivos dentro de determinados límites. Los materiales adecuados para preparar tales envases incluyen vidrio, plástico (por ejemplo, polietileno, polipropileno, policarbonato), botellas, viales, papel o sobres. El kit de la invención puede contener además instrucciones para usar los componentes contenidos en el mismo, en particular los que constituyen el parche hemostático de la invención. Dichas instrucciones se pueden encontrar en forma de material impreso o en forma de un soporte electrónico que puede almacenar instrucciones de modo que las pueda leer posteriormente un sujeto, tal como un medio de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas), o medios ópticos (por ejemplo, CD-ROM, DVD). Los medios pueden contener de forma adicional o alternativa sitios web de internet que proporcionan dichas instrucciones.
Procedimientos generales
1. Diseño de inmunógenos de células T
Se siguió el siguiente planteamiento para el diseño de los OLP de VIH de la invención.
El cribado experimental (ELISpot de interferón gamma) de 232 individuos sin tratar infectados por el VIH usando un conjunto de péptidos consenso del clado B puso de manifiesto regiones del proteoma vírico que eran predominantemente atacados en sujetos con control del VIH superior. Véase, Frahm N, et al., J. Virol. 2004; 78:2187-2200; Mothe B, et al., J. Transí. Med. 2011; 9(1):208. El conjunto de péptidos de ensayo global consistió en 410 péptidos solapantes 18-meros que abarcaban el proteoma vírico entero. De estos, se identificaron 26 OLP donde el grupo de los que responden a OLP tenía una carga vírica significativamente reducida (p<0.05 sin corregir para comparación múltiple) comparado con el grupo de los que no responden a OLP (es decir, individuos que no reaccionaron a estos OLP en el ensayo ELISpot de interferón gamma). Estos OLP beneficiosos tenían una relación protectora (PR>1) y se localizaban en la proteína Gag del VIH (n=10), en Pol (n=12), y en las proteínas Vif (n=3) y Nef (n=1) del virus. De los 26 OLP, 15 eran parcialmente solapantes. Véase la tabla 1.
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Para construir una secuencia de inmunógeno continua, los 26 OLP se alinearon y ensamblaron hasta un total de 16 segmentos, que variaban de 11-78 aminoácidos de longitud. Las posiciones iniciales y finales precisas de estos segmentos se basaron en el análisis de restos anteriores y posteriores de los 26 o Lp identificados y se basó en una serie de consideraciones que se aplicaron a los diferentes sitios flanqueantes. Estas consideraciones incluían:
1) Datos de inmunogenicidad de los OLP
2) Datos de reactividad de regiones conservadas
3) Extensión o corte de segmentos para inclusión/exclusión de epítopos buenos o malos conocidos
4) Cobertura de epítopo CD4
5) Cobertura de HLA
6) Variabilidad de secuencia (consenso 2010 y epítopos definidos de HBX2)
7) Análisis multivariante de OLP
8) Creación de nuevos epítopos/autoepítopos
9) Mantenimiento de la secuencia natural aunque no incluyera OLP beneficioso
10) Introducción de cambios para evitar reconocimiento de epítopos y
11) Evitar restos prohibidos (G, P, E, D, Q, N, T, S o C)
Este protocolo produjo el diseño de las SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 16 como inmunógenos potenciales. 2. Vectores
Las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 16 se unieron con aminoácidos alanina única, doble o triple entre los segmentos para asegurar el procesamiento óptimo y para evitar la digestión prematura del epítopo.
A continuación, los segmentos unidos se usaron como secuencias de inmunógeno de células T de VIH para la inclusión en vectores de ADN y MVA. Para la administración de los inmunógenos usando péptidos solubles solo o en combinación con proteínas de choque térmico, se diseñaron péptidos solapantes más cortos (longitud mediana 23 restos) que abarcan los 16 segmentos, sin incluir los enlazadores triples AAA. Estos OLP se generaron de una manera que ayudó a evitar restos prohibidos en el extremo C-terminal (importante para la presentación óptima del epítopo en moléculas de HLA de clase I. Véase, SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 45, , Enero 2012). Estos péptidos solapantes varían en longitudes de 11-27 aminoácidos.
3. Inmunógeno de células T
El inmunógeno de células T se ha diseñado como un polipéptido y ensamblado a partir de 16 segmentos del genoma de VIH-1 de tamaño variable (entre 11 y 78 aa) unificado por enlazadores de triple alanina. La descripción de las regiones incluía:
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Figure imgf000020_0001
4. Inclusión de una secuencia líder
Los péptidos señal generalmente son secuencias de aminoácidos muy hidrofóbicas (de 15 a 60 aminoácidos de longitud) de proteínas que deben cruzar a través de membranas para llegar a su localización celular de funcionamiento. Uniéndose a partículas de reconocimiento señal, estas secuencias dirigen complejos proteína naciente-ribosoma a una membrana donde la proteína se inserta durante la traducción. Los péptidos señal dirigen la captación traduccional de la proteína por varias membranas (por ejemplo, retículo endoplásmico, mitocondria, cloroplasto, peroxisoma). Las secuencias señal líder en proteínas no de membrana son eliminadas finalmente por peptidasas específicas.
Algunos péptidos señal usados incluyen quimioquina MCP-3, para fomentar la secreción y atracción de células presentadoras de antígeno; un péptido derivado de catenina (CATE) para degradación proteosómica aumentada; y la proteína lisosomal asociada, LAMP1 para dirigirse al compartimento de MHC II. Véase, Rosati M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009; 106:15831-15836.
En el presente diseño, se introdujo el péptido señal del GMCSF (factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos) en el extremo amino del inmunógeno para aumentar la secreción del inmunógeno de células que lo expresan, seguido por una valina para aumentar la estabilidad. La secuencia de péptido señal del GMCSF es:
MWLQSLLLLGTVACSIS (SEQ ID NO: 46)
5. Inclusión de una etiqueta para experimentos de expresión in vitro
Para el fin de evaluar la expresión en células transfectadas, la secuencia de inmunógeno incluía primero un péptido FLAG en la región C-terminal, antes del codón de terminación, que era:
DYKDDDDKL (SEQ ID NO: 48)
El sistema FLAG utiliza un péptido corto, hidrofílico de 8 aminoácidos, que se fusiona a la proteína recombinante de interés. El péptido FLAG incluye el sitio de unión para varios anticuerpos monoclonales ANTI-FLAG muy específicos (M1, m 2, M5; Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, EE. UU.), que se pueden usar para evaluar la expresión de la proteína de interés en material de células transfectadas.
Debido al pequeño tamaño de la etiqueta peptídica FLAG, no cubre otros epítopos, dominios o altera la función, secreción o transporte de la proteína de fusión en general. Esta secuencia se eliminó después para el ensayo de inmunogenicidad en ratones. La etiqueta FLAG se elimina del inmunógeno final (298H) antes de la inmunización.
6. Descripción del inmunógeno de células T
El inmunógeno de células T tiene la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 49):
M W L Q S L L L L G T V A C S I 5 V ( E K I R L R P G G K
K K Y K L K H I V W A S R E L E R F A V N P G L L E T S E
G C R Q I L G Q L Q P S L Q T G S E E L K S L Y N T V A T
L Y C V H Q K I E V J jí i A A A ( K A F S P E V I P M F S A
L ) s2 A A A ( G H Q A A M Q M L K E ) S 3 A A A ( I A P G Q M R
E P R G S D I A G T T S T L Q E Q I G W M T N N P P I P V
G E I Y K R W I I L G L N K I V R M Y S P T S D 5 4 A A A
( Y V D R F Y K T L R A E Q A ) s s A ( A C Q G V G G P G H K A R V L ) s6 A A A ( C T E R Q A N F L G K I W P S H K G R P G N F L Q S R ) s7 A A A ( K M I G G I G G F I K V R Q Y D Q
I L I E I C G H K A I G T V L V G P T P V N I I G R N L L
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K I ) .59 A A A ( L R W G F T T P D K K H Q K E P P F L W M G
Y E L H P D K W T V Q P I V L P E K D S W T V N D I Q K L
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I Q K Q G Q G Q W T Y Q I Y) S11 A A A ( T K E L Q K Q I T K
I Q N F R V Y Y R D S R D P L W K G P A K L L W ) 312A A A
( K I I R D Y G K Q M A G D D C V A ) Si3 A A ( V K H H M Y I S K K A K G W F Y R H H Y E S T H P R ) si4 A A A ( V T K L T E D R W N K P Q K T K G H R ) s i 5 A A ( A W L E A Q E E E E V G F) sis D Y K D D D D K L
en donde,
el péptido señal del GMCSF se muestra subrayado, la valina que sigue inmediatamente a la secuencia señal está destacada, los enlazadores de A única, doble o triple (AAA) se muestran en negrita, el epítopo FLAG (eliminado en la construcción final para estudios in vivo) se muestra en cursiva y los diferentes segmentos se muestran en paréntesis como sigue:
Figure imgf000021_0001
7. Optimización de codones de la secuencia de nucleótidos
La secuencia de inmunógeno de células T se tradujo en un ARN/secuencia de nucleótidos optimizada de codones para aumentar la expresión y secreción (Mr. Gene GmbH, Regensburg, DE). La optimización de codones se basó en introducir múltiples cambios de nucleótidos para destruir las secuencias de procesamiento de ARN, inhibidora y de inestabilidad previamente identificadas en el ARNm sin afectar a la proteína codificada. Véase, Schwartz S, et al., J. Virol. 1992; 66(12): 7176-7182. Este proceso también puede incluir la eliminación de sitios de ayuste predichos (puntuación>0.4) de las secuencias codificantes por cambios de codones apropiados, para minimizar la posibilidad de ayuste.
Como resultado de los cambios de nucleótidos indicados anteriormente, el contenido en GC final del inmunógeno de células T fue de 63%. La secuencia de nucleótidos con codones optimizados completa del inmunógeno es (SEQ ID NO: 50):
1 ATGTGGCTCC AGAGCCTGCT ACTCCTGGGG ACGGTGGCCT GCAGCATCTC GGTCGAGAAG
61 ATCCGGCTGC GGCCAGGCGG AAAGAAGAAG TACAAGCTGA AGCACATCGT CTGGGCCTCG
121 AGGGAGCTGG AGCGGTTCGC GGTGAACCCG GGACTTCTGG AGACGTCGGA GGGGTGCAGG
161 CAGATCCTCG GCCAGCTGCA GCCCTCTCTG CAAACGGGGT CTGAGGAGCT GAAGAGCCTG
241 TACAACACGG TGGCGACCCT CTACTGCGTC CACCAGAAGA TCGAGGTGGC AGCGGCCAAG
301 GCGTTCTCGC CGGAGGTCAT CCCCATGTTC TCGGCGCTGG CAGCTGCCGG ACACCAGGCC
361 GCGATGCAGA TGCTGAAGGA GGCCGCTGCG ATCGCACCGG GCCAGATGAG GGAGCCACGC
421 GGTTCCGACA TCGCGGGAAC CACCTCGACG CTCCAGGAGC AGATCGGATG GATGACGAAC
431 AACCCGCCAA TCCCGGTCGG GGAGATCTAC AAGCGGTGGA TCATCCTCGG GCTGAACAAG
541 ATCGTCCGGA TGTACAGCCC GACGTCGATC GCTGCGGCAT ACGTTGACCG GTTCTACAAG
601 ACCCTGAGGG CCGAGCAGGC AGCGGCCTGC CAGGGGGTCG GTGGACCAGG GCACAAGGCC
661 CGAGTGCTCG CGGCCGCATG CACGGAGCGG CAGGCGAACT TCCTGGGGAA GATCTGGCCG
721 TCGCACAAGG GCCGACCGGG AAACTTCCTC CAGTCTCGCG CAGCGGCTAA GATGATCGGA
731 GGCATCGGAG GCTTCATCAA AGTCCGTCAG TACGACCAGA TCCTCATCGA GATCTGCGGG
8 41 CACAAGGCGA TCGGAACCGT GCTCGTCGGC CCAACGCCCG TGAACATCAT CGGCCGCAAC
901 CTGTTAACGC AGATCGGCTG CACCCTCAAC TTCGCCGCAC TAGTGGAGAT CTGCACGGAG
961 ATGGAGAAGG AGGGCAAGAT ATCGAAGATC GCGGCAGCTC TGAGGTGGGG CTTCACCACG
1021 CCGGACAAGA AGCACCAGAA GGAGCCGCCA TTCCTGTGGA TGGGATACGA GCTGCACCCG
1081 GACAAGTGGA CCGTGCAGCC CATCGTCCTG CCGGAGAAGG ACTCGTGGAC GGTGAACGAC
1141 ATCCAGAAGC TCGTGGGGAA GCTGGCGGCA GCCATCCTCA AGGAGCCCGT CCACGGGGTG
12 01 TACTACGACC CCTCTAAGGA CCTGATCGCG GAGATCCAGA AGCAGGGGCA GGGTCAGTGG
12 61 ACCTACCAGA TCTACGCAGC AGCAACCAAG GAGCTGCAGA AGCAGATCAC GAAGATCCAG
1321 AACTTCCGCG TATACTACCG CGACTCGCGG GACCCCCTGT GGAAGGGCCC TGCGAAGCTT
1381 CTCTGGGCAG CCGCGAAGAT CATCCGGGAC TACGGCAAGC AGATGGCGGG CGACGACTGC
1441 gtggccgcag cggtgaagca ccatatgtac atctcgaaga aggcgaaggg ctggttctac
15 01 AGACACCACT ACGAGTCCAC CCACCCCAGG GCAGCTGCGG TGACGAAGCT GACGGAGGAC
1561 CGGTGGAACA AGCCCCAGAA GACGAAGGGT CACCGGGCGG CTGCATGGCT GGAGGCTCAG
1621 GAGGAGGAGG AGGTGGGCTT CGATTACAAG GACGATGACG ACAAGCTGtg a ta a
en donde la secuencia que codifica el péptido señal del GMCSF está subrayada, el codón de valina inmediatamente después de la secuencia que codifica la secuencia señal se muestra destacada, la secuencia que codifica el polipéptido inmunógeno se muestra en letras normales, la secuencia que codifica la etiqueta Flag se muestra en cursiva y los codones de terminación tga y taa se muestran en minúscula.
8. Estrategia de clonación
El inmunógeno de células T con codones optimizados se clonó en el plásmido de expresión de mamífero BV5, que consiste en un esqueleto de plásmido básico de CMV modificado optimizado para el crecimiento en bacterias, que tiene el promotor del citomegalovirus (CMV) humano, el sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y el gen de resistencia a kanamicina --sin el sitio Xho. Los pasos de clonación fueron como sigue:
1) En un primer paso, se introdujo un cambio de aminoácido de Leu a Met en el inmunógeno de células T sintetizado -uno que incluye el epítopo FLAG en la posición 41 de RT (segmento 9) para cubrir uno de los sitios de mutación de resistencia antirretroviral principales. El gen del inmunógeno de células T (vector inicial) se clonó en un plásmido que tiene resistencia a la espectomicina. Se insertó un segmento generado por PCR que cubría el cambio M4l en RT en el inmunógeno de células T como Spel/HindIII. Se usaron células DH108B competentes para la transformación y se cultivaron en medio LB-espectomicina. El plásmido resultante se denominó HIVACAT RT M41. La inserción de la mutación puntual se confirmó por secuenciación por PCR usando cebadores sentido y antisentido que cubren la secuencia del segmento 9.
2) En un segundo paso, el gen HIVACAT RT M41 se insertó en el plásmido BV5 que carece del sitio Xho en el gen de resistencia a la kanamicina como SalI/EcoRI, por ligación del vector y del fragmento de HIVACAT RT M41 digerido purificado en gel. Se usaron células DH108B competentes para la transformación y se cultivaron en medio LB-Kan. El nombre del plásmido resultante fue 297H (GMCSF-HIVACAT-FLAG). La inserción del gen se confirmó por digestión de restricción y secuenciación por PCR usando cebadores sentido (desde el promotor de CMV) y antisentido (desde la región poliA de BGH).
3) En un tercer paso, el epítopo para la etiqueta FLAG se eliminó del plásmido 297H por digestión con BstEII-EcoRI y la inserción se hibridó con los cebadores 298H Plus y 298H Minus:
298HPlus
GTCACCGGGCGGCTGCATGGCTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGG
AGGTGGGCTTCtgataaG (SEQ ID NO: 51)
298H Minus
aattCttatcaGAAGCCCACCTCCTCCTCCTCCTGAGCCTCCAGCCAT
GCAGCCGCCCG (SEQ ID NO: 52)
El plásmido resultante se denominó 298H GMCSF-HIVACAT, número de acceso DSM 25555). Véase la figura 1. La eliminación de la etiqueta FLAG se confirmó por secuenciación por PCR usando cebadores antisentido (desde la región poliA de BGH).
Ejemplo 1
Estudios de expresión in vitro
Se realizaron varias transfecciones transitorias para evaluar la expresión, localización y estabilidad del inmunógeno de células T HIVACAT.
Brevemente, se sembraron 1*106 células 293 humanas en DMEM completo más suero bovino fetal (SBF) al 10% en placas de cultivo de tejidos de 60 mm y se dejaron adherir durante la noche. Las células HEK 293 se transfectaron por coprecipitación de ADN con fosfato de Ca con un total de 7 |jg de ADN (100 ng o 250 ng de ADN del plásmido 297H GMCSF-HIVACAT-FLAG, 50 ng de plásmido que expresa GFP pFRED143 completado hasta 7 jg con ADN de Bluescript).
6 horas después de la transfección el medio se reemplazó con 3 ml de DMEM complementado con STF al 2%. Después de 24 y 48 horas las células y los líquidos sobrenadantes se recogieron en RIPA 0.5X.
Se analizó la expresión de proteínas por inmunotransferencia Western. Se cargaron 1/250 del total de extractos y líquidos sobrenadantes celulares. Las proteínas se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio al 10% (Nu-Page Bis-Tris, NuPAGE, Invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, EE. UU.) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa.
El plásmido 297H se detectó tras hibridación de las membranas con anticuerpo monoclonal anti-FLAG conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, EE. UU.) a una dilución 1:3000.
Las bandas se visualizaron usando ECL. Se generaron imágenes de las membranas en un ChemiDoc XRS+.
Se usaron controles positivos e incluían ADN de plásmido que codifica p55 Gag del clado B, que también tenía la etiqueta FLAG.
Se hibridaron extractos celulares de transfecciones transitorias usando el plásmido 298H (que codifica el inmunógeno de células T HIVACAT sin la etiqueta FLAG) con suero humano de un sujeto infectado con VIH-1 a una dilución 1:3000 seguido por un anti-IgG humano conjugado a peroxidasa de rábano picante, dilución 1:10000.
Los plásmidos 297H y 298H expresaron establemente (misma cantidad estimada a las 24 horas y 48 horas) la construcción de inmunógeno de células T HIVACAT, que se visualizó en el compartimento de extracto celular. No hubo evidencia de secreción de la construcción.
Ejemplo 2
Respuesta celular en ratones
Se produjo una solución madre de 1 ml (2 mg/ml) de ADN de 298H GMCSF-HIVACAT sin endotoxina para estudios in vivo en ratones.
Se evaluó la inmunogenicidad del inmunógeno de células T HIVACAT en ratones C57BL/6 hembra de 6-8 semanas de edad (Charles River Labs, Inc., Frederick, MD, EE. UU.).
Se administraron 20 |jg y 5 |jg de ADN por vía intramuscular mediante electroporación usando el sistema Inovio (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA, EE. UU.) en los cuádriceps izquierdo y derecho (20 jg/50 j l por dosis, 25 j l por sitio) en la semana 0 y 4. Los ratones se sacrificaron 2 semanas después de la última inmunización. Se recogieron esplenocitos y suero de los ratones para estudios de inmunogenicidad. Los ADN de control usados fueron:
1) 114H p55 gag clado B: expresa la proteína gag entera;
2) 132H NTV: expresa una proteína quimérica de nef, tat y vif;
3) 133H pol: expresa la proteína pol entera; y
4) BV4 CMV-Kan-Básico: control de referencia, esqueleto de plásmido de ADN similar sin ningún transgén expresado.
Se usaron 35 ratones en el experimento, agrupando 5 ratones por grupo. La distribución de la inmunización por grupo fue como sigue:
Figure imgf000024_0001
_________
Las respuestas inmunitarias celulares se caracterizaron en un primer paso usando tinción de citoquina intracelular (ICS) en mezclas de esplenocitos (células de 5 ratones que pertenecían al grupo) y usando un conjunto de péptidos solapantes que cubren las proteínas gag, pol, nef, tat y vif enteras.
Brevemente, las mezclas de esplenocitos de ratón aislados de cada grupo de ratones se incubaron a una densidad de 2* 106 células/ml, en cocultivo de 1 ml durante la noche, en presencia de conjuntos de péptidos (15-meros, solapantes en 11 aa que cubren gag de clado B, pol B consenso y secuencias de nef, tat y vif de NL43, 1 jg/m l de cada péptido, total de aproximadamente 12 horas, 1 hora sin parada de Golgi para prevenir la secreción de citoquinas). La inmunotinción de superficie se realizó con CD3-aloficocianina-Cy7, CD4-PerCP, CD8-Azul Pacifico (BD Biosciences, Inc., Franklin Lakes, NJ, EE. UU.). La tinción de citoquinas intracelulares se realizó usando anticuerpo de interferón gamma-FITC (BD Biosciences, Inc., Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) después de permeabilización.
Desde los primeros análisis de inmunogenicidad, tanto 20 jg como 5 jg de ADN en ratones C57BL/6 generaron respuestas-+ detectables de interferón gamma a gag entera, pol y conjuntos de péptidos nef-tat-vif. Véase la figura 2a. Se muestra la distribución de respuestas CD4+ y CD8+. Véase la figura 2b.
A nivel de ratones individual, las respuestas se deconvolucionaron usando esplenocitos congelados estimulados con 8 conjuntos de péptidos para cubrir las subunidades de proteína incluidas en el inmunógeno en un ensayo ELISpot de interferón gamma.
El ensayo ELISpot se realizó usando el kit de ELISpot de interferón gamma de ratón (ALP) (Mabtech AB, Estocolmo, SE) siguiendo las instrucciones del fabricante con modificaciones menores. Para todos los ensayos, se añadieron esplenocitos de ratón con un número de células aportado de 4*105 células/pocillo en 140 pl de medio Rosewell Park Memorial Institute 1640 con suero bovino fetal al 10% en placas de polivinilideno de 96 pocillos (Millipore Corp., Bedford, MA, EE. UU.) solo o con conjuntos de péptidos específicos de VIH-1 (concentración final para cada péptido, 14 pg/ml) durante 16 horas a 37°C en CO2 al 5%. Ocho conjuntos de péptidos, que contenía cada uno entre 2 y 12 péptidos de 18 aminoácidos basados en la secuencia consenso B 2001 se agruparon en diferentes subunidades proteicas (gag-p17, gag-p24, gag-p2p7plp6, pol-RT, polproteasa, pol-integrasa, vif y nef) que abarcaban los segmentos incluidos en el inmunógeno de células T HIVACAT. Véase, http://hiv-web.lanl.gov/content/hiv-db/CONSENSUS/M_GROUP/Consensus.html, enero 2012. Los conjuntos de péptidos de VIH usados en ratones inmunizados con ADN que expresan las proteínas gag, pol, nef, tat y vif enteras, consistían en péptidos 18-meros con un solapamiento de 11 restos que abarcan las proteínas gag (6 conjuntos, 11 péptidos/cada uno), pol (8 conjuntos, 16 o 17 péptidos/cada uno), nef (2 conjuntos, 13 o 14 péptidos/cada uno), tat (1 conjunto, 12 péptidos) y vif (2 conjuntos, 12 péptidos/cada uno) completas.
Se usó concavalina A (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, EE. UU.), en 5 mg/ml, como control positivo. Las placas se revelaron con fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo/nitroazul de tetrazolio en un paso (BCIP/NBT; Bio-Rad Laboratories, Inc., Irvine, CA, EE. UU.). Las manchas en las placas se contaron usando un sistema lector de ELISPOT automatizado (CTL Analyzers LLC, Cleveland, OH, EE. UU.) usando el software ImmunoSpot y la magnitud de las respuestas se expresó como células formadoras de manchas (SFC) por millón de esplenocitos aportados. El umbral para respuestas positivas se definió como al menos 5 manchas por pocillo y respuestas que superaban el “número medio de manchas en pocillos de controles negativos más 3 desviaciones estándar de los pocillos de controles negativos” y “tres veces la media de los pocillos de controles negativos”, el que fuera más alto.
1) El dominio de respuestas de interferón gamma desarrolladas en ratones inmunizados con plásmidos que codifican las proteínas gag, pol, nef, tat y vif enteras era hacia regiones fuera de los segmentos cubiertos del inmunógeno de células T HIVACAT (la relación mediana de respuestas que se dirigen a regiones del inmunógeno HIVACAT/gag+pol+nef+tat+vif total fue 0.26 (intervalo 0.17-0.42)) y no difería entre grupos inmunizados con dosis alta (20 pg) o dosis baja (5 pg) de ADN. Véase la figura 3.
2) La amplitud mediana de las respuestas a subunidades proteicas incluidas en la secuencia del inmunógeno de células T HIVACAT fue 4 (intervalo 2-5) en ratones inmunizados con 20 pg de HIVACAT frente a 2 respuestas (intervalo 1-3) en ratones inmunizados con 20 pg de plásmidos que codifican proteínas enteras (ns) sin diferencias significativas en la magnitud de las respuestas. Seis de las ocho subunidades proteicas eran al menos una vez objetivo en los ratones inmunizados con el inmunógeno de células T HIVACAT. Véase la figura 4.
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4) El dominio de las respuestas en ratones inmunizados con plásmidos que codifican las proteínas enteras de gag, pol, nef, tat y vif fue del 89% dirigido principalmente hacia gag, mientras que en ratones inmunizados con el inmunógeno de células T HIVACAT a dosis altas fue más equilibrado hacia todos los componentes proteicos (gag, pol, vif y nef) contenidos en el inmunógeno. Véase la figura 5.
Ejemplo 3
Respuesta humoral en ratones
Las respuestas humorales se analizaron primero en mezclas de suero de ratones. Se detectaron anticuerpos de unión a p24, p37 y p55 por inmunotransferencia Western usando extractos celulares de células HEK 293 transfectadas con 1 mg de los vectores de expresión de gag, separados en SDS-PAGE al 12% e hibridando las membranas con mezclas de suero de ratones (a una dilución 1:100). Los títulos de anticuerpo contra gag p24 se midieron por ELISA. Se evaluaron diluciones en serie de 4 veces de las muestras de mezclas de suero y se determinó la absorbancia óptica a 450 nm (Advanced BioScience Lab, Inc., Kensington, MD, EE. UU.). Los títulos de unión se describieron como la dilución mayor con puntuación positiva que tenía un valor mayor que la media más 3 desviaciones estándar obtenida con sueros de control de los ratones inmunizados con ADN SHAM.
a) Desde los primeros análisis de inmunogenicidad humoral, el inmunógeno de células T HIVACAT indujo respuestas de anticuerpos de unión a gag p55, p37 y p24 detectables por inmunotransferencia Western en los grupos de ratones inmunizados con 20 |jg. Véase la figura 6.
b) Los anticuerpos de unión a p24 se cuantificaron por ELISA. Los títulos finales del anticuerpo de unión específico para p24-gag de los ratones que recibieron los plásmidos descritos se determinaron por ELISA de muestras de mezclas de suero individuales diluidas en serie 4 veces. En el grupo de dosis alta de ratones se inmunizaron con el inmunógeno de células T HIVACAT a un título de 1:4000 que era menor que los títulos detectados en ratones inmunizados con la construcción de gag completa. Los anticuerpos de unión a p24 no fueron medibles en el grupo de dosis baja. Véase la figura 7a. A nivel de ratones individuales, se realizó un ELISA para gag p55 desarrollado internamente usando la proteína recombinante VIH-1IIIB pr55 gag (N° de catálogo 3276, NIH Reagent Program, Bethesda, MD, EE. UU.) con sueros de ratón a una dilución 1:100. Se detectaron niveles bajos de anticuerpo en 2 de 3 ratones inmunizados con dosis altas del inmunógeno. Véase la figura 7b.
Ejemplo 4
Inmunogenicidad in vivo por sensibilización/refuerzo heterólogo en ratones
Materiales y métodos
Preparación de las vacunas pDNA-HIVACAT y MVA-HIVACAT
Se clonó el inmunógeno de células T con codones optimizados en el plásmido de expresión de mamífero BV5, que consiste en un esqueleto plasmídico básico de CMV modificado optimizado para crecimiento en bacterias, que tiene el promotor de citomegalovirus (CMV) humano, el sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y el gen de resistencia a kanamicina -- que carece del sitio Xho. El ADN de plásmido para las inmunizaciones de ratones se preparó usando Endo-Free Megaprep (Qiagen) y se almacenó a -80°C hasta su uso.
Se hizo un MVA recombinante que expresa el gen HIVACAT como se describe previamente {Letourneau, 2007 n° 235; Nkolola, 2004 n° 321}. Brevemente, se infectaron células fibroblastos de pollo embrionarios (CEF) cultivadas en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con SBF al 10%, penicilina/estreptomicina y glutamina (DMEM 10) con MVA parental con una MOI 1 y se transfectaron usando Superfectin (Qiagen) con 3 jg de pDNA-HIVACAT que tiene el gen de la p-galactosidasa como marcador. Dos días después, el virus total se recogió y usó para reinfectar células CEF. El MVA se sometió a cinco rondas de purificación en placa, después de lo cual se hizo crecer una cepa madre de virus, se purificó en un colchón de sacarosa al 36%, se tituló y se almacenó a -80°C hasta su uso.
Inmunogenicidad in vivo en ratones C57BL/6

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido inmunógeno que comprende
las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1-16, con la condición de que el polipéptido inmunógeno no comprenda ningún tramo de secuencia derivado de aminoácidos derivada del genoma del VIH de una longitud de 8 o más aminoácidos diferente de una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NOs 1­ 16, y en donde al menos dos de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs 1-16 están unidas por un enlazador de aminoácidos en el polipéptido inmunógeno.
2. El polipéptido inmunógeno según la reivindicación 1, en donde el polipéptido inmunógeno tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de:
EKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELK
S LYN TVAT LYCVH Q KIEVAAAKAFS P EVIPMF SALAAAGHQAAMQMLKEAAAIAP GQMRE
PRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSIAAAYVDRF
YKTLRAEQAAACQGVGGPGHKARVLAAACTERQANFLGKIWPSHKGRPGNFLQSRAAAKM
IGGIGGFIKVRQYDQIL IEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNFAAALVEI
CTEMEKEGKISKIAAALRWGFTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWT
VNDIQKLVGKLAAAILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYAAATKELQKQIT
KIQNFRVYYRDSRDPLWKGPAKLLWAAAKIIRDYGKQMAGDDCVAAAVKHHMYISKKAKG
WFYRHHYESTHPRAAAVTKLTEDRWNKPQKTKGHRAAAWLEAQEEEEVGF
3. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido inmunógeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.
4. El polinucleótido de la reivindicación 3, en donde el polinucleótido tiene la secuencia de ácido nucleico de
g a g a a g a t c c g g c t g c g g c c a g g c g g a a a g a a g a a g t a c a a g c t g a a g c a c a t c g t c t g g g c c t c g a g g g a g c t g g a g c g g t t c g c g g t g a a c c c g g g a c t t c t g g a g a c g t c g g a g g g g t g c a g g c a g a t c c t c g g c c a g c t g c a g c c c t c t c t g c a a a c g g g g t c t g a g g a g c t g a a g a g c c t g t a c a a c a c g g t g g c g a c c c t c t a c t g c g t c c a c c a g a a g a t c g a g g t g g c a g c g g c c a a g g c g t t c t c g c c g g a g g t c a t c c c c a t g t t c t c g g c g c t g g c a g c t g c c g g a c a c c a g g c c g c g a t g c a g a t g c t g a a g g a g g c c g c t g c g a t c g c a c c g g g c c a g a t g a g g g a g c c a c g c g g t t c c g a c a t c g c g g g a a c c a c c t c g a c g c t c c a g g a g c a g a t c g g a t g g a t g a c g a a c a a c c c g c c a a t c c c g g t c g g g g a g a t c t a c a a g c g g t g g a t c a t c c t c g g g c t g a a c a a g a t c g t c c g g a t g t a c a g c c c g a c g t c g a t c g c t g c g g c a t a c g t t g a c c g g t t c t a c a a g a c c c t g a g g g c c g a g c a g g c a g c g g c c t g c c a g g g g g t c g g t g g a c c a g g g c a c a a g g c c c g a g t g c t c g c g g c c g c a t g c a c g g a g c g g c a g g c g a a c t t c c t g g g g a a g a t c t g g c c g t c g c a c a a g g g c c g a c c g g g a a a c t t c c t c c a g t c t c g c g c a g c g g c t a a g a t g a t c g g a g g c a t c g g a g g c t t c a t c a a a g t c c g t c a g t a c g a c c a g a t c c t c a t c g a g a t c t g c g g g c a c a a g g c g a t c g g a a c c g t g c t c g t c g g c c c a a c g c c c g t g a a c a t c a t c g g c c g c a a c c t g t t a a c g c a g a t c g g c t g c a c c c t c a a c t t c g c c g c a c t a g t g g a g a t c t g c a c g g a g a t g g a g a a g q a q q g c a a g a t a t c g a a q a t c q c g g c a q c t c t q a q q t g g g q c t t c a c c a c q c c g q a c a a q a a q c a c c a q a a q q a q c c q c c a t t c c t q t q q a t q q q a t a c q a q c t q c a c c c q q a c a a q t q q a c c q t q c a q c c c a t c q t c c t q c c q q a q a a q q a c t c q t q q a c q q t q a a s g a s a tG C agaagGtsgt ggggaagGtg gGggGagGGa tGGtGaagga gGGGgtGGaG crcrcratcr tact a c c r a c c c c t c t a a c r c ra c c t c r atccrccfcracra t c c a c r a a c r c a crcrcracacrcrat c a q t q q a c c t a c c a q a t c t a c q c a q c a q c a a c c a a q q a q c t q c a q a a q c a q a t c a c q a a q a t c c a q a a c t t c c q c g t a t a c t a c c g c q a c t c q c q q q a c c c c c t q t q q a a q q g c c c t q c q a a g c t t c t c t g g g c a g c c g c g a a g a t c a t c c g g g a c t a c g g c a a g c a g a t g g c g g g c g a c gactgcgtgg G G g c a g c g g t gaagcaccat a tg ta ca tc t cgaagaaggc gaagggctgg t t c t a c a q a c a c c a c t a c q a g t c c a c c c a c c c c a q q q c a q c t q c q q t q a c q a a q c t q a c q q a g q a c c q q t g q a a c a a g c c c c a g a a q a c q a a q g q t c a c c q g q c q q c t g c a t g q c t g q a q q c t c a q q a q q a q g a q q a q q t g q q c t t c
5. Un virus que comprende el polinucleótido de la reivindicación 3 o 4.
6. El virus de la reivindicación 5, en donde el virus es un virus vaccinia Ankara modificado.
7. Una célula aislada que comprende el polinucleótido de la reivindicación 3 o 4.
8. Una vacuna que comprende el polipéptido inmunógeno de las reivindicaciones 1 o 2, y uno o más adyuvantes.
9. El polipéptido inmunógeno de las reivindicaciones 1 o 2, el polinucleótido de la reivindicación 3 o 4, el virus de la reivindicación 5 o 6, la célula de la reivindicación 7 o la vacuna de la reivindicación 8 para usar en medicina.
10. El polipéptido inmunógeno de las reivindicaciones 1 o 2, el polinucleótido de la reivindicación 3 o 4, el virus de la reivindicación 5 o 6, la célula de la reivindicación 7 o la vacuna de la reivindicación 8 para usar en la prevención o tratamiento de una infección por el VIH.
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