BR112013030017A2 - anticorpos anti-kir para o tratamento de distúrbios inflamatórios - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTI-KIR2DL1, ANTI-KIR2DL2 E ANTI-KIR2DL3, SEUS MÉTODO DE PRODUÇÃO E USO NO TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS AUTOIMUNES E INFLAMATÓRIOS E NA ELIMINAÇÃO OU REDUÇÃO DE CÉLULAS T, BEM COMO COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO OS REFERIDOS ANTICORPOS. A presente invenção refere-se aos compostos que inibem os polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2 E KIR2DL3, em que particularmente os referidos compostos são anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, ao método de produção dos mesmos e ao uso dos referidos compostos no tratamento de distúrbios inflamatório e autoimune e na eliminação ou redução do número de células T. A presente invenção refere-se ainda a composições compreendendo os referidos compostos que inibem os polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2 E KIR2DL3.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS ANTI-KIR2DL1, ANTI-KIR2DL2 E ANTI-KIR2DL3, SEUS MÉTODO DE PRODUÇÃO E USO NO TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS AUTOIMU- NES E INFLAMATÓRIOS E NA ELIMINAÇÃO OU REDUÇÃO DE CÉLU- LAST, BEMCOMO COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO OS REFERIDOS ANTICORPOS",

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS Este pedido de patente reivindica a prioridade ao Pedido de Pa- tente Provisório Nº 61/489, 806, depositado em 25 de maio de 2011, cuja descrição está incorporada na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à modulação da atividade da célu- la NK usando os anticorpos anti-KIR imunomoduladores para tratar ou pre- venir as doenças inflamatórias e as doenças autoimunes, em especial, as doenças mediadas, pelo menos em parte, por meio das células T pró- inflamatórias.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO As células assassinas naturais (NK) são um subconjunto de lin- fócitos granulares grandes que atuam como células imunitárias citotóxicas. À atividade citotóxica mediada por meio das células NK, naturalmente contra células alvo (por exemplo, células cancerosas, células infectadas com vírus) é geralmente expressa como sendo um resultado de um"equilíbrio"de sinais positivos e negativos, respectivamente, transmitidos por meio da ativação e inibição dos receptores de superfície de célula.

As células NK podem ser identificadas por um número qualquer de marcadores de superfície de célula conhecidos, que variam entre espé- cies (por exemplo, em CD56, CD16, NKp44, NKp46, NKp30 humanos e são frequentemente usados, em camundongos NK1.1, Ly49A-W, CD49b são muitas vezes usados). No estado ativo, as células NK são capazes de matar certas células tumorais autólogas, alogênicas e até mesmo xenogênicas, células infectadas por vírus, certas bactérias (por exemplo, Salmonella typhi) e outras células alvo. As células NK parecem matar preferencialmente as

1a/312 células alvo que expressam as moléculas de pouca ou nenhuma Histocom- patibilidade Principal de Classe | (MHCI ou MHC-I), na sua superfície.

As cé- lulas NK também mataram as células alvo para a qual as moléculas de anti-

ticorpos foram ligadas, de um mecanismo conhecido como citotoxicidade de célula dependente de anticorpo (ADCC). Na ação contra as células alvo, as células NK, podem libertar as proteínas formadoras de poros dilataçãodas perforinas, enzimas proteolíticas dilataçãodas granzimas, e citoci- nas/quimiocinas (por exemplo, TNFa, IFN-y), que conduzem diretamente para alvider a apoptose das células ou lise, ou outros, que regulam as res- postas imunitárias. Após a ativação, as células NK, também podem expres- sar o ligante Fas (FasL), permitindo que estas células venham a induzir a apoptose em células que expressam Fas.

A atividade das células NK suficiente e a contagem de células NK normalmente são necessárias para montar uma resposta imune mediada por meio das células NK adequadas. As células NK podem estar presentes em números normais de um indivíduo, mas se não forem ativadas estas cé- lulas serão ineficazes na realização de funções vitais do sistema imunitário, tais como a eliminação de células anormais. A diminuição da atividade da célula NK é ligada ao desenvolvimento e progressão de muitas doenças. Por exemplo, a pesquisa demonstrou que a baixa atividade das células NK cau- sa maior suscetibilidade a doenças como a síndrome da fadiga crônica (SFC), infecções virais, bem como o desenvolvimento de cânceres.

A atividade das células NK é regulada por meio da atividade de receptores de células NK (como moduladoras NKCAMRs), que podem ser específicos para vários ligantes, tais como as moléculas de MHC-Il, MHC-I, ou os homólogos de outras moléculas biológicas, expressas em células alvo. As células NK em um indivíduo normalmente apresentam um certo número de receptores de ativação e inibitórios. A atividade das células NK é regula- da por meio de um equilíbrio de sinais de transdução através da ativação e inibição dos receptores. A maioria dos receptores de modulação da ativida- dede células NK parecem pertencer a uma das duas classes de proteínas: a super família dos receptores do tipo imunoglobulina (lg) (ISF) ou a super família dos receptores do tipo lectina do tipo C (CTLR). Vide, por exemplo, Radaev e Sun (2003) Annu. Rev. Biomol. Struct. 32: 93 a 114). No entanto, outras formas de NKCAMRs são conhecidas.

Muitos receptores de ativação de células NK pertencem à super família Ig (IGSF) (tais receptores podem também ser referidos como recepto- res do tipo lg ou"lILRs"usados na presente invenção). A ativação de recepto- res NK (ILR AILRs) incluem, por exemplo, molécula-1de acessório CD?2, CD16,CD69, DNAX (DNAM-1), 2B4, NK1.1; receptores de ativação do tipo imunoglobulina (Ig) assassinas (de Kars); ILTS/LIR; receptores de citotoxici- dade naturais (NCRs), tais como NKp44, NKp46, NKp30 e.

Vários outros receptores ativadores pertencem à super família CLTR (por exemplo, os he- terodímeros NKRP-1, CD69, CD94/NKG2C e CD94/NKG2E, homodímero NKG2D,e em camundongos, a ativação de isoformas de Ly49, como Ly49A- D). Ainda outros receptores de ativação (por exemplo, LFA-1 e VLA-4) per- tencem à super família de proteínas de integrina e outros receptores de ati- vação podem ter ainda outras estruturas distintas.

Muitos receptores de ati- vação possuem domínios extracelulares, que se ligam às moléculas de MHC-I e domínios citoplasmáticos que são relativamente curtos e não têm o motivo imunorreceptor de inibição com base em tirosina (ITIM) de sinaliza- ção dos motivos característicos dos receptores de NK inibidores.

Os domí- nios transmembranares destes receptores incluem, tipicamente, um resíduo de aminoácidos carregado que facilita a sua associação com as moléculas de transdução de sinal associadas, por exemplo, CD3zeta, FceRIly, DAP12, e DAP10 (2B4, no entanto, parece ser uma exceção a esta regra geral), que contêm sequências curtas de aminoácidos denominadas um"motivo de ati- vação com base em imunorreceptor de tirosina"(ITAMs) que se propagam aos sinais de ativação de células NK.

O receptor 2B4 contém os Motivos de troca com base no imunoreceptor de tirosina 4 (ITSMS) em sua cauda cito- plasmática.

Os motivos ITSM também podem ser encontrados em NKCARs CS1/CRACC e NTB-A.

Os domínios citoplásmicos de 2B4 e SLAM contêm dois ou mais motivos com bases em tirosina únicas que se assemelham aos motivos presentes nos receptores de ativação e inibitórios e podem recrutar odomínioSH2 contendo as proteínas SHP-2 e a proteína associada SLAM

(SAP). As moléculas induzidas pelo stress, por exemplo, MIC-A, B-MIC e ULBPs (em seres humanos), e Rae-1 e H-60 (em camundongos), podem servir como ligantes para os receptores de ativação, tal como o Homodímero NKG2D. Os carboidratos de célulaes, antígenos patogênicos e anticorpos também podem ser os ligantes dos receptores de ativação. Por exemplo, —“NKR-P1 pode ligar aos carboidratos ligantes e desencadeam a ativação de células NK, especialmente contra as células tumorais que apresentam os padrões de glicosilação aberrante. As hemaglutininas virais podem servir como ligantes para os receptores naturais (NCRs citotóxicos), tais como ILR NKCARs NKp30, NKp44, NKp46, e NKp80.

Os receptores de ativação podem transduzir diretamente os si- nais de ativação, ou podem atuar em ligação com as moléculas de adapta- dores ou outros receptores, ou no contexto de uma resposta coordenada entre os receptores, que são, por vezes, ou singularmente eficazes no con- texto de emparelhamentos co-receptor-receptor. Por exemplo, NCRs tipica- mente falta ITAMs e, por conseguinte, liga-se a moléculas de adaptaçãor por meio de um resíduo carregado nos seus domínios transmembranares (por exemplo, NKp30 se associa com a cadeia zeta CD3; NKp44 se associa com DAP12 e/ou KARAP; NKp46 é acoplado com a cadeia zeta CD3 e cadeia FcCRIy), que são, por sua vez, capazes de recrutar as proteínas tirosina- quinases (PTK), a fim de propagar os sinais de ativação de células NK. CD16, que é um receptor de ativação importante a ADCC mediada pela cé- lula NK e a produção de citoquinas, associadas com homodímeros ou hete- rodímeros formados das cadeias CD3 Zeta e/ou gama. NKG2D parece de- sempenhar um papel complementar e/ou sinérgico com NCRs e receptores de ativação na ativação da célula NK. A ativação das células NK contra al- vos específicos podem requerer ativação coordenada de receptores ativado- res ou vários NCRs, ou apenas a ação de um único receptor. Outras molécu- las de superfície desencadeantes, incluindo 2B4 e NKp80 pareceu funcionar como co-receptores para a ativação de células NK.

As isoformas de ativação dos receptores do tipo imunoglobulina assassinas humanos (KIR) (por exemplo, KIR2DS e KIR3DS) e Ly-49 murina (por exemplo, proteínas, Ly-49D e Ly49H) são expressas por meio de al-

gumas células NK. As células de estimulação ou tolerância de assassinos naturais (NK) são conseguidas através de um cross-talk de sinais derivados de ativação na superfície de célula e receptores inibitórios. Os receptores do tipo imunoglobulina das célulassassinas (KIR), são uma família de recepto- resinibitórios e de ativação altamente polimórficos que servem como regula- dores chave da função das células NK humanas. Os domínios estruturais distintos em diferentes membros da família KIR determinam a função, pro- porcionando locais de encaixe para ligantes ou proteínas de sinalização. Vi- de, Campbell & Purdy (2011) Immunology 132 (3): 315 a 25. Estas molécu- las diferem das suas contrapartes inibitórias, que são discutidas abaixo, por falta de ITIMs nos seus domínios citoplasmáticos relativamente curtos, e possuindo uma região transmembranar carregada que se associa com os polipetídeos de transdução de sinal, tais como dímeros ligados por meio do dissulfureto de DAP12.

Os receptores inibitórios das células NK ILR (IgSF) incluem uma série de diferentes KIR humanos específicos para HLA-A,-B ou-C alotipos, KIR podem reconhecer alelos múltiplos dentro de um alotipo particular, por exemplo, KIR2DL1 reconhece os alotipos HLA-Cw2, CWA4, e Cw6. Os recep- tores inibitórios da super família ctlr incluem os membros da família de prote- ínas CD94/NKG2, que compreendem os receptores formados por meio da lectina-CD94 como com vários membros da família NKG2, tais como a NKG?2A, e reconhecem as moléculas MCH-I não clásicas HLA-E e QA-1 (em seres humanos e camundongos, respectivamente), e as moléculas de Ly49 murinos que reconhecem as moléculas MHC-I em camundongos clássicos. Emainda mais o contraste, NKRP1A, Nkrp1f e Nkrpid são receptores inibi- tórios cujos ligantes não são relacionados a MHC, mas são membros da fa- mília CTLR expressas em vários tipos de células, tais como células dendríti- cas, os macrôfagos e os linfócitos. Os NKCIRs específicos de MHC da classe | incluem os recepto- resCTLR Ly49 (em camundongos), os receptores do tipo imunoglobulina de leucócitos do receptor IGSF (LIR) (em seres humanos), KIRs (por exemplo, p58 e p70 de receptores do tipo imunoglobulina de célulassassinas) (em se-

res humanos), e receptores CD94/NKG2 CTLR (em camundongos e seres humanos). Todos NKCIRs específicos de MHC-I parecem usar um meca- nismo inibitório aparentemente comum envolvendo a fosforilação de ITIMs nos seus domínios citoplasmáticos, no decurso da ligação de MHC-lI, e do recrutamento de tirosina fosfatase (por exemplo, SHP-1 e SHP-2) para a ITIMs fosforilada, resultando na inibição da proteínas tirosina quinases pro- ximais (PTK) envolvidas na ativação NK através de NKCARs.

Os anticorpos contra receptores de atividade de modulação, como a KIR, foram anterior- mente descritos.

Tem havido também, pelo menos, alguma sugestão de combinação de anticorpos antirreceptores de NK, tal como Os anticorpos anti-KIR, com outros agentes anticâncer, na técnica anterior.

Por exemplo, o documento WO 2004/ 056392 descreve Os anticorpos anti-NKp30 e/ou anti- NKp46 usados em mistura com a interleucina-2 (I1L-2). WO 2008/ 084106 descreve formulações, dosagens e posologias anti-KIR.

O documento WO 2005/ 079766 também descreve as combinações de anticorpos (por exem- plo, anticorpos anti-fator de tecido), incluindo Os anticorpos anti-KIR para uso em terapias do câncer.

O documento WO 2005/ 003168 e WO 2005/ 003172 descreve uma combinação de um número de anticorpos anti-KIR com uma variedade de agentes, incluindo interleucina IL-2 e-2! (11-21). O documento WO 2005/ 037306 descreve as combinações de forma seme- lhante a 11-21, IL-21 e os derivados e os análogos dos mesmos de |L-21 em combinação com anticorpos anti-KIR.

O documento WO 2005/ 009465 des- creve a combinação de um anticorpo terapêutico (por exemplo, RUTIxan), em combinação com um composto que bloqueia um receptor inibitório ou estimula um receptor de ativação de uma célula NK (por exemplo, um anti- corpo monoclional anti-KIR, tal como o anticorpo monoclonal DF200, ou um anticorpo monoclional anti-NKp30) a fim de aumentar a eficiência do trata- mento com anticorpos terapêuticos em seres humanos.

Doença Autoimune Uma doença autoimune é uma condição que ocorre quando o sistema imunitário ataca erroneamente e destrói o tecido corporal saudável.

Existem mais de 80 tipos diferentes de distúrbios autoimunes.

Normalmente,

os glóbulos brancos do sistema imunológico ajudam a proteger o organismo de substâncias nocivas, dilatação das de antígenos. Exemplos de antigênios incluem as bactérias, os vírus, toxinas, células cancerígenas no sangue e tecidos ou de outra pessoa, ou espécie. O sistema imune produz anticorpos que destroem estas substâncias nocivas.

No entanto, em pacientes com uma doença autoimune, o siste- ma imunológico não consegue distinguir entre (por exemplo, o tecido saudá- vel e antígenos estranhos) si próprio e o que não é de si próprio. O resultado é uma resposta imune que destrói os tecidos normais do corpo. Esta respos- taé uma reação de hipersensibilidade semelhante à resposta em condições alérgicas. Nas alergias, o sistema imune reage a uma substância fora que é normalmente ignorada. Com distúrbios autoimunes, o sistema imune reage aos tecidos normais do corpo que normalmente seriam ignorados.

O que faz com que o sistema imunológico para não dizer a dife- rença entre os tecidos saudáveis do corpo e antígenos é desconhecido. Uma teoria é que alguns microorganismos (tais como bactérias ou vírus) ou fár- macos podem desencadear algumas destas mudanças, especialmente em pessoas que têm genes que os tornam mais propensos a ter doenças autoi- munes.

Uma doença autoimune pode resultar na destruição de um ou mais tipos de tecidos do corpo, no crescimento anormal de um órgão, e nas alterações na função de órgãos. Uma doença autoimune pode afetar um ou mais órgãos ou tipos de tecidos. Os órgãos e tecidos acometidos por doen- ças autoimunes incluem vasos sanguíneos, tecidos conjuntivos, glândulas endócrinas (por exemplo, tireoide e pâncreas), articulações, músculos, célu- las vermelhas do sangue e pele. Um indivíduo pode ter mais do que um dis- túrbio autoimune ao mesmo tempo.

Os sintomas de um distúrbio autoimune variam de acordo com a doença e localização da resposta imune anormal. Os sintomas mais comuns que ocorrem frequentemente com doenças autoimunes incluem fadiga, febre e um mal-estar geral (mal-estar). Os testes que podem ser feitos para diag- nosticar uma doença autoimune podem incluir: testes de anticorpos antinu-

cleares, testes de auto-anticorpos, CBC, proteína C reativa (PCR), e taxa de sedimentação de eritrócitos (ESR). Os fármacos são frequentemente prescritos tendo a finalidade de controlar ou de diminuir a resposta do sistema imunológico, Eles são fre- quentemente dilataçãodos de fármacos imunossupressores. Tais fármacos podem incluir corticosteroides (como a prednisona) e os fármacos não este- roides como a azatioprina, ciclofosfamida, micofenolato, sirolimus ou tacroli- mus. As complicações são comuns e dependem da doença. Os efei- tos colaterais dos fármacos usados para suprimir o sistema imune podem ser graves, como infecções que podem ser difíceis de controlar."Doenças autoimune."MedlinePlus-EUA National Library of Medicine (19 abril de 2012). Condições inflamatórias A inflamação é parte da resposta biológica complexa de tecidos vasculares a estímulos nocivos, tais como agentes patogênicos, as células danificadas, ou irritantes. A inflamação é uma tentativa de proteção do orga- nismo para remover os estímulos nocivos e para iniciar o processo de cura. Sem a inflamação, as feridas e as infecções nunca vão sarar. Da mesma forma, a destruição progressiva do tecido iria comprometer a sobrevivência do organismo. No entanto, a inflamação crônica também pode levar a uma variedade de doenças, tais como a febre do feno, a periodontite, ateroscle- rose, artrite reumatoide e até mesmo ao câncer (por exemplo, carcinoma da vesícula biliar). É por essa razão que a inflamação é normalmente estreita- mente regulada pelo corpo.

A inflamação pode ser classificada como aguda ou crônica. A in- flamação aguda é a resposta inicial do organismo a estímulos nocivos e é conseguida por meio do aumento da circulação de plasma e leucócitos (es- pecialmente granulócitos) a partir do sangue para os tecidos lesionados. Uma cascata de eventos bioquímicos propaga e amadurece a resposta in- flamatória, que envolve o sistema vascular local, o sistema imunológico, e várias células no interior do tecido lesionado. A inflamação prolongada, co- nhecida como a inflamação crônica, conduz a um deslocamento progressivo do tipo de células presentes no local da inflamação e é caracterizada pela destruição simultânea e cicatrização do tecido a partir do processo inflamató- rio. Kindt, et al. (2006) Immunology Kuby [6th ed.] As células T estão envolvidas na promulgação da inflamação. À diferenciação das células T ingênuas conduz à geração de subconjuntos de células T, cada uma possuindo perfis de expressão de citoquinas distintas para servir as diferentes funções do sistema imunológico. Através da ativa- ção de vias de sinalização distintas, esse processo resulta em duas células T auxiliares diferenciadas (Th), denominadas Th1, Th2 e Th17 e células T reguladoras induzidas, que suprimem as células Th. Estas células diferentes são importantes para combater as doenças infecciosas e cânceres, no en- tanto, quando aberrante, que pode ser responsável por doenças inflamató- rias crônicas. Uma dessas doenças é a doença inflamatória do intestino (IBD), em que cada subconjunto de células T pode ter um papel na doença. Zenewicz, et al. (2009) Trends in Molecular Medicine 15 (5): 199 a 207. Enquanto as células NK têm recebido muita atenção na literatura científica para a sua potencial contribuição para as respostas antitumorais e antiviral, poucos estudos têm sido direcionados para examinar o papel das células NK na inflamação e autoimunidade, em particular nos subconjuntos que expressam KIR2DL1,2 e/ou 3. A abordagem em relação a essas células NK, ou nada, tem sido a de procurar eliminar ou inibir as células NK sobre a base de que elas podem contribuir para a inflamação e autoimunidade. O efeito de potenciação mediada de KIR2DL1, 2 e/ou 3 dda citoxicidade por meio das células NK, em configurações inflamatórias ainda não foi aborda- do Consequentemente, existe uma necessidade na técnica no que diz respeito aos métodos de uso de modulação das células NK para propor- cionar melhor benefício para os pacientes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Nos modelos in vivo (camundongos transgênicos tanto para KIR2DL3 quanto seus ligantes HLA), desenvolvidos especificamente para o estudo humano KIR2DL1, 2 e 3 de bloqueio mostraram que a administração de um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 ou 3 é capaz de induzir as células NK para eficientemente reduzir ou eliminar a concanavalina A (Con A) de blastos. Con A atua principalmente sobre os linfócitos T e os resultados no cresci- mento e divisão de linfócitos e, portanto, tem sido frequentemente usado comoum modelo de inflamação. Os resultados sugerem que, em vez de ten- tar reduzir ou eliminar as células KIR2DL1, 2 e/ou NK 3 positivas na inflama- ção e imunidade, pode ser benéfico potenciar a sua atividade uma vez que elas podem contribuir para a remoção de células T pró-inflamatórias, incluin- do, mas não se limitando a células T na circulação, sem induzir a toxicidade de autorreatividade relacionada.

A presente invenção refere-se aos métodos para o tratamento de um indivíduo com um distúrbio inflamatório ou autoimune. Os métodos podem compreender a administração ao indivíduo de uma quantidade tera- peuticamente ativa de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou3.O indivíduo pode ter uma doença inflamatória ou autoimune mediada por meio das células T, por exemplo, um distúrbio que envolve as células T pró-inflamatórias, ativadas e/ou proliferação (por exemplo, em circulação ou em um tecido doente ou inflamado), células T CD4 +, células T de infiltração, e/ou as células T que expressam o HLA-cw3 e/ou HLA-cw4. Em uma moda- lidade, o indivíduo pode ter uma doença inflamatória ou autoimune selecio- nada a partir do grupo que consiste em lúpus eritematoso sistêmico, granu- lomatose de Wegener, hepatite autoimune, doença de Crohn, esclerodermia, colite ulcerativa, síndrome de Sjôgren, diabetes mellUTIs tipo 1, uveite, mio- cardite, febre reumática, espondilite anquilasante, artrite reumatoide, escle- rose múltipla, e psoríase.

Em uma modalidade, Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 po- dem ser caracterizados com base na sua capacidade para bloquear ou neu- tralizar a inibição de NK mediada por KIR2DL1, 2 e/ou a 3 e assim potenciar a atividade das células NK contra as células alvo bloqueadas de uma outra maneira.

Em uma modalidade, o anticorpo pode ser um único anticorpo anti-KIR ou uma combinação de anticorpos anti-KIR. Em uma outra modali-

dade, o anticorpo pode ser uma combinação de um anticorpo anti-KIR2DL1 e um anticorpo anti-KIR2DL2, ou um anticorpo anti-KIR2DL1 e um anticorpo anti-KIR2DL3, ou um anticorpo anti-KIR2DL1 e um anticorpo anti-KIR2DL2 e um anticorpo anti-KIR2DL3, ou um anticorpo anti-KIR que se liga, pelo me- nos, a dois produtos diferentes de receptores KIR inibidores humanos de genes selecionados a partir do grupo que consiste em KIR2DL1, 2 e/ou 3, ou um anticorpo anti-KIR se liga cada um dos KIR2DL1, 2 e 3, em que o referi- do anticorpo pode ser capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade das células NK em células NK que expressam os Receptores KIR2DL1,2 e/ou3 em particular.

Em uma modalidade, uma quantidade eficaz de um ou mais An- ticorpos KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser uma quantidade de anticorpo tal que resulta na saturação praticamente completa (90%, opcionalmente, 95% da ocupação do receptor) de KIR2DL1, 2 e/ou 3 em células NK por um período de, pelo menos, cerca de | semana, opcionalmente, cerca de 2 semanas, opcionalmente, cerca de 3 semanas, opcionalmente cerca de um mês, após a administração do anticorpo. Em uma modalidade, o anticorpo pode ser administrado em uma quantidade e com uma frequência que resulta na saturação praticamente completa (90%, opcionalmente, 95% de ocupação do receptor) de KIR2DL1, 2 e/ou 3 em células NK por um período de pelo menos cerca de uma sema- na, sem um significativo"de-saturação", durante o período de tratamento. Em uma modalidade, uma quantidade eficaz de um ou mais Anticorpos KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser uma quantidade de anticorpo tal que resulta em saturação substancialmente completa de KIR2DL1, 2 e/ou 3 (90% de ocupa- ção de KIR2DL1, 2 e/ou 3, opcionalmente, 95% de ocupação de KIR2QDL1,2 e/ou 3) circulando em células NK por um período de, pelo menos, cerca de 2 semanas, opcionalmente, cerca de 3 semanas, opcionalmente cerca de um mês, após a administração do anticorpo, e o anticorpo pode ser administrado emdosesde menos duas vezes, qual a dosagem ocorre cerca de uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada 3 semanas, ou uma vez por mês (do- ses subsequentes estão separados por cerca de 2 semanas, três semanas ou um mês).

Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser doseado em quantidade e com uma frequência que resulta na saturação praticamente completa (90%, opcionalmente, 95% de ocupação do receptor) deKIR2DL1,2 e/3 ou sobre as células NK por um período de, pelo menos, cerca de | semana, e que permite uma significativa"des-saturação", durante o período de tratamento. Em uma modalidade, uma quantidade eficaz de um ou mais Anticorpos KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser uma quantidade de anticor- po tal que resulta em saturação substancialmente completa KIR2DL1, 2 e/ou 3(90% de ocupação de KIR2DL1,2 e/ou 3, opcionalmente, 95% de ocupa- ção de KIR2DL1, 2 e/ou 3) circulando em células NK por um período de, pe- lo menos, cerca de 2 semanas, opcionalmente, cerca de 3 semanas, opcio- nalmente cerca de um mês, após a administração do anticorpo, e o anticorpo pode ser administrado em doses de menos duas vezes, qual a dosagem o- corre cerca de uma vez a cada dois meses (doses subsequentes estão se- parados por cerca de dois meses).

Em uma modalidade, um método para a produção de um anti- corpo pode incluir: (a) imunização de um mamífero não humano com um imunogênio que compreende um polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3, (b) sele- ção de anticorpos do referido mamífero, em que imunizados os referidOs anticorpos se ligam ao referido polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3, e (c) sele- cionar anticorpos de (b), que potenciam a eliminação de células T, CD4 + ativadas em particular as células T das células NK. Em uma outra modalida- de, um anticorpo selecionado na etapa (c) pode ser determinado para ser apropriado para o tratamento de um distúrbio inflamatório ou autoimune. Em uma outra modalidade, o método de produção de um anticorpo pode com- preender proporcionar uma biblioteca de anticorpos, opcionalmente, por meio de técnicas de exibição em fagos. Em uma modalidade, um método para a produção de um anticorpo compreende: (a) proporcionar uma biblio- teca de anticorpos por meio das técnicas de exibição em fagos, (b) seleção de anticorpos a partir da referida biblioteca, em que os referidos anticorpos se ligam ao referido polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3, e (c) selecionar anticor-

pos de (b), que potenciam a eliminação de células T, CD4 + ativados em particular as células T das células NK. Preferencialmente, um anticorpo se- lecionado na etapa (c) será determinado para ser apropriado para o trata- mento de um distúrbio inflamatório ou autoimune.

Em uma modalidade, um método para reduzir ou eliminar uma célula T in vitro ou in vivo, pode compreender o contato de uma célula T com um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3, na presença de células (por exemplo, células NK) que expressam um polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, as células T podem ser célu- lasT das células T pró-inflamatórias, ativadas e/ou proliferação, células T CDA4 +, células T de infiltração, e/ou que expressam HLA-cw3 e/ou HLA-cw4.

Em uma modalidade, um método para a redução ou eliminação de células T in vivo, pode compreender a administração a um indivíduo com um distúrbio inflamatório ou autoimune, de preferência uma doença mediada pelomenos em parte, por meio das referidas células T, uma quantidade efi- caz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, as células T podem ser células T ativadas e/ou de proliferação, células T CD4 +, células T pró-inflamatórias (por exemplo, na circulação ou em um tecido doente ou inflamado), = as células T que ex- pressam HLA-cw3 e/ou HLA-cw4 ou células T de infiltração. Em uma outra modalidade, as células T de infiltração podem infiltrar tecidos doentes inclu- indo, mas não limitado a tecidos sinovial ou fluido sinovial, no sistema nervo- so central, do cólon, ou do tecido dérmico. Em uma modalidade, um método para a redução ou eliminação de células T, que compreende a administração aumindivíduo tendo uma doença inflamatória autoimune ou de uma quanti- dade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2QDL1, 2 e/ou 3.

Em uma outra modalidade, as referidas células T são células T ativadas e/ou de proliferação, células T CD4 +, células T pró-inflamatórias (por exemplo, na circulação ou em um tecido doente ou inflamado), células T de infiltração (infiltração de tecidos patológicos, por exemplo, sinovial tecidos ou fluido Ssinovial, no sistema nervoso central, do cólon, o tecido dérmico), e/ou as células T que expressam o HLA-cw3 e/ou HLA-cw4. Em um outro enqua-

dramento, o referido paciente pode ter uma doença mediada pelo menos em parte, por meio das referidas células T. Em uma outra modalidade, uma quantidade eficaz pode ser uma quantidade de um composto que inibe um polipetídeo eficaz KIR2QDL1, 2 e/ou 3 para reduzir o número das referidas célulasT.

Em uma modalidade, um método para a células T ativadas e/ou de proliferação pode compreender a administração a um indivíduo com um distúrbio inflamatório ou autoimune, de preferência uma doença mediada pelo menos em parte, por meio das referidas células T, uma quantidade efi- cazde um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, um método para a redução ou eliminação de células T CD4 +, células T, que compreende a administração a um indivíduo tendo uma doença inflamatória ou autoimune, de preferência uma doença mediada pelo menos em parte, por meio das referidas células T, uma quantidade efi- cazde um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, um método para células T pró-inflamatórias (por exemplo, em circulação ou em um tecido doente ou inflamado) pode compreender a administração a um indivíduo com um distúrbio inflamatório ou autoimune, de preferência uma doença mediada pelo menos em parte, por meio das referidas células T, uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, um método para a redução ou eliminação de células T de infiltração (infiltração de tecidos pato- lógicos, por exemplo tecidos sinovial ou fluido sinovial, no sistema, o cólon, o tecido dérmico nervoso central) pode compreender a administração a um indivíduo com um distúrbio inflamatório ou autoimune, de preferência uma doença mediada pelo menos em parte, por meio das referidas células T, uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, o referido composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 é um anticorpo, um fragmento de anti- corpo, um peptídeo, um glicoalcoide, um ácido nucleico antissentido, uma ribozima, um retinoide, um avemir, uma molécula pequena, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o referido composto é um anticorpo quimérico, humanizado, anti-idiotípico, da cadeia simples, bi- funcional, ou co-específico ou um fragmento de anticorpo dos mesmos. Em uma modalidade, um método para a redução ou eliminação das células T que expressam o HLA-cw3 e/ou HLA-cw4, pode compreender a administração a um indivíduo com um distúrbio inflamatório ou autoimune, de preferência uma doença mediada pelo menos em parte pela referida T células, uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, o referido composto que inibe um Polipetídeo de KIR2QDL1, 2 e/ou 3 é um anticorpo, um fragmento de anti- corpo, um peptídeo, um glicoalcoide, um ácido nucleico antissentido, uma ribozima, um retinoide, um avemir, uma molécula pequena, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o referido composto é um anticorpo quimérico, humanizado, anti-idiotípico, da cadeia simples, bi- funcional, ou co-específico ou um fragmento de anticorpo dos mesmos.

Em uma outra modalidade, o referido composto que inibe um Polipetídeo de KIR2QDL1, 2 e/ou 3 é um anticorpo, um fragmento de anticor- po, um peptídeo, um glicoalcoide, um ácido nucleico antissentido, uma ribo- zima, um retinoide, um avemir, um molécula pequena, ou qualquer combina- ção dos mesmos. Em uma outra modalidade, o referido composto é um anti- corpo quimérico, humanizado, anti-idiotípico, da cadeia simples, bifuncional, ou co-específico ou um fragmento de anticorpo dos mesmos.

Em uma outra modalidade, o referido composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 é um anticorpo, um fragmento de anticor- po, um peptídeo, um glicoalcoide, um ácido nucleico antissentido, uma ribo- zima,umretinoide, um avemir, um molécula pequena, ou qualquer combina- ção dos mesmos. Em uma outra modalidade, o referido composto é um anti- corpo quimérico, humanizado, anti-idiotípico, da cadeia simples, bifuncional, ou co-específico ou um fragmento de anticorpo dos mesmos.

Em uma modalidade, um método para tratar um distúrbio infla- —matório compreende: (a) determinar se um indivíduo tem um distúrbio infla- matório ou autoimune, e (b), se o indivíduo tem um distúrbio inflamatório ou autoimune, tratamento do indivíduo com uma eficaz quantidade de um com-

posto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modali- dade, um método para o tratamento de uma doença autoimune é constituído por: (a) determinar se um indivíduo tem um distúrbio inflamatório ou autoi- mune, e (b), se o indivíduo tem um distúrbio inflamatório ou autoimune, tra- tamento do indivíduo com uma quantidade eficaz de um composto que inibe o Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, o referido composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um peptídeo, um glicoalcoide, um ácido nucleico antissentido, uma ribozima, um retinoide, um avemir, uma molécula peque- na, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o re- ferido composto é um anticorpo quimérico, humanizado, anti-idiotípico, da cadeia simples, bifuncional, ou co-específico ou um fragmento de anticorpo dos mesmos.

Em uma modalidade, um método para tratar um distúrbio infla- matório compreende: (a) determinar se um indivíduo tem um distúrbio infla- matório mediado, pelo menos em parte, por meio das células T, por exem- plo, as células T pró-inflamatórias, ativadas e/ou de proliferação (por exem- plo, em circulação ou em um tecido doente ou inflamado), células T CDA4 +, células T de infiltração, e/ou as células T que expressam o HLA-cw3 e/ou HLA-cw4, e (b), se o indivíduo tem um distúrbio inflamatório mediado pelo menos, em parte, por meio das referidas células T, tratando o indivíduo com uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, o referido composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 é um anticorpo, um fragmento de anti- corpo, um peptídeo, um glicoalcoide, um ácido nucleico antissentido, uma ribozima, um retinoide, um avemir, uma molécula pequena, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o referido composto é um anticorpo quimérico, humanizado, anti-idiotípico, da cadeia simples, bi- funcional, ou co-específico ou um fragmento de anticorpo dos mesmos. Em uma modalidade, um método para o tratamento de uma do- ença autoimune é constUTlído por: (a) determinar se um indivíduo tem um distúrbio autoimune mediado pelo menos em parte, por meio das células T,

por exemplo, as células T pró-inflamatórias, ativadas e/ou de proliferação (por exemplo, em circulação ou em um tecido doente ou inflamado), células T CD4 +, células T de infiltração, e/ou as células T que expressam o HLA- cw3 e/ou HLA-cw4, e (b), se o indivíduo tem um distúrbio autoimune media- do pelomenos, em parte, por meio das referidas células T, tratando o indiví- duo com uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, o referido composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um peptídeo, um glicoalcoide, um ácido nucleico antissentido, uma ribozima, um retinoide, um avemir, uma molécula pequena, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em uma outra modalidade, o referido composto é um anticorpo quimérico, humanizado, anti-idiotípico, da cadeia simples, bi-

funcional, ou co-específico ou um fragmento de anticorpo dos mesmos.

Em uma modalidade, um método para o tratamento de uma do- ença inflamatória em um indivíduo compreende: (a) avaliar a presença, fase e/ou a evolução da doença inflamatória em um indivíduo, e (b) administrar ao referido indivíduo uma dose eficaz de um composto que inibe um Polipe- tídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Opcionalmente, a avaliação da presença, fase e/ou a evolução da doença em um indivíduo compreende analisar os níveis de autoanticorpos, PCR, ou qualquer enzima proteolítica, mediador inflama- tório ou marcador de inflamação em curso.

Se o referido indivíduo é deter- minado para ser apropriado para o tratamento com um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 (por exemplo, o indivíduo sofre de ar- trite, uma exacerbação), a administração ao referido indivíduo de uma dose eficaz deum composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, o referido composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um peptídeo, um glicoalcoide, um ácido nucleico antissentido, uma ribozima, um retinoide, um avemir, uma molécula pequena, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em uma outra modalidade, o referido composto é um anticorpo quimérico, humanizado, anti-idiotípico, da cadeia simples, bifuncional, ou co-específico ou um fragmento de anticorpo dos mesmos.

Em uma modalidade, um método para o tratamento de uma do- ença autoimune em um indivíduo, pode compreender: (a) avaliar a presença, fase e/ou a evolução da doença autoimune em um indivíduo, e (b) adminis- trar ao referido indivíduo uma dose eficaz de um composto que inibe um Po- lipetíideo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Opcionalmente, a avaliação da presença, fase e/ou a evolução da doença em um indivíduo compreende analisar os níveis de auto-anticorpos, PCR, ou qualquer enzima proteolítica, mediador inflamatório ou marcador de inflamação em curso. Se o referido indivíduo é determinado para ser apropriado para o tratamento com um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 (por exemplo, o indivíduo sofre de artrite, uma exacerbação), a administração ao referido indivíduo de uma dose eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, o referido composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um peptídeo, um dglicoalcoide, um ácido nucleico antissentido, uma ribozima, um retinoide, um avemir, uma molécula pequena, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o referido composto é um anticorpo quimérico, humanizado, anti-idiotípico, da cadeia simples, bifuncional, ou co-específico ou um fragmento de anticorpo dos mesmos.

Em uma modalidade, um método para o tratamento de uma do- ença inflamatória em um indivíduo compreende: (a) determinar se o referido indivíduo tem uma doença inflamatória estabelecida, e (b), se o referido indi- víduo tem uma doença inflamatória estabelecida, a administração ao referido paciente uma dose eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1,2 e/ou 3. Em uma modalidade, um método para o tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo, compreende: (a) determinar se o referido indivíduo tem um distúrbio autoimune estabelecido, e (b), se o refe- rido indivíduo tem um distúrbio autoimune estabelecido, a administração ao referido paciente de uma dose eficaz de um composto que inibe um Polipetí- deode KIR2DL1,2 e/ou3. Em uma modalidade, o referido composto é um agente anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Em uma modalidade, um método para o tratamento de uma do-

ença inflamatória em um indivíduo compreende: (a) determinar se o referido indivíduo tem uma doença inflamatória estabelecida, e (b), se o referido indi- víduo tem uma doença inflamatória estabelecida, a administração ao referido paciente uma dose eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1,2 e/ou3.Em uma modalidade, um método para o tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo, compreende: (a) determinar se o referido indivíduo tem um distúrbio autoimune estabelecido, e (b), se o refe- rido indivíduo tem um distúrbio autoimune estabelecido, a administração ao referido paciente de uma dose eficaz de um composto que inibe um Polipetí- deode KIR2DL1,2 e/ou 3. Em uma modalidade, o referido composto é um agente anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Em uma modalidade, um método para o tratamento de uma do- ença inflamatória em um indivíduo compreende (a) determinar se o referido indivíduo está experimentando um ataque, crise, exacerbação ou alarga- mento de uma doença inflamatória, e (b), se o referido indivíduo experimenta um ataque, crise, exacerbação ou alargamento de uma doença inflamatória, a administração ao referido indivíduo de uma dose eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, o refe- rido composto é um agente anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma mo- dalidade, um método para o tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo, compreende: (a) determinar se o referido indivíduo está experi- mentando um ataque, crise, exacerbação ou alargamento de uma doença autoimune, e (b), se o referido indivíduo experimenta um ataque, crise, exa- cerbação ou alargamento de uma doença autoimune, a administração ao referido indivíduo de uma dose eficaz de um composto que inibe um Polipe- tídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, o referido composto é um agente anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Em uma modalidade, um método para o tratamento de uma do- ença inflamatória em um indivíduo compreende (a) determinar se o referido indivíduo tem uma doença inflamatória, caracterizada pela presença de célu- las T, e (b), se o referido indivíduo tem uma doença inflamatória caracteriza- do pela presença das referidas células T, a administração ao referido pacien-

te de uma dose eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, as referidas células T podem ser células T ativadas e/ou de proliferação, células T CD4 +, células T pró- inflamatórias, as células T de infiltração, e/ou as células T que expressam o HLA-cw3ô3 e/ou HLA-cw4. Em uma modalidade, o referido composto é um agente anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, um método para o tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo, compreende: (a) determinar se o referido indivíduo sofre de doença autoimune caracteri- za-se pela presença de células T, e (b), se o referido indivíduo tem um dis- túrbio autoimune caracterizado pela presença de que as referidas células T, a administração ao referido paciente de uma dose eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, as referidas células T podem ser células T ativadas e/ou de proliferação, cé- lulas T CD4 +, células T pró-inflamatórias, as células T de infiltração, e/ou as células T que expressam o HLA-cw3 e/ou HLA-cw4. Em uma modalidade, o referido composto é um agente anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Em uma modalidade, um método para o tratamento de um indi- víduo que tem uma doença inflamatória, particularmente uma doença infla- matória estabelecida, ou experimentar um ataque, crise, exacerbação ou alargamento de uma doença inflamatória, compreende a administração ao indivíduo de um composto que inibe KIR2QDL1 um, dois e/ou três polipetídeo. Em uma modalidade, um método para o tratamento de um indivíduo com uma doença autoimune, particularmente um distúrbio autoimune estabeleci- do, ou experimentar um ataque, crise, exacerbação ou alargamento de uma doença autoimune, que compreende a administração ao indivíduo de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modali- dade, o referido composto é um agente anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Em uma modalidade, um método para o tratamento de uma do- ença inflamatória pode compreender a administração de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, o referido composto é um agente anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalida- de, um método para o tratamento de uma doença autoimune pode compre-

ender a administração de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, o referido composto é um agente anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, um método de tratamento de um indivíduo pode compreender: (a) determinar se um indivíduo tem um distúrbio inflama- tório ou autoimune, e (b), se o indivíduo tem um distúrbio inflamatório ou au- toimune, tratamento do indivíduo com uma eficaz quantidade de um compos- to que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, um método de tratamento de um indivíduo pode compreender: (a) determinar se um indivíduo tem um distúrbio inflama- tório ou autoimune mediado pelo menos em parte, por meio das células T, e (b), se o indivíduo tem um distúrbio inflamatório ou autoimune mediado, pelo menos em parte, por meio das referidas células T, o tratamento do indivíduo com uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1,2e/ou3.

Em uma modalidade, um método de tratamento de um indivíduo pode compreender: (a) avaliar a presença, fase e/ou a evolução da doença inflamatória ou autoimune em um indivíduo, e (b) administrar ao referido in- divíduo de uma dose eficaz de um um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1,2e/ou3.

Em uma modalidade, um método de tratamento de um indivíduo pode compreender: (a) determinar se o referido indivíduo tem uma doença inflamatória ou autoimune estabelecida, e (b), se o referido indivíduo tem uma doença inflamatória ou autoimune estabelecida, a administração ao re- ferido paciente uma dose eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Em uma modalidade, um método de tratamento de um indivíduo pode compreender: (a) determinar se o referido indivíduo está experimen- tando um ataque, crise, exacerbação ou alargamento de uma doença infla- —matóriaou autoimune, e (b), se o referido indivíduo experimenta um ataque, crise, exacerbação ou alargamento de uma doença inflamatória ou autoimu- ne, a administração ao referido indivíduo de uma dose eficaz de um compos-

to que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, o composto que inibe um Polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3 é administrado como uma monoterapia, ou seja, usado no tratamento como um agente único, Por exemplo, o fármaco que compre- endeo composto que inibe um Polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3 é isento de quaisquer outros agentes Farmaceuticamente ativos e/ou sem agentes Far- maceuticamente ativos adicionais são usados para tratar o indivíduo para o estado de doença em particular. Nos métodos in vitro, o composto que inibe um Polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser usado sem a adição ou a pre- —sença de outros agentes ativos.

Em uma modalidade dos métodos da presente invenção, os compostos que inibem um tratamento de Polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado em combinação com, por exemplo, antes, concomi- tantemente com, ou depois, um segundo agente terapêutico.

Em uma modalidade, o composto que inibe um Polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado em combinação com um segundo agente terapêutico, opcionalmente, qualquer agente normalmente usado no contexto da patologia da doença em particular. De preferência, o segundo agente pode ser um agente que não seja um anticorpo terapêutico que in- duz, através ADCC, a morte de uma célula que expressa um antigênio ao qual se liga ao segundo agente. De preferência, o segundo agente terapêuti- co pode ser um agente que não seja um anticorpo possuindo um isotipo I9G1 ou IgG3, cujo modo de ação envolve a indução de ADCC para uma célula à qual o anticorpo se liga. Em uma modalidade, o segundo agente pode ser um anticorpo possuindo uma região constante de IgG4 de isotipo ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, Fab ou F (ab) '2 do fragmento). Em uma modalidade, o segundo agente pode ser um anticorpo ligado a uma porção citotóxica. Em uma modalidade, o segundo agente pode ser um poli- petídeo não-anticorpo. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico pode ser um agente de molécula pequena sintética. Em uma outra modali- dade, o segundo agente terapêutico pode ser um agente quimioterapêutico de molécula pequena. Ainda em uma outra modalidade, o segundo agente terapêutico pode ser um DMARD.

Em uma outra modalidade, o segundo agente terapêutico é .... Opcionalmente, em quaisquer processos de tratamento, os mé- todos podem ainda compreender a administração ao indivíduo de um —DMARD.Em uma modalidade, pode ser fornecido um método de tratamento de um indivíduo em que uma doença autoimune ou inflamatória pode com- preender a administração ao indivíduo de (a) uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3, e (b) um DMARD.

De preferência, o composto inibe um polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou3e modula a citotoxicidade de células NK como um resultado da inibi- ção de um referido Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. De preferência, o composto compreende um anticorpo que se liga a um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, um método para determinar a adequação dotratamento com um composto que inibe um Polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3 para um paciente, compreende a determinação se o referido paciente tem uma doença inflamatória estabelecida, se o referido paciente pode experi- mentar um ataque, crise, exacerbação ou dilatação, e/ou se o referido paci- ente tem uma doença que se caracteriza pela presença de células T, por exemplo, ativados e/ou proliferação de células T, células T CD4 +, células T pró-inflamatórias, as células T de infiltração, e/ou as células T que expres- sam o HLA-cw3 e/ou HLA-cw4. Em uma modalidade, um método para de- terminar a adequação do tratamento com um composto que inibe um Poli- peptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3 para um paciente, compreende a determinação seoreferido paciente tem uma doença inflamatória estabelecida, se o referi- do paciente pode experimentar um ataque, crise, exacerbação ou dilatação, e/ou se o referido paciente tem uma doença que se caracteriza pela presen- ça de células T, por exemplo, ativados e/ou proliferação de células T, células T CD4 +, células T pró-inflamatórias, as células T de infiltração, e/ou As cé- lulasT que expressam o HLA-cw3 e/ou HLA-cw4. Em uma modalidade, um método para o tratamento de uma do- ença autoimune pode compreender a administração de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, o referido composto é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um peptídeo, um glicoalcoide, um ácido nucleico antissentido, uma ribozima, um retinoide, um avemir, uma molécula pequena, ou qualquer combinação dos mesmos.

Emuma outra modalidade, o composto é um agente anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, o indivíduo tem de ter um distúrbio autoimune mediado por meio das células T. Em uma outra modalidade, a doença auto- imune é Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), atrofia espênica adquirida, uveíte anterior aguda, encefalomielite aguda disseminada (A- DEM), artrite gotosa aguda, leucoencefalite hemorrágica necrosante aguda, sinusite aguda ou crônica, meningite purulenta aguda (ou outros distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central), inflamação grave aguda, doença de Addison, adrenalite, adulto aparecimento de diabetes mellUTIs em adul- tos (diabetes Tipo 1I), hipoparatiroidismo idiopático adulto (AOIH), Agama- globulinemia, agranulocitose, vasculite, incluindo vasculite (incluindo vasculi- te de grandes vasos (incluindo polimialgia reumática e artrite de célula gigan- te (de Takayasu)), condições alérgicas, dermatite de contato alérgico, der- matite alérgica, alergia angiite granulomatosa, doenças alérgicas de hiper- sensibilidade, neurite alérgica, reação alérgica, alopecia areata, alopecia totalis, síndrome de Alport, alveolite (por exemplo, alveolite alérgica e alveoli- te fibrosante), doença de Alzheimer, amilaidose, esclerose amilatrófica late- ral (ALS, doença de Lou Gehrig), um distúrbio relacionado com a eosinofilia (por exemplo, eosinofilia), anafilaxia, espondilite anquilasante, antgiectasis, nefrite mediada por anticorpos, Nefrite Anti-GBM/Anti-TBM, doenças media- das por meio do complexo antígeno-anticorpo, doença da membrana com base antiglomerular, a síndrome do anticorpo antifosfolipídeo, síndrome de antifosfolipídeo (APS), aftas, estomatite aftosa, anemia aplástica, arritmia, aterosclerose, doenças arterioscleróticas, a artrite (por exemplo, artrite reu- matoide, como artrite aguda, artrite reumatoide crônica), artrite crônica pro- gressiva, artrite deformante, ascaridíase, aspergilama (ou granulomas con- tendo eosinófilas), aspergilase, aspermiogenese, asma (por exemplo asma brônquica, asma brônquica, e asma autoimune), ataxia telangiectasia, escle-

rose atáxica, aterosclerose, autismo, angioedema autoimune, anemia aplás-

tica autoimune, gastrite atrófica autoimune, diabetes autoimune, doença au- toimune do testículo e ovário, incluindo ooforite e orquite autoimune, distúr-

bios autoimunes, associadas com doenças do colagênio, disautonomia auto-

imune, doença autoimune do ouvido (por exemplo, doença autoimune do ouvido interno (envelhecidos)), doenças endócrinas autoimunes incluindo tiroidite como tiroidite autoimune, síndrome autoimune enteropatia, insufici- ência gonadal autoimune, a perda auditiva autoimune, hemólise autoimune, hepatite autoimune, doença autoimune de hepatologia, hiperlipidemia autoi-

—mune, doença autoimune, imunodeficiência autoimune da orelha interna (Al- ED), miocardite autoimune, neutropenia autoimune, pancreatite autoimune, Poliendocrinopatias autoimunes, síndrome poliglandular autoimune do tipo |, retinopatia autoimune, trombocitopênica púrpura autoimune (ATP), doença autoimune da tiroide, urticária autoimune, doenças gastrointestinais media-

das autoimune, neuropatias axonais e neuronais, doença de Balo, doença de Behçet, dano de reperfusão de isquemia benigna e familiar, angiite linfo- cítica benigna, a doença de Berger (nefropatia por IgA), pulmão de pássaro apreciador, cegueira, doença de Boeck, bronquiolite obliterante (sem trans- plante) vs NSIP, bronquite, aspergilase broncopneumônica, síndrome de

Bruton, penfigoide bolhoso, síndrome de Caplan, Cardiomiopatia, isquemia cardiovascular, síndrome de Castleman, doença celíaca, doença celíaca (en- teropatia de glúten), degeneração cerebelar, isquemia cerebral e doenças de vascularização acompanhante, doença de Chagas, canalopatias (por exem-

plo, epilepsia), canalopatias do SNC, coriorretinite, coroireferide, distúrbio hematológico autoimune, hepatite crônica ativa ou a hepatite crônica ativa autoimune, dermatite de contato crônica, pneumonia eosinofílica crônica, síndrome da fadiga crônica, hepatite crônica, pneumonite por hipersensibili- dade crônica, artrite inflamatória crônica, polineuropatia desmielinizante in- flamatória crônica (CIDP), inflamação intratável crônica, candidíase mucocu-

tânea crônica, neuropatia crônica (por exemplo, polineuropatias IgM ou neu- ropatia mediada por IgM), doença obstrutiva crônica das vias aéreas, doença inflamatória pulmonar crônica, ostomielite multifocal crônica recorrente (CR-

MO), tiroidite crônica (tiroidite de Hashimoto) ou tiroidite subaguda, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial/penfigoide benigna mucosal, doen-

ças inflamatórias do SNC, vasculite do SNC, doença celíaca, síndrome Co- gans, doença de aglutinina fria, poliposa colite, colite, tais como colite ulcera-

tiva, colite ulcerosa, colite colagenosa, condições que envolvem células T de infiltração e respostas inflamatórias crônicas, bloqueio cardíaco congênito, infecção da rubéola congênita, anemia Coombs positiva, doença arterial co- ronariana, Coxsackie miocardite, síndrome CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud), doença de Crohn, crioglobulinemia, síndrome de Cushing, ciclite

(por exemplo, ciclite crônica, heterocrônico ciclite, iridociíclite, ou ciclite de Fuchs), fibrose cística, a toxicidade induzida por citocinas, surdez, artrite de- generativa, doenças desmielinizantes (por exemplo, doenças autoimunes desmielinizantes), neuropatias desmielinizantes, dengue, dermatite herpeti- forme e dermatite atópica, dermatite, incluindo dermatite de contato, derma-

tomiosite, dermatoses com componentes inflamatórias agudas, doença de Devic (neuromielite óptica), transtorno diabético artéria grande, nefropatia diabética, retinopatia diabética, anemia Diamond Blackfan, fibrose pulmonar intersticial difusa, cardiomiopatia dilatada, lúpus discoide, doenças envol- vendo a diapedese de leucócitos, síndrome de Dressler, contratura de Du-

puytren, a infecção ecovirus, eczema incluindo eczema alérgico ou atópico, encefalite, como a encefalite de Rasmussen e encefalite límbica e/ou do tronco encefálico, encefalomielite (por exemplo, encefalomielite alérgica e encefalomielite alérgica experimental (EAE)), hiperplasia endarterial, endo- carreferide, oftalmotia endócrina, endometrioses, endomiocardiofibrose, en-

doftalmia facoanafilática, endoftalmite, enterite allergica, síndrome de eosi- nofilia-mialgia, eosinofílica faciitis, ceratoconjuntivite epidêmica, Epidermólise bolhosa adquirida (EBA), episclera, episclerite infecção pelo vírus Epstein- Barr, Eritema elevada et diutinum, eritema multiforme, eritema nodoso han- sênico, eritema nodoso, eritroblastose fetal, dismotilidade do esôfago, crio-

— globulinemia mista essencial, etmoide, síndrome de Evan, encefalomielite alérgica Experimental (EAE), deficiência de Fator VIII, pulmão do fazendeiro, febre reumática, síndrome de Felty, fibromialgia, alveolite fibrosante, flaria-

sis, gomeruloesclerose segmentar e focal (FSGS), intoxicação alimentar, frontal, atrofia gástrica, artrite de células gigantes (artrite temporal), hepatite de células gigantes, polimialgia de células gigantes, glomerulonefrites, glo- merulonefrite (GN) com e sem síndrome nefrótica, como glomerulonefrite crônica ou aguda (por exemplo, GN primária), síndrome de Goodpasture, artrite gotosa, síndromes associada à transfusão de granulócitos, granulo- matose incluindo granulomatose linfomatoide, granulomatose com poliangiite (GPA), uveite granulomatosa, doença de Graves, síndrome de Guillain- Barre, psoríase gutatte, hemoglobinúria paroxismática, doença de Hamman-

Rich, doença de Hashimoto, encefalite de Hashimoto, tiroireferide de Hashi- moto, hemocromatose, anemia hemolítica ou anemia hemolítica imune, in- cluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), anemia hemolítica, hemofilia A, púrpura de Henoch-Schônlein, herpes gestacional, vírus da imunodeficiência humana (HIV), hiperalgesia, hipogamaglobulinemia, hipogonadismo, hipopa-

ratireoidismo, diabetes insipidus idiopática, paralisia facial idiopática, hipoti- reoidismo idiopática, púrpura nefropatia por IgA, nefropatia membranosa idi- opática ou GN membranosa idiopática, síndrome nefrótica idiopática, fibrose pulmonar idiopática, sprue idiopática, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), nefropatia por IgA, doenças mediadas por IgE (por exemplo: anafilaxia erinite alérgica e atópica), doença relacionada com esclerosante IgGA4, ileite regionalis, nefrite do complexo imune, as respostas imunitáriassociadas à hipersensibilidade mediada aguda e tardia por citocinas e linfócitos T, GN imune-mediada, lipoproteínas imunorreguladoras, incluindo síndrome da an- gústia respiratória adulta ou aguda (ARDS), miosite de corpos de inclusão,

artrite infecciosa, a infertilidade devido aOs anticorpos antiespermatozoanos, inflamação de toda ou parte da úvea, doença inflamatória do intestino (IBD) doenças inflamatórias hiperproliferativas da pele, miopatia inflamatória, dia- betes idependente de nsulina (tipo 1), insulite, cistite intersticial, doença pul- monar intersticial, fibrose pulmonar intersticial, irite, distúrbio de re-perfusão isquêmica, inflamação das articulações, artrite juvenil, dermatomiosite juve- nil, diabetes juvenil, com início na juventude (Tipo |), diabetes mellUTIs, in- cluindo diabetes mellUTIs dependente de insulina pediátrica (IDDM), apare-

cimento da artrite reumatoide juvenil, síndrome de Kawasaki, ceratoconjunti-

vite seca, kypanosomiasis, síndrome de Lambert-Eaton, leishmaniose, lepra, leucopenia, deficiência de adesão de leucócitos, vasculite leucocitoclástica, leucopenia, líquen plano, líquen escleroso, conjuntivite lenhosa, dermatose

—porlgA linear, Linear doença IgA (LAD), síndrome de Loffler, hepatite lúpica, lúpus (incluindo nefrite, cerebrite, pediátrica, não renal, extra-renal, discoide, alopecia), Lúpus (SLE), o lúpus disseminado eritematoso, artrite de Lyme, doença de Lyme, pneumonite intersticial linfoide, malária, infertilidade autoi- mune macho e fêmea, maxilar, vasculite meio navio (incluindo a doença de

Kawasaki e poliartrite nodosa), GN proliferativa membrana ou membranosa (MPGN), incluindo Tipo | e Tipo Il, e rapidamente GN progressiva, GN mem- branosa (nefropatia membranosa), doença de Méniêre, meningite, colite mi- croscópica, poliangeíte microscópica, enxaqueca, alteração nefropatia míni-

ma, doença mista do tecido conjuntivo (MCTD), mononucleose infecciosa,

úlcerade Mooren, doença de Mucha-Habermann, neuropatia motora multifo- cal, insuficiência endócrina múltipla, síndrome da lesão de múltiplos órgãos,

tais como aqueles secundários a septicemia, trauma ou hemorragia, síndro-

me de lesão de múltiplos órgãos, esclerose múltipla (MS), tal como espino-

MS óptica, esclerose múltipla, papeira, distúrbios musculares, tais como a miastenia grave timoma associada à miastenia grave, miastenia grave, mio- cardite, miosite, narcolepsia, enterocolite necrosante, e colite transmural e doença intestinal inflamatória autoimune, necrosante, cutânea ou vasculite de hipersensibilidade, síndrome neonatal lúpus (NLE), nefrose, síndrome nefrótica, doença neurológica, neuromielite óptica (do Devic), neuromielite óptica, neuromiotonia, neutropenia, linfocitose não cancerosos, uveíte non- granulomatous, timoma não-malignas, distúrbios inflamatórios orbitais e ocu- lares, penfigoide cicatricial ocular, ooforite, oftalmia simfática, síndrome op- soclonus myoclonus (OMS), síndrome opsoclonus ou opsoclonus myoclonus (OMS) e neuropatia sensorial, neurite óptica, orquite granulomatosa, artrose,

reumatismo palíndromo, pancreatite, pancitopenia, PANDAS (Distúrbios neu- ropsiquiátricos autoimune pediátricos associados com Streptococcus), dege- neração cerebelar paraneoplásica, síndrome paraneoplásica, síndromes pa-

raneoplásicas, incluindo síndromes paraneoplásicas neurológicas (por e- xemplo, síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou síndrome Eaton- Lambert), doenças parasitárias, tais como Lesihmania, hemoglobinúria paro- xística noturna (PNH), síndrome de Parry Romberg, pars planitis (uveíite peri-

férica), síndrome Parsonnage-Turner, parvovirose, penfigoide como penfi- goide penfigoide bolhoso e pele, pênfigo (incluindo pênfigo vulgaris), pênfigo eritematoso, pênfigo foliáceo, membrana penfigoide do muco pênfigo, pênfi-

go, úlcera péptica, paralisia periódica, neuropatia periférica, perivenosa en- cefalomielite, anemia perniciosa (anemia perniciosa), anemia perniciosa,

uveite facoantigênica, pneumonocirrose, síndrome POEMS, poliartrite nodo- sa, poliartrite crônica primária do tipo |, Il, e Ill, policondrite (por exemplo, policondrite refratária ou recorrente), doenças autoimunes poliendócrinas, insuficiência poliendócrina, síndromes poliglandulares (por exemplo, síndro-

mes poliglandulares autoimunes (ou síndromes de endocrinopatia poliglan-

dular)), polimialgia reumática, polimiosite, polimiosite/dermatomiosite, poli- neuropatias, poliradiculite acuta, síndrome pós-cardiotomia, uveíte posterior,

ou uveite autoimune, síndrome de infarto pós-miocárdio, síndrome pós, nefri-

te pós-estreptocócica, síndromes pós-vacinação, demência pré-senil, cirrose biliar primária, hipotireoidismo primário, mixedema idiopática primária, linfoci-

tose primário, que inclui linfocitose monoclonal de células B (por exemplo, gamopatia monoclonal benigna e gmRNAopatia monoclonal de significado indeterminado, MGUS), mixedema principal, MS progressiva primária (PPMS) e recidivante remitente (RRMS), colangite esclerosante primária, progesterona dermatite, esclerose sistêmica progressiva, artrite proliferativa,

psoríase, como a psoríase em placas, psoríase, artrite psoriática, Proteinose alveolar pulmonar, infiltração eosinofilia, anemia de células vermelhas pul- monar ou aplasia pura (AEP), aplasia pura de glóbulos vermelhos, purulenta ou sinusite não purulenta, psoríase pustulosa e psoríase das unhas, pielitis, pioderma gangrenoso, tiroireferide de Quervain, fenômeno de Raynaud, ar-

trite reativa, aborto de repetição, redução na resposta da pressão arterial, distrofia simpático-reflexa, sprue refratária, doença de Reiter ou síndrome, policondrite recidivante, lesões de reperfusão do miocárdio ou outra tecidos,

lesão de reperfusão, síndrome de angústia respiratória, síndrome das pernas inquietas, autoimunidade retiniana, fibrose retroperitoneal, síndrome de Rey- naud, doenças reumáticas, febre reumática, reumatismo, artrite reumatoide, espondilite reumatoide, infecção por vírus da rubéola, síndrome de Sampter, sarcoidose, esquistossomose, síndrome Schmidt SCID e doençassociadas aos vírus Epstein-Barr, esclera, esclerite, esclerodatila, esclerodermia (inclu- indo esclerodermia sistêmica), colangite esclerosante, esclerose dissemina- da, esclerose, como esclerose sistêmica, perda auditiva sensoneural, es- pondilaartrite soronegativo, síndrome de Sheehan, síndrome de Shulman, silicose, síndrome de Sjogren A, esperma e autoimunidade testicular, sinusi- te esfenoidal, síndrome de Stevens-Johnson, dura homem (ou dura pessoa) síndrome, endocarreferide bacteriana subaguda (SBE), lúpus eritematoso cutâneo subagudo, perda auditiva súbita, síndrome de Susac, coréia de Si- denham, Simpático oftalmia, lúpus eritematoso sistêmico (SLE) ou lúpus eri- tematoso sistêmico (por exemplo, o SLEcutâneo), vasculite necrosante sis- têmica e vasculite associada ao ANCA, como Churg-Strauss, vasculite ou síndrome (CSS)), tabes dorsalis, arterite de Takayasu, telangiectasia, arterite temporal/arterite de células gigantes, tromboangite ubiterans, trombocitope- nia (por exemplo desenvolvida por pacientes com infarto do miocárdio), in- —cluindo púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) e trombocitopenia autoi- mune ou imune mediada como púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), incluindo ITP crônica ou aguda, púrpura trombocitopênica (TTP), tireotoxico- se, lesão tecidual, síndrome de Tolosa-Hunt, necrôlise epidérmica tóxica, síndrome tóxico-choque, reação transfusional, hipogamaglobulinemia transi- tóriada infância, mielite transversa, travessia mielite, tropical eosinofilia pul- monar, tuberculose, colite ulcerativa, indiferenciada doença do tecido conjun- tivo (UCTD), urticária (por exemplo, urticária alérgica crônica e urticária idio- pática crônica, incluindo urticária autoimune crônica), uveite (por exemplo, a uveite anterior), uveoretinite, valvulite, disfunção vascular, vasculite, artrite vertebral, vesicular dermatose, vitiligo, granulomatose de Wegener (agora denominado granulomatose com Poliangeíte (GPA), síndrome de Wiskott-

Aldrich, ou a síndrome do IgM hiper ligado a X.

Em uma forma modalidade, um método para tratar um distúrbio inflamatório pode compreender a administração de um composto que inibe um polipeptídeo KIR2QDL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, o referido composto é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um peptídeo, um gli- coalcoide, um ácido nucleico antissentido, uma ribozima, um retinoide, um avemir, uma molécula pequena, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o composto é um e anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 do. Em uma modalidade, o indivíduo tem um distúrbio inflamatório mediado por meio das células T.

Em uma modalidade, um método para o tratamento de um dis- túrbio inflamatório é doenças reumáticas (por exemplo, a artrite reumatoide, osteoartrite, artrite psoriática), espondilaartropatias (por exemplo, espondilite anquilasante, artrite reativa, síndrome de Reiter), artropatias de cristal (por exemplo, gota, pseudogota, pirofosfato de cálcio, doença de deposição), es- clerose múltipla, doença de Lyme, polimialgia reumática; doenças do tecido conjuntivo (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose sistêmica, polimiosite, dermatomiosite, síndrome de Sjogren), vasculites (por exemplo, poliartrite nodosa, granulomatose de Wegener, síndrome de Churg-Strauss); condições inflamatórias, incluindo consequências de trauma ou isquemia, sarcoidose, doenças vasculares, incluindo doença vascular aterosclerótica, aterosclerose e doença vascular obstrutiva (por exemplo, aterosclerose, do- ença isquêmica cardíaca, enfarte do miocárdio, acidentes vasculares cere- brais, periféricos), stent vascular, doenças oculares, incluindo uveite, doença da córnea, irite, iridociclite, catarata, ácido refluxo/azia, acne, acne vulgar, alergias e sensibilidades, Doença de Alzheimer, asma, aterosclerose e do- enças vasculares oclusivas (por exemplo, aterosclerose, doença isquêmica cardíaca, enfarte do miocárdio, acidentes vasculares cerebrais, periféricos) e stent vascular, doenças autoimunes, bronquite, câncer, carreferide, catarata, doença celíaca, dor crônica, prostatite crônica, cirrose, colite, doenças do tecido conjuntivo (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose sis- têmica, polimiosite, dermatomiosite, síndrome de Sjogren), doença da cór- nea, doença de Crohn, artropatias Cristal (por exemplo, Gota, Pseudogota pirofosfato de cálcio, doença de deposição), Demência, Dermatite, Diabetes, olhos secos, eczema, edema, enfisema, fibromialgia, gastroenterite, gengivi- te, glomerulonefrite, doença cardíaca, hepatite, pressão arterial alta, hiper- sensibilidades, doenças inflamatórias intestinais, condições inflamatórias, incluindo consequências do trauma ou isquemia, resistência à insulina, a cistite intersticial, Iridociíclite, irite, dor nas articulações/Artrite/artrite reuma- toide, doença de Lyme, síndrome metabólica (síndrome X), Esclerose Múlti- pla, miosite, nefrite, obesidade, doenças oculares, incluindo uveite, Osteo- penia, A osteoporose, doença de Parkinson, doença inflamatória pélvica, doença periodontal, poliarterite, Policondrite, polimialgia reumática, psoríase, lesões de reperfusão, artrite reumática, doenças reumáticas (por exemplo, artrite reumatoide, osteoartrite, artrite psoriática), artrite reumatoide, sarcoi- dose, Esclerodermia, Sinusite, Síndrome de Sjôgren, cólon espástico, es- pondilaartropatias (por exemplo, espondilite anquilasante, artrite reativa, sín- drome de Reiter), candidíase sistêmica, Tendinite, Transplante Rejeição, UTI, vaginite, Doenças Vasculares incluindo a doença aterosclerótica vascu- lar, vasculites (por exemplo, poliarterite nodosa, granulomatose de Wegener, Churg-Strauss), e vasculite. Em uma outra modalidade, o composto pode ser um anticorpo anti-KIR2DL1,2 e/ou 3. Em uma modalidade, o anticorpo pode ser quiméri- co, humanizado, anti-idiotípico, da cadeia simples, bifuncional, ou co- específico. Em uma modalidade, o anticorpo pode compreender uma se- quência de aminoácidos da VL da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 3 ou 5. Em uma modalidade, os resíduos 3, 4, 9, 24, 32, 41, 47, 50, 55,71,e74daSEQID NO: 3 podem ser Q, G, S RA G,LD,E,F,eA, respectivamente. Em uma modalidade, o anticorpo pode compreender uma sequência de aminoácidos da VH da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, 4 ou 6. Em uma outra modalidade, os resíduos 3, 4, 9, 24, 32, 41, 47, 50, 55, 71 e 74 da SEQ ID NO: 3 podem ser R M, E, W, Y, A, FE, Y, Q, Y, e T,respectivamente.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode compreender a CDR1 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que cor-

responde aos 24 a 34 resíduos de SEQ ID NO: 1; CDR?2 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que corresponde aos 50 a 56 resíduos de SEQ ID NO: 1, a CDR3 da cadeia leve da sequência de aminoácido que corres- ponde aos 89 a 97 resíduos de SEQ ID NO: 1, a CDR1 da cadeia pesada da — sequência de aminoácidos que corresponde aos 31 a 35 resíduos de SEQ ID NO: 2; CDR2 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que cor- responde aos resíduos 50 a 65 de SEQ ID NO: 2, ou a sequência de CDR3 da cadeia pesada de aminoácido que corresponde aos resíduos 99 a 112 de SEQ ID nO: 2.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode compreender a CDR1 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que cor- responde aos 24 a 34 resíduos de SEQ ID NO: 3; CDR?2 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que corresponde aos 50 a 56 resíduos de SEQ ID NO: 3, a CDR3 da cadeia leve da sequência de aminoácido que corres- —ponde aos 89 a 97 resíduos de SEQ ID NO: 3; CDR1 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que corresponde aos 31 a 35 resíduos de SEQ ID NO: 4; CDR2 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que cor- responde aos 50 a 66 resíduos de SEQ ID NO: 4, ou a CDR3 da cadeia pe- sada da sequência de aminoácidos que corresponde aos resíduos 99 a 113 deSEQIDnO:4.

Em uma modalidade, o anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode compreen- der um anticorpo de VL e VH de uma sequência que compreende a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente, a SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente, ou SEQ ID NO: 5 e 6, res- pectivamente.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção pode compreender as re- giões CDR como se segue: a CDR1 da cadeia leve da sequência de amino- ácidos que corresponde a cerca de 24 a 34 resíduos de SEQ ID NO: 1, a cadeiade sequência de aminoácidos de CDR2 de luz correspondente a cer- ca de 50 a 56 resíduos de SEQ ID NO: 1, a CDR3 da cadeia leve da se- quência de aminoácidos que corresponde a cerca de 89 a 97 resíduos de

SEQ ID NO: 1, a CDR1 da cadea pesada da sequência de aminoácidos que corresponde a cerca de 31 a 35 resíduos de SEQ ID NO: 2; CDR2 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que corresponde a cerca de 50 a 65 resíduos de SEQ ID NO: 2, ou a sequência de CDR3 da cadeia pesada de aminoácidos que corresponde a cerca de 99 resíduos-112 de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção pode compreender as re- giões CDR como se segue: a CDR1 da cadeia leve da sequência de amino- ácidos que corresponde a cerca de 24 a 34 resíduos de SEQ ID NO: 3, uma CDR2 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que corresponde a cer- ca de 50 a 56 resíduos de SEQ ID NO: 3, uma CDR3 da cadeia leve da se- quência de aminoácidos que corresponde a cerca de 89 a 97 resíduos de SEQ ID NO: 3, uma CDR1 da cadea pesada da sequência de aminoácidos que corresponde a cerca de 31 a 35 resíduos de SEQ ID NO: 4; uma CDR2 dacadeia pesada da sequência de aminoácidos que corresponde a cerca de 50 a 66 resíduos de SEQ ID NO: 4, ou uma sequência de CDR3 da cadeia pesada de aminoácidos que corresponde a cerca de 99 a 113 resíduos da

SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção pode compreender uma CDR1 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que consiste essencial- mente em 24 a 34 resíduos de SEQ ID NO: 1, a uma cadeia leve CDR2 a sequência de aminoácidos que consiste essencialmente em 50 a 56 resí- duos de SEQ ID NO: 1, uma CDR3 da cadeia leve da sequência de aminoá- —cidos que consiste essencialmente em 89 a 97 resíduos de SEQ ID NO: 1, uma cadeia pesada de CDR1 a sequência de aminoácidos que consiste es- sencialmente em 31 a 35 resíduos de SEQ ID NO: 2, uma CDR?2 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que consiste essencialmente em resí- duos 50 a 65 de SEQ ID NO: 2, ou uma sequência de CDR3 da cadeia pe- sada de aminoácidos que consiste essencialmente em 99 a 112 resíduos de

SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção pode compreender as re- giões CDR como se segue: uma CDR1 da cadeia leve da sequência de ami- noácidos que consiste essencialmente em dos 24 a 34 resíduos de SEQ ID NO: 3, uma CDR?2 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que consiste essencialmente em 50 a 56 resíduos de SEQ ID NO: 3; CDR3 da cadeia le- ve da sequência de aminoácidos que consiste essencialmente em, que con- siste essencialmente em 89 a 97 resíduos de SEQ ID NO: 3; uma CDR1 da cadea pesada da sequência de aminoácidos que consiste essencialmente em 31 a 35 resíduos de SEQ ID NO: 4; uma CDR?2 da cadeia pesada de se- quência de aminoácidos que consiste essencialmente em 50 a 66 resíduos de SEQ ID NO: 4, ou uma sequência de CDR3 da cadeia pesada de amino- ácidos que consiste essencialmente em 99 a 113 resíduos da SEQ ID NO: 4.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção pode ligar-se a um epitopo dentro da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, 8, 9, ou 10. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ligar-se dentro de uma região definida por pelo menos um dos resíduos de aminoácidos seleciona- dos a partir do grupo que consiste em 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159,160,161,162, 163, 181, e 192. Em uma modalidade, o anticorpo anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ligar-se KIR2DL1 e KIR2DL2/3, dentro de uma regi- ão definida por pelo menos um dos resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161,162,163,181,e192.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 ou fragmento de anticorpo usado nos métodos de tratamento da presente in- venção pode ser direta ou indiretamente conjugado com um marcador, agen- te citotóxico, um agente terapêutico ou um agente imunossupressor. Em uma modalidade, o marcador pode ser um marcador quimioluminescente, marcador paramagnético, um agente de contraste para IRM, marcador fluo- rescente, marcador bioluminescente ou marcador radioativo. Em uma moda-

lidade, o marcador paramagnético pode ser alumínio, o manganês, a platina, o oxigênio, o lantânio, lutécio, escândio, ítrio, ou gálio. Em uma modalidade, o agente citotóxico pode ser um radical que inibe DNA, RNA, ou para a sín- tese de proteínas, um radionucleotídeo, ou a proteína inibidora ribossomal. Emuma modalidade, o agente citotóxico pode ser 212Bi, 1311, 188Re, 90Y, vindesina, metotrexato, adriamicina, cisplatina, proteína antiviral de pokewe- ed, exotoxina A de Pseudomonas, ricina, toxina da difteria, cadeia A de rici- na, ou enzima fosfolipase citotóxica.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção bloqueiam ou neutralizam a inibição NK. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 ou 3 pode ligar-se a pelo menos um dos KIR2DL1, 2 ou 3 e neutralizar a inibição medi- ada de KIR2DL1, 2 e/ou a 3 da citoxicidade por meio das células NK. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 ou 3 que pode neutralizar po- de compreender pelo menos cerca de 20% de aumento Na lise específica mediada por meio da célula NK das células alvo NK.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção pode competir por meio da ligação com a mesma região determinante antigênica do anticorpo monoclo- nal 1-7F9, DF200, e/ou NKVSF1. Em uma modalidade, o anticorpo anti- KIR2DL1, 2 ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção pode ligar-se a pelo menos aos dois receptores KIR inibidores na superfície de células NK. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção pode ligar-se de uma regi- ão determinante antigênica comum dos receptores KIRQDL humanos. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção podem ligar-se a Receptores KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção tem uma afinidade para KIR2DL1,2 e/ou 3 de, pelo menos, cerca de 104 a cerca de 1010 M-1. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção pode ter uma afinidade para KIR2DL1, 2 e/ou 3 de, pelo menos, cerca de 107 a cerca de 109 M-1. Em uma modali- dade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção pode apresentar ligação com uma constante de menos do que cerca de 100 nm a dissociação KIR. Em uma modalidade, o anticorpo antiKIR2DL1,2 ou 3 pode reagir de forma cruzada com mais KIRs 2DL1 2DL2/3, 3DL1 mais 3DL2, 2DL1 (e 2DL2/3) mais 2DS4 e 2DL1 (e 2DL2/3), mas não 2D24. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 ou 3 pode ser DF200, 1-7F9, ou o anticorpo NKVSF1. Em uma modalidade, o composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1,2 e/ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção pode ser administrado como uma monoterapia. Em uma modalidade, o com- posto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção pode ser administrado em combinação com um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo agen- te terapêutico pode ser um agente que diminui a inflamação. Em uma moda- lidade, o segundo agente terapêutico pode ser um agente químico da molé- cula pequena. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico pode ser um DMARD, opcionalmente, um anticorpo anti-TNFa, um inibidor da tirosina- quinase de pequena molécula, ou o metotrexato (MTX). Em uma modalida- de,o segundo agente terapêutico pode ser um agente que não seja um anti- corpo possuindo um isotipo IgG1 ou IgG3. Em uma modalidade, o composto que inibe um KIR2DL1, 2 e/ou 3 usado nos métodos de tratamento da presente invenção pode ser um anti- corpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 possuindo a capacidade de bloquear ou neu- tralizar a Inibição NK mediada por KIR2DL1, 2 e/ou 3 e assim potenciar a atividade das células NK contra células alvo outra bloqueado. Em uma mo- dalidade, o anticorpo pode ser um anticorpo anti-KIR que se pode ligar a KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR podem competir com 1-7F9 para a ligação a KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Em uma modalidade, o anticorpo pode ser de 1-7F9. Em uma modalidade, o anticorpo pode compreender os domínios de 1-7F9 VL e VH. Em uma modalidade, o anticorpo pode compreender os CDRs de VL e VH de 1-7F9. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado como uma composição Farmaceuticamente aceitável, pode compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, a composição pode estar isenta de quaisquer outros agentes Farmaceuticamente ativos.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado em uma quantidade que resulta na saturação praticamente completa de KIR2DL1, 2 e/ou 3 em células NK por um período de, pelo me- nos, cerca de 1 semana. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou3 pode ser administrado em uma quantidade que resulta na saturação praticamente completa de KIR2DL1, 2 e/ou 3 em células NK por um período de, pelo menos, cerca de 2 semanas. Em uma modalidade, o anticorpo anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado em uma quantidade que resulta na saturação praticamente completa de KIR2DL1, 2 e/ou 3 em células NK por um período de pelo menos cerca de 1 mês. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado várias vezes com uma fre- quência de dosagem de uma vez a cada 2 semanas. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado várias vezes com uma frequência de dosagem de cerca de uma vez a cada | mês. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado várias vezes com uma frequência de dosagem de uma vez a cada 2 meses, ou uma vez em cada período de mais de 2 meses.

Em uma modalidade, a presente invenção proporciona uma composição para o tratamento de um distúrbio autoimune ou inflamatória, que pode compreender um anticorpo anti-KIR2DL1 e, opcionalmente, um outro agente ativo. Em uma outra modalidade, uma composição pode com- preender um anticorpo anti-KIR2DL2. Em uma outra modalidade, uma com- posição para uso na presente invenção pode compreender um anticorpo an- ti-KIR2DL3 e, opcionalmente, um outro agente ativo. Em uma outra modali- dade, uma composição pode compreender um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 e, opcionalmente, um outro agente ativo.

Em uma modalidade, uma composição para uso no tratamento de um distúrbio autoimune pode compreender uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-KIR2DL1. Em uma modalidade, uma composição para uso no tratamento de um distúrbio autoimune de acordo com a presente invenção pode compreender uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-KIR2DL2. Emuma modalidade, uma composição para uso no tratamento de um distúr- bio autoimune de acordo com a presente invenção pode compreender uma quantidade adminstering ofan do anticorpo anti-KIR2DL3 eficaz. Em uma outra modalidade, uma composição para uso no tratamento de um distúrbio autoimune pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Em uma modalidade, uma composição para uso no tratamento de um distúrbio inflamatório de acordo com a presente invenção pode com- preender um anticorpo anti-KIR2QDL1. Em uma modalidade, uma composição para uso no tratamento de um distúrbio inflamatório de acordo com a pre- sente invenção pode compreender um anticorpo anti-KIR2DL2. Em uma mo- dalidade, uma composição para uso no tratamento de um distúrbio inflama- tório de acordo com a presente invenção pode compreender um anticorpo anti-KIR2DL3. Em uma outra modalidade, uma composição para uso no tra- tamento de um distúrbio inflamatório de acordo com a presente invenção pode compreender um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um mé- todo para a produção de anticorpos que compreende (a) a imunização de um animal com um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3, (b) remover o referido baço do animal e preparar uma única suspensão de células, (c) fusão de uma célula de baço com uma célula de mieloma, (d) cultivar as células pós- fusão no meio de seleção de hibridoma, (e) a cultura dos hibridomas resul- tantes, (f) triagem para a produção de um anticorpo específico, e (g) seleção de hibridomas que produzem a desejada anticorpo.

Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um mé- todo para produzir um anticorpo para o tratamento de um distúrbio inflamató- rio ou autoimune que compreende: (a) imunização de um mamífero não hu- mano com um imunogênio que compreende um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3; (b) seleção de anticorpos a partir dos referidos imunizados mamífero, em que os referidOs anticorpos se ligam ao referido polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3, e (c) selecionar anticorpos de (b), que potenciam a eliminação de células T das células NK., Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um mé- todo para produzir um anticorpo para o tratamento de um distúrbio inflamató- rio ou autoimune que compreende: (a) proporcionar uma biblioteca de anti- corpos através de tecnologia de exibição em fagos, (b) da biblioteca, em que os referidOs anticorpos se ligam ao referido polipeptídeo KIR2QDL1, 2 e/ou 3, e(c) selecionar anticorpos de (b), que potenciam a eliminação de células T das células NK.

Em uma outra modalidade, qualquer um dos vários métodos descritos acima podem, opcionalmente, ser ainda mais modificados por meio da aplicação de um tratamento com um ou mais agentes terapêuticos adi- cionais, por exemplo, agentes de moléculas pequenas, DMARDs (de prefe- rência que não sejam anticorpos, cujo modo de ação principal pode ser para induzir ADCC) Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um mé- todo para o tratamento de uma doença autoimune pode compreender a ad- ministração de uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipe- tídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, um método para tratar um distúrbio inflamatório pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, um método para a eliminação ou redução do número de células T envolvidas em uma condição de doença pode com- preender o contato das referidas células T com um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3, na presença de células que expressam um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, as células que expressam um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 são as células NK. Em uma modalidade, o mesmo é efetuado ex vivo. Em uma modalidade, o mesmo é efetuado in vivo. Em uma modalidade, as células T incluem uma ou mais células T pró-inflamatórias, ativadas e/ou de proliferação, células T

CD4 +, células T de infiltração e/ou a células T, que expressam HLA-cw3 e/ou HLA-cw4. Em uma outra modalidade, um método para a eliminação ou re- dução do número de células T que estão envolvidas na patologia de um dis- túrbio inflamatório pode compreender a administração a um indivíduo com um distúrbio inflamatório, uma quantidade de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 eficaz para reduzir o número das referidas células T.

Em uma outra modalidade, um método para a eliminação ou redu- ção do número de células T que estão envolvidas na patologia de um distúr- bio autoimune pode compreender a administração a um indivíduo com um distúrbio autoimune uma quantidade de um composto que inibe um Polipetí- deo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 eficaz para reduzir o número das referidas células T.

Em uma modalidade, as células T compreendem células T ativadas e/ou de proliferação, células T CDA4 +, células T pró-inflamatórias e/ou das células T que expressam o HLA-cw3 e/ou HLA-cw4. Em uma modalidade, as células T incluem uma ou mais das seguintes características: se encontrem em cir- culação, são formadas em um tecido doente ou inflamado, são células T de infiltração, são células T que foram infiltradas em tecidos doentes, são com- postas em tecidos sinovial ou fluido sinovial, ou está compreendida no sis- tema nervoso central, no cólon, do tecido dérmico.

Em uma modalidade, o indivíduo tem uma doença mediada pelo menos em parte, por meio das refe-

ridas células T.

Em uma outra modalidade, um método para a eliminação ou re- dução do número de células T ativadas e/ou de proliferação que estão en- volvidasna patologia de um distúrbio inflamatório ou autoimunes in vivo, po- de compreender a administração a um indivíduo tendo uma doença inflama- tória ou autoimune de uma quantidade de um composto que inibe um polipe- tídeo eficaz KIR2DL1, 2 e/ou 3 para reduzir o número das referidas células T.

Em uma outra modalidade, um método para a eliminação ou redução do número de células T CD4 +, que estão envolvidas na patologia de um distúr- bio inflamatório ou autoimune pode compreender a administração a um indi- víduo tendo uma doença inflamatória ou autoimune de uma quantidade de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 eficaz para reduzir o número das referidas células T. Em uma outra modalidade, um mé- todo para a eliminação ou redução do número de células T pró-inflamatórias podem compreender a administração a um indivíduo com um distúrbio infla- matório ou autoimune, uma quantidade de um composto que inibe um Poli- petídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 eficaz para reduzir o número das referidas células T. Em uma modalidade, a doença é mediada, pelo menos em parte, por meio das referidas células T.

Em uma outra modalidade, um método para a eliminação ou re- dução do número de células T de infiltração pode compreender a adminis- tração a um indivíduo tendo uma doença inflamatória ou autoimune de uma quantidade de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 eficaz para reduzir o número das referidas células T. Em uma modalidade, a doença é mediada, pelo menos em parte, por meio das referidas células T.

Em uma modalidade, as células T de infiltração incluem uma ou mais das seguintes características: as células que se infiltraram em tecidos doentes, as células que se infiltraram em tecidos sinovial ou fluido sinovial, ou as célu- las que se infiltraram no sistema nervoso central, no cólon, ou no tecido dérmico.

Em uma outra modalidade, um método para a eliminação ou re- dução do número das células T que expressam o HLA-cw3 e/ou HLA-cw4 pode compreender a administração a um indivíduo tendo uma doença infla- matória ou autoimune de uma quantidade de um composto que inibe um Po- lipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 eficaz para reduzir o número das referidas célulasT. Em uma modalidade, as células T, pelo menos em parte, mediar o referido distúrbio.

Em uma outra modalidade, um método para tratar um distúrbio inflamatório pode compreender: (a) determinar se um indivíduo tem um dis- túrbio inflamatório ou autoimune, e (b), se o indivíduo tem um distúrbio infla- —matório ou autoimune, tratamento do indivíduo com uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2QDL1, 2 e/ou 3.

Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de uma doença autoimune pode compreender: (a) determinar se um indivíduo tem um distúrbio inflamatório ou autoimune, e (b), se o indivíduo tem um dis- túrbio inflamatório ou autoimune, tratamento do indivíduo com uma quanti- dade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2QDL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, um método para tratar um distúrbio inflamatório pode compreender: (a) determinar se um indivíduo tem um dis- túrbio inflamatório mediado, pelo menos em parte, por meio das células T, e (b), se o indivíduo tem um distúrbio inflamatório mediado pelo menos em parte, por meio das referidas células T, o tratamento do indivíduo com uma quantidade terapeuticamente ativa de um composto que inibe um Polipetí- deo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, as células T incluem um ou mais dos seguintes: são células T pró-inflamatórias, ativadas e/ou de prolife- ração, estão em circulação em um tecido doente ou inflamado, células T CD4 +, são células T de infiltração, e/ou expressam HLA-cw3 e/ou HLA-cw4. Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de uma doença autoimune pode compreender: (a) determinar se um indivíduo tem um distúrbio autoimune mediado pelo menos em parte, por meio das células T, e (b), se o indivíduo tem um distúrbio autoimune mediado pelo menos em parte, por meio das referidas células T, o tratamento do indivíduo com uma quantidade terapeuticamente ativa de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, as células T incluem um ou mais dos seguintes, são células T pró-inflamatórias, ativadas e/ou de proliferação, estão em circulação em um tecido doente ou inflamado, são células T CD4 +, são células T de infiltração, e/ou expressam HLA-cw3 e/ou

HLA-cw4. Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de uma doença inflamatória em um indivíduo pode compreender: (a) avaliar a presença, fase e/ou a evolução da doença inflamatória em um indivíduo, e (b) administrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de um composto que inibeum Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo, pode compreender: (a) avaliar a presença, fase e/ou a evolução da doença autoimune em um indivíduo, e (b) administrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, o método compreende a avaliação da presen- ça, fase e/ou a evolução da doença em um indivíduo compreende analisar os níveisde auto-anticorpos, PCR, qualquer enzima proteolítica, mediador inflamatório, ou marcador de inflamação em curso. Em uma modalidade, o indivíduo é determinado para ser apropriado para o tratamento com um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3, a administração ao referido indivíduo de uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, um méto- do para o tratamento de uma doença inflamatória em um indivíduo pode compreender: (a) determinar se o referido indivíduo tem uma doença infla- matória estabelecida, e (b), se o referido indivíduo tem uma doença inflama- tória estabelecida, a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de uma doença autoi- mune em um indivíduo, pode compreender: (a) determinar se o referido indi- víduo tem um distúrbio autoimune estabelecido, e (b), se o referido indivíduo tem um distúrbio autoimune estabelecido, a administração ao referido paci- entede uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de uma doença inflamatória em um indivíduo pode compreender (a) deter- minar se o referido indivíduo está experimentando um ataque, crise, exacer- bação ou alargamento de uma doença inflamatória, e (b), se o referido indi- víduo experimenta um ataque, crise, exacerbação ou alargamento de uma doença inflamatória, a administração ao referido indivíduo de uma quantida- de eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo, pode compreender (a) determinar se o referido indivíduo está experimentando um ataque, crise, exacerbação ou alarga- mento de uma doença autoimune, e (b), se o referido indivíduo experimenta um ataque, crise, exacerbação ou alargamento de uma doença autoimune, a administração ao referido indivíduo de uma quantidade eficaz de um com- posto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modali- dade, um método para o tratamento de uma doença inflamatória em um indi- víduo pode compreender (a) determinar se o referido indivíduo tem uma do- ençainflamatória, caracterizada pela presença de células T, e (b), se o refe- rido indivíduo tem uma doença inflamatória caracterizada pela a presença das referidas células T, a administração ao referido paciente de uma quanti- dade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2QDL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de uma doença —autoimune em um indivíduo, pode compreender (a) determinar se o referido indivíduo sofre de doença autoimune caracteriza-se pela presença de célu- las T, e (b), se o referido indivíduo tem um distúrbio autoimune caracterizado pela presença das referidas células T, a administração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1,2e/ou3.

Em uma modalidade, as células T podem ser células T ativadas e/ou de proliferação, células T CD4 +, células T pró-inflamatórias, as células T de infiltração e/ou as células T que expressam o HLA-cw3 e/ou HLA-cw4 Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um mé- todo para o tratamento de um indivíduo que está experimentando um ata- que, crise, exacerbação ou alargamento de uma doença inflamatória, pode compreender a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modali- dade, o indivíduo tem uma doença inflamatória estabelecida. Em uma outra modalidade, um método para o tratamento de um indivíduo que está experi- mentando um ataque, crise, exacerbação ou alargamento de uma doença autoimune, pode compreender a administração ao indivíduo de uma quanti- dade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, o indivíduo tem uma doença inflamatória autoimune. Emuma outra modalidade, um método de tratamento de um indivíduo pode compreender: (a) determinar se um indivíduo tem um distúrbio inflamatório ou autoimune, e (b), se o indivíduo tem um distúrbio inflamatório ou autoi-

mune, tratamento do indivíduo com uma quantidade eficaz de um um com- posto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modali- dade, um método de tratamento de um indivíduo pode compreender: (a) de- terminar se um indivíduo tem um distúrbio inflamatório ou autoimune media- do pelomenos em parte, por meio das células T, e (b), se o indivíduo tem um distúrbio inflamatório ou autoimune mediado pelo menos em parte, por meio das referidas células T, o tratamento do indivíduo com uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, um método de tratamento de um indivíduo pode compreender: (a) avaliar a presença, fase e/ou a evolução da doença infla- matória ou autoimune em um indivíduo, e (b) administrar ao referido indiví- duo uma quantidade eficaz de um composto que inibe KIR2DL1 um, dois e/ou três polipetídeo.

Em uma outra modalidade, um método de tratamento de um indivíduo pode compreender: (a) determinar se o referido indivíduo tem uma doença inflamatória ou autoimune estabelecida, e (b) se o referido indivíduo tem uma doença inflamatória ou autoimune estabelecida, a admi- nistração ao referido paciente de uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma outra modalidade, um método de tratamento de um in- divíduo pode compreender: (a) determinar se o referido indivíduo está expe- rimentando um ataque, crise, exacerbação ou alargamento de uma doença inflamatória ou autoimune, e (b), se o referido indivíduo experimenta um ata- que, crise, exacerbação ou alargamento de uma doença inflamatória ou au- toimune, a administração ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de um composto que inibe um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modali- dade, o composto é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um peptídeo, um glicoalcoide, um ácido nucleico antissentido, uma ribozima, um retinoide, um avemir, uma molécula pequena, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em uma modalidade, o indivíduo tem um distúrbio inflamatório ou autoimune mediado por meio das células-T.

Em uma modalidade, a doença autoimune é Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), atrofia espênica adquiri- da, uveite anterior aguda, encefalomielite aguda disseminada (ADEM), artrite gotosa aguda, leucoencefalite hemorrágica necrosante aguda, sinusite agu-

da ou crônica, meningite purulenta aguda (ou outros distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central), inflamação grave aguda, doença de Addison, adrenalite, adulto aparecimento de diabetes mellUTIs em adultos (diabetes

Tipo ll), hipoparatiroidismo idiopático adulto (AOIH), Agamaglobulinemia, agranulocitose, vasculite, incluindo vasculite (incluindo vasculite de grandes vasos (incluindo polimialgia reumática e artrite de célula gigante (de Takaya-

su)), condições alérgicas, dermatite de contato alérgico, dermatite alérgica, alergia angiite granulomatosa, doenças alérgicas de hipersensibilidade, neu-

rite alérgica, reação alérgica, alopecia areata, alopecia totalis, síndrome de Alport, alveolite (por exemplo, alveolite alérgica e alveolite fibrosante), doen-

ça de Alzheimer, amilaidose, esclerose amilatrófica lateral (ALS, doença de

Lou Gehrig), um distúrbio relacionado com a eosinofilia (por exemplo, eosi- nofilia), anafilaxia, espondilite anquilasante, antgiectasis, nefrite mediada por anticorpos, Nefrite Anti-GBM/Anti-TBM, doenças mediadas por meio do complexo antígeno-anticorpo, doença da membrana com base antiglomeru-

lar, a síndrome do anticorpo antifosfolipídeo, síndrome de antifosfolipídeo (APS), aftas, estomatite aftosa, anemia aplástica, arritmia, aterosclerose, doenças arterioscleróticas, a artrite (por exemplo, artrite reumatoide, como artrite aguda, artrite reumatoide crônica), artrite crônica progressiva, artrite deformante, ascaridíase, aspergilama (ou granulomas contendo eosinófilas), aspergilase, aspermiogenese, asma (por exemplo asma brônquica, asma brônquica, e asma autoimune), ataxia telangiectasia, esclerose atáxica, ate- rosclerose, autismo, angioedema autoimune, anemia aplástica autoimune,

gastrite atrófica autoimune, diabetes autoimune, doença autoimune do testí- culo e ovário, incluindo ooforite e orquite autoimune, distúrbios autoimunes, associadas com doenças do colagênio, disautonomia autoimune, doença autoimune do ouvido (por exemplo, doença autoimune do ouvido interno (envelhecidos)), doenças endócrinas autoimunes incluindo tiroidite como tiroidite autoimune, síndrome autoimune enteropatia, insuficiência gonadal autoimune, a perda auditiva autoimune, hemólise autoimune, hepatite autoi- mune, doença autoimune de hepatologia, hiperlipidemia autoimune, doença autoimune, imunodeficiência autoimune da orelha interna (AIED), miocardite autoimune, neutropenia autoimune, pancreatite autoimune, Poliendocrinopa-

tias autoimunes, síndrome poliglandular autoimune do tipo |, retinopatia auto- imune, trombocitopênica púrpura autoimune (ATP), doença autoimune da tiroide, urticária autoimune, doenças gastrointestinais mediadas autoimune, neuropatias axonais e neuronais, doença de Balo, doença de Behçet, dano de reperfusão de isquemia benigna e familiar, angiite linfocítica benigna, a doença de Berger (nefropatia por IgA), pulmão de pássaro apreciador, ce- gueira, doença de Boeck, bronquiolite obliterante (sem transplante) vs NSIP,

bronquite, aspergilase broncopneumônica, síndrome de Bruton, penfigoide bolhoso, síndrome de Caplan, Cardiomiopatia, isquemia cardiovascular, sín- drome de Castleman, doença celíaca, doença celíaca (enteropatia de glú-

ten), degeneração cerebelar, isquemia cerebral e doenças de vascularização acompanhante, doença de Chagas, canalopatias (por exemplo, epilepsia),

canalopatias do SNC, coriorretinite, coroireferide, distúrbio hematológico au- toimune, hepatite crônica ativa ou a hepatite crônica ativa autoimune, derma-

tite de contato crônica, pneumonia eosinofílica crônica, síndrome da fadiga crônica, hepatite crônica, pneumonite por hipersensibilidade crônica, artrite inflamatória crônica, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica

(CIDP), inflamação intratável crônica, candidíase mucocutânea crônica, neu- ropatia crônica (por exemplo, polineuropatias IgM ou neuropatia mediada por

IgM), doença obstrutiva crônica das vias aéreas, doença inflamatória pulmo-

nar crônica, ostomielite multifocal crônica recorrente (CRMO), tiroidite crôni-

ca (tiroidite de Hashimoto) ou tiroidite subaguda, síndrome de Churg-

Strauss, penfigoide cicatricial/penfigoide benigna mucosal, doenças inflama- tórias do SNC, vasculite do SNC, doença celíaca, síndrome Cogans, doença de aglutinina fria, poliposa colite, colite, tais como colite ulcerativa, colite ul- cerosa, colite colagenosa, condições que envolvem células T de infiltração e respostas inflamatórias crônicas, bloqueio cardíaco congênito, infecção da rubéola congênita, anemia Coombs positiva, doença arterial coronariana, Coxsackie miocardite, síndrome CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud), doença de Crohn, crioglobulinemia, síndrome de Cushing, ciclite (por exem-

plo, ciclite crônica, heterocrônico ciclite, iridocíclite, ou ciclite de Fuchs), fi- brose cística, a toxicidade induzida por citocinas, surdez, artrite degenerati-

va, doenças desmielinizantes (por exemplo, doenças autoimunes desmielini- zantes), neuropatias desmielinizantes, dengue, dermatite herpetiforme e dermatite atópica, dermatite, incluindo dermatite de contato, dermatomiosite, dermatoses com componentes inflamatórias agudas, doença de Devic (neu- romielite óptica), transtorno diabético artéria grande, nefropatia diabética, retinopatia diabética, anemia Diamond Blackfan, fibrose pulmonar intersticial difusa, cardiomiopatia dilatada, lúpus discoide, doenças envolvendo a diape-

dese de leucócitos, síndrome de Dressler, contratura de Dupuytren, a infec- ção ecovirus, eczema incluindo eczema alérgico ou atópico, encefalite, como a encefalite de Rasmussen e encefalite límbica e/ou do tronco encefálico, encefalomielite (por exemplo, encefalomielite alérgica e encefalomielite alér-

gica experimental (EAE)), hiperplasia endarterial, endocarreferide, oftalmotia endócrina, endometrioses, endomiocardiofibrose, endoftalmia facoanafiláti- ca, endoftalmite, enterite allergica, síndrome de eosinofilia-mialgia, eosinofí-

lica faciitis, ceratoconjuntivite epidêmica, Epidermólise bolhosa adquirida (EBA), episclera, episclerite infecção pelo vírus Epstein-Barr, Eritema eleva-

da et diutinum, eritema multiforme, eritema nodoso hansênico, eritema no-

doso, eritroblastose fetal, dismotilidade do esôfago, crioglobulinemia mista essencial, etmoide, síndrome de Evan, encefalomielite alérgica Experimental (EAE), deficiência de Fator VIII, pulmão do fazendeiro, febre reumática, sín- drome de Felty, fibromialgia, alveolite fibrosante, flariasis, glomeruloesclero-

se segmentar e focal (FSGS), intoxicação alimentar, frontal, atrofia gástrica,

artrite de células gigantes (artrite temporal), hepatite de células gigantes, polimialgia de células gigantes, glomerulonefrites, glomerulonefrite (GN) com e sem síndrome nefrótica, como glomerulonefrite crônica ou aguda (por e- xemplo, GN primária), síndrome de Goodpasture, artrite gotosa, síndromes associada à transfusão de granulócitos, granulomatose incluindo granuloma-

tose linfomatoide, granulomatose com poliangiite (GPA), uveite granuloma- tosa, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barre, psoríase gutatte, he- moglobinúria paroxismática, doença de Hamman-Rich, doença de Hashimo-

to, encefalite de Hashimoto, tiroireferide de Hashimoto, hemocromatose, a- nemia hemolítica ou anemia hemolítica imune, incluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), anemia hemolítica, hemofilia A, púrpura de Henoch- Schônlein, herpes gestacional, vírus da imunodeficiência humana (HIV), hi-

peralgesia, hipogamaglobulinemia, hipogonadismo, hipoparatireoidismo, dia- betes insipidus idiopática, paralisia facial idiopática, hipotireoidismo idiopáti-

ca, púrpura nefropatia por IgA, nefropatia membranosa idiopática ou GN membranosa idiopática, síndrome nefrótica idiopática, fibrose pulmonar idio- pática, sprue idiopática, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), nefropatia

—porlIgA, doenças mediadas por IgE (por exemplo: anafilaxia e rinite alérgica e atópica), doença relacionada com esclerosante IgG4, ileíite regionalis, ne-

frite do complexo imune, as respostas imunitáriassociadas à hipersensibili- dade mediada aguda e tardia por citocinas e linfócitos T, GN imune- mediada, lipoproteínas imunorreguladoras, incluindo síndrome da angústia respiratória adulta ou aguda (ARDS), miosite de corpos de inclusão, artrite infecciosa, a infertilidade devido aOs anticorpos antiespermatozoanos, infla- mação de toda ou parte da úvea, doença inflamatória do intestino (IBD) do- enças inflamatórias hiperproliferativas da pele, miopatia inflamatória, diabe-

tes idependente de nsulina (tipo 1), insulite, cistite intersticial, doença pulmo-

nar intersticial, fibrose pulmonar intersticial, irite, distúrbio de re-perfusão is- quêmica, inflamação das articulações, artrite juvenil, dermatomiosite juvenil, diabetes juvenil, com início na juventude (Tipo 1), diabetes mellUTIs, incluin-

do diabetes mellUTIs dependente de insulina pediátrica (IDDM), aparecimen-

to da artrite reumatoide juvenil, síndrome de Kawasaki, ceratoconjuntivite seca, kypanosomiasis, síndrome de Lambert-Eaton, leishmaniose, lepra, leucopenia, deficiência de adesão de leucócitos, vasculite leucocitoclástica, leucopenia, líquen plano, líquen escleroso, conjuntivite lenhosa, dermatose por IgA linear, Linear doença IgA (LAD), síndrome de Loffler, hepatite lúpica, lúpus (incluindo nefrite, cerebrite, pediátrica, não renal, extra-renal, discoide,

alopecia), Lúpus (SLE), o lúpus disseminado eritematoso, artrite de Lyme, doença de Lyme, pneumonite intersticial linfoide, malária, infertilidade autoi- mune macho e fêmea, maxilar, vasculite meio navio (incluindo a doença de

Kawasaki e poliartrite nodosa), GN proliferativa membrana ou membranosa (MPGN), incluindo Tipo | e Tipo Il, e rapidamente GN progressiva, GN mem- branosa (nefropatia membranosa), doença de Méniêre, meningite, colite mi- croscópica, poliangeíte microscópica, enxaqueca, alteração nefropatia míni-

ma, doença mista do tecido conjuntivo (MCTD), mononucleose infecciosa, úlcera de Mooren, doença de Mucha-Habermann, neuropatia motora multifo-

cal, insuficiência endócrina múltipla, síndrome da lesão de múltiplos órgãos,

tais como aqueles secundários a septicemia, trauma ou hemorragia, síndro-

me de lesão de múltiplos órgãos, esclerose múltipla (MS), tal como espino-

MS óptica, esclerose múltipla, papeira, distúrbios musculares, tais como a miastenia grave timoma associada à miastenia grave, miastenia grave, mio- cardite, miosite, narcolepsia, enterocolite necrosante, e colite transmural e doença intestinal inflamatória autoimune, necrosante, cutânea ou vasculite de hipersensibilidade, síndrome neonatal lúpus (NLE), nefrose, síndrome nefrótica, doença neurológica, neuromielite óptica (do Devic), neuromielite óptica, neuromiotonia, neutropenia, linfocitose não cancerosos, uveiíte non- granulomatous, timoma não-malignas, distúrbios inflamatórios orbitais e ocu- lares, penfigoide cicatricial ocular, ooforite, oftalmia simfática, síndrome op- soclonus myoclonus (OMS), síndrome opsoclonus ou opsoclonus myoclonus

(OMS) e neuropatia sensorial, neurite óptica, orquite granulomatosa, artrose, reumatismo palíndromo, pancreatite, pancitopenia, PANDAS (Distúrbios neu- ropsiquiátricos autoimune pediátricos associados com Streptococcus), dege- neração cerebelar paraneoplásica, síndrome paraneoplásica, síndromes pa- raneoplásicas, incluindo síndromes paraneoplásicas neurológicas (por e-

xemplo, síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou síndrome Eaton- Lambert), doenças parasitárias, tais como Lesihmania, hemoglobinúria paro- xística noturna (PNH), síndrome de Parry Romberg, pars planitis (uveite peri- férica), síndrome Parsonnage-Turner, parvovirose, penfigoide como penfi- goide penfigoide bolhoso e pele, pênfigo (incluindo pênfigo vulgaris), pênfigo eritematoso, pênfigo foliáceo, membrana penfigoide do muco pênfigo, pênfi- go, úlcera péptica, paralisia periódica, neuropatia periférica, perivenosa en- cefalomielite, anemia perniciosa (anemia perniciosa), anemia perniciosa,

uveite facoantigênica, pneumonocirrose, síndrome POEMS, poliartrite nodo-

sa, poliartrite crônica primária do tipo |, Il, e Ill, policondrite (por exemplo, policondrite refratária ou recorrente), doenças autoimunes poliendócrinas, insuficiência poliendócrina, síndromes poliglandulares (por exemplo, síndro-

mes poliglandulares autoimunes (ou síndromes de endocrinopatia poliglan- dular)), polimialgia reumática, polimiosite, polimiosite/dermatomiosite, poli- neuropatias, poliradiculite acuta, síndrome pós-cardiotomia, uveite posterior,

ou uveite autoimune, síndrome de infarto pós-miocárdio, síndrome pós, nefri-

te pós-estreptocócica, síndromes pós-vacinação, demência pré-senil, cirrose biliar primária, hipotireoidismo primário, mixedema idiopática primária, linfoci- tose primário, que inclui linfocitose monoclonal de células B (por exemplo, gamopatia monoclonal benigna e gmRNAopatia monoclonal de significado indeterminado, MGUS), mixedema principal, MS progressiva primária (PPMS) e recidivante remitente (RRMS), colangite esclerosante primária,

progesterona dermatite, esclerose sistêmica progressiva, artrite proliferativa, psoríase, como a psoríase em placas, psoríase, artrite psoriática, Proteinose alveolar pulmonar, infiltração eosinofilia, anemia de células vermelhas pul- monar ou aplasia pura (AEP), aplasia pura de glóbulos vermelhos, purulenta ou sinusite não purulenta, psoríase pustulosa e psoríase das unhas, pielitis,

pioderma gangrenoso, tiroireferide de Quervain, fenômeno de Raynaud, ar- trite reativa, aborto de repetição, redução na resposta da pressão arterial, distrofia simpático-reflexa, sprue refratária, doença de Reiter ou síndrome, policondrite recidivante, lesões de reperfusão do miocárdio ou outra tecidos, lesão de reperfusão, síndrome de angústia respiratória, síndrome das pernas inquietas, autoimunidade retiniana, fibrose retroperitoneal, síndrome de Rey- naud, doenças reumáticas, febre reumática, reumatismo, artrite reumatoide, espondilite reumatoide, infecção por vírus da rubéola, síndrome de Sampter, sarcoidose, esquistossomose, síndrome Schmidt SCID e doençassociadas aos vírus Epstein-Barr, esclera, esclerite, esclerodatila, esclerodermia (inclu-

indo esclerodermia sistêmica), colangite esclerosante, esclerose dissemina- da, esclerose, como esclerose sistêmica, perda auditiva sensoneural, es- pondilaartrite soronegativo, síndrome de Sheehan, síndrome de Shulman,

silicose, síndrome de Sjogren A, esperma e autoimunidade testicular, sinusi- te esfenoidal, síndrome de Stevens-Johnson, dura homem (ou dura pessoa) síndrome, endocarreferide bacteriana subaguda (SBE), lúpus eritematoso cutâneo subagudo, perda auditiva súbita, síndrome de Susac, coréia de Si- denham, Simpático oftalmia, lúpus eritematoso sistêmico (SLE) ou lúpus eri- tematoso sistêmico (por exemplo, o SLEcutâneo), vasculite necrosante sis- têmica e vasculite associada ao ANCA, como Churg-Strauss, vasculite ou síndrome (CSS)), tabes dorsalis, arterite de Takayasu, telangiectasia, arterite temporal/arterite de células gigantes, tromboangite ubiterans, trombocitope- nia (por exemplo desenvolvida por pacientes com infarto do miocárdio), in- cluindo púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) e trombocitopenia autoi- mune ou imune mediada como púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), incluindo ITP crônica ou aguda, púrpura trombocitopênica (TTP), tireotoxico- se, lesão tecidual, síndrome de Tolosa-Hunt, necrôlise epidérmica tóxica, síndrome tóxico-choque, reação transfusional, hipogamaglobulinemia transi- tória da infância, mielite transversa, travessia mielite, tropical eosinofilia pul- monar, tuberculose, colite ulcerativa, indiferenciada doença do tecido conjun- tivo (UCTD), urticária (por exemplo, urticária alérgica crônica e urticária idio- pática crônica, incluindo urticária autoimune crônica), uveite (por exemplo, a uveite anterior), uveoretinite, valvulite, disfunção vascular, vasculite, artrite vertebral, vesicular dermatose, vitiligo, granulomatose de Wegener (agora denominado granulomatose com Poliangeíte (GPA), síndrome de Wiskott-

Aldrich, ou a síndrome do IgM hiper ligado a X.

Em uma modalidade, um método para o tratamento de um dis- túrbio inflamatório é doenças reumáticas (por exemplo, a artrite reumatoide, osteoartrite, artrite psoriática), espondilaartropatias (por exemplo, espondilite anquilasante, artrite reativa, síndrome de Reiter), artropatias de cristal (por exemplo, gota, pseudogota, pirofosfato de cálcio, doença de deposição), es- clerose múltipla, doença de Lyme, polimialgia reumática; doenças do tecido conjuntivo (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose sistêmica, polimiosite, dermatomiosite, síndrome de Sjogren), vasculites (por exemplo, poliartrite nodosa, granulomatose de Wegener, síndrome de Churg-Strauss);

condições inflamatórias, incluindo consequências de trauma ou isquemia, sarcoidose, doenças vasculares, incluindo doença vascular aterosclerótica, aterosclerose e doença vascular obstrutiva (por exemplo, aterosclerose, do- ença isquêmica cardíaca, enfarte do miocárdio, acidentes vasculares cere- brais, periféricos), stent vascular, doenças oculares, incluindo uveite, doença da córnea, irite, iridocíclite, catarata, ácido refluxo/azia, acne, acne vulgar, alergias e sensibilidades, Doença de Alzheimer, asma, aterosclerose e do- enças vasculares oclusivas (por exemplo, aterosclerose, doença isquêmica cardíaca, enfarte do miocárdio, acidentes vasculares cerebrais, periféricos) e stent vascular, doenças autoimunes, bronquite, câncer, carreferide, catarata, doença celíaca, dor crônica, prostatite crônica, cirrose, colite, doenças do tecido conjuntivo (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose sis- têmica, polimiosite, dermatomiosite, síndrome de Sjogren), doença da cór- nea, doença de Crohn, artropatias Cristal (por exemplo, Gota, Pseudogota pirofosfato de cálcio, doença de deposição), Demência, Dermatite, Diabetes, olhos secos, eczema, edema, enfisema, fibromialgia, gastroenterite, gengivi- te, glomerulonefrite, doença cardíaca, hepatite, pressão arterial alta, hiper- sensibilidades, doenças inflamatórias intestinais, condições inflamatórias, incluindo consequências do trauma ou isquemia, resistência à insulina, a cistite intersticial, Iridociíclite, irite, dor nas articulações/Artrite/artrite reuma- toide, doença de Lyme, síndrome metabólica (síndrome X), Esclerose Múlti- pla, miosite, nefrite, obesidade, doenças oculares, incluindo uveite, Osteo- penia, A osteoporose, doença de Parkinson, doença inflamatória pélvica, doença periodontal, poliarterite, Policondrite, polimialgia reumática, psoríase, lesões de reperfusão, artrite reumática, doenças reumáticas (por exemplo, artrite reumatoide, osteoartrite, artrite psoriática), artrite reumatoide, sarcoi- dose, Esclerodermia, Sinusite, Síndrome de Sjógren, cólon espástico, es- pondilaartropatias (por exemplo, espondilite anquilasante, artrite reativa, sín- drome de Reiter), candidíase sistêmica, Tendinite, Transplante Rejeição, UTI, vaginite, Doenças Vasculares incluindo a doença aterosclerótica vascu- lar, vasculites (por exemplo, poliarterite nodosa, granulomatose de Wegener,

Churg-Strauss), e vasculite.

Em uma modalidade, o composto pode ser um anticorpo anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, o anticorpo pode ser quiméricos, humanizados, anti-idiotípico, da cadeia simples, bifuncional, ou co- específica.

Em uma modalidade, a cadeia leve do referido anticorpo com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 3 ou 5. Em uma modalidade, os resíduos 3, 4, 9, 24, 32, 41, 47, 50, 55, 71, e 74 da sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 são Q, G, S RA LL D,E,F,eA, respectivamente. Em uma modalidade, os resíduos 3, 4, 9, 24, 32, 41, 47, 50,55,71,e74da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 são R, M, F, W,Y,A,F,Y,Q,Y,eT, respectivamente. Em uma modalidade, a cadeia pesada do referido anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, 4 ou 6. Em uma modalidade, o anticorpo compreende a C- DR1 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que corresponde aos 24 a 34 resíduos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; CDR2 da ca- deia leve da sequência de aminoácidos que corresponde aos 50 a 56 resí- duos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, ou a CDR3 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que corresponde aos 89 a 97 resíduos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o anti- corpo compreende a CDR1 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que corresponde aos 24 a 34 resíduos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; CDR2 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que cor- responde aos 50 a 56 resíduos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, ou a sequência de CDR3 da cadeia leve aminoácido que corresponde aos89a597 resíduos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.

Em uma modalidade, o anticorpo compreende a sequência de CDR1 da cadeia pesada de aminoácido que corresponde aos 31 a 35 resí- duos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, a CDR2 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que corresponde aos resíduos 50 a 65 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, ou a sequência de CDR3 da cadeia pesada de aminoácido que corresponde aos 99 a 112 resíduos da sequência de aminoácidos da SEQ ID nO: 2. Em uma modalidade, o anti-

corpo compreende a cadeia de sequência de aminoácidos de CDR1 pesada corresponde aos 31 a 35 resíduos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, a CDR2 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que corres- ponde aos 50 a 66 resíduos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, ouaCDR3da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que correspon- de aos resíduos 99 a 113 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma cadeia leve variável e uma sequência da cadeia pesada variável pode compreender SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma sequência da cadeia leve variável e da cadeia pesada variável pode compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma sequência da cadeia leve variável e da cadeia pesada va- riável pode compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e SEQID NO: 6, respectivamente. Em uma modalidade, o anticorpo se liga a um epitopo dentro da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24. Em uma modali- dade, o anticorpo liga-se KIRQ2DL1 dentro de uma região definida por pelo menos um dos resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, e

192. Em uma modalidade, o anticorpo liga-se KIR2DL1 e KIR2DL2/3, dentro de uma região definida por pelo menos um dos resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em 105, 106, 107, 108, 109, 110,111,127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, e 192.

Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento pode ser direta ou indiretamente conjugado com um marcador, agente citotóxico, um agente terapêutico ou um agente imunossupressor. Em uma modalidade, o marca- dor pode ser um marcador quimioluminescente, marcador paramagnético, um agente de contraste para IRM, marcador fluorescente, marcador biolumi- nescente ou marcador radioativo. Em uma modalidade, o marcador pode ser paramagnético alumínio, o manganês, a platina, o oxigênio, o lantânio, luté- cio, escândio, ítrio, ou gálio. Em uma modalidade, o agente citotóxico pode ser um radical que inibe a DNA, RNA, ou para a síntese de proteínas, um radionucleotídeo, ou a proteína inibidora ribossomal. Em uma modalidade, o agente citotóxico pode ser 212Bi, 1311, 188Re, 90Y, vindesina, metotrexato, adriamicina, cisplatina, proteína antiviral de pokeweed, exotoxina A de Pseudomonas, ricina, toxina da difteria, cadeia A de ricina, ou enzima fosfo- lipase citotóxica. Em uma modalidade, o anticorpo bloqueia ou neutraliza a inibi- çãode NK.Em uma modalidade, o anticorpo se ligue a pelo menos um de KIR2DL1, 2 ou 3 e neutraliza A inibição mediada de KIR2DL1, 2 e/ou 3 de citotoxicidade das células NK. Em uma modalidade, o anticorpo de neutrali- zação pode compreender pelo menos cerca de 20% de aumento Na lise es- pecífica mediada por meio da célula NK das células alvo NK.

Em uma modalidade, o anticorpo compete para a ligação com a mesma região determinante antigênica do anticorpo monocional 1-7F9, DF200, e/ou NKVSF1. Em uma modalidade, o anticorpo liga-se a pelo me- nos dois receptores KIR inibidores na superfície de células NK. Em uma mo- dalidade, o anticorpo liga-se a uma região determinante antigênica comum dos receptores KIRQDL humanos. Em uma modalidade, o anticorpo liga-se aos Receptores KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Em uma modalidade, o anticorpo tem uma afinidade para KIR2DL1, 2 e/ou 3 de, pelo menos, cerca de 104 a cerca de 1010 M-1. Em uma modalidade, o anticorpo tem uma afinidade para KIR2DL1, 2 e/ou 3 de, pelomenos, cerca de 107 a cerca de 109 M-1. Em uma modalidade, o anti- corpo apresenta KIR de ligação com uma constante de menos do que cerca de 100 nM de dissociação.

Em uma modalidade, o anticorpo reage de forma cruzada com mais KIRs 2DL1 2DL2/3, 3DL1 mais 3DL2, 2DL1 (e 2DL2/3) mais 2DS4 e 2DL1(e2DL2/3), mas não 2D24.

Em uma modalidade, o anticorpo pode ser DF200, 1-7F9, ou o anticorpo NKVSF1.

Em uma modalidade, o composto que inibe um Polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado como uma monoterapia.

Em uma modalidade, o composto que inibe um Polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado em combinação com um segundo agente terapêutico.

Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico pode ser um agente que diminui a inflamação.

Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico pode ser um agente químico da molécula pequena.

Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico pode ser um DMARD, opcionalmente, um anti- corpo anti-TNFa, um inibidor da tirosina-quinase de pequena molécula, ou o —metotrexato (MTX). Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico po- de ser um agente que não seja um anticorpo possuindo um isotipo IgG1 ou I1gG3. Em uma modalidade, o composto que inibe um KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 possuindo a capacidade de bloquear ou neutralizar a KIR2DL1, 2 e/ou NK 3 inibição mediada e, dessa maneira, potencializar a atividade das células NK contra células alvo de ou- tro modo bloqueado.

Em uma modalidade, o anticorpo pode ser um anticor- po anti-KIR que se liga a KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Em uma modalidade, o an- ticorpo anti-KIR compete com 1-7F9 para a ligação a KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, o anticorpo pode ser de 1-7F9. Em uma modalidade, o an- ticorpo compreende os domínios de 1-7F9 VL e VH.

Em uma modalidade, o anticorpo compreende os CDR de VL e VH de 1-7F9. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado como uma composição Farmaceuticamente aceitável pode compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, a composição pode estar isenta de quaisquer outros agentes Farmaceuticamente ativos.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado em uma quantidade que resulta na saturação praticamente completa de KIR2DL1,2 e/ou 3 em células NK por um período de, pelo me- nos, cerca de 1 semana.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado em uma quantidade que resulta na saturação praticamente completa de KIR2QDL1, 2 e/ou 3 em células NK por um período de, pelo menos, cerca de 2 semanas. Em uma modalidade, o anticorpo anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado em uma quantidade que resulta na saturação praticamente completa de KIR2QDL1, 2 e/ou 3 em células NK por um período de pelo menos cerca de 1 mês. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado várias vezes com uma fre- quência de dosagem de uma vez a cada 2 semanas. Em uma modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado várias vezes com uma frequência de dosagem de cerca de uma vez a cada | mês. Em uma — modalidade, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado várias vezes com uma frequência de dosagem de uma vez a cada 2 meses, ou uma vez em cada período de mais de 2 meses.

A presente invenção também proporciona uma composição para uso no tratamento de um distúrbio autoimune que pode compreender um anticorpo anti-KIR2DL1. Em uma outra modalidade, uma composição para uso no tratamento de um distúrbio autoimune que pode compreender um anticorpo anti-KIR2DL2. Em uma outra modalidade, uma composição para uso no tratamento de um distúrbio autoimune que pode compreender um anticorpo anti-KIR2QDL3. Em uma outra modalidade, uma composição para uso no tratamento de um distúrbio inflamatório que pode compreender um anticorpo anti-KIR2DL1. Em uma outra modalidade, uma composição para uso no tratamento de um distúrbio inflamatório que pode compreender um anticorpo anti-KIR2DL2. Em uma outra modalidade, uma composição para uso no tratamento de um distúrbio inflamatório que pode compreender um anticorpo anti-KIR2DL3.

Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona o uso de um anticorpo anti-KIR2DL1 na preparação de um fármaco para o tra- tamento de um distúrbio autoimune. Em uma modalidade, a presente inven- ção proporciona o uso de um anticorpo anti-KIR2DL2 na preparação de um fármaco para o tratamento de um distúrbio autoimune. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona o uso de um anticorpo anti-KIR2DL3 na preparação de um fármaco para o tratamento de um distúrbio autoimune.

Em uma modalidade, a presente invenção proporciona o uso de um anticor- po anti-KIR2DL1 na preparação de um fármaco para o tratamento de uma doença inflamatória. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona o uso de um anticorpo anti-KIR2DL2 na preparação de um fármaco para o tratamento de uma doença inflamatória. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona o uso de um anticorpo anti-KIR2DL3 na preparação de um fármaco para o tratamento de uma doença inflamatória. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um mé- todo para produzir um anticorpo para o tratamento de um distúrbio inflamató- rio ou autoimune, o referido método pode compreender as etapas de: (a) imunização de um mamífero não humano com um imunogênio pode com- preender um Polipetídeo de KIR2DL1, 2 e/ou 3, (b) seleção de anticorpos a partir do referido mamífero imunizado, em que os referidOs anticorpos se ligam ao referido polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3, e (c) selecionar anticorpos de(b), que potenciam a eliminação de células NK ' células T. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um mé- todo para produzir um anticorpo para o tratamento de um distúrbio inflamató- rio ou autoimune, o referido método pode compreender as etapas de: (a) proporcionar uma biblioteca de anticorpos através de tecnologia de exibição em fagos,(b) biblioteca, em que os referidOs anticorpos se ligam ao referido polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3, e (c) selecionar anticorpos de (b), que po- tenciam a eliminação ou a depleção de células T por meio das células NK. Estes aspectos são descritos mais detalhadamente em, e outros aspectos, características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partirda descrição da presente invenção fornecida aqui.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1A mostra uma diminuição na percentagem de células marcadas CSFE-(Con A blastos) em PBMC em camundongos KIR2DL3tg B6 quando tratados com o anticorpo 1-7F9, em comparação com os não tra- tados camundongos KIR2DL3tg B6 e os camundongos C57BL6 tratados e não tratados. A Figura 1B representa uma diminuição na percentagem de cé-

lulas de baço com marcador CSFE em camundongos KIR2DL3tg B6 quando tratados com o anticorpo 1-7F9, em comparação com os camundongos KIR2DL3tg B6 não tratados e camundongos C57BL6 tratados e não trata- dos.

A Figura 2 representa uma diminuição na sobrevivência de KBDB-/ -CW3 blastos ConA em PBMC e no baço de camundongos B6 KIR2DL3tg quando tratados com o anticorpo 1-7F9, em comparação com os camundongos não tratadas KBDB KO CW3 tg.

DESCRIÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO A fim de que a presente invenção descrita aqui possa ser total- mente compreendida, a seguinte descrição detalhada é apresentada. Várias modalidades da presente invenção são descritas em pormenores e podem ser adicionalmente ilustradas por meio dos exemplos fornecidos. Definições A menos que definido de uma outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado que os vulgarmente entendidos por meio de uma pessoa versada na técnica à qual pertence esta presente invenção. Embora métodos e materiais simila- res ou equivalentes aos descritos na presente invenção podem ser usados outestados na invenção, os métodos e materiais adequados são descritos a seguir. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos, e não se destinam a ser limitativos.

Como usado na descrição aqui e em toda as reivindicações que se seguem, o significado de"a","um","uma" e "o", inclui referência plural a menos que o contexto indique claramente o contrário.

O termo "célula que apresenta antigênios", como usado na pre- sente invenção, refere-se de uma maneira geral às células apresentadoras de antigênios profissionais (por exemplo, linfócitos B, monócitos, células dendríticas e as células de Langerhans) assim como outras células apresen- tadoras de antigênios (por exemplo, queratinócitos, células endoteliais, as- trócitos, fibroblastos e oligodendrócitos).

O termo "aminoácido", tal como usado na presente invenção re-

fere-se de uma maneira geral aos ácidos que ocorrem naturalmente e ami- noácidos sintéticos, bem como a análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de um modo semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são os codificados pormeio do código genético, bem como os aminoácidos que são posterior- mente modificados (por exemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, e O- fosfoserina.) Os análogos de aminoácidos referem-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natu- ral (isto é, um um átomo de carbono que está ligado a um átomo de hidrogê- nio, um grupo carboxila, um grupo amino), e um grupo R (por exemplo, ho- moserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio.) Estes análogos possuem os grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou estruturas principais peptídicas modificadas, mas retêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural. Os miméticos de aminoácidos referem-se aos compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que fun- ciona de um modo semelhante a um aminoácido de ocorrência natural. O termo "anergia"ou"tolerância", tal como é usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a refratariedade da ativação da estimulação mediada pelo receptor. Tal refratariedade é geralmente especí- fica do antigênio e persiste após a exposição á tolerância ao antigênio ter cessado.

Os termos"anticorpos", tal como é usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a uma"porção de ligação ao antigênio"de um anticorpo (também usado alternadamente com"porção de anticor- po" "fragmento de ligação ao antigênio” "fragmento de anticorpo"), bem co- mo as moléculas de anticorpo inteiras. O termo "porção de ligação ao anti- gênio", tal como é usado na presente invenção, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especifica- mentea um antigênio (por exemplo, KIR2DL1, 2 e/ou 3). Tem sido demons- trado que a função de ligação ao antigênio de um anticorpo pode ser execu- tada por meio dos fragmentos de um anticorpo de comprimento completo.

Exemplos de fragmentos de ligação ao antigênio englobados no termo "por- ção de ligação ao antigênio"de um anticorpo incluem (a) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1, (b) um fragmento F (ab ') 2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por meio de uma ponte de dissulfureto na região de dobradiça, (c) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1, (d) um fragmento Fv que consiste dos domínios VL e VH de um um único braço de um anticorpo, (e) um fragmento dAb (Ward et al (1989) Nature 341: 544 a

546.), que consiste em um domínio VH e (f) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por meio dos genes separados, eles podem ser ligados, utilizando métodos recombinantes, por meio de um ligante sintético que permite que sejam constUTlídos por meio de uma única cadeia de proteína em que os pares das regiões VL e VH formam as molé- culas mono valentes (conhecidas como Fv da cadeia simples (scFv), Vide, por exemplo, Bird, et al (1988) Science 242: 423 a 426, Huston, et al (1988) Proc Natl Acad Sci. USA 85: 5879 a 5883, e Osbourn et al (1998) Nat Biote- chnol 16 a 778. Tais anticorpos da cadeia simplestambém se destinam a ser englobados no termo "porção de ligação ao antigênio"de um anticorpo.

Qualquer uma das sequências VH e VL de scFv específico pode ser ligada à imunoglobulina da região de cDNA ou sequências genômicas humanas constantes, de modo a gerar vetores de expressão que codificam as molécu- las de IgG completas ou outros isotipos. VH e VL, podem também ser usa- dos na geração de fragmentos Fab, Fv, ou outros fragmentos de imunoglo- —bulnas utilizando quer química de proteínas ou tecnologia de DNA recombi- nante. Outras formas de anticorpos da cadeia simples, tais como diacorpos estão também englobadas. Os diacorpos são bivalentes, anticorpos biespe- cicos em que os domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia po- lipeptídica, mas utilizando um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando assim os domínios a emparelhar com domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antigênio. Vide, por exemplo, Holliger, et al.

(1993) Proc Natl. Acad Sci EUA 90: 6444-6448; Poljak, et al (1994) Structure 2: 1121 a 1123. Mais ainda, um anticorpo ou uma porção de ligação ao antigênio da mesma (fragmento de ligação ao antigênio, fragmento de anticorpo, a porção de anticorpo), podem ser parte de moléculas de imunoadesão maio- res, formadas por meio da associação covalente ou não covalente do anti- corpo, ou porção de anticorpo, com uma ou mais outras proteínas ou peptí- deos. Exemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem a uso da região núcleo de estreptavidina para fazer uma molécula scFv tetramérica (Kipriya- nov, et al (1995) Hum. Antibodies Hibridomas 6: 93 a 101) e a uso de um resíduo de cisteína, um peptídeo marcador e uma etiqueta polihistidina Do terminal C para fazer as moléculas scFv bivalentes e biotina. Kipriyanov, et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047 a 1058. As porções de anticorpos, tais como Fab e F (ab ') 2, podem ser preparadas a partir de anticorpos totais, usando as técnicas convencionais, tais como digestão com papaína ou pep- sina, respectivamente, de anticorpos completos. Além disso, Os anticorpos, porções de anticorpos e moléculas de imunoadesão podem ser obtidos u- sando as técnicas de DNA recombinante convencionais, como descrito na presente invenção.

Os anticorpos podem ser policlonais, monoclonais, xenogênicos, alogênicos, singeneicos, ou formas modificadas do mesmo, por exemplo, humanizadas, quiméricas. De preferência, Os anticorpos da presente inven- ção se ligam especificamente ou substancialmente especificamente ao Poli- peptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3s. Os termos"anticorpos monoclonais" e "compo- siçãode anticorpo monoclonal", tal como usado na presente invenção, refe- rem-se a uma população de moléculas de anticorpo que contêm apenas uma espécie de um local de ligação ao antigênio capazes de imunorreagir com um epitopo particular de um antigênio, enquanto que o termo "policlonal anticorpos" e "composição de anticorpo policlonal"refere-se a uma popula- ção de moléculas de anticorpo que contêm múltiplas espécies de locais de ligação ao antigênio capazes de interagir com um antigênio particular. Uma composição de anticorpo monoclonal, apresenta tipicamente uma única afi-

nidade de ligação para um antigênio particular com o qual ele imunorreage. O termo "antigênio", tal como é usado na presente invenção, re- fere-se de uma maneira geral a uma molécula ou uma porção de uma molé- cula capaz de ser ligada por um anticorpo que é adicionalmente capaz de induzir um animal a produzir um anticorpo capaz de se ligar a um epitopo desse antigênio. Um antigênio pode ter um epitopo, ou tem mais do que um epitopo. A reação específica referida na presente invenção indica que o anti- gênio irá reagir, de uma forma altamente seletiva, com o seu anticorpo cor- respondente e não com a multidão de outrOs anticorpos que podem ser e- —vocados por meio de outros antigênios. No caso de uma resposta imune aumentada desejada para antigênios específicos de interesse, tais antigê- nios incluem, mas não estão limitados a, antigênios da doença infecciosa para a qual uma resposta imunitária protetora pode ser eliciada são exem- plares.

O termo "molécula de ácido nucleico antissentido", como usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma"sensação"de ácido nucleico que codifica para uma proteína (por exemplo, complementar à cadeia de codifi- cação de uma molécula de CDNA da cadeia dupla) complementar com uma sequência de MRNA ou complementar da cadeia codificadora de um gene. Dessa maneira, uma molécula de ácido nucleico antissentido pode ligar-se hidrogênio a uma molécula de ácido nucleico de sentido.

O termo "apoptose", como usado na presente invenção, refere- se de uma maneira geral à morte de célula programada, a qual pode ser ca- racterizada através de técnicas que são conhecidas na técnica. A morte de célula por apoptose pode ser caracterizada por meio do encolhimento de célula, membrana Blebbing, e a condensação da cromatina culminando na fragmentação de célula. As células em apoptose também exibem um padrão característico de clivagem internucleossômica de DNA.

O termo "autoimunidade"ou"doença ou condição autoimune", tal como é usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a uma doença ou distúrbio decorrente e dirigida contra os próprios tecidos do indi-

víduo ou de uma co-segregação ou suas manifestações ou condição daí re- sultante.

O termo "anticorpo quimérico”", tal como é usado na presente in- venção, se refere de uma maneira geral a uma molécula de anticorpo em quearegião constante, ou uma sua porção, é alterada, substituída ou troca- da de modo que o local de ligação ao antigênio (região variável) é ligado a uma constante região de uma classe diferente ou alterada, a função efetora e/ou espécie, ou uma molécula inteiramente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimico, por exemplo, uma enzima, toxina, hor- mona, fator de crescimento, fármaco, a região variável ou de uma porção respectiva, é alterada, substituída ou trocada com uma região variável com especificidade para o antigênio diferente ou alterado.

O termo "região de codificação", como usado na presente inven- ção, refere-se de uma maneira geral a regiões de uma sequência de nucleo- tídeos que compreende os códons que são traduzidos em resíduos de ami- noácidos, enquanto que o termo "região codificante"refere-se a regiões de uma sequência nucleotídica que não são traduzidas em aminoácidos (por exemplo, as regiões 5 'e 3' não traduzidas). As"variantes modificadas conservadoramente", como usado na presente invenção, aplica-se a ambas sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos, e no que diz respeito a determinadas sequências de ácido nuclei- co, refere-se de uma maneira geral a variantes modificadas de forma con- servadora refere-se aos ácidos nucleicos que codificam as sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas ou onde o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, a sequências essencialmente idêntica.

Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteí- na.

Tais variações de ácidos nucleicos são"variações silenciosas", que são uma espécie de variações conservadora modificadas.

Cada sequência de ácido nucleico na presente invenção que codifica para um polipetídeo tam- bém descreve qualquer possível variação silenciosa do ácido nucleico.

Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que cada códon em um ácido nucle-

ico (exceto AUG, que é normalmente o único códon para metionina, e TGG, que é normalmente o único códon para triptofano) pode ser modificado para originar uma molécula idêntica funcionalmente.

O termo "região determinante de complementaridade","região hipervariável", ou"CDR", tal como é usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a uma ou mais das regiões hiper-variáveis , ou com- plementarmente determinante (CDR) encontradas nas regiões variáveis de cadeia leve ou pesada de um anticorpo. Vide Kabat, et al. (1987), "Sequên- cias de Proteínas de Interesse imunológica" National Institutes of Health, Bethesda, MD. Estas expressões incluem as regiões hipervariáveis , tal co- mo definidas por Kabat, et al. (1983),"Sequências de proteínas de interesse imunológica"EUA Departamento de Saúde e Serviços Humanos ou as alças hipervariáveis em estruturas 3-dimensionais de anticorpos. Chotia e Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 a 917. As CDR em cada cadeia são mantidas em estreita proximidade pelas regiões estruturais e com as CDR da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antigênio. Dentro dos CDRs existem aminoácidos selecionados que têm sido descritos como a seletividade das regiões determinantes (DSE), que representam os resíduos de contato críticos usados pelo CDR na interação anticorpo-antigênio. Ca- xemira (2005) Métodos 36: 25 a 34.

O termo "quantidade de controle", tal como é usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a um marcador que pode ser qualquer valor ou uma gama de valores a ser comparado com um valor de ensaio de um marcador. Por exemplo, uma quantidade de um marcador de controle pode ser a quantidade de um marcador em um paciente com uma doença ou condição particular ou um indivíduo sem a referida doença ou condição. A quantidade de controle pode ser em quantidade absoluta (por exemplo, micrograma/ml) ou uma quantidade relativa (por exemplo, a inten- sidade relativa dos sinais).

O termo "diagnóstico"como usado na presente invenção, refere- se de uma maneira geral para identificar a presença ou natureza de uma condição patológica. Os métodos de diagnóstico diferem na sua especifici-

dade e sensibilidade. A"sensibilidade"de um teste de diagnóstico é a porcen- tagem de indivíduos pacientes com teste positivo (porcentagem dos "verda- deiros positivos"). Os pacientes particulares que não foram detectados por ensaio são"falsos negativos". Indivíduos que não estão doentes e que apre- sentaram teste negativo no ensaio são denominados"verdadeiros negativos". A"especificidade"de um ensaio de diagnóstico é um menos a taxa de falsos positivos, quando a taxa de"falso positivo"é definida como a proporção de pessoas sem a doença que testam positivo. Enquanto um método de diag- nóstico particular pode não proporcionar um diagnóstico definitivo de uma condição, é suficiente que o método venha a proporcionar uma indicação positiva que ajuda no diagnóstico.

O termo "diagnosticar", tal como usado na presente invenção re- fere-se de uma maneira geral a classificação de uma doença ou um sintoma, determinando uma severidade da doença, a monitorização da progressão da doença,a previsão de um resultado de uma doença e/ou de perspectivas de recuperação. O termo "detecção", também pode opcionalmente incluir qual- quer um dos precedentes. O diagnóstico de uma doença, de acordo com a presente invenção pode, em algumas modalidades, ser afetado por meio da determinação do nível de um polinucleotídeo ou de um polipetídeo da pre- sente invenção, em uma amostra biológica obtida a partir do indivíduo, em que o nível determinado pode ser correlacionado com a predisposição, ou a presença ou ausência da doença. Deve notar-se que uma"amostra biológica obtida a partir do indivíduo"também pode compreender, opcionalmente, uma amostra que não tenha sido fisicamente removido do indivíduo.

O termo "quantidade eficaz", como usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral à quantidade de um composto, o anticorpo, antigênio ou células que, quando administrado a um paciente para tratamen- to de uma doença, é suficiente para efetuar esse tratamento para a doença. A quantidade eficaz pode ser uma quantidade eficaz para a profilaxia e/ou uma quantidade eficaz para a prevenção. A quantidade eficaz pode ser uma quantidade eficaz para reduzir, em uma quantidade eficaz para prevenir a incidência dos sinais/sintomas, reduzir a gravidade da ocorrência de si-

nais/sintomas, eliminar a incidência de sinais/sintomas, para retardar o de- senvolvimento da incidência de sinais/sintomas, para prevenir o desenvolvi- mento da incidência de sinais/sintomas, e/ou para a profilaxia efeito da inci- dência de sinais/sintomas. A"quantidade eficaz"pode variar, dependendo da doençae da sua gravidade e da idade, peso, história médica, a sensibilida- de, e condições pré-existentes do paciente a ser tratado. O termo "quantida- de eficaz"é sinônimo de"quantidade terapeuticamente eficaz"para os fins da presente invenção.

O termo "domínio extracelular", como usado na presente inven- ção refere-se de uma maneira geral à porção de uma proteína que se esten- dem a partir da superfície de uma célula.

O termo "vetor de expressão", tal como é usado na presente in- venção, refere-se de uma maneira geral a qualquer sistema de expressão recombinante para o propósito de expressar uma sequência de ácido nuclei- coda presente invenção, in vitro ou in vivo, ou constUTltivamente a inducibi- lidade, em qualquer célula, incluindo os procariotas, de levedura, fungos, plantas, células de inseto ou mamífero. O termo inclui os sistemas de ex- pressão lineares ou circulares. O termo inclui os sistemas de expressão que permanecem epissomal ou integração no genoma da célula hospedeira. Os sistemas de expressão podem ter a capacidade de auto-replicação ou não, ou seja, conduzir apenas a expressão transiente em uma célula. O termo inclui os cassetes de expressão recombinantes, que contêm apenas os ele- mentos mínimos necessários para a transcrição do ácido nucleico recombi- nante.

O termo "receptor de Fc"(FcRs), tal como usado na presente in- venção, refere-se de uma maneira geral a receptores de superfície de célula para a porção Fe de moléculas de imunoglobulina (lg 's). Os receptores Fc são encontrados em várias células que participam em respostas imunes. Entre as FcR humanas que tenham sido identificadas até agora são aquelas que reconhecem IgG (Fc designado y R), IgE (Fc e R1), IMA (a Fc R) e IGM/A polimerizada (Fcy a R). FcR são encontrados nos seguintes tipos de célulaes: Fc a RI (mastócitos), Fc RII (muitos leucócitos), Fc a R (neutrófilos)

e Fcu a R (epitélio glandular, hepatócitos). Hogg (1988) Immunol. Today 9: 185-86. Os Rs Fci amplamente estudados são centrais nas defesas imunes de célulaes, e são responsáveis por estimular a liberação de mediadores da inflamação e enzimas hidrolíticas envolvidas na patogênese da doença auto- imune. Unkeless (1988) Annu. Rev. Immunol. 6: 251 a 87. O Fc y Rs forne- cer um elo crucial entre as células efetoras e os linfócitos que secretam lg, uma vez que os macrôfagos/monócitos, leucócitos polimorfonucleares e a célula natural assassina (NK) Fc gamma Rs confere um elemento de reco- nhecimento específico mediado por IgG. Os leucócitos humanos possuem pelo menos três receptores diferentes para IgG: hFcy RI (encontrada em monócitos/macrôfagos), HFC gamma RII (em monócitos, neutrófilas, eosinó- filas, plaquetas, células B, e, possivelmente, a linhagem de células K562) e Fegammalll (em células NK, neutrófilas, eosinófilas e macrôfagos).

No que diz respeito às células T, a transmissão de um sinal co- estimulador a uma célula T envolve uma via de sinalização que não é inibida pela ciclosporina A. Além disso, um sinal co-estimulador pode induzir a se- creção de citoquinas (por exemplo, IL-2 e/ou I1L-10) em uma célula T e/ou para prevenir a indução de ausência de resposta ao antigênio, a indução de anergia, ou a indução de morte de célula na célula T.

O termo "região de estrutura"ou"FR", tal como é usado na pre- sente invenção, refere-se de uma maneira geral a uma ou mais das regiões de estrutura no interior das regiões variáveis das cadeias leve e pesada de um anticorpo. Vide Kabat, et al. (1987),"Sequências de Proteínas de Interes- se imunológica"National InstuTItes of Health, Bethesda, MD. Estas expres- sões incluem as regiões da sequência de aminoácidos interpostas entre os CDRs dentro das regiões variáveis das cadeias leve e pesada de um anti- corpo.

O termo "heterólogo", tal como é usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a porções de um ácido nucleico indica que o ácido nucleico inclui duas ou mais subsequências que não se encontram na mesma relação entre si na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipica- mente produzido recombinantemente, tendo duas ou mais sequências de genes não relacionados arranjados para fazer um novo ácido nucleico fun- cional (por exemplo, um promotor de uma fonte e uma região de codificação de outra fonte.) Do mesmo modo, uma proteína heteróloga indica que a pro- teína inclui duas ou mais subsequências que não se encontram na mesma relação entre si na natureza (por exemplo, uma proteína de fusão).

O termo "alta afinidade", como usado na presente invenção, re- fere-se de uma maneira geral a um anticorpo possuindo uma KD de pelo menos 10-8 M, mais preferencialmente pelo menos 10-9 M, e ainda mais preferencialmente pelo menos 10-10 M para um antigênio alvo. No entan- to/elevada afinidade"de ligação pode variar para outros isotipos do anticor- po. Por exemplo, "elevada afinidade"de ligação para um isotipo IgM refere-se a um anticorpo possuindo uma KD de pelo menos 10-7 M, mais preferenci- almente pelo menos 10º M.

O termo "homologia", tal como é usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a um grau de semelhança entre uma se- quência de ácido nucleico e uma sequência de ácido nucleico de referência, ou entre uma sequência de polipetídeo e uma sequência de polipetídeo de referência. A homologia pode ser parcial ou completa. A homologia completa indica que o ácido nucleico ou as sequências de aminoácidos são idênticas.

Um ácido nucleico homólogo parcialmente ou a sequência de aminoácidos é um que não é idêntico à referência de ácido nucleico ou sequência de ami- noácidos. O grau de homologia pode ser determinado por meio da compara- ção de sequências. O termo "identidade de sequência"pode ser usado alter- nadamente com"homologia".

O termo "célula hospedeira", tal como é usado na presente in- venção, refere-se de uma maneira geral para se referir a uma célula na qual uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, tal como um vetor de expressão recombinante da presente invenção, foi introduzido. As células hospedeiras podem ser células procariotas, tais como E. coli, ou células eu- carióticas, tais como leveduras, de insetos (por exemplo, Sf9), anfíbio ou células de mamífero, tais como CHO, HeLa, HEK-293, por exemplo, as célu- las cultivadas, explantes, e as células in vivo. Os termos"célula hospedeira"

e "cula hospedeira recombinante"são usados na presente invenção indife- rentemente.

Deve ser entendido que tais termos se referem não só à célula indivíduo em particular, mas a progênie ou progênie potencial de tal célula.

Porque podem ocorrer certas modificações em gerações, quer devido a mu- taçãooua influências ambientais, tal progênie não pode, de fato, ser idênti- ca à célula parental, mas está ainda incluída no âmbito do termo como usa- do na presente invenção.

O termo "anticorpo humanizado", como usado na presente in- venção, refere-se de uma maneira geral para incluir Os anticorpos produzi- dos por meio de uma célula não-humana possuindo as regiões variáveis e constantes que foram alteradas para se assemelhar aOs anticorpos adicio- nais que seriam produzidos por uma célula humana.

Por exemplo, por meio da alteração da sequência de aminoácidos do anticorpo não-humano para incorporar os aminoácidos encontrados nas sequências de imunoglobulina dalinha germinativa humana.

Os anticorpos humanizados da presente in- venção podem incluir os resíduos de aminoácidos não codificados por meio das sequências de imunoglobulinas da linha germinativa humana (por e- xemplo, mutações introduzidas por meio da mutagênese ao acaso, ou espe- cífica do local in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo nas CDRs.O termo "anticorpo humanizado", como usado na presente invenção, também inclui anticorpos em que sequências CDR derivadas da linha germi- nativa de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foi enxerta- do nas sequências de estrutura humana.

O termo "hibridação", como usado na presente invenção, refere- sede uma maneira geral à interação física de filamentos de polinucleotídeos complementares (incluindo parcialmente complementar) por meio da forma- ção de ligações de hidrogênio entre nucleotídeos complementares, quando os filamentos são dispostos antiparalelo ao outro.

O termo "célula imune", tal como é usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral às células que são de origem hematopoiéti- ca e que desempenham um papel na resposta imune.

As células imunes incluem linfócitos, tais como as células B e células T, células assassinas na-

turais e células mieloides, tais como monócitos, macrôfagos, eosinófilas, mastócitos, basófilas, e granulócitos.

O termo "Imunoensaio", como usado na presente invenção, refe- re-se de uma maneira geral a um ensaio que utiliza um anticorpo para se ligar especificamente um antigênio.

O imunoensaio pode ser caracterizado por meio do uso das propriedades específicas de ligação de um anticorpo particular para isolar, direcionar e/ou quantificar o antigênio.

O termo "resposta imune", tal como é usado na presente inven- ção, refere-se de uma maneira geral as respostas imunitárias mediadas por meio das células T e/ou por meio das células B, que são influenciadas por meio da modulação de co-estimulação de células T.

As respostas imunitárias exemplares incluem as respostas de células B (por exemplo, a produção de anticorpos), as respostas de células T (por exemplo, a produção de citoqui- nas, e da citotoxicidade de célula) e a ativação de células que respondem a citoquina, por exemplo, os macrôfagos.

Tal como usado na presente inven- ção, o termo "baixa modulação", com referência à resposta imune inclui uma diminuição em uma ou mais respostas imunitárias, enquanto que o termo "alta modulação", com referência à resposta imune inclui um aumento em quaisquer uma ou mais respostas imunológicas.

Será entendido que a alta modulação de um tipo de resposta imunitária pode levar a uma baixa modu- lação correspondente em um outro tipo de resposta imunitária.

Por exemplo, alta modulação da produção de certas citocinas (por exemplo, IL-10) pode levar a baixa modulação das respostas imunes de célulaes.

O termo "condições inflamatórias ou doença inflamatória", tal como usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a doen- ças inflamatórias crônicas ou agudas.

O termo "isolado", tal como é usado na presente invenção, refe- re-se de uma maneira geral ao material removido do seu ambiente original, de ocorrência natural, e dessa maneira, é alterado pela mão do homem, a partirdoseu ambiente natural.

O material isolado pode ser, por exemplo, o ácido nucleico exógeno incluído em um sistema de vetor, o ácido nucleico exógeno contido dentro de uma célula hospedeira, ou de qualquer material que tenha sido removido do seu ambiente original e, dessa maneira, alterado pela mão do homem (por exemplo,"isolado anticorpo"). Por exem- plo, "isolado"ou"purificado", como usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a uma proteína, DNA, anticorpos, RNA ou parte biologi- camente ativa da mesma, que é substancialmente isenta de material de cé- lula ou outras proteas contaminantes a partir da célula ou tecido fonte a par- tir do qual a substância biológica é derivada, ou substancialmente livre de percursores químicos ou outras substâncias químicas quando sintetizadas quimicamente.

A linguagem"substancialmente livre de material de célu- la"incluias preparações de KIR2QDL1, 2 e/ou 3 proteínas em que a proteína é separada dos componentes de célulaes das células a partir da qual é isolada ou produzida de forma recombinante.

O termo "K-assoc"ou"Ka", tal como é usado na presente inven- ção, refere-se de uma maneira geral à taxa de uma determinada interação de associação anticorpo-antigênio, ao passo que o termo "Kdiss"ou"Kd", tal como é usado na presente invenção, refere-se à dissociação da taxa de uma determinada interação anticorpo-antigênio.

O termo "DK", tal como usado na presente invenção, pretende referir-se à constante de dissociação, o qual é obtido a partir da relação de Kd para Ka (isto é, Kd/Ka), e é expresso como a concentração molar (M). Os valores de Kd para anticorpos podem ser de- terminados usando os métodos bem estabelecidos na técnica.

O termo "etiqueta"ou"porção detectável", tal como usado na pre- sente invenção, refere-se de uma maneira geral a uma composição detectá- vel por meio dos métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, i- munoquímicos, outros meios físicos ou químicos.

O termo "baixa severidade", "rigor médio", "rigor elevado" ou "condições de rigor muito elevado", como usado na presente invenção, refe- re-se de uma maneira geral a condições de hibridação de ácidos nucleicos e de lavagem.

As orientações para a realização de reações de hibridação po- dem ;ser encontradas em Ausubel et al. (2002) Shorts Protocols in Molecular Biology (5a ed.) John Wiley & Sons, Nova lorque.

Exemplos de condições de hibridação específicas incluem, mas não estão limitados a: (1) as condições de hibridação de baixa restringência de cloreto de sódio/citrato de sódio 6X (SSC) a cerca de 45C, seguido por duas lavagens em 0.2XSSC, 0,1% de SDS, pelo menos, 50 (a temperatura das lavagens p ode ser aumentada para 55 durante as condições de baixo rigor), (2) condições de hibridação de rigor médio ems6 x SSC a cerca de 45T, seguido por uma ou mais lava- gens em 0.2XSSC, 0,1% SDS a 60, (3) condies de hi bridao de elevado rigor em 6 x SSC a cerca de 45C, seguido por uma ou mais lavagens em

0.2XSSC, 0,1% SDS a 650, e (4), as condições de hi bridação de muito ele- vado rigor são fosfato de sódio a 0,5 M, SDS a 7% a 65C, seguido por meio deuma ou maislavagensem0O.2XSSC, 1% de SDS a 65ºC.

O termo "Mamiífero", tal como usado na presente invenção, refe- re-se de uma maneira geral a qualquer e todos os animais vertebrados de sangue quente da classe Mammalia, incluindo seres humanos, caracteriza- dos por uma cobertura de pêlo sobre a pele e, nas fêmeas, de produção de leite, as glândulas mamarias para nutrir os jovens. Exemplos de mamíferos incluem, mas não estão limitados a alpacas, tatus, capivaras, gatos, came- los, chimpanzés, chinchilas, bovinos, cães, cabras, gorilas, hamsters, cava- los, seres humanos, os lêmures, lhamas, camundongos, primatas não- humanos, porcos, camundongos, ovelhas, musaranhos, esquilas, e antas.

Mamíferos incluem, mas não estão limitados a espécie bovina, canina, feli- na, equina, murina, ovina, suína, de primatas e de roedores. Mamífero tam- bém inclui qualquer e todos aqueles listados nas espécies de mamíferos do mundo mantido pelo Museu Nacional de História Natural, Smithsonian Ins- tUTItion, em Washington DC.

O termo "molécula de ácido nucleico de ocorrência natural", co- mo usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a uma mo- lécula de RNA ou DNA tendo uma sequência nucleotídica que ocorre na na- tureza (por exemplo, codifica uma proteína natural).

O termo "ácido nucleico"ou"sequência de ácido nucleico", como usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a um oligonu- cleotídeo desóxi-ribonucleotídeo ou ribonucleotídeo quer na forma simples ou da cadeia dupla. O termo abrange ácidos nucleicos, isto é, oligonucleotí-

deos, que contêm análogos conhecidos de nucleotídeos naturais. O termo também abrange estruturas de ácido nucleico, como com as estruturas prin- cipais sintéticas. A menos que seja especificado de uma outra maneira, uma sequência de ácido nucleico particular, implicitamente também abrange vari- antes modificadas de forma conservadora do mesmo (por exemplo, substitu- ições de códon degeneradas) e sequências complementares, assim como a sequência indicada explicitamente. O termo ácido nucleico é usado alterna- damente com gene, CDNA, mRNA, oligonucleotídeo e polinucleotídeo. O termo "operacionalmente ligado", tal como é usado na presen- te invenção, refere-se de uma maneira geral a quando dois fragmentos de DNA são ligados de tal forma que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de DNA permanecem na estrutura.

O termo "paratopo", como usado na presente invenção, refere- se de uma maneira geral com a parte de um anticorpo que reconhece um —antigênio (por exemplo, o local de ligação ao antigênio de um anticorpo.) Os paratopos podem ser de uma pequena região (por exemplo, 15-22 aminoá- cidos) da região Fv do anticorpo e podem conter partes da cadeias pesadas e leves do anticorpo. Vide Goldsby, et al. Antígenos (Capítulo 3) Imunologia (5th ed.) New York: WH Freeman and Company, páginas 57 a 75.

O termo "paciente", como usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a qualquer animal que esteja em necessidade de tra- tamento, quer para aliviar um estado de doença ou para prevenir a ocorrên- cia ou recorrência de um estado de doença. Além disso, o termo "paciente", tal como usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a qualquer animal que tem fatores de risco, uma história de doença, a suscep- tibilidade, os sintomas, sinais, que foi diagnosticado anteriormente, está em risco de, ou é um membro de uma população de pacientes para uma doen- ça. O paciente pode ser um paciente clínico, como um ser humano ou um paciente veterinário como um animal de companhia, doméstico, pecuária, exótico, ou animal de zoológico. O termo "indivíduo"pode ser usado alterna- damente com o termo "paciente".

O termo "polipeptídeo","peptídeo" e "proteína"são usados indiferentemente e referem-se de uma maneira geral a um polímero de resí- duos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um análogo ou mimético do cor- respondente aminoácido de ocorrência natural, bem como a ocorrência natu- ralde polímeros de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de ami- noácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um produto quími- co artificial mimético do correspondente aminoácido de ocorrência natural, bem como a polímeros de ocorrência natural e polímeros de aminoácidos de ácido de ocorrência não natural de amino. Os polipetídeos podem ser modi- ficados, por exemplo, através da adição de resíduos de hidratos de carbono para as glicoproteínas de forma. Os termos "polipetídeo", "peptídeo" e "pro- teína" incluem as glicoproteínas, bem como não-glicoproteínas.

O termo "promotor", tal como é usado na presente invenção, re- fere-se de uma maneira geral a um conjunto de sequências de ácidos nucle- icos que direciona a transcrição de um ácido nucleico. Tal como usado na presente invenção, um promotor inclui as sequências de ácido nucleico ne- cessárias perto do local de iniciação da transcrição, como por exemplo, no caso de um promotor do tipo polimerase Il, um elemento TATA. O promotor inclui também opcionalmente os elementos de intensificador distal ou re- pressor, que podem estar localizados até vários milhares de pares de bases a partir do local do início da transcrição. Um promotor"constitutivo "é um promotor que está ativo na maioria das condições ambientais e de desenvol- vimento. Um promotor"induzido"é um promotor que está ativo sob regulação ambiental ou de desenvolvimento.

O termo "quantidade profilaticamente eficaz", como usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral à quantidade de um composto que, quando administrado a um paciente para a profilaxia de uma doença ou a prevenção da recorrência de uma doença, é suficiente para efe- tuar esse para a profilaxia doença ou recorrência. A quantidade profilatica- mente eficaz pode ser uma quantidade eficaz para prevenir a ocorrência de sinais e/ou sintomas. A"quantidade profilaticamente eficaz"pode variar, de- pendendo da doença e da sua gravidade e da idade, peso, história médica, a predisposição para condições, doenças preexistentes, do paciente a ser tra- tado.

O termo "profilaxia", como usado na presente invenção, refere- se de uma maneira geral a um curso de terapia onde os sinais e/ou sinto- mas, não estão presentes no paciente, estão em remissão, ou estavam pre- sentes anteriormente em um paciente. A profilaxia inclui a prevenção da do- ença que ocorre subsequente ao tratamento de uma doença em um pacien- te. Além disso, a prevenção inclui o tratamento de pacientes que podem po- tencialmente desenvolver a doença, especialmente os pacientes que são suscetíveis à doença (por exemplo, membros de uma população de patente, aqueles com fatores de risco, ou em risco de desenvolver a doença).

O termo "recombinante", como usado na presente invenção, re- fere-se de uma maneira geral com a referência a um produto, por exemplo, a uma célula ou ácido nucleico, proteína ou vetor indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, foi modificado pela introdução de um ácido nu- cleico ou proteína heterólogos ou a alteração de um ácido nucleico ou prote- Ína nativa ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Dessa maneira, por exemplo, células recombinantes expressam os genes que não são encontrados dentro da forma (não recombinante) nativa da célula ou expressam os genes nativos que de outra forma anormalmente expressos, sobexpressos ou não são expressos em todos.

O termo "especificamente (ou seletivamente) se liga"a um anti- corpo —ou"especificamente (ou seletivamente) imunorreativo com", ou"interage ou liga-se especificamente", como usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a uma proteína ou peptídeo (ou outro epito- po) refere-se, em algumas modalidades, a uma reação de ligação que é de- terminativa da presença da proteína em uma população heterogênea de pro- teínas e outros produtos biológicos. Por exemplo, sob condições de imuno- ensaio designadas, Os anticorpos especificados ligam a uma proteína em particular, pelo menos, duas vezes maior do que o fundo (o sinal não- específico), e não se ligam substancialmente em uma quantidade significati- va a outras proteínas presentes na amostra. Uma reação específica ou sele-

tiva, será tipicamente pelo menos duas vezes o sinal de fundo ou o ruído e mais tipicamente superior a cerca de 10 a 100 vezes o fundo.

O termo "Especificamente hibrida" e "complementar", tal como usado na presente invenção, referem-se de uma maneira geral a um ácido nucleico que pode formar ligação (s) de hidrogênio com outra sequência de ácido nucleico por meio tanto do tipo Watson-Crick ou de outros tipos não- tradicionais.

A energia livre de ligação para uma molécula de ácido nucleico com a sequência complementar é suficiente para permitir a função corres- pondente do ácido nucleico de proceder, por exemplo, a atividade de RNAi.

A determinação das energias livres de ligação para as moléculas de ácidos nucleicos é bem conhecida na técnica.

Vide, por exemplo, Turner et al. (1987) CSH Simp.

Quant.

Biol.

LIl: 123 a 33; Frier et al. (1986) PNAS 83: 9373 a 77; Turner et al. (1987) J.

Am.

Chem.

Chem.

Soe. 109: 3783 a 85. À porcentagem da complementaridade indica a percentagem de resíduos con- tíguos em uma molécula de ácido nucleico que pode formar pontes de hidro- gênio (por exemplo, emparelhamento de bases de Watson-Crick) com uma segunda sequência de ácido nucleico (por exemplo, cerca de, pelo menos, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 sendo cerca de, pelo menos, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% complementares, inclusive)."Perfeitamente complementar"ou 100% de complementaridade refere-se de uma maneira geral a todos os re- síduos contíguos de uma sequência de ácido nucleico de ligação de hidro- gênio com o mesmo número de resíduos contíguos de uma segunda se- quência de ácido nucleico.

O termo "Complementaridade substancial"refere- se aos filamentos de polinucleotídeos que exibem pelo menos cerca de 90% de complementaridade, excluindo as regiões dos filamentos de polinucleotí- deos, tais como saliências, que são selecionadas de modo a ser não com- plementares.

A ligação específica requer um grau suficiente de complemen- taridade para evitar a ligação não-específica do composto oligomérico de sequências não alvo em condições em que é desejada a ligação específica, isto é, sob condições fisiológicas, no caso de ensaios in vivo ou tratamento terapêutico ou, em no caso de ensaios in vitro, sob condições em que os ensaios são realizados.

As sequências não alvo tipicamente podem diferir em pelo menos 5 nucleotídeos.

O termo "sinais"de doença, tal como é usado na presente inven- ção, refere-se de uma maneira geral a qualquer anormalidade indicativa de doença, detectável no exame do paciente, a indicação objetiva da doença, ao contrário de um sintoma, que é uma indicação subjetiva da doença.

O termo "suporte sólido" "suporte" e "substrato", como usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a qualquer material que proporciona uma estrutura de sólido ou semi-sólido com um outro material que possa ser ligado, incluindo, mas não limitado a suportes lisos (por e- xemplo, metal, vidro, plástico, silício, e superfícies de cerâmica), bem como materiais texturizados e poroso.

O termo "indivíduos", tal como usado na presente invenção, refe- re-se de uma maneira geral a qualquer pessoa adequada para ser tratada em conformidade com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, os indivíduos de aves e mamíferos, e são de preferência de mamífero. Os mamíferos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, cani- nos, felinos, bovinos, caprinos, equinos, ovinos, porcinos, roedores (por e- xemplo, camundongos e murganhos), lagomorfos, primatas, seres humanos. Qualquer indivíduo mamífero em necessidade de ser tratado de acordo com apresente invenção é adequada. Os indivíduos humanos de ambos os se- xos e em qualquer fase de desenvolvimento (isto é, recém-nascido, infantil, juvenil, adolescente, adulto) podem ser tratados de acordo com a presente invenção. A presente invenção também pode ser realizado em pacientes animais, em especial indivíduos mamíferos, como camundongos, ratos, cães,gatos, bovinos, caprinos, ovinos e cavalos para fins veterinários, e pa- ra a triagem de fármacos e para fins de desenvolvimento de fármacos. O termo "indivíduos"é usado como sinônimo de"pacientes".

O termo "sintomas"da doença, tal como usado na presente in- venção, refere-se de uma maneira geral a qualquer fenômeno mórbido ou a saída normal na estrutura, função ou sensação experimentada pelo pacien- te, e é indicativo de doença.

O termo "célula T", como usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral às células T CD8 + e células T CD4 +. O termo célula T também inclui tanto as células T auxiliaries do tipo 1 e células T auxiliares do tipo 2. O termo "terapia" "terapêutico" "tratar"ou"tratamento", tal como é usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral ao tratamento de uma doença, prendendo, ou reduzindo o desenvolvimento da doença ou dos seus sintomas clínicos, e/ou aliviar o doença, causando a regressão da doença ou dos seus sintomas clínicos.

A terapia abrange a profilaxia, trata- mento, remédio, redução, diminuição, e/ou alívio de uma doença, e sinais e/ou sintomas de uma doença.

A terapia engloba um alívio dos sinais e/ou sintomas em pacientes com sinais de doença em curso e/ou sintomas (por exemplo, inflamação, dor). A terapia engloba também"profilaxia". O termo "reduzido", para fins de terapia, refere-se de uma maneira geral à redução clínica significativa nos sinais e/ou sintomas.

Terapia inclui o tratamento de recidivas ou sinais de repetição e/ou sintomas (por exemplo, inflamação, dor). Terapia engloba, mas não se limita a excluir a possibilidade do apare- cimento de sinais e/ou sintomas de qualquer altura, bem como reduzir os sinais existentes e/ou os sintomas e reduzir ou eliminar os sinais existentes e/ou sintomas.

A terapia inclui o tratamento de doenças crônicas ("manuten- ção")e doença aguda.

Por exemplo, o tratamento inclui tratamento ou pre- venção de recaídas ou a recorrência de sinais e/ou sintomas (por exemplo, inflamação, dor). O termo "região variável"ou"VR", como usado na presente in- venção, refere-se de uma maneira geral aos domínios dentro de cada par da cadeiasleve e pesada de um anticorpo em que estão envolvidos diretamen- te na ligação do anticorpo ao antigênio.

Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes.

Cada cadeia leve tem um domínio variável (VL) em uma extre- midade e um domínio constante na sua outra extremidade, o domínio cons- tante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da ca- deia pesada, e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domí- nio variável da cadeia pesada.

O termo "vetor", como usado na presente invenção, refere-se de uma maneira geral a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar uma outra molécula de ácido nucleico ao qual foi ligada.

Um tipo de vetor é um"plasmídeo", que se refere a um loop de DNA da cadeia dupla circular no qualos segmentos de DNA adicionais podem ser ligados.

Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser |i- gados no genoma viral.

Determinados vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos episomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissômicos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira quando da introdução na célula hospedeira, e são assim replicados junta- mente com o genoma do hospedeiro.

Além disso, alguns vetores são capa- zes de dirigir a expressão de genes aos quais estão ligados operacionalmen- te.

Estes vetores são referidos na presente invenção como"vetores de ex- pressão recombinantes"ou simplesmente"vetores de expressão". Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante es- tão muitas vezes na forma de plasmídeos.

Na presente invenção, "plasmí- deo" e "vetor" podem ser usados alternadamente como o plasmídeo que é a forma mais comumente usada de vetor.

No entanto, a presente invenção pretende incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais como veto- res virais (por exemplo, os retrovírus defeituosos replicação, adenovírus e vírus adeno-associados), que servem funções equivalentes.

As técnicas e procedimentos são geralmente realizados de acordo com métodos conven- —cionaisbem conhecidos na técnica e tal como descrito em várias referências gerais e mais específicos que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação.

Vide, por exemplo, Sambrook, et al. (2001) Molec.

Cloning: Lab.

Manual [3 Ed] Cold Spring Harbor Laboratory Press.

As técnicas padrão podem ser usadas para o DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos, e culturade tecidos e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofec- ção). As reações enzimáticas e as técnicas de purificação podem ser reali- zadas de acordo com as especificações do fabricante ou como realizadas normalmente na técnica ou como descrito na presente invenção. As nomen- claturas usadas em conexão com, e os procedimentos e as técnicas de labo- ratório, química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e Farmacêutica descrito na presente invenção são os bem conhecidos e vul- garmente usados na técnica. As técnicas padrão podem ser usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação Farmacêutica, formulação e distribuição e tratamento dos pacientes. Os receptores inibitórios das células NK KIR2DL1,2e3 KIR são glicoproteínas da superfície de célula, que compreende de1a3domínios extracelulares do tipo imunoglobulina, que são expressas por algumas células T bem como células NK humanas adicionais. Uma série de KIRs estão bem caracterizados (Vide, por exemplo, Carrington e Norman, O Gene Cluster KIR, 28 de maio de 2003, disponível por meio do Centro Na- cional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) web site). KIRs humanos incluem KIR2DL e KIR3DL (KIRs também podem ser referidos por vários outros nomes, como CD158e1, CD158k, CD158z, p58 KIR CD158e1 (p70), CD244.) Vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. n º 2004/ 0038894, Radaev et al. Annu. Rev. Biophis. Biomol. Struct., 32: 93 a 114 (2003), Cer- weknka et al., Nat. Rev. Immunol. 1: 41 a 49 (2001); Farag et al, Expert O- pin. Biol. Ther, 3 (2): 237 a 250 (2003),. Biassoni et al, J. Cell.. Mol. Med., 7 (4): 376 a 387 (2003)... E Warren et al, British J. Haematology, 121: 793 a 804 (2003), cada uma das quais sendo incorporadas na presente invenção na sua totalidade). A estrutura de um número de KIR foi elucidada e revela uma semelhança estrutural notável entre estas proteínas. Vide, por exemplo, Radaevetal. Supra.

KIR podem ser classificados estruturalmente como funcional- mente. Por exemplo, a maioria dos KIRs tem dois domínios lg (58 kxDa KIRs KIR2D), enquanto que outros têm três domínios Ig (70 kDa KIR3D KIR) (às vezes dilataçãodos respectivamente como moléculas p58 e p70). KIRs vari- am também no comprimento da cauda citoplasmática. Normalmente, KIRs com uma cauda citoplasmática relativamente longo (L) entregam um sinal de inibição, a etapa KIR com uma cauda citoplasmática curta (S) pode ativar respostas ao NK ou T de célulaes.

Nomenclatura para KIRs consequente- mente pode ser baseada no número de domínios extracelulares (KIR2D e KIR3D) e se a cauda citoplasmática é longa (KIR2DL ou KIR3DL) ou curta (KIR2DS ou KIR3DS). Nomenclatura de informações adicionais para KIRs é fornecida na seguinte descrição detalhada da presente invenção.

Alguns membros da"família KIR'são NKCARs ou, mais particularmente"kars"(por exemplo, KIR2DS2 e KIR2DS4); eles compreendem tipicamente um ou mais resíduos de transmembrana carregadas (por exemplo, Lys), que se associ- am com uma molécula de adaptador possuindo um motivo imunoestimulante (ITAM) (por exemplo, a DAP12). A porção intracitoplasmática de KIR inibitó- ria compreende tipicamente um ou mais ITIMs que recrutam fosfatases.

Os inibidores KIRs se ligam a domínios alfa1/alfa2 de moléculas de HLA.

Os inibidores KIR não parecem normalmente requerem associação de molécula adaptadora para a atividade.

A menos que seja especificado de uma outra maneira, os termos como"KIR","KIR", e assim por diante referem-se a KIR2DL1, 2 e/ou 3 membros da"família KIR"e termos como"KAR","Kars", e outros referem-se para NKCAR dos membros da"família KIR". KIR podem ligar as moléculas MHC-I (por exemplo, certos alóti- pos de HLA de classe |), tipicamente resultando na transmissão de um sinal negativo que neutraliza e podem substituir o (s) sinal (is) estimulador (es), ativação para a célula NK, impedindo assim a células NK de matar a célula alvo potencial associada (aparentemente através ITIM e fosforilação de tiro- sina fosfatase (por exemplo, do domínio SH2 contendo as fosfatases da tiro- sina de proteínas, tais como SHP-1 e SHP-2), que conduzem a PTK (por exemplo, Sik, TcR e/ou ZAP70) desfosforilação e/ou inibição da formação de complexo LAT/PLC e perturbação associada de cascata (s) de ITAM). Como os vírus muitas vezes suprimem a expressão de MHC de classe | nas célu- las que infetam as células infectadas por vírus, tais tornam-se suscetíveis a matar por meio das células NK.

Porque as células cancerosas também mui- tas vezes têm reduzido ou levado a nenhuma expressão de MHC de classe |, essas células também podem se tornar suscetíveis a matar por meio das células NK.

As células infectadas também pode alterar as proteínas ligadas no MHC em termos de glicosilação.

Se isto ocorrer, o complexo MHC-I: pro- teína da célula expressa será alterado.

Se KIR associados a NK não pode ligar-se a estes complexos"estranhos", nenhum sinal de inibição pode ser gerado, e a lise irá proceder, Todos os inibidores KIR confirmados parecem interagir com dife- rentes subconjuntos de antígenos HLA/MHC, dependendo do subtipo KIR.

Em seres humanos, KIR contendo dois domínios Ig (KIR2D) reconhecem alotipos de HLA-C: KIR2DL2 (anteriormente designado p58.2) e o produto do gene intimamente relacionado KIR2QDL3 ambos reconhecem um epitopo par- tilhado por um grupo de alotipos de HLA-C (Cw1, 3, 7 e 8), enquanto que KIR2DL1 (p58.1) reconhece um epitopo partilhado por meio dos dois grupos recíprocos alotipos de HLA-C (Cw2, 4, 5 e 6). A especificidade de KIR2QDL1 parece ser referida pela presença de um resíduo Lys na posição 80 do grupo 2 alelos de HLA-C.

KIR2DL2 e KIR2DL3 reconhecimento parece ser motiva- da pela presença de um resíduo de Asn na posição 80. A grande maioria dos alelos HLA-C quer ter um ASN ou um resíduo de Lys na posição 80. Um KIR com três domínios de lg, KIR3DL1 (p70), reconhece um epítopo parti- lhado por HLA-Bw4 alelos.

Finalmente, um homodímero de moléculas com três domínios de lg, KIR3DL2 (p140), reconhece HLA-A3 e-A11. Os receptores de células NK-I| específicos de MHC individuais de qualquer tipo (de ativação ou inibição) normalmente não interagem com toda a classe | de moléculas MHC, mas ligam-se especificamente a certas aloti- pos (proteínas codificadas por meio das diferentes variantes de um único locus genético). Além disso, uma célula individual NK pode expressar vários receptores inibitórios diferentes e/ou ativação, que funcionam de forma inde- pendente um do outro.

Por exemplo, nos seres humanos na presença ou ausência de um dado KIR é variável de uma célula NK para o outro dentro de um único indivíduo.

Há também um nível relativamente elevado de poli- morfismo de KIR em seres humanos, com determinadas moléculas de KIR estando presente em alguns, mas não todos os indivíduos.

Embora KIR e outros receptores inibitórios MHC reconhecendo podem ser co-expressos por meio das células NK, no repertório NK qualquer determinado indivíduo existem tipicamente células que expressam um único KIR, por conseguinte, a atividade de células NK correspondente neste último tipo de células NK é inibida apenas por meio das células que expressam MHC de um grupo-l de alelo específico.

De fato, estimativas recentes da extensão da diversidade genótipo KIR na população sugerem que < 0,24% de indivíduos não aparen- tados pode esperar ter genótipos idênticos.

O haplótipo mais comum Euro- peu, o haplotipo"A"(frequência de — 47-59%), contém apenas um gene KIR de ativação (KIR2DS4) e seis locais de KIR inibitórias (KIR3DL3,-2DL3, 2DL1-,-2DL4, 3DL1-, e-3DL2). Os haplótipos restantes"B"são muito diversos econtêm2? a 5 locais de ativação KIR (incluindo KIR2DS1,-2DS2, 2DS3-e- 2DS5). Deve notar-se que o KIR são conhecidos por vários nomes al- ternativos, como refletido na presente invenção na Tabela 1 e na Tabela 2: Tabela 1-Nomenciatura KIR KIR Nome completo Aliases IDde ||SEQID acesso NO KIR2DL1 ||receptor do tipo imunoglobulina da — ||cl-42, nkat1, 47.11,|) L41267 11 célula assassina, dois domínios, p58.1, CD158a cauda citoplásmica longa, 1 KIR2DL2 |ireceptor do tipo imunoglobulina da cI-43, nkat6, L76669 12 célula assassina, dois domínios, CD158b1 cauda citoplásmica longa, 2 KIR2DL3 ||receptor do tipo imunoglobulina da — ||cl-6, nkat2, nkat2a, || L41268 18 célula assassina, dois domínios, nkat2b, p58, cauda citoplásmica longa, 3 CD158b2 KIR2DLA4 ||receptor do tipo imunoglobulina da 103AS, 15.212, X97229 14 célula assassina, dois domínios, CD158d cauda citoplásmica longa, 4 receptor do tipo imunoglobulina da KIR2DL5.1, AF21748 KIR2DLS5A ||célula assassina, dois domínios, CD1581f 5 15 cauda citoplásmica longa, SA receptor do tipo imunoglobulina da KIR2DL5.2, AF21748 KIR2DL5B ||célula assassina, dois domínios, KIR2DL5.3, 6 cauda citoplásmica longa, 5B KIR2DL5.4

KIR Nome completo Aliases IDde ||SEQID acesso NO KIR2DS1 |ireceptor do tipo imunoglobulina da EBG6Actl, EB6Actll, || X89892 16 célula assassina, dois domínios, CD158h cauda citoplásmica curta, 1 KIR2DS?2 ||receptor do tipo imunoglobulina da cl-49, nkat5, L76667 17 célula assassina, dois domínios, 183Actl, CD158j cauda citoplásmica curta, 2 KIR2DS3 ||receptor do tipo imunoglobulina da nkat7 L76670 18 célula assassina, dois domínios, cauda citoplásmica curta, 3 KIR2DS4 ||receptor do tipo imunoglobulina da — jjcl-39, KKA3, nkat8,|| L76671 19 célula assassina, dois domínios, CD158i cauda citoplásmica curta, 4 KIR2DS5 ||receptor do tipo imunoglobulina da nkat9, CD158g L76672 20 célula assassina, dois domínios, cauda citoplásmica curta, 5 receptor do tipo imunoglobulina da KIRZ, KIRY, AF20490 KIR2DP1 |icélula assassina, dois domínios, KIR15, KIR2DL6 8 pseudogene 1 KIR3DL1 |lreceptor do tipo imunoglobulina da cl-2, NKB1, cl-11, || L41269 21 célula assassina, três domínios, nkat3, NKB1B, cauda citoplásmica longa, 1 AMB11, KIR, CD158e1 KIR3DL2 ||receptor do tipo imunoglobulina da — ||cl-5, nkat4, nkat4a, || L41270 22 célula assassina, três domínios, nkat4b, CD158k cauda citoplásmica longa, 2 ; lobuli receptor do tipo imunoglobu! ina da KIRC1, KIR3DL7, || AF35232 KIRSDL3 ||célula assassina, três domínios, 23 ; s KIR44, CD158z 4 cauda citoplásmica longa, 3 KIR3DS1 |lreceptor do tipo imunoglobulina da nkat10, CD158e2 || L76661 24 célula assassina, três domínios, cauda citoplásmica curta, 1 AF20491 ; : KIRX, KIRA48, 049 receptor do tipo imunoglobulina da KIR2DS6, 9, KIR3DP1 ||célula assassina, três domínios, ' AF20491 KIR3DS?2P, pseudogene 1 5- CD158c AF20491 acesso NO

E A Obtidos a partir do web site do Comitê de Nomenclatura do Ge- ne.

Table 2 — Nomenclatura KIR CD [Ra TO ente ros E | eorssernez [Ross Te Andre, et a/. Nature Immunol. 2(8):661 (2001).

As moléculas de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, e KIR2DS4 exemplares compreendem as seguintes sequências aminoácidas respecti- vas: domínio KIR2DL1 extracelular:

HEGVHRKPSLLAHPGXLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREG MFNDTLRLIGEHHDGVSKANFSISRMTQDLAGTYRCIGSVTHSPIQVSAPSD PLDIVIIGLYEKPSLSAQXGPTVLAGENVTLSCSSRSSIDMYHLSREGEAHER

RLPAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFHDSPIEWSKSSDPLLVS VTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLH (SEQ ID NO: 7), onde"X"na posição 16 é P ou R, eonde"X"na posição 114 é P or L, representando os variants alélicos.

domínio KIR2DL?2 extracelular:

HEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVRFEHFLLHREG KFKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCIGSVTHSPIQLSAPSD PLDIVITGLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSIDMYHLSREGEAHE

CRFSAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPIEWSNSSDPLLV SVIGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLH (SEQ ID NO: 8). domínio KIR2DL3 extracelular:

HEGVHRKPSLLAHPGPLVKSEETVILQCWSDVRFQHFLLHREG KFKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCIGSVTHSPIQLSAPSD PLDIVITGLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSIDMYHLSREGEAHE

RRFSAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPIEWSNSSDPLLV SVTGNPSNSWPSPTEPSSETGNPRHLH (SEQ ID NO: 9). domínio KIRQDSA4 extracelular:

QEGVHRKPSFLALPGHLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREG KFNNTLHLIGEHHDGVSKANFSIGP- MPVLAGTYRCIGSVPHSPIQLSAPSDPLDMV (SEQ ID NO: 10). Neutralização de Inibição de célula NK Associada a KIR2DL1, 2 e/ou 3 Os anticorpos anti-KIR2QDL1, 2 e/ou 3 podem ser caracterizados com base na sua capacidade de bloquear ou neutralizar a inibição NK e as- sim potenciar a atividade das células NK contra células alvo outra bloquea- das de outra maneira (células T, por exemplo, células T, células CD4 +). Como indicado acima, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 que se ligam a pelo menos um KIR2DL1, 2 e/ou 3 por um período de tempo suficiente para neutralizar a KIR2DL1, 2 e/ou 3 a inibição da citotoxicidade mediada por meio das células NK as células NK pode ser usada no contexto da presente invenção. Tais anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 podem ser usados direta- mente como agentes terapêuticos sob uma forma nativa. Uma característica mais particular vantajosa da presente invenção são Os anticorpos anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3 que reagem de forma cruzada com dois ou mais KIR2DL1, 2 e/ou 3 e neutralizar a atividade inibidora associada com algumas ou todas (normalmente de preferência todas) tais associade KIR2QDL1, 2 e/ou 3. Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 neutralizantes podem neu- tralizar parcialmente ou totalmente a KIR2QDL1, 2 e/ou 3 mediada por meio da inibição da citotoxicidade das células NK.

A neutralização refere-se a qualquer bloqueamento substancial que de outra forma apresentam os sinais inibitórios.

A neutralização pode ser medida por meio de qualquer método adequado.

Em um aspecto, a neutralização de inibição é refletida pelo fato de o anticorpo anti-KIR de neutralização causar menos cerca de 20%, de preferência pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo me- nos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, em menos cerca de 75% ou mais (por exemplo, cerca de 25 a 100%), aumento de Na lise específica me- diada por meio da célula NK por meio das células, em particular, uma mistu- ra de células NK e células alvo NK em comparação com a quantidade de lise específica que ocorre tipicamente em uma configuração substancialmente idêntica sem o presença do (s) anticorpo (s) anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. A per- centagem de aumento, neste aspecto, pode ser determinada quando se considera anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3, ou por outrOs anticorpos, por exemplo, a comparação com os resultados de ensaios de libertação de crômio de testes de toxicidade obtidos a partir de uma mistura de células alvo NK (por exem- plo, célulasT, qualquer linhagem de célula adequada) e as células NK não bloqueou a sua KIR2DL1, 2 e/ou 3 associada (100%) e uma mistura de célu- las NK e células alvo NK, em que as células alvo NK apresentar um ligante para a KIR2DL1, 2 e/ou 3 (0%). No caso dos anticorpos anti-KIR, a compa- ração pode ser com os resultados de ensaios de libertação de crômio de testes de toxicidade obtidos a partir de uma mistura de células alvo NK e células NK não bloqueou a sua associada KIR (100%) e uma mistura de cé- lulas NK e as células NK alvo, nas quais as células alvo NK apresentam a molécula do MHC de classe |, para a cognato KIR inibitório sobre as células NK (0%). Em um aspecto vantajoso, a presente invenção proporciona anti- corpo anti-KIR2DL1,2 e/ou 3 que induzem a lise da (s) célula (s) que não seria eficazmente lisada , sem a presença de tal anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em alternativa, a neutralização de KIR2DL1, 2 e/ou 3 de atividade inibidora pode ser indicada por, por exemplo, os resultados de um ensaio de crômio, utilizando um clone de células NK ou de transfectante que expressa um ou vários KIR2DL1, 2 e/ou 3s (por exemplo, KIR, NKG2, NKG2A, LIR (por exemplo LILRB1, LILRB5) e uma célula alvo que expressa apenas um ligante (por exemplo, polipetídeo ou alelo HLA, HLA-E), que é reconhecido por um dos KIR2DL1, 2 e/ou 3s na célula NK, onde o nível de citotoxicidade obtido com o anticorpo é pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70% ou mais (por exemplo,, cer- cade 25-100%) da citotoxicidade observada com um anticorpo de bloqueio conhecida para o ligante de KIR2DL1, 2 e/ou 3. Por exemplo, ao testar um anticorpo anti-KIR, uma molécula de classe | anti-MHC é administrada uma configuração substancialmente idênticas, tals como W6/32 de classe | do CPH anti-anticorpo (que está disponível a partir, por exemplo, Research Di- —agnostics, Flanders, NJ, EUA, e descrito em, por exemplo, Shields et al, Tis- sue Antigens 1998 Maio; 51 (5): 567 a 70).

Os ensaios de libertação de crômio e outros métodos de avalia- ção da atividade citolítica das células NK são conhecidos na técnica. As condições adequadas para tais ensaios são também bem conhecidas. Um ensaio típico de libertação de crômio é realizado através da marcação de células alvo (por exemplo, Cw3 e/ou linhagens de célulaes positivas CW4-a cerca de, por exemplo, 5.000 células por cavidade em uma placa de microti- tulação) com Na251CrO4 (51Cr tal modo que é absorvido e retido por meio das células alvo viáveis), de lavagem para remover o excesso de radioativi- dade, em seguida expostos a células NK durante um período de cerca de 4 horas, na presença ou ausência de anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 (s) a um efetor adequado: proporção alvo (por exemplo, cerca de 4: 1), e medição dos níveis de 51Cr subsequentes refletindo a morte e lise de células alvo. Um exemplo de um tal ensaio é descrito em, por exemplo, Moretta et al.

(1993)J. Exp. Med. 178: 597 a 604. Em um ensaio semelhante, as células alvo em proliferação podem ser marcadas com 3H-timidina, a qual é incorpo- rada no DNA replicante. Após a ação citolítica de células NK, o DNA das células alvo é rapidamente fragmentado e retido em um filtrado, enquanto que o DNA grande, não fragmentado pode ser recolhido em um filtro, de tal forma que se possa medir ou a libertação destes fragmentos ou a retenção de 3H-timidina no DNA de célula. Outros exemplos e discussão relevantes relacionados com tais ensaios podem ser encontrados em, por exemplo, o documento WO 2006/ 072625.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona anticor- pos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 caracterizados pela sua capacidade para compe- tir com a reatividade cruzada e/ou neutralizantes anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pa- rase ligar a anticorpos cognatos KIR2DL1, 2 e/ou 3s e/ou de se ligar com o mesmo determinante antigênico região/epitopo tais comOs anticorpos co- nhecidos. A frase"compete com"quando se refere a um anticorpo monoclio- nal específico (por exemplo, 1-7F9) significa que o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 concorre com o anticorpo ou outra molécula de referência em um en- saio de ligação usando as moléculas recombinantes KIR2DL1, 2 e/ou 3 ou de moléculas de KIR2DL1, 2 e/ou 3 de superfície expressa. Por exemplo, se um anticorpo anti-KIR reduz de forma detectável a ligação de 1-7F9 a uma molécula normalmente ligado por KIR 1-7F9 em um ensaio de ligação, o an- ticorpo anti-KIR pode ser referido"compete"com 1-7F9. Um anticorpo anti- KIR que"compete"com 1-7F9 pode competir com 1-7F9 para a ligação ao receptor humano KIR2DL1, o receptor humano KIR2DL2/3, ou ambos os receptores KIR2DL1 e KIR2DL2/3 humanos.

Embora muitas vezes relacionados, descreve-se uma proteína em termos de competição com uma proteína de ligação de referência versus acapacidade da proteína de se ligar ao mesmo ou epitopo substancialmente semelhante como uma proteína de referência, em alguns casos implica sig- nificativamente diferentes propriedades biológicas e físico-química. A com- petição entre as proteínas de ligação indica que o teste anticorpo anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3 se liga a um epitopo que, pelo menos parcialmente, se sobrepõe a um epitopo ligado por um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3, ou o anticorpo está localizada suficientemente perto para tal um epitopo de modo que um tal anticorpo anti-KIR compete com anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou

3 conhecidos, devido ao impedimento estérico.

Um anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode competir com o anticorpo de referência anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3, sem se ligar ao mesmo epitopo ou semelhante, devido ao tamanho gran- de dos anticorpos.

Tal anti-KIR2DL1 concorrente, 2 e/ou 3 de anticorpo po- dem ser úteis no bloqueio de interações associadas com a mesma região determinante antigênica como referência anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3, embora o anticorpo liga-se um determinante antigênico diferente.

Em outro aspecto exemplificativo, a presente invenção propor- ciona um anticorpo anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 que se liga substanci- almente a mesma região determinante antigênica como um anticorpo anti- KIR disponível, tal como 1-7F9, DF200 e/ou NKVSF1. Vide, por exemplo, o documento WO 2006/ 003179. A competição se refere a qualquer redução significativa na pro- pensão para uma molécula específica para ligar um parceiro de ligação es- pecíficana presença de uma outra molécula que se liga ao parceiro de liga- ção.

Tipicamente, a competição, uma redução de pelo menos cerca de 15% na ligação, tal como uma redução de pelo menos cerca de 20% na ligação (por exemplo, uma redução na ligação de cerca de 25% ou mais, cerca de 30% ou mais, cerca de 15a 35%) entre, por exemplo, um anticorpo anti-KIR, e pelomenos um KIR, na presença da molécula de competição, por exem- plo, um anticorpo anti-KIR.

Em certas situações, tal como nos casos em que os epitopos de anticorpos pertencentes concorrentes estão estreitamente situados em um antigênio, a competição pode ser marcada por uma maior do que cerca de 40% de inibição relativa de receptor (por exemplo, KIR) de ligação, ainibição de pelo menos cerca de 50%, em menos cerca de 55% de inibição, pelo menos cerca de 60% de inibição, pelo menos cerca de 75% de inibição, ou de um nível mais elevado de inibição (tal como um nível de inibi- ção de cerca de 45 a 95%). Avaliar competição tipicamente envolve uma avaliação da liga- ção inibitória relativa utilizando uma primeira quantidade de uma primeira molécula (por exemplo, um anticorpo anti-KIR), uma segunda quantidade de uma segunda molécula (por exemplo, um anticorpo anti-KIR conhecido), e uma terceira quantidade de uma terceira molécula (por exemplo, um KIR), em que os primeiro, segundo e terceiro valores todos são suficientes para permitir uma comparação que dá informações sobre a seletividade e/ou es- pecificidade das moléculas em questão em relação à outra presentes molé- culas.

Normalmente, para os ensaios de ELISA de competição, cerca de 5 a 50 ng (por exemplo, cerca de 10 a 50 mg, cerca de 20 a 50 mg, cerca de 5 a 20 mg, cerca de 10 a 20 ug) de um anticorpo anti-KIR, um conhecido anti- anticorpo KIR, e pelo menos um KIR são usados para avaliar se existe com- petição.

As condições também devem ser adequadas para a ligação das moléculas que competem para o seu alvo putativo/conhecido.

As condições fisiológicas ou quase fisiológicas (por exemplo, temperaturas de cerca de 20 a 40T, pH de cerca de 7 a 8) pode tipicamente ser adequado para o anti-

corpo anti-KIR: KIR.

A determinação da competição (ou inibição relativa de ligação) entre duas ou mais moléculas pode ser feita por uso de imunoensaios em que o controle da molécula de ligação KIR2DL1, 2 e/ou 3 (anticorpo 1-7F9, por exemplo) e anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 teste são misturados (ou pré-adsorvidos) e aplicados a uma amostra contendo KIR relevantes, tais como ambos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 (cada um dos quais é conhecido por estar ligado por DF200). Os protocolos com bases em radioimunoensaio, ELISA, Western blot, e outros semelhantes são adequados para o uso em tais estudos de competição.

Os testes ELISA de competição são tipicamente realizados em condições adequadas para a ligação das moléculas (por e- xemplo, as condições fisiológicas, particularmente, no caso de Os anticorpos que se ligam a epitopos conformacionais/não-linear). Competição também pode ser avaliada, por exemplo, por meio de um teste de citometria de fluxo, a análise de SPR e outras técnicas encontradas em, por exemplo, Harlow et al, Anticorpos:. Um Manual de Laboratório, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova lorque, 1988), Colligan et al., eds., Current —Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience, Nova lorque, (1992, 1993), Ausubel et al.

Eds., Protocolos Curtos Na Bioligia Biomelocular, (5a edição), John Wiley & Sons (2002), e Muller, Meth.

Enzy-

moL. 92: 589 a 601 (1983)).

Uma região determinante antigênica ou epítopo pode ser identi- ficado por meio de um número de técnicas conhecidas. Por exemplo, uma região determinante antigênica pode ser rapidamente identificada por ensai- os de"impressão de pé", como por exemplo através de uma modificação química das aminas/carboxilas expostos nas proteínas KIR2QDL1, 2 e/ou 3 alvo. Um exemplo específico de tal técnica de impressão de pé é o uso de HXMS (troca de hidrogênio-deutério detectada por espectrometria de mas- sa), onde uma troca de receptores e ligantes de prótons amida de proteína, a ligação de hidrogênio/deutério, e de volta ocorre, em que as estruturas principais dos grupos amida que participam na ligação de proteínas são pro- tegidas de troca de volta e, por conseguinte, continuará a ser deuterado. As regiões relevantes podem ser identificadas neste ponto por meio da proteóli- se péptica, a separação rápida de microboro cromatografia líquida de alto desempenho, e/ou espectrometria de massa por ionização por eletropulveri- zação. Vide, por exemplo, Ehring H, Analytical Biochemistry, vol. 267 (2) pp 252-259 (1999) e/ou Engen, JR e Smith, DL (2001) Anal. Chem. 73, 256A- 265A.

Um outro exemplo de uma técnica adequada é a identificação de epítopos de ressonância magnética nuclear (RMN), o mapeamento de epíto- pos, onde normalmente a posição dos sinais em espectros de RMN bidi- mensionais do antigênio livre e o antigênio complexado com o peptídeo de ligação ao antigênio, tais como um anticorpo, são comparados. O antigênio é tipicamente seletivamente isotopicamente marcado com 15N de modo que somente sinais correspondentes para o antigênio e não há sinais a partir do peptídeo de ligação ao antigênio são vistos no espectro de RMN. Os sinais provenientes de antígenos de aminoácidos envolvidos na interação com o peptídeo de ligação ao antigênio irá mudar de posição normalmente nos es- pectros do complexo em comparação com os espectros do antigênio livre, e os aminoácidos envolvidos na ligação podem ser identificados desta manei- ra. Vide, por exemplo, Ernst Schering Res Encontrado Oficina. 2004, (44): 149 a 67; Huang, et al, Journal of Molecular Biology 281 (1): 61 a 67 (1998)

e Saito e Patterson, Metods. 1.996 junho; 9 (3): 516 a 24.

O mapeamento de epíitopos/caracterização também pode ser realizado utilizando os métodos de espectrometria de massa. Vide, por e- xemplo, Downward, J Mass Spectrom, Abril 2000, 35 (4): 493 a 503 e Kiselar e Downard, Anal Chem. 1999 01 de maio, 71 (9): 1792 a 801.

As técnicas de digestão da protease podem também ser úteis no contexto de mapeamento e identificação de epítopos. As Sequências/regiões determinante antigênicas relevantes podem ser determinadas por meio da digestão da protease, por exemplo, usando tripsina em uma proporção de cercade 1:50 aKlR2DL1,2 e/ou 3 o/h a digestão a 37 CT e pH 7 a 8, segui- do por meio da espectrometria de massa (MS) para a identificação de peptí- deos. Os peptídeos protegidos da clivagem com tripsina pelo anticorpo anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3-ligante podem ser subsequentemente identificados por meio da comparação das amostras submetidas a digestão com tripsina e amostras incubadas com anticorpo e, em seguida, submetido a digestão por exemplo tripsina (revelando assim uma impressão do pé para o ligante). Ou- tras enzimas como quimotripsina, pepsina também, ou, alternativamente, podem ser usadas em métodos de identificação de epitopos semelhantes. Além disso, a digestão enzimática pode fornecer um método rápido para a- nalisar se uma sequência potencial determinante antigênico é uma região dentro de KIR2DL1, 2 e/ou 3, no contexto de um anti-Polipeptídeo KIR2DL1, 2 e/ou 3 que não seja de superfície exposta e, por conseguinte, muito prova- velmente não é relevante em termos de antigenicidade. Vide, por exemplo, Manca, Ann Ist Super Sanita. 1991, 27 (1): 15a 9 para uma discussão de técnicas semelhantes.

As várias técnicas de apresentação de fagos também podem ser usadas para identificar epitopos. Vide, por exemplo, Wang and Yu, Curr Drug Targets. 2004 Jan; 5(1): 1 a 15; Burton, Immunotechnology. 1995 Aug;1(2):87 a 94; Cortese et al., Inmunotechnology. 1995 Aug;1(2):87 a 94; elrvingetal, Curr Opin Chem Biol. 2001 Jun;5(3):314 a 24. Os epítopos de consenso também pode ser identificados através de técnicas de exposição relacionadas com a modificação de fago (Vide, Mumey et al., J. Comput. Bi-

ol. 10:555-567 e Mumey, Proceedings of the Sixth Annual International Con- ference on Computational Molecular Biology (RECOMB-02), pp. 233-240 (ACM Press, New York)) para discussão (Vide também Bailey et al., Protein Science (2003), 12:2453 a 2475; Dromey et al, J Immunol. 2004 Apr 1;172(7):4084 a 90; Parker et a/., Mol Biotechnol. 2002 Jan;20(1):49 a 62; and Czompoly et a/., Biochem Biophis Res Commun. 2003 Aug 8;307(4):791 a6)). O mapeamento de epítopos de ligação competitivos para um KIR com duas moléculas de KIR de ligação, onde um é biotinilado (por e- xemplo, um anticorpo anti-KIR conhecido) ou de outra forma semelhante marcado é um outro método para a identificação de regiões determinantes antigênicas relevantes.

Outros métodos potencialmente úteis no mapeamento de epíto- pos incluem as técnicas de cristalografia, as técnicas de difração de raios X (como os de difração/sequência de técnicas de estudo de raios-X desenvol- vidas pela Poljak e outros na década de 1970 década de 1980), bem como a aplicação de tecnologia de Síntese de Peptídeo Multipina.

Os métodos com base em computador, tais como análise da se- quência e a análise da estrutura de três dimensões e de encaixe podem também ser usados para identificar os determinantes antigênicos.

Por e- xemplo, um epitopo pode também ser determinado através de modelação molecular, com uma estrutura de um KIR2DL1, 2 e/ou 3, ou sua porção de encaixe com a estrutura do fragmento Fab de um mAb individual.

Sempre que necessário, os modelos de KIR2DL1, 2 e/ou 3 podem ser produzidos por meio da modelagem por homologia com a estrutura caracterizada de KIR2DL1, 2 e/ou 3 usando programas tais como MOE (Molecular Operating Environment), que está disponível a partir de Chemical Computing Group (Montreal, Quebec, Canadá-www.chemcomp.com). Esses e outros métodos de mapeamento são discutidos em Uma Abordagem Prática de Mapeamento de Epitopo (Westwood e Hay Eds.) 2001 Oxford University Press (Vide tam- bém Cason (1994) J Virol Metods49 (2):. 209 a 19). Características de anticorpos anti-KIR

Os anticorpos antivantajosos KIR podem ser classificaos com base nas características funcionais, em particular no que diz respeito à sua capacidade para reagir de forma cruzada ou ligar de forma cruzada mais do que um KIR, tal como mais do que um tipo de inibidor KIR e/ou a capacidade para neutralizar eficazmente os sinais inibitórios de NK.

Os anticorpos anti-KIR que se ligam de forma eficaz a mais de um tipo de KIR são uma característica particularmente vantajosa da presente invenção. Em um aspecto particular exemplar, a presente invenção propor- ciona anticorpos anti-KIR que se ligam a pelo menos dois receptores KIR inibidores na superfície de células NK. Em um aspecto ainda mais específico ilustrativo, a presente invenção proporciona anticorpos anti-KIR que se ligam a uma região determinante antigênica comum dos receptores KIR2DL hu- manos. Em ainda um aspecto ainda mais específico, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-KIR que se liga aos Receptores KIR2DL1, KIR2DL2,e KIR2DL3.

O termo "KIR2DL2/3"pode ser usado para se referir a um ou ambos os receptores KIR2DL2 e KIR2DL3. Estes dois receptores têm uma homologia muito elevada, são formas alélicas do mesmo gene e são consi- derados pela técnica como sendo permutáveis em muitos aspectos. Dessa maneira, KIR2DL2/3 pode ser considerado em certos aspectos ser uma úni- ca molécula de KIR inibidora. Embora Os anticorpos anti-KIR que apresen- tam reação cruzada com KIR2DL2/3 está no âmbito da presente invenção, Os anticorpos anti-KIR que possuem um perfil de KIR de ligação que incluiu apenas KIR2DL2 e KIR2DL3, não são considerados"reatividade cruzada".

Porque pelo menos um dos KID2DL2 ou KIR2DL1/3 está pre- sente em pelo menos cerca de 90% da população humana, Os anticorpos KIR2DL1-anti-KIR KIR2DL2/3 com reatividade cruzada, podem promover ou aumentar a atividade NK contra a maioria das células associadas ao alotipo HLA, respectivamente, grupo 2 de alotipos de HLA-C e grupo 1 de alotipos de HLA-C. Uma composição que compreende um único anticorpo KIR de reação cruzada tendo tal reatividade cruzada pode ser usada no tratamento e/ou diagnóstico da maioria dos seres humanos, eliminando assim a neces-

sidade de caracterização genética do paciente e reduzindo a quantidade de anticorpos diferentes que precisam de ser administrados a um paciente para garantir um resultado eficaz.

Uma reação cruzada de anticorpos anti-KIR pode ter qualquer composição adequada e pode ser obtida por meio de uma série de técnicas adequadas.

Por exemplo, um anticorpo anti-KIR de reação cruzada pode compreender um número de KIR ligante e/ou sequências de anticorpos anti- anti-KIR que se ligam ao KIR diferentes, que podem ser associadas por meio da conjugação, a multimerização, ou (no caso do peptídeo ligantes) por ser constUTlídas de uma proteína de fusão.

Em um outro aspecto, um anticorpo anti-KIR está previsto compreender as sequências de anticorpos anti-anti- KIR de um anticorpo anti-anti-KIR de reação cruzada.

Uma reação cruzada de anticorpos anti-anti-KIR, a partir dos quais as sequências de ligação de KIR podem ser obtidas ou derivadas, são conhecidas.

Um exemplo de tal anticorpo é o anticorpo NKVSF1 (também referido como pan2D mAb, reconhecendo um epitopo comum de CD158a (KIR2DL1), CD158b (KIR2DL2) e p50.3 (KIR2DS4)) tendo a região variável e as sequências de CDR mostrado em, por exemplo, Figura 15, de WO?2006/003179 (Farma inata; Novo Nordisk, da Universidade de Gênova). O anticorpo monoclonal de DF200, que reage com vários membros da famí- lia KIR, incluindo KIR2DL1 e KIR2DL2/3 é outro exemplo de um tal anticorpo de reação cruzada.

Um hibridoma que produz DF200 foi depositado na co- lecção de culturas CNCM, com o no. de identificação"”DF200", registro nº.

CNCM 1-3224, registrada em 10 de Junho de 2004, Colecção Nacional de Culturasde Microorganismos, InstUTIt Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F- 75724 Paris Cedex 15, França.

Vários anticorpos monocilonais adicionais podem ser gerados e demonstraram ser anticorpos anti-anti-KIR com reativi- dade cruzada.

No entanto, outros exemplos são Os anticorpos 1-7F9 e 1- 4F1, descritos em WO2006/003179. Um anticorpo anti-KIR de reação cruzada pode ter qualquer afi- nidade adequada e/ou avidez para as duas ou mais KIRs aos quais se ligam.

A afinidade se refere à força de ligação de um anticorpo anti-KIR ou outra proteína de ligação ao antigênio a um epitopo ou determinante antigênico. Tipicamente, a afinidade é medida em termos de uma constante de dissoci- ação Kd, definida como [Ab] x [Ag]/[Ab-Ag] em que [Ab-Ag] é a concentração molar do complexo anticorpo-antigênio, [AB] é o concentração molar do anti- corpo não ligado e [Ag] é a concentração molar do antigênio não ligado. À afinidade constante Ka é definida por meio de 1/Kd. Os métodos adequados para a determinação da especificidade do peptídeo de ligação e afinidade por meio da inibição concorrencial, diálise de equilíbrio, e semelhantes po- dem ser encontradas em, por exemplo, Harlow et al, Antibodies: A Labora- tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova lorque, 1988); Colligan et al, eds, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc e Wiley Interscience, Nova lorque, (1992, 1993), e Muller, Meth. EnzymoL. 92: 589-601 (1983). Tipicamente, um anticorpo anti-KIR proporcionado pela presente invenção tem uma afinidade para pelo menos um KIR na gama de cerca de 104 a cerca de 1010 M-1 (por exemplo, cerca de 107 a cerca de 109 M-1). O termo imunorreage aqui refere-se tipicamente a ligação de um anticorpo anti- KIR para um KIR com uma constante de dissociação, Kd, inferior a cerca de 10-4 M. Por exemplo, em um aspecto particular, a presente invenção pro- porciona anticorpos anti-KIR que tem um distanciamento médio constante (KD) de cerca de 7 x 10-9 M ou mais com respeito a KIR2DL1 e KIR2DL2/3, como determinado por, por exemplo, a ressonância de plasmon de superfí- cie (SPR) blindagem (por exemplo, por meio da análise com um dispositivo de análise de SPR BIAcoreº). Em um aspecto mais particular, exemplar, a presente invenção proporciona anticorpos anti-KIR que possuem um KD de cerca de 2 x 10-9 M (por exemplo, cerca de 0,1-4x10-9 M) ou mais para KIR2DL2/3 e cerca de 11 x 10-9 M (por exemplo, cerca de 7-15 x 10-9 M) ou mais para KIR2DL1.

A afinidade pode ser determinada por meio de qualquer um dos métodos descritos neste documento, ou seus equivalentes conhecidos na técnica. Um exemplo de um método que pode ser usado para determinar a afinidade é fornecido na análise de Scatchard de Munson & Pollard, Anal.

Bioquímica. 107: 220 (1980). A afinidade de ligação pode também ser de- terminada por meio dos métodos de equilíbrio (por exemplo, um ensaio imu- noabsorvente ligado a enzima (ELISA) ou radioimunoensaio (RIA)), ou de análise de cinética (por exemplo, análise de BIAcoreº).

Os anticorpos anti-KIR também ou, alternativamente, podem ser caracterizados por meio da exibição de ligação com uma constante de me- nos do que cerca de 100 nM, menos do que cerca de 50 nM, menos do que cerca de 10 nm dissociação KIR, cerca de 5 nM ou menos, cerca de 1 nM ou menos, cerca de 0,5 nm ou menos, cerca de 0,1 nm ou menos, cerca de 0,01nmou menos, ou até mesmo cerca de 0,001 nm ou menos.

A avidez refere-se à força total das interações totais entre uma proteína de ligação e o antigênio (por exemplo, a força total de interações entre um anticorpo anti-KIR e um KIR). A a finidade é a força do total intera- ções não covalentes entre um único local de ligação ao antigênio de um an- ticorpo ou outro peptídeo de ligação e um único epitopo ou determinante an- tigênico. A avidez tipicamente rege-se por meio de três fatores principais: a afinidade intrínseca da proteína de ligação para o (s) epitopo (s) ou determi- nante (s) antigênico (s) a que se liga, a valência do anticorpo ou proteína de ligação e o antigênio (por exemplo, um anticorpo anti-KIR anticorpo com uma valência de três, quatro, ou mais, normalmente exibem níveis mais ele- vados de avidez para um antigênio de um anticorpo bivalente e um anticorpo bivalente que pode ter uma avidez maior para um antigênio de um anticorpo monovalente, especialmente onde são epitopos repetidos em o antigênio), e/ou a disposição geométrica dos componentes que interagem. A avidez é medida tipicamente pelo mesmo tipo de técnicas usadas para avaliar a afini- dade.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um anti- corpo anti-KIR que reage de forma cruzada com KIR de duas ou mais espé- cies. Por exemplo, em um aspecto, a presente invenção proporciona um an- ticorpo anti-KIR que reage de forma cruzada com KIR de seres humanos e macacos cinomólogos. Em um aspecto particular, a presente invenção pro- porciona um anticorpo anti-KIR que reage de forma cruzada com pelo menos dois KIR humanos e também se liga às células NK de macacos cinomolgus. Tal anticorpo anti-KIR pode compreender as sequências de ou que são deri- vadas a partir de anticorpo NKVSF1, que apresenta um tal perfil de reativi- dade cruzada, Tais anticorpos anti-KIR podem ser submetidos a testes de toxicidade e outros estudos úteis nos macacos cinomólogos, se necessário.

Os anticorpos que são inter-reativos com uma variedade de KIR podem ser usados nas composições de combinação e métodos da presente invenção. Os perfis de reatividade cruzada Exemplares de tais anticorpos incluem anticorpos que apresentam reação cruzada com mais KIRs 2DL1 2DL2/3, 3DL1 mais 3DL2, 2DL1 (e 2DL2/3) mais 2DS4 e 2DL1 (e 2DL2/3), mas não 2DS4.

Dessa maneira, por exemplo, os métodos da presente invenção ou composições podem compreender um anticorpo anti-KIR que se liga a KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 e reduz ou bloqueia a inibição mediada por KIR de citotoxicidade de células NK, como descrito em, por exemplo, WO2005003168.

Exemplos de anticorpos anti-KIR úteis nos métodos de combina- ção e as composições da presente invenção incluem anticorpos anti-KIR que compreendem uma região VL que corresponde ao do anticorpo anti-KIR — DF200,ou consiste essencialmente em uma região VL tal (por ser substan- cialmente um perfil semelhante e reter ligação e afinidade semelhante), ou uma sequência/domínio que é altamente semelhante (por exemplo, pelo menos cerca de 90% idênticas, ou 95% idêntica) à sequência de VL de DF200 VL. A sequência de VL de DF200 é mostrado na WO2006/3179. Tais anticorpos anti-KIR pode também ser alternativamente definida por compre- ender o conjunto de CDRs de variáveis leve de DF200 (também mostrado na WO?2006/3179). Tal anticorpo tipicamente incluirá também, quer o domínio VH de DF200 ou uma sequência muito semelhante (por exemplo, uma se- quência possuindo elevada identidade com o domínio VH de DF200 ou de outra forma que consiste essencialmente em uma tal sequência), ou pelo menos os CDRs de variáveis pesadas de DF200 (mostrada em WO?2006/3179).

Em um outro aspecto exemplar, a composição de combinação ou método da presente invenção inclui um anticorpo anti-KIR que compre- ende as sequências de VH e VL, que correspondem a, ou são altamente semelhantes (por exemplo, consiste essencialmente em) às sequências de WVHeVL de anticorpo 1-7F9 (mostrado na WO2006/3179) ou, pelo menos, compreende as CDRs de VL e VH de 1-7F9. Competição com anticorpos anti-KIR de reação cruzada e/ou neutralizados Em um outro aspecto, os métodos da presente invenção ou composições são caracterizadas pelo fato de compreender um anticorpo anti-KIR que compete com um desses anticorpos, ou um dos outrOs anticor- pos anti-KIR descritos nas referências incorporadas na presente invenção (por exemplo, 1-7F9). Os anticorpos que competem com Os anticorpos anti-KIR exem- plificativos, tais como DF200, 1-7F9 e/ou NKVSF1, podem ser identificados usando ensaios de rastreio conhecidos.

Um certo número de tais ensaios são rotineiramente praticados e bem conhecidos na técnica (Vide, por e- xemplo, Patente U.S.. No. 5.660.827, que é especificamente incorporada na presente invenção por meio de referência). Protocolos com bases em, por exemplo, ELISA, radioimunoensaios, transferência de Western, e o uso da análise BIACORE são adequados para uso em tais estudos de competição.

Pode-se, por exemplo, usar a pré-mistura do anticorpo de con- trole (por exemplo, DF200, NKVSF1, ou 1-7F9) com diferentes quantidades do anticorpo de teste (por exemplo, em proporções de cerca de 1: 1, 1: 2, 1: 100u cerca de 1: 100), durante um período de tempo antes de se aplicar a uma amostra do antigênio KIR.

Alternativamente, o controle e quantidades variadas de anticorpos teste podem simplesmente ser adicionados separa- damente e misturados durante a exposição ao antigênio de amostra KIR.

Contanto que se possa distinguir a partir de anticorpos ligados livres (por exemplo, usando técnicas de separação ou de lavagem para eliminar Os anticorpos não-ligados) e de controle de anti-corpo a partir do anticorpo de teste (por exemplo, através da uso de anticorpos secundários específicos de espécies específicas ou isotipo ou especificamente etiquetar o anticorpo de controle com um marcador detectável) uma será capaz de determinar se o anticorpo de teste reduz a ligação do anticorpo de controle para os diferen- tes antigênios de KIR2DL, indicando que o anticorpo de teste reconhece substancialmente o mesmo epitopo, como controle. A ligação do anticorpo de controle (marcado) na presença de um anticorpo completamente irrele- vante (que não se liga KIR) pode servir como o alto valor de controle. O bai- xo valor de controle pode ser obtido por meio da incubação do anticorpo de controle marcado com o mesmo, mas não marcado anticorpo de controle, onde a competição iria ocorrer e reduzir a ligação do anticorpo marcado. Em um ensaio de teste, uma redução significativa da reatividade dos anticorpos marcados, na presença de um anticorpo de ensaio é indicativa de um anti- corpo teste que reconhece substancialmente o mesmo epitopo, ou seja, um que compete com o anticorpo de controle marcado. Por exemplo, qualquer anticorpo teste que reduz a ligação do anticorpo de controle para um ou am- bos KIR2DL1 e KIR2DL3 antigênios em, pelo menos, cerca de 50%, tal co- mo pelo menos cerca de 60%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 70% (por exemplo, cerca de 65 a100%), em qualquer proporção de con- trole: anticorpo de teste entre cerca de 1: 1 ou de 1: 10 e cerca de 1: 100 é considerado para ser um anticorpo que compete com o controle.

A competição também pode ser avaliada, por exemplo, por meio da citometria de fluxo. Em tal ensaio, células portadoras de um dado KIR podem ser incubadas primeiro com um anticorpo de controle, e em seguida com o anticorpo de teste marcado com um fluorocromo ou biotina. O anti- corpo é referido para competir com o anticorpo de controle se a ligação obti- da após pré-incubação com uma quantidade saturante de anticorpo de con- trole é de cerca de 80%, de preferência cerca de 50%, cerca de 40% ou me- nos (por exemplo, cerca de 30%) da ligação (tão medido por meio de fluo- rescência) obtida pelo anticorpo de teste, sem pré-incubação com o anticor- pode controle. Alternativamente, um anticorpo é referido para competir com o anticorpo de controle se a ligação obtida com um anticorpo de controle marcado (por um fluorocromo ou biotina) em células pré-incubadas com uma quantidade saturante de anticorpo de teste é de cerca de 80%, de preferên- cia cerca de 50%, cerca de 40%, ou menos (por exemplo, cerca de 30%) da ligação obtidos sem pré-incubação com o anticorpo de teste.

Um ensaio simples de competição em que um anticorpo de teste é pré-adsorvido e aplicado a uma concentração saturante a uma superfície sobre a qual ou KIR2QDL1 ou KIR2DL2/3, ou ambos, são imobilizados podem também ser usados vantajosamente.

A superfície de ensaio de competição simples é preferivelmente um chip BIACORE (ou outros meios adequados para a análise de ressonância de plasma de superfície). A ligação de um anticorpo de controle à superfície KIR-revestida é medida.

Esta ligação à superfície KIR contendo o anticorpo de controle sozinho é comparada com a ligação do anticorpo de controle, na presença de um anticorpo de teste.

Uma redução significativa na ligação à superfície contendo KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL 3 pelo anticorpo de controle, na presença de um anticorpo de teste indica que o anticorpo de teste reconhece substancialmente o mesmo epito- po que o anticorpo de controle de tal modo que o anticorpo de tes- te"compete"com o controlar anticorpo.

Qualquer anticorpo teste que reduz a ligação do anticorpo de controle a ambos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 de antigê- nios em pelo menos cerca de 20% ou mais, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, ou mais, pode ser conside- rado como um anticorpo que compete com o anticorpo de controle.

De prefe- rência, tal anticorpo de teste reduz a ligação do anticorpo de controle a cada um de, pelo menos, a KIR2DL1, 2, 3 e antigênios de, pelo menos, cerca de 50% (por exemplo, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, ou mais). Será apreciado que a ordem dos anticorpos de teste e de controle pode ser invertida, isto é, o anticorpo de controle pode ser ligado em primei- ro lugar à superfície e, em seguida, o anticorpo de teste é posto em contato com a superfície posterior, em um ensaio de competição.

Preferencialmente, o anticorpo que possui uma afinidade mais elevada para a KIR2QDL1 e KIR2DL2/8 antigênios está ligado à superfície KIR2DL2/3-containing KIR2DL1 e em primeiro lugar, uma vez que será de esperar que a diminui- ção na ligação observada para o segundo anticorpo (assumindo que Os an-

ticorpos estão a competir) será de maior magnUTIde. Outros exemplos de tais ensaios são fornecidos nos exemplos na presente invenção, e, por e- xemplo, Saunal e Regenmortel, (1995) J. Immunol. Metods 183: 33 a 41, cuja descrição é incorporada na presente invenção por meio de referência.

Em um outro aspecto, o método ou da composição da presente invenção é caracterizado pela inclusão de apenas Os anticorpos que não sejam de reação cruzada com mais de um KIR. Por exemplo, Os anticorpos monoclonais específicos apenas para KIR2DL1 foram mostrados para blo- quear as interações entre KIRQDL1 e HLA-CWA4 alotipos, assim como simila- res alotipos de HLA-C, pertencentes ao mesmo grupo quanto CWA4 (Moretta et al., J. Exp. Med. 1993., 178 (2): 597-604, cuja descrição é incorporada na presente invenção por meio de referência). Em outro exemplo, Os anticorpos monoclonais contra KIR2DL2/3 foram também descritos que bloqueiam as interações de KIR2DL2/3 com HLACw3 (ou semelhantes) alotipos (Moretta etal. 1993, supra). Opcionalmente, o anticorpo pode ser selecionado a par- tir do grupo constUTIído por GL183 (KIR2DL2/3/S2 específico, disponível a partir de Immunotech, França e Beckton Dickinson, EUA); EB6 (KIR2DL1/s1 específico, disponível a partir de Immunotech, França e Beckton Dickinson, EUA).

Epitopos Em aspectos adicionais, a presente invenção proporciona anti- corpos anti-KIR que são dirigidos a regiões específicas antigênicas e/ou epi- topos presentes em vários KIR. Em um aspecto exemplar, a presente inven- ção proporciona anticorpos anti-KIR que se ligam especificamente KIR2QDL1 dentro de uma região definida por um ou mais (ou todos) dos resíduos de aminoácido selecionados a partir de 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181, e 192. Em uma outra modalidade, a presente in- venção proporciona anticorpos anti-KIR que se ligam especificamente a KIR2DL1 e KIR 2DL2/3 em uma região definida por um ou mais (ou todos) dos resíduos de aminoácidos 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160,

161, 162, 163, 181, e 192 do mesmo.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona anticor- pos anti-KIR que se ligam a KIR2DL1, mas que se ligam a um mutante de KIR2DL1 no qual R131 é Ala reduziu significativamente com a afinidade de ligação em relação à mesma (cerca de 20% ou menos, cerca de 30% ou menos, cerca de 40% ou menos, cerca de 50% ou menos, cerca de 60% ou menos, cerca de 70% ou menos, da afinidade exibida para KIR2DL1). Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona anticorpos anti-KIR que se ligam a KIR2DL1, mas que se ligam a um mutante de KIR2QDL1 no qual R157 é Ala, com uma afinidade de ligação relativamente reduzida (cerca de 20% ou menos, cerca de 30% ou menos, cerca de 40% ou menos, cerca de 50% ou menos, cerca de 60% ou menos, cerca de 70% ou menos, da afini- dade exibida para KIR2QDL1). Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona anticorpos anti-KIR que se ligam a KIR2DL1 e que se liga a um mutante de KIR2DL1 no qual R158 é Ala, com uma afinidade de ligação rela- tivamente reduzida (cerca de 20% ou menos, cerca de 30% ou menos, cerca de 40% ou menos, cerca de 50% ou menos, cerca de 60% ou menos, cerca de 70% ou menos, da afinidade exibida para KIR2DL1).

A presente invenção proporciona anticorpos anti-KIR que se |li- gama kKIlR2DL1 dos resíduos 131, 157, e 158.

A presente invenção proporciona anticorpos anti-KIR que se li- gam a KIR2DS3 (R131W), mas não para KIR2DS3 tipo selvagem. Em ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona anticorpos anti-KIR que se ligam a KIR2DL1 e KIR2DL2/3, bem como KIR2DS4. Em ainda outro aspec- to, a presente invenção proporciona anticorpos anti-KIR que se ligam a am- bos KIR2QDL1 e KIR2DL2/3, mas não para KIR2QDSA4.

Para ilustrar o uso de sequências de anticorpos anti-KIR na composição e construção de anticorpos anti-KIR, sequências de exemplares de anticorpos anti-KIR e variantes de sequências de anticorpos serão descri- tasna presente invenção. As sequências de aminoácidos e de ácidos nucle- icos e das regiões CDR de anticorpos exemplares KIR DF200 e 1-7F9 variá- veis são também descritas em WO 2006/ 003179.

Exemplos de mAbs anti-KIR incluem mAb 1-7F9 e 1-4F1, que tem várias vantagens sobre outrOs anticorpos anti-KIR. Por exemplo, 1-7F9 e 1-4F1 são totalmente humano, reduzindo ou minimizando, dessa maneira, qualquer resposta imune contra o anticorpo quando administrado a um indi- víduo. Além disso, tanto 1-7F9 e 1-4F1 de isotipos são adequadas para Os anticorpos anti-KIR terapêuticos (I9G2 e IgG4, respectivamente), tal como descrito abaixo. 1-7F9 é também mais eficaz na indução de morte de células NK que expressam KIR2DL1, quer,-2 e/ou-3 do que os mAbs de murideo EB6, GL183, DF200 e NKVSF1 (Pan2D). 1-7F9 tem ainda uma afinidade maior para KIR anteriormente conhecidas em comparação com os mAbs anti-KIR. Por exemplo, 1-7F9 se liga a KIR2DL1 e KIR2DL3 com constantes de dissociação (Kd) de 0,43 nM e 0,025 nM, respectivamente, representando uma afinidade mais elevada para ambos os antigênios do que, por exemplo, DF200. Os anticorpos particularmente preferidos de acordo com a presente invenção, portanto, têm as mesmas ou semelhantes antigênio especificida- des como 1-7F9 e/ou 1-4F1. Por exemplo, Os anticorpos que compreendem as regiões VH e VL idênticas ou semelhantes como 1-7F9 podem ter as mesmas ou semelhantes propriedades de ligação ao antigênio e/ou NK- estimuladora como 1-7F9, e anticorpos que compreendem o mesmo ou simi- larregiões VH e VL, como 1-4F1 podem ter as mesmas ou semelhantes propriedades de ligação ao antigênio como 1-4F1.

Um anticorpo pode compreender uma sequência de aminoáci- dos da VL e/ou regiões de VH de 1-7F9 como se segue: região VL 1-7F9 (SEQ ID NO: 1):

EIVLTAOSPVYTLSLSPGERATLSCRASQSVSSILAWYQQKPGQA PRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNW

MYTFGQGTKLEIKRT região VH 1-7F9 (SEQ ID NO: 2):

QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPG —QGLEWMGGFIPIFGAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAV YYCARIPSGSIYYDYDMDVWGQGTTVTVSS.

As sequências de aminoácidos de 1-4F1 regiões VH e VL são fornecidas nas SEQ ID NOS: 3 e 4, respectivamente. Em uma modalidade particular, os resíduos 3, 4, 9, 24, 32, 41, 47, 50, 55, 71 e 74 da SEQ ID NO: 3 são OQ, G, SÉ, R A,G,L, D,E, F, e A, respectivamente. Em uma outra mo- dalidade particular, os resíduos 3, 4, 9, 24, 32, 41, 47, 50, 55, 71 e 74 da SEQIDNO:3sãoR M,F,W,Y,A,F,Y,Q,Y,elT, respectivamente.

As sequências de aminoácidos das CDRs de 1-7F9 são como se segue: CDR1 da cadeia leve da sequência de aminoácido que corresponde aos 24 a 34 resíduos de SEQ ID NO: 1; CDR2 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que corresponde aos 50 a 56 resíduos da SEQ ID NO: 1,a CDR3 da cadeia leve da sequência de aminoácido que corresponde aos 89 a 97 resíduos de SEQ ID NO: 1, a CDR1 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que corresponde aos 31 a 35 resíduos de SEQ ID NO: 2, a CDR?2 da cadeia pesada da sequência de aminoácido que corresponde aos resíduos 50 a 65 de SEQ ID NO: 2, e CDR3 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que corresponde aos 99 a 112 resíduos de SEQ ID nO: 2. As sequências de aminoácidos das CDRs de 1-4F1 foram identificadas co- mo se segue: CDR1 da cadeia leve da sequência de aminoácido que cor- responde aos 24 a 34 resíduos de SEQ ID NO: 3; CDR?2 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que corresponde aos 50 a 56 resíduos de SEQ IDNO:3,aCDR3 da cadeia leve da sequência de aminoácido que corres- ponde aos 89 a 97 resíduos de SEQ ID NO: 3; CDR1 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que corresponde aos 31 a 35 resíduos de SEQ ID NO: 4, a CDR2 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que cor- responde aos 50 a 66 resíduos de SEQ ID NO: 4, e CDR3 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que corresponde aos resíduos 99 a 113 de SEQ ID nO: 4.

As sequências de aminoácidos para as cadeias leve e pesada inteiras 1-7F9 são fornecidas nas SEQ ID NOS: 5 e 6, respectivamente.

Dessa maneira, Os anticorpos adicionais, por exemplo, várias —subclasses de anticorpos humanos, fragmentos de anticorpos, derivados de anticorpos, e outros peptídeos de ligação a KIR, podem ser facilmente pro- duzidos por, por exemplo, técnicas recombinantes, com base nestas infor-

mações.

Por exemplo, em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo possuindo uma sequência de VL e uma sequência de VH que con-

siste essencialmente da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente,

e/ou um anticorpo possuindo uma sequência de VL e uma sequência de VH que consiste essencialmente da SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectiva- mente.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo que compreende regiões CDR que consiste essencialmente em a 1-7F9 ou 1-4F1 VH CDR1-3 e VL CDR1-3 acima descrito, ou um anticorpo possuindo cadeias leve e pesada, que consiste essencialmente em a 1-7F9 cadeias levee pesada de SEQ ID NOS: 5 e 6, respectivamente.

Em um outro aspec- to, a presente invenção proporciona um anticorpo que compreende regiões CDR como se segue: a cadeia CDR1 a sequência de aminoácidos de luz correspondente a cerca de 24 a 34 resíduos de SEQ ID NO: 1; CDR2 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que corresponde a cerca de 50 a

56resíduos da SEQ ID NO: 1, a CDR3 da cadeia leve da sequência de ami- noácidos que corresponde a cerca de 89 a 97 resíduos de SEQ ID NO: 1, a CDR1 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que corresponde a cerca de 31 a 35 resíduos de SEQ ID NO: 2, o CDR2 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que corresponde a cerca de 50 a 65 resíduos de

SEQIDNO:2,ea cadeia pesada CDR3 de sequência de aminoácidos que corresponde a cerca de 99-112 resíduos das SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo que compreende regiões CDR como se segue: a cadeia CDR1 a sequência de aminoácidos de luz correspondente a cerca de 24 a 34 resíduos de SEQ ID NO: 3, uma

CDR2 da cadeialeve da sequência de aminoácidos que corresponde a cer- ca de 50 a 56 resíduos da SEQ ID NO: 3, uma CDR3 da cadeia leve da se- quência de aminoácidos que corresponde a cerca de 89 a 97 resíduos de

SEQ ID NO: 3, a CDR1 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que corresponde aos 31 a 35 resíduos de SEQ ID NO: 4; uma CDR?2 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que corresponde a cerca de 50 a 66 resíduos de SEQ ID NO: 4, e uma cadeia pesada CDR3 de sequência de aminoácidos que corresponde a cerca de 99 a 113 resíduos das SEQ ID NO:

4. Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende uma cadeia de sequência de aminoácidos de CDR1 leve que consiste essencialmente dos 24 a 34 resíduos de SEQ ID NO: 1, uma CDR2 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que consiste essencialmente em50a 56 resíduos de SEQ ID NO: 1, uma CDR3 da cadeia leve da se- quência de aminoácidos que consiste essencialmente em 89 a 97 resíduos de SEQ ID NO: 1; uma CDR1 da cadeia pesada de sequência de aminoáci- dos que consiste essencialmente em 31 a 35 resíduos de SEQ ID NO: 2; uma CDR?2 da cadeia pesada aminoácidos sequência que consiste essenci- almente em resíduos 50 a 65 de SEQ ID NO: 2, e uma sequência de CDR3 da cadeia pesada de aminoácidos que consiste essencialmente em 99 a 112 resíduos de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto, a presente invenção pro- porciona um anticorpo que compreende regiõês CDR como se segue: a CDR1 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que consiste essen- cialmente em 24 a 34 resíduos de SEQ ID NO: 3, uma CDR?2 da cadeia leve de sequência de aminoácidos que consiste essencialmente em 50 a 56 resí- duos da SEQ ID NO: 3, uma CDR3 da cadeia leve da sequência de aminoá- cidos que consiste essencialmente em 89 a 97 resíduos de SEQ ID NO: 3, uma CDR1 cadeia pesada da sequência de aminoácidos que consiste es- sencialmente em 31 a 35 resíduos de SEQ ID NO: 4, um CDR?2 da cadeia pesada da sequência de aminoácidos que consiste essencialmente em 50 a 66 resíduos de SEQ ID NO: 4, e uma sequência de CDR3 da cadeia pesada de aminoácidos que consiste essencialmente em resíduos 99 a 113 de SEQ ID NO: 4.

A presente invenção também abrange a uso de um anticorpo an- ti-KIR, fragmento de anticorpo, ou derivado de anticorpo, ou um, que com- preende pelo menos uma variante de sequência de aminoácidos do polipetí- deo de ligação de KIR substancialmente idêntico ao 1-7F9 ou 1-4F1 ou VH sequência de VL, ou a uma região CDR, no seu interior. A sequência de a- —minoácidos variante pode compreender ou consistir essencialmente em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 50, 80, 90, 95, 98 ou 99 (por exemplo, cerca de 50-99, cerca de 65-99, cerca de 75-99, ou cerca de 85-99 por cento) idêntico a um 1-7F9 ou 1-4F1 CDR, VH, ou a região VL,

ou a sequência da cadeia pesada ou leve.

Um anticorpo pode compreender por exemplo uma cadeia leve e uma cadeias pesada de 7F9, cada uma ten-

do uma sequência que é pelo menos cerca de 50, 80, 90, 95, 98 ou 99 (por exemplo, cerca de 50-99, cerca de 65-99, cerca de 75-99, ou cerca de 85-99 por cento) idêntica à SEQ ID NOS: 5 e 6, respectivamente.

A sequência de aminoácidos variante pode, por exemplo, compreender um, dois, ou três CDRs que contêm ou consistem em sequências de aminoácidos que são pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% idêntica a 1-7F9 ou CDRs de 1-4F1. A sequência de aminoácidos variante, também ou alternativamente, pode compreender um, dois, ou três CDRs que contêm ou consistem em sequências de aminoácidos que são pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% idêntica a 1-7F9 ou 1-4F1 CDRs.

Dessa maneira, em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo humano, que compreende uma CDR1 da cadeia leve da sequência de aminoácidos que, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% idênticos aos 24 a 34 resíduos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, uma CDR?2 da ca-

deia leve da sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% idênticos aos 50 a 56 resíduos de SEQ ID nO: 1 ou SEQ ID NO: 3; CDR3 da cadeia leve da se- quência de aminoácidos que consiste essencialmente em, pelo menos, cer-

ca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% idênti-

cos aos 89 a 97 resíduos de SEQ ID nO: 1 ou SEQ ID NO: 3; uuma CDR1 da cadeia pesada da sequência de aminoácido, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% idênticos aos 31 a

35 resíduos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, uma CDR?2 da cadeia pesa-

da da sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% idênticos aos resíduos 50 a 65 deSEQIDnO:2 ou aos 50 a 66 resíduos de SEQ ID NO: 4, e uma sequên- cia de CDR3 da cadeia pesada de aminoácidos de pelo menos cerca 80%,

pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% idênticos aos 99 a

112 resíduos de SEQ ID nO: 2 ou os resíduos 99 a 113 de SEQ ID nO: 4. As propriedades básicas de sequências de aminoácidos de 1-7F9 ou 1-4F1 de- rivadas de KIR de ligação que são retidas em tais sequências de aminoáci- dos variantes, desejavelmente, incluir a especificidade e/ou avidez da se- quência de 1-7F9 ou 1-4F1, para uma ou mais KIR, e podem também, ou alternativamente, incluem a capacidade de 1-7F9 em bloquear a interação KIR/HLA-C e potenciar a atividade lítica de células NK. Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona a uso de um anticorpo anti-KIR, fragmento de anticorpo, ou derivado de anticorpo, ou um polipetídeo de ligação de KIR, que compreende uma sequência de ami- noácidos de ligação KIR que difere de um 1-7F9 ou 1 sequência de KIR-4F1 de ligação em um ou mais resíduos de aminoácidos (por exemplo, pelo me- nos 2, 3, 5, pelo menos, cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 30, em menos cerca de 35, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 50 ou mais resí- duos de aminoácidos) por meio de uma ou mais inserções, deleções de re- síduos, e/ou substUTlições. Tal sequência de uma variante de ligação de KIR confere maior afinidade; maior ou diferente especificidade; menos imu- nogenicidade (em termos de resposta do hospedeiro à sequência), uma maior estabilidade in vivo, e/ou outras propriedades benéficas para a se- quência de mais de uma variante de aminoácidos essencialmente idêntica que compreende a sequência de 1-7F9 ou 1-4F1 sequência nativa. Varia- ções de sequência adequadas são descritos mais adiante neste documento. Uma porção de ligação KIR de um anticorpo anti-KIR, fragmento de anticor- po, ou derivado de anticorpo, ou um polipetídeo de ligação de KIR, também pode compreender qualquer número apropriado de componentes de ácido não-aminoácidos ou substUTlintes, tais como amino-ácidos não porções orgânicas, KIR que facilitam a ligação e/ou fornecer outras propriedades fisi- co-químicas, ou imunológicas vantajosas.

Como já foi referido, as variantes de sequências adequadas de sequências de anticorpos de ligação ao antigênio, tais comas sequências de anticorpos anti-KIR, podem ser incorporadas em anticorpos da presente in-

venção. Variações na maioria dos tipos de sequência do anticorpo podem ser adequadas. Dessa maneira, por exemplo, um anticorpo anti-KIR pode compreender as sequências constantes variantes e/ou variantes de sequên- cias estruturais.

A presente invenção proporciona um anticorpo anti-KIR, que compreende uma ou mais sequências de CDR variante (isto é, uma sequên- cia que difere da CDR semelhante sequência de CDR de tipo selvagem por uma ou mais inserções de aminoácidos, deleções, adições e/ou substitui- ções que o impacto das propriedades biológicas e/ou físico-químico da se- quência, com respeito à sua sequência relativa do tipo selvagem). Vide, por exemplo, as técnicas descritas em WO 2006/ 072625. CDR, VH, e variantes de sequências de VL podem apresentar qualquer nível adequado de identi- dade de um ou mais"pai"CDR, VH, e as sequências de VL, respectivamente, tais como a CDR de VH e VL de sequências anti-KIR mAb DF200 e/anti-KIR ouomAb NKVSF1. Tipicamente, uma sequência variante que se liga a uma região determinante antigênica essencialmente idêntica como um pai irá re- ter pelo menos cerca de 40% de identidade de sequência de ácido com a sequência controladora, tal como cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou mais, cerca de 70% ou mais, cerca de 75% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 85% ou mais, cerca de 90% ou mais, ou, pelo menos, cerca de 95% (por exemplo, cerca de 45-99%, cerca de 55-99%, ou cerca 65-99%) de identidade com a sequência original. No entanto, em alguns casos, especi- almente em relação às sequências de CDR específicas para um epitopo, essencialmente idêntica, as variantes com níveis ainda mais baixos de iden- tidade podem ser adequadas.

As variantes das sequências CDR, VH e VL que se ligam a regi- ões determinantes antigênicas diferentes ou um conjunto diferente (ou"perfil") das regiões determinantes antigênicas podem também ser gera- das por meio de qualquer uma das técnicas descritas na presente invenção emum outro lado (concepção racional, mutagênese, evolução dirigida). Em tais casos, os níveis significativamente mais baixos de identidade de se- quência com uma sequência pai pode ser esperado. Por exemplo, no con-

texto de um CDR-L1, CDR-H1, CDR-H2, H3 ou variante de CDR ter um perfil diferente epitopo de ligação a partir de uma sequência controladora, tão pouco como cerca de 20-30% de identidade de sequência com um dos pais sequência de CDR podem ser afixados em variantes que contribuem para a ligação de NKCAMRs, como KIR.

O documento WO 2006/ 072625 proporciona ainda as variantes de sequências de anticorpos anti-KIR, incluindo as fórmulas específicas para o CDR e as sequências da região variável, as descrições das quais são in- corporadas na presente invenção por meio de referência.

Normalmente, as variantes diferem das sequências "parentais" principalmente por meio de substituições conservadoras, por exemplo, pelo menos cerca de 35%, cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou mais, cerca de 70% ou mais, cerca de 75% ou mais, cerca 80% ou mais, cerca de 85% ou mais, cerca de 90% ou mais, cerca de 95% ou mais (por exemplo, cerca de 65-99%) das substituições na variante são substituições conservadoras de resíduos de aminoácidos. No contexto da presente invenção, as substitu- ições conservadoras podem ser definidas através de substituições dentro das classes de aminoácidos refletidas em um ou mais das estruturas 4, 5e 6 do documento WO 2006/ 072625 (Novo Nordisk AS e Inato Farma SA). O documento WO 2006/ 072625 também descreve substituições conservado- ras adicionais agrupamentos; fazendo alterações substanciais na função de seleção de substituições que são menos conservadoras; princípios úteis pa- ra a concepção e seleção de variantes de peptídeos, a conservação em ter- mos de propriedades termais/hidrófila; manter uma estrutura da variante peptídeo substancialmente similar à estrutura do peptídeo progenitor, inclu- indo os métodos para avaliar a similaridade de peptídeos em termos de substituições conservativas, propriedades termais, conservação peso, com- parações de estrutura secundária ou de pontuação de similitude, como de- terminado pela uso de um programa de BLAST; outros pontos de varia- ção/divergência entre uma variante e um parental pode ser aceitável; altera- ções na sequência vantajosas em CDRs; variações de sequência que resul- tam em uma glicosilação alterada; inserções regiões hipervariáveis e geram um anticorpo variante e, mais em geral, as variantes CDR.

A identidade no contexto das sequências de aminoácidos da presente invenção pode ser determinada por meio de qualquer técnica ade- quada, tipicamente por meio de uma análise de alinhamento de Needleman- Wunsch (Needleman e Wunsch Vide, J. Mol. Biol. (1970) 48: 443 a 453), tal como é fornecida através de análise com ALIGN 2,0 utilizando a matriz de pontuação BLOSUM5O com uma pena de folga inicial de-12 e uma penali- dade de extensão de-2 (Vide Myers e Miller, CABIOS (1989) 4: 11-17 para discussão do técnicas globais de alinhamento incorporados no programa —ALIGN). Uma cópia do programa ALIGN 2.0 está disponível, por exemplo, através do San Diego Supercomputer (SDSC) Workbench Biology. Porque alinhamento Needleman-Wunsch fornece uma medição global ou global de identidade entre duas sequências, deve reconhecer-se que as sequências alvo que podem ser ou subsequências porções de sequências de peptídeos maiores podem ser usadas de uma maneira análoga às sequências comple- tas ou, em alternativa, os valores de alinhamento local pode ser usado para avaliar as relações entre subsequências, tal como determinado por, por e- xemplo, um alinhamento de Smith-Waterman (J. Mol. Biol. Biol. (1981) 147: 195 a 197), que pode ser obtido através de programas disponíveis (outros métodos de alinhamento local que podem ser adequados para a análise de identidade incluem os programas que se aplicam os algoritmos de alinha- mento local heurísticos, tais como os programas BLAST e FastA). Outros métodos disponíveis para avaliar a identidade encontram-se descritos em, por exemplo, Pedido de Patente Internacional WO 2003/ 048185. O algorit- mode Gotoh, que visa melhorar o algoritmo de Needleman-Wunsch, alterna- tivamente, pode ser usado para alinhamentos de sequência globais. Vide, por exemplo, Gotoh, J. Mol.. Biol. 162: 705-708 (1982).

Os compostos, incluindo Os anticorpos que inibem um Polipetí- deo de KIR2DL1, 2 e/ou 3 podem ser capaz de aumentar a eliminação de célulasT que podem estar a contribuir ativamente para a inflamação, o que faz com que estes compostos, incluindo Os anticorpos adequados para a uso em ambas configurações crônicas e agudas inflamação, bem como para uso em combinação com um segundo agente terapêutico usado em ambien- tes inflamatórias. Em particular, o segundo agente terapêutico diminui a in- flamação, por exemplo, agentes usados em ambientes crônicos e agudos, tais como modificadores da doença de fármacos anti-reumáticos (DMARDs), tais como anti-cTNFa e MTX, no caso de artrite reumatoide e outras condi- ções em que tais fármacos são usadps. Visto que os mecanismos de condu- ção à inflamação — particularmente, inflamação aguda e crônica — são acre- ditados em, muitas vezes, serem redundantes, Os anticorpos da presente invenção serão especialmente úteis para uso em combinação com agentes que atuam sobre um mecanismo de inflamação exceto morte direta (por e- xemplo, via ADCC) das células T, mas têm um objetivo biológica semelhan- te, como a redução da produção de citocina pró-inflamatória ou ação, nome- adamente a redução ou inibição de TNFa.

Produção de anticorpos Os anticorpos monoclonais, em particular, podem ser feitos utili- zando o método do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), ou por outros métodos conhecidos, subsequente- mente desenvolvidos (Vide, por exemplo, Goding, Monoclonal anticorpos: Princípios e Prática, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)). Os hibrido- mase outras células de fusão podem ser formadas por meio da fusão quími- ca, a fusão elétrica, ou qualquer outra técnica adequada, com qualquer tipo adequado de mielomas, heteromielomas, células phoblastoid plasmacito- mas, ou semelhante de células imortalizadas e qualquer tipo adequado de células que expressam o anticorpo (s).

As células B imortalizadas transformadas também podem ser usadas para produzir de forma eficaz Os anticorpos. As células B transfor- madas podem ser produzidas por meio das técnicas convencionais, tais co- mo transformação com um vírus de Epstein-Barr, ou um gene transformante. (Vide, por exemplo, "Continuously Proliferating Human Cell Lines Sinthetizing —Antibody of Predetermined Specifity "Zurawaki, VR et al, em Monoclonal An- tibodies, ed. RH por Kennett et al, Plenum Press, NY, 1980, páginas 19-33.). Dessa maneira, as células que expressam anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 estáveis e contínuos e/ou imortalizados das linhagens de célulaes são outra característica da presente invenção. Uma etapa de um método para a pro- dução de anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode incluir, por exemplo, uma etapa de produção de células B imortalizadas que produzem um anticorpo que são fundidas com parceiros adequados para a produção de anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3 anticorpo (s), ou que são sequenciados e as sequências usadas para a produção de um recombinante anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou

3.

As linhagens de célulares disponíveis como hospedeiras para a expressão de proteínas recombinantes são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens de célulaes imortalizadas disponíveis em American Type Culture Collection (ATCC). Estes incluem, inter alia, de ovário de hamster chinês (CHO) células NSO, células SP2, células HeLa, rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatode célula humano (por exemplo, Hep G2), células A549, e um número de outras linhagens de célulaes. Outras linhagens de célulaes que podem ser usados são linhas de células de inseto, tais como células Sf9. Quando os genes de ácidos nucleicos (ou vetores contendo ácido nucleicos) que codifi- cam anticorpos são introduzidos nas células hospedeiras de mamífero, Os anticorpos podem ser produzidos por cultura das células hospedeiras duran- te um período de tempo suficientes para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras, ou mais preferencialmente, a secreção do anticor- po para o meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura utilizando mé- todos de purificação de proteínas padrão. Os anticorpos também podem ser recuperados a partir de lisados da célula hospedeira quando expressados diretamente sem um sinal secretor. A purificação de anticorpos a partir de culturas de células, lisa- dos de célulaes, e os animais transgênicos ou materiais biológicos obtidos comos mesmos (por exemplo, a partir do fluido ascítico de um animal! trans- gênico a produção de anticorpos) pode ser conseguida por meio da aplica- ção de uma série de técnicas adequadas conhecidas na técnica, incluindo,

por exemplo, purificação em coluna de imunoafinidade; precipitação de sul- fato; cromatofocagem, SDS-PAGE preparativa e semelhantes.

Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 também podem ser produ- zidos em células de bactérias e microorganismos unide célulaes eucarióti- cos,tais como leveduras.

Célula bacteriana anticorpos produzidos falta de glicosilação normal e consequentemente pode ser deficiente em termos de funções de ADCC e outros aspectos da resposta imune que podem ser de outro modo associados com anticorpos essencialmente idênticas produzidas em células de mamíferos e/ou animais.

Os métodos apropriados para a purificação, rastreio e seleção de anticorpos podem ser usados, incluindo aqueles descritos no documento WO 2006/ 072625. Triagem e seleção de anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser conseguida por meio de qualquer técnica adequada ou uma com- binação de técnicas.

Por exemplo, uma variedade de formatos de imunoen- saio pode ser usada para selecionar Os anticorpos que se ligam de forma seletiva com uma proteína particular, a variante, ou fragmento.

Por exemplo, os imunoensaios ELISA de fase sólida são usados rotineiramente para sele- cionar anticorpos seletivamente imunoreativos com uma proteína, a proteína variante, ou fragmento deste.

Vide Harlow e Lane, supra.

A afinidade de li- gação de um anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada por meio da análise de Scatchard de Munson et al.

Anal.

Biochem., 107: 220 (1980). Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 tipicamente são rastreados quanto à capacidade para modular a atividade das células NK, tal como por inibira KIR2DL1,2 e/ou 3 sinais mediados, promover a ativação das células NK através de ativação do receptor de sinais mediados por NK.

Uma série de ensaios de células NK foram desenvolvidas que podem ser úteis em tais contextos, incluindo, por exemplo, métodos de triagem de citometria de flu- xo.

Vide, por exemplo, McGinnes, et al. (1984) J.

Imnmunol Metods 80: 70-85. Métodos relevantes para a cultura de células NK, avaliando as células NK, e outros semelhantes são conhecidos na técnica.

Vide, por exemplo, Campbell e Colonna, Protocolos de células naturais assassinas (Methods in Molecular biology Series vol 121.) (2000).

No contexto de anticorpos anti-KIR2DL1, 2, e/ou 3, a atividade neutralizante de células NK pode ser demonstrada pela capacidade de um anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 Anticorpo de reconstUTIir a lise das células alvo por KIR2DL1,2,&e/ou3 de células NK positivas. Anticorpo Anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 associado a modulação de células NK (por exemplo, a inibição KIR) pode também ser avaliada por vários ensaios de citotoxicidade com células. Ma- tança redirecionada é um sistema experimental para a determinação da ca- pacidade de um receptor da célula NK para induzir a citotoxicidade. As célu- las NK revestidas com anticorpo específico para um receptor candidato são avaliadas quanto à sua capacidade para matar células alvo que expressam um receptor Fc a que o anticorpo se liga. Em uma outra variante, a modula- ção de atividade de células NK associadas com um anticorpo anti-KIR pode ser avaliado em um ensaio de libertação de citoquinas. Outras atividades biológicassociadas com vários compostos anti-Anticorpos KIR2DL1, 2 e/ou 3 também pode ser usadas para avaliar anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 são tipicamente usados e fornecidos em uma forma substancialmente pura. Uma molécula substanci- almente pura é uma molécula que é a espécie predominante na composição em que é encontrada no que diz respeito à classe de moléculas a que per- tence (por exemplo, um anticorpo substancialmente pura é a espécie de pro- teína predominantes na composição em que se encontra. Uma espécie substancialmente pura constitui pelo menos cerca de 50% do tipo de molé- cula na composição e, tipicamente, vai fazer, pelo menos, cerca de 70%, pelomenos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou maior percentagem de espécies na composição em peso. Comumente, uma composição que compreende um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 irá apresentar, pelo menos, cerca de 98%, 98% ou 99% de homogeneidade para o anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 o anticorpo no contexto de todas espécies de peptídeos presentes na composição ou, pelo menos, no que diz respeito a espécies de peptídeos substancialmente ativos no contexto da uso proposta. Por exemplo, um estabilizador de peptí-

deo/tampão, tal como uma albumina pode ser intencionalmente incluído na formulação Farmacêutica final, sem prejudicar a atividade dos anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3, e, por conseguinte, pode ser excluído de tais cálcu- los de pureza.

A presença de impurezas que não interfiram com a atividade fundamental também podem ser aceitável no contexto de uma composição substancialmente pura pureza pode ser medida por meio dos métodos apro- priados para o composto dado (por exemplo, métodos cromatográficos, de agarose e/ou eletroforese em gel de poliacrilamida, análise de HPLC, etc.). Uma molécula isolada refere-se a uma molécula que não está associada com níveis significativos (por exemplo, mais do que cerca de 1%, mais do que cerca de 2%, mais do que cerca de 3%, ou mais do que cerca de 5%), de qualquer estranhos e moléculas biológicas indesejáveis, tais co- mo a não-anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 moléculas de anticorpos biológicos conti- dos dentro de uma célula, cultura de célula, meios químicos, ou animal, em queo anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 foi produzida.

Uma molécula isolada também refere-se a qualquer molécula que tenha passado através de uma tal fase de pureza devido à intervenção humana (quer automático, manual, ou de ambos) para uma quantidade significativa de tempo (por exemplo, pe- lo menos cerca de 10 minutos, pelo menos cerca de 20 minutos, pelo menos cercade uma hora, ou mais). Em muitas das várias composições fornecidas pela presente invenção, como por exemplo em uma composição que com- preende um ou mais veículos Farmaceuticamente aceitáveis, um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode estar presente em quantidades relativamente pequenas em termos de número de espécies moleculares totais na compo- sição (por exemplo, no caso de uma composição que compreende uma grande quantidade de um veículo farmaceuticamente aceitável, um estabili- zador, e/ou conservante). Em alguns casos, os peptídeos adicionais, tal co- mo a BSA, podem ser incluídas em uma tal composição com um previamen- te purificada anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. No entanto, desde que tais componentes adicionais da composição são aceitáveis para a aplicação pre- tendida do anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3, uma tal composição pode ainda ser descrita como que compreende um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 iso-

lado.

Em outras palavras, o termo "isolado"não pretende excluir as misturas artificiais ou sintéticas com outros compostos ou materiais, tais como podem formar parte de uma preparação farmaceuticamente aceitável.

Os veículos Farmaceuticamente aceitáveis Um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser combinado com um ou mais veículos (diluentes, excipientes, e semelhantes) e/ou adjuvantes adequados para uma ou mais vias de administração pretendidas para pro- porcionar as composições que são Farmaceuticamente aceitável.

O anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser, por exemplo, mis- turado com latose, sacarose, pó (por exemplo, pó de amido), ésteres de ce- lulose de ácidos alcanóicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnésio, óxido de magnésio, sais de sódio e cálcio de ácidos fosfórico e sulfúrico, a- cácia, gelatina, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, e/ou álcool polivinílico, e ainda opcionalmente comprimidos ou encapsulados para administração convencional.

Alternativamente, um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser dissolvido em solução salina, água, polietilenoglicol, propilenoglicol, so- luções coloidais de carboximetilcelulose, etanol, óleo de milho, óleo de a- mendoim, óleo de semente de algodão, óleo de sésamo, goma de tragacan- to, e/ou vários tampões.

Outros veículos, adjuvantes e modos de administra- ção são bem conhecidas nas artes Farmacêuticas.

Um veículo ou diluente pode incluir material de atraso de tempo, tal como monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila sozinho ou com uma cera, ou outros materiais funcionalmente semelhantes.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis geralmente incluem qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores da absor- ção adequados e similares que são fisiologicamente compatíveis com um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem água, solução salina, solução salina tamponada com fos- fato, dextrose, glicerol, etanol, e semelhantes, bem como combinações de quaisquer dos mesmos.

Em muitos casos, pode ser desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, tais como, sorbitol, manitol ou cloreto de sódio em uma tal composição.

As substâncias farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes molhantes ou quantidades menores de subs- tâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, conser- vantes ou tampões, que desejavelmente pode aumentar a vida de prateleira ouateficáciado anticorpo anti-KIR, composição relacionada, ou combinação.

A adequação para os veículos e outros componentes de composições far- macêuticas é determinada com base na falta de um impato negativo signifi- cativo sobre as propriedades biológicas desejadas do anticorpo.

As composições de anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3, e compo- sições e combinações relacionadas, de acordo com a presente invenção podem estar em uma variedade de formas adequadas.

Tais formas incluem, por exemplo, as formas de dosagem líquida, semi-sólidos e sólidos, tais co- mo soluções liquidas (por exemplo, soluções injetáveis e para infusão), dis- persões ou suspensões, emulsões, microemulsões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas, dendrímeros e outras nanopartículas (Vide, por exemplo, Baek et al, Methods Enzymol 2003; 362: 240 A 9; Nigavekar et al, Farm Res 2004 Mar 21 (3): 476 A 83), as micropartículas, e os supositórios.

As formu- lações e os sais são ainda descritos em WO2006/072625. Tipicamente, as composições sob a forma de soluções injetáveis ouparainfusão, tais como composições semelhantes às usadas para a imu- nização passivas de seres humanos com outrOs anticorpos, são usados pa- ra a entrega de anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 da presente invenção.

Um modo típico para a entrega de composições de anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 é através de administração parentérica (por exemplo, intravenosa, — subcutânea, intraperitoneal e/ou a administração intramuscular). Em um as- pecto, um anticorpo anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 é administrado a um paciente humano por meio da infusão intravenosa ou injeção.

Uma composição para uso farmacêutico pode também incluir vá- rios diluentes, cargas, sais, tampões, detergentes (por exemplo, um deter- gente não iônico, tal como Tween-80), estabilizadores (por exemplo, açúca- res ou aminoácidos livres da proteína), conservantes, os fixadores de teci- dos, solubilizantes, e/ou outros materiais apropriados para inclusão em uma composição para uso farmacêutico. Exemplos de componentes adequados são também descritos em, por exemplo, Berge et al. Farm. Sci., 6661), 1 a 19 (1977), Wang e Hanson, J. Parenteral. Sci. Tecnologia: 42, S4, S6 (1988); EUA Patent n º s 6165779 e 6225289. Uma tal composição Farma- cêutica pode também incluir conservantes, antioxidantes ou outros aditivos conhecidos por meio das pessoas que são versadas na técnica. Os veículos Farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo referências em WO2006/072625. POLIPETÍDEOS KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 A presente invenção proporciona Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 e composições que contêm os compostos que inibem a tais polipetídeos para uso no tratamento ou prevenção de distúrbios autoi- munes e inflamatórios. Exemplos de Polipetídeos KIR2Q2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 são definidos nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 7, 8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, e 24. Vide a Tabela

1. Os ácidos nucleicos que codificam para Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 podem ser modificados usando as técnicas de biologia molecular convencionais, que resultam em variantes de polipetídeos que compreende pelo menos um KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, incluindo mas não se limitando a deleções, adições e substUTlições na sequência de ami- noácido, que retêm a antigenicidade específica de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 (por exemplo, a Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 está ligada por um anti-KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 anticorpo). Além disso, os polipetídeos variantes que compreendem pelo menos um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 também pode reter a antigenicidade de Po- lipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 (por exemplo, aumentar uma resposta imunitária específica contra o polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL?2, KIR2DL3 variante de polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, respec- tivamente, após imunização de um indivíduo). O Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 podem ser formulados com um veículo Farmacêutico para a fabricação de uma composição útil como um antigênio"vacina contra o câncer"(por exemplo, uma composição Farmacêutica que provoca uma resposta imune específica contra o KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 (por e- xemplo, as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24), que produz anti-KIRD2L1, 2, 3e/ou anticorpos após a imunização em um indivíduo). Derivados de polipeptídeos e análogos Deve notar-se que os polipetídeos descritos na presente inven- ção podem ser os produtos de degradação, peptídeos sintéticos ou peptí- deos recombinantes, bem como peptidomiméticos, peptídeos sintéticos, pep- toides e semipeptoids (por exemplo, os análogos de peptídeos, os quais po- dem ter, por exemplo, modificações que tornam os peptídeos mais estáveis enquanto que em um corpo ou mais capazes de penetrar nas células.) modi- ficações de Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 descrito na presen- te invenção incluem, mas não estão limitados a modificação Do terminal N, a modificação Terminal C, o peptídeo modificação ligação (por exemplo, CH2- NH, CH2-S, CH2-S = O, O = C-NH, CH2-S, CH2-CH2, S = C-NH, CH = CH ou CF = CH), modificações de estrutura principal, e modificação resíduo.

Métodos para a preparação de compostos peptidomiméticos são bem co- nhecidos na técnica.

Martin, (2010) Quantitative Drug Design: Uma Introdu- ção Crítica [2º ed] CRC Press.

As ligações peptídicas (-CO-NH-) dentro do peptídeo podem ser substituídas, por exemplo, por meio das ligações N-metiladas (-N (CH3)-CO- ), ligações de éster (-C (R) HCOOC (R)-N-), ligações de cetometileno (-CO- CH2-), ligações a-aza (-NH-N (R)-CO-), em que R é qualquer grupo alquila, por exemplo, metila, ligações carba (-CH2-NH), ligações de hidroxietileno (- CH (OH)-CH2-), ligações tioamida (-CS-NH-), ligações duplas olefínicas (CH = CH-), ligações de amida (retro-NH-CO-), derivados peptídicos (-N (R)- CH2-CO-), em que R é a cadeia"normal"lateral, naturalmente apresentados no átomo de carbono.

Estas modificações podem ocorrer em qualquer das ligações ao longo da cadeia de peptídeo e até mesmo em várias (2-3), ao mesmo tempo.

Os aminoácidos aromáticos naturais, Trp, Tyr e Phe, podem ser substUTlídos por meio dos aminoácidos não naturais sintéticos, tais como fenilglicina, tic, naftilelanina (Nol), derivados de anel metilados de fenilalani- na, derivados halogenados de fenilalanina ou a o-metil-tirosina. Em adição ao acima, os polipetídeos da presente invenção também podem incluir um ou maisaminoácidos modificados ou de um ou mais monômeros de ácido não-aminoácidos (por exemplo, ácidos graxos, hidratos de carbono comple- xos), por exemplo, hidroxiprolina, fosfosserina e fosfotreonina, e outros ami- noácidos invulgares, incluindo, mas não limitado a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina e ornitina. Além disso, o termo ”"aminoácido"inclui ambos os aminoácidos D-e L-.

Uma vez que os polipetídeos da presente invenção são prefe- rencialmente usados em terapêutica, o qual requer que os peptídeos este- jam na forma solúvel, os polipetídeos da presente invenção podem compre- ender um ou mais aminoácidos polares não naturais ou naturais, incluindo, mas não limitado a serina e treonina, que são capazes de aumentar a solubi- lidade do peptídeo, devido à sua cadeia lateral contendo hidroxila.

Os polipepeptídeos da presente invenção podem estar em uma forma linear, embora seja apreciado que em casos podem também ser usa- dos.

Os Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ser purificados a partir de células que tenham sido alteradas para expressar (por exemplo, recombinante). As sequências de DNA que codificam os Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 podem ser inseridos em um vetor de expressão e, em seguida, transformados (ou transfectados) em uma célula hospedeira apropriada e/ou expressa em um animal transgênico. Os polipeptídeos KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 (por exemplo, as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24), dete modo expressos podem então ser isolados por meio dos métodos conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Maniatis, et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual [3 ? ed.] Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Os polipepeptídeos da presente invenção podem ser sintetiza-

dos bioquimicamente, por exemplo, usando as técnicas de fase sólida pa- drão.

Estes métodos incluem a síntese de fase sólida exclusiva, métodos de síntese em fase sólida parcial, condensação de fragmentos, a síntese clássi- ca em solução.

Estes métodos são de preferência usados quando o peptí- deoé relativamente pequeno (isto é, 10 kDa) e/ou, quando não podem ser produzidos por meio das técnicas recombinantes (isto é, não codificados por meio de uma sequência de ácido nucleico) e, por conseguinte, envolve química diferente.

Os procedimentos de síntese de peptídeos em fase sóli- da são bem conhecidos na técnica e descritos por Stewart (1984) Sínteses de peptídeos em fase sólida [2nd ed.] Pierce Chemical Company e Benoi- ton (2005) Chemistry of Peptide Sinthesis CRC Press.

Os peptídeos sintéti- cos podem ser purificados por meio da cromatografia líquida de alta efici- ência preparativa e cuja composição pode ser confirmada através de se- quenciação de aminoácidos.

Vide Creighton (1992) [2 º ed] Proteínas, Es- truturas e Princípios Molecular WH Freeman and Company; Aguilar (2004) [ed] HPLC de Peptídeos e Proteínas: Métodos e protocolos Humana Press; Simpson (2002) Protocolos de Sequencamento da Proteína [2 * ed.]

Humana Press.

Nos casos em que grandes quantidades de polipetídeos da pre- sente invenção são desejados, os polipetídeos da presente invenção podem ser gerados usando as técnicas recombinantes, como descrito por Invitrogen (2002)"Guia para os sistemas de vetores de expressão de baculovírus (BEVs) e Técnicas de Cultura deinsetos"manual de Instruções; Hatti-Kaul e Mattiasson (2003) [Eds] Isolamento e purificação de proteínas; Ahmed (2004) Princípios e reações de proteína Extração, purificação e caracteriza- ção CRC Press.

Outras técnicas recombinantes, tais como descritos por, por exemplo, Bitter et al. (1987) Métodos em Enzimol. 153: 516-544, Studier, et al. (1990) Métodos em Enzimol. 185: 60-89, Brisson et al. (1984) Nature 310: 511-514, Takamatsu, et al. (1987) EMBO J. 6: 307-311, Corruzzi et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680 e Brogli, et al. (1984) Science 224: 838-843, Gurley, et al. (1986) Célula.

Mol.

Biol. 6: 559-565 e Weissbach e Weissbach (1988) Métodos de Biologia Vegetal Molecular, Academic Press, NY, Seção

VIII, páginas 421 a 463. Variantes de sequência de polipetídeo Para qualquer sequência de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 das sequências de aminoácidos SEQ ID: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19,20,21,22,23e 24, uma caracterização ou optimização adicional po- de ser conseguida por sistematicamente tanto na adição quanto na remoção de resíduos de aminoácido para gerar peptídeos mais longos ou mais curtos, e os testes e as sequências geradas por uma janela curta de tamanho maior ou menor, ou até o estabelecimento do antigênio a partir desse ponto.

O a- —coplamento esta abordagem para gerar novos alvos candidatos com os tes- tes de eficácia de moléculas antigênicas baseadas nessas sequências em um ensaio de imunogenicidade, tal como conhecidos na técnica ou tal como descrito na presente invenção, pode conduzir a uma maior manipulação do antigênio.

Mais ainda, tais sequências optimizadas podem ser ajustadas por, por exemplo, a partir da adição, eliminações, ou outras mutações, como co- nhecido na técnica e/ou discutido na presente invenção para optimizar ainda mais a KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 (por exemplo, aumento da estabili- dade de soro ou meio circulante-vida, aumentando a estabilidade térmica, aumentando a entrega, aumentando a imunogenicidade, aumentando a so- lubilidade, direcionandopara um local particular no tipo de células ou in vivo). Os Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 descritos na presente invenção podem compreender mutações de substUTlição conser- vadores, (isto é, a substUTlição de um ou mais aminoácidos por meio dos aminoácidos semelhantes). Por exemplo, a substUTlição conservativa refe- re-se à substUTlição de um aminoácido por outro da mesma classe geral, por exemplo, um aminoácido ácido por outro aminoácido acídico, um amino- ácido básico por outro aminoácido básico, ou um aminoácido neutro por ou- tro aminoácido neutro.

As sequências KIRQ2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 polipeptídicas — podemter pelomenos cerca de 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de homologia de se- quência com qualquer uma ou mais das sequências de aminoácidos das

SEQ ID NOS: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23 e

24. Mais preferencialmente, a presente invenção contempla as sequências polipeptídicas tendo pelo menos cerca de 95% de homologia de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 98% de homologia de sequência, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% de ho- mologia de sequência com qualquer uma ou mais das sequências de polipe- tídeos de Sequências KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 polipeptidicas das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, e 24. Os métodos para determinar a homolo- giaentreas sequências de aminoácidos, bem comas sequências de ácidos nucleicos, são bem conhecidos por meio das pessoas que são versadas na técnica. Vide, por exemplo, Nedelkov & Nelson (2006) Novas e emergentes técnicas proteômicas Humana Press.

Dessa maneira, um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2?, e KIR2DL3 pode ter pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de homologia de sequência com uma sequência de polipetí- deo. Por exemplo, um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ter pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de homologia de sequência com as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23 e 24. O termo homologia ou identidade, é entendido como significando que o número de acordar aminoácidos (identidade) com outras proteas, ex- pressas em percentagem. A identidade é de preferência determinado por comparação com uma dada sequência de outras proteínas com a ajuda de programas de computador. Se as sequências que são comparadas umas com as outras são diferentes em comprimento, a identidade deve ser deter- minada de tal modo que o número de aminoácidos com as partes curtas de sequência com a sequência mais longa determina a percentagem de identi- dade. A identidade pode ser determinada rotineiramente por meio de pro- gramas de computador conhecidos, que estão disponíveis ao público, tais como, por exemplo, ClustalW. Tompson, et al. (1994) Nucleic Acids Resear- ch 22: 4673-4680. ClustalW está disponível ao público a partir do Laboratório Europeu de Biologia Molecular e pode ser baixado a partir de várias páginas da internet, entre outros, o IGBMC (Instituto de Genética et de Biologie et Cellulaire moleculaire) ea EBI e todos EBI páginas espelhadas internet (Eu- ropean Bioinformatics Institute). Se o programa de computador ClustalW Versão 1.8 é usado para determinar a identidade entre, por exemplo, a pro- teína de referência do presente pedido de patente e de outras proteínas, os seguintes parâmetros são ajustados: KTUPLE = 1, TOPDIAG = 5, WINDOW =5,PAIRGAP = 3, GAPOPEN = 10, GAPEXTEND = 0,05, GAPDIST = 8, MAXDIV = 40, MATRIX = GONNET, ENDGAPS (OFF), NOPGAP, NOHGAP. Vide também Instituto Europeu de Bioinformática (EBI) caixa de ferramentas disponíveis on-line e Smith (2002) Protocolos de Sequenciamento de Proteí- na [2 ? ed.] Humana Press.

Uma possibilidade de encontrar sequências similares é realizar pesquisas de banco de dados de sequência. Na presente invenção, uma ou mais sequências podem ser inseridas como o que é conhecido como uma consulta. Esta sequência de consulta é então comparada com sequências presentes nas bases de dados selecionadas usando programas de compu- tador estatísticos. Tais pesquisas de banco de dados (pesquisas BLAST) são conhecidos do perito e podem ser realizadas em diferentes fornecedo- res. Se, por exemplo, como uma consulta do banco de dados é realizada no NCBI (National Center for Biotechnology Information), devem ser usadas configurações padrão para a respectiva comparação consulta. Para a com- paração de sequências de proteína (blastp), essas configurações são: Limite entrez = Não ativado; filtro = baixa complexidade ativada; Espere valor = 10; tamanho da palavra = 3; Matrix = BLOSUMG62; custos Gap: Existência = 11, Extensão = 1. O resultado de uma tal consulta é, entre outros parâmetros, do grau de identidade entre a sequência de busca e as sequências seme- lhantes encontradas nas bases de dados.

Os Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 incluem os fragmentos funcionais dos referidos polipetídeos. Um"fragmento funcio-

nal"do referido polipetídeo inclui um fragmento do gene ou cDNA que codi- fica disse KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, fragmento que é capaz de indu- zir uma resposta imune (por exemplo, a resposta imune humoral ou de cé- lula.) Dessa maneira, por exemplo, fragmentos de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 de acordo com a presente invenção que correspondem aos resí- duos de aminoácidos que contribuem para a imunogenicidade do antigênio e que os fragmentos podem servir para funcionar como antigênios para induzir uma resposta imune (por exemplo, a resposta imune humoral ou de célula). Este aspecto da presente invenção também inclui as isoformas de fatiamento diferenciais e começa a transcrição dos polipetídeos de acordo com a presente invenção.

Os polipetídeos de acordo com a presente in- venção podem também compreender fragmentos, derivados e variantes alélicas de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3. Métodos e materiais para a pro- dução de fragmentos de Polipetídeos KIR2QDL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 são bem conhecidos na técnica.

Vide, por exemplo, Maniatis, et al. (2001) Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual [3 ? ed.] Cold Spring Harbor Labora-

tory Press.

As variantes de polipeptídeos KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 podem manter a sua especificidade antigênica para ligar os respectivOs an- ticorpos (por exemplo, uma variante de polipeptídeo KIR2DL1, KIR2DL2 ou KIR2DL3 será vinculado por um anti-KIR2DL1, KIR2DL2 ou KIR2DL3 anti- corpo). As variantes totalmente antigênicas podem conter apenas variações conservadoras ou variações de resíduos não-críticos ou em regiões não- críticos.

As variantes antigênicas podem também conter a substituição de aminoácidos semelhantes que resultam em nenhuma mudança ou uma alte- ração insignificante da antigenicidade.

Em alternativa, estas substituições podem afetar positivamente ou negativamente a antigenicidade em algum grau.

Variantes não antigênicas tipicamente contêm uma ou mais substitui- ções não conservativas de aminoácidos, deleções, inserções, inversões, ou truncagem ou uma substituição, inserção, inversão ou deleção de um resí- duo crítico na região crítica ou de um epitopo.

A biologia molecular e técni- cas de modificação bioquímica dos Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e

KIR2DL3 preservando antigenicidade específica dos polipetídeos para os seus respectivOs anticorpos são bem conhecidos na técnica. Vide, por e- xemplo, Ho, et al. (1989) Gene 77 (1): 51 a 59; Landt, et al. (1990) Gene 96 (1): 125 a 128; Hopp & Woods (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 78 (6): 3824 a 3828; Kolaskar & Tongaonkar (1990) FEBS Letters 276 (1-2): 172 a 174, e Cavidadeing, et al. (1985) FEBS Letters 188 (2): 215 a 218.

As Variantes de Polipeptídeos KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 funcionam tanto como agonistas KIR2DL1, KIR2DL2 ou KIR2DL3 (miméti- cos) ou como antagonistas KIR2QDL1, KIR2DL2 ou KIR2DL3. As variantes de Polipetídeos KIRQDL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 podem ser geradas por meio da mutagênese, por exemplo, mutação de ponto discreto ou truncamento de um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Um agonista de Polipetí- deos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode reter substancialmente as mes- mas, ou um subconjunto, das atividades biológicas da forma de ocorrência natural de um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Um antagonis- ta de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode inibir uma ou mais das atividades da forma de ocorrência natural da Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 através de, por exemplo, modular uma competitiva- mente KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 atividade mediada de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Dessa maneira, os efeitos biológicos espe- cíficos podem ser induzidos por meio do tratamento com uma variante da função limitada. Por exemplo, um indivíduo pode ser tratado com uma vari- ante tendo um subconjunto das atividades biológicas de forma de ocorrência natural, do polipetídeo tem menos efeitos colaterais em um indivíduo em re- lação ao tratamento com a forma de ocorrência natural da Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3.

As variantes de um polipeptídeo KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 que funcionam quer como Agonistas KIR2QDL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 (mimi- cos) ou como antagonistas KIR2QDL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 podem ser identi- ficados por rastreio de bibliotecas combinatoriais de mutantes, por exemplo, mutantes de truncamento, de um Polipeptídeo KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 para polipeptídeo agonista KIR2QDL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 ou ativi-

dade antagonista.

Peptidomiméticos Além de Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 constUTI- ídos apenas por meio dos aminoácidos que ocorrem naturalmente, KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 peptidomiméticos são também fornecidos. Os análogos peptidicos são comumente usados na indústria Farmacêutica como fármacos não peptídicos com propriedades análogas às do peptídeo modelo. Estes tipos de compostos não peptídicos são designados por"miméticos de peptídeos"ou"peptidomiméticos"(Fauchere (1986) Adv. Drug Res. 15:29; Advances in Miméticos e peptidomiméticos de aminoáci- dos (Volume 2) Andrew Abell (Ed.) (1999) JAI Press, Inc., e Evans et al (1987) J. Med. Chem 30: 1.229) e são normalmente desenvolvidos com a ajuda de modelagem molecular computorizada. Os miméticos de peptídeos que são estruturalmente semelhantes aos peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profiláctico equiva- lente. Geralmente, peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um polipetídeo paradigma (isto é, Um polipeptídeo que possui uma atividade biológica ou Farmacolôgica), tal como KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 hu- mano ou de camundongo, mas têm uma ou mais ligações peptídicas, opcio- —nalmente substituída por um enlace selecionado de entre o grupo constituído por:-CH2NH-,-CH2S-,-CH2-CH2-,-CH = CH-(cis e trans),-COCH2-,-CH (OH) CH2-e-CH2SO-, por meio dos métodos conhecidos na técnica e descritos nas referências seguintes: Spatola em Química e Bioquíma de Aminoácidos, Peptídeos e Proteínas Weinstein, B., ed, Marcel Dekker, Nova lorque, p. 267 (1983), Spatola, Vega Data (Março 1983), vol. 1, Issue 3,"modificações da estrutura principal peptídica"”; Morley (1980) Trends. Farm. Sci. pp.463 a 468; Hudson et al. (1979) Int. J. Pept. Prot. Res. 14: 177 a 185 (-CH2NH-,- CH2CH2); Spatola et al. (1986) Vida. Sci. 38: 1243-1249 (-CH2-S); Hann, (1982) J. Chem. SoC Perkin. Trans. | 307-314 (-CH-CH-, cis e trans); Alm- quist, et al. (1980) J. Med. Chem. Chem. 23: 1392-1398 (-COCH2-); Jen- nings-White et al. (1982) Tetra-hedron Lett. 23: 2533 (-COCH2-), -CH (OH) CH2-), Holladay et al. (1983) tetra-hedro. Lett. 24: 4401-4404 (-C(OH)CH2-),

e Hruby (1982) Life Sei. 31: 189-199 (-CH2-S-). Um vínculo não peptídeo particularmente preferido é-CH2NH-. Esses miméticos peptídicos podem ter vantagens significativas sobre as modalidades de polipeptídeos, incluindo, por exemplo: a produção mais econômica, uma maior estabilidade química e as propriedades farmacolôgicas melhoradas (semi-vida, a absorção, a po- tência, eficácia), especificidade alterada (por exemplo, um largo espectro de biológico atividades), reduzida antigenicidade, e outras.

A rotulagem de pep- tidomiméticos geralmente envolve a ligação covalente de uma ou mais eti- quetas, diretamente ou através de um espaçador (por exemplo, um grupo amida), a(s) posição (ões) de não interferência sobre o peptidomimético que são previstas por dados quantitativos de estrutura-atividade e/ou molecular modelagem.

Tais posições não interferentes são geralmente posições que não formam contatos diretos com a (s) macromoléculas (s) ao qual se liga o peptidomimético para produzir o efeito terapêutico.

A derivatização (por e- xemplo, a etiquetagem) de peptidomiméticos não deve interferir substanci- almente com a atividade biológica ou Farmacolôgica desejada do peptido-

mimético.

A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 sequência de aminoácidos com uma D- aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina em lugar de L-lisina) pode ser usada para gerar peptídeos mais estável.

Além disso, os peptídeos res- tritos que compreende uma sequência KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 de aminoácidos ou uma sequência substancialmente idêntica a variação pode ser gerado por meio de métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch (1992) Annu Rev.

Biochem 61: 387); Por exemplo, pela adição de resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes dissulfureto intramoleculares que ciclizam o ptido.

As sequências de aminoácidos de Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 aqui identificadas permitir aos que são ver- sados na técnica produzir polipetídeos que correspondem a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, e variantes de sequências de peptídeos de sequências do mesmo.

Tais polipetídeos podem ser produzidos em células hospedeiras de procariotas ou eucariotas por expressão de polinucleotídeos que codifi-

cam para uma sequência KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 do peptídeo, com frequência, como parte de um polipetídeo maior. Em alternativa, tais peptí- deos podem ser sintetizados por meio dos métodos químicos. Os métodos para a expressão de polipetídeos heterólogos em hospedeiros recombinan- tes, a síntese química de polipetídeos, e a tradução in vitro são bem conhe- cidos na técnica. Certas modificações nos terminais amino e/ou no terminal carbóxi e/ou extensões peptídicas para a sequência do núcleo pode propor- cionar propriedades Farmacolôgicas vantajosas física, química, bioquímica, e, tais como: estabilidade aumentada, o aumento da potência e/ou a eficá- cia, aresistência às proteases séricas, desejáveis propriedades Farmacoci- néticas, e outros. Os peptídeos podem ser usados terapeuticamente para tratar a doença, por exemplo, alterando a co-estimulação de um paciente. Os aminoácidos que são essenciais para a função podem ser identificados por meio dos métodos conhecidos na técnica, tais como muta- gênese dirigida ou a mutagênese de varrimento de alanina. Cunningham, et al. (1989) Sei. 244: 1081 a 1085. Este último procedimento introduz as mu- tações de alanina únicas em todos os resíduos da molécula. As moléculas mutante resultantes são então testadas quanto à atividade biológica, tais como epitopo de ligação ou na atividade de ADCC in vitro. Os locais que são críticos para a ligação ligante-receptor podem também ser determinadas por meio da análise estrutural tal como a cristalografia, a ressonância magnética nuclear, ou fotoafinidade rotulagem. Smith, et al. (1992) J. Mol. Biol. Biol.

224: 899-904; de Vos, et al. (1992) Sei. 255: 306-12.

Por exemplo, em uma classe de substituições conserva-se as substituições de aminoácidos. Tais substituições são as que substituem um determinado aminoácido em um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 por outro aminoácido de características semelhantes. Normalmen- te visto como substituições conservadoras são os substitutos, um para o ou- tro, entre os aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; troca dos resíduos de hidroxila Ser e Thr, troca do resíduos de ácido Asp e Glu, a substituição en- tre os resíduos de amida Asn e Gln, a troca dos resíduos básicos Lys e Arg, substituições entre os resíduos aromáticos Phe, Tyr. Orientações quanto que as alterações de aminoácidos são susceptíveis de ser fenotipicamente silen- ciosas é encontrada em, por exemplo, Bowie, et al. (1990) Sei. 247: 1306 a

1310. Dessa maneira, uma pessoa que é versada na técnica reconhece que os inventores possuem variantes de peptídeos, sem delimitação de todas variantes específicas. Tal como com as sequências de aminoácidos, um pe- rito reconhecerá que substituições individuais, deleções ou adições de um ácido nucleico, peptídeo, polipetídeo ou sequência de proteína que altera, adiciona ou elimina um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na codificado sequência é uma"variante modificada de forma conservadora", onde os resultados de alteração da substituição de um ami- noácido por um aminoácido quimicamente semelhante. As tabelas de substi- tuição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas na técnica. Tais variantes modificadas conservadora- mente são em adição a, e não excluem as variantes polimórficas, interespé- cies de homólogos, e alelos da da presente invenção. Vide, por exemplo, Creighton (1992) Proteínas: estruturas e propriedades moleculares [2nd ed.] WH Freeman. Além disso, os polipetídeos contêm frequentemente aminoácidos do que os outros vinte aminoácidos que"ocorrem naturalmente". Além disso, muitos aminoácidos, incluindo os aminoácidos terminais, podem ser modifi- cados por meio dos processos naturais, como o processamento e outras modificações pós-tradução, ou por meio das técnicas de modificação quími- ca bem conhecidas na técnica. As modificações conhecidas incluem, mas não estão limitadas a, acetilação, acilação, ribosilação de ADP, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um derivado, a ligação covalente de nucleotídeo ou nucleotí- deos de um lípido ou derivado lipídico, ligação covalente de fosfotidylinositol, ligação cruzada, ciclização, formação de dissulfeto de títulos, desmetilação, a formação de ligações cruzadas covalentes, a formação de cistina, forma- ção de piroglutamato, formulação, g-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, pro- cessamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilani-

zação, sulfatação, transferência mediada por RNA de adição de aminoácidos a proteínas, como arginilação, e ubiquitinação.

Vide Creighton (1992) Proteí- nas: estrutura e propriedades moleculares [2 ? ed.] E Lundblad (1995) Técni- cas de Modificação de proteínas [1 Ed.] Muitas revisões detalhadas estão disponíveis sobre este assunto.

Vide, por exemplo, Wold (1983) posttransla- tional modificação covalente de proteínas Acad.

Press, NY; Seifter et al. (1990) Meth.

EnzymoL. 182: 626-46, e Rattan, et al. (1992) Ann.

NY Acad.

Sci. 663: 48-62. Fragmentos Uma porção biologicamente ativa de um Polipeptídeo KIR2QDL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 inclui um fragmento de um Polipeptídeo KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 que participa de uma interação entre uma molécula de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 molécula e uma não-molécula de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, por exemplo, um ligante natural de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Porções biologicamente ativas de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 incluem os peptídeos que compreendem as sequências de aminoácidos suficientemente idênticas ou derivadas a partir da sequência de aminoácidos de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, por exemplo, a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:2,40u5, que incluem menos aminoácidos do que o comprimento total de Polipeptídeos KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, e exibem pelo menos uma atividade de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Tipicamente, as porções biologicamente ativas compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade de Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, por exemplo, modulando (suprimir) de células T CD4 para respostas prolife- rativas anti-CD3, a supressão da resposta proliferativa das células CD4 T cognatos células de um modo específico do antigênio, os efeitos sobre a expressão de citocinas específicas.

Uma parte biologicamente ativa de um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ser um polipetídeo que é, por exemplo, 25,50, 75,100, 125, 150, 175, 200, 225 ou mais aminoáci- dos de comprimento do aminoácidas sequências de SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24. Porções biologi-

camente ativas de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 podem ser usadas como alvo para agentes que modulam o desenvolvimento de ativida- de mediada por KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, por exemplo, ativação de células imunes.

Uma parte biologicamente ativa de um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode compreender pelo menos uma porção de um domínio extracelular. Uma parte biologicamente ativa de um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode conter pelo menos uma porção de um domínio extracelular e um ou mais dos seguintes domínios: um domínio de —peptídeo de sinal, um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático. Além disso, outras partes biologicamente ativas, nas quais outras regiões do polipetídeo são eliminadas, podem ser preparadas por meio das técnicas recombinantes e avaliadas para uma ou mais das atividades funcionais de um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 nativo.

O Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ter a se- quência de aminoácidos mostrada nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,236 24. O Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ser substancialmente idêntico às sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23 e 24, e mantém a atividade funcio- nal do polipetídeo das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, e 24, mas difere na se- quência de aminoácidos, devido à variação alélica natural ou de mutagêne- se, tal como descrito na presente invenção.

Proteínasde Fusão As fusões que compreendem os Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 estão também dentro do âmbito da presente invenção. Por exemplo, a proteína de fusão pode ser ligada a uma proteína de fusão GST em que as Sequências polipeptídicas KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 são fundidos ao terminal C das sequências GST. Tais proteínas de fusão podem facilitar a purificação do recombinante de Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Alternativamente, Polipetídeos KIR2QDL1, KIR2DL2, e

KIR2DL3 podem ser fundidos com uma proteína que se liga aos folículos das células B, iniciando assim uma resposta imune humoral e ativação de células T. Berney et al. (1999) J. Exp.. Med. Chem. 190: 851 a 60. Alternati- vamente, por exemplo, os Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 po- dem ser geneticamente acoplados com o anticorpo anti-células dendríticas para entregar o antigênio ao sistema imunitário e de estimular uma resposta imune de célula. He, et al. (2004) Clin. Câncer Res. 10: 1920 a 1927. Uma proteína quimérica ou de fusão da presente invenção podem ser produzidos por meio das técnicas de DNA recombinante convencionais. Por exemplo, os fragmentos de DNA que codificam para diferentes sequências polipeptídicas são ligados uns aos outros em grelha, de acordo com técnicas convencio- nais, por exemplo, empregando extremidades atenuadas ou extremidades vacilantes para a ligação, digestão com enzimas de restrição para propor- cionar terminais apropriados, preenchimento das extremidades coesivas conforme apropriadas, tratamento com fosfatase alcalina para evitar ligações indesejáveis , e ligação enzimática. O gene de fusão pode ser sintetizado por meio das técnicas convencionais incluindo sintetizadores de DNA auto- matizados.

As proteínas de fusão podem incluir um terminal C ou transloca- çãodas sequências dos terminais N. Além disso, as proteínas de fusão po- dem compreender elementos adicionais, por exemplo, para a detecção da proteína, a purificação, ou outras aplicações. Detecção e domínios que facili- tam a purificação incluem, mas não se limitam aos peptídeos quelantes de metal, tais como intervalos de poli-histidina, módulos de histidina-triptofano, ou outrosdomínios que permitem a purificação em metais imobilizados, pro- teína de ligação a maltose, domínios de proteína A que permitem a purifica- ção sobre imunoglobulina imobilizada, e o domínio usado no sistema de puri- ficação de extensão/afinidade FLAG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.) A proteína de fusão pode ser preparada a partir de uma proteína da presente invenção por meio de fusão com uma porção de uma imunoglo- bulina que compreende uma região constante de uma imunoglobulina. Mais preferivelmente, a porção da imunoglobulina inclui uma região da cadeia pe-

sada constante, a qual é opcionalmente e mais preferencialmente uma regi- ão constante da cadeia pesada humana. A região constante da cadeia pe- sada é mais preferencialmente uma região constante da cadeia pesada de IgG e, opcionalmente, e mais preferencialmente é uma cadeia de Fc, com maior preferência um fragmento Fe de IgG que compreende domínios CH2 e CH3. Embora qualquer subtipo de IgG podem, opcionalmente, ser usado, o subtipo I9gG1 é o preferido. A cadeia de Fc pode opcionalmente ser um"tipo selvagem"ou a cadeia Fc conhecida, ou alternativamente, pode ser mutada. Vide, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2006/

0034852.O termo "cadeia Fc"também opcionalmente compreende qualquer tipo de fragmento Fc. Vários dos resíduos de aminoácidos específicos que estão envolvidos na atividade de anticorpo mediada região constante da subclasse de IgG foram identificados. Inclusão, substUTlição ou exclusão destes aminoácidos específicos, portanto, permite a inclusão ou exclusão de imunoglobulina constante atividade mediada região específica. Além disso, as alterações específicas podem resultar em não glicolização por exemplo, e/ou outras alterações desejadas para a cadeia de Fc. Pelo menos algumas alterações podem, opcionalmente, ser feitas para bloquear uma função de Fc que é considerada indesejável, tal como um efeito indesejável do sistema imune. Vide McCafferty, et al. (2002) Engenharia de Anticorpo: Uma Abor- dagem Prática (Eds.) Oxford University Press. A inclusão de uma sequência ligante clivável tal como Fator Xa (Vide, por exemplo, Ottavi, (1998) Biochimie 80: 289 a 93), o motivo de re- conhecimento de proteases subtilisina (Vide, por exemplo, Polyak (1997) Protein Eng. 10.: 615-19);. enteroquinase (Invitrogen, San Diego, CA), entre o domínio de translocação (para a expressão eficiente da membrana do plasma) e o resto do recém polipetídeo traduzido pode ser útil para facilitar a purificação. Por exemplo, um constructo pode incluir uma sequência de codi- ficação de um polipetídeo de ácido nucleico ligado a seis resíduos de histidi- na seguidos de tioredoxina um, um local de clivagem de enterocinase (Vide, por exemplo, Williams (1995) Biochemistry 34: 1787 a 1797), e um domínio de translocação do Terminal C. Os resíduos histidina facilitam a detecção e a purificação, enquanto o local de clivagem de enterocinase proporciona um meio para purificar a (s) proteína (s) desejada (s) a partir do restante da pro- teína de fusão. Tecnologia pertencente a vetores que codificam proteínas de fusão e à aplicação de proteínas de fusão são bem descritas na literatura científicae de patentes. Vide, v.g., Kroll (1993) DNA Cell. Biol. 12: 441 a 53.

A proteína de fusão pode ser uma proteína de fusão GST- KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 a em que as Sequências KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 são fundidas ao terminal C das sequências GST. Tais proteínas de fusão podem facilitar a purificação de proteínas recombinantes KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Em uma outra modalidade, a proteína de fusão é um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 contendo uma sequência de sinal heteróloga na sua extremidade N-terminal. Em determi- nadas células hospedeiras (por exemplo, as células hospedeiras de mamífe- ro), expressão e/ou secreção de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ser aumentada através da uso de uma sequência de sinal heteróloga. Em uma modalidade, a proteína de fusão é uma proteína de fusão Ig KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 em que as sequências KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 são fundidas com uma porção de uma molécula de Ig. A porção de Ig da proteína de fusão e pode incluir a região constante de imunoglobulina, por exemplo, um domínio Cgammail gama4 humana ou um domínio C (por e- xemplo, a dobradiça, regiões de IgG CH2 e CH3 humana gama1 ou IgG hu- mana gama4 (Vide, por exemplo, Patente U.S. Nºs 5.116.964, 5.580.756,.

5.844.095) Uma proteína de fusão resultante pode ter alterada a a solubili- dade, afinidade de ligação, estabilidade e/ou de valência de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 (isto é, o número de locais de ligação por molécula) e pode aumentar a eficácia de purificação de proteínas. Particularmente preferidas, as proteínas de fusão KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 de Ig incluem uma porção do domínio extracelular de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 acoplado a uma região constante de imuno- — globulina (por exemplo, região Fc). A região constante da imunoglobulina pode conter as modificações genéticas que reduzem ou eliminam a atividade efetora inerente na estrutura de imunoglobulina. Por exemplo, o DNA que codifica uma porção extracelular de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ser ligado a DNA que codifica a dobradiça, CH2 e CH3 de IgG humana gama1 e/ou IgG gama4 modificado por meio da mutagênese dirigida, por exemplo, conforme ensinado em WO 97/28267, O KIR2DL1, KIR2DL2,KIR2DL3 proteínas de fusão da presente invenção pode ser incor- porado em composições Farmacêuticas e administrados a um indivíduo in vivo.

As Proteínas de fusão KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 podem ser usa- das para afetar a biodisponibilidade de um parceiro de ligação de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Uso de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 proteínas de fusão pode ser útil terapeuticamente para o tratamento de afecções ou dis- túrbios que podem beneficiar da modulação da resposta imune.

Além disso, as proteínas de fusão KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 da presente invenção podem ser usadas como imunogênios para produzir anticorpos anti- KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 em um indivíduo, para purificar as proteínas deligaçãoaKIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 no rastreio ensaios para identifi- car moléculas que inibem a interação KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 com o seu parceiro de ligação natural.

Conjugados Os Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 podem ser con- jugados com outras porções.

Tais conjugados são muitas vezes usadas na preparação de vacinas.

O Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ser conjugado com um hidrato de carbono (por exemplo, manose, fu- cose, glucose, GICNAs, maltose), que é reconhecido pelo receptor de mano- se presentes nas células dendríticas e macrôfagos.

A ligação que se seguiu, a agregação e, endocitose mediada por receptor fornecer as funções fagoci- tose aumentada a imunidade inata e adaptativa.

Vide Mahnke, et al. (2000) J.

Cell Biol. 151: 673-84; Dong, et al. (1999) J.

Immonol. 163: 5427-34. Ou- tras porções adequadas para conjugação para induzir uma resposta imune inclui, mas não se limitam a Keyhole Limpit Hemociannin (KLH), toxoide da difteria, toxoide da cólera, Pseudomonas exoproteína A, e as proteínas da membrana externa (OMPS). Isolamento do polipeptídeo

A presente invenção também fornece métodos para o isolamen- to de Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 (por exemplo, as sequên- cias de aminoácidos das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24). Por exemplo, as linhagens de célulaes relevan- tes podem ser obtidas a partir de um paciente que sofre de um distúrbio au- toimune ou inflamatória. Após a homogeneização e a solubilização com de- tergente, o antigênio é purificado por meio da cromatografia. A exclusão por tamanho ou cromatografia de afinidade pode ser usada para este, e pode ser usada em conjunto com anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3.

Por exemplo, anti-KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 anticorpo pode ser imobi- lizado em um suporte sólido (por exemplo, juntamente com as resinas, grâ- nulos magnéticos) para o antigênio simples adsorção, lavagem e eluição a partir do suporte sólido. A proteína eluída é então mais estudada para a pre- sença do antigênio, a caracterização e identificação. Vide Walker (2002) Pro- tein Protocols Handbook [2 *? ed.] Humana Press e da Cultura (2003) [ed.] Protein Purification Protocolos Humana Press.

O antigênio isolado desta maneira pode ser usado para a prepa- ração de um produto Farmacêutico utilizando o excipiente Farmacêutico convencional e substância transportadora. Por exemplo, a administração in vivodo antigênio purificado de uma solução fisiológica de NaCl.

Além disso, os Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 de acordo com a presente invenção pode servir como um antigênio na identifi- cação de atividades como parte de um rastreio de alto rendimento. Os méto- dos de rastreio de alto rendimento são conhecidos por meio das pessoas que são versadas na técnica. Cavidades (2002) High Durante bioanalíticos Preparação de Amostras Elsevier Health Sciences. POLINUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM KIR2DL1, KIR2DL2, E KIR2DL3 A presente invenção proporciona também nucleotídeos que codi- ficam a KIR2QDL1, KIR2DL2, KIR2DL3. A presente invenção também propor- ciona polinucleotídeos que codificam os Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24. A presente invenção tam-

bém proporciona os fragmentos hibridizáveis com as sequências, e sequên- cias homólogas às sequências de polinucleotídeos descritas na presente invenção que são pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%o0ou100%.

A presente invenção também proporciona os polinucleotídeos que compreendem pelo menos uma sequência KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 que codifica os Polipetídeos semelhantes com uso de códons dife- rente, sequências alteradas caracterizadas por mutações, tais como a elimi- nação, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, quer de ocor- rência natural ou de origem humana, quer induzidos aleatoriamente ou de uma forma orientada. A presente invenção também engloba as sequências de ácido nucleico homólogas (por exemplo, que formam uma parte de uma sequência polinucleotídica da presente invenção), que incluem as regiões de sequências únicas para os polinucleotídeos da presente invenção.

A presente invenção também abrange os ácidos nucleicos que codificam os homólogos de Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, tais homólogos pode ser pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica homólogas às sequências de aminoácidos aqui esta- belecidos, como pode ser determinada utilizando software BLASTP do Cen- tro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI), utilizando os parâ- metros padrão. A presente invenção também abrange os fragmentos dos polinucleotídeos e polipeptídeos acima descritos que têm mutações, tais como deleções, inserções ou substituições de um ou mais ácidos nucleicos, quer de ocorrência natural ou de origem humana, quer induzidos aleatoria- mente ou de uma forma orientada.

As moléculas de ácido nucleico podem codificar um KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, ou um fragmento funcional da referida molécula de ácido nucleico. Um"fragmento funcional"do referido ácido nucleico que inclui um fragmento do gene ou cDNA que codifica o referido fragmento de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 é capaz de ser expressas para produzir um

KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 também é capaz de induzir uma resposta i- mune (por exemplo, anticorpos que se ligam seletivamente a KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3) Dessa maneira, por exemplo, os fragmentos de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 de acordo com a presente invenção corres- pondem aos resíduos de aminoácidos que contribuem para a imunogenici- dade do antigênio e os fragmentos podem servir para funcionar como anti- gênios para induzir uma resposta imune (por exemplo, a resposta imune humoral ou de célula.) Este aspecto da presente invenção também inclui as isoformas de fatiamento diferencialmente e inicia transcrição dos ácidos nu- cleicosde acordo com a presente invenção. As moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção também compreendem os fragmentos, derivados e variantes alélicas das moléculas de ácidos nucleicos descritas acima, que codifica um KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 de acordo com a presente invenção. Métodos e materiais para fazer ácidos nucleicos que co- dificam para fragmentos de KIR2QDL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, são bem conhe- cidos na técnica. Vide, por exemplo, Maniatis, et al. (2001) Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual [3 º ed.] Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Uma molécula de ácido nucleico que compreende a totalidade ou uma porção de um polinucleotídeo que codifica as sequências de amino- ácidos das SEQ ID NOs: 7,38, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, e 24, ou um ortólogo ou variante podem ser isolados pela reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores oligonucleotidicos sin- téticos concebidos com base na sequência de um polinucleotídeo que codifi- ca as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23e24.

Uma molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ser amplificado utilizando CDNA, MRNA ou, em alternativa, o DNA genômico como molde e os iniciadores oligonucleotídicos apropriados de acordo com as técnicas de amplificação padrão de PCR. A molécula de ácido nucleico assim amplificada pode ser clonada em um vetor adequado e caracterizada por meio da análise da sequência de DNA. Além disso, os oligonucleotídeos que correspondem a Sequências KIR2QDL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 nucleotídi-

cas podem ser preparados por meio das técnicas de síntese padrão, por e- xemplo, utilizando um sintetizador de DNA automatizado. Em uma modalidade, um isolado de KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 que codifica a molécula de ácido nucleico da presente invenção compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1 ou 3, ou um fragmento do mesmo. Em uma outra modalidade a molécula de ácido nucleico da presente invenção compreende uma molécula de ácido nucleico que é o complemento da sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 3, ou uma porção de qualquer destas sequências de nu- cleotídeos. Uma molécula de ácido nucleico que é complementar à de um polinucleotídeo que codifica as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23 e 24, é um que é suficientemente complementar à sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS:7,8,9,10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24 de modo que ele pode hibridar com a sequência de nucleotídeos de um polinu- cleotídeo que codifica as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24, respectivamen- te, formando-se assim um duplex estável.

Em ainda uma outra modalidade, uma molécula de ácido nuclei- co isolada da presente invencão compreende uma sequência de nucleotí- deos que é pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 99,5% idêntica a toda a extensão de um polinucleotídeo que codifica as sequências de aminoácidos das SEQ IDNOs:7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, e 24, ou uma porção de uma dessas sequências de nucleotídeos.

Além disso, a molécula de ácido nucleico da presente invenção pode compreender apenas uma porção de um polinucleotídeo que codifica as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23 e 24, por exemplo, um fragmento que pode ser usado como uma sonda ou iniciador ou um fragmento que codifica uma porção de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, por exemplo,,

uma parte biologicamente ativa de um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. As sequências de nucleotídeos determinadas a partir da clonagem do gene DP-L2 humano permitem a geração de sondas e iniciadores dese- nhados para uso na identificação e/ou clonagem de outros membros da fa- míliade PD-L2 assim como KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 homólogos de outras espécies.

O iniciador/sonda compreende tipicamente oligonucleotídeo substancialmente purificado.

O oligonucleotídeo compreende tipicamente uma região da sequência de nucleotídeos que hibrida sob condições rigoro- sas com pelo menos cerca de 12 ou 15, preferencialmente cerca de 20 ou 25, mais preferencialmente cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ou 75 consecutivo nucleotídeos de uma sequência com sentido da SEQ ID NO: 1 ou 3, de uma sequência antissentido de um polinucleotídeo que codifica as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, e 24, ou uma variante alélica de ocorrência natural ou mutante de um polinucleotídeo que codifica as sequências de a- minoácidos das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,

20,21,22,23e 24. Em uma modalidade, uma molécula de ácido nucleico da pre- sente invenção compreende uma sequência de nucleotídeos que é maior do que cerca de 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350- 400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750- 800, 800-850, 850-900, 900-950, ou mais nucleotídeos de comprimento e hibrida sob condições de hibridação rigorosas a um polinucleotídeo que codi- fica as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14,15,16,17,18,19, 20, 21, 22,23 e 24, ou o seu complemento.

Em uma outra modalidade, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção compreende uma sequência de nucleotídeos que é maior do que cerca de 880-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1100, 1100-1150 ou mais nucleotídeos de comprimento e hibrida sob condições de hibridação rigoro- sasa um bpolinucleotídeo que codifica as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23 e 24, ou o seu complemento.

Ainda em uma outra modalidade, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção compreende uma sequência de nu- cleotídeos que é maior do que 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, ou mais nucleotídeos de comprimento e hibrida sob hibridação rigorosa con- dições para uma molécula de ácido nucleico que compreende a região de codificação de um polinucleotídeo que codifica as sequências de aminoáci- dos de SEQ ID NOS: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, e 24, ou um seu complemento. Ainda em uma outra modalidade, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção compreende uma se- quência de nucleotídeos que é maior do que cerca de 50-100, 100-150, 150- 200,200-250,250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550- 600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 850-900, 900-950, ou mais nu- cleotídeos de comprimento, inclui pelo menos cerca de 15 (ou seja, 15 con- tíguos) da sequência de nucleotídeos que compreende a região de codifica- ção de um polinucleotídeo que codifica as sequências de aminoácidos das SEQID NOs:7,8,9,10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, e 24, ou um seu complemento, e hibrida sob condições rigorosas com uma molécula de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24a e seu complemento.

As sondas baseadas na Sequências KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 de nucleotídeos podem ser usadas para detectar os transcritos ou as sequências genômicas que codificam os mesmos polipetídeos ou homó- logos. Em modalidades, a sonda compreende ainda um grupo marcador |i- gado a este, por exemplo, o grupo marcador pode ser um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um co-fator de enzima. Tais sondas podem ser usadas como parte de um kit de teste de diagnóstico para identi- ficar as células ou tecidos que não expressam corretamente um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, tal como por medição de um nível de KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 que codifica o ácido nucleico de uma amos- trade células de um indivíduo, por exemplo, a detecção de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 os níveis de mMRNA ou determinar se uma genômico KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 gene foi mutado ou eliminado.

Além das sequências de nucleotídeos de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 de um polinucleotídeo que codifica as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, e 24, será apreciado por aqueles que são versados na técnica que os poli- morfismos da sequência de DNA que conduzam a alterações nas sequên- cias de aminoácidos de Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 podem existir dentro de uma população (por exemplo, a população humana). Tal polimorfismo genético nos Genes KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 podem existir entre os indivíduos dentro de uma população devido à variação alélica natural. Tal como usado na presente invenção, os termos"gene" e "gene re- combinante"referem-se a moléculas de ácido nucleico que incluem uma es- trutura de leUTIra aberta que codifica um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, de preferência um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 mamífero, e podem ainda incluir uma sequência não codificante regulatória e íntrons.

As variantes alélicas de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 humano ou de camundongo incluem tanto os polipeptídeos funcionais e não- funcionais KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Variantes alélicas funcionais são amino variantes de sequências de ácidos do polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 humano ou de camundongo que mantêm a capacidade de se ligarem ao (s) parceiro (s) de ligação (ões) KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 naturais e/ou modulam de células CD4 + e CD8 +, a proliferação da célula T que ocorrem naturalmente e a produção de citocinas e a ativação dos linfócitos. Variantes alélicas funcionais irão conter tipicamente apenas uma substituição conservadora de um ou mais aminoácidos das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, e 24, ou de substituição, deleção ou inserção de resíduos não críticos em regiões não essenciais do polipetídeo.

As variantes alélicas não funcionais são as variantes de sequên- cia de aminoácidos que ocorrem de forma natural do polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 humano ou de camundongo e que não têm a capacidade de ligação natural aos Parceiros de ligação KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, e/ou modulam qualquer uma das atividades de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 descritas na presente invenção. As variantes alélicas não funcionais irão conter tipicamente uma substituição não conservativa, deleção ou inserção ou truncagem prematura das sequências de aminoáci- dosdasSEQID NOs:7,8,9,10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, e 24, ou uma substituição, inserção ou deleção de resíduos críticos ou regiões críticas do polipetídeo.

A presente invenção proporciona ainda ortólogos não humano, não de camundongo do polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 hu- mano ou de camundongo. Ortólogos de polipetídeo de KIR2QDL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 humano são polipetídeos que são isolados a partir de, organismos não humanos não-camundongo e possuem a mesma atividade de ligação e/ou atividade moduladora de ativação de linfócitos, e capacidade para mo- dular as células CD4 + e CD8 +, a proliferação da célula T e a produção de citoquinas como os polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 humanos ou de murinos descritos na presente invenção.

Um mutante de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ser ensaiado quanto à capacidade para se ligarem e/ou modular a ati- vidade de um parceiro de ligação KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3singular, paramodular a sinalização intra ou interde célula, modular a ativação de lin- fócitos T e/ou modular a resposta imunitária de um organismo.

As moléculas de ácido nucleico isoladas codificam um KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ou as proteínas de fusão KIR2DL1, KIR2DL?2, KIR2DL3. Tais moléculas de ácido nucleico, que compreendem pelo menos uma primeira sequência de nucleotídeos que codifica um KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ou proteína de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, polipe- tídeo ou peptídeo ligado operacionalmente a uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica para uma não proteínas de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, polipetídeo ou peptídeo, pode ser preparado por meio das técni- casde DNA recombinante convencionais.

Além disso, a identidade refere-se de uma maneira geral à equi- valência funcional e/ou estrutural que existe entre as moléculas de ácido nu-

cleico em causa ou as proteínas codificadas por elas. As moléculas de ácido nucleico, que são homólogas às moléculas descritas acima e constituem derivados destas moléculas são, em geral, variações destas moléculas, que constituem modificações, que executam a mesma função biológica. Ao mesmo tempo, as variações podem ocorrer naturalmente, por exemplo, po- dem ser sequências de outras espécies ou podem ser mutantes, em que estes mutantes podem ter ocorrido de forma natural ou de ter sido introduzi- do por meio da mutagênese objetivo. As variações podem também ser se- quências produzidas sinteticamente. As variantes alélicas podem ser ambas variantes que ocorrem naturalmente e também as variantes produzidas sin- teticamente ou variantes produzidas por meio das técnicas de DNA recombi- nante. As moléculas de ácido nucleico, que se desviem a partir de moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, devido à degenera- ção do código genético, constituem uma forma especial de derivados.

Incluída também no âmbito da presente invenção está uma se- quência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 mesma. Devido ao código genético ser de- generado, mais de um códon pode ser usado para codificar um aminoácido particular. Utilizando o código genético, um ou mais nucleotídeos diferentes podem ser identificados, cada um dos quais seria capaz de codificar o ami- noácido. A probabilidade de que um determinado nucleotídeo será, de fato, constUTIir a sequência de codificação de códon real pode ser estimada con- siderando relações de emparelhamento de bases anormais ea frequência com que um códon particular é realmente usado (para codificar um aminoá- cido particular) em células eucarióticas ou procarióticas expressando um KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 mesma. Tais"regras de uso de códons"são descritas por Lathe et al. (1985) J. Moles. Biol. 183: 1 a 12.

Polinucleotídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 Modificados Os nucleotídeos da presente invenção podem ser modificados — polinucleotídeos. Os nucleotídeos não modificados são frequentemente me- nos óptimos em algumas aplicações, por exemplo, sujeitos a degradação por meio das nucleases de célulaes. As modificações químicas para uma ou mais das subunidades do oligonucleotídeo podem conferir propriedades me- lhoradas, por exemplo, podem tornar mais polinucleotídeos estáveis às nu- cleases.

Modificações de oligonucleotídeos típicos são bem conhecidas na técnica e podem incluir um ou mais dos seguintes: (i) a alteração, por exem- plo, substituição de um ou ambos os átomos de oxigênio não-ligante de fós- foro e/ou de um ou mais dos oxigênios de fosfato que ligam na ligação fos- fodiéster intersugar, (ii) a alteração, por exemplo, a substituição de um com- ponente de açúcar ribose, por exemplo, por meio da modificação ou substitu- ição de 2 ' hidroxila na ribose, (iii) substituição total do radical fosfato; (iv) a modificação ou a substituição de uma base de ocorrência natural, com uma substituição de uma base não-natural (v) ou a modificação da estrutura prin- cipal ribose-fosfato, por exemplo, com ácido nucleico peptídico (PNA), (vi) a modificação da extremidade 3 ' ou 5' da oligonucelotide, e (vii) a modificação do açúcar, por exemplo, anéis de seis membros.

Os polinucleotídeos usados em conformidade com a presente invenção podem ser sintetizados por meio de qualquer número de meios bem conhecidos na técnica, ou adquiridos a partir de uma variedade de vendedores comerciais (LC Sciences, Houston, TX; Promega, Madison, WI; Invitrogen, Carisbad, CA). Antissentido Para além das moléculas de ácido nucleico que codificam para Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 descritos acima, um outro as- pecto da presente invenção diz respeito a moléculas de ácido nucleico isola- das que nelas são antissentido.

Um ácido nucleico"antissentido"compreende uma sequência de nucleotídeos que é complementar a um"sentido"de ácido —nucleico que codifica para um polipetídeo, por exemplo, complementar à ca- deia de codificação de uma molécula de cDNA da cadeia dupla ou comple- mentar a uma sequência de MRNA.

Consequentemente, um ácido nucleico antissentido pode ligar-se hidrogênio com um ácido nucleico sentido.

O áci- do nucleico antissentido pode ser complementar a toda um KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 cadeia de codificação, ou a apenas uma porção do mesmo.

Em uma modalidade, uma molécula de ácido nucleico antissentido é antissentido para uma"região codificante"da cadeia de codificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica um KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3.

O termo "região codificante"refere-se a região da sequência de nucleotídeos que compreende os códons que são traduzidos em resíduos de aminoáci- dos. Em uma outra modalidade, a molécula de ácido nucleico antissentido é antissentido para uma"região não codificante"da cadeia codificante de uma sequência nucleotídica que codifica PD-L. A expressão"região codifican- te"refere-se a sequências 5 ' e 3 ' que flanqueiam a região de codificação, que não são traduzidas em aminoácidos (também referida como regiões 5 ' e 3' não traduzidas). Tendo em conta as sequências de filamento de codifi- cação que codificam KIR2QDL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 humano ou de camun- dongo descrito na presente invenção, os ácidos nucleicos antissentido da presente invenção podem ser concebidos de acordo com as regras de em- parelhamento de Watson e Crick base. A molécula de ácido nucleico antis- sentido pode ser complementar de toda a região codificadora de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 MRNA, mas mais preferencialmente é um oligonucleo- tídeo que é antissentido a apenas uma porção da região de codificação ou não codificante de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 MRNA. Por exemplo, o oligonucleotídeo antissentido pode ser complementar da região em torno do local de iniciação da tradução de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ou KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 MRNA. Um oligonucleotídeo antissentido pode ser, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 nu- cleotídeos de comprimento. Uma molécula de ácido nucleico antissentido da presente invenção pode ser construída utilizando a síntese química e rea- ções de ligação enzimáticas usando procedimentos conhecidos na técnica.

Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico antissentido (por exemplo, um oligonucleotídeo antissentido) pode ser quimicamente sintetizada utilizando os nucleotídeos que ocorrem naturalmente ou nucleotídeos variadamente modificados desenhados para aumentar a estabilidade biológica das molécu- las ou para aumentar a estabilidade física do duplex formado entre o antis- sentidoe os ácidos nucleicos de sentido, por exemplo, derivados de fosforo- tioato e nucleotídeos de acridina substituída pode ser usado. Exemplos de nucleotídeos modificados que podem ser usados para gerar o ácido nucleico antissentido incluem 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-clorouracila, 5-iodo- uracila, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carbóxi-hidroxilmetil) uracila, 5-carboximetilaminometil 2-tiouridin-e, 5-carboximetilaminometiluracila, di- hidrouracila, beta-D-galatosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilgua- nina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilami- nometiluracila, 5-Metoxiaminometil-2-tiour-acila, beta-D-mannosilqueosina, S5'-metoxicarboximetiluracila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-N6-isopentenilade- nina, uracila-ácido 5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracila, queosina, 2Htiocitosina, 5-metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, metil éster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-S-oxiacético (v), 5-metil-2- tiouracila, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracila, (ACP3) w, e 2,6 diaminopurina.

Alternativamente, o ácido nucleico antissentido pode ser pro- duzido biologicamente utilizando um vetor de expressão no qual um ácido nucleico foi subclonado em uma orientação antissentido (isto é, o RNA transcrito a partir do ácido nucleico inserido será de orientação antissentido para um ácido nucleico alvo de interesse, descrito mais adiante na subseção seguinte). As moléculas de ácido nucleico antissentido da presente inven- ção são tipicamente administradas a um indivíduo ou produzidas in situ de tal modo que elas hibridam com, ou se ligam a mRNA de célula e/ou DNA genômico codificando um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, para assim inibir a expressão o polipetídeo, por exemplo, por meio da inibi- ção de transcrição e/ou tradução.

A hibridação pode ser por meio da com- plementaridade de nucleotídeos convencional para formar um duplex está- vel, ou, por exemplo, no caso de uma molécula de ácido nucleico antissenti- do que se liga a duplexes de DNA, através de interações específicas no maior sulco da dupla hélice.

Um exemplo de uma via de administração de moléculas de ácido nucleico antissentido da presente invenção incluem a injeção direta em um local do tecido.

Alternativamente, moléculas de ácido nucleico antissentido podem ser modificadas para atingir as células selecio- nadas e depois administradas sistemicamente.

Por exemplo, para adminis-

tração sistêmica, as moléculas antissentido podem ser modificadas de tal forma que elas se ligam especificamente a receptores ou antigênios expres- sas na superfície de uma célula selecionada, por exemplo, ligante as molé- culas de ácido nucleico antissentido a peptídeos ou anticorpos que se ligam a receptores da superfície de célula ou antigênios. As moléculas de ácido nucleico antissentido podem também ser entregues a células que utilizam os vetores descrito na presente invenção. Para atingir as concentrações intrade célulaes suficientes das moléculas antissentido, são preferidos os construc- tos de vetores em que a molécula de ácido nucleico antissentido é colocada sobo controle de um promotor forte pol || ou pol Ill.

A Molécula de ácido nucleico antissentido KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 pode ser uma molécula de ácido nucleico a-anomérica. Uma molé- cula de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos específicos da cadeia dupla com RNA complementar em que, ao contrário das habUTIais B- unidades, as cadeias correm paralelamente umas às outras. Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6625-6641. A molécula de ácido nucleico an- tissentido pode ainda compreender um 2'-O-metilribonucleotide (Inoue, et al (1987) Nucleic Acids Res. 15:. 6131 a 6148.) Ou um químico de RNA-DNA análogo (Inoue, et al (1987). FEBS Lett 215:. 327 a 330).

Uma molécula de ácido nucleico antissentido KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ser uma ribozima. As ribozimas são moléculas de RNA catalíticas com atividade de ribonuclease que são capazes de clivar um ácido nucleico da cadeia simples, tal como um mRNA, para o qual têm uma região complementar. Dessa maneira, as ribozimas (por exemplo, ribo- zimas em forma de cabeça de martelo (descritas em Haseloff e Gerlach (1988) Nature 334: 585 a 591)) podem ser usadas para clivar cataliticamente KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 transcritos de MRNA, para desse modo ini- bir a tradução de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 mRNA. Uma ribozima ten- do especificidade para um KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 ácido nucleico que codificapode ser concebido com base na sequência de nucleotídeos de um KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 CDNA descrito na presente invenção. Por exemplo, um derivado de um RNA de Tetrahimena L-19 IVS pode ser cons-

truído em que a sequência de nucleotídeos do local ativo é complementar à sequência nucleotídica a ser clivada em um KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 que codifica MRNA.

Vide, por exemplo, Patente U.S.

No. 4.987.071 e Paten- te U.S.

No. 5.116.742. Alternativamente, KIR2DL1, KIR2DL2 KIR2DL3 do —mRNA pode ser usado para selecionar um RNA catalítico tendo uma ativida- de específica de ribonuclease de um conjunto de moléculas de RNA.

Vide, por exemplo, Bartel e Szostak (1993) Science 261: 1411-1418. Alternativamente, a expressão do gene KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 pode ser inibida visando as sequências de nucleotídeos comple- —mentar da região reguladora de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 (por exem- plo, promotor e/ou potenciadores KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, para for- mar estruturas helicoidais triplas que impedem a transcrição da KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 do gene nas células alvo Vide, em geral, Helene (1991) Anticancer Drug Des 6 (6): 569 a 84, Helene, et al (1992) Ann.

NY Acad Sci 660: 27 a 36;. e Maher, LJ (1992) Bioessays 14 (12): 807 a 15. Ácido Nucleico de Peptídeo Em ainda uma outra modalidade, as moléculas de ácido nucleico KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 da presente invenção podem ser modificadas na unidade de base, unidade de açúcar ou estrutura principal de fosfato para melhorar, por exemplo, a estabilidade, a hibridização, ou solubilidade da mo- lécula.

Por exemplo, a estrutura principal de desoxirribose de fosfato das moléculas de ácido nucleico pode ser modificada para gerar os ácidos nucle- icos peptídicos.

Vide Hirup e Nielsen (1996) Bioorg.

Med.

Chem.

Chem. 4 (1): 5 a 23. Tal como usado na presente invenção, os termos"ácidos nuclei- cos de peptídeos" ou "PNAs" referem-se a mímica de ácido nucleico, por exemplo, mímicos de DNA, em que a estrutura principal desoxirribose de fosfato é substituída por meio de uma estrutura principal pseudopeptídeo e apenas quatro nucleobases naturais são retidos.

A estrutura principal neutro dos PNAs tem sido mostrado para permitir hibridação específica para o DNA eRNA, em condições de baixa força iônica.

A síntese de oligômeros de PNA pode ser realizada utilizando os protocolos de síntese de peptídeos em fase sólida padrão, tal como descrito em Hirup e Nielsen (1996) supra e Perry-

O'Keefe et al. (1996) Proc Natl. Acad. Sci. EUA 93: 14670 a 675. Os PNAs das moléculas de ácido nucleico KIR2DL1, KIR2DL?2, KIR2DL3 podem ser usados em aplicações terapêuticas e de diagnóstico. Por exemplo, os PNA de verificação ser usados como agentes antissentido ou antigene para a modulação específica da sequência de expressão do ge- ne, por exemplo, induzindo a paragem da transcrição ou tradução ou a inibi- ção da replicação. PNAs de Moléculas de ácido nucleico KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 também pode ser usado na análise de mutações de pa- res de bases únicos em um gene (por exemplo, engatamento de PCR dirigi- doaoPNA); como"enzimas de restrição artificiais", quando usados em com- binação com outras enzimas (por exemplo, nucleases S1 (Hirup e Nielsen (1996) supra)), ou como sondas ou iniciadores para sequenciação ou hibri- dação de DNA (Hirup e Nielsen (1996) supra; Perry-O'Keefe et al (1996) su- pra.).

Os PNAs de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 podem ser modifica- dos (por exemplo, para melhorar a sua estabilidade ou a absorção de célu- la), grupos auxiliares ligantes de lipofílicos ou outros, para o PNA, pela for- mação de quimeras de PNA-e DNA, ou pelo uso de lipossomas ou outras técnicas de administração de fármacos conhecidos na técnica. Por exemplo, as quimeras de PNA-DNA de Moléculas de ácido nucleico KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 podem ser geradas, o que pode combinar as proprieda- des vantajosas do PNA e do DNA. Tais quimeras permitem que enzimas de reconhecimento de DNA (por exemplo, RNAse H e DNA polimerases), para interagir com a porção de DNA, enquanto a parte de PNA proporcionaria elevada afinidade e especificidade. Quimeras PNA-DNA podem ser ligadas utilizando ligantes de comprimentos apropriados selecionados em termos de empilhamento de bases, o número de ligações entre as nucleobases, e ori- entação (Hirup e Nielsen (1996) supra). A síntese de quimeras de PNA-DNA pode ser executada como descrito em Hirup e Nielsen (1996) supra e Finn PJetal. (1996) Nucleic Acids Res. 24 (17): 3357 a 63. Por exemplo, uma cadeia de DNA pode ser sintetizada em um suporte sólido utilizando a qui- mica de acoplamento fosforamireferide padrão e análogos de nucleosídeos modificados, por exemplo, fosforamireferida de 5'-(4-metoxitritila) amino-5'- desoxi-timidina, pode ser usada como uma ponte entre o fim do PNA e do DNA 5 ' (Mag, M. et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 5973-88.). Monômeros de PNA são então acoplados de uma forma gradual para produzir uma mo- léculaquimérica com uma porção 5' de PNA e um segmento 3' do segmento de DNA (Finn PJ et al. (1996) supra). Alternativamente, as moléculas quimé- ricas podem ser sintetizadas com um 5 ' e um segmento de DNA 3' do seg- mento PNA (Peterser, et al. (1975) Bioorganic Med.

Chem.

Chem.

Lett. 5: 1119 a 11124). —Oligonucleotídeo O oligonucleotídeo pode incluir outros grupos anexos tais como peptídeos (por exemplo, para visar os receptores das células hospedeiras in vivo), ou agentes que facilitem o transporte através da membrana de célula (Vide, por exemplo, Letsinger et al. (1989) Proc Natl.

Acad.. Sci.

EUA 86: 6553-6556, Lemaitre et al (1987) Proc Natl Acad Sci EUA 84: 648-652; Pu- blicação PCT n º WO 88/ 09810) ou a barreira hemato -encefálica (Vide, por exemplo, Publicação PCT n º WO 89/10134). Além disso, os oligonucleotí- deos podem ser modificados com agentes de clivagem de hibridação accio- nados (Vide, por exemplo, Krol et al (1988) Biotechniques 6: 958-976.) Ou agentes intercalantes (Vide, por exemplo, Zon (1988) Farm Res. 5: 539-549). Para este fim, o oligonucleotídeo pode ser conjugado com uma outra molé- cula (por exemplo, um peptídeo, a hibridação desencadeada agente reticu- lante, agente de transporte, agente de clivagem ou de hibridação engatilha- da). Expressão O isolamento e a expressão de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 da presente invenção pode ser efetuado por meio dos procedimentos de clonagem bem estabelecidos, utilizando as sondas ou os iniciadores constru- ídos com base nas sequências de ácidos nucleicos KIR2QDL1, KIR2DL2, —KIR2DL3 descritas no pedido.

As sequências KIR2QDL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 relacionadas também podem ser identificadas a partir de espécie humana ou de outro banco de dados genômicos usando as sequências descritas na presente invenção e tecnologias conhecidas de busca com bases em com- putador, por exemplo, sequência BLAST a pesquisas. Os pseudogenes des- crito na presente invenção podem ser usados para identificar os alelos de genes funcionais ou afins.

Os vetores de expressão podem depois ser usados para trans- fectar ou infectar células hospedeiras para a expressão funcional destas se- quências. Estes genes e vetores podem ser feitos e expressas in vitro ou in vivo. Um especialista reconhecerá que os fenótipos desejados para alterar e controlar a expressão do ácido nucleico pode ser obtido através da modula- çãoda expressão ou a atividade dos genes e ácidos nucleicos (por exemplo, promotores, potenciadores) dentro dos vetores da presente invenção. Qual- quer um dos métodos conhecidos descritos para aumentar ou diminuir a ex- pressão ou a atividade podem ser usados.

Em uma outra modalidade, o vetor de expressão recombinante dos mamíferos é capaz de dirigir a expressão do ácido nucleico preferenci- almente em um tipo particular de célula (por exemplo, elementos regulado- res específicos de tecido são usados para expressar o ácido nucleico). Ele- mentos reguladores específicos de tecido são conhecidos na técnica. Exem- plos não limitantes de promotores específicos de tecido adequados incluem o promotor da albumina (específico do fígado; Pinkert et al (1987) Genes Dev. 1: 268-277), promotores específicos de linfoides (Calame e Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), promotores de receptores de células T particulares (Winoto e Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) e imunoglobu- linas de célula 33: 729-740 (Banerji et al (1983).; Queen e Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), promotores específicos de neurônios (por exemplo, o promotor do neurofilamento, Byrne e Ruddle (1989)... Proc Natl Acad Sci EUA 86: 5473-5477), promotores específicos do pâncreas (Edlund et al (1985) Science 230: 912-916) e promotores específicos das glândulas ma- marias (por exemplo, promotor de soro de leite, Patente U.S. No. 4.873.316 e Pedidode Patente Européia Publicação n º 264.166). Promotores regula- dores mentalmente desenvolvidos estão também englobados, por exemplo, os promotores hox de murino (Kessel e Gruss (1990) Science 249: 374-379)

e o promotor a-fetoproteína (Campes e Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-

546.).

As sequências polinucleotídicas fornecidas na presente invenção podem ser gerados de acordo com qualquer método de síntese de oligonu- cleotídeos conhecidos na técnica tais como síntese enzimática ou síntese em fase sólida. Equipamento e reagentes para a execução de síntese em fase sólida estão disponíveis comercialmente a partir, por exemplo, de Ap- plied Biosistems. Quaisquer outros meios para tal síntese podem também ser empregues, a síntese real dos polinucleotídeos está bem dentro das ca- —pacidades de um perito na técnica. Vide, por exemplo, Maniatis, et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual [3"* Ed] Cold Spring Harbor Labora- tory Press; Swamy (2008) Laboratory Manual on Biotechnology Rastogi Pu- blications; Herdewijn (2005) [Ed.] Methods in Molecular Biolog: Oligonucleo- tide Synthesis: Methods and Applications Volume 288 Humana Press; e Ra- pley (2000) [Ed.] The Nucleic Acid Protocols Handbook Humana Press. Os fragmentos de DNA da cadeia dupla podem então ser obtidos, quer por sín- tese da cadeia complementar e emparelhamento das cadeias em conjunto em condições adequadas ou por adição da cadeia complementar usando DNA polimerase com uma sequência iniciadora apropriada.

[0100] As técnicas para a manipulação de ácidos nucleicos, tais como, por exemplo, para a geração de mutações em sequências, subclona- gem, marcação de sondas, sequenciação, a hibridação são bem descritos na literatura científica e de patentes. Vide, por exemplo, Sambrook, et al. (2001) (Eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 Ed.) Cold Spring Harbor Laboratory; Ausubel, et a/. (2011) Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York; Tijssen (1993) [Ed.] Laboratory Techniques in Biochemistry e Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part |, Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, NY.

A hibridação e a força de hibridação (por exemplo, a força de associação entre polinucleotídeos) é influenciada por muitos fatores bem conhecidos na técnica, incluindo o grau de complementaridade entre os poli- nucleotídeos, e a severidade das condições envolvidas, que é afetado por condições tais como a concentração de sais, na presença de outros compo- nentes (por exemplo, a presença ou ausência de polietileno-glicol), a molari- dade dos filamentos de hibridação e do conteúdo das cadeias polinucleotídi- cas G+ C, todas quais resulta em uma característica temperatura de fusão (Tm) do híbrido formado. Técnicas de hibridização de ácidos nucleicos são descritas por Sambrook et al. (2001) (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual [3 ? ed] Fria Spring Harbor Laboratory, e por Hayrnes, et al. (1985) em Hibridização de Ácido Nucleico, uma abordagem prática (IRL Press, DC). As condições de lavagem de hibridação podem incluir solução de lavagem de 02x SSC/0.1% SDS e incubação com rotação durante 10 minutos à temperatura ambiente (lavagem de severidade baixa), a solução de lavagem da pré-aquecido (42) de 0,2 x SSC/0.1% SDS e incu bação com rotação durante 15 minutos a 42% (rigor meio de lavagem) e lavagem de solução pré-aquecida (68ºC) 0.1 x SSC/0.1% SDS e incubação com rotação durante 15 minutos a 68 (lavagem de severidade elevada). Vide Ausubel et al.

(2011) [ed.] Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, Inc. Os iniciadores oligonucleotídicos podem ser usados para ampli- ficar os ácidos nucleicos que codificam um KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Os ácidos nucleicos descrito na presente invenção também podem ser clo- nados ou medidos quantitativamente usando técnicas de amplificação. Mé- todos de amplificação são também bem conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR) (Innis (1990) [Ed.] PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press, NY; Innis (1995) [Ed] PCR Strategies, Academic Press, Inc., NY.); reação de cadeia ligase (LCR) (Wu (1989) Genomics 4: 560; Landegren (1988) Science 241: 1077; Barringer (1990) Gene 89: 117); amplificação da transcrição (Kwoh (1989) PNAS 86: 1173); replicação da sequência auto-sustentada (Guatelli (1990) PNAS 87: 1874); amplificação da replicase Q Beta (Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35: 1477-91)); ensaio da amplificação da replicase Q-beta automatizada (Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10: 257a 71); e outras técnicas mediadas por meio da polimerase RNA(e.g., NASBA, Cangene, Mississau- ga, Ontario). Vide também Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 307—16;

Sambrook, et al. (2001) (Eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3º Ed.) Cold Spring Harbor Laboratory; Ausubel, et a/. (2011) [Ed.] Current Pro- tocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York; Maniatis, et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual [3 Ed] Cold Spring Har- bor Laboratory Press; U.S. Patent Nos. 4,683,195 e4,683,202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13: 563 a 64.

Os paradigmas para conceber pares de iniciadores degenerados são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um consenso degenerador do programa de computador de estratégia Iniciador de Oligonucleotídeo híbrido (CODEHOP) é facilmente acessível e está diretamente ligada a partir do lo- cal alinhamento de sequências múltiplo BlockMaker para o início da previsão do iniciador híbrido com um conjunto de sequências de proteínas relaciona- das, tais como as Sequências KIR2Q2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 previstas. Vide, por exemplo, Rose (1998) Nucleic Acids Res. 26: 1628-35; Singh (1998) Biotécnicas 24: 318 a 19.

As variantes polimórficas, alelos, e entre espécies homólogas que são substancialmente idênticas aos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ser isolados utilizando as sondas de ácidos nucleicos descritas acima. Alternativamente, as bibliotecas de ex pressão podem ser usadas para clonar KIR2QDL1, KIR2DL2, e KIRQ2DL3 e as variantes, alelos polimórficos e interespécies homólogos ddos mesmos, a- través da detecção de homólogos expressas imunologicamente com anti- soros ou de anticorpos produzidos contra um KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 purificado, que também reconhecem e seletivamente ligar para o KIR2DL1,KIR2DL2 e KIR2DL3 homólogo.

Os ácidos nucleicos que codificam para KIR2DL1, KIR2DL?2, KIR2DL3 podem ser gerados por meio da amplificação (por exemplo, PCR) de sequências de ácido nucleico apropriadas que utilizam apropriado (perfei- to ou degenerada), pares de iniciadors. O ácido nucleico amplificado pode ser DNA genômico a partir de qualquer célula ou tecido ou MRNA ou CDNA derivada das células que expressam KIR2QDL1, KIR2DL2, KIR2DL3. Os mé- todos para a expressão de sequências heterólogas em células hospedeiras são bem conhecidos na técnica.

Vide, por exemplo, Maniatis, et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual [3 º ed.] Cold Spring Harbor Labora-

tory Press.

As proteínas de fusão que compreende um KIR2DL1, KIR2DL?2,

eKliR2DL3 As sequências codificantes de proteína híbrida que compreen- dem os ácidos nucleicos codificandes KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 fundi- dos com uma sequência de translocação podem ser construídas.

Também são fornecidos KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 híbridos que compreende os motivos e as regiões antigênicas.

Estas sequências de ácido nucleico podem ser operativamente ligadas a elementos de controle da transcrição ou da tradução, por exemplo, sequências de iniciação de transcrição e tradução, promotores e potenciadores, terminadores de transcrição e tradução, se- quências de poliadenilação, e outras sequências úteis para a transcrição de DNA em RNA.

Na construção de cassetes de expressão recombinantes, ve- tores e transgênicos, um fragmento do promotor pode ser empregue para dirigir a expressão do ácido nucleico desejado, em todas células ou tecidos desejados.

As proteínas de fusão podem compreender as sequências de translocação nos terminais C ou nos terminais N.

Além disso, as proteínas de fusão podem compreender elementos adicionais, por exemplo, para a detecção da proteína, a purificação, ou outras aplicações.

Detecção e domí- nios que facilitam a purificação incluem, por exemplo, peptídeos quelantes de metal, tais como intervalos de poli-histidina, módulos de histidina- triptofano, ou outros domínios que permitem a purificação em metais imobili- zados, proteína de ligação a maltose, domínios de proteína A que permitem a purificação sobre imunoglobulina imobilizada, e o domínio usado na exten-

são/afinidade do sistema de purificação FLAGS (Sigma-Aldrich.)

A inclusão de uma sequência ligante clivável tal como Fator Xa (Vide, por exemplo, Ottavi, (1998) Biochimie 80: 289 a 93), o motivo de re- conhecimento de proteases subtilisina (Vide, por exemplo, Polyak (1997) Protein Eng. 10: 615 a 19);. enteroquinase (Invitrogen, San Diego, CA), entre o domínio de translocação (para a expressão eficiente da membrana do plasma) e o resto do polipetídeo recém traduzido pode ser útil para facilitar a purificação. Por exemplo, um constructo pode incluir uma sequência de codi- ficação de um polipetídeo de ácido nucleico ligado a seis resíduos de histidi- na seguidos de tioredoxina um, um local de clivagem de enterocinase (Vide, por exemplo, Williams (1995) Biochemistry 34: 1787 a 1797), e um Terminal C do domínio de translocação. Os resíduos histidina facilitam a detecção e a purificação, enquanto o local de clivagem de enterocinase proporciona um meio para purificar a (s) proteína (s) desejada (s) a partir do restante da pro- teína de fusão. Tecnologia pertencente a vetores que codificam proteínas de fusão e à aplicação de proteínas de fusão são bem descritas na literatura científica e de patentes. Vide, v.g., Kroll (1993) DNA Cell. Biol. 12: 441-53.

Os sistemas de expressão recombinantes de Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 e anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 Os vetores de expressão, quer como vetores de expressão indi- viduais ou como bibliotecas de vetores de expressão, que compreendem as sequências de codificação da região de ligação ao ligante podem ser intro- duzidos em um genoma ou no citoplasma, ou de um núcleo de uma célula e expressos por meio das diversas técnicas convencionais, bem descritas na literatura científica e de patentes. Vide, por exemplo, Sambrook, et al. (2001) [eds.] Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory, Ausubel, et al. (2011) [ed] Protocolos Atuais em Biologia Mole- cular John Wiley & Sons, Inc.

Os ácidos nucleicos podem ser expressos em cassetes de ex- pressão, vetores ou vírus que são expressos de forma estável ou transitória em células (por exemplo, sistemas de expressão epissômica). Os marcado- res de seleção podem ser incorporados em cassetes de expressão e vetores conferindo um fenótipo selecionável em células transformadas e sequências.

Por exemplo, os marcadores de seleção podem codificar para a manutenção e replicação epissômica de tal forma que a integração no genoma do hospe- deiro não seja necessária. Por exemplo, o marcador pode codificar resistên-

cia a antibióticos (por exemplo, cloranfenicol, canamicina, G418, bleomicina, higromicina) ou resistência a herbicida (por exemplo, chlorosulfurone ou Basta) para permitir a seleção das células transformadas com as sequências de DNA desejadas. Vide, por exemplo, Ausubel, et al. (2011) [ed] Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, Inc., e Walker & Papley (2009) Molecular Biology and Biotechnology[5 Ed.] Royal Society of Chemis- try. Porque os genes marcadores selecionáveis que conferem resistência aos substratos tais como a neomicina ou higromicina apenas podem ser u- sados em cultura de tecidos, os genes quimioresistência também são usa- —doscomo marcadores de seleção in vitro e in vivo.

Para permitir a expressão de célula dos polinucleotídeos da pre- sente invenção, um constructo de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser usados, o que inclui, pelo menos, uma região de codifica- ção de uma das sequências de ácido nucleico acima, e inclui ainda pelo me- nos um elemento cis regulador agindo. Preferencialmente, o promotor usado pela estrutura de ácido nucleico da presente invenção é ativo na população de célula específica transformada. Exemplos de células de tipo específico e/ou promotores de tecidos específicos são bem conhecidos na técnica. À construção de ácido nucleico da presente invenção inclui ainda, de preferên- cia, um marcador de seleção apropriado e/ou uma origem de replicação. De preferência, a construção de ácido nucleico usado é um vetor de transporte, que pode propagar-se, tanto em E. coli (em que a construção compreende um marcador de seleção apropriado e origem de replicação) quanto é com- patível para propagação em células, ou a integração de um gene e um teci- do de escolha. A construção de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, um plasmídeo, um bacmídeo, um fagemídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.

Exemplos de construções adequadas incluem, mas não estão limitados a, pcDNA3, pcDNA3.1 (+/-), pbGL3, PzeoSV2 (+/-), pDisplay, pEF/myc/cyto, PCMV/myc/cyto cada um que está comercialmente disponível a partir da Invitrogen Co. (Carlsbad, CA). Exemplos de sistemas de embala- gem e de vetor retroviral são os vendidos pela Clontech (San Diego, CA.),

incluindo os vetores retro -X pLNCX e plXSN, os quais permitem a clona- gem em vários locais de clonagem e o transgene é transcrito a partir do promotor de CMV. Os vetores derivados a partir de Mo- MuLV também estão incluídos como pBabe, onde o transgene será transcrito a partir do promotor LIRS.

Os vetores de expressão recombinantes da presente invenção compreendem um ácido nucleico da presente invenção em uma forma ade- quada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, o que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais sequências reguladoras, selecionadas com base das células hospedeiras a serem utilizadas para a expressão, que está operativamente ligado à se- quência de ácido nucleico a ser expressa. Dentro de um vetor de expressão recombinante, "operativamente ligado", pretende significar que a sequência de nucleotídeos de interesse está ligada à (s) sequência (s) reguladora (s) de um modo que permite a expressão da sequência de nucleotídeos (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira).

O termo "sequência reguladora"destina-se a incluir os promoto- res, estimuladores e outros elementos de controle de expressão (por exem- plo, sinais de poliadenilação). Tais sequências reguladoras estão descritas, por exemplo, em Goeddel (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, CA. As sequências regulado- ras incluem as que expressão direta constitutiva de uma sequência de nu- cleotídeos, em muitos tipos de célula hospedeira e as que tem expressão direta da sequência nucleotídica apenas em determinadas células hospedei- ras (por exemplo, sequências reguladoras específicas de tecido). Será apre- ciado por aqueles que são versados na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospe- deiraa ser transformada, o nivel de expressão da proteína desejada. Os ve- tores de expressão da presente invenção pode ser introduzido nas células hospedeiras para deste modo produzir proteínas ou peptídeos, incluindo pro-

teínas ou peptídeos de fusão, codificados por ácidos nucleicos como descri- to na presente invenção.

Os vetores de expressão recombinantes da presente invenção podem ser concebidos para a produção de proteínas variantes em células procariotas ou eucariotas.

Por exemplo, as proteínas da presente invenção podem ser expressas em células bacterianas tais como Escherichia coli, cé- lulas de inseto (por exemplo, utilizando vetores de expressão de baculovírus) células de levedura, ou células de mamíferos.

As células hospedeiras ade- quadas serão discutidas em Goeddel (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, CA.

Alternativa- mente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo usandas sequências reguladoras do promotor T7 e T7 polimerase.

A expressão de proteínas em procariotas é geralmente realizada em E. coli com vetores contendo promotores constUTItivos ou induzíveis dirigindo a expressão de proteínas de fusão ou de não fusão.

Vetores de fusão incluem um número de aminoácidos de uma proteína codificada aí, ao terminal amino ou C da proteína recombinante.

Tais vetores de fusão nor- malmente servem três objetivos: (i) para aumentar a expressão de proteína recombinante, (ii) para aumentar a solubilidade da proteína recombinante, e (iii) para ajudar na purificação da proteína recombinante ao atuar como um ligante de afinidade purificação.

Muitas vezes, em vetores de expressão de fusão, um local de clivagem proteolítica é introduzido na junção do fragmen- to de fusão e a proteína recombinante, para permitir a separação da proteína recombinante a partir da porção posterior de fusão para a purificação da pro- teína de fusão.

Essas enzimas, e suas sequências de reconhecimento de cognatos incluem o fator Xa, trombina, PreScission, TEV e enteroquinase.

Vetores de expressão de fusão típicos incluem pGEX (Farmaca Biotech Inc; Smith e Johnson (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (. New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Farmaca, Piscataway, NJ) que fundem glutationa S- transferase (GST), proteína de ligação a maltose E, ou proteína A, respecti- vamente, com a proteína alvo recombinante.

O vetor de expressão de mamífero recombinante é capaz de di- rigir a expressão do ácido nucleico pode ser um tipo de célula em particular (por exemplo, elementos reguladores específicos de tecido são usados para expressar o ácido nucleico). Elementos reguladores específicos de tecido são conhecidos na técnica. Para uma produção eficiente da proteína, é pre- ferível colocar as sequências de nucleotídeos que codificam a proteína da presente invenção, sob o controle de sequências de controle de expressão optimizados para a expressão em um hospedeiro desejado. Por exemplo, as sequências podem incluir sequências reguladoras da transcrição e/ou da tradução optimizada (por exemplo, sequências Kozak alteradas).

Uma estratégia para maximizar a expressão da proteína recom- binante em E. coli é expressar a proteína em uma bactéria hospedeira com uma capacidade diminuída para clivar proteoliticamente a proteína recombi- nante. Vide, por exemplo, Gottesman (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzimology Academic Press, San Diego, CA. 185: 119-128. Uma outra estratégia é alterar a sequência de ácido nucleico do ácido nucleico a ser inserido em um vetor de expressão de modo a que os códons individuais para cada um dos aminoácidos são os preferencialmente usados em E. coli. Vide, por exemplo, Wada, et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118. Tal alteração das sequências de ácidos nucleicos da presente invenção pode ser realizada por meio das técnicas convencionais de síntese de DNA. Outra estratégia para resolver o limite do códon é usando BL21-códon mais as ce- pas bacterianas (Invitrogen) ou tensão Rosetta bacteriana (Novagen), essas cepas contêm cópias extras de genes raros E.coli tRNA.

O vetor de expressão que codifica para a proteína da presente invenção pode ser um vetor de expressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão na levedura Saccharomyces cerevisiae incluem piepSec1 (Baldari, et al (1987) EMBO J. 6:. 229-234), PMFA (Kurjan e Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz, et al (1987) Gene 54:. 113-123), piES2 (Invittogen Corporation, San Diego, CA), e picz (Invitrogen Corp, San Diego, CA)..

Em alternativa, os polipetídeos da presente invencão podem ser produzidos em células de inseto usando vetores de expressão de baculoví- rus. Vetores de baculovírus disponíveis para expressão de proteínas em cé- lulas de inseto cultivadas (por exemplo, SF9) incluem a série pAc (Smith et al (1983) Cell Mol Biol 3: 2156-2165) e a série pVL (LuckKlow e Summers (1989) Virology 170: 31 a 39). Ainda em uma outra modalidade, um ácido nucleico da presente invenção é expresso em células de mamífero usando um vetor de expressão de mamífero. Exemplos de vetores de expressão de mamífero incluem pCDMB8 (Seed (1987) Nature 329: 840) e pMT2PC (Kauf- man, et al (1987) EMBO J. 6: 187-195), plRESpuro (Clontech), pUB6 (Invi- trogen),) pCEP4 (Invitrogen),) pREP4 (Invitrogen), pcADN3 (Invitrogen). Quando usado em células de mamífero, as funções de controle do vetor de expressão são muitas vezes fornecidas por meio dos elementos reguladores virais. Por exemplo, os promotores vulgarmente usados são derivados de polioma, adenovírus 2, citomegalovírus, vírus do sarcoma de Rous, e vírus —símio40. Para outros sistemas de expressão adequados para células proca- rióticas e eucarióticas, tanto Vide, por exemplo, Sambrook, et al. (2001) (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory.

Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, a proteína da presente invenção pode ser produzi- da em células bacterianas tais como E. coli, células de inseto, leveduras, plantas ou células de mamíferos (por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO), COS, HEK293). Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas por meio das pessoas que são versadas na técnica.

O vetor de DNA pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas através de técnicas de transformação ou transfecção conven- cionais. Tal como usado na presente invenção, os termos"transformação" e "transfecção"são destinados a referir uma variedade de técnicas reconheci- das na técnica para a introdução de ácido nucleico estranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira, incluindo precipitação com fosfato de cál- cio ou cloreto de cálcio, dextrano DEAE transfecção mediada por lipofecção ou eletroporação. Métodos adequados para transformação ou transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook, et al. (2001) [eds.] Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory, e outros manuais de laboratório.

Qualquer um dos procedimentos bem conhecidos para introduzir assequências de nucleotídeos estranhos em células hospedeiras podem ser usadas.

Estes incluem a uso de transfecção com fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, lipos somas, microinjeção, vetores de plasma, vetores virais e qualquer um dos outros métodos bem conhecidos para introdução de DNA genômico clonado, CDNA, DNA sintético ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira.

Vide, por exemplo, Sambrook, et al. (2001) (Eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory e Walker & Papley (2009) Molecular Bio- logy and Biotechonology [5 Ed.] Royal Society of Chemistry.

É apenas ne- cessário que o procedimento de engenharia genética particular usado seja capaz de introduzir com sucesso no fim de que uma molécula de ácido nu- cleico na célula hospedeira capaz de expressar KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, fragmento ou variante de interesse.

Para a transfecção estável de células de mamífero, sabe-se que, dependendo do vetor de expressão e técnica de transfecção usada, apenas uma pequena fração das células pode integrar o DNA estranho no seu ge- noma.

De modo a identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedeiras, juntamente com o gene de interesse.

Vários marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência o fármacos, tais como G418, higromicina, puromicina, blasticidina e metotrexato.

Os ácidos nucleicos que codificam para um marcador de se- leção podem ser introduzidos em uma célula hospedeira no mesmo vetor que codifica a proteína de que a presente invenção ou podem ser introduzi- dos em um vetor separado.

As células estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas por seleção de fármacos (por exemplo, células que incorporaram o gene marcador selecionável so- breviverão, enquanto que as outras células morrem).

Uma célula hospedeira da presente invenção, tal como uma cé- lula hospedeira procariótica ou eucariótica em cultura, pode ser usada para produzir (ou seja, expressar) a proteína da presente invenção.

Por conse- guinte, a presente invenção proporciona ainda métodos para a produção de proteínas da presente invenção utilizando as células hospedeiras da presen- te invenção.

Em uma modalidade, o método compreende cultura da célula hospedeira da presente invenção (na qual foi introduzido um vetor de ex- pressão que codifica a proteína recombinante da presente invenção) em um meio adequado de tal modo que a proteína da presente invenção é produzi- do.

Em uma outra modalidade, o método compreende ainda o isolamento da proteína da presente invenção a partir do meio ou da célula hospedeira.

Após o vetor de expressão é introduzida nas células, as células transfectadas são cultivadas sob condições que favorecem a expressão do receptor, o fragmento ou variante de interesse, o qual é então recuperado da cultura usando as técnicas convencionais.

Exemplos dessas técnicas são bem conhecidos na técnica.

Vide, por exemplo, WO 00/ 06593. Por exemplo, a produção de anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 monocionais descritos na presente invenção pode ser efetuada utilizando um vetor que permite a inserção de genes das cadeias pesadas e leves, com a transfecção de células CHO que podem ser usados para opti- mizar a produção.

O vetor plasmídeo pRc/CMV empregado foi projetado com a intenção de alcançar a alta expressão dos anticorpos monocionais quiméricos.

O vetor tem um local de clonagem, que aceita os genes da ca- deia pesada e leve, inserindo-os a jusante do CMV humano.

O vetor permite anticorpo a ser produzido em concentrações maiores do que 1000 mg/L em meio de reatores biológicos, de modo que as doses terapêuticas de 250-500 mg pode ser entregue.

Os anticorpos monoclonais que demonstram HAMA mínima nas doses de 200 mg a 400 mg entregues a cada duas semanas |V poderia ser eficazno controle do câncer metastático.

No presente momento, foi escolhi- do um vetor que permite a inserção mais recente semelhante de genes da cadeia pesada e leve, mas tem um potencial para a produção em excesso de 1000 mg/L de fluído biorreator.

Ambos os vetores de plasmídeo transpor- tam uma unidade de expressão de dhfr conduzida por meio de um promotor precoce de SV40-deficiente.

O vetor pode ser introduzido no CHO-D-SFM (di-hidrofolato-redutase (DHFR) com deficiência de ovário de hamster chi- nês), as células no próximo meio isento de soro suplementado com 1,0 ug/ml de metotrexato (MTX). No final da produção, as células podem ser adaptadas ao meio livre de soro antes da purificação final do anticorpo.

ANTICORPOS QUE SE LIGAM KIR2DL1, KIR2DL2 E KIR2DL3 A presente invenção também proporciona anticorpos que se li- gam seletivamente a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, incluindo mas não se limitando aOs anticorpos monoclonais e anticorpos monoclonais humaniza- dos.

Os anticorpos que se ligam seletivamente a KIR2DL1, KIR2DL?2, KIR2DL3 podem ser misturados em composições com veículos Farmacêuti- cos e agentes adicionais (por exemplo, um agente anti-inflamatório, analgé- sico, ou modificadores da doença de fármacos antirreumáticos (DMARDs)). Um polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 isolado ou uma porção ou um fragmento do mesmo, pode ser usado como um imuno- gênio para gerar anticorpos que se ligam a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, usando as técnicas convencionais para a preparação de anticorpos policlo- naise monoclonais.

O Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 de comprimento total pode ser usado ou, alternativamente, a presente invenção proporciona fragmentos de peptídeos antigênicos de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 para uso como imunogênios.

Em uma modalidade, um peptídeo antigênico de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 compreende pelo menos 8 resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos mostrada em qual- quer uma das SEQ ID NO: 7-24 e engloba um epitopo de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, tais que um anticorpo criado contra o ptido forma um complexo imune específico com a Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. De preferência, o peptídeo antigênico compreende pelo menos 10 resíduos de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 15 resíduos de aminoácidos, ainda mais preferencialmente pelo menos 20 resíduos de ami- noácidos, e mais preferencialmente pelo menos 30 resíduos de aminoáci-

dos. Epitopos preferidos abrangidos pelo peptídeo antigênico são regiões de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, que estão localizados no domínio extracelu- lar do polipetídeo, por exemplo, regiões hidrofílicas, bem como as regiões com maior antigenicidade, Um imunogênio KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 tipicamente é usado para preparar anticorpos através da imunização de um indivíduo ade- quado (por exemplo, coelho, cabra, camundongo ou outro mamífero) com o imunogênio. Uma preparação imunogênica adequada pode conter, por e- xemplo, por via recombinante expressa polipetídeo de KIR2Q2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ou um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 sintetizado quimicamente. Por exemplo, pode compreender o domínio extracelular de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 (por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7-24). A preparação pode ainda incluir um ad- juvante, tal como adjuvante completo ou incompleto de Freund, ou um agen- te imunoestimulante semelhante. A imunização de um indivíduo adequado com uma preparação imunogênica KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 que in- duz um anticorpo policlonal anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 de resposta de anticorpos.

Os anticorpos pode ser compostos de duas cadeias leves idênti- casde peso molecular de polipetídeo de aproximadamente 23.000 dáltons (" cadeia leve "), e duas cadeias pesadas idênticas de peso molecular de

53.000 a 70.000 (" cadeia pesada "). Vide Edelman (1971) Ann. NY. Acad. Sci. 190: 5. As quatro cadeias são unidas por pontes dissulfureto em uma configuração " Y " em que o suporte da cadeias leve as cadeias pesadas começando na boca da configuração de "Y". A porção do " ramo " da confi- guração em "Y" é designada a região de Fab, a porção de haste da configu- ração em "Y" é designada a região FC. A orientação de sequência de ami- noácidos é executado a partir da extremidade Do terminal N, na parte supe- rior da configuração em "Y " para a extremidade Terminal C, na parte inferior decada cadeia. A extremidade Do terminal N possui a região variável tendo especificidade para o antigênio que o induziu, e tem cerca de 100 aminoáci- dos de comprimento, havendo ligeiras variações entre as cadeia leve e pe-

sada do anticorpo e ao anticorpo.

A região variável é ligada em cada cadeia para uma região cons- tante, que se estende ao comprimento restante da cadeia e que dentro de uma classe particular de anticorpo não varia com a especificidade do anti- corpo (ou seja, provocando que o antigênio). Existem cinco classes princi- pais conhecidas de regiões constantes que determinam a classe da molécu- la de imunoglobulina (por exemplo, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE correspondente ay, u, a, õ, e as regiões constantes das cadeias pesadas £). A região cons- tante determina a classe ou função efetora posterior do anticorpo, incluindo a ativação de complemento (Kabat (1976) Conceitos Estruturais em Imunolo- gia e Imunoquímica [2 ? ed] Páginas 413-436; Holt, Rinehart, Winston) e outras respostas de células (Andrews, e outros (1980) Clinic Inmunobiology 1-18; Kohl, e outros (1983) Immunology 48: 187), enquanto a região variável determina o antigênio com o qual ele vai reagir. As cadeias leves são classi- ficadas como K (kapa) ou À (lambda). Cada classe da cadeia pesada pode ser preparada com qualquer cadeia leve kappa ou lambda. As cadeias leve e pesada estão covalentemente ligadas uma à outra, e as porções da "cauda" das duas cadeias pesadas estão ligadas uma à outra por ligações dissulfure- to covalentes quando as imunoglobulinas são geradas por hibridomas ou por meiodas célulasB.

A ligação especifica a um anticorpo sob tais condições pode re- querer um anticorpo que é selecionado pela sua especificidade para uma proteína particular. Por exemplo, os anticorpos policlonais criados para pro- teína básica seminal de espécies específicas, tais como camundongo, rato ou humana podem ser selecionados para obter apenas os anticorpos poli- clonais que são especificamente imunorreativos com a proteína básica se- minal e não com outras proteínas, exceto para as variantes e alelos polimór- ficos de proteína básica seminal. Esta seleção pode ser realizada subtraindo os anticorpos que para reagir de forma cruzada com moléculas de proteínas básicas seminais de outras espécies. Uma variedade de formatos de imuno- ensaio pode ser usado para selecionar anticorpos especificamente imunor- reativos com uma proteína particular. Por exemplo, os imunoensaios ELISA de fase sólida são usados rotineiramente para selecionar anticorpos especi- ficamente imunorreativos com uma proteína.

Vide, por exemplo, Harlow & Lane (1998) Using Antibodies: A Laboratary manual Cold Spring Harbor La- boratory, para uma descrição de formatos e condições de imunoensaio que podem ser usados para determinar imunorreatividade específica.

Uma rea- ção específica ou seletiva, será tipicamente pelo menos duas vezes o sinal de fundo ou o ruído e mais tipicamente superior a cerca de 10 a 100 vezes o fundo.

Em uma outra modalidade, o vetor de expressão recombinante dos mamiíferos é capaz de dirigir a expressão do ácido nucleico preferenci- almente em um tipo particular de célula (por exemplo, elementos regulado- res específicos de tecido são usados para expressar o ácido nucleico). Ele- mentos reguladores específicos de tecido são conhecidos na técnica.

Exem- plos não limitantes de promotores específicos de tecido adequados incluem o promotor da albumina (específico do fígado; Pinkert e outros (1987) Genes Dev. 1: 268-277), promotores específicos de linfoides (Calame e Eaton (1988) Adv.

Immunol. 43: 235-275), promotores de receptores de células T particulares (Winoto e Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) e imunoglobu- linas de célula 33: 729-740 (Banerji e outros (1983).; rainha e Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), promotores específicos de neurónios (por exemplo, o promotor do neurofilamento, Byrne e Ruddle (1989)... Proc Natl Acad Sci EUA 86: 5473-5477), promotores específicos do pâncreas (Edlund e outros (1985) Science 230: 912-916) e promotores específicos das glândulas ma- marias (por exemplo, promotor de soro de leite,. Patente U.S.

No. 4.873.316 ePedidode Patente Européia Publicação n º264.166). Os promotores regu- lados Mentalmente desenvolvidos estão também englobados, por exemplo, os promotores hox de murino (Kessel e Gruss (1990) Science 249: 374-379) e o promotor a-fetoproteína (Campes e Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537- 546). —Anticorpo policlonal Os anticorpos policlonais são populações heterogêneas de mo- léculas de anticorpo derivadas de soros de animais imunizados com um an-

tigênio.

Os anticorpos policlonais que se ligam seletivamente a KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 podem ser feitos por meio dos métodos bem conhecidos na técnica.

Vide, por exemplo, Howard & Kaser (2007) Making and Using Antibodies: A Pratical Handbook CRC Press. —Anticorpo monoclonal Um anticorpo monoclonal contém uma população substancial- mente homogênea de anticorpos específicos para antigênios, cuja popula- ção contém locais de ligação ao epitopo substancialmente semelhantes.

Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos por meio dos métodos conheci- dos por meio das pessoas que são versadas na técnica.

Vide, por exemplo Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495-497, Patente EUA No. 4,376,110; Ausubel, e outros [Eds.] (2011) protocolos atuais em biologia molecular, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, NY, e Harlow & Lane (1998) Using Antibodies: A laboratory manual Cold Spring Harbor Labora- tory, Colligan, e outros. (2005) [Eds.] Protocolos Atuais em Imunologia Gree- ne Publishing Assoc. e Wiley Interscience, Nova lorque.

Tais anticorpos po- dem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD e qualquer subclasse dos mesmos.

Um hibridoma que produza um anticorpo da presente invenção pode ser cultivado in vitro, in situ ou in vivo. — Anticorpo quimérico Os anticorpos quiméricos são porções diferentes de moléculas que são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aqueles que têm a região variável derivada de um anticorpo murino e uma região cons- tante de imunoglobulina humana, os quais são usados principalmente para reduzir a imunogenicidade na aplicação e para aumentar os rendimentos em produção, por exemplo, onde Os anticorpos monoclonais murinos têm ren- dimentos mais elevados a partir de hibridomas mas maior imunogenicidade em humanos, de tal modo que são usados Os anticorpos monocionais qui- méricos murino humanos.

Anticorpos e métodos para a sua produção quimé- ricos são conhecidos na técnica.

Vide Cabilly e outros (1984) Proc.

Natl.

A- cad.

Sci.

EUA 81: 3273-3277; Morrison, e outros (1994) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

EUA 81: 6851-6855, Boulianne e outros. (1984) Nature 312: 643-646;

Neuberger e outros. (1985) Nature 314: 268-270; Pedido de Patente Euro- péia 173494 (1986), WO 86/01533 (1986), Pedido de Patente Européia 184187 (1986), Pedido de Patente Européia 73494 (1986); Sahagan e ou- tros. (1986) J. Immunol. 137: 1066-1074; Liu, e outros (1987) Proc. Natl. A- cad. Sci. EUA 84: 3439-3443; Sun, e outros. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci.

EUA 84: 214-218; melhor, e outros. (1988) Science 240: 1041-1043, e Har- low e Lane (1998) Using Antibodies: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, Patente EUA N * 5.624.659. Anticorpo humanizado Os anticorpos humanizados são concebidos para conter ainda mais semelhante à humana domínios de imunoglobulina, e incorporar ape- nas as regiões determinantes de complementaridade do anticorpo de origem animal. Isto pode ser realizado através da análise da sequência das laçadas hiper-variáveis das regiões variáveis do anticorpo monoclonal e equipando- oscoma estrutura das cadeias de anticorpos humanos. Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 6.187.287. Da mesma forma, outros métodos de produção de anticorpos humanizados são agora bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patente U.S. Ns 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089, 5.693.762;

6.054.297, 6.180.370; 6.407.213, 6.548.640, 6.632.927, e 6.639.055; Jones, e outros (1986) Nature 321: 522-525; Reichmann, e outros (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen, e outros (1988) Science 239: 1534-1536, e Zhigi- ang An (2009) [Ed.] Therapeutics Monoclonal Antibodies: From Bench to Cli- nic para o Clinic John Wiley & Sons, Inc. Fragmentos de Anticorpo Para além das imunoglobulinas inteiras (ou os seus homólogos recombinantes), os fragmentos de imunoglobulina que compreendem o local de ligação ao epitopo (por exemplo, Fab ', F (ab ') », ou outros fragmentos) podem ser sintetizados. "Fragmento", ou imunoglobulinas mínimas, podem ser concebidos usando as técnicas de imunoglobulinas recombinantes. Por exemplo imunoglobulinas "Fv" para uso na presente invenção podem ser produzidas por meio da síntese de uma região variável da cadeia leve fundi- da e uma região da cadeia pesada variável. As combinações de anticorpos também são de interesse, por exemplo, diacorpos, que compreendem duas especificidades de Fv distintos.

Fragmentos de ligação ao antigênio de imu- noglobulinas incluem, mas não estão limitados a pequenas SMIPs (molécula imunofarmacêutica), a camelanticorpos, nanocorpos, e IgNAR. —Anticorpo anti-idiotípico Um anticorpo anti-idiotípico (anti-ld) é um anticorpo que reco- nhece determinantes únicos geralmente associados com o local de ligação ao antigênio de um anticorpo.

Um anticorpo Id pode ser preparado por meio da imunização de um animal da mesma espécie e tipo genético (por exem- plo, cepade camundongo) como a fonte do anticorpo com o anticorpo para o qual um anti-ld está a ser preparado.

O animal imunizado irá reconhecer e responder aos determinantes idiotipicos do anticorpo imunizante, produzindo um anticorpo para estes determinantes idiotípicos (o anticorpo anti-ld). Vide, por exemplo, Patente U.S.

No. 4.699.880. O anticorpo anti-ld também pode ser usado como um "imunogênio" para induzir uma resposta imune em ainda outro animal, produzindo um dilataçãodo anticorpo anti-anti-ld.

O anti-anti-ld pode ser epitopicamente idêntico ao anticorpo original, que induziu o anti-ld.

Dessa maneira, usandos anticorpos para os determinantes idiotípicos de um anticorpo, é possível identificar outros clones que expressam anticorpos de especificidade idêntica.

Anticorpos Engenheirados e Modificados Um anticorpo da presente invenção também pode ser preparado utilizando um anticorpo com uma ou mais das sequências VH e/ou VL deri- vadas a partir de um material de partida de anticorpo para engendrar um anticorpo modificado, que o anticorpo modificado pode ter alterado as pro- priedades do anticorpo de partida.

Um anticorpo pode ser manipulada pela modificação de um ou mais resíduos dentro de uma ou de ambas regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de estrutura.

Adicionalmente ou em alternativa, um anticorpo pode ser manipulado por meio da modificação de resíduos no interior da (s) região (ões) constante (s), por exemplo, para alterar a (s) função (ões) efetora (s) do anticorpo.

Um tipo de engenharia da região variável que pode ser realizado é enxerto de CDR. Os anticorpos interagem com antigênios alvo predomi- nantemente através de resíduos de aminoácidos que estão localizados em seis regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada e leve (CDR).Por esta razão, as sequências de aminoácidos dentro de CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que as sequências das CDRs de fora. Com as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das inte- rações anticorpo-antigênio, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitem as propriedades de anticorpos que ocorrem naturalmente especí- ficos através da construção de vetores de expressão que incluem sequên- cias de CDR do anticorpo específico ocorre naturalmente enxertadas se- quências estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes. Vide, por exemplo, Riechmann e outros. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, e outros (1986) Nature 321: 522-525; Rainha, e outros (1989) Proc. Natl.

Acad. EUA 86: 10.029-10.033, Patente EUA Nºs 5.225.539, 5.530.101,

5.585.089, 5.693.762, e 6.180.370.

As sequências de estrutura adequadas podem ser obtidas a par- tir de bases de dados de DNA públicas ou referências publicadas, que inclu- em sequências genéticas germinativas de anticorpos. Por exemplo, as se- —quênciasde DNA da linha germinativa de genes da região variável da cadeia pesada e leve humana podem ser encontradas na base de dados " Vbase " da sequência da linha germinativa humana (disponível na Internet), bem co- mo em Kabat, EA, e outros (1991) Sequências de proteínas de interesse imunológico [5 ed] EUA Departamento de Saúde e Serviços Humanos, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, e outros. (1992) " O repertório de se- quências humanas germinativas VH revela cerca de cinquenta grupos de Segmentos VH com diferentes Loops hipervariáveis " J. Mol. Biol. 227: 776- 798, e Cox e outros. (1994) Eur.. J Immunol. 24: 827-836.

Outro tipo de modificação da região variável é a mutação de re- —síduos de aminoácidos dentro da VH e/ou VL CDR 1, CDR2 e/ou CDR3 de regiões aumentando assim uma ou mais propriedades de ligação (por e- xemplo, a afinidade) do anticorpo de interesse. Mutagênese local-dirigida ou a mutagênese mediada por CRP pode ser realizada para introduzir a (s) mu- tação (ões) e o efeito na ligação de anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliada in apropriado in vitro ou em ensaios in vivo. De preferência, as modificações conservadoras (como discutido na presente invenção) podem ser introduzidas. As mutações podem ser substituições de aminoácidos, adições ou deleções, substituições, mas são, de preferência. Além disso, normalmente não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos de uma região CDR são alterados.

Os anticorpos projetados da presente invenção incluem aqueles nos quais as modificações foram feitas para os resíduos estruturais dentro de VH e/ou VL, por exemplo para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, tais modificações são feitas de enquadramento para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem consiste em " backmutate " um ou mais resíduos de estrutura com a sequência da linha germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos de estrutura principal que diferem da sequência da linha germinativa do anticorpo a partir do qual é derivado. Estes resíduos podem ser identificados por meio da comparação das se- quências estruturais de anticorpos para as sequências da linha germinativa doanticorpo a partir do qual é derivado.

Em adição ou em alternativa as modificações feitas dentro da estrutura ou regiões CDR, Os anticorpos da presente invenção podem ser manipulados para incluir alterações na região da Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tais como a semivida sérica, fixação do complemento, ligação a receptores Fc e/ou antigênio de citotoxicidade de célula dependente. Além disso, um anticorpo da presente invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, um ou mais gru- pos químicos podem ser ligados ao anticorpo), ou ser modificados para alte- rar a sua glicosilato, novamente para alterar uma ou mais propriedades fun- cionaisdo anticorpo. Tais modalidades são descritas mais adiante. A nume- ração dos resíduos na região Fc, é a do índice de Kabat UE.

A região dobradiça CH1 pode ser modificada de tal modo que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Vide a Patente U.S. No. 5.677.425. O número de resíduos de cisteína na região dobradiça de CH1 pode ser alte- rado, por exemplo, facilitando a montagem das cadeias leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

A região dobradiça Fc de um anticorpo pode ser mutada para reduzir a sua meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, a uma ou mais mutações de aminoácidos podem ser introduzidos CH3-CH2 região de interface do domínio do fragmento de Fc-dobradiça de tal modo que o anticorpo tem prejudicado proteína Staphilococcil Um parente (SPA) de liga- ção com o domínio Fc-dobradiça de ligação nativo SpA. Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 6.165.745.

O anticorpo pode ser modificado para aumentar a sua semivida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações pode ser introduzido: T252L, T254S, T256F. Vide a pa- tente U.S. No. 6.277.375. Alternativamente, para aumentar a semivida bioló- gica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL ou para con- ter um epitopo de ligação de receptor de salvamento feita a partir de duas voltas de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG. Vide a Patente U.S Nºs5.869.046 e 6.121.022.

A região Fc pode ser alterada substituindo pelo menos um resí- duo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar a (s) função (ões) efetora (s) do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoá- cidos selecionados de entre os resíduos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297,318,320 e 322 podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente tal que o anticorpo tem uma afinidade alterada para um ligante efe- tor mas retém a capacidade de ligação ao antigênio do anticorpo progenitor. O ligante ao qual efetor de afinidade pode ser alterado pode ser, por exem- plo, um receptor Fc ou do componente C1 do complemento. Vide a patente U.S Nºs5.624.821 e 5.648.260.

A glicosilação de um anticorpo pode ser modificada. Por exem- plo, um anticorpo não glicosilado pode ser feito (ou seja, o anticorpo carece de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, aumentando a afinidade do anticorpo para o antigênio. Tais modificações de hidratos de carbono podem ser conseguidas por, por exemplo, alterando um ou mais locais de glicosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas, que resultam na eliminação de um ou mais locais de glicosilação da região variável de qua- dro, para assim eliminar a glicosilação nesse local. Tal não glicolização pode aumentar a afinidade do anticorpo para o antigênio. Vide, por exemplo, Pa- tente U.S. Nºs 5.714.350 e 6.350.861.

Além disso, ou em alternativa, um anticorpo pode ser previsto que tem um tipo de glicosilação alterado, tal como um anticorpo hipofucosi- lado tendo quantidades reduzidas de resíduos fucosila ou um anticorpo ten- do estruturas bissetriz GICNAc aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterados foram demonstrados para aumentar a capacidade de anticorpos ADCC. Tais modificações de hidratos de carbono pode ser conseguida por, por exemplo, expressando o anticorpo em uma célula hospedeira com a alte- ração da maquinaria de glicosilação. Células com glicosilação alterada má- quinas têm sido descritas na técnica e podem ser usadas como células hos- pedeiras para expressar Os anticorpos recombinantes da presente invenção, paradesse modo produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Vide Pu- blicação de Pedido de Patente EUA No. 2004/0110704 e Yamane-Ohnuki e outros. (2004) Biotechnol Bioeng. 87: 614-22; EP 1176195; WO 2003/035835; Shields, e outros. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26.733-26.740; WO 99/54342; Umana e outros. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180, e Tarenti- no,e outros (1975) Biochem. 14: 5516-23.

Um anticorpo pode ser peguilado para, por exemplo, aumentar o biológico (por exemplo, soro) a meia vida do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento do mesmo, tipicamente faz-se reagir com polietilenoglicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG,sob condições em que um ou mais grupos PEG tornaram-se liga- dos ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. Preferencialmente, a peguilação é realizada através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). A presente invenção proporciona também variantes e equivalen- tes, que são substancialmente homólogos dos anticorpos, fragmentos de anticorpos, diacorpos, SMIPs, camelanticorpos, nanocorpos, Ignar, polipetí- deos, as regiões variáveis e CDRs aqui estabelecidos.

Estas podem conter, por exemplo, mutações de substituição conservadores, (isto é, a substituição de um ou mais aminoácidos por meio dos aminoácidos semelhantes). Por exemplo, a substituição conservativa refere-se à substituição de um aminoá- cido por outro da mesma classe geral, por exemplo, um aminoácido ácido por outro aminoácido acídico, um aminoácido básico por outro aminoácido básico, ou um aminoácido neutro por outra aminoácido neutro.

Produção de anticorpos Os anticorpos monoclonais, em particular, podem ser feitos utili- zandoo método do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler e outros, Nature, 256: 495 (1975), ou por outros bem conhecidos, os métodos desen- volvidos posteriormente (Vide, por exemplo, Goding, Anticorpos monocio- nais: Princípios e Prática, páginas 59 a 103 (Academic Press, 1986)). Os hibridomas e outras células de fusão podem ser formados por meio da fusão química, a fusão elétrica, ou qualquer outra técnica adequada, com qualquer tipo adequado de mielomas, heteromyelomas, células phoblastoid plasmaci- tomas, ou semelhante de células imortalizadas e qualquer tipo adequado de células que expressam o (s) anticorpo (s). As células B imortalizadas transformadas também podem ser usadas para produzir de forma eficaz os anticorpos.

As células B transfor- madas podem ser produzidas por meio das técnicas convencionais, tais co- mo transformação com um vírus de Epstein-Barr, ou um gene transformante. (Vide, por exemplo, " Continuously Proliferating Human Cell Lines Syntheti- zing Antibody of Predeermined Specifity, " Zurawaki, VR e outros, em Mono- clonal Antibodies, ed.

RH por Kennett e outros, Plenum Press, NY, 1980, páginas 19-33.). Dessa maneira, estável e contínuo e/ou anti-KIR2DL1 imor- talizada, 2 e/ou 3 de células que expressam anticorpos e linhagens de célu-

las são outras características da presente invenção. Uma etapa de um mé- todo para a produção de anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode incluir, por exemplo, uma etapa de produção de células B imortalizadas que produzem um anticorpo que são fundidas com parceiros adequados para a produção de anticorpo (s)anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3, ou que são sequenciados e as se- quências usadas para a produção de um recombinante anticorpo anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3.

As linhagens de células disponíveis como hospedeiros para a expressão de proteínas recombinantes são bem conhecidos na técnica e incluem muitas linhagens de células imortalizadas disponíveis em American Type Culture Collection (ATCC). Estes incluem, inter alia, de ovário de hamster chinês (CHO) células NSO, SP2 células, as células HeLa, rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatode célula humano (por exemplo, Hep G2), células A549, e um número de outras linhagens de células. Outras linhagens de células que podem ser usados são linhas de células de inseto, tais como células Sf9. Quando os ácidos nucleicos (ou ácidos nucleicos contendo o ácido nucleico) genes que codificam anticorpos são introduzidos nas células hospedeiras de mamífero, Os anticorpos podem ser produzidos por cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficientes para permitir a expressão do anti- corpo nas células hospedeiras, ou mais preferencialmente, a secreção do anticorpo para o meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultiva- das. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura utili- zando métodos de purificação de proteínas padrão. Os anticorpos também podem ser recuperados a partir de lisados da célula hospedeira quando ex- pressa diretamente sem um sinal secretor.

A purificação de anticorpos a partir de culturas de células, lisa- dos de células, e os animais transgênicos ou materiais biológicos obtidos com os mesmos (por exemplo, a partir do fluido ascítico de um animal trans- gênicoa produção de anticorpos) pode ser conseguida por meio da aplica- ção de uma série de técnicas adequadas conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, purificação em coluna de imunoafinidade; precipitação de sul-

fato; cromatofocagem, SDS-PAGE preparativa e semelhantes.

Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 também podem ser produ- zidos em células de bactérias e microorganismos unide células eucarióticos, tais como leveduras. Célula bacteriana anticorpos produzidos falta de glicosi- lação normal e consequentemente pode ser deficiente em termos de funções de ADCC e outros aspectos da resposta imune que podem ser de outro mo- do associados com anticorpos essencialmente idênticas produzidas em célu- las de mamíferos e/ou animais.

Os métodos apropriados para a purificação, triagem e seleção de anticorpos pode ser usado, incluindo aqueles descritos no documento WO 2006/072625. Triagem e seleção de anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser conseguida por meio de qualquer técnica adequada ou uma com- binação de técnicas. Por exemplo, uma variedade de formatos de imunoen- saio pode ser usada para selecionar anticorpos que se ligam de forma sele- tiva com uma proteína particular, a variante, ou fragmento. Por exemplo, os imunoensaios ELISA de fase sólida são usados rotineiramente para selecio- nar Os anticorpos seletivamente imunoreativos com uma proteína, a proteína variante, ou fragmento deste. Vide Harlow e Lane, supra. A afinidade de li- gação de um anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada por —meioda análise de Scatchard de Munson e outros Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 tipicamente são rastreados quanto à capacidade para modular a atividade das células NK, tal como por inibir os sinais mediados por KIR2QDL1, 2 e/ou 3, promover a ativação das células NK através de ativação do receptor de sinais mediados por NK. Uma série de ensaios de células NK foi desenvolvido que podem ser úteis em tais contextos, incluindo, por exemplo, métodos de triagem de citometria de flu- xo. Vide, por exemplo, McGinnes, e outros (1984) J. Immunol Metods 80: 70-

85. Métodos relevantes para a cultura de células NK, avaliando as células NK,e outros semelhantes são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Campbell e Colonna, Protocolos de células naturais assassinas (Methods in Molecular biology Series vol 121.) (2000).

No contexto de anti-KIR2DL1, 2, 3 e/ou anticorpos, a atividade neutralizante de células NK pode ser demonstrada pela capacidade de um anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 Anticorpo de reconstituir a lise das células alvo por KIR2DL1, 2, e/ou células NK 3-positivos. Anticorpo Anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 associado a modulação de células NK (por exemplo, a inibição KIR) pode também ser avaliada por vários ensaios de citotoxicidade com células. Ma- tança redirecionada é um sistema experimental para a determinação da ca- pacidade de um receptor da célula NK para induzir citotoxicidade. As células NK revestidas com anticorpo específico para um receptor candidato são ava- liadas quanto à sua capacidade para matar células alvo que expressam um receptor Fc a que o anticorpo se liga. Em uma outra variante, a modulação de atividade de células NK associadas com um anticorpo anti-KIR pode ser avaliado em um ensaio de libertação de citoquinas. Outras atividades bioló- gicassociadas com vários compostos antianticorpos KIR2DL1, 2 e/ou 3 tam- bém podem ser usados para avaliar anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

CONJUGADOS DE ANTICORPOS Um anticorpo (ou fragmento do mesmo) pode ser conjugado com uma porção terapêutica tal como uma citotoxina, um agente terapêutico ou de um íon de metal radioativo. Uma citotoxina ou agente citotico inclui qualquer agente que seja prejudicial para as células. Exemplos incluem, mas não estão limitados ao taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etí- dio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposide, vincristina, vinblastina, col- chicin, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidróxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, atinomicina D, 1-dehidrotestosterone, glucocorticoides, procaí- na, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e seus análogos ou ho- mólogos dos mesmos. Os agentes terapêuticos incluem, mas não estão limi- tados a, antimetabolitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6- tioguanina, citarabina, decarbazine 5-fluorouracila), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU) elomustina(CCNU), busulfano, ciclotosfamida, dibromomannitol, estreptozo- tocina, mitomicina C, e cis-dichlorodiamine de platina (11) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, datinomicina (anteriormente atino- micina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)), e agentes antimitóti- cos (por exemplo, vincristina e vinblastina).

Métodos de anticorpos de engenharia Os anticorpos que têm sequências de VH e VL descritas na pre- sente invenção podem ser usadas para criar novos anticorpos variantes, modificando as sequências de VH e/ou de VL, ou region (s) constante (s) a ele ligado. Dessa maneira, as características estruturais de um anticorpo variante da presente invenção, são usadas para criar anticorpos variantes estruturalmente similares que retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da presente invenção, tal como a ligação a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Por exemplo, uma ou mais regiões de CDR de uma variante de anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 ou mutações dos mesmos, podem ser combinados de modo recombinante com regiões de estrutura conhecida e/ou outros CDRs para criar adicional, recombinante- engenharia, anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 (por exemplo, anticorpos que se ligam a KIR2DL1, KIR2DL2 e/ou KIR2DL3) da presente invenção, como discutido na presente invenção. O material de partida para o método de engenharia pode ser uma ou mais das sequências VH e/ou de VK proporcionadas na presente invenção, ou uma ou mais regiões CDR dos mesmos. Para criar o anticorpo de engenharia, que não é necessário para preparar de uma forma eficaz (ou seja, expressa como uma proteína), um anticorpo com uma ou mais das Sequência de VH e/ou sequências de VK proporcionadas na presente invenção, ou uma ou mais regiões CDR dos mesmos. Pelo contrário, a informação contida na (s) sequência (s) é usado como material de partida para criar uma sequência de "segunda geração" derivada da (s) sequência (s) original (s) e, em seguida, a sequência de "se- gunda geração" é preparada e expressa como uma proteína. As técnicas de biologia molecular convencionais podem ser usadas para preparar e expres- sara sequência do anticorpo alterado. O anticorpo codificado pela (s) sequência (s) de anticorpo alte- rado pode reter uma, algumas ou todas propriedades funcionais dos anticor-

pos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 produzidos por meio dos métodos e com as sequências fornecidas na presente invenção, cujas propriedades funcionais incluem a ligação variante de KIRQ2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 ou variante de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 conjugado com um nível especí- fico KD ou menos e/ou modular a atividade das células imunes e/ou de se ligar seletivamente a células alvo desejadas, tais como, por exemplo, o car- cinoma colorretal, do pulmão câncer, câncer de próstata, câncer de pân- creas, câncer de ovário, câncer de estômago e câncer de fígado. As proprie- dades funcionais dos anticorpos alterados pode ser avaliada utilizando en- saios padrão disponíveis na técnica e/ou descrito na presente invenção.

As mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de forma seletiva ou a totalidade ou parte de um anticorpo anti-KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 da sequência de codificação e os modificados anticor- pos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 resultantes podem ser rastreados para a atividade de ligação e/ou outras desejadas propriedades funcionais. Vide WO 2011/120013.

Ácidos nucleicos que codificam anticorpos que se ligam seleti- vamente a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a moléculas de ácido nucleico que codificam Os anticorpos da presente invenção que se ligam a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado de célula, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico pode ser isolado por meio da purificação longe de outros componentes de células ou outros contaminantes (por exemplo, outros idos nucleicos ou protease de células) por meio das técnicas convencionais, incluindo o tratamento alcali- no/SDS, unindo, cromatografia de coluna de CsClI, eletroforese em gel de agarose e outros bem conhecidos na técnica. Vide Ausubel e outros. (2011) Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, Inc. Um ácido —nucleico da presente invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter sequências intrônicas. O ácido nucleico pode ser uma molécu- la de cDNA.

Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser obtidos usando as técnicas de biologia molecular padrão. Para os anticorpos ex- pressos por hibridomas (por exemplo, os hibridomas preparados a partir de camundongos transgênicos portadores de genes de imunoglobulinas huma- nastal como descrito mais abaixo), os CDNA codificando as cadeias leve e pesada do anticorpo feito pelo hibridoma podem ser obtidos por meio da amplificação por CRP convencional ou técnicas de clonagem de cDNA. Para Os anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (por exemplo, usando as técnicas de exibição em fagos), o ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser recuperado a partir da biblioteca.

Especificamente, as substituições de códons degenerados po- dem ser alcançadas através da geração de, por exemplo, as sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados é substituída com resíduos mistos de base e/ou desoxiinosina. Batzer e outros. 1991 () Nucleic Acid. 19: 5081; Ohtsuka, e outros (1985) J. Biol. Chem. 260: 2605- 08; Rossolini e outros. (1994) Mol. Célula. Sondas 8: 91-98.

Uma vez que os fragmentos de DNA que codificam para os segmentos VH e VL são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser ainda manipulados por meio das técnicas de DNA recombinante convencionais, por exemplo para converter os genes da região variável de genes da cadeia de anticorpo de comprimento completo, com os genes ou fragmentos Fab de um gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento de DNA de VL ou VH de codificação está operacionalmente ligado a um outro fragmento de DNA que codifica para outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou umligante flexível.

O DNA isolado que codifica para a região VH pode ser converti- do em um gene da cadeia pesada de comprimento total por meio da ligação de forma operativa ao DNA que codifica VH a outra molécula de DNA que codifica para regiões constantes da cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências dos genes da região constante da cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (Vide, por exemplo, Kabat e outros. (1991) Sequên- cias de proteínas de interesse imunológicas, Quinta Edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, NIH Publication No. 91-3242), e fragmentos de DNA que englobam estas regiões podem ser obtidos por meio da amplificação por CRP padrão. A região constante da cadeia pesada pode ser uma IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgD ou região constan- te, mas mais preferencialmente é uma região constante de I9G1 ou IgG4. Para um gene da cadeia pesada fragmento Fab, o DNA que codifica VH po- de ser operacionalmente ligado a uma outra molécula de DNA que codifica apenas CH1 da cadeia pesada da região constante.

O DNA isolado que codifica para a região VL pode ser converti- doemum gene da cadeia leve de comprimento total (bem como um gene da cadeia leve Fab), por meio da ligação de forma operativa do DNA que codifi- ca VL a outra molécula de DNA que codifica a região constante da cadeia leve CL. As sequências dos genes da região constante da cadeia leve hu- mana são conhecidas na técnica (Vide, por exemplo, Kabat e outros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Quinta Edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, NIH Publication No. 91 a 3242) e os fragmentos de DNA que englobam estas regiões podem ser obtidos por meio da amplificação por CRP padrão. A região constante da cadeia leve pode ser lambda ou Kappa da região constante, mas mais preferencialmente é umaregião constante kappa.

Para criar um gene scFv, os fragmentos VH e DNA que codifi- cam VL estão ligados operacionalmente a outro fragmento que codifica para um ligante flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (Gly4-Ser) 3, de tal modo que as sequências VH e VL podem ser expressas como uma proteína da cadeia simples contígua, com as regiões VL e VH ligadas por o ligante flexível. Vide, por exemplo, Pássaro, e outros. (1988) Science 242: 423-426, Huston, e outros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85: 5879-5883; McCafferty, e outros (1990) Nature 348: 552 a 554.

Métodos de produção de anticorpos e os fragmentos dos mesmos A presente invenção também proporciona os métodos para pro- duzir anticorpos e seus fragmentos. Os métodos de produção de anticorpos são bem conhecidos por meio das pessoas que são versadas na técnica.

Por exemplo, métodos de produção de anticorpos quiméricos são bem co- nhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patente U.S. 4.816.567; Morrison, e outros (1984), PNAS EUA 81: 8651-55; Neuberger e outros. (1985) Nature 314: 268-270; Boulianne e outros. (1984) Nature 312: 643-46, Por exemplo, Os anticorpos ou fragmentos de antigênio de liga- ção podem ser produzidos por meio da engenharia genética. Nesta técnica, tal como com outros métodos, as células produtoras de anticorpos são sen- sibilizadas para o antigênio ou imunogênio desejado. O RNA mensageiro isolado a partir de células produtoras de anticorpos é usado como um molde para fazer CDNA utilizando amplificação por CRP. Uma biblioteca de veto- res, cada um contendo um gene da cadeia pesada e cadeia leve de um gene retendo a especificidade do antigênio inicial, é produzido por meio da inser- ção de seções apropriadas da imunoglobulina cDNA amplificado em vetores de expressão. Uma biblioteca combinatória é construída através da combi- nação da biblioteca de genes da cadeia pesada com a biblioteca de genes da cadeia leve. Isso resulta em uma biblioteca de clones que coexpressam uma cadeia pesada e leve (semelhante ao fragmento Fab ou fragmento de antigênio de ligação de uma molécula de anticorpo). Os vetores que carre- gam destes genes são co-transfectados para uma célula hospedeira. Quan- doa síntese do gene do anticorpo é induzida no hospedeiro transfectada, as proteínas da cadeia pesada e leve auto-reunir-se para produzir anticorpos ativos que podem ser detectados por rastreio com o antigênio ou imunogê- nio.

Os anticorpos e os fragmentos da presente invencão podem também ser produzidos através da construção, usando as técnicas conven- cionais bem conhecidas por meio das pessoas que são versadas na técnica, um vetor de expressão contendo um operona e uma sequência de DNA que codifica uma cadeia pesada de anticorpo em que a sequência de DNA que codifica as CDR requeridas para a especificidade do anticorpo é derivada de uma célula de origem não humana, enquanto que a sequência de DNA que codifica para as restantes partes da cadeia do anticorpo é derivada de uma célula de origem humana. Além disso, a presente invenção refere-se a veto-

res, particularmente plasmídeos, cosmídeos, vírus, bateriófagos e outros vetores comuns na engenharia genética, que contêm as moléculas de ácido nucleico acima mencionadas da presente invenção. As moléculas de ácido nucleico contidas nos vetores podem ser ligadas a elementos reguladores que asseguram a transcrição em células procariotas e eucariotas.

Os vetores contêm os elementos que facilitam a manipulação da expressão de uma proteína estranha dentro da célula hospedeira alvo. Con- venientemente, a manipulação e a produção de sequências de DNA para a transformação é realizada pela primeira vez em um hospedeiro bacteriano (por exemplo, E. coli) e, geralmente, irá incluir sequências de vetores para facilitar tais manipulações, incluindo uma origem de replicação bacteriana e um marcador de seleção bacteriano adequado. Os marcadores de seleção codificam as proteínas necessárias para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas crescidas em um meio de cultura seleti- vo. As células hospedeiras não transformadas com o vetor contendo o gene de seleção não sobreviverão no meio de cultura. Os genes de seleção típi- cos codificam proteínas que conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, complementam deficiências auxotróficas, ou fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos. Vetores e métodos pa- ra transformação de leveduras exemplificativos encontram-se descritos na técnica. Vide, por exemplo, Burke, e outros (2000) Methods in Yeast Gene- tics Cold Spring Harbor Laboratory Press.

A sequência de codificação do polipetídeo de interesse pode ser ligada operacionalmente a sequências de regulação da transcrição e tradu- ção que fornecem para a expressão do polipetídeo nas células de levedura. Estes componentes do vetor podem incluir, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: um elemento potenciador, um promotor, e uma se- quência de terminação da transcrição. Sequências para a secreção do poli- petídeo podem também ser incluídas (por exemplo, uma sequência de sinal).

Os ácidos nucleicos são " operativamente ligados " quando colo- cados em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma sequência de sinal está operativamente ligado a

DNA para um polipetídeo se for expresso como uma pré-proteína que parti- cipa na secreção do polipetídeo; um promotor ou um potenciador está opera- tivamente ligado a uma sequência de codificação se afeta a transcrição da sequência.

Geralmente, "operativamente ligado" refere-se de uma maneira gerala sequências de DNA contíguas ligadas, e, no caso de um líder secre- tor, contíguas e na estrutura de leitura.

No entanto, os potenciadores não têm que ser contíguos.

Os promotores sãas sequências não traduzidas localizadas a montante (5 ') do códon de iniciação de um gene estrutural (geralmente den- trode cerca de 100 a 1000 pb) que controlam a transcrição e tradução das sequências específicas de ácidos nucleicos aos quais estão operativamente ligados.

Tais promotores caem em várias categorias: indutíveis, constituti- vos, e os promotores reprimíveis (por exemplo, que o aumento dos níveis de transcrição em resposta à ausência de um repressor). Os promotores indutí- veis podem iniciar níveis aumentados de transcrição a partir do DNA sob o seu controle em resposta a alguma alteração nas condições de cultura (por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma mudança na tem- peratura). Um segundo vetor de expressão pode ser produzido usando os mesmos meios convencionais bem conhecidos por meio das pessoas que são versadas na técnica, referido vetor de expressão contendo uma operona e uma sequência de DNA que codifica uma cadeia leve de anticorpo na qual a sequência de DNA que codifica as CDR necessária para a especificidade do anticorpo é derivada de uma célula de origem não humana, de preferên- cia uma fonte de células B de coelho, enquanto que a sequência de DNA que codifica para as restantes partes da cadeia do anticorpo é derivada de uma célula de origem humana.

Os vetores de expressão são transfectados para uma célula hospedeira por meio das técnicas convenção bem conhecidos das pessoas que são versados na técnica, para produzir uma célula hospedeira transfec- tada, a referida célula hospedeira transfectada cultivada por meio das técni- cas convencionais bem conhecidas por meio das pessoas que são versadas na técnica para produzir os referidos polipetídeos do anticorpo.

A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetores de expressão descritos acima, o primeiro vetor de expressão contendo DNA que codifica um operona e uma cadeia leve derivada de polipetídeo e o se- gundo vetor contendo um operona que codifica para o DNA e uma cadeia pesada do derivado polipetídeo. Os dois vetores contém diferentes marcado- res selecionáveis mas, de preferência atingem substancialmente uma igual expressão dos polipetídeos das cadeias pesada e leve. Alternativamente, um único vetor pode ser usado, incluindo o vetor de DNA que codifica ambos os polipetídeos das cadeias pesada e leve. As sequências de codificação para as cadeias pesada e leve podem compreender CDNA, DNA genômico ou ambos.

As células hospedeiras usadas para expressar os anticorpos, e seus fragmentos, podem ser uma célula bacteriana tal como E. coli, ou uma célula eucariótica. Uma célula de mamífero de um tipo bem definido, para este fim, tal como uma célula de mieloma, o ovário de hamster chinês (CHO), uma NSO, ou uma linhagem de célula HEK293 podem ser usados.

Os métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construí- dos, os métodos de transfecção necessários para produzir a célula hospe- deirae os métodos de cultura necessárias para produzir os anticorpos e seus fragmentos, a partir da referida todas células hospedeiras incluem as técnicas convencionais. Embora, de preferência a linhagem de célula usada para produzir o anticorpo é uma linhagem de células de mamíferos, qualquer outra linhagem de célula adequada, tal como uma linhagem de células bac- terianas tais como E. coli, um derivado de cepa bacteriana, ou uma linhagem de células de levedura, podem ser usados.

Do mesmo modo, uma vez produzidos, os anticorpos podem ser purificados de acordo com procedimentos padrão na técnica, tais como, por exemplo, filtração de fluxo cruzado, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia em coluna de afinidade. Geração de Anticorpos Anti-KIR2DL1,2 e 3 usando Animais Os anticorpos da presente invenção que se ligam seletivamente a KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 podem ser anticorpos monoclonais huma- nos. Tais anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra um KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 podem ser gerados utilizando camundongos transgê- nicos ou transcromossômicos que transportam partes do sistema imunitário humano em vez do sistema do camundongo. Estes camundongos transgêni- cos e transcromossômicos incluem os camundongos referidos na presente invenção como Mouse & e KM Rato AcMHu &, respectivamente, e são refe- ridos na presente invenção colectivamente como " camundongos lg huma- nos. " O camundongo AcMHu & (Medarpor exemplo Inc.) contém minilocal do gene da imunoglobulina humana que codifica as sequências de imuno- globulinas não rearranjadas da cadeia leve « e da cadeia pesadoa humana (up e y), juntamente com mutações específicas que inativam o py endógeno e locais da cadeia «x. Vide, por exemplo, Lonberg e outros. (1994) Nature 368 (6474): 856-859. Consequentemente, os camundongos apresentam uma expressão reduzida de IgM ou K camundongo, e, em resposta à imunização, os transgenes da cadeia pesada e leve humana introduzida sofrem troca de classe e a mutação somática de elevada afinidade para gerar IgGK mono- clonal humano. Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg e Huszar (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, e Hardinge Lonberg (1995) Ann. NY. Acad. Sci. 764: 536-546. A preparação e uso do camundongo AcMHu &, e as modificações genômicas transportadas por esses camundongos, é ainda descrita em Taylor e outros. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, e outros (1993) International Immuno- logy 5: 647-656; Tuaillon e outros. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90: 3720-3724; Choi, e outros (1993) Nature Genetics 4: 117-123, Chen e ou- tros. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon e outros. (1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Taylor, e outros (1994) International Immunology 6: 579-591, e Fishwild, e outros (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Vide ainda, Pa- tente U.S. Nos 5.545.806; 5.569.825, 5.625.126; 5.633.425, 5.789.650,

5.877.397, 5.661.016, 5.814.318, 5.874.299, 5.770.429, e 5.545.807, WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852; WO 98/24884; WO 99/45962 e WO 01/14424.

Os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 (por exemplo, anticorpos que se ligam seletivamente KIR2DL1, KIR2DL2, ou KIR2DL3) da presente invenção podem ser aumentados usando um camundongo que transporta as sequências de imunoglobulinas humanas e em transgenes transcromossomos, tal como um camundongo que transporta um transgene da cadeia pesada humana e uma cadeia leve humana transcromossomo. Estes camundongos, referidos na presente invenção como " camundongos KM & ", estão descritos em detalhe em WO 02/43478.

Mais ainda, os sistemas alternativos de animais transgênicos que expressam os genes da imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para aumentar anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 da presente invenção. Por exemplo, um sistema trans- gênico alternativa referido como o Xenomouse (Abgenix, Inc.) pode ser usa- do, tais camundongos são descritos em, por exemplo, Patente EUA Nºs

5.939.598,6.075.181,6.114.598, 6.150.584 e 6.162.963.

Além disso, os sistemas animais transcromossômicos alternati- vos que expressam genes da imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para aumentar anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 da presente invenção. Por exemplo, os camundongos que transportam tanto um transcromossomo da cadeia humana pesada e um transcromossomo da cadeia leve humana, referidos como " camundongos TC " podem ser usados. Vide Tomizuka e outros. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97: 722-727. Além disso, as vacas portadoras de transcromosso- mos da cadeia pesada e leve humanos têm sido descritos na técnica (Kuroi- wa, e outros (2002) Nature Biotechnology 20: 889 a 894) e podem ser usa- dos para aumentar anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2 e/ou KIR2DL3 da presente invenção.

Os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção tam- bém podem ser preparados utilizando métodos de apresentação de fagos paraa pesquisa de bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Tais métodos de apresentação de fagos para isolamento de anticorpos humanos são estabelecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patente U.S. Nºs

5,223,409; 5.403.484, 5.571.698, 5.427.908 5.580.717, 5.969.108,

6.172.197, 5.885.793, 6.521.404, 6.544.731, 6.555.313, 6.582.915 e

6.593.081. Os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção po- demtambém ser preparados utilizando camundongos SCID no qual as célu- las imunitárias humanas foram reconstituídas de tal modo que uma resposta do anticorpo humano pode ser gerada por meio da imunização. Vide, por exemplo, Patente U.S. Nºs 5.476.996 e 5.698.767. Quando os camundongos lg humanos são usados para produzir anticorpos humanos da presente invenção, tais camundongos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, tal como descrito por Lonberg, e outros (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, e outros (1996) Nature Biote- chnology 14: 845-851, WO 98/24884 e WO 01/14424. Preferencialmente, os camundongos serão de 6 a 16 semanas de idade aquando da primeira infu- são. Por exemplo, uma preparação purificada ou recombinante (5-50 ug) de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 pode ser usada para imunizar o camundongo de Ig humana por via intraperitoneal. A experiência anterior com vários antigênios de outros tem mos- trado que os camundongos transgênicos que respondem quando inicialmen- te imunizados intraperitonealmente (IP) com o antigênio em adjuvante com- pleto de Freund, seguido por todas outras imunizações IP semana (até um total de 6) com o antigênio em adjuvante incompleto de Freund. No entanto, outros adjuvantes de Freund também são encontrados para ser eficaz. Além disso,as células totais, na ausência de adjuvante, são encontradas para ser altamente imunogênicas. A resposta imune pode ser monitorizada ao longo do curso do protocolo de imunização com amostras de plasma sendo obti- das por sangrias retro-orbital. O plasma pode ser rastreado por ELISA (como descrito abaixo), e os camundongos com títulos de anti-suficientes KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 de imunoglobulina humana podem ser usados para fusões. Os camundongos podem ser impulsionados por via intravenosa com antigênio três dias antes do sacrifício e a remoção do baço. Espera-se que 2 a 3 fusões para cada imunização pode precisar ser realizada. Entre 6 e 24, os camundongos são tipicamente imunizados para cada antigio. Normalmen- te, são usadas duas cepas HCo7 e HCo12. Além disso, ambos os transge- nes HCo7 e HCo12 podem ser criados para formar um único camundongo tendo duas diferentes transgenes da cadeia pesada humana (HCo7/HCo12). Alternativamente ou adicionalmente, a cepa de camundongo KM & pode ser usada.

Geração de hibridomas produtores de anticorpos monocionais humanos da presente invenção Para gerar os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos da presente invenção, os esplenócitos e/ou células de nódulos lin- fáticos de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos com uma linhagem de célula imortalizada apropriada, tal como uma linhagem de células de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser rastreados para a produção de anticorpos específicos de antigênio. Por e- xemplo, as suspensões de linfócitos do baço de camundongos imunizados com células isoladas podem ser fundidos com um sexto número de P3X63- Ag8.653 de células de mieloma de camundongo não secretores (ATCC, CRL 1580) com 50% de PEG. As células podem ser plaqueadas a cerca de 2 X 10-5em placas de microtitulação de fundo plano, seguido de uma incubação de duas semanas em meio seletivo que continha 20% de soro fetal Clone, 18% " 653 " de meios condicionados, 5% de Origen (IGEN), L-glutamina a 4mM, piruvato de sódio a 1 mM, HEPES a 5 mM, 2-mercaptoetanol a 0,055 MM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicinae 1XHAT (Sigma; o HAT é adicionado 24 horas após o fusão). Após aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas em um meio em que o HAT é substituído com HT. Cavidades individuais podem então ser pesquisados por ELISA para monoclonal IgM humano e IgG. Uma vez que o crescimento extensivo de hibridoma ocorre, o meio pode ser ob- — servado normalmente após 10-14 dias. Os hibridomas secretores de anticor- pos podem ser novamente plaqueados, peneirados novamente e se ainda positivos para IgG humana, Os anticorpos monoclonais podem ser subclo-

nados pelo menos duas vezes por meio da diluição limitante. Os subclones estáveis podem então ser cultivados in vitro para gerar pequenas quantida- des de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.

Para a purificação de anticorpos monoclonais humanos, os hi- bridomas selecionados podem ser cultivados em dois litros de frascos rota- dores para a purificação de anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteí- na A-Sefarose (Farmácia, Piscataway, NJ), eluindo IgG pode ser verificada por meio da eletroforese em gel e cromatografia líquida de elevado desem- penho para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser trocado em PBS, e a concentração pode ser determinada por OD280 utilizando coefici- ente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80ºC.

RÓTULOS Os antigênios, anticorpos e seus fragmentos descrito na presen- te invenção podem ser modificadas pós-tradução para adicionar porções efetoras, tais como ligantes, porções químicas detectáveis , tais como, por exemplo, corantes fluorescentes, enzimas, substratos, materiais biolumines- centes, materiais radioativos, unidades quimioluminescentes, um agente ci- totóxico, materiais radioativos, ou porções funcionais.

Uma ampla variedade de organismos, por exemplo, ligantes, po- de ser acoplada com os oligonucleotídeos como é conhecido na técnica. Os ligantes podem incluir moléculas que ocorrem naturalmente, ou moléculas recombinantes ou sintéticas. Exemplos de ligantes incluem, mas não estão limitados a, avadin, biotina, peptídeos, peptidomiméticos, polilisina (PLL), o polietileno-glicol (PEG), MPEG, grupos catiônicos, espermina, espermidina, poliamina, tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína surfa- tante A mucina, poliaminoácidos, glicosilados, transferrina aptâmero, imuno- globulinas (por exemplo, anticorpos), insulina, transferrina, albumina, o açú- car, as moléculas lipofílicas (por exemplo, esteroides, ácidos biliares, ácido eólico, colesterol e ácidos graxos), vitamina A, vitamina e, vitamina K, vita- mina B, ácido fólico, vitamina B12, riboflavina, biotina, piridoxal, vitaminas,

co-fatores, hormônios e lipopolissacarídeo receptores hormonais, lectinas, hidratos de carbono, hidratos de carbono multivalentes, marcadores marca- dos radioativamente, corantes fluorescentes, e os derivados dos mesmos. Vide, por exemplo, Patente U.S. Nºs 6,153, 737; 6.172.208, 6.300.319,

6.335.434, 6.335.437, 6.395.437, 6.444.806, 6.486.308, 6.525.031,

6.528.631 e 6.559, 279.

Além disso, porções podem ser adicionadas ao antigênio ou epi- topo para aumentar a meia-vida in vivo (por exemplo, por prolongamento do tempo de recarga da corrente sanguínea. Tais técnicas incluem, por exem- plo, a adição de porções de PEG (também denominado peguilação), e são bem conhecidos na técnica. Vide Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2003/0031671. Um antigênio, anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo de antigênio, descrito na presente invenção, pode ser "ligado " a um substrato quando é associado com o marcador por meio de um produto químico sólido não aleatória ou interação física. A ligação pode ser através de uma ligação covalente. No entanto, os anexos não precisa ser covalente ou permanente. Os materiais podem ser ligados a um marcador através de uma molécula "separadora" ou "grupo de ligação . Tais moléculas espaçadoras são molé- culas que têm uma primeira parte que se liga com o material biológico, e uma segunda parte que se liga ao rótulo. Dessa maneira, quando ligado ao rótulo, a molécula de espaçador separa o rótulo e os materiais biológicos, mas está ligado a ambos. Os métodos de fixação do material biológico (por exemplo, o rótulo) a um rótulo são bem conhecidos na técnica, e incluem, mas não estão limitados a acoplamento químico. Rótulos detectáveis Os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ser modificados pós-tradução para adicionar os marcadores efetores, tais como ligantes químicos, marcadores detectáveis , tais como, por exemplo, corantes fluorescentes, enzimas, substratos, mate- riais bioluminescentes, materiais radioativos, e rótulos quimioluminescentes, etiquetas ou funcionais, tais como, por exemplo, estreptavidina, avidina, bio-

tina, uma citotoxina, um agente citotóxico, e materiais radioativos.

As enzi- mas exemplares incluem, mas não estão limitadas a, peroxidase de rábano silvestre, a acetilcolinesterase, a fosfatase alcalina, B-galatosidase e lucife- rase.

Outros materiais fluorescentes exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, rodamina, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, umbelife- rona, diclorotriazinilamina, cloreto de dansila e ficoeritrina.

Os rótulos quimio- luminescentes exemplares incluem, mas não estão limitados a, luminol.

Ou- tros materiais bioluminescentes exemplares incluem, mas não estão limita- dos a, a luciferina, luciferase, e aequorina.

Outros exemplos de materiais — radioativos incluem, mas não estão limitados a, bismuto-213 (213Bs), carbo- no-14 (14C), carbono-11 (11C), cloro-18 (CL18), crômio-51 (51 Cr), cobalto- 57 (57Co), o cobalto-60 (60Co), cobre-64 (64Cu), cobre-67 (67Cu), dispró- sio-165 (165Dy), érbio-169 (169Er), flúor-18 (18F), gálio-67 (67Ga), gálio-68 (68Ga), germânio-68 (68Ge), o hólmio-166 (166Ho), índio-111 (111In), iodo- 125 (125)), iodo-123 (124I), iodo-124 (124/), iodo-131 (131), irídio-192 (1921r), ferro-59 (59Fe), criptônio-81 (81Kr), chumbo-212 (212Pb), lutécio- 177 (177LuU), molibdênio-99 (99Mo), nitrogenio-13 (13N), oxigênio-15 (150), paládio-103 (103Pd), fósforo-32 (32P), o potássio-42 (42K), rénio-186 (186Re), rénio-188 (188Re), rubídio-81 (81Rb), rubídio-82 (82Rb), samário- 153 (153Sm), selênio-75 (75Se), sódio-24 (24Na), estrôncio-82 (82Sr), es- trôncio-89 (89Sr), enxofre 35 (35S), tecnécio-99m (99Tc), tálio 201 (201TI), trítio (3H), xénon-133 (133Xe), o itérbio-169 (169Yb), o itérbio-177 (177Yb), e o ítrio-90 (90Y). Agentes citotóxicos Os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ser conjugados com os agentes citotóxicos, inclu- indo, mas não estão limitados a, metotrexato, aminopterina, 6-mercapto- purina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracila decarbazine; agentes alqui- lantes tais como mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU), mitomicina C, lomustina (CCNU), 1-metilnitrosouréia, ciclotosfami- da, mecloretamina, busulfano, dibromomannitol, estreptozotocina, mitomici- na C, dichlorodiamine cis-platina (11) (DDP) cisplatina e carboplatina (para-

platina); antraciclinas incluem daunorrubicina (anteriormente daunomicina), doxorrubicina (adriamicina), detorrubicina, carminomicina, idarubicina, epir- rubicina, mitoxantrona e bisantreno; antibióticos incluem datinomicina (ati- nomicina D), bleomicina, caliqueamicina, mitramicina e Antramicina (AMC) e agentes antimytotic como os alcaloides de vinca, vincristina e vinblastina.

Outros agentes citotóxicos incluem o paclitaxel (Taxol O), a ricina, exotoxina de pseudomonas, a gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, etoposido, tenoposide, colchicin, di anthracin diona, 1- dehidrotestosterone, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, pro- —pranolol, puromicina, procarbazina, hidroxiureia, asparaginase, corticosteroi- des, mytotane (o, p"-DDD ()), interferons, e misturas destes agentes citotóxi-

cos.

Outros agentes citotóxicos incluem, mas não estão limitados a, agentes quimioterapêuticos, tais como cisplatina, carboplatina, paclitaxel, gemcitabina, caliqueamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracila, mitomicina C, atinomicina D, ciclofosfamida, vincristina, bleomicina, antagonistas de VEGF, EGFR antagonistas, platinas, taxóis, irinotecano, 5-fluorouracila, gemcitabi- na, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalano, alcaloides da vinca (por exemplo, vinblastina, vincristina, vindesina e vinorelbina), mustines, ini- bidores da tirosina quinase, radioterapia, antagonistas de hormônios sexu- ais, andrógenos seletiva moduladores de receptores, moduladores seletivos do receptor de estrogênio, os antagonistas do PDGF, antagonistas do TNF, antagonistas da IL-1, interleucinas (por exemplo, IL-12 ou IL-2), os antago- nistas de IL-12R, Erbitux O, Avastin O,, anticorpos anti-CD20 pertuzumab, Rituxan O, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, Herceptin O, ou qualquer combinação dos mesmos.

Enzimas tóxicas a partir de plantas e bactérias, tais como ricina, toxina da difteria e toxina de Pseudomonas pode ser conju- gado com Os anticorpos humanizados, ou os seus fragmentos de ligação destes, para gerar reagentes de células do tipo específico de matar.

Youle, e outros (1980) Proc.

Nat'l Acad.

Sci.

EUA 77: 5483; Gilliland, e outros (1980) Proc.

Nat'l Acad.

Sci.

EUA 77: 4539; Krolick, e outros (1980) Proc.

Nat'| A- cad.

Sci.

EUA 77: 5419. Outros agentes citotóxicos incluem ribonucleases citotóxicos. Vide a patente U.S. No. 6.653.104.

Os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ser conjugados com um radionucleotídeo que emi- te partículas alfa ou beta (por exemplo, radioimmunoconjuagtes). Estes isó- topos radioativos incluem, mas não estão limitadas a beta-emissores, tais como fósforo-32 (*ºP), o escândio-47 (Sc), cobre-67 (Cu), gálio-67 (Ga), o ítrio-88 (*Y), ítrio-90 (PY), iodo-125 (PI), iodo-131 (9), samário-153 (**Sm), o lutécio-177 (Lu), rénio-186 (Re), rénio-188 (Re), e alfa e- missores, como astato-211 (2'At), chumbo-212 (2?Pb), bismuto-212 (2ºBi), bismuto-213 (2ºBi) ou atínio-225 (2PPAc).

Os métodos são conhecidos na técnica para conjugar um KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 descrito na presente invenção a um marca- dor, tal como os métodos descritos por Hunter, e outros (1962) Nature 144: 945; David, e outros (1974) Biochemistry 13: 1014, Pain, e outros (1981) J.

15. Immunol. Meth. 40: 219, e Nygren (1982) Histochem and Citochem, 30: 407.

SUBSTRATOS Os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ser ligados a um substrato. Uma série de substra- tos (por exemplo, os suportes sólidos) conhecidos na técnica são apropria- dos parauso com Os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 descritos na presente invenção. O substrato pode ser modificado para conter canais ou outras configurações. Vide Fung (2004) [ed,] Protein Arrays: Methods and Protocols Humana Press e Kambhampati (2004) [ed] Protein Microarray Tecnhnology John Wiley & Sons.

Os materiais de substrato incluem, mas não se limitam a acríli- cos, agarose, vidro de borosilicato, de carbono (por exemplo, folhas ou grâà- nulos de nanofibras de carbono), acetato de celulose, celulose, produtos ce- râmicos, géis, vidro (por exemplo, inorgânico, controlador de poros, modifi- cado, carbonato de cal, ou de vidro funcionalizado), látex, esferas magnéti- cas, membranas metálicas, metaloides, nitrocelulose, náilon O, feixes de fibras ópticas, os polímeros orgânicos, papel, plásticos, polyacryloylmorpho- lide, poli (4-metilbuteno), poli (tereftalato de etileno), poli (butirato de vinila),

poliacrilamida, polibutileno, policarbonato, polietileno, tereftalato de polietile- no glicol, poliformaldeído, polimetacrilato, polimetilmetacrilato, polipropileno, polissacáridos, poliestireno, poliuretanos, acetato de polivinila, cloreto de polivinila, de difluoreto de polivinilideno (PVDF), polivinilpirrolidinona, seda artificia, resinas, borrachas, materiais semicondutores, sefarose &, sílica, silicone, copolímeros de estireno, TEFLON &, e uma variedade de outros polímeros. Os substratos não precisam ser planos e podem incluir qualquer tipo de formas, incluindo as formas esféricas (por exemplo, grânulos) ou formas cilíndricas (por exemplo, fibras). Os materiais ligados a suportes sóli- dos podem ser ligados a qualquer porção do suporte sólido (por exemplo, podem ser ligados a uma porção interior de um material de suporte sólido poroso).

O corpo de substrato pode estar na forma de um grânulo, caixa, coluna, cilindro, disco, placa (por exemplo, placa de vidro, uma placa de Pe- tri), fibras, películas, placas filtradas de microtitulação (por exemplo, placa de microtitulação de 96 cavidades), vara multi-lâminas, líquidos, granulados, placa, anel, haste, rolo, folha, slide, vara, bandeja, tubo ou frasco. O substra- to pode ser um corpo discreto singular (por exemplo, um único tubo, um úni- co grânulo), qualquer número de uma pluralidade de corpos de substrato (por exemplo, uma prateleira de tubos de 10, várias esferas), ou as combi- nações dos mesmos (por exemplo, uma bandeja compreende uma plurali- dade de placas de microtitulação, de uma coluna cheia com esferas, uma placa de microtitulação arquivada com grânulos).

Um anticorpo anti-KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ser " li- gado " a um substrato quando é associado com o substrato sólido por meio de um produto químico não aleatório ou de interação física. A ligação pode ser através de uma ligação covalente. No entanto, os anexos não precisa ser covalente ou permanente. Os materiais podem ser ligados a um substrato através de uma molécula " separadora" ou " grupo de ligação ". Tais molécu- las espaçadoras são moléculas que têm uma primeira parte que se liga com o material biológico, e uma segunda parte que se liga ao substrato. Dessa maneira, quando ligado ao substrato, a molécula separadora separa o subs- trato e os materiais biológicos, mas está ligado a ambos. Os métodos de fixação do material biológico (por exemplo, etiqueta) a um substrato são bem conhecidos na técnica, e incluem, mas não estão limitados a acoplamento químico.

As placas, tais como placas de microtitulação, que suportam e contém a fase sólida para as reações de síntese de fase sólida podem ser usados. As placas de microtitulação podem abrigar grânulos que são usados como a fase sólida. Por " partículas " ou " micropartícula " e " nanopartícula " ou "bolha" ou" microconta " ou " microesferas " entende-se aqui a matéria em micropartículas ter qualquer um de uma variedade de formas ou tama- nhos. A forma pode ser geralmente esférica mas não precisa de ser de for- ma esférica, sendo, por exemplo, cilíndrica ou poliédrica. Como será apreci- ado por aqueles na técnica, as partículas podem compreender uma grande variedade de materiais, dependendo da sua uso, incluindo, mas não limita- dos a, amido de ligação cruzada, dextrano, celulose, proteínas, polímeros orgânicos, incluindo os polímeros de estireno, como poliestireno e metilesti- reno, bem como outros copolímeros de estireno, plásticos, vidro, cerâmica, polímeros acrílicos, materiais magneticamente responsivas, colôides, toriaso! carbono, grafite, dióxido de titânio, de náilon, de látex e de TEFLON &. Vide, por exemplo, o "Guia de Detecção de Microesfera " do Bangs Laboratories, Fishers, IN.

Os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ser ligados a em qualquer uma das formas de substratos descrito na presente invenção (por exemplo, grânulo, caixa, colu- na, cilindro, disco, placa (por exemplo, placa de vidro, uma placa de Petri), fibras, películas, placas de microtitulação filtradas (por exemplo, placa de microtitulação de 96 cavidades), vara de multilaminado, líquidos, granulados, placa, do anel, haste, rolo, a folha, a corrediça, vara, bandeja, tubo ou fras- co). Em particular, as partículas ou grânulos podem ser um componente de um material de gel, ou podem ser componentes separados, tais como contas de látex feitas de uma variedade de plásticos sintéticos (por exemplo, polies-

tireno). O rótulo (por exemplo, estreptavidina) pode ser ligado a um substrato (por exemplo, grânulo).

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS Uma " composição farmacêutica " refere-se a uma composição química ou biológica adequada para administração a um mamífero. Tais composições podem ser especificamente formuladas para administração através de um ou mais de um número de vias, incluindo mas não se limitan- do a bucal, epicutânea, epidural, por inalação, intra-arterial, intracardíaca, intracerebroventricular, intradérmica, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intravenosa, oral, parentérica, por via retal através de um enema ou supositório, por via subcutânea, subdérmica, sublingual, transdérmica e transmucosa. Além disso, a administração pode ocorrer por meio de injeção, pó, líquido, gel, gotas, ou outros meios de ad- ministração.

Um " excipiente Farmacêutico " ou um " excipiente Farmaceuti- camente aceitável " é um veículo, geralmente um líquido, em que um agente terapêutico ativo é formulado. Em uma modalidade da presente invenção, o agente terapêutico ativo é um anticorpo humanizado descrito na presente invenção, ou um ou mais seus fragmentos. O excipiente geralmente não proporciona qualquer atividade Farmacolôgica para a formulação, embora possa proporcionar características de libertação do produto químico e/ou a estabilidade biológica e Exemplos de formulações podem ser encontrados, por exemplo, em Grennaro (2005) [ed.] Remington: The Science and Pratice of Farmac [. 21a Ed] As composições Farmacêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabrico e armazenamento. A presente inven- ção contempla que a composição Farmacêutica está na forma liofilizada. À composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, liposso- ma, ou outra estrutura ordenada adequada para concentração de fármaco elevada. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido), e suas misturas adequadas. A presente invenção contempla ainda a inclusão de um estabilizador na composição farmacêuti- ca.

Os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ser formulados em composições Farmacêuticas deváriasformas de dosagem.

Para preparar as composições Farmacêuticas da presente invenção, pelo menos um KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 como o ingrediente ativo pode ser misturado intimamente com os veículos e aditi- vos adequados de acordo com técnicas bem conhecidas por meio das pes- soas que são versadas na técnica de formulações Farmacêuticas.

Vide Grennaro (2005) [ed] Remington: The Science and Pratice of Phamarcy [21a ed.] Por exemplo, Os anticorpos descritos na presente invenção podem ser formulados em solução salina tamponada com fosfato pH 7,2 e forneci- dos como uma solução líquida de 5,0 mg/mL, incolor.

Da mesma forma, as composições para as preparações líquidas incluem soluções, emulsões, dispersões, suspensões, xaropes e elixires, com veículos e aditivos adequados, incluindo, mas não limitados a água, álcoois, glicóis, óleos, conservantes, agentes aromatizantes, agentes coran- tes, e agentes de suspensão.

As preparações típicas para administração parenteral compreendem o ingrediente ativo com um transportador, tal como água estéril ou óleo parentericamente aceitável, incluindo mas não limitados a polietileno glicol, polivinil pirrolidona, lecitina, óleo de amendoim ou óleo de sésamo, com outros aditivos para auxiliar a solubilidade ou de preservação, também pode ser incluídos.

No caso de uma solução, podem ser liofilizados em um pó e depois reconstituídos, imediatamente antes de usar.

Para dis- persões e suspensões, os veículos e aditivos adequados incluem gomas aquosas, celuloses, silicatos, ou óleos.

Para cada uma das modalidades recitadas, Os anticorpos anti- KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ser administrados por meio de uma variedade de formas de dosagem.

Qualquer forma de dosagem biologicamente aceitável conhecida das pessoas com conhecimentos normais na técnica, e as combinações dos mesmos, são contempladas.

Exemplos de tais formas de dosagem incluem, sem limitação,

pós reconstituíveis, elixires, líquidos, soluções, suspensões, emulsões, pós, grânulos, partículas, micropartículas, grânulos dispersíveis, cápsulas, inalan- tes, inalantes de aerossóis, inalantes, emplastros de partículas, implantes depot, implantes, injetáveis (incluindo subcutânea, intramuscular, intraveno- saeintradérmica), infusões, e as combinações dos mesmos.

Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de só- dio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pela inclusão na composição de um agente que retarda a ab- sorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina. Além disso, os com- postos descrito na presente invenção podem ser formulados em uma formu- lação de libertação no tempo, por exemplo,, em uma composição que inclui um polímero de libertação lenta. Os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ser preparados com veícu- los que irão proteger o composto contra a libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de en- trega microencapsulados. Os polímeros biodegradáveis , biocompatíveis, podem ser usadas, tais como acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colagênio, poliortoésteres, ácido poliláctico e ácido poliláctico, poliglicólico copolímeros (PLG). Muitos métodos para a preparação de tais formulações são conhecidos pelos que são versados na técnica.

Os compostos ativos suplementares podem também ser incorpo- rados nas composições.

Como observado tais composições podem compreender adicio- nalmente um antigênio desejado, por exemplo, um antigênio de tumor ou outro compostos moduladores imunes, tais como agonistas dos receptores do tipo Toll, um tipo de interferonao, tais como interferons alfa e beta e os agonistas de CD40, tais como CDA40, anticorpos e anticorpos agonistas fragmentos, de preferência anti-CD40 anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos agonistas ou outros potenciadores ou supressores imunitários, tais como Pd, Pd-L1-L2, as proteínas de fusão CTLA4 e seus anticorpos es- pecíficos.

As composições que compreendem os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ainda compreen- der um antigênio ou outro agonista imune. O antigênio pode ser administra- do em uma quantidade que, em combinação com os outros componentes da combinação, é eficaz para gerar uma resposta imune contra o antígeno. Por exemplo, o antigênio pode ser administrado em uma quantidade desde cerca de 100 ug/kg a cerca de 100 mg/kg. Em algumas modalidades, o antigênio pode ser administrado em uma quantidade de cerca de 10 ug/kg a cerca de mg/kg. Em algumas modalidades, o antigênio pode ser administrado em 10 uma quantidade de cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg. A quantidade es- pecífica de antigênio que constitui uma quantidade eficaz para gerar uma resposta imune, no entanto, depende em certa medida, alguns fatores, tais como, por exemplo, o antigênio específico a ser administrado, o agonista específico a ser administrado e a sua quantidade, o agonista específico a ser administrado e a sua quantidade, o estado do sistema imunológico, do mé- todo e ordem de administração do agonista e o antigênio, a espécie a que a formulação está a ser administrado, e o resultado terapêutico desejado. Dessa maneira, não é prático para expor normalmente, a quantidade que constitui uma quantidade eficaz de antigênio. As pessoas que são versadas natécnica, no entanto, podem facilmente determinar a quantidade apropria- da tendo em devida consideração tais fatores.

Os veículos Farmaceuticamente aceitáveis Um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser combinado com um ou mais veículos (diluentes, excipientes, e semelhantes) e/ou adjuvantes adequados para uma ou mais vias de administração pretendidas para pro- porcionar composições que são Farmaceuticamente aceitáveis.

O anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser, por exemplo, mis- turado com latose, sacarose, pó (por exemplo, pó de amido), ésteres de ce- lulose de ácidos alcanóicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnésio, óxidode magnésio, sais de sódio e cálcio de ácidos fosfórico e sulfúrico, a- cácia, gelatina, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, e/ou álcool polivinílico, e ainda opcionalmente comprimido ou encapsulado para administração con-

vencional. Alternativamente, um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser dissolvido em solução salina, água, polietilenoglicol, propilenoglicol, soluções coloidais de carboximetilcelulose, etanol, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de sésamo, goma de tragacanto, e/ou vá- rios tampões. Outros veículos, adjuvantes e modos de administração são bem conhecidos nas técnicas Farmacêuticas. Um veículo ou diluente pode incluir material de atraso de tempo, tal como monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila sozinho ou com uma cera, ou outros materiais fun- cionalmente semelhantes.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis geralmente incluem qualquer e todos os solventes adequados, meios de dispersão, revestimen- tos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardado- res da absorção, e similares que são fisiologicamente compatíveis com um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. Exemplos de veículos Farmaceuticamente aceitáveis incluem água, solução salina, solução salina tamponada com fos- fato, dextrose, glicerol, etanol, e semelhantes, bem como combinações de quaisquer dos mesmos. Em muitos casos, pode ser desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, tais como, sorbitol, manitol ou cloreto de sódio em uma tal composição. As substâncias Farmaceuticamen- te aceitáveis, tals como agentes molhantes ou quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, con- servantes ou tampões, que desejavelmente pode aumentar a vida de prate- leira ou a eficácia do anticorpo anti-KIR, composição relacionado, ou combi- nação. Adequação para os veículos e outros componentes de composições Farmacêuticas é determinada com base na falta de um impato negativo sig- nificativo sobre as propriedades biológicas desejadas do anticorpo.

As composições de anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 relaciona- das,, composições e combinações de acordo com a presente invenção po- dem estar em uma variedade de formas adequadas. Tais formas incluem, por exemplo, as formas de dosagem líquida, semissólidos e sólidos, tais co- mo soluções liquidas (por exemplo, soluções injetáveis e para infusão), dis- persões ou suspensões, emulsões, microemulsões, comprimidos, pílulas,

pós, lipossomas, dendrímeros e outras nanopartículas (Vide, por exemplo, Baek e outros, Methods Enzymol 2003; 362: 240-9; Nigavekar e outros, Farm Res 2004 Mar; 21 (3): 476-83), as micropartículas, e os supositórios. As formulações, os sais são ainda descritos em WO2006/072625, Tipicamente, as composições sob a forma de soluções injetáveis ou para infusão, tais como composições semelhantes às usadas para a imu- nização passiva de humanos com outros anticorpos, são usados para a en- trega de anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 da presente invenção. Um modo típico para a entrega de composições de anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 é através de administração parentérica (por exemplo, intravenosa, subcutãâ- nea, intraperitoneal e/ou a administração intramuscular). Em um aspecto, um anticorpo anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 é administrado a um paciente humano por meio da infusão intravenosa ou injeção.

Uma composição para uso farmacêutico pode também incluir vá- rios diluentes, cargas, sais, tampões, detergentes (por exemplo, um deter- gente não iônico, tal como Tween-80), estabilizadores (por exemplo, açúca- res ou aminoácidos livres da proteína), conservantes, os fixadores de teci- dos, solubilizantes, e/ou outros materiais apropriados para inclusão em uma composição para uso farmacêutico. Exemplos de componentes adequados são também descritos em, por exemplo, Berge e outros Farm. Sci., 6661), 1- 19 (1977); Wang e Hanson, J. Parenteral. Sci. Tecnologia: 42, S4, S6 (1988); EUA Patent n º s 6165779 e 6225289. Uma tal composição Farma- cêutica pode também incluir conservantes, antioxidantes ou outros aditivos conhecidos por meio das pessoas que são versadas na técnica. Os veículos Farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica. Vide, por exem- plo, referências em WO 2006/072625.

Uma pessoa que é versada na técnica seria capaz de determinar a dosagem eficaz e a frequência de administração através de experimenta- ção de rotina, por exemplo guiada por meio da descrição e os ensinamentos da presente invençãoem Goodman e outros. (2011) Goodman & Gilman, The Farmacological Basis of Therapeutics [12th Ed.]; Howland e outros. (2005), Lippincott Illustrated Reviews: Pharmacology [2 º ed.] E Golan,

(2008) Princípios de Farmacologia: A base fisiopatológica da terapia fárma- cosa [2nd ed.] Vide, também, Grennaro (2005) [ed] Remington: The Science and Practice of Pharmacy [21 Ed.] Vias de Administração As composições descritas na presente invenção podem ser ad- ministradas em qualquer das seguintes vias: bucais, epicutânea, epidural, infusão, inalação, intra-arterial, intracardíaca, intracerebroventricular, intra- dérmica, intramuscular, intranasal, intra-ocular, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intravenosa, oral, parentérica, pulmonar, retal através de um ene- ma ou supositório, por via subcutânea, subdérmica, sublingual, transdérmica e transmucosa.

As vias de administração preferidas são a injeção ou infusão intravenosa.

A administração pode ser local, onde a composição é adminis- trada diretamente, para fechar, na localidade, próximo, em, sobre, ou na proximidade do (s) local (is) de doença, por exemplo, localizada ou sistêmi- ca,emque a composio é administrado ao paciente e passa através do corpo amplamente, alcançando, dessa maneira, o (s) local (is) de doença.

A admi- nistração local (por exemplo, injeção) pode ser conseguida por meio da ad- ministração aos sinais da doença de células, tecidos, órgãos, e/ou sistemas de órgãos, que compreende e/ou é afetado pela doença, e/ou onde e/ou sin- tomas são ativos ou possam vir a ocorrer (por exemplo, local do tumor). À administração pode ser tópica com um efeito local, a composição é aplicada diretamente quando a sua ação é desejada (por exemplo, locais de inflama- ção ou dor). Para cada uma das modalidades recitadas, os compostos po- dem ser administrados por uma variedade de formas de dosagem como co- nhecido na técnica.

Qualquer forma de dosagem biologicamente aceitável conhecida das pessoas com conhecimentos normais na técnica, e as combi- nações dos mesmos, são contempladas.

Exemplos de tais formas de dosa- gem incluem, sem limitação, comprimidos mastigáveis, comprimidos que dissolvem de forma rápida, comprimidos efervescentes, pós reconstituíveis, elixires, líquidos, soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, comprimi- dos de multi-ccamada, bi-camada de comprimidos, cápsulas, cápsulas de gelatina moles, cápsulas de gelatina dura, drageias, pastilhas, comprimidos mastigáveis , grânulos, pós, pastilhas, grânulos, partículas, micropartículas, grânulos dispersíveis, cápsulas, duches, supositórios, cremes, produtos tópi- cos, inalantes, aerossóis inaláveis , remendos, inalantes partículas, implan- tes depot, implantes ingestíveis, injetáveis (incluindo subcutânea, intramus- cular, intravenosa e intradérmica), infusões, e as combinações dos mesmos. Outros compostos que podem ser incluídos por meio da mistura são, por exemplo, ingredientes medicamente inertes (por exemplo, um dilu- ente sólido e líquido), tais como latose, dextrosesacarose, celulose, amido ou fosfato de cálcio para comprimidos ou cápsulas, azeite ou oleato de etila para cápsulas moles e água ou óleo vegetal para suspensões ou emulsões; agentes lubrificantes tais como sílica, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio ou de cálcio e/ou polietileno glicóis, agentes de gelificação, tais como argilas coloidais; agentes de espessamento tais como goma tragacan- ta ou alginato de sódio, agentes de ligação, tais como amidos, gomas arábi- cas, gelatina, metilcelulose, carboximetilcelulose ou polivinilpirrolidona, agen- tes de desintegração, tais como amido, ácido algínico, alginatos ou glicolato de amido e sódio, misturas efervescentes, corantes; adoçantes, agentes mo- lhantes, tais como lecitina, polissorbatos ou laurilsulfatos; e outros ingredien- tes auxiliares terapeuticamente aceitáveis, tais como umectantes, conser- vantes, tampões e antioxidantes, que são aditivos conhecidos para essas formulações.

As dispersões líquidas para administração oral podem ser xaro- pes, emulsões, soluções ou suspensões. Os xaropes podem conter como veículo, por exemplo, sacarose ou sacarose com glicerol e/ou manitol e/ou sorbitol. As suspensões e as emulsões podem conter um veículo, por exem- plo, uma goma natural, ágar, alginato de sódio, pectina, metilcelulose, car- boximetilcelulose, ou álcool polivinílico. Em outras modalidades, a presente invenção fornece kits que incluem um ou mais recipientes que compreendem unidades de dosagem Farmacêuticas que compreende uma quantidade eficaz de um ou mais anti- corpos e os fragmentos dos mesmos da presente invenção. Os kits podem incluir instruções, orientações, etiquetas, informações de marketing, avisos ou panfletos informativos.

Dosagens A quantidade dos anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 descritos na presente invenção em uma composição terapêutica de acordo com as modalidades da presente invenção pode variar de acordo com fato- res tais como o estado da doença, idade, sexo, peso, história clínica do pa- ciente, o risco fatores, a predisposição para a doença, via de administração, o regime de tratamento pré-existentes (por exemplo, possíveis interações com outros fármacos), e peso do indivíduo. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta terapêutica óptima. Por exemplo, um único bolus pode ser administrada, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo, ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação te- rapêutica.

É especialmente vantajoso formular as composições parenterais em forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformi- dade de dosagem. A forma de dosagem unitária tal como usada na presente invenção refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosa- gens unitárias para os indivíduos mamíferos a serem tratados: cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de anticorpos, e os fragmentos dos mesmos, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em as- sociação com o veículo Farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem unitárias da presente invenção são referidadas por e diretamente dependente das características únicas dos anticorpos, e seus fragmentos, e o efeito terapêutico particular a ser alcançado, e as limitações inerentes na técnica de compor um desses anticorpos, e os fragmentos dos mesmos, para o tratamento de sensibilidade em indivíduos. No uso terapêu- tico para o tratamento de condições em mamíferos (por exemplo, seres hu- manos) para a qual os anticorpos e seus fragmentos da presente invencão ou um seu composição Farmacêuticas adequadas são eficazes, os anticor- pos e os fragmentos dos mesmos da presente invenção podem ser adminis-

trados em uma quantidade eficaz. As dosagens, como apropriado para a presente invenção podem ser uma composição, uma composição farmacêu- tica ou de quaisquer outras composições descritas na presente invenção.

A dosagem pode ser administrada como uma dose única, uma dose dupla, uma dose tripla, uma dose quádrupla, e/ou uma dose quíntupla. As dosagens podem ser administradas isoladamente, simultaneamente, e sequencialmente.

A forma de dosagem pode ser qualquer forma de libertação co- nhecida das pessoas com conhecimentos normais na técnica. As composi- ções da presente invenção podem ser formuladas para proporcionar a liber- tação imediata do ingrediente ativo ou de libertação sustentada ou controla- da do ingrediente ativo. Em uma preparação de libertação sustentada ou de libertação controlada, de libertação do ingrediente ativo pode ocorrer a uma velocidade tal que os níveis no sangue se mantêm dentro de uma gama te- rapêutica, mas abaixo dos níveis tóxicos durante um período de tempo pro- longado (por exemplo, 4 a 24 horas). As formas de dosagem preferidas in- cluem libertação imediata, de libertação prolongada, libertação de pulso, li- bertação variável, libertação controlada, libertação temporizada, libertação sustentada, libertação retardada, ação prolongada, e combinações dos mesmos, e são conhecidos na técnica.

Tal como definido na presente invenção, uma quantidade tera- peuticamente eficaz de proteína ou polipetídeo (isto é, uma dosagem eficaz) varia entre cerca de 0,001 a 30 mg/kg de peso corporal, de preferência cerca de 0,01 a 25 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente cerca de 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, e ainda mais preferencialmente cerca de 1 a 10 mg/kg, 2 a 9 mg/kg, 3 a 8 mg/kg, 4 a 7 mg/kg, ou 5 a 6 mg/kg de peso corpo- ral. O perito na técnica irá apreciar que determinados fatores podem influen- ciar a dosagem requerida para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo, mas não se limitando a gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos ante- riores, o estado de saúde geral e/ou idade do indivíduo, e outras doenças apresentar. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína, polipetídeo, ou anticorpo pode in-

cluir um tratamento único ou, preferencialmente, pode incluir uma série de tratamentos. Em um exemplo preferido, um indivíduo tratado com anticorpo, proteína ou polipetídeo no intervalo de entre cerca de 0,1 a 20 mg/kg de pe- so corporal, uma vez por semana durante entre cerca de 1 a 10 semanas, de preferência entre 2 e 8 semanas, mais preferencialmente entre cerca de 3 a 7 semanas, e ainda mais preferencialmente durante cerca de 4, 5, ou 6 se- manas. Será também apreciado que a dosagem eficaz de anticorpo, proteí- na ou polipetídeo usado para o tratamento pode aumentar ou diminuir ao longo do curso de um tratamento em particular. As alterações na dosagem podem resultar e tornam-se aparente a partir dos resultados de ensaios de diagnóstico, tal como descrito na presente invenção. Deve notar-se que a atividade Farmacolôgica das composições pode ser monitorizada utilizando modelos Farmacolôgicos padrão, que são conhecidos na técnica. Além disso, deve notar-se que as composições que compreendem um anti-KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, o anticorpo ou frag- mento de ligação ao antigênio dos mesmos, podem ser incorporados ou en- capsulados em uma matriz de polímero ou membrana adequada para entre- ga específica do local, ou podem ser funcionalizadas com agentes de seg- mentação específicas capazes de efetuar a entrega local específico. Estas técnicas, bem como outras técnicas de administração de fármacos são bem conhecidas na técnica. A determinação das dosagens óptimas para uma situação particular está dentro das capacidades por meio das pessoas que são versadas na técnica. Vide, por exemplo, Grennaro (2005) [ed] Reming- ton: The Science and Practice of Pharmacy [. Ed 21]

TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS INFLAMATÓRIOS E AUTOIMUNES A presente invenção proporciona métodos terapêuticos para o tratamento ou prevenção de um distúrbio inflamatório ou autoimune em indi- víduos com ou susceptível a, um distúrbio inflamatório ou autoimune, em que o tratamento envolve as composições de anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3, e/ou composições similares. Por exemplo, os níveis elevados de expressão de KIR2DL?2 fo-

ram reportados em pacientes que sofrem da doença inflamatória do intestino (IBD) e doença de Crohn.

Vide Wilson, e outros (2010)Human Immunol. 71

(3): 293 a 7. Os anticorpos KIR2DL1, 2 e/ou 3 descritos na presente invenção podem ser usados em composições, usos e métodos para o tratamento de doenças ou distúrbios autoimunes.

Exemplos de doenças ou distúrbios auto- imunes incluem, mas não estão limitadas a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), atrofia espênica adquirida, uveite anterior aguda, encefa- lomielite aguda disseminada (ADEM), artrite gotosa aguda, leucoencefalite hemorrágica necrosante aguda, sinusite aguda ou crônica, meningite puru- lenta aguda (ou outros distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central), inflamação grave aguda, doença de Addison, adrenalite, adulto aparecimen- to de diabetes mellitus em adultos (diabetes Tipo II), hipoparatiroidismo idio- pático adulto (AOIH), Agamaglobulinemia, agranulocitose, vasculite, incluin- do vasculite (incluindo vasculite de grandes vasos (incluindo polimialgia reumática e artrite de célula gigante (de Takayasu)), condições alérgicas, dermatite de contato alérgico, dermatite alérgica, alergia angiite granuloma- tosa, doenças alérgicas de hipersensibilidade, neurite alérgica, reação alér- gica, alopecia areata, alopecia totalis, síndrome de Alport, alveolite (por e- xemplo, alveolite alérgica e alveolite fibrosante), doença de Alzheimer, ami- laidose, esclerose amilatrófica lateral (ALS, doença de Lou Gehrig), um dis- túrbio relacionado com a eosinofilia (por exemplo, eosinofilia), anafilaxia, es- pondilite anquilasante, antgiectasis, nefrite mediada por anticorpos, Nefrite Anti-GBM/Anti-TBM, doenças mediadas por meio do complexo antígeno- anticorpo, doença da membrana com base antiglomerular, a síndrome do anticorpo antifosfolipídeo, síndrome de antifosfolipídeo (APS), aftas, estoma- tite aftosa, anemia aplástica, arritmia, aterosclerose, doenças arterioscleróti- cas, a artrite (por exemplo, artrite reumatoide, como artrite aguda, artrite reumatoide crônica), artrite crônica progressiva, artrite deformante, ascaridí- ase,aspergilama (ou granulomas contendo eosinófilas), aspergilase, asper- miogenese, asma (por exemplo asma brônquica, asma brônquica, e asma autoimune), ataxia telangiectasia, esclerose atáxica, aterosclerose, autismo,

angioedema autoimune, anemia aplástica autoimune, gastrite atrófica autoi- mune, diabetes autoimune, doença autoimune do testículo e ovário, incluin-

do ooforite e orquite autoimune, distúrbios autoimunes, associadas com do- enças do colagênio, disautonomia autoimune, doença autoimune do ouvido

(por exemplo, doença autoimune do ouvido interno (envelhecidos)), doenças endócrinas autoimunes incluindo tiroidite como tiroidite autoimune, síndrome autoimune enteropatia, insuficiência gonadal autoimune, a perda auditiva autoimune, hemólise autoimune, hepatite autoimune, doença autoimune de hepatologia, hiperlipidemia autoimune, doença autoimune, imunodeficiência

—autoimune da orelha interna (AIED), miocardite autoimune, neutropenia auto- imune, pancreatite autoimune, Poliendocrinopatias autoimunes, síndrome poliglandular autoimune do tipo |, retinopatia autoimune, trombocitopênica púrpura autoimune (ATP), doença autoimune da tiroide, urticária autoimune, doenças gastrointestinais mediadas autoimune, neuropatias axonais e neu-

ronais, doença de Balo, doença de Behçet, dano de reperfusão de isquemia benigna e familiar, angiite linfocítica benigna, a doença de Berger (nefropatia por IgA), pulmão de pássaro apreciador, cegueira, doença de Boeck, bron- quiolite obliterante (sem transplante) vs NSIP, bronquite, aspergilase bron- copneumônica, síndrome de Bruton, penfigoide bolhoso, síndrome de Ca-

plan, Cardiomiopatia, isquemia cardiovascular, síndrome de Castleman, do- ença celíaca, doença celíaca (enteropatia de glúten), degeneração cerebe-

lar, isquemia cerebral e doenças de vascularização acompanhante, doença de Chagas, canalopatias (por exemplo, epilepsia), canalopatias do SNC, co- riorretinite, coroireferide, distúrbio hematológico autoimune, hepatite crônica ativa ou a hepatite crônica ativa autoimune, dermatite de contato crônica, pneumonia eosinofílica crônica, síndrome da fadiga crônica, hepatite crônica, pneumonite por hipersensibilidade crônica, artrite inflamatória crônica, poli- neuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), inflamação intratável crônica, candidíase mucocutânea crônica, neuropatia crônica (por exemplo,

polineuropatias IgM ou neuropatia mediada por IgM), doença obstrutiva crô- nica das vias aéreas, doença inflamatória pulmonar crônica, ostomielite mul- tifocal crônica recorrente (CRMO), tiroidite crônica (tiroidite de Hashimoto) ou tiroidite subaguda, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatrici- al/penfigoide benigna mucosal, doenças inflamatórias do SNC, vasculite do SNC, doença celíaca, síndrome Cogans, doença de aglutinina fria, poliposa colite, colite, tais como colite ulcerativa, colite ulcerosa, colite colagenosa,

condições que envolvem células T de infiltração e respostas inflamatórias crônicas, bloqueio cardíaco congênito, infecção da rubéola congênita, ane-

mia Coombs positiva, doença arterial coronariana, Coxsackie miocardite, síndrome CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud), doença de Crohn, cri- oglobulinemia, síndrome de Cushing, ciclite (por exemplo, ciclite crônica,

—heterocrônico ciclite, iridociclite, ou ciclite de Fuchs), fibrose cística, a toxici- dade induzida por citocinas, surdez, artrite degenerativa, doenças desmieli- nizantes (por exemplo, doenças autoimunes desmielinizantes), neuropatias desmielinizantes, dengue, dermatite herpetiforme e dermatite atópica, der- matite, incluindo dermatite de contato, dermatomiosite, dermatoses com componentes inflamatórias agudas, doença de Devic (neuromielite óptica), transtorno diabético artéria grande, nefropatia diabética, retinopatia diabéti-

ca, anemia Diamond Blackfan, fibrose pulmonar intersticial difusa, cardiomi- opatia dilatada, lúpus discoide, doenças envolvendo a diapedese de leucóci-

tos, síndrome de Dressler, contratura de Dupuytren, a infecção ecovirus, ec-

zema incluindo eczema alérgico ou atópico, encefalite, como a encefalite de Rasmussen e encefalite límbica e/ou do tronco encefálico, encefalomielite

(por exemplo, encefalomielite alérgica e encefalomielite alérgica experimen-

tal (EAE)), hiperplasia endarterial, endocarreferide, oftalmotia endócrina, en- dometrioses, endomiocardiofibrose, endoftalmia facoanafilática, endoftalmite,

enterite allergica, síndrome de eosinofilia-mialgia, eosinofílica faciitis, cerato- conjuntivite epidêmica, Epidermólise bolhosa adquirida (EBA), episclera, e- pisclerite infecção pelo vírus Epstein-Barr, Eritema elevada et diutinum, eri- tema multiforme, eritema nodoso hansênico, eritema nodoso, eritroblastose fetal, dismotilidade do esôfago, crioglobulinemia mista essencial, etmoide,

síndrome de Evan, encefalomielite alérgica Experimental (EAE), deficiência de Fator VIII, pulmão do fazendeiro, febre reumática, síndrome de Felty, fi- bromialgia, alveolite fibrosante, flariasis, glomeruloesclerose segmentar e focal (FSGS), intoxicação alimentar, frontal, atrofia gástrica, artrite de células gigantes (artrite temporal), hepatite de células gigantes, polimialgia de célu-

las gigantes, glomerulonefrites, glomerulonefrite (GN) com e sem síndrome nefrótica, como glomerulonefrite crônica ou aguda (por exemplo, GN primá-

ria), síndrome de Goodpasture, artrite gotosa, síndromes associada à trans- fusão de granulócitos, granulomatose incluindo granulomatose linfomatoide, granulomatose com poliangiite (GPA), uveite granulomatosa, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barre, psoríase gutatte, hemoglobinúria paro- xismática, doença de Hamman-Rich, doença de Hashimoto, encefalite de

Hashimoto, tiroireferide de Hashimoto, hemocromatose, anemia hemolítica ou anemia hemolítica imune, incluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), anemia hemolítica, hemofilia A, púrpura de Henoch-Schónlein, herpes ges- tacional, vírus da imunodeficiência humana (HIV), hiperalgesia, hipogama- globulinemia, hipogonadismo, hipoparatireoidismo, diabetes insipidus idiopá-

tica, paralisia facial idiopática, hipotireoidismo idiopática, púrpura nefropatia por IgA, nefropatia membranosa idiopática ou GN membranosa idiopática, síndrome nefrótica idiopática, fibrose pulmonar idiopática, sprue idiopática, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), nefropatia por IgA, doenças medi-

adas por IgE (por exemplo: anafilaxia e rinite alérgica e atópica), doença re-

lacionada com esclerosante IgGA4, ileite regionalis, nefrite do complexo imu- ne, as respostas imunitáriassociadas à hipersensibilidade mediada aguda e tardia por citocinas e linfócitos T, GN imune-mediada, lipoproteínas imunor- reguladoras, incluindo síndrome da angústia respiratória adulta ou aguda (ARDS), miosite de corpos de inclusão, artrite infecciosa, a infertilidade devi-

do aos anticorpos antiespermatozoanos, inflamação de toda ou parte da ú- vea, doença inflamatória do intestino (IBD) doenças inflamatórias hiperproli- ferativas da pele, miopatia inflamatória, diabetes idependente de nsulina (ti-

po 1), insulite, cistite intersticial, doença pulmonar intersticial, fibrose pulmo-

nar intersticial, irite, distúrbio de re-perfusão isquêmica, inflamação das arti-

culações, artrite juvenil, dermatomiosite juvenil, diabetes juvenil, com início na juventude (Tipo |), diabetes mellitus, incluindo diabetes mellitus depen- dente de insulina pediátrica (IDDM), aparecimento da artrite reumatoide ju-

venil, síndrome de Kawasaki, ceratoconjuntivite seca, kypanosomiasis, sín- drome de Lambert-Eaton, leishmaniose, lepra, leucopenia, deficiência de adesão de leucócitos, vasculite leucocitoclástica, leucopenia, líquen plano, líquen escleroso, conjuntivite lenhosa, dermatose por IgA linear, Linear do-

ençalgA(LAD), síndrome de Loffler, hepatite lúpica, lúpus (incluindo netfrite, cerebrite, pediátrica, não renal, extra-renal, discoide, alopecia), Lúpus (SLE),

o lúpus disseminado eritematoso, artrite de Lyme, doença de Lyme, pneu- monite intersticial linfoide, malária, infertilidade autoimune macho e fêmea, maxilar, vasculite meio navio (incluindo a doença de Kawasaki e poliartrite

—nodosa), GN proliferativa membrana ou membranosa (MPGN), incluindo Ti- po | e Tipo Il, e rapidamente GN progressiva, GN membranosa (nefropatia membranosa), doença de Méniêre, meningite, colite microscópica, poliangeí-

te microscópica, enxaqueca, alteração nefropatia mínima, doença mista do tecido conjuntivo (MCTD), mononucleose infecciosa, úlcera de Mooren, do-

ença de Mucha-Habermann, neuropatia motora multifocal, insuficiência en- dócrina múltipla, síndrome da lesão de múltiplos órgãos, tais como aqueles secundários a septicemia, trauma ou hemorragia, síndrome de lesão de múl- tiplos órgãos, esclerose múltipla (MS), tal como espino-MS óptica, esclerose múltipla, papeira, distúrbios musculares, tais como a miastenia grave timoma associada à miastenia grave, miastenia grave, miocardite, miosite, narcolep- sia, enterocolite necrosante, e colite transmural e doença intestinal inflamató-

ria autoimune, necrosante, cutânea ou vasculite de hipersensibilidade, sín- drome neonatal lúpus (NLE), nefrose, síndrome nefrótica, doença neurológi-

ca, neuromielite óptica (do Devic), neuromielite óptica, neuromiotonia, neu-

tropenia, linfocitose não cancerosos, uveiíte nongranulomatous, timoma não- malignas, distúrbios inflamatórios orbitais e oculares, penfigoide cicatricial ocular, ooforite, oftalmia simfática, síndrome opsoclonus myoclonus (OMS), síndrome opsoclonus ou opsoclonus myoclonus (OMS) e neuropatia senso-

rial, neurite óptica, orquite granulomatosa, artrose, reumatismo palíndromo,

pancreatite, pancitopenia, PANDAS (Distúrbios neuropsiquiátricos autoimune pediátricos associados com Streptococcus), degeneração cerebelar parane- oplásica, síndrome paraneoplásica, síndromes paraneoplásicas, incluindo síndromes paraneoplásicas neurológicas (por exemplo, síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou síndrome Eaton-Lambert), doenças parasitárias, tais como Lesihmania, hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), síndrome de Parry Romberg, pars planitis (uveiíte periférica), síndrome Parsonnage-

Turner, parvovirose, penfigoide como penfigoide penfigoide bolhoso e pele, pênfigo (incluindo pênfigo vulgaris), pênfigo eritematoso, pênfigo foliáceo, membrana penfigoide do muco pênfigo, pênfigo, úlcera péptica, paralisia periódica, neuropatia periférica, perivenosa encefalomielite, anemia pernicio-

sa (anemia perniciosa), anemia perniciosa, uveiíte facoantigênica, pneumo-

—nocirrose, síndrome POEMS, poliartrite nodosa, poliartrite crônica primária do tipo |, Il, e Ill, policondrite (por exemplo, policondrite refratária ou recor- rente), doenças autoimunes poliendócrinas, insuficiência poliendócrina, sín- dromes poliglandulares (por exemplo, síndromes poliglandulares autoimunes

(ou síndromes de endocrinopatia poliglandular)), polimialgia reumática, poli-

miosite, polimiosite/dermatomiosite, polineuropatias, poliradiculite acuta, sín- drome pós-cardiotomia, uveiíte posterior, ou uveiíte autoimune, síndrome de infarto pós-miocárdio, síndrome pós, nefrite pós-estreptocócica, síndromes pós-vacinação, demência pré-senil, cirrose biliar primária, hipotireoidismo primário, mixedema idiopática primária, linfocitose primário, que inclui linfoci-

tose monoclonal de células B (por exemplo, gamopatia monoclonal benigna e gmRNAopatia monoclonal de significado indeterminado, MGUS), mixede-

ma principal, MS progressiva primária (PPMS) e recidivante remitente (R- RMS), colangite esclerosante primária, progesterona dermatite, esclerose sistêmica progressiva, artrite proliferativa, psoríase, como a psoríase em placas, psoríase, artrite psoriática, Proteinose alveolar pulmonar, infiltração eosinofilia, anemia de células vermelhas pulmonar ou aplasia pura (PRCA), aplasia pura de glóbulos vermelhos, purulenta ou sinusite não purulenta, psoríase pustulosa e psoríase das unhas, pielitis, pioderma gangrenoso, ti- roireferide de Quervain, fenômeno de Raynaud, artrite reativa, aborto de re-

petição, redução na resposta da pressão arterial, distrofia simpático-reflexa, sprue refratária, doença de Reiter ou síndrome, policondrite recidivante, le- sões de reperfusão do miocárdio ou outra tecidos, lesão de reperfusão, sín-

drome de angústia respiratória, síndrome das pernas inquietas, autoimuni- dade retiniana, fibrose retroperitoneal, síndrome de Reynaud, doenças reu- máticas, febre reumática, reumatismo, artrite reumatoide, espondilite reuma- toide, infecção por vírus da rubéola, síndrome de Sampter, sarcoidose, es- quistossomose, síndrome Schmidt SCID e doençassociadas aos vírus Eps- tein-Barr, esclera, esclerite, esclerodatila, esclerodermia (incluindo esclero- dermia sistêmica), colangite esclerosante, esclerose disseminada, esclerose, como esclerose sistêmica, perda auditiva sensoneural, espondilaartrite soro- negativo, síndrome de Sheehan, síndrome de Shulman, silicose, síndrome de Sjogren A, esperma e autoimunidade testicular, sinusite esfenoidal, sín- drome de Stevens-Johnson, dura homem (ou dura pessoa) síndrome, endo- carreferide bacteriana subaguda (SBE), lúpus eritematoso cutâneo subagu- do, perda auditiva súbita, síndrome de Susac, coréia de Sidenham, Simpáti- co oftalmia, lúpus eritematoso sistêmico (SLE) ou lúpus eritematoso sistêmi- co (por exemplo, o SLEcutâneo), vasculite necrosante sistêmica e vasculite associada ao ANCA, como Churg-Strauss, vasculite ou síndrome (CSS)), tabes dorsalis, arterite de Takayasu, telangiectasia, arterite temporal/arterite de células gigantes, tromboangite ubiterans, trombocitopenia (por exemplo desenvolvida por pacientes com infarto do miocárdio), incluindo púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) e trombocitopenia autoimune ou imune mediada como púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), incluindo ITP crô- nica ou aguda, púrpura trombocitopênica (TTP), tireotoxicose, lesão tecidual, síndrome de Tolosa-Hunt, necrôlise epidérmica tóxica, síndrome tóxico- choque, reação transfusional, hipogamaglobulinemia transitória da infância, mielite transversa, travessia mielite, tropical eosinofilia pulmonar, tuberculo- se, colite ulcerativa, indiferenciada doença do tecido conjuntivo (UCTD), urti- cária (por exemplo, urticária alérgica crônica e urticária idiopática crônica, incluindo urticária autoimune crônica), uveite (por exemplo, a uveite anteri- or), uveoretinite, valvulite, disfunção vascular, vasculite, artrite vertebral, ve- sicular dermatose, vitiligo, granulomatose de Wegener (agora denominado granulomatose com Poliangeíte (GPA), síndrome de Wiskott-Aldrich, ou a síndrome do IgM hiper ligado a X.

Os anticorpos KIR2DL1, 2 e/ou 3 descritos na presente invenção podem ser usados nas composições, usos e métodos para o tratamento de condições inflamatórias e doença inflamatória.

As condições inflamatórias e doença inflamatória, incluem, mas não estão limitadas às doenças reumáticas (por exemplo, a artrite reumatoi- de, osteoartrite, artrite psoriática), espondiloartropatias (por exemplo, espon- dilite anquilasante, artrite reativa, síndrome de Reiter), artropatias de cristal (por exemplo, gota, pseudogota, pirofosfato de cálcio, doença de deposição), esclerose múltipla, doença de Lyme, polimialgia reumática; doenças do teci- do conjuntivo (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose sistêmi- ca, polimiosite, dermatomiosite, síndrome de Sjogren), vasculites (por exem- plo, poliartrite nodosa, granulomatose de Wegener, síndrome de Churg- Strauss); condições inflamatórias, incluindo consequências de trauma ou isquemia, sarcoidose, doenças vasculares, incluindo doença vascular ate- —rosclerótica, aterosclerose e doença vascular obstrutiva (por exemplo, ate- rosclerose, doença isquêmica cardíaca, enfarte do miocárdio, acidentes vas- culares cerebrais, periféricos), stent vascular, doenças oculares, incluindo uveíite, doença da córnea, irite, iridociclite, catarata. Condições inflamatórios também inclui, mas não estão limitados aácidorefluxo/azia, acne, acne vulgar, alergias e sensibilidades, doença de Alzheimer, asma, aterosclerose e doenças vasculares oclusivas (por exem- plo, aterosclerose, doença isquêmica cardíaca, enfarte do miocárdio, aciden- tes vasculares cerebrais, periféricos) e stent vascular, doenças autoimunes, bronquite, câncer, carreferide, catarata, doença celíaca, dor crônica, prostati- te crônica, cirrose, colite, doenças do tecido conjuntivo (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose sistêmica, polimiosite, dermatomiosite, sín- drome de Sjogren), doença da córnea, doença de Crohn, artropatias Cristal (por exemplo, Gota, Pseudogota pirofosfato de cálcio, doença de deposi- ção), Demência, Dermatite, Diabetes, olhos secos, eczema, edema, enfise- ma, fibromialgia, gastroenterite, gengivite, glomerulonefrite, doença cardíaca, hepatite, pressão arterial alta, hipersensibilidades, doenças inflamatórias intestinais, condições inflamatórias, incluindo consequências do trauma ou isquemia, resistência à insulina, a cistite intersticial, Iridociclite, irite, dor nas articulações/Artrite/artrite reumatoide, doença de Lyme, síndrome metabólica (síndrome X), Esclerose Múltipla, miosite, nefrite, obesidade, doenças ocula- res, incluindo uveite, Osteopenia, A osteoporose, doença de Parkinson, do- ença inflamatória pélvica, doença periodontal, poliarterite, Policondrite, poli- mialgia reumática, psoríase, lesões de reperfusão, artrite reumática, doenças reumáticas (por exemplo, artrite reumatoide, osteoartrite, artrite psoriática), artrite reumatoide, sarcoidose, Esclerodermia, Sinusite, Síndrome de Sjógren, cólon espástico, espondiloartropatias (por exemplo, espondilite an- quilasante, artrite reativa, síndrome de Reiter), candidíase sistêmica, Tendi- nite, Transplante Rejeição, UTI, vaginite, Doenças Vasculares incluindo a doença aterosclerótica vascular, vasculites (por exemplo, poliarterite nodosa, granulomatose de Wegener, Churg-Strauss), e vasculite.

O termo "tratamento " usado na presente invenção refere-se a entrega de uma quantidade eficaz de uma tal formulação com o propósito de prevenir sintomas de doença ou estado a desenvolver ou com o objetivo de prevenir (por exemplo, a prevenção ou adiamento de progressão), aliviando, melhorando ou erradicando (curando) tais sintomas ou estados de doença já desenvolvida.

O termo "tratamento" é, portanto, pretendido incluir o trata- mento de doença mínima ou não detectável, por exemplo, em um indivíduo tendo experimentado uma resposta ao tratamento, após um primeiro trata- mento, ou o tratamento de uma fase estabelecida e/ou aguda.

A liberação dos anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 para um indi- víduo (quer por meio da administração direta ou expressão de um ácido nu- cleiconomesmo, tal como a partir de um vetor de transferência de gene pox virai que compreende a sequência de anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 que codifica o (s) ácido (s) nucleico (s)) e praticando os outros métodos da pre- sente invenção podem ser usados para a finalidade de prevenção (por e- xemplo, a prevenção ou adiamento de progressão), aliviando, melhorando, ou erradicando (curando) tais sintomas ou estados de doença já desenvolvi do.

Os métodos da presente invenção podem ser particularmente úteis na redução e/ou melhoramento da atividade de células T, a proliferação ou o número (por exemplo, número de células T pró-inflamatórias ativadas (eg células T CD4 +, o HLA-Cw3 e/ou HLA-cw4-positivo de células T) em circulação ou em um local de inflamação), ou qualquer parâmetro ou sintoma associado com o mesmo (por exemplo, níveis de marcadores de inflama- ção). Os métodos que reduzem, impedir ou atenuar tais aspectos de distúr- bios inflamatórias ou autoimunes, de forma independente e colectivamente, são as características vantajosas da presente invenção. Tal como usado na presente invenção, " células T " refere-se a uma sub-população de linfócitos que amadurecem no timo, e que exibem, entre outras moléculas de recepto- res de células T na superfície das mesmas. As células T podem ser identifi- cados em virtude de certas características e as propriedades biológicas, tais como a expressão de antigênios de superfície específicos, incluindo o TCR, CD4 ou CD8, a capacidade de certas células T para matar células tumorais ouinfectadas, a capacidade de certas células T ativar outras células do sis- tema imunológico, e a capacidade de libertar as moléculas de proteína dila- taçãodos citocinas que estimulam ou inibem a resposta imunitária. Qualquer uma destas características e atividades podem ser usadas para identificar as células T, utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Dentro do contex- toda presente invenção, as células T " ativos " ou " ativado " designa as cé- lulas T, células T biologicamente ativas, mais particularmente, possuindo a capacidade de citólise ou de estimular uma resposta imunitária por exemplo, por secreção de citocinas. Células ativo pode ser detectado em qualquer um de uma série de métodos bem conhecidos, incluindo os ensaios funcionais e ensaios com bases em expressão, tais como a expressão de citoquinas, tais como TNF-alfa.

Os métodos para o tratamento de um indivíduo com uma doença autoimune ou inflamatória, pode compreender a administração ao indivíduo de um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. Em uma modalidade, o indivíduo tendo uma doença autoimune ou inflamatória que tem sido estabelecida (por exemplo, sido declarada por um período de tempo prolongado, por exemplo mais de um ano), tem sinais de inflamação em curso ou ativos, tem sinais físicos da doença (por exemplo inchaço das articulações, lesões, sintomas neurológicos), tem uma doença crônica, não tem doença grave (avaliada por critérios aplicáveis , por exemplo, critérios DAS ou ACR na artrite reumatoi- de) ou tem a doença progredindo, Os métodos para o tratamento de um indivíduo com uma doença autoimune ou inflamatória estabelecida, pode compreender a administração ao indivíduo de um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. A presente invenção proporciona métodos para o tratamento da fase aguda, ou de um ataque, crise, exacerbação ou alargamento, de doenças autoimunes ou inflamatórias usando um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 (ou composições relacionadas), em que de preferência o anticorpo é administrado a um indivíduo, durante a fase aguda ou durante um ataque, crise, exacerbação ou alargamento de uma doença autoimune ou inflamatória. A doença pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, artrite juvenil idiopática, esclerose múltipla, doença de Crohn ou retocolite, lúpus eritematoso, espon- dilite anquilasante e doenças relacionadas. Em uma modalidade, a doença é caracterizada pela presença de células que expressam anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 do ligante (por exemplo, HLA-CW3 ou HLA-cw4), de preferência com a presença de células T CD4 + que expressam HLA-cw3 e/ou HLA-cw4. A do- ença é caracterizada pela presença de níveis detectáveis de uma enzima proteolítica, um mediador inflamatório, um marcador de inflamação em pro- gresso ou uma citocina pró-inflamatória (por exemplo, TNF-a e/ou interleuci- na-1 (IL-1)).

O diagnóstico, evolução e classificação da doença (ou preparo) pode ser definido por meio dos critérios médicos padrão para o tipo específi- co da doença, a fim de determinar se um indivíduo tem a doença que está estabelecido, está em fase aguda, está progredindo, é crônica, tem sintomas físicos, ou de um certo nível de gravidade. Da mesma forma, ataque, crise, exacerbação ou dilatação podem ser identificados por quaisquer critérios médicos adequados.

Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 podem ser vantajosamen- te usados no tratamento da doença estabelecida. " Doença estabelecida"

refere-se a uma doença autoimune ou inflamatória, que tem sido declarado por um período prolongado de tempo, por exemplo, mais do que um ano. Dependendo da doença específica, doença estabelecida também significa uma doença, que não é controlada por exemplo, que ainda está a decorrer, ouparaoqualo paciente não experimente remissão, na presença ou na au- sência de um tratamento. Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de uma doença autoimune ou inflamatória em um paciente, que compreende: (a) determinar se o referido paciente tem uma doença estabelecida, e (b) se o referido paciente tem uma doença es- tabelecida, a administração a referido paciente de uma dose eficaz de anti- corpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 podem também ser usa- dos vantajosamente para o tratamento de doença crônica. " Doença crônica " refere-se a uma doença, que persiste por um período prolongado de tem- po.Por exemplo, uma doença crônica pode ser uma doença com duração de 3 meses ou mais, conforme definido pelo National Center for Health Statis- tics EUA. Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de uma doença autoimune ou inflamatória em um paciente, que compreende: (a) determinar se o referido paciente tem uma doença crônica, e(b)seoreferido paciente tem doenças crônicas, a administração ao referi- do paciente uma dose eficaz de anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

O anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 também pode ser vantajo- samente usado para tratar indivíduos que possuem um ataque, crise, exa- cerbação ou dilatação. Os termos " ataque", " crise ", " exacerbação "e" dilatação", designar uma evolução mais rápida de novos sintomas ou agra- vamento dos sintomas antigos relacionados a uma doença inflamatória ou uma doença autoimune. Tais fases passadas por um período de horas ou dias, ao contrário de uma lenta progressão da doença, que ocorre ao longo de meses e anos. Durante esses ataques, o paciente demonstra febre, dor, síndrome inflamatória (síndrome gripal). Na RA, as articulações do paciente estão inchadas e dolorosas. O paciente pode experimentar síndromes gri- pais. Uma crise pode durar desde algumas horas até várias semanas. Na esclerose múltipla, a dilatação pode caracterizar um novo sintoma ou o a- gravamento de um sintoma existente, mas deve durar pelo menos 24 horas para ser considerado um verdadeiro exacerbação, a dilatação-se denota formando novas lesões no cérebro ou na medula espinhal que interromper a transmissão neural. A maioria das crises durar alguns dias ou semanas, mas pode durar vários meses. Os efeitos podem ser por exemplo: dificuldades de movimento ou espasmos, problemas de equilíbrio e coordenação, problemas de visão, movimentos oculares sem coordenação, visão turva ou visão du- pla, cegueira parcial durante um flare-up, bexiga e sintomas intestinais, pro- blemas sexuais, mudanças na função mental: perda de memória, desaten- ção e mau julgamento ou depressão. Na doença de Crohn ou retocolite, a dilatação-se, principalmente, é a exacerbação dos sintomas da doença de Crohn habitual: diarréia, dor abdominal tipo cólica, febre, perda de apetite. Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para o trata- mento de uma doença autoimune ou inflamatória em um paciente, que com- preende: (a) determinar se o referido paciente está experimentando um ata- que, crise, exacerbação ou dilatação, (b), se o referido paciente experimenta um ataque, crise, exacerbação ou dilatação, a administração ao referido pa- ciente de uma dose eficaz de anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 podem também ser vanta- josamente usados para o tratamento de indivíduos que têm uma recaída. O termo " recaída " refere-se à estabilização ou melhoria dos sintomas de um paciente. A doença é recorrente quando a saúde ou a condição do paciente melhorar. Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para otratamento de uma doença autoimune ou inflamatória em um paciente, que compreende: (a) determinar se o referido paciente está passando por uma recaída, crise, exacerbação ou dilatação, (b), se o referido paciente experi- menta uma recaída, a administração ao referido paciente de uma dose efi- caz de anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Opcionalmente, a etapa de detecção de HLA-cw3 e/ou HLA-cw4 pode ser realizada, que compreende a detecção da presença de um HLA- cw3 e/ou HLA-cw4 em um paciente, antes do tratamento com um anticorpo anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. Geralmente, nesta etapa, a amostra bioló- gica é feita a partir de um paciente, por exemplo, uma amostra de fluido si- novial, por exemplo em um paciente com artrite reumatoide.

A amostra bio- lógica é avaliada para a presença de polipetídeo ou ácido nucleico de HLA- cw3elouHLA-cw4. Se a amostra biológica é positivo para a presença de HLA-cw3 e/ou HLA-cw4, o paciente pode, então, ser vantajosamente tratado com Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. O anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 é usado como monoterapia (o único agente terapêutico). Os métodos de tratamento da presente inven- ção podem ainda compreender o tratamento de um indivíduo com um anti- corpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 e um segundo agente terapêutico, incluindo agentes normalmente usados para o efeito terapêutico particular para o qual o anticorpo é administrado.

O anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 e o segundo agente terapêutico podem ser administrados separadamente, em conjunto ou sequencialmente, ou de um coquetel.

O segundo agente terapêutico será normalmente administrado em quantidades normalmente usadas para esse agente, em uma monoterapia para a doença ou condição particular a ser tratada.

Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é administrado em uma dose inferior à dose eficaz geralmente aceitáveis, por exemplo, em várias modalidades, a composição compreende uma dose que é inferior a cerca de 10% a 75% da dose eficaz é geralmente aceite administrada.

De preferência, o segundo agente terapêutico é um agente que reduz as enzi- mas proteolíticas, de um mediador inflamatório, ou uma citoquina pró- inflamatória tal como TNF-a e/ou interleucina-1 (IL-1). De preferência, o se- gundo agente terapêutico é um DMARD ou DMD, ainda opcionalmente, em que o segundo agente terapêutico é o metotrexato (Rheumatrex O, Trexall O), hidroxicloroquina (Plaquenil &), sulfassalazina (Azulfidina &), leflunomida (Arava O), uma necrose tumoral inibidor do fator (por exemplo, um receptor de TNF solúvel, tais como o etanercept (Enbrel &), um grupo (anticorpo neu- tralizante de preferência não descartável) com anti-TNF, tais como adalimu- mab (Humira &) ou certolizumab certolizumab (Cimzia &)), um coestimulador das células T bloqueando agente (por exemplo abatacepte (Orencia O),),

uma interleucina-1 (IL-1), a terapia antagonista do receptor (anakinra (Kine- ret O),), um anticorpo anti-BIlyS (Benlysta &), um inibidor de proteassoma (por exemplo, bortezomib), uma tirosina inibidor de quinase, ouro intramus- cular, ou outro agente citotóxico ou imunomoduladores (por exemplo, azatio- prina (Imuran O), ciclofosfamida, ciclosporina A (Neoral O, Sandimmune &)) ou um inibidor da quinase (por exemplo, um inibidor da quinase SIK como fostimatinib (R788) ou de um JAK1, JAK2, tais como inibidores INCB28050, tanezumab ou tasocitinib (CP-690, 550)). O anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 é administrado antes da ad- ministração do segundo agente terapêutico. Por exemplo, um anticorpo anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado cerca de O a 30 dias antes da ad- ministração do segundo agente terapêutico. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 é administrado a partir de cerca de 30 mi- nutos para cerca de 2 semanas, cerca de 30 minutos a cerca de 1 semana, de cerca de 1 hora até cerca de 2 horas, a partir de cerca de 2 horas até cerca 4 horas, a partir de cerca de 4 horas até cerca de 6 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 8 horas, desde cerca de 8 horas a 1 dia, ou de cerca de 1 a 5 dias antes da administração do segundo agente terapêutico. Em algu- mas modalidades, o anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 é administrado simul- taneamente com a administração dos agentes terapêuticos. O anticorpo anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3 é administrado após a administração do segundo agente terapêutico. Por exemplo, um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser administrado cerca de O a 30 dias após a administração do segundo agente terapêutico. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 é administrado a partir de cerca de 30 minutos para cerca de 2 semanas, cerca de 30 minutos a cerca de 1 semana, de cerca de 1 hora até cerca de 2 horas, a partir de cerca de 2 horas até cerca 4 horas, a partir de cerca de 4 horas até cerca de 6 horas, de cerca de 6 horas a cerca de 8 horas, desde cerca de 8 horas a 1 dia, ou de cerca de 1 a 5 dias após a administração do segundo agente terapêutico.

A composição pode ainda compreender, pelo menos, um agente anti-inflamatório, analgésico, ou modificadores da doença de fármacos antir-

reumáticos (DMARD).

O agente anti-inflamatório pode ser selecionado de entre o grupo constituído por esteroides, glucocorticoides, cortisona, prednisona, predniso- lona, hidrocortisona (cortisol), acetato de cortisona, metilprednisolona, de- xametasona, betametasona, triamcinolona, beclometasona, acetato de flu- drocortisona e, fármacos não esteroidais anti-inflamatórios (NSAIDs), ibupro- feno, naproxeno, meloxicam, etodolac, nabumetona, sulindac, tolementin, salicilato de colina de magnésio, diclofenac, diflusinal, indometicin, cetopro- feno, Oxaprozin, piroxicam e nimesulide, salicilatos, aspirina (ácido acetilsa- licílico), diflunisal, salsalato, derivados de p-amino fenol, paracetamol, fena- cetina, derivados de ácido propiônico, ibuprofeno, naproxeno, fenoprofeno, cetoprofeno, oxaprozin, Flurbiprofeno, loxoprofeno, derivados de ácido acéti- co, indometacina, sulindac, etodolac, cetorolac, diclofenac, Nabumetone, ácido enólico derivados (oxicamo), piroxicam, meloxicam, tenoxicam, Droxi- cam, olornoxicam, isoxicam, derivados do ácido fenâmico (fenamatos), áci- do mefenâmico, ácido meclofenâmico, ácido flufenâmico, ácido tolfenâmico, inibidores seletivos da COX-2 (coxibes), celecoxib, rofecoxib, valdecoxib, parecoxib, lumiracoxib, etoricoxib, Firocoxib, Sulfonanilidas, nimesulida, e Licofelone.

A artrite reumatoide A artrite reumatoide (RA) é uma doença inflamatória crônica e, normalmente progressiva em que a membrana sinovial, o principal local de inflamação. A destruição óssea ocorre com a progressão da inflamação, o que resulta na deformação ou dano de ossos e cartilagens. A artrite reuma- toide (RA) avança em etapas. A primeira etapa é a expansão do revestimen- to sinovial, causando dor, calor, rigidez, vermelhidão e inchaço em torno da articulação. O segundo é a rápida divisão e o crescimento das células, ou pannus, que faz com que a membrana sinovial para engrossar. Na terceira fase, as células inflamadas liberar as enzimas que podem digerir o osso e cartilagem, causando frequentemente a articulação envolvida a perder a sua forma e alinhamento, mais dor, e perda de movimento. Um paciente afetado com a doença pode ter um período de remissão, sem dor, e, em seguida,

uma crise da artrite reumatoide, também denominada alargamento ou de ataque, em que a dor aumenta. Os métodos de acordo com a presente in- venção propõe tratar tal paciente passando por uma crise para ajudá-los a lidar com a dor.

O grau da doença RA pode ser avaliado usando vários critérios. Os critérios mais conhecidos foram estabelecidos pelo ACR (American Col- lege of Rhneumatology). Critérios do ACR são indicados como ACR 20, ACR 50 e ACR 70. A melhoria da medida dos critérios ACR nas contages das jun- tas inchadas e melhoria em três das cinco seguintes parâmetros: reagente de fase aguda (como taxa de sedimentação), avaliação do paciente, avalia- ção do médico, escala de dor e incapacidade/questionário funcional. A gravidade da doença também pode ser medida por meio de uma pontuação conhecido como DAS (Pontuação da Atividade da Doença). DAS é um índice composto da atividade RA elaborado pela EULAR (Liga européia contra o reumatismo) desenvolvido inicialmente para 44 juntas para o número de articulações com sinovite e os 53 índices dos locais Ritchie. DAS é calculado de acordo com a seguinte fórmula: DAS = [0,553938 Y índice de Richie] + [0,06465 V (número de ar- ticulações com sinovite)] + [0,330 Ln (taxa de sedimentação de eritrócitos)] + 0,024 Índice de Ritchie cobre 53 articulações: temporomandibular, a- cromioclavicular, Esternocostoclavicular, ombro, cotovelo, punho, metacar- pofalângica (MCP), proximal interfalângica (PIP) nos dedos das mãos, qua- dril, joelho, tornozelo, subtalar, transversa do tarso, e metatarsofalangeal (MTP). Três níveis de atividade foram definidos de acordo com o valor do DAS: RA com baixo nível de atividade DAS < 2,4, moderada ativo RA 2,4 < DAS < 3.7, RA ativa > 3.7. Valor limite definido para remissão DAS é < 1.6. O objetivo principal dos métodos de tratamento de acordo com a presente invenção é para controlar a atividade da doença e, também, para atingir a remissão, reduzir a dor, prevenir e controlar a destruição das articu- lações e evitar a perda de função em atividades diárias e no trabalho e oti-

mizar a qualidade de vida do paciente.

Opções atuais de tratamento As recomendações correntes para o tratamento de RA incluem o tratamento precoce com modificadores da doença de fármacos antirreumáti- cos (DMARDs) após o diagnóstico ter sido estabelecido.

Fármacos anti- inflamatórios não esteroides (AINE), e, até recentemente, os inibidores de COX-2 têm sido amplamente usados, enquanto espera para confirmar o di- agnóstico ou mais tarde no curso da doença em conjunto com DMARDs.

O DMARD metotrexato é mais amplamente usados, mas outros agentes, inclu- indo hidroxicloroquina, sulfasalazina, ouro, minociclina, e leflunomida, são também prescritos.

Os corticosteroides podem ser usados em combinação com DMARDs, mas, em geral, apenas são usadas doses baixas para mini- mizar os eventos adversos (O'Dell, New Engl.

J.

Med.

Chem. 350: 2591 a 2603, 2004). Nos últimos anos, as terapias anticitocinas objetivo citocinas inflamatórias têm recebido atenção, e os novos produtos bioFarmacêuticos com ações eficazes antirreumáticos, tais como o infliximab, etanercept, ana- kinra e atlizumab, têm sido desenvolvidos.

No entanto, não existe atualmen- te nenhum tratamento totalmente eficaz e continua a haver uma necessidade de um tratamento eficaz da doença, e de melhoria do conforto do paciente e oalívioda dor e terapias alternativas são necessários para melhorar a vida quotidiana do paciente.

Alguns dos principais tratamentos são revistos abai- xo.

Os agentes anti-inflamatórios não-esteroides (NSAIDs). Estes fármacos inibem a produção de prostaglandinas por enzimas de bloqueio da ciclo-oxigenase, COX-1 e COX-2. As prostaglandinas são mediadores da inflamação e dor, mas também tem um papel importante na manutenção das funções normais do corpo, incluindo proteção contra o ácido do estômago, a manutenção do fluxo sanguíneo renal, e contribuindo para a aderência de plaquetas e função vascular.

COX-2 inibidores seletivos bloquear seletiva- mente prostaglandinas geradas via COX-2, que têm papéis importantes na inflamação.

Muitos AINEs diferentes estão disponíveis, alguns de balcão, incluindo a aspirina, ibuprofeno (Advil O, Motrin O, Nuprin O) e naproxeno

(Alleve &) e muitos outros estão disponíveis pela prescrição, incluindo melo- xicam (Mobic &), etodolaco (Lodine &), nabumetona (Relafen &), sulindac (Clinoril &), tolementin (Tolectin &), salicilato de colina de magnésio (Trilasa- te O), o diclofenac (Cataflam O, Voltaren O, Arthrotec &), Diflusinal (Dolobid O), indometicin (Indocin O) O cetoprofeno (Orrudis &, Orruvail O), Oxaprozin (Daypro &), e piroxicam (Feldene &). Mais agindo NSAIDs que permitem a dosagem diária ou duas vezes por dia pode melhorar a aderência. A classe de AINE também inclui fármacos conhecidas como inibidores de COX-2, que também são eficazes no controle da inflamação (celecoxib, Celebrex &; eto- ricoxib, Arcoxia &; lumiracoxib, Prexige O).

Os corticosteroides (prednisona; metilprenisolone, Medrol &) têm atividade tanto anti-inflamatória quanto imuno-reguladora. Eles podem ser administrados por via oral, intravenosa, intramuscular, ou podem ser injeta- dos diretamente na articulação. Os corticosteroides são úteis no início da doença, como terapia adjuvante temporário enquanto espera por DMARDs para exercer os seus efeitos anti-inflamatórios. Os corticosteroides também são úteis como terapia adjuvante crônica em pacientes com doença grave que não está bem controlada em AINEs e DMARDs. A dose habitual é de prednisona 5 a 10 mg por dia. Apesar de prednisona pode ser iniciado com doses mais elevadas (15 a 20 mg por dia), devem ser feitas tentativas para reduzir a dose durante algumas semanas para menos de 10 mg por dia. Uma vez iniciada, a terapia corticosteroide pode ser muito difícil a desconti- nuar e mesmo em doses baixas. Alguns pacientes são muito sensíveis ao afilamento de prednisona, que é geralmente feito lentamente, ao longo de algumas semanas.

Os modificadores dos fármacos da doença anti-reumática (DMARDs): Embora ambos os NSAIDs e agentes DMARD melhoram os sin- tomas da artrite reumatoide ativa, apenas agentes DMARD foram mostrados para alterar o curso da doença e melhorar os resultados radiográficos.

—“DMARDs tem um efeito sobre a artrite reumatoide, que é diferente e pode ser mais demorado do que no início, tanto NSAIDs quanto corticosteroides. Na maioria dos casos, quando o diagnóstico de artrite reumatoide é confir-

mado, agentes DMARD devem ser iniciados.

A presença de erosões ou jun- tas do espaço articular em radiografias das articulações envolvidas é uma clara indicação para a terapia DMARD, no entanto, não se deve esperar mu- danças de raios-x para ocorrer.

Os fármacos atualmente disponíveis inclu- em: Metotrexato (Rheumatrex O, Trexall &), hidroxicloroquina (Plaquenil O), sulfassalazina (Azulfidine &), leflunomida (Arava &), fator de necrose tumoral inibidores-etanercept (Enbrel O, adalimumabe (Humira &), e infliximab (Re- micade &), coestimulador das células T dos agentes bloqueadores abata- cepte (Orencia O), agentes de esgotar células B-rituximab (Rituxan &), inter- leucina-1 (IL-1) Receptor Antagonist Terapia anakinra (Kineret O), intramus- cular ouro, Outros agentes citotóxicos e imunomoduladora-azatioprina (Imu-

ran O), ciclofosfamida e ciclosporina A (Neoral O, Sandimmune O). O metotrexato é agora considerado o agente DMARD de primei- ra linha para a maioria dos pacientes com RA.

Ele tem um início de ação relativamente rápido em doses terapêuticas (6-8 semanas), boa eficácia, perfil de toxicidade favorável, facilidade de administração, e de custo relati- vamente baixo.

O metotrexato é eficaz na redução dos sinais e sintomas de RA, assim como retardar ou interromper dano radiográfico.

O metotrexato também é eficaz em muitas outras formas de artrite inflamatória, incluindo a artrite psoriática e outros espondilaartopatias, e é usada em muitas outras doenças autoimunes.

Dosagem: Em um estudo comparando o metotrexato para o etanercept no início de RA, metotrexato foi iniciado com uma dose de 10 mg por semana, e aumentou para 20 mg por semana, por oito semanas.

Este regime ou regimes que começam em doses ainda mais elevadas (até 15 mg por semana), com um aumento da dose para 20 mg nos primeiros três meses de dosagem está agora muito bem aceito na prática clínica.

Dose máxima é normalmente de 25 mg por semana, mas, por vezes, ser de novo aumentada.

O metotrexato pode ser administrado por via oral ou por meio da injeção subcutânea.

A última via de administração pode ser vantajoso para pacientes que tenham metotrexato associada a náusea.

Os pacientes inicia- dos com metotrexato devem ser cuidadosamente avaliados por insuficiência renal, doença hepática aguda ou crônica, a ingestão de álcool significativo ou abuso de álcool, leucopenia (contagens baixas de glóbulos brancos), trombocitopenia (baixa contagem de plaquetas), ou deficiência de folato não tratada. A co-administração de AINEs com metotrexato não é de rotina em pacientes com artrite reumatoide e é considerada segura pelos reumatolo- gistas, enquanto os testes de função hepática são monitoradas de perto. Metotrexato podem ser combinados de forma segura com quase todos os outros DMARDs aprovados pela FDA para RA, incluindo sulfassalazina, hi- droxicloroquina, inibidores de TNF, abatacept, rituximab, anakinra e lefluno- mida. Em todos os ensaios clínicos que combinam o metotrexato, com uma destas DMARDs, sem toxicidade ou toxicidades sinérgicos inesperados fo- ram observados com a exceção de maior toxicidade hepática com leflunomi- da, que também é metabolizada pelo fígado.

A hidroxicloroquina ou cloroquina são fármacos antimaláricos que são agentes relativamente seguros e bem tolerados para o tratamento de artrite reumatoide. Porque estes fármacos têm uma capacidade limitada para evitar lesões articulares por conta própria, o seu uso deve, provavel- mente, ser limitado a pacientes com doença muito leve e não erosiva. A hi- droxicloroquina é às vezes combinado com metotrexato para benefícios adi- tivos para sinais e sintomas ou como parte de um regime de " terapia tripla " com metotrexato e sulfassalazina.

A sulfasalazina (Azulfidina O) é um DMARD eficaz para o trata- mento da RA. É dado em conjunto com o metotrexato e hidroxicloroquina, como parte de um regime de " terapia tripla ", que tem sido mostrado para fornecer benefícios para os pacientes que tiveram resposta inadequada ao metotrexato. A sulfassalazina é também usado no tratamento da doença in- flamatória do intestino e espondiloartropatia. Seu mecanismo de ação na RA é desconhecida. Alguns desses efeitos podem ser devidos à depleção de folato. Dosagem: a dose habitual é de 2 a 3 gramas por dia em um regime de dosagem de duas vezes por dia. A dose pode ser iniciada com 1 grama pordia,e aumentada como tolerado.

A leflunomida (Arava O) é também um DMARD eficaz. Sua efi- cácia é semelhante ao metotrexato, em termos de sinais e sintomas, e é uma alternativa viável para pacientes que falharam ou são intolerantes ao metotrexato.

A leflunomida foi demonstrado para retardar a progressão ra- diográfica.

Estudos têm demonstrado que os mesmos também podem ser cuidadosamente combinados com o metotrexato em pacientes com doença de fígado não pré-existentes, enquanto os testes de função hepática são cuidadosamente monitorizados.

A leflunomida foi também estudada em artri- te psoriática, com alguma eficácia demonstrada.

Dosagem: A meia-vida do metabólito ativo da leflunomida é muito longo.

Leflunomida e seus metabóli- tos são extensivamente ligado às proteínas e sofrer ainda mais o metabolis- mo antes da excreção.

Quando inicialmente aprovado, o fármaco foi admi- nistrado utilizando-se uma dose de 100 mg por dia durante três dias, em se- guida, seguidos por 20 mg diários.

Devido a uma significativa incidência de efeitos colaterais gastrointestinais e diarréia, a maioria dos praticantes usam agora um período de carregamento mais curtos com doses mais baixas ou iniciar o tratamento em 10-20 mg/dia, sem dose de carga.

A dose pode ser reduzida para 10 mg por dia, se não tolerada em uma dose de 20 mg.

Inibidores do fator tumoral da necrose (TNF). TNF é encontrado em grandes quantidades na articulação artrite e é produzido localmente na articulação sinovial por macrôfagos e linfócitos que infiltram a sinóvia articu- lar O TNF é uma das citocinas críticas que medeiam os danos e destruição das articulações, devido às suas atividades em muitas células em articula- ção, bem como os efeitos sobre outros órgãos e sistemas do corpo.

Os an- tagonistas de TNF foram os primeiros dos DMARDs biológicos a serem a- provados para o tratamento da RA e também têm sido referidos como modi- ficadores de resposta biológica ou " agentes biológicos " para diferenciá-las dos outros DMARDs, tais como metotrexato, leflunomida, sulfassalazina.

Três antagonistas do TNF estão aprovados para o tratamento da RA e agen- tes adicionais estão sob investigação.

Estes fármacos são semelhantes na sua eficácia em reduzir os sinais e sintomas de RA, retardar ou interromper dano radiográfico, e melhoria da função e da qualidade de vida.

Estes agen- tes também estão agora aprovados para o tratamento de outras formas de artrite inflamatória, incluindo a artrite psoriática, artrite idiopática juvenil e espondilite anquilasante. Atualmente, existem três inibidores de TNF apro- vado pela FDA para o tratamento da RA (listados em ordem de sua aprova- ção para RA), etanercept (Enbrel &), inflixóimab (Remicade O) e adalimuma- be (Humira O).

O etanercept (Enbrel &) é eficaz na redução dos sinais e sinto- mas de RA, bem como para retardar ou interromper dano radiográfico, quando usado quer como monoterapia ou em combinação com metotrexato. Etanercept é também aprovado para o tratamento da artrite psoriática e es- pondilite anquilasante, bem como a psoríase. Etanercept é uma proteína de fusão que combina dois domínios extracelulares de ligação a forma do re- ceptor do TNF com a porção Fc de uma molécula de IgG1 humana anticorpo p75. Os componentes da proteína são totalmente humanos, e Os anticorpos anti-etanercept são relativamente raros. Dosagem: A dose mais comum u- sada atualmente é de 50 mg autoadministrada uma vez por semana, por meio da injeção subcutânea. Ambas seringas pré-cheias e um sistema de autoinjeção (SureClick &) estão disponíveis. Etanercept está também dispo- nível em uma dose de 25 mg, que é administrada duas vezes por semana a esta dose. Doseamento intermitente ou pontual não foi estudado. Existe in- formação limitada sobre a segurança ou a eficácia com doses superiores a 50 mg por semana. Etanercept tem uma meia-vida de 70 horas após uma dose de 25 mg.

O inflixóimab (Remicade O) em combinação com o metotrexato, é aprovado para o tratamento da RA, e para o tratamento da artrite psoriática, espondilite anquilasante e, assim como a psoríase e a doença de Crohn.

Infliimab é um anticorpo monoclonal quimérico que se liga ao TNF com ele- vada afinidade e especificidade. O local de ligação do anticorpo para o TNF é de origem murina, sendo os restantes 75% do anticorpo derivado de um infliximab sequência do anticorpo IgG1 humana. Inflixóimab é eficaz como monoterapia na redução dos sinais e sintomas da RA, mas Os anticorpos anti-infikimab pode desenvolver o que pode, por sua vez, reduzir a durabili- dade da resposta. Co-tratamento com metotrexato reduz a frequência des- ses anticorpos e, portanto, é recomendado juntamente com inflixóimab. À combinação de inflióimab e metotrexato não é muito eficaz em reduzir as manifestações clínicas da doença, bem como para retardar ou interromper a progressão da doença radiográfica na RA. Dosagem: Inflixóimab é adminis- trado por via intravenosa. Infusões normalmente levam entre 2 a 3 horas. À dose inicial recomendada de inflixóimab é de 3 mg/kg para RA dada como uma infusão intravenosa seguido por dose adicional de 2 e 6 semanas, de- pois a cada 8 semanas. Infliximab deve ser administrada em combinação com o metotrexato. Se a resposta clínica é inadequada a uma dose de parti- da, o inflikimab pode ser aumentado gradualmente até uma dose máxima de 10mg/kge a frequência de infusão aumentou para todas 4-6 semanas.

Adalimumab (Humira O) é um anticorpo monoclonal anti-TNF completamente humano com elevada especificidade para o TNF. Tal como os outros antagonistas de TNF, que é eficaz como monoterapia ou em com- binação com o metotrexato, a redução dos sinais e sintomas da RA e em retardar ou interromper a progressão da doença radiográfica. É administrada por via subcutânea a cada duas semanas, mas pode ser aumentado para semanalmente, se necessário. Adalimumab é eficaz na RA, artrite psoriática e espondilite anquilasante e doença de Crohn. Dosagem: Adalimumab está atualmente disponível em uma dose de 40 mg e é dada por meio da injeção subcutânea autoadministrado (SC) a cada duas semanas. Ambas seringas pré-carregadas, bem como um sistema de autoinjeautoinjetor (Huimira Pen O) estão disponíveis. Se a resposta a esta dose é insuficiente, a frequência das injeções pode ser aumentada para semanal. Adalimumab tem uma mei- a-vida de cerca de 2 semanas (variando de 10-20 dias) após uma dose pa- drãode40mg.

Bloqueio do coestimulador de célula T: abatacepte (Orencia O): abatacepte é o primeiro de uma classe de fármacos conhecidos como blo- queadores de coestimulação de células-T. Estes agente interferem com as interações entre células apresentadoras de antígenos e de linfócitos T e afe- tamas fases precoces da cascata de eventos patogênicos em artrite reuma- toide. Linfócitos T se tornam ativados devido a um estímulo desconhecido, mas provavelmente envolvendo a interação entre o antigênio apresentada no contexto da molécula Il Complexo major de histocompatibilidade classe na superfície das células apresentadoras de antigênios. As células T reco- nhecem antígenos como estrangeiros e se receber um segundo pacote de estímulo, irá tornar-se ativo, proliferam, o tráfego para sites inflamadas, e secretam citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF. Um dos sinais de se- gunda importantes para a ativação de células T é mediado pelas moléculas de CD80 e CD86 que foram encontradas em células apresentadoras de an- tigênio e a molécula CD28 na superfície das células T. Dosagem: Abatacept é administrado por perfusão intravenosa, uma vez por mês após doses inici- aisno início do estudo, duas semanas e quatro semanas. A dose baseia-se no peso do corpo, com os pacientes < 60 kg receberam 500 mg, 60-100 kg receberam 750 mg e 100 kg que receberam > 1000 mg. O fármaco é admi- nistrado ao longo de um período de aproximadamente 30 minutos a uma hora.

Esgotamento de célula B: Rituximab (Rituxan &): as células B são células inflamatórias importantes com múltiplas funções na resposta i- mune. Elas servem como células apresentadoras de antigênios, pode segre- gar citocinas, e diferenciar-se em células formadoras de anticorpo no plas- ma. A depleção de células B tem sido demonstrada ser eficaz na redução dossinaise sintomas da RA e no abrandamento da progressão radiográfica. Um agente de empobrecimento de células B, Rituximab, está atualmente disponível para o tratamento da artrite reumatoide. Rituximab (Rituxan &) foi originalmente desenvolvido para o tratamento de linfoma não-Hodgkin e tem sido usado para tratar esta doença maligna de linfócitos e nódulos linfáticos por vários anos. Os primeiros estudos em pacientes com artrite reumatoide causada rituximab mostrou uma depleção rápida e sustentada de células B em circulação na circulação com melhorias clínicas em muitos pacientes, bem. Estudos clínicos demonstraram agora que o rituximab é eficaz na dimi- nuição de sinais e sintomas e no retardamento da progressão radiográfica em pacientescom RA que falharam outras terapias DMARD. O agente está atualmente aprovado em os EUA, no entanto, apenas em pacientes que fa- lharam antagonistas do TNF. Dosagem: A dose atualmente aprovada é de

1000 mg administrado por via intravenosa durante 3 a 4 horas com duas do- ses administradas duas semanas de intervalo. Os pacientes normalmente recebem corticosteroides por via intravenosa a cada infusão e pré- medicação com difenidramina e acetaminofeno. O tempo ideal para a read- ministração ainda não é clara. Alguns têm defendido um regime de dose fixa de cada 6 meses, enquanto outros defenderam a esperar até um paciente começa a dilatação antes de se retirar. Estudos estão em andamento para avaliar os horários de redosagem. A extensão e duração da depleção de células B não foi claramente correlacionada com a eficácia. Também a re- constituição de níveis normais de células B está bem correlacionada com a eficácia da perda.

A interleucina-1 (IL-1) é outra citocina pró-inflamatória implicada na patogênese da RA. Antagonista do receptor de IL-1 (IL1ra) é um bloque- ador endógeno da citocina. Evidência de apoio a um papel anti-inflamatório dell-1ra,in vivo é demonstrada pela observação de que camundongos defi- cientes em IL-1ra desenvolvem espontaneamente doenças autoimunes se- melhantes a artrite reumatoide, bem como vasculite. IL-1 tem efeitos sobre a degradação da cartilagem que conduzem a danos, bem como inibir a repa- ração, e é um potente estímulo para osteoclastos levando à erosão óssea.

Um antagonista da IL-1, anakinra (Kineret O), está atualmente aprovado pa- ra o tratamento da RA. Outros agentes têm sido estudados, bem como em RA.

Anakinra (Kineret O), um antagonista do receptor IL-1 recombi- nante humana (hu riL-1ra) está aprovado para o tratamento da RA. Anakinra pode ser usado sozinho ou em combinação com outros agentes bloqueado- res de TNF (etanercept, infliximab, adalimumab) DMARDs. Anakinra não é recomendado para uso em combinação com inibidores de TNF, pois estudos têm mostrado aumento de infecções sem benefício clínico aditivo. Dosagem: a dose recomendada é de anakinra 100 mg/dia administrada diariamente por —meioda injeção subcutânea. A dose deve ser administrada aproximadamen- te à mesma hora em cada dia. Um sistema de autoinjeção está disponível para a medicação.

O ouro intramuscular é eficaz no tratamento da artrite reumatoi- de. Sais de ouro intramusculares foram, até à década de 1990, os agentes DMARD mais frequentemente usados, mas têm sido substituídos por meto- trexato e outros DMARDs como os agentes preferidos para o tratamento de —RA.Dois compostos injetáveis estão disponíveis, (Myochrysina O e Solganal O). Compostos de ouro são raramente usados agora devido aos seus inú- meros efeitos colaterais e os requisitos de monitorização, a sua eficácia limi- tada, e início muito lento de ação. Um composto de ouro oral (auranofina O) também está disponível, mas a sua eficácia é ainda mais limitado do que os compostos injetáveis. Dosagem: Myochrysina Solganal ou terapia é iniciada a 10 mg, por via intramuscular, 259mg é dada então a segunda semana, e depois 50 mg é administrada semanalmente até que tenha ocorrido uma resposta ou até que tenha sido dado um total de 1 gq. Se há uma resposta favorável, a terapia é reduzida para 50 mg a cada duas semanas, durante 3 meses, a seguir, a cada 3 semanas para 3 meses e, em seguida, finalmente, para uma dose de manutenção mensal. Nenhuma resposta depois de um total de 1 g deve ser considerado uma falha no tratamento. Ouro mensal de- ve ser continuado indefinidamente.

Outro imunomodulador e agentes citotóxicos: Os fármacos cito- tóxicos mais usados são a azatioprina (Imuran O&), ciclosporina A (Sandim- mune &, Neoral O), ciclofosfamida (Citoxan O) e d-penicilamina. Por causa do potencial de elevada toxicidade, estes agentes são tipicamente usados para manifestações extra-articulares fatais da RA tais como vasculite sistê- mica ou com doença articular grave que é refratária a outras terapias.

Azatioprina (Imuran O) tem alguma atividade na artrite reumatoi- de, mas pode demorar de 8 a 12 semanas para ver um efeito. É um análogo de purina que podem causar supressão da medula óssea e abaixamento das contagens de células sanguíneas (glóbulos brancos, glóbulos vermelhos e plaquetas), particularmente em pacientes com insuficiência renal ou quando usado concomitantemente com alopurinol ou inibidores de ACE. O aumento do risco de malignidade secundária devido à azatioprina é controversa. À triagem para os níveis da enzima tiopurina metiltransferase (TPMT) é reco-

mendada antes de iniciar terapia com azatioprina. Alguns indivíduos têm de- ficiências nesta enzima que metaboliza azatioprina concomitantemente com um risco aumentado de toxicidade do fármaco. Os efeitos colaterais incluem náuseas e alopécia. Os exames de sangue para monitorar a contagem de sangue e testes de função hepática são necessários para pacientes em aza- tioprina.

A ciclosporina (Sandimmune &, Neoral O) tem alguma atividade como uma terapia modificadora da doença na artrite reumatoide. Estudos têm demonstrado que a ciclosporina pode ser combinada com o metotrexato em pacientes com RA para capturar respostas clínicas. É um agente imu- nossupressor aprovado para uso na prevenção da rejeição de transplante renal e do fígado e também tem uma atividade no tratamento da psoríase e de outras doenças autoimunes. A ciclosporina inibe a função das células T através da inibição da transcrição de interleucina-2. As principais toxicidades incluem infecção e insuficiência renal. O aumento da pressão arterial é co- mum e pode exigir tratamento. É necessária uma monitorização cuidadosa da função renal e pressão arterial durante todo o tempo um paciente está tomando ciclosporina. Numerosas interações fármacosas podem afetar os níveis sanguíneos de ciclosporina e levam a mais toxicidade. O pacote con- tém informações importantes sobre essas interações fármacosas. Ciclospo- rina aumenta os riscos de infecção e podem também aumentar o risco de doenças malignas incluindo linfomas.

Ciclofosfamida (Citoxan &O) é um agente imunossupressor poten- te que é reservado para casos graves de artrite reumatoide refratária e aque- lescom manifestações tais como vasculite. É usada no tratamento de outras doenças autoimunes, incluindo lúpus e vasculite. A ciclofosfamida é um a- gente alquilante com toxicidades graves, incluindo a supressão da medula óssea, cistite hemorrágica, insuficiência ovariana prematura, infecção e ma- lignidade secundária particularmente de um aumento do risco de câncer de bexiga. O hemograma deve ser cuidadosamente monitorado com esta medi- cação.

d-penicilamina (Cuprimine O, Depen &) historicamente tem al-

guma atividade como um tratamento para a artrite reumatoide. Ele é prescri- to principalmente para pacientes com doença agressiva persistente que fa- lharam outros DMARDS disponíveis. Como o ouro é uma fármaco relativa- mente tóxico que tem uma utilidade limitada devido a problemas de tolerân- ciae eficácia que não é tão forte como outros agentes atualmente disponí- veis. Os principais efeitos colaterais incluem prurido e os efeitos na função renal grave. É necessária uma monitorização cuidadosa da função renal com este fármaco. Os pacientes podem desenvolver lúpus como doença ou ou- tras doenças autoimunes quando se toma d-penicilamina.

Outros compostos DMARD atualmente em desenvolvimento são também adequados para uma combinação dos métodos de tratamento de acordo com a presente invenção, tal como VX-702, ocrelizumab, compostos de objetivo de SIK quinase tais como fostimatinib (R788) e JAK1, JAK?2, tais como inibidores INCB28050, tanezumab ou tasocitinib (CP-690, 550).

Os DMARDs podem ser selecionados a partir do grupo que con- siste em micofenolato mofetil (CellCept), inibidores da calcineurina, a ciclos- porina, sirolimus, everolimus, retinoides orais, a azatioprina, os ésteres de ácido fumárico, a D-penicilamina, a ciclofosfamida, a coluna de imunoadsor- ção, prosorba (r) coluna, um sal de ouro, auranofina, aurotiomalato de sódio (Myocrisin), hidroxicloroquina, cloroquina, leflunomida, metotrexato (MTX), minociclina, sulfassalazina (SSZ), fator alfa (TNF) bloqueadores de necrose tumoral, o etanercept (Enbrel), infliimab (Remicade), adalimumabe (Humi- ra), certolizumab pegol (Cimzia), golimumab (Simponi)), interleucina-1 (IL-1) bloqueadores, por exemplo, anakinra (Kineret), anticorpos monocilonais con- traascélulasB, o rituximab (Rituxan)), bloqueadores dos coestimulação das células T, abatacept (Orencia), bloqueadores de interleucina 6 (IL-6), tocili- zumabe, RoAtemra e Atemra.

O tratamento com um antianticorpos KIR2DL1, 2 e/ou 3 Um paciente com RA pode ser avaliado para avaliar a presen- çca,estágio, evolução ou classificação da doença. Opcionalmente, uma amos- tra biológica (por exemplo, fluido sinovial), é obtida e avaliada quanto à pre- sença de mediadores pró-inflamatórios ou outros marcadores de inflamação ativa, e/ou presença de células T (por exemplo, células T CD4 +). Em uma modalidade, a presença de autoanticorpos é detectada, por exemplo, a de- tecção de fator reumatoide (RHF), Os anticorpos anti-peptídeos citrulinados cíclicos, anti-ssRNA, anti-dsRNA, anti-Smith, antifosfolipídeo, antinuclearan- tinucleares e/ou anticorpos anti-atina. Em uma modalidade, os métodos compreendem avaliar os níveis de uma enzima proteolítica, um mediador inflamatório, um marcador de inflamação em progresso ou uma citocina pró- inflamatória. Em uma modalidade, os métodos compreendem a determina- ção (CRP), nível de proteína reativa-c e/ou a taxa de sedimentação de eri- trócitos. A determinação de que um paciente tem RA ou dos mediadores pró-inflamatórios ou outros marcadores de inflamação ativa, e/ou células T (por exemplo, as células T de infiltração, HLA-Cw3 e/ou CWA4 células T posi- tivas) estão presentes (por exemplo, no inflamado de tecido), que a doença é aguda, crônica, tendo um alargamento ou a progredir indica que o paciente pode ser tratado com um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Um paciente com RA, e, opcionalmente, tendo a inflamação ati- va e/ou RA estabelecida ou crônica, e/ou tendo um alargamento é tratado com um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. De preferência, RA estabelecido pode ser caracterizado como RA, que tem vindo a progredir mais de um ano, ou que tenha progredido há menos de um ano, mas não responde a um pri- meiro modificador da doença de fármacos antirreumáticos (DMARDs). RA estabelecida também pode ser avaliada por meio do critério da CAS ou DAS. " RA e doenças relacionadas " se refere a doenças que podem causar ou derivar a partir do início ou a evolução da artrite reumatoide, como por e- xemplo, episclerite, pneumotórax, embolia e úlcera isquêmica da pele.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção são adminis- trados em combinação com outro tratamento da RA, tais como os enumera- dos acima.

Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 podem ser injetados ou in- fundidos por meio da via subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra- articular, intra-sinovial, intra-esternal, intratecal, intra-hepática, intralesional e intracraniana rotas. Em uma modalidade, um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou

3 é administrado intra-articular, de preferência no local da inflamação.

Esclerose Múltipla A esclerose múltipla (MS) é uma doença inflamatória crônica do sistema nervoso central (CNS) em que a bainha de mielina em torno dos axons graxos do cérebro e medula espinal são danificados, levando a des- mielinização e cicatrização, bem como um amplo espectro de sinais e sinto- mas.

A causa fisiopatológica permanece desconhecida, embora diferentes teorias incriminam genética ou infecções.

Diferentes fatores de risco ambien- tais também têm sido propostos.

As manifestações clínicas são associadas coma infiltração do sistema nervoso central por meio das células imuno- competentes.

Populações específicas de células T dirigidas de neuroantíge- nos, tais como a proteína básica mielina, pode ser demonstrada na periferia.

Quase qualquer sintoma neurológico pode aparecer com a doença, e muitas vezes evolui para incapacidade física e cognitiva.

MS avança em duas for- mas: os novos sintomas que ocorrem tanto em ataques discretos (formas reincidentes) ou lentamente acumulando ao longo do tempo (formas pro- gressivas). Entre os ataques, os sintomas podem desaparecer completa- mente, mas os problemas neurológicos permanentes ocorrem frequente- mente, especialmente com o avanço da doença.

Avaliação e classificação de Doenças Vários subtipos, ou padrões de evolução, têm sido descritos.

O uso de subtipos do curso passado da doença em uma tentativa para prever o futuro curso.

Eles são importantes não só para o prognóstico, mas também para decisões terapêuticas.

Em 1996, a Sociedade de Esclerose Múltipla —Nacionaldos Estados Unidos padronizou quarto subtipos de definições: exa- cerbação-remissão, secundária progressiva, progressiva primária e progres- siva recidivante.

O subtipo remitente-recorrente é caracterizado por surtos impre- visíveis seguidos por períodos de meses a anos de remissão, sem novos sinais de atividade da doença.

Este artigo descreve o curso inicial de 80% dos indivíduos com esclerose múltipla.

MS secundária progressiva descreve cerca de 65% das pessoas com uma inicial remitente-recorrente, que, em seguida, começa a ter declínio neurológico progressivo entre os ataques a- gudos, sem quaisquer períodos definidos de remissão. As recaídas ocasio- nais e pequenas remissões podem aparecer. O tempo médio entre o início da doença e conversão de remitente-recorrente da MS secundária progres- sivaé de 19 anos. O subtipo primário progressivo descreve a aproximada- mente 10 a 15% das pessoas que nunca tiveram remissão após os sintomas iniciais MS. Caracteriza-se pela progressão da incapacidade desde o início, sem ou com apenas remissões menores e melhorias ocasionais. A idade de início para o subtipo primária progressiva é mais tarde do que para o remi- tente-recorrente, mas similar à média de idade de progressão entre o remi- tente-recorrente e secundária progressiva. Em ambos os casos, é de cerca de 40 anos de idade. MS Progressiva recidivante descreve aqueles indiví- duos que, desde o início, têm um declínio neurológico estável, mas também sofrem ataques sobrepostos claras. Este é o menos comum de todos os subtipos. À esclerose múltipla evolui quer pela diminuição neurológica pro- gressiva, ou por ataques agudos, ou por uma combinação de ambas, de- pendendo do tipo de MS. Sintomas da EM incluem: fadiga, problemas visu- ais, tais como visão turva ou dupla, formigamento, entorpecimento ou sen- sação de queimação, fraqueza muscular, rigidez, tremor e espasmos, cami- —nhadas e problemas de marcha, bexiga e disfunção intestinal, disfunção se- xual, cognitiva e memória problemas, deglutição e fala problema, dor ou de- pressão. Esses sintomas são exacerbados durante um ataque enquanto que a condição geral do paciente diminui. Variantes típicas de MS com o com- portamento fora do padrão foram descritas, que incluem a doença de Devic, esclerose concêntrica de Balo, esclerose difusa de Schilder e esclerose múl- tipla Marburg.

O diagnóstico de esclerose múltipla é estabelecido com base em critérios diferentes. Historicamente, foram amplamente usados os critérios de Schumacher e Poser. Atualmente, os critérios de McDonald, estabeleci- dos pela Sociedade de Esclorese Múltipla Nacional (NMSS) da América, u- sando imagem IMR tendem a substituir os critérios antigos. (McDonald WI, Compston A, Ethan G, e outros (2001), Ann Neurol 50 (1): 121-7).

Opções atuais de tratamento Há muitas questões para o paciente e o médico a considerar no tratamento da esclerose múltipla. Os objetivos podem incluir: a melhoria da velocidade de recuperação a partir de ataques (por exemplo, tratamento com fármacos esteroides), a redução do número de ataques ou o número de le- sões de ressonância magnética; tentativa para retardar a progressão da do- ença (tratamento com fármacos modificadores da doença ou DMDS), um adicional objetivo é o alívio de complicações devido à perda de função dos órgãos afetados.

A maioria dos neurologistas irá considerar o tratamento com DMDs uma vez que o diagnóstico de esclerose múltipla é estabelecido. Mui- tos irão começar o tratamento, no momento do primeiro ataque da esclerose múltipla, uma vez que os ensaios clínicos sugeriram que os pacientes nos quais o tratamento é retardada podem não beneficiar tanto quanto os paci- entes que são tratados mais cedo.

Os pacientes recebem a terapia imunossupressora, incluindo azatioprina e corticosteroides, a fim de limitar a extensão do processo infla- matório. A terapia imunossupressora de esclerose múltipla, no entanto, é apenas parcialmente eficaz, e na maioria dos casos, apenas oferece um a- traso na progressão da doença, apesar do tratamento anti-inflamatório e i- munossupressor. Atuais tratamentos modificadores da doença para MS são, inter alia: IFNp-1a (Avonex O, CinnoVex O, ReciGen &, Rebif &), IFNp-1b (Betaferon &, Betaferon O), acetato de glatirâmer (Copaxone &), que é um não-interferonao, imunomodulador não-esteroides, mitoxantrona, um imu- —nossupressor, natalizumab (Tysabri O), fingolimod (Gilenia O). Uma série de tratamentos estão sob investigação. Agentes emergentes para RRMS que mostraram a promessa em estudos fase 2 incluem alemtuzumab (Campath O), daclizumab (Zenapax O), rituximab, dirucotide, BHT-3009, a cladribina, dimetil fumarato, estriol, fingolimod, laquinimod, minociclina, as estatinas, temsirolimus e teriflunomida.

O tratamento com antianticorpos KIR2DL1, 2 e/ou 3 Opcionalmente, em um primeira etapa de doença de um pacien-

te pode ser avaliado. O paciente é então tratado com um anticorpo anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3 de forma adequada. A paciente ter MS pode ser avaliada para avaliar a presença, palco, evolução ou classificação da doença. Em um aspecto vantajoso, para um determinado paciente tem inflamação ativa, e/ou crônica estabelecida ou MS, e/ou tendo um alargamento é tratado com um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. De preferência, estabelecida MS pode ser caracterizadaocomo MS que tem declínio neurológico progressivo, tal como, doença progressiva secundária progressiva primária ou recidivante progres- siva tipo em alternativa, uma " estabelecida MS " refere-se a um MS que tem vindoa progredir durante mais de um ano, ou que tenha progredido há me- nos de um ano, mas não responde a uma primeira linha de tratamento. De preferência, um queimador é definido como uma exacerbação dos sintomas relacionados com a esclerose múltipla, opcionalmente, como queimador leva a uma diminuição da condição geral do paciente. Outro aspecto da presente invenção é proporcionar uma composição que seja capaz de tratar um MS estabelecido, ou para reduzir ou abortar um ataque de EM, conduzindo as- sim a uma melhoria da saúde do paciente e também o conforto.

Em uma modalidade, os anticorpos de acordo com a presente invenção são administrados em combinação com outro tratamento de EM, tais como os enumerados acima.

Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 podem ser injetados ou in- fundidos via subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra- sinovial, intra-esternal, intratecal, intra-hepática, intralesional e intracraniana rotas.

Doenças inflamatórias crônicas do intestino (CIDI) - Doença de Crohn -retocolite As doenças inflamatórias crônicas do intestino são uma série de doenças que afetam o trato gastrointestinal. CIDI mais comuns são a colite ulcerativa, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, enterite regio- nal, retocolite granulomatosa e ileocolite. Avaliação e classificação de Doenças Os testes de diagnóstico incluem: testes não-invasivos laborato-

riais (anemia e infecção, testes de função hepática para triagem de proble- mas de dutos biliares e fígado, e os estudos de fezes para descartar infec- ções bacterianas, virais e parasitárias), endoscopia, ultra-sonografia endos- cópica (EUS), cápsula endoscopia, radiologia, como enterografia Multifase CT,enterografia MR (MRE).

As doenças inflamatórias crônicas do intestino são bastante difí- ceis de pontuação. Em retocolite, uma colonoscopia pode proporcionar uma visão bastante completa das feridas no cólon, mas na doença de Crohn, a ferida pode aparecer em qualquer parte do esófago ao reto, a avaliação do paciente é muito mais difícil de obter. Um sistema de pontuação foi criado para avaliar a doença de Crohn: índice da atividade da doença de Crohn (CDAI, Vide para revisão Sandborn WJ e outros Gastroenterology 2002; 112:. 512). A pontuação varia de O a 600. Abaixo de 150 pontos, os pacien- tes são classificados como " muito bem ". Entre 150 e 219, a doença é mo- deradamente ativo, entre 220 e 449, a doença é moderadamente ativo. Aci- ma de 450 pontos a doença é classificada como muito grave. No entanto, essa pontuação pode ser dependente do paciente e, mais recentemente, um outro sistema de pontuação, a doença de Crohn do dano da pontuação Di- gestiva (CD3s) ou pontuação Lemann foi estabelecida a pontuação de paci- entes com doença através de valores científicos mais precisos, como uma pontuação estabelecida por tomografia computorizada. (Paciente B. e outros Development of the Crohn's Disease Digestive Damage score, the Lémann score Innflamm Bowel Dis 2010; Nov 28).

A doença de Crohn evolui com a crise, também conhecida coma dilatação. As dilatações podem ser leves ou graves, breves ou prolongadas. Tais surtos ou ataques podem ser associados com um CDAI de mais de 150, mais de 219, superior a 449 pontos. Graves crises pode levar à dor in- tensa, desidratação e perda de sangue. Inflamação recorrente tende a apa- recer na mesma área do intestino, mas pode espalhar-se para áreas adja- centes após um segmento paciente tenha sido removido cirurgicamente. Quando a doença de Crohn causa uma exacerbação de sintomas gastroin- testinais, a pessoa também pode ter inflamação das articulações (artrite),

inflamação da parte branca dos olhos (episclerite), feridas na boca (estomati- te aftosa), nódulos cutâneos inflamados nos braços e pernas (eritema nodo- so), e chagas azul-vermelho pele contendo pus (pioderma gangrenoso). Mesmo quando a doença de Crohn não está causando um surto de sintomas gastrointestinais, a pessoa ainda pode enfrentar pioderma gangrenoso, en- quanto a inflamação da coluna (espondilite anquilasante), inflamação das articulações pélvicas (sacroileite), inflamação no interior do olho (uveite), ou inflamação das vias biliares (colangite esclerosante primária) são passíveis de ocorrer totalmente sem relação com a atividade clínica da doença intesti- nal.

Opções atuais de tratamento As opções de tratamento atuais são restritas a controlar os sin- tomas, manter a remissão e prevenção da recaída.

O tratamento da doença de Crohn envolve primeiro o tratamento dos sintomas agudos da doença, em seguida manter a remissão.

O tratamento envolve inicialmente o uso de fár- macos para eliminar as infecções, geralmente antibióticos, e reduzir a infla- mação, geralmente aminosalicilate fármacos anti-inflamatórios e corticoste- roides.

A cirurgia pode ser necessária para a complicações, tais como obs- truções ou abcessos, ou quando a doença não responde a fármacos dentro deumtempo razoável.

Os fármacos anti-inflamatórios aminossalicilatos: mesalazina ou mesalamina (LialdaTM, AsacolTM, Pentasa, TM SalofalkTM, DipentumTM e RowasaTM), sulfasalazina, que é convertido em 5-ASA e a sulfapiridina por meio das bactérias intestinais.

A sulfapiridina pode ter algum efeito terapêu- ticona artrite reumatoide.

No entanto, o componente de sulfapiridina é mui- tas vezes o fator limitante no tratamento de doenças devido a elevado perfil de efeitos secundários de Crohn.

Compostos de 5-ASA têm sido mostrados como sendo úteis no tratamento da doença ligeira a moderada de Crohn.

Eles são geralmente considerados terapia de primeira linha para a doença —nolado direito leo e do cólon particularmente devido ao seu perfil de efeitos colaterais menor em comparação com corticosteroides.

Corticosteroides anti-inflamatórios: enemas de esteroides podem ser usadas para o tratamento dos sintomas da doença retais. Os corticoste- roides são uma classe de fármacos anti-inflamatórios que são usados princi- palmente para o tratamento de alargamentos moderados a grave ou ataques de doença de Crohn, Eles são usados mais fracamente, devido à disponibili- dade de tratamentos eficazes e com menos efeitos colaterais. O mais co- mumente prescritos esteroide oral é prednisona, o que é normalmente admi- nistrado em doses de 0,5 mg/kg para a indução de remissão. Esteroides in- travenosos são usados para os casos refratários aos esteroides orais, ou onde os esteroides orais não podem ser tomadas. Como os corticosteroides reduzem a capacidade de combater a infecção, o cuidado deve ser usado para garantir que não há nenhuma infecção ativa, particularmente um ab- cesso intra-abdominal antes do início de esteroides. A budesonida é um cor- ticosteroide oral com absorção limitada e alto nível de metabolismo de pri- meira passagem, o que significa que menos quantidades de esteroides en- tram na corrente sanguínea. Tem-se mostrado útil no tratamento de doença ligeira a moderada de Crohn e para a manutenção da remissão da doença de Crohn. Formulado como Entocort O, budesonida é liberada no ileo termi- nal e cólon direito, e, portanto, tem um efeito tópico contra a doença nessa área. Budesonida também é útil quando usado em combinação com antibió- ticosparaa doença de Crohn ativa.

Fármacos imunossupressores de Mercaptopurina: Azatioprina, mostrado aqui em forma de comprimido, é a primeira linha de esteroides poupadores imunossupressores. A azatioprina e 6-mercaptopurina (6-MP), são os imunossupressores mais usados para a terapia de manutenção da doença de Crohn. Eles são anti-metabolitos de purina, o que significa que eles interferem com a síntese de purinas necessárias para que as células inflamatórias. Eles têm uma duração de ação de meses, o que torna difícil de manejar para usá-los para indução de remissão. Ambos fármacos são dose- ados em 1,5 a 2,5 mg/kg, com a literatura suporta o uso de doses mais ele- vadas. Azatioprina e 6-MP, foram encontrados para ser útil para as seguin- tes indicações: a terapia de manutenção para as pessoas que são depen- dentes de esteroides, doenças fistulizing, indução da remissão na doença refratária esteroide, a manutenção da remissão após a cirurgia para a doen- ça de Crohn. Azatioprina é no entanto um fármaco particularmente perigoso, com grande potencial para convidar uma série de infecções potencialmente fatais, e também está listado pelo FDA como um carcinógeno humano, O infliximab, comercializado como REMICADE &, é um anticorpo quimérico camundongo-humano que tem como alvo o fator de necrose tumo- ral, uma citocina na resposta inflamatória. Trata-se de um anticorpo mono- clonal que inibe a citocina pró-inflamatória do fator de necrose tumoral alfa. É administrado por via intravenosa e doseado por peso a partir de 5 mg/kg e de acordo com o caractere crescente de doenças. Inflixóimab encontrou utili- dade da seguinte forma: a manutenção da remissão para as pessoas com doença de Crohn, a indução da remissão para as pessoas com doença de Crohn, a manutenção de fistulizing doença de Crohn, efeitos colaterais de infliximab, assim como outros imunossupressores da classe TNF, pode ser grave e potencialmente fatal e inflixóimab traz um aviso da caixa preta FDA no marcador. Efeitos secundários incluem hipersensibilidade e reações alér- gicas, o risco de re-ativação de tuberculose, doença do soro, e o risco de esclerose múltipla.

Adalimumab, comercializado como Humira*”: como infliximab é um anticorpo que tem como alvo o fator de necrose tumoral. Adalimumab foi mostrado para reduzir os sinais e sintomas, e é aprovado para o tratamento de moderada a grave doença de Crohn (CD) em adultos que não responde- ram bem aos tratamentos convencionais e que tenham perdido a resposta ou são incapazes de tolerar infliximab.

O natalizumab, comercializado como Tysabri O, é um anticorpo monoclonal anti-integrina que tem demonstrado utilidade como a indução e manutenção de tratamento para uma doença moderada ou grave de Crohn. Natalizumab pode ser apropriado em pacientes que não respondem a fár- macos que bloqueiam fator de necrose tumoral-alfa, tais como o inflixóimab.

O tratamento com antianticorpos KIR2DL1, 2 e/ou 3 Um aspecto da presente invenção é proporcionar uma composi- ção que é capaz de tratar a doença de Crohn, opcionalmente uma doença de Crohn estabelecida. Na presente invenção " a doença de Crohn estabe- lecida " refere-se a doença de Crohn que tenha sido declarada por mais de um ano.

Um outro aspecto da presente invenção é proporcionar um mé- todo de tratamento para reduzir ou abortar um ataque da doença de Crohn, conduzindo assim para uma melhoria da saúde do paciente e conforto. Um ataque da doença pode referir-se a um paciente que tem uma CDA! de mais de 150, mais de 219, mais de 449 pontos. Dessa maneira, a presente inven- ção também proporciona um método para tratar um paciente tendo uma do- ençainflamatória crônica do intestino, que compreende a etapa de avaliar se o referido paciente está experimentando um flare-up ou um ataque, e, se o referido paciente está experimentando um ataque, tratando a referida paci- ente com uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3.

Ainda outro aspecto da presente invenção é o de proporcionar um método para o tratamento profiláctico de um paciente que sofre de doen- ça de Crohn, evitando, dessa maneira, um alargamento acima.

Em uma modalidade, os anticorpos de acordo com a presente invenção são administrados em combinação com o tratamento da doença de Crohn do outro, tais como os enumerados acima.

O lúpus eritematoso Quatro tipos principais de lúpus existem - lúpus eritematoso sis- têmico, lúpus eritematoso discoide, lúpus eritematoso induzido por fármacos, e lúpus eritematoso neonatal. Destes, o lúpus eritematoso sistêmico é a for- ma mais comum e grave de lúpus.

O lúpus eritematoso discoide (DLE) é uma condição crônica da pele de feridas com inflamação e cicatrizes favorecendo o rosto, orelhas e couro cabeludo e, por vezes, em outras áreas do corpo. Essas lesões se desenvolvem como, uma mancha vermelha, inflamada com uma escala e aparência crocante. As áreas do centro pode aparecer de cor mais clara com uma borda mais escura do que a pele normal.

O lúpus eritematoso induzido por fármacos (DIL ou DILE) é uma doença autoimune, causada pelo uso crônico de certos fármacos. Estes fár-

Mmacos causam uma resposta autoimune produzindo sintomas semelhantes aos da SLE.

Há 38 fármacos conhecidos por causar DIL mas há três que denunciar o maior número de casos: hidralazina, procainamida e isoniazida.

Embora os critérios para o diagnóstico de DIL não tenham sido completa- mente estabelecidos, os sintomas de DIL tipicamente presentes como mial- gia e artralgia.

Geralmente, os sintomas recuam após a interrupção do uso dos fármacos.

O lúpus eritematoso neonatal apresenta em crianças, na maioria das vezes meninas, nascidas de mães que carregam o anticorpo Ro/SSA.

Ascrianças não têm lesões de pele no nascimento, mas desenvolvê-los du- rante as primeiras semanas de vida.

O lúpus eritematoso sistêmico é uma doença autoimune crônica sistêmica que pode afetar qualquer parte do corpo.

Tal como ocorre em ou- tras doenças autoimunes, o sistema imunitário ataca as células do corpo e os tecidos, resultando em inflamação e danos nos tecidos.

SLE na maioria das vezes prejudica o coração, articulações, pele, pulmões, vasos sanguí- neos, fígado, rins e sistema nervoso.

O curso da doença é imprevisível, com períodos de doença (explosões), alternando com remissões.

A doença ocor- re nove vezes mais frequentemente em mulheres do que em homens, espe- cialmente em mulheres em anos idade de gestação 15 a 35, e é mais co- mum em pessoas também de ascendência não-Européia.

O SLE é tratável através da abordagem de seus sintomas, principalmente com ciclofosfamida, corticosteroides e imunossupressores, não há atualmente nenhuma cura.

SLE pode ser fatal, embora com os avanços médicos recentes, as mortes estão se tornando cada vez mais raro.

SLE é considerada incurável, mas altamente tratável.

Na década de 1950, a maioria das pessoas diagnostica- das com SLE viveu menos de cinco anos.

Os avanços no diagnóstico e tra- tamento têm melhorado a sobrevivência até o ponto onde mais de 90% ago- ra sobreviver por mais de dez anos, e muitos podem viver relativamente as- sintomáticos.

Avaliação e classificação de Doenças Os esteroides devem ser usados na menor dose pelo menor pe-

ríodo possível, para reduzir a possibilidade de problemas cardiovasculares, e outros fármacos que podem reduzir os sintomas devem ser usados sempre que possível. Creatinina sérica elevada, hipertensão, síndrome nefrótica, anemia e hipoalbuminemia são fatores de mau prognóstico. A ANA é o teste de rastreio para avaliação mais sensível, enquanto anti-Sm (anti-Smith) é o mais específico. O anticorpo dCDNA é também bastante específica e, muitas vezes varia com a atividade da doença e, como tal, a título de dsDNA às ve- zes é útil para monitorizar alargamentos da doença ou resposta a um trata- mento.

Alguns médicos fazem um diagnóstico sobre a base dos critérios de classificação da American College of Rheumatology (ACR). No entanto, foram estabelecidos os critérios, principalmente para uso em pesquisas cien- tíficas, incluindo o uso em ensaios clínicos randomizados que exigem níveis de confiança mais elevados, por isso algumas pessoas com lúpus não pode passar todos os critérios.

O Colégio Americano de Reumatologia estabeleceu onze crité- rios, em 1982, revisado em 1997, como um instrumento classificatório para operacionalizar a definição de SLE em ensaios clínicos. Para fins de identifi- cação de pacientes para estudos clínicos, um indivíduo tem SLE se houver 4 dos11 sintomas estão presentes simultaneamente ou em série em duas o- casiões distintas: Serosite: pleurite ou pericarreferide, úlceras orais, artrite: artrite não erosiva de duas ou mais articulações periféricas, com ternura, inchaço ou efusão, fotossensibilidade, sangue (doença hematológica, ane- mia hemolítica (baixa contagem de células vermelhas do sangue) ou leuco- penia (contagem de glóbulos brancos < 4000/u4l!), linfopenia (< 1500/ul) ou trombocitopenia (< 100.000/mL) na ausência de fármaco ofensor; doença renal; anticorpo antinuclear positivo; distúrbio imunológica: Positivo anti- Smith, DNA anti-ds, anticorpo antifosfolípide, e/ou teste sorológico falso- positivo para sífilis; presença de DNA anti-ss em 70% dos casos, o distúrbio — neurológico: Convulsões ou psicose, eritema malar, eritoma discoide.

Opções atuais de tratamento O tratamento do SLE envolve a prevenção de crises e reduzindo a sua gravidade e duração quando eles ocorrem. O tratamento pode incluir corticosteroides e fármacos anti-malária. Certos tipos de nefrite lúpica, como glomerulonefrite proliferativa difusa exigem acessos de fármacos citotóxicos. Estes fármacos incluem ciclofosfamida e micofenolato.

Os fármacos modificadores da doença (DMARDs) são usados de forma preventiva para diminuir a incidência de crises, o processo da do- ença, e menor será a necessidade de uso de esteroides, quando ocorrem explosões, eles são tratados com corticosteroides. DMARDs comumente em uso são os antimaláricos como plaquenil e imunossupressores (por exemplo, metotrexato e azatioprina). Hidroxicloroquina (HCQ) foi a última medicação aprovada pela FDA, em 1955, para o lúpus. Os anticorpos anti-BLyS (Ben- Iysta O Humana Genomce Science, Inc.) também pode ser usado como um DMARD. Hidroxicloroquina é um antimalárico usado para manifestações constitucionais, cutânea e articular. Hidroxicloroquina tem relativamente poucos efeitos secundários, e há evidências de que ele melhora a sobrevi- vência entre as pessoas que têm SLE. Ciclofosfamida é usada para glome- rulonefrite grave ou outras complicações órgão-prejudiciais. Alguns fármacos aprovados para outras doenças que são usados para o SLE " off-label ", fármacos imunossupressores também são usados para controlar a doença e prevenir a recorrência de sintomas (conhecido como exarcebação). Depen- dendo da dose, as pessoas que necessitam de esteroides podem desenvol- ver a síndrome de Cushing, os efeitos colaterais das quais podem incluir a obesidade, o rosto inchado round, diabetes mellitus, grande apetite, dificul- dade para dormir e osteoporose. Esses efeitos secundários podem diminuir, see quando a grande dose inicial é reduzida, mas o uso a longo prazo de doses baixas pode até causar a elevação da pressão arterial e as cataratas. Inúmeros novos fármacos imunossupressores estão sendo testados ativa- mente para SLE. Ao invés de suprimir o sistema imune inespecífico, como os corticosteroides fazem, eles têm como alvo as respostas das células imu- —nológicas individuais; analgésicos, tais como a indometacina e diclofenaco, podem ser usados se osfármacos de sobre-reação f (fármacos anti- inflamatórios não esteroidais, principalmente) não fornecerem alívio eficaz. À dor é normalmente tratada com a prescrição.

Devido à variedade de sinto- mas e envolvimento do sistema do órgão com SLE, sua gravidade em um indivíduo deve ser avaliado a fim de tratar com sucesso SLE.

Doença leve ou remitente às vezes pode ser deixada em segurança se não tratada, O tratamento com antianticorpos KIR2DL1, 2 e/ou 3 Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 podem ser usados para tratar o lúpus, incluindo, mas não limitado a um lúpus estabelecida, ou para reduzir ou interromper uma crise do lúpus, conduzindo assim para uma me- lhoria da saúde do paciente e conforto. "Lúpus Fundada " se refere a uma doença lúpus que tem vindo a progredir mais de um ano ou que tenha sido declarada há mais de um ano.

Em uma modalidade, Os anticorpos de acor- do com a presente invenção são administrados em combinação com um ou- tro tratamento do lúpus, como os listados acima.

Outras doenças autoimunes e inflamatórias Os anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 podem ser usados para tratar doenças autoimunes e inflamatórias adequadas, de preferência células T distúrbios envolvidas.

Doenças autoimunes e inflamatórias podem, mas não estão limitados a: Achlorhidra hepatite crônica ativa autoimune, encefa- lomielite disseminada aguda, leucoencefalite hemorrágica aguda, doença de — Addison, Agamaglobulinemia, Alopecia areata, Esclerose Lateral Amiotrófi- ca, Espondilite Anquilasante, Anti-GBM/TBM nefrite, síndrome antifosfolípi- de, síndrome antissintetase, artrite, alergia atópica, dermatite atópica, ane- mia aplástica autoimune, cardiomiopatia autoimune, anemia hemolítica auto- imune, hepatite autoimune, doença autoimune da orelha interna, a síndrome linfoproliferativa autoimune, neuropatia periférica autoimune, pancreatite au- toimune, síndrome polyendocrine autoimune, desconhecido ou múltipla auto- imune dermatite progesterona, autoimune púrpura trombocitopênica, uveite autoimune, Balo doença/esclerose concêntrica de Balo, sindrome Bechets, doença de Berger, encefalite de Bickerstaff, síndrome Blau, Penfigoide, do- ençade Castleman, doença de Chagas, síndrome da Disfunção Imune de Fadiga Crônica, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, crônica multifocal recorrente ostomyelitis, doença de Lyme crônica, doença pulmo-

nar obstrutiva crônica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, doença celíaca, síndrome de Cogan, doença aglutinina fria, a deficiência de componente do complemento 2, arterite craniana, síndrome CREST, a do- ença de Crohn (um dos dois tipos de idiopática, doença inflamatória intesti-

nal"IlBD'"), síndrome de Cushing, angiite leucocitoclástica cutânea, doença de Dego, doença de Dercum, dermatite herpetiforme, dermatomiosite, Dia- betes mellitus tipo 1, difusa esclerose sistêmica cutânea, síndrome de Dress-

ler, lúpus eritematoso discoide, eczema, endometriose, Entesite-artrite rela- cionada, fasciíte eosinofílica, Epidermólise bolhosa adquirida, eritema nodo-

so, crioglobulinemia mista essencial, síndrome de Evan, Fibrodisplasia ossi- ficante progressiva, fibromialgia, Fibromyositis, fibrosante aveolitis, gastrite, penfigoide Gastrointestinal, arterite de células gigantes, glomerulonetfrite, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, Guillain síndrome-Barré (SGB), encefalite de Hashimoto, tiroidite de Hashimoto, anemia hemolítica,

púrpura de Henoch-Schôónlein, herpes gestacional, hidradenite supurativa, síndrome de Hughes, Hipogamaglobulinemia, inflamatórias idiopáticas Do- enças Desmielinizantes, fibrose pulmonar idiopática, púrpura trombocitopê-

nica idiopática, nefropatia por IgA, corpo de inclusão miosite inflamatória polyneuopati desmielinizante, cistite intersticial, síndrome do intestino irritá-

vel(IBS), artrite idiopática juvenil, artrite reumatoide juvenil, doença de Ka- wasaki, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, vasculite leucocitoclástica, líquen plano, líquen escleroso, Linear doença IgA (LAD), doença de Gehrig

Lou, lupoide hepatite, lúpus eritematoso, síndrome de Majeed, doença de Ménieêre, poliangiite microscópica, síndrome de Miller-Fisher, Doença mista

—dotecido conectivo, morféia, doença de Mucha-Habermann, síndrome Muc- Kle-Cavidades, mieloma múltiplo, esclerose múltipla, miastenia gravis, miosi-

te, Narcolepsia, neuromielite óptica, Neuromiotonia, penfigoide ocular cicatri-

cial, síndrome Opsoclonia myoclonus, Ord tiroidite, reumatismo palíndromo, PANDAS (Distúrbios pediátricos neuropsiquiátricos autoimune associados com Streptococcus), degeneração cerebelar paraneoplásica, hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), síndrome de Parry Romberg, Parsonnage-A sín- drome de Turner, Pars planitis, Pênfigo, pênfigo vulgar, anemia perniciosa,

perivenoso encefalomielite, síndrome POEMS, poliarterite nodosa, polimial- gia reumática, polimiosite, cirrose biliar primária, colangite esclerosante pri- mária, neuropatia inflamatória progressiva, psoríase, artrite psoriática, pio- derma gangrenoso, aplasia vermelha Pure, encefalite de Rasmussen, o fe- nômeno de Raynaud, policondrite recidivante, síndrome de Reiter, síndrome das pernas inquietas, fibrose retroperitoneal, artrite reumatoide, febre reuma- toide, sarcoidose, esquizofrenia, síndrome de Schmidt, síndrome de Schnit- zler, esclerite, esclerodermia, síndrome de Sjógren, espondiloartropatias, síndrome do sangue pegajoso, doença de Still, síndrome de pessoa rígida, endocarreferide bacteriana subaguda (SBE), síndrome de Susac, síndrome de Sweet, coréia de Sidenham, oftalmia simpática, arterite de Takayasu, ar- terite temporal, síndrome de Tolosa-Hunt, mielite transversa, colite ulcerati- va, doença indiferenciada do tecido conjuntivo indiferenciado espondiloartro- patia, vasculite, vitiligo, granulomatose de Wegener, doença de Wilson e síndrome de Wiskott-Aldrich.

Dosagem e regimes de dosagem de anticorpos anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3

Em um aspecto, os métodos de tratamento da presente inven- ção proporcionam compreender a administração a um indivíduo de uma composição que compreende um anticorpo anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

Uma quantidade terapeutica- mente eficaz pode ser, por exemplo, uma dosagem de cerca de 0,0003 mg (anticorpo)/kg (peso do paciente) de cerca de 3 mg/kg (por exemplo, cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, tal como cerca de 0,015 a cerca 3 mg/kg, por exemplo, qualquer um de cerca de 0,075 mg a cerca de 3 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, e cerca de 1 mg/kg a cerca de 3 mg/Kg, ou de qualquer de cerca de 0,0003 mg/Kg, cerca de 0,003 mg/kg, cerca de 0,015 mg/kg, cerca de 0,075 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, e cerca de 3 mg/kg). As doses e formulações de anticorpos anti-KIR são descritos em WO2008/084106, a descrição das quais é incorporada na presente invenção por meio de referência.

Em uma modalidade, o método compreende a repetição da administração pelo menos uma vez, por exem-

plo, com uma frequência de dosagem na gama de 3 vezes por dia a uma vez cada 2 meses. A dose também pode ser administrado, por exemplo, pelo menos, 3 vezes, pelo menos 6 vezes, ou, pelo menos, 10 vezes. Em uma modalidade, o anticorpo é administrado por via intravenosa. Em uma outra modalidade, a ligação do anticorpo a um KIR inibidor na superfície de uma célula NK potência a atividade citotóxica das células NK. Ainda em uma ou- tra modalidade, o anticorpo é um anticorpo anti-KIR de reação cruzada. Por exemplo, o anticorpo pode ser o anticorpo 1-7F9 em uma formulação tal co- mo descrita no WO2008/084106.

Em uma modalidade preferida, a dose é selecionada para pro- porcionar a saturação completa (pelo menos 90% de ocupação do alvo KIR2DL1, 2 e/ou 3) em pacientes humanos. O método inclui opcionalmente o paciente para avaliar a potenciação da célula NK e/ou atividade anti- inflamatória (ou anti-célula T) (o que pode ser realizado através da uso de qualquer técnica adequada, vários dos quais sendo conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, nível de ocupação de KIR2QDL1, 2 e/ou 3, marcador CD107a, tal como descrito na presente invenção). A formulação é normal- mente administrada por via i.v. A administração durante um período de tem- po adequado, tal como cerca de 1 hora.

Por exemplo, um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 pode ser ad- ministrado em uma dose e frequência de dosagem, pelo menos, atingido cerca de 90%, de preferência pelo menos cerca de 95% KIR2DL1, 2 e/ou 3 de ocupação em NK As células no plasma durante pelo menos cerca de um, dois, três ou seis meses, dessa maneira, depois de terem sofrido de satura- ção durante um período de tempo prolongado (por exemplo, pelo menos, 3 meses, 6 meses). Em modalidades separadas, a dose está na gama de cer- ca de 0,1 a cerca de 3 mg/kg, desde cerca de 0,3 a cerca de 3 mg/kg, desde cerca de 0,1 a cerca de 1 mg/kg e cerca de 1 a cerca de 3 mg/kg, ainda mais preferencialmente, na qual o anticorpo é um anticorpo anti-KIR, ainda mais preferencialMmente em que o anticorpo é o 1-7F9. A frequência de dosagem pode estar na gama de uma vez por dia para uma vez cada dois meses, a partir de cerca de uma vez por semana até cerca de uma vez a cada 2 me-

ses, ou cerca de uma vez por mês. Alternativamente, a frequência de dosa- gem pode ser selecionada a partir de cerca de três vezes, a cerca de duas Vezes, e cerca de uma vez por dia, cerca de cinco vezes, de cerca de quatro Vezes, a cerca de três vezes, e cerca de duas vezes por semana e cerca de umaveza cada duas, quatro e seis semanas.

Em uma modalidade preferida, uma dose de anticorpo anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3 resultando em substancialmente completa saturação do receptor (por exemplo, pelo menos cerca de 90% ou 95% de ocupação do receptor) é administrado a partir de cerca de 2 vezes por semana a cerca uma vez por mês, ou a partir de cerca de uma vez por mês para cerca de uma vez a cada 2 meses. A dose pode ser, por exemplo, administradas, pelo menos, 3 vezes, pelo menos 6 vezes, ou mais. Por exemplo, o método pode compreender a administração de um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 em uma dose e frequência de dosagem, pelo menos, atingir cerca de 90% ou 95% de KIR2DL1,2 e/ou 3 de ocupação em células NK por pelo menos cer- ca duas semanas, um mês, 6 meses, 9 meses ou 12 meses.

Em uma modalidade preferida, um regime resulta na saturação do receptor sustentada substancialmente completa. Uma dose de anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 resultando em saturação substancialmente completa doreceptor por um período de, pelo menos, cerca de | semana, 2 semanas ou 1 mês é administrada. Quando os resultados de dose em substancial- mente completa saturação do receptor (por exemplo, pelo menos cerca de 90% ou 95% de ocupação do receptor), durante cerca de uma semana, a dose pode ser administrada, por exemplo, entre uma vez por semana e uma veza cada duas semanas, quando os resultados de dose em substancial- mente saturação do receptor total para cerca de duas semanas, a dose pode ser administrada, por exemplo, entre uma vez cada duas semanas e uma vez por mês. Quando os resultados de doses na saturação do receptor subs- tancialmente completa durante cerca de duas semanas até cerca de um mês, a dose pode ser administrada, por exemplo, cerca de uma vez por mês. Em cada esquema, a dose pode ser, por exemplo, administrada pelo menos 3 vezes, pelo menos 6 vezes, ou mais. Por exemplo, o método pode compreender a administração de um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 em uma dose e frequência de dosagem, pelo menos, atingir cerca de 95% de ocupação KIR em células NK por pelo menos cerca de 6 meses, 9 meses ou 12 meses.

Em uma outra modalidade preferida, um regime intermitente re- sulta na saturação do receptor substancialmente completa. Uma dose de anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 resultando em substancialmente completa saturação do receptor (por exemplo, pelo menos cerca de 90% ou 95% de ocupação do receptor), por um período de, pelo menos, cerca de | semana, 2semanas ou 1 mês é administrada. Quando os resultados de doses na sa- turação do receptor substancialmente completa durante cerca de uma a du- as semanas, a dose pode ser administrada, por exemplo, cerca de uma vez por mês, ou uma vez por período de pelo menos dois meses (por exemplo, uma vez de dois em dois meses). Quando os resultados de doses na satura- ção do receptor substancialmente completa durante cerca de duas semanas até cerca de um mês, a dose pode ser administrada, por exemplo, cerca de uma vez por período de, pelo menos, dois meses (por exemplo, uma vez de dois em dois meses). Em modalidades separadas, a dose está na gama de cerca de 0,1 a cerca de 0,3 mg/kg, administrado uma vez por mês, em uma modalidade, a dose está na gama de cerca de 0,1 a cerca de 3 mg/kg, de preferência de 1 a cerca 3 mg/Kkg, administrado uma vez a cada dois meses (ou uma vez por período de mais de dois meses, isto é, menos do que uma vez por período de dois meses), ainda mais de preferência em que o anti- corpo é um anticorpo anti-KIR, ainda mais preferencialmente em que o anti- corpo é 1-7F9. O tratamento pode ser repetido de modo que o tratamento resulta na saturação regime intermitente receptor substancialmente comple- ta, por um período de pelo menos 6 meses, 9 meses ou 12 meses.

O anticorpo é tipicamente administrada por via intravenosa, mas outros modos de administração adequados são conhecidos, e também des- critosem, por exemplo, WO2008/084106.

Apesar de anti-KIR (1-7F9), ou a sua variante S241P é um anti- corpo preferido para a atividade de modulação de células NK e/ou tratamen-

to de doença, outros anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3, e os anticorpos anti-KIR podem ser também usados nos métodos de acordo com a presente invenção. Estes anticorpos devem, no entanto, têm valores semelhantes de Kd semelhante, o afastamento em um paciente, e um volume semelhante de distribuição, tal como anti-KIR (1-7F9), onde os meios "semelhantes" dentro de cerca de 50%, preferivelmente dentro de cerca de 30% de o correspondente anti-KIR (1-7F9) parâmetro. Anti-KIR (1-7F9) tem uma elevada afinidade de Kd de cerca de 4 ng/ml, e baixa afinidade de Kd de cerca de 20 ng/ml para doses de até 0.015 mg/kg, uma folga de cerca de 0,5 ml/h/kg, e um volume de dis- tribuição de cerca de 115 ml/kg (ver WO2008/084106). Um anticorpo anti- KIR2DL1 exemplar, 2 e/ou 3 útil em um ou mais dos métodos da presente invenção podem ter as seguintes propriedades: (a) reduz ou bloqueia a sina- lização de um inibidor KIR2DL1, 2 e/ou 3 em células NK, (b) uma elevada afinidade de Kd de cerca de 2 a cerca de 6 ng/ml, (c) uma menor afinidade dekKdde cerca de 10 a cerca de 30 ng/ml, (d) uma folga de cerca de 0,25 a cerca de 0,75 ml/h/kg, (e), um volume de distribuição de cerca de 50 ml/kg a cerca de 175 ml/kg. Anti-KIR2DL1, 2 e/ou ocupação do receptor 3 ' de anti- corpos pode ser determinada utilizando ensaios tal como descrito na presen- te invenção, adaptado para o particular KIR2DL1, 2 e/ou 3 ligado pelo anti- corpo. Vide, por exemplo, Exemplo 2. Propriedades Farmacocinéticas anti- KIR2DL1, 2 e/ou 3de anticorpos pode ser determinada utilizando ensaios tal como descrito na presente invenção, adaptado para o particular anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. Vide, por exemplo, o Exemplo 1.

DOENÇAS AUTOIMUNES Os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ser usados em composições, usos e métodos pa- ra o tratamento de doenças autoimunes. Exemplos de doenças ou distúrbios autoimunes incluem, mas não estão limitadas a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), atro- fiaespênica adquirida, uveite anterior aguda, encefalomielite aguda dissemi- nada (ADEM), artrite gotosa aguda, leucoencefalite hemorrágica necrosante aguda, sinusite aguda ou crônica, meningite purulenta aguda (ou outros dis-

túrbios inflamatórios do sistema nervoso central), inflamação grave aguda, doença de Addison, adrenalite, adulto aparecimento de diabetes mellitus em adultos (diabetes Tipo 1l), hipoparatiroidismo idiopático adulto (AOIH), Aga- maglobulinemia, agranulocitose, vasculite, incluindo vasculite (incluindo vas-

culite de grandes vasos (incluindo polimialgia reumática e artrite de célula gigante (de Takayasu)), condições alérgicas, dermatite de contato alérgico, dermatite alérgica, alergia angiite granulomatosa, doenças alérgicas de hi- persensibilidade, neurite alérgica, reação alérgica, alopecia areata, alopecia totalis, síndrome de Alport, alveolite (por exemplo, alveolite alérgica e alveoli-

te fibrosante), doença de Alzheimer, amilaidose, esclerose amilatrófica late- ral (ALS, doença de Lou Gehrig), um distúrbio relacionado com a eosinofilia

(por exemplo, eosinofilia), anafilaxia, espondilite anquilasante, antgiectasis, nefrite mediada por anticorpos, Nefrite Anti-GBM/Anti-TBM, doenças media-

das por meio do complexo antígeno-anticorpo, doença da membrana com base antiglomerular, a síndrome do anticorpo antifosfolipídeo, síndrome de antifosfolipídeo (APS), aftas, estomatite aftosa, anemia aplástica, arritmia, aterosclerose, doenças arterioscleróticas, a artrite (por exemplo, artrite reu- matoide, como artrite aguda, artrite reumatoide crônica), artrite crônica pro- gressiva, artrite deformante, ascaridíase, aspergilama (ou granulomas con-

tendo eosinófilas), aspergilase, aspermiogenese, asma (por exemplo asma brônquica, asma brônquica, e asma autoimune), ataxia telangiectasia, escle-

rose atáxica, aterosclerose, autismo, angioedema autoimune, anemia aplás-

tica autoimune, gastrite atrófica autoimune, diabetes autoimune, doença au- toimune do testículo e ovário, incluindo ooforite e orquite autoimune, distúr-

bios autoimunes, associadas com doenças do colagênio, disautonomia auto- imune, doença autoimune do ouvido (por exemplo, doença autoimune do ouvido interno (envelhecidos)), doenças endócrinas autoimunes incluindo tiroidite como tiroidite autoimune, síndrome autoimune enteropatia, insufici- ência gonadal autoimune, a perda auditiva autoimune, hemólise autoimune,

hepatite autoimune, doença autoimune de hepatologia, hiperlipidemia autoi- mune, doença autoimune, imunodeficiência autoimune da orelha interna (Al-

ED), miocardite autoimune, neutropenia autoimune, pancreatite autoimune,

Poliendocrinopatias autoimunes, síndrome poliglandular autoimune do tipo |, retinopatia autoimune, trombocitopênica púrpura autoimune (ATP), doença autoimune da tiroide, urticária autoimune, doenças gastrointestinais media-

das autoimune, neuropatias axonais e neuronais, doença de Balo, doença de Behçet, dano de reperfusão de isquemia benigna e familiar, angiite linfo- cítica benigna, a doença de Berger (nefropatia por IgA), pulmão de pássaro apreciador, cegueira, doença de Boeck, bronquiolite obliterante (sem trans- plante) vs NSIP, bronquite, aspergilase broncopneumônica, síndrome de Bruton, penfigoide bolhoso, síndrome de Caplan, Cardiomiopatia, isquemia cardiovascular, síndrome de Castleman, doença celíaca, doença celíaca (en- teropatia de glúten), degeneração cerebelar, isquemia cerebral e doenças de vascularização acompanhante, doença de Chagas, canalopatias (por exem-

plo, epilepsia), canalopatias do SNC, coriorretinite, coroireferide, distúrbio hematológico autoimune, hepatite crônica ativa ou a hepatite crônica ativa autoimune, dermatite de contato crônica, pneumonia eosinofílica crônica, síndrome da fadiga crônica, hepatite crônica, pneumonite por hipersensibili- dade crônica, artrite inflamatória crônica, polineuropatia desmielinizante in- flamatória crônica (CIDP), inflamação intratável crônica, candidíase mucocu- tânea crônica, neuropatia crônica (por exemplo, polineuropatias IgM ou neu-

ropatia mediada por IgM), doença obstrutiva crônica das vias aéreas, doença inflamatória pulmonar crônica, ostomielite multifocal crônica recorrente (CR- MO), tiroidite crônica (tiroidite de Hashimoto) ou tiroidite subaguda, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial/penfigoide benigna mucosal, doen-

ças inflamatórias do SNC, vasculite do SNC, doença celíaca, síndrome Co-

gans,doença de aglutinina fria, poliposa colite, colite, tais como colite ulcera- tiva, colite ulcerosa, colite colagenosa, condições que envolvem células T de infiltração e respostas inflamatórias crônicas, bloqueio cardíaco congênito, infecção da rubéola congênita, anemia Coombs positiva, doença arterial co- ronariana, Coxsackie miocardite, síndrome CREST (calcinose, fenômeno de

Raynaud), doença de Crohn, crioglobulinemia, síndrome de Cushing, ciclite (por exemplo, ciclite crônica, heterocrônico ciclite, iridocíclite, ou ciclite de Fuchs), fibrose cística, a toxicidade induzida por citocinas, surdez, artrite de-

generativa, doenças desmielinizantes (por exemplo, doenças autoimunes desmielinizantes), neuropatias desmielinizantes, dengue, dermatite herpeti- forme e dermatite atópica, dermatite, incluindo dermatite de contato, derma- tomiosite, dermatoses com componentes inflamatórias agudas, doença de Devic (neuromielite óptica), transtorno diabético artéria grande, nefropatia diabética, retinopatia diabética, anemia Diamond Blackfan, fibrose pulmonar intersticial difusa, cardiomiopatia dilatada, lúpus discoide, doenças envol- vendo a diapedese de leucócitos, síndrome de Dressler, contratura de Du- puytren, a infecção ecovirus, eczema incluindo eczema alérgico ou atópico, encefalite, como a encefalite de Rasmussen e encefalite límbica e/ou do tronco encefálico, encefalomielite (por exemplo, encefalomielite alérgica e encefalomielite alérgica experimental (EAE)), hiperplasia endarterial, endo- carreferide, oftalmotia endócrina, endometrioses, endomiocardiofibrose, en- doftalmia facoanafilática, endoftalmite, enterite allergica, síndrome de eosi- —nofilia-mialgia, eosinofílica faciitis, ceratoconjuntivite epidêmica, Epidermólise bolhosa adquirida (EBA), episclera, episclerite infecção pelo vírus Epstein- Barr, Eritema elevada et diutinum, eritema multiforme, eritema nodoso han- sênico, eritema nodoso, eritroblastose fetal, dismotilidade do esôfago, crio- globulinemia mista essencial, etmoide, síndrome de Evan, encefalomielite alérgica Experimental (EAE), deficiência de Fator VIII, pulmão do fazendeiro, febre reumática, síndrome de Felty, fibromialgia, alveolite fibrosante, flaria- sis, glomeruloesclerose segmentar e focal (FSGS), intoxicação alimentar, frontal, atrofia gástrica, artrite de células gigantes (artrite temporal), hepatite de células gigantes, polimialgia de células gigantes, glomerulonetfrites, glo- merulonefrite (GN) com e sem síndrome nefrótica, como glomerulonefrite crônica ou aguda (por exemplo, GN primária), síndrome de Goodpasture, artrite gotosa, síndromes associada à transfusão de granulócitos, granulo- matose incluindo granulomatose linfomatoide, granulomatose com poliangiite (GPA), uveite granulomatosa, doença de Graves, síndrome de Guillain- Barre, psoríase gutatte, hemoglobinúria paroxismática, doença de Hamman- Rich, doença de Hashimoto, encefalite de Hashimoto, tiroireferide de Hashi- moto, hemocromatose, anemia hemolítica ou anemia hemolítica imune, in-

cluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), anemia hemolítica, hemofilia A, púrpura de Henoch-Schônlein, herpes gestacional, vírus da imunodeficiência humana (HIV), hiperalgesia, hipogamaglobulinemia, hipogonadismo, hipopa- ratireoidismo, diabetes insipidus idiopática, paralisia facial idiopática, hipoti-

reoidismo idiopática, púrpura nefropatia por IgA, nefropatia membranosa idi- opática ou GN membranosa idiopática, síndrome nefrótica idiopática, fibrose pulmonar idiopática, sprue idiopática, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), nefropatia por IgA, doenças mediadas por IgE (por exemplo: anafilaxia e rinite alérgica e atópica), doença relacionada com esclerosante IgGA4, ileite regionalis, nefrite do complexo imune, as respostas imunitáriassociadas à hipersensibilidade mediada aguda e tardia por citocinas e linfócitos T, GN imune-mediada, lipoproteínas imunorreguladoras, incluindo síndrome da an- gústia respiratória adulta ou aguda (ARDS), miosite de corpos de inclusão, artrite infecciosa, a infertilidade devido aOs anticorpos antiespermatozoanos,

inflamação de toda ou parte da úvea, doença inflamatória do intestino (IBD) doenças inflamatórias hiperproliferativas da pele, miopatia inflamatória, dia- betes idependente de nsulina (tipo 1), insulite, cistite intersticial, doença pul- monar intersticial, fibrose pulmonar intersticial, irite, distúrbio de re-perfusão isquêmica, inflamação das articulações, artrite juvenil, dermatomiosite juve-

nil, diabetes juvenil, com início na juventude (Tipo 1), diabetes mellitus, inclu- indo diabetes mellitus dependente de insulina pediátrica (IDDM), apareci- mento da artrite reumatoide juvenil, síndrome de Kawasaki, ceratoconjuntivi-

te seca, kypanosomiasis, síndrome de Lambert-Eaton, leishmaniose, lepra, leucopenia, deficiência de adesão de leucócitos, vasculite leucocitoclástica,

leucopenia, líquen plano, líquen escleroso, conjuntivite lenhosa, dermatose por IgA linear, Linear doença IgA (LAD), síndrome de Loffler, hepatite lúpica, lúpus (incluindo nefrite, cerebrite, pediátrica, não renal, extra-renal, discoide, alopecia), Lúpus (SLE), o lúpus disseminado eritematoso, artrite de Lyme, doença de Lyme, pneumonite intersticial linfoide, malária, infertilidade autoi-

mune macho e fêmea, maxilar, vasculite meio navio (incluindo a doença de Kawasaki e poliartrite nodosa), GN proliferativa membrana ou membranosa (MPGN), incluindo Tipo | e Tipo Il, e rapidamente GN progressiva, GN mem-

branosa (nefropatia membranosa), doença de Méniêre, meningite, colite mi- croscópica, poliangeíte microscópica, enxaqueca, alteração nefropatia míni-

ma, doença mista do tecido conjuntivo (MCTD), mononucleose infecciosa, úlcera de Mooren, doença de Mucha-Habermann, neuropatia motora multifo-

cal, insuficiência endócrina múltipla, síndrome da lesão de múltiplos órgãos, tais como aqueles secundários a septicemia, trauma ou hemorragia, síndro-

me de lesão de múltiplos órgãos, esclerose múltipla (MS), tal como espino-

MS óptica, esclerose múltipla, papeira, distúrbios musculares, tais como a miastenia grave timoma associada à miastenia grave, miastenia grave, mio-

cardite, miosite, narcolepsia, enterocolite necrosante, e colite transmural e doença intestinal inflamatória autoimune, necrosante, cutânea ou vasculite de hipersensibilidade, síndrome neonatal lúpus (NLE), nefrose, síndrome nefrótica, doença neurológica, neuromielite óptica (do Devic), neuromielite óptica, neuromiotonia, neutropenia, linfocitose não cancerosos, uveite non-

granulomatous, timoma não-malignas, distúrbios inflamatórios orbitais e ocu- lares, penfigoide cicatricial ocular, ooforite, oftalmia simfática, síndrome op- soclonus myoclonus (OMS), síndrome opsoclonus ou opsoclonus myoclonus (OMS) e neuropatia sensorial, neurite óptica, orquite granulomatosa, artrose, reumatismo palíndromo, pancreatite, pancitopenia, PANDAS (Distúrbios neu-

—ropsiquiátricos autoimune pediátricos associados com Streptococcus), dege- neração cerebelar paraneoplásica, síndrome paraneoplásica, síndromes pa- raneoplásicas, incluindo síndromes paraneoplásicas neurológicas (por e- xemplo, síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou síndrome Eaton- Lambert), doenças parasitárias, tais como Lesihmania, hemoglobinúria paro-

xísticanoturna (PNH), síndrome de Parry Romberg, pars planitis (uveite peri- férica), síndrome Parsonnage-Turner, parvovirose, penfigoide como penfi- goide penfigoide bolhoso e pele, pênfigo (incluindo pênfigo vulgaris), pênfigo eritematoso, pênfigo foliáceo, membrana penfigoide do muco pênfigo, pênfi-

go, úlcera péptica, paralisia periódica, neuropatia periférica, perivenosa en-

cefalomielite, anemia perniciosa (anemia perniciosa), anemia perniciosa, uveíite facoantigênica, pneumonocirrose, síndrome POEMS, poliartrite nodo-

sa, poliartrite crônica primária do tipo |, Il, e Ill, policondrite (por exemplo,

policondrite refratária ou recorrente), doenças autoimunes poliendócrinas, insuficiência poliendócrina, síndromes poliglandulares (por exemplo, síndro-

mes poliglandulares autoimunes (ou síndromes de endocrinopatia poliglan- dular)), polimialgia reumática, polimiosite, polimiosite/dermatomiosite, poli-

neuropatias, poliradiculite acuta, síndrome pós-cardiotomia, uveíite posterior, ou uveíite autoimune, síndrome de infarto pós-miocárdio, síndrome pós, nefri-

te pós-estreptocócica, síndromes pós-vacinação, demência pré-senil, cirrose biliar primária, hipotireoidismo primário, mixedema idiopática primária, linfoci-

tose primário, que inclui linfocitose monoclonal de células B (por exemplo,

gamopatia monoclonal benigna e gmRNAopatia monoclonal de significado indeterminado, MGUS), mixedema principal, MS progressiva primária (PPMS) e recidivante remitente (RRMS), colangite esclerosante primária, progesterona dermatite, esclerose sistêmica progressiva, artrite proliferativa, psoríase, como a psoríase em placas, psoríase, artrite psoriática, Proteinose alveolar pulmonar, infiltração eosinofilia, anemia de células vermelhas pul- monar ou aplasia pura (PRCA), aplasia pura de glóbulos vermelhos, purulen-

ta ou sinusite não purulenta, psoríase pustulosa e psoríase das unhas, pieli-

tis, pioderma gangrenoso, tiroireferide de Quervain, fenômeno de Raynaud, artrite reativa, aborto de repetição, redução na resposta da pressão arterial,

distrofia simpático-reflexa, sprue refratária, doença de Reiter ou síndrome, policondrite recidivante, lesões de reperfusão do miocárdio ou outra tecidos, lesão de reperfusão, síndrome de angústia respiratória, síndrome das pernas inquietas, autoimunidade retiniana, fibrose retroperitoneal, síndrome de Rey- naud, doenças reumáticas, febre reumática, reumatismo, artrite reumatoide,

espondilite reumatoide, infecção por vírus da rubéola, síndrome de Sampter, sarcoidose, esquistossomose, síndrome Schmidt SCID e doençassociadas aos vírus Epstein-Barr, esclera, esclerite, esclerodatila, esclerodermia (inclu-

indo esclerodermia sistêmica), colangite esclerosante, esclerose dissemina-

da, esclerose, como esclerose sistêmica, perda auditiva sensoneural, es-

pondilaartrite soronegativo, síndrome de Sheehan, síndrome de Shulman, Silicose, síndrome de Sjogren A, esperma e autoimunidade testicular, sinusi-

te esfenoidal, síndrome de Stevens-Johnson, dura homem (ou dura pessoa)

síndrome, endocarreferide bacteriana subaguda (SBE), lúpus eritematoso cutâneo subagudo, perda auditiva súbita, síndrome de Susac, coréia de Si- denham, Simpático oftalmia, lúpus eritematoso sistêmico (SLE) ou lúpus eri- tematoso sistêmico (por exemplo, o SLEcutâneo), vasculite necrosante sis- têmica e vasculite associada ao ANCA, como Churg-Strauss, vasculite ou síndrome (CSS)), tabes dorsalis, arterite de Takayasu, telangiectasia, arterite temporal/arterite de células gigantes, tromboangite ubiterans, trombocitope- nia (por exemplo desenvolvida por pacientes com infarto do miocárdio), in- cluindo púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) e trombocitopenia autoi- mune ou imune mediada como púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), incluindo ITP crônica ou aguda, púrpura trombocitopênica (TTP), tireotoxico- se, lesão tecidual, síndrome de Tolosa-Hunt, necrôlise epidérmica tóxica, síndrome tóxico-choque, reação transfusional, hipogamaglobulinemia transi- tória da infância, mielite transversa, travessia mielite, tropical eosinofilia pul- monar, tuberculose, colite ulcerativa, indiferenciada doença do tecido conjun- tivo (UCTD), urticária (por exemplo, urticária alérgica crônica e urticária idio- pática crônica, incluindo urticária autoimune crônica), uveite (por exemplo, a uveite anterior), uveoretinite, valvulite, disfunção vascular, vasculite, artrite vertebral, vesicular dermatose, vitiligo, granulomatose de Wegener (agora denominado granulomatose com Poliangeíte (GPA), síndrome de Wiskott- Aldrich, ou a síndrome do IgM hiper ligado a X.

TRATAMENTO DO CÂNCER Os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ser usados em composições, usos e métodos pa- raotratamento do câncer (por exemplo, tumores).

Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carci- noma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem câncer de células escamosas, o câncer de pulmão (inclusive o câncer de pequenas células de pulmão, câncer de pulmão de célulasnão-pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma epidermoide de pulmão), o câncer do peritônio, câncer hepatode célula, câncer gástrico ou (incluindo câncer gastrointestinal), o câncer de pâncreas, glioblastoma,

câncer de colo uterino, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândulas salivares, renal ou câncer renal estômago, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de vulva, cân- cer de tireoide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, bem como linfoma de célula B (incluindo linfoma de baixo grau/folicular não-Hodgkin (NHL); pequeno linfocítica (SL) NHL; gra- de/folicular NHL intermediária; grau NHL intermediário difuso; grau NHL alto imunoblástico; grau NHL alto pequeno de célula não clivada; grau NHL alto linfoblásticpo; grau NHL de doença volumosa; célula linfoma de manto; linfo- ma relacionado com a AIDS, e macroglobulinemia de Waldenstrom); A leu- cemia linfocítica crônica (LLC), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia de células pilasas, leucemia mieloblástica crônica, mieloma múltiplo e doen- ça linfoproliferativa pós-transplante (PTLD).

O termo câncer passível de tratamento pela presente invenção incluem, mas não se limitando a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais específicos desses cân- ceres incluem bexiga, ovário, melanoma, câncer de células escamosas, o câncer de pulmão (inclusive o câncer de pequenas células de pulmão, cân- cerde pulmão de não pequenas células, adenocarcinoma do pulmão e car- cinoma epidermoide de pulmão), o câncer de peritônio, câncer hepatocelu- lar, câncer gástrico ou de estômago (incluindo câncer gastrointestinal), o câncer de pâncreas, glioblastoma, câncer de colo uterino, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterina, glândula salivar carcinoma, renal ou renal câncer, câncer de fígado, câncer de próstata, cân- cer de vulva, câncer de tireoide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, bem como linfoma de célula B (incluindo linfoma de baixo grau/folicular não-Hodgkin (NHL), linfocítica (SL) de NHL pequeno; grau intermediário/NHL folicular; pequenas células não-clivada de grau NHL alto; NHL de doença volumosa, linfoma de células do manto; grau intermedi- ário NHL difuso; grau alto imunoblástico NHL; grau NHL alto linfoblástico de linfoma relacionado com a AIDS e macroglobulinemia de Waldenstrom), leu- cemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia de células pilasas, leucemia mieloblástica crônica, e doença linfoproliferativa pós-transplante (DLPT), assim como a proliferação vascular anormal associ- ada com fakomatoses, edema (tal como a associada com tumores cere- brais), e síndrome de Meigs. De preferência, o câncer é selecionado do gru- po que consiste em câncer de mama, câncer colorretal, câncer retal, câncer de pulmão não-pequenas células, linfoma não Hodgkin (NHL), câncer de células renais, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer pancreático, —softsarcoma de tecido, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cabeça e pescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma e mieloma múltiplo. Em uma modalidade exemplar (Vide exemplos de trabalho) o câncer é um início avançado (metastático inclusive) da bexiga, ovário ou melanoma. Em uma outra modalidade, o câncer é do câncer colorretal. As doenças cancerosas passíveis de tratamento da presente invenção incluem cânceres metastáti- cos em que a expressão KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 por meio das célu- las supressoras mieloides derivadas suprimem as respostas antitumor e as respostas imunes anti-invasivas. O método da presente invenção é particu- larmente adequado para o tratamento de tumores vascularizados.

A presente invenção é também adequada para o tratamento de cânceres, em combinação com a quimioterapia ou a radioterapia ou a outros agentes biológicos e para aumentar a atividade dos mesmos, isto é, em indi- víduos em que a expressão KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 por meio das células supressoras mieloides derivadas suprimiram as respostas antitumo- raise eficácia de quimioterapia ou a radioterapia ou a eficácia biológica. Qualquer agente quimioterapêutico exibindo atividade anti-cancerígena pode ser usado de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, o agente quimioterapêutico pode ser selecionado de entre o grupo que consiste em agentes alquilantes, antimetabolitos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores relacionados, alcaloides da vinca, antibióticos, epipodopiillotoxinas, L-asparaginase, inibidores da topoisomera- se, interferonas, complexos de coordenação de platina, antracenedione substituído uréia, derivados metil hidrazina, adrenocorticais supressor, adre- nocorticosteroides, progesterona, estrógenos, antiestrógeno andrógenos, antiandrogênicos, e liberador de gonadotrofinas analógico hormonal. Mais preferencialmente, o agente quimioterapêutico pode ser selecionado de en- treogrupo que consiste em 5-fluorouracila (5-FU), leucovorina (LV), irenote- can, oxaliplatina, capecitabina, paclitaxel e doxetaxel. Dois ou mais agentes quimioterapêuticos pode ser usado em um coquetel a ser administrado em combinação com a administração do anticorpo anti-VEGF. Uma combinação preferida é a quimioterapia baseada em fluorouracila, que compreende 5-FU eumou mais outro agente quimioterapêutico (s). Regimes de dosagem a- dequados de quimioterapias combinadas são conhecidos na técnica e des- critos em, por exemplo, Saltz, e outros (1999) Proc ASCO 18: 233 a e Douil- lard, e outros (2000) Lancet 355: 1041-7. O bilógico pode ser outro potencia- dor do sistema imunológico, tais como os anticorpos para o PD-L1-L2, Pd, CTLAHA e DP-L1, PD-L2, as proteínas de fusão CTLA-4, bem como as cito- cinas, os antagonistas do fator de crescimento e agonistas, hormônios e anti anticorpos-citocina.

ALERGIAS Os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ser usados em composições, usos e métodos pa- ra o tratamento de alergias (por exemplo, reações alérgicas aos alérgenos). Exemplos de alérgenos incluem antígenos de ácaros e antíge- nos de pólen. As doenças alérgicas representativas são asma brônquica, rinite alérgica, dermatite atópica e alergias pólen e de insetos. A Diátese alérgica é um fator genético que pode ser herdado pelos filhos de pais alérgicos. Do- enças alérgicas familiares são também dilatações dasdoenças atópicas, e o fator causal, transmitido geneticamente é a diátese atópica. A " Dermatite atópica " é um termo geral para uma doença atópica, especialmente doen- çasacompanhadas por meio dos sintomas de dermatite. Os exemplos prefe- ridos incluem a condição alérgica que é selecionada a partir do grupo que consiste em eczema, rinite alérgica, febre dos fenos, urticária, e alergias ali-

mentares. Condições alérgicas incluem eczema, rinite alérgica ou coriza, febre do feno, asma brônquica, urticária (urticária) e alergias alimentares e outras condições atópicas

CONDIÇÕES INFLAMATÓRIAS E DOENÇAS INFLAMATÓRIAS Os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 descritos na presente invenção podem ser usados em composições, usos e métodos pa- ra o tratamento de condições inflamatórias e doenças inflamatórias. As condições inflamatórias e doenças inflamatórias, incluem, mas não estão limitados a doenças reumáticas (por exemplo, artrite reuma- toide, osteoartrite, artrite psoriática), espondilartropatias (por exemplo, es- pondilite anquilasante, artrite reativa, síndrome de Reiter), artropatias de cristal (por exemplo, gota, pseudogota, pirofosfato de cálcio doença de de- posição), esclerose múltipla, doença de Lyme, polimialgia reumática, doen- ças do tecido conjuntivo (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, esclero- dermia, polimiosite, dermatomiosite, síndrome de Sjogren); vasculitides (por exemplo, poliarterite nodosa, granulomatose de Wegener, de Churg-Strauss síndrome); condições inflamatórias, incluindo as consequências de trauma ou isquemia, sarcoidose, doenças vasculares, incluindo a doença ateroscle- rótica vascular, aterosclerose e doença oclusiva vascular (por exemplo, a aterosclerose, a doença isquêmica do coração, enfarte do miocárdio, doença vascular, acidente vascular cerebral, periférico), e reestenose vascular, do- enças oculares, incluindo uveite, doença da córnea, irite, iridocíclite, e cata- rata. As condições inflamatórias também incluem, mas não estão limi- tadas a ácido refluxo/azia, acne, acne vulgar, alergias e sensibilidades, Do- ença de Alzheimer, asma, aterosclerose e doença oclusiva vascular (por e- xemplo, aterosclerose, doença isquêmica cardíaca, enfarte do miocárdio, AVC, doença vascular periférica) e stent vascular, doenças autoimunes, bronquite, câncer, carreferide, catarata, doença celíaca, dor crônica, prostati- te crônica, cirrose, colite, doenças do tecido conjuntivo (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose sistêmica, polimiosite, dermatomiosite, sín- drome de Sjogren), doença da córnea, doença de Crohn, artropatias cristal

(por exemplo, Gout, Pseudogout, Cálcio doença de Depósito pirofosfato), Demência, Dermatite, Diabetes, olhos secos, eczema, edema, enfisema, fibromialgia, gastroenterite, gengivite, glomerulonefrite, coração doença, he- patite, pressão arterial alta, hipersensitivities, doenças inflamatórias intesti- nais, doenças inflamatórias, incluindo consequências do trauma ou isquemi- a, resistência à insulina, a cistite intersticial, Iridociclite, irite, dor nas articula- ções/artrite/artrite reumatoide, doença de Lyme, síndrome metabólica (sín- drome X), Esclerose Múltipla, miosite, nefrite, obesidade, doenças oculares, incluindo uveite, osteopenia, osteoporose, doença de Parkinson, doença inflamatória pélvica, doença periodontal, poliarterite, Policondrite, polimialgia reumática, psoríase, lesões de reperfusão, artrite reumática, doenças reumá- ticas (por exemplo, reumatoide reumatoide, osteoartrite, artrite psoriática), artrite reumatoide, sarcoidose, Esclerodermia, sinusite, síndrome de Sjôgren, cólon espástico, espondiloartropatias (por exemplo, espondilite anquilasante, artrite reativa, síndrome de Reiter), candidíase sistêmica, Tendinite, Rejeição ao Transplante, UTI, vaginite, doenças Vasculares, incluindo a doença ate- rosclerótica vascular, vasculites (por exemplo, poliarterite nodosa, granulo- matose de Wegener, Churg-Strauss) e vasculite.

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Os anti-KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 e anticorpos anti- KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 que se ligam seletivamente a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, e fragmentos de ligação ao antigênio dos mesmos, podem ser usados em métodos de diagnóstico para detectar a presença ou ausência de um Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Anti-KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 e os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 po- dem ser usados em métodos que compreende: (a) pôr em contato uma a- mostra de ensaio com um anticorpo, ou fragmento do mesmo, que se liga a um KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ou KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, e (b) ensaiar para complexos epitopo-anticorpo. O complexo anticorpo-epitopo pode ser detectado através de Western blot, radioimunoensaios, ELISA (en- saio imunoenzimático), imunoensaio do tipo " sanduíche ", ensaio de imuno- precipitação, a reação de precipitação, reação de precipitação de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, teste de fixação do complemento, imuno ensaio, imunoensaio fluorescente e um imunoensaio de proteína.

A amostra pode ser uma amostra de biópsia de tecido, linfa, urina, líquido cefalorraquidiano, líquido amniótico, de exsudado inflamatório, sangue, soro, fezes, ou líquido recolhido a partir do trato colorretal.

Os anticorpos que se ligam seletivamente a KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 podem ser recombinantes.

Os fragmentos de anticorpos que se ligam seletivamente a KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 podem ser um fragmen- to Fab, Fab ', F (ab ') 2, Fv, CDR paratopo, ou uma porção de um anticorpo que é capaz de se ligar ao antigênio.

Os anticorpos que se ligam seletiva- mente a KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 podem ser quiméricos, humaniza- dos, anti-idiotípicos, da cadeia simples, bifuncionais, ou coespecíficos.

Os anticorpos que se ligam seletivamente a KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 po- dem ser um fragmento ou é conjugado com um marcador, incluindo, mas não limitado a um marcador quimioluminescente, paramagnética marcador (por exemplo, o alumínio, o manganês, a platina, o oxigênio, o lantânio, luté- cio, escândio, ítrio, ou gálio), um agente de contraste MRI, marcador fluores- cente, marcador bioluminescente, ou o marcador radioativo.

Além disso, KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, anticorpos que se ligam seletivamente a KIR2QDL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, e fragmentos de liga- ção ao antigênio dos mesmos, podem ser ligados a um suporte sólido (por exemplo, esfera, tubo de ensaio, a folha, placa de cultura, ou tira de teste) como uma matriz.

O método pode incluir a imagem de um Polipeptídeo KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 por meio da tomografia por emissão de pósitrons (PET), CCD sistema de monitoramento de pouca luz, raios-x, tomografia computadorizada, cintilagrafia, foto acústica de imagem, emissão de fóton único de tomografia computadorizada (SPECT), ressonância magnética (RM), ultra-sonografia, paramagnética, e endoscópicos tomografia de coe- rência óptica.

A presente invenção pode compreender uma etapa de realiza- ção de um teste de avaliação ou etapa para avaliar a presença, a fase, a evolução da doença ou de classificação.

Dessa maneira, um método para o tratamento de uma doença autoimune ou inflamatória em um paciente pode compreender: (a) fazer uma avaliação da doença no paciente, e (b) se o re- ferido paciente tem uma doença adequados para o tratamento com um anti- corpo anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3 da presente invenção, a administra- ção ao referido paciente de uma dose eficaz de anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou 3. Opcionalmente, tal etapa de avaliação pode incluir a obtenção de uma amostra biológica a partir de um paciente suspeito de ter uma doença autoimune ou inflamatória.

Por exemplo, o genótipo de um paciente com ar- trite reumatoide KIR e HLA-C, pode proporcionar informação de previsão para a resposta à terapia anti-TNF-a.

Vide McGeough, e outros (2011) Rheumatology International.

Além disso, a expressão de isoformas KIR2DL está associada com a doença inflamatória do intestino.

Zhang, e outros (2008) Life Science Journal 5 (4): 17-22. Os métodos de avaliação da doen- ça (por exemplo, diagnóstico, o estadiamento) podem ser alcançados por meio de qualquer técnica adequada conhecida na técnica, por exemplo atra- vés da realização de um teste com base em laboratório.

Exemplos de técni- cas adequadas incluem a realização de um ensaio com base em CRP ou RT-CRP (por exemplo, para detectar a doença associada aos ácidos nuclei- cos ou genes, muitas vezes referida como "marcadores" ou "biomarcadores "), a biópsia, endoscopia, estudos de fezes, todos os testes de laboratório não invasivos (por exemplo, anemia e infecção, testes da função hepática para o ecrã para problemas do fígado e das vias biliares, os testes para as infecções bacterianas, virais e parasitárias), ultra-sons, TOC, MRE, técnicas deimagem de ressonância magnética e de outras, a análise cromossômica, as técnicas de detecção de imunoensaios/imunocitoquímica (por exemplo ensaios presença de autoanticorpos), histológicos e/ou histopatológico, ele- troforese de proteínas séricas, citometria de fluxo (por exemplo, a detecção de células do sistema imunológico, células T), o gás (ABG) de análise do sangue arterial (em asma ou DPOC), e as técnicas de exame físico (por e- xemplo, por meio dos sintomas físicos, número de articulações com sinovi-

te).

Além disso, os indivíduos com ativação dos genes KIR2DS1 e/ou KIR2DS2 são suscetíveis a desenvolver artrite psoriática, mas só quan- do ligantes HLA para seus receptores inibitórios homólogo, KIR2DL1 e KIR2DL2/3 estão em falta. A ausência de ligantes de inibidores KIR poderia diminuir o limiar para NK (e/ou T) a ativação de células mediada por meio dos receptores de ativação, contribuindo para patogênese da artrite psoriáti- ca. Martin, e outros (2002) The Journal of Immunology 169: 2818 a 2822. Os métodos compreendem a detecção da presença de autoanticorpos, por e- xemplo, a detecção de fator reumatoide (RHF), Os anticorpos anti-peptídeos citrulinados cíclicos, anti-ssRNA, anti-dsRNA, anti-Smith, antifosfolipídeo, antinucleares e/ou anti anticorpos-atina. Em uma modalidade, os métodos compreendem a avaliar os níveis de uma enzima proteolítica, um mediador inflamatório, um marcador de inflamação em progresso ou uma citocina pró- inflamatória. Em uma modalidade, os métodos compreendem a determina- ção (CRP), nível de proteína reativa-c e/ou a taxa de sedimentação de eri- trócitos. A determinação de que um indivíduo tem resultados anormais (indi- cativo de doença, exacerbação inflamação em curso), por exemplo, os níveis anormais de BAG, autoanticorpos, CRP qualquer enzima proteolítica, medi- ador inflamatório ou um marcador de inflamação em curso indica que o indi- víduoé adequado para o tratamento com um anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e/ou

3. Uma amostra biológica a partir de um paciente é avaliado quanto à pre- sença de células T, de preferência células T CD4 + e/ou células T ativadas e/ou de proliferação).

Ensaios de Seleção A presente invenção proporciona um método para identificação de moduladores (" ensaio de rastreio "), isto é, compostos candidatos ou de teste ou agentes (por exemplo, peptídeos, peptidomiméticos, moléculas pe- quenas ou outros fármacos) que se ligam a Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 tem um efeito estimulador ou inibidor, por exemplo, expressão de KIR2DL1, KIR2DL2, e a atividade de KIR2DL3 ou KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, ou tem um efeito estimulador ou inibidor sobre a interação entre KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 e do (s) seu (s) parceiro (s) de ligação natu-

ral.

A presente invenção proporciona ensaios para rastreio candidato ou compostos de teste que se ligam a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, ou porção de proteína ou polipetídeo biologicamente ativo, por exemplo, modu- landoa capacidade de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 de interagir com o (s) seu (s) parceiro (s) de ligação natural. Em uma outra mo- dalidade, a presente invenção proporciona ensaios para rastreio candidato ou compostos de teste que se ligam a ou modulam a atividade de uma prote- Ína ou porção de polipetídeo deKIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 ou biologi- camente ativo. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona en- saios para rastreio candidato ou compostos de ensaio que têm um efeito estimulador ou inibidor sobre as funções imunológicas regulados negativa- mente por KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, tais como são aqui identificados ou com base no seu efeito sobre a interação entre KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 e do (s) seu (s) parceiro (s) de ligação natural. Estas funções KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 relacionadas incluem a título de exemplo, a inibição da produção de citoquinas (por exemplo, IL-2, interferonao gama por meio das células T, suprimindo coestimulação de CD28 moderada, inibindo CD4 + e CD8 +, a proliferação de células T, proliferação supressora da ingê- nuasede memória CD4 + células T, e a ativação de TCR suprimindo sem induzir apoptose) os compostos de teste da presente invenção podem ser obtidos utilizando qualquer um dos numerosos métodos de bibliotecas com- binatórias de métodos conhecidos na técnica, incluindo: bibliotecas biológi- cas; endereçável espacialmente paralelo de bibliotecas de fase sólida ou em fase de solução, métodos sintéticos de biblioteca que necessitam de decon- volução, o método de biblioteca de "um-composto uma-conta " e métodos da biblioteca sintéticos usando seleção cromatografia de afinidade. A aborda- gem de biblioteca biológica está limitada a bibliotecas de peptídeos, enquan- to que as outras quatro abordagens são aplicáveis ao peptídeo, oligômero não peptídico, ou bibliotecas de pequenas moléculas dos compostos. Lam (1997) Fármacos Anticâncer Des. 12: 145.

Em uma modalidade, um ensaio é um ensaio com base em célu-

las, em que uma célula que expressa um KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ou porção de polipetídeo biologicamente ativo é posto em contato com um composto teste, e a capacidade do composto teste para modular a atividade de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 é determinado. A determinação da capa- cidadedo composto teste para modular a Atividade de KIR2QDL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 pode ser realizada por monitorização, por exemplo, a capacidade de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3e ligar ao seu parceiro de ligação natural (s), e modulam a atividade de células imunitárias. A célula imunitária pode ser uma célula T, uma célula B ou uma célula mieloide. Determinação da capacidade do composto teste para modular a ligação de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ao seu contra-receptor pode ser conseguida, por e- xemplo, por acoplamento de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, com um radioi- sótopo ou marcador enzimático para monitorar a capacidade de um compos- to teste para modular a KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ligação a as células T que expressam a KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 contra-receptor. A de- terminação da capacidade do composto de ensaio de KIR2QDL1, KIR2DL2, KIR2DL3 para ligação pode ser conseguida, por exemplo, por meio do aco- plamento do composto com um radioisótopo ou marcador enzimático tal que a ligação do composto a KIR2QDL1, KIR2DL2, KIR2DL3 pode ser determina- da pormeioda detecção ao composto KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 rotu- ladoo em um complexo.

Está também dentro do âmbito da presente invenção determinar a capacidade de um composto para interagir com KIR2DL1, KIR2DL?2, KIR2DL3 sem a rotulagem de qualquer um dos interatantes. Por exemplo, um microfisiômetro pode ser usado para detectar a interação de um compos- to com KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 sem a rotulagem de qualquer compos- to ou a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. McConnell, H. M. e outros. (1992) Science 257: 1906 a 1912. Um microfisiômetro (por exemplo, Citosensor) é um instrumento analítico que mede a taxa à qual uma célula acidifica o seu ambiente utilizando um sensor potenciométrico luz endereçável (LAPS). As alterações nesta taxa de acidificação podem ser usadas como um indicador da interação entre um composto KIR2QDL1, KIR2DL2 e KIR2DL3.

Um ensaio pode ser um ensaio com base em células que com- preende o contato de uma célula T que expressa um parceiro de ligação de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 com um composto de teste e determinar a capacidade do composto teste para modular (por exemplo, estimular ou ini- bir)a atividade do parceiro de ligação de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. À determinação da capacidade do composto teste para modular a atividade de um parceiro de ligação de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ser conse- guida, por exemplo, através da determinação da capacidade de polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 para se ligar a ou interagir com o parcei-

rodeligação de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. A determinação da capacidade do KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 polipeptídeo, ou um fragmento biologicamente ativo, para se ligar a ou interagir com um parceiro de ligação de KIR2Q2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, pode ser realizado por um dos métodos descritos acima para determinação de ligação direta.

Em uma modalidade, a determinação da capacidade de polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 para se ligar a ou interagir com um Parceiro de ligação de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ser realizado através da determinação da atividade do parceiro de ligação.

Por exemplo, a atividade do parceiro de ligação pode ser determinada através da detecção de indução de um segundo mensageiro de célula (por exemplo, tirosina-cinase ou a atividade da fosfatase), detectando atividade catalíti- ca/enzimática de um substrato adequado, detectando a indução do gene repórter (que compreende um elemento regulador alvo responsivo operati- vamente ligado a um ácido nucleico que codifica para um marcador detectá- vel, por exemplo, a luciferase), ou detectando uma resposta de célula regu- lada alvo.

Por exemplo, para determinar a capacidade do Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 para se ligar a ou interagir com um Parceiro de ligação de KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 singular, pode ser conseguida através da medição da capacidade de um composto para modular a coesti- —mulação de células imunitárias ou de inibição em um ensaio de proliferação, ou interferindo com a capacidade de Polipetídeo de KIR2QDL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 para se ligar a anticorpos que reconhecem uma porção de Polipe-

tídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Em uma modalidade, os compos- tos que modulam a ativação de células T podem ser identificados através da determinação da capacidade de um composto para modular a proliferação de células T ou a produção de citoquinas. Em uma modalidade, os compos- tos que modulam a ativação de células T podem ser identificados através da determinação da capacidade de um composto para modular a proliferação de células T ou a produção de citocinas em mais do que uma concentração de antigênio.

Um ensaio pode ser um ensaio livre de células em que uma por- ção biologicamente ativa ou polipetídeo de KIR2QDL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 mesma é contactado com um composto de teste e a capacidade do compos- to teste para se ligar a uma porção ou polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3 biologicamente ativo é determinado. As preferidas porções biologi- camente ativas da Polipetídeos KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 a serem usa- dasem ensaios da presente invencão incluem fragmentos que participam na interação com as não- moléculas de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, por exemplo, pelo menos uma porção de um domínio extracelular que se liga a um Parceiro de ligação de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. A ligação do composto em teste para a polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ser determinada diretamente ou indiretamente como acima descrito. O ensaio pode ser um ensaio livre de células em que uma por- ção biologicamente ativa ou polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 é conctatado com um composto de teste e a capacidade do composto teste para modular (por exemplo, estimular ou inibir) a atividade de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 porção polipetídeo ou biologicamente ativo é determi- nada. A determinação da capacidade do composto teste para modular a ati- vidade de um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ser con- seguida, por exemplo, através da determinação da capacidade de Polipetí- deo de KIR2QDL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 para se ligar a um Parceiro de liga- çãode KIR2DL1,KIR2DL?2, e KIR2DL3 através de um dos métodos descri- tos acima para a determinação da ligação direta. Os ensaios livres de célu- las da presente invenção são passíveis de uso de formas solúveis e/ou liga-

dos à membrana de polipetídeos (por exemplo, KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, ou porções de polipeptídeos biologicamente ativos, ou os parcei- ros de ligação em que KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 se liga). No caso dos ensaios isentos de células em que uma forma ligada à membrana de um polipetídeo é usada (por exemplo, uma superfície da célula KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3), pode ser desejável utilizar um agente solubilizante tal que a forma ligada à membrana do polipetídeo é mantida em solução. E- xemplos de tais agentes solubilizantes incluem detergentes não-iônicos, tais como n-octiglucosídeo, n-n-, dodecilglucosídeo dodecilmaltosida, octanoíl-N- —metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton & X-100, Triton & X-114, Thesit, Isotridecipoly (éter etileno-glicol) n, 3-[(3-colamidopropil) dimetilam- minio] sulfonato-1-propano (CHAPS), 3-[(3-colamidopropil) dimetilamminio]- 2-hidróxi-1-propano sulfonato (CHAPSO), ou N-dodecil.dbd.N, N-dimetil-3- amônio-1-propano sulfonato.

No caso dos métodos de ensaio, pode ser desejável imobilizar tanto KIR2QDL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 quanto o seu parceiro de ligação para facilitar a separação das formas não complexadas de formas complexada de ambos os polipetídeos, bem como acomodar a automatização do ensaio. À ligação de um composto de teste a um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, ou a interação de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 com o seu parceiro de ligação na presença e na ausência de um composto candidato, pode ser conseguida em qualquer recipiente adequado para con- ter o reagentes. Exemplos de tais vasos incluem placas de microtitulação, tubos de ensaio e tubos de micro-centrifugação. Uma proteína de fusão po- de serfornecida que adiciona um domínio que permite que um ou ambos os polipetídeos a ser ligado a uma matriz. Por exemplo, glutationa-S- transferase/KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, proteínas de fusão ou proteínas de fusão do parceiro de ligação/glutationa-S-transferase pode ser adsorvido sobre esferas de glutationa Sefarose & (Sigma Chemical, St. Louis, MO) ou glutationa derivatizados placas de microtitulação, que são então combinadas com o composto de ensaio ou o composto de teste e, ou o parceiro de liga- ção não adsorvido polipetídeo ou Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e

KIR2DL3 e a mistura incubada sob condições conducentes à formação de complexos (por exemplo, em condições fisiológicas para sal e pH). Após in- cubação, as esferas ou cavidades de placa de microtitulação são lavadas para remover quaisquer componentes não ligados, a matriz imobilizada no casodas esferas, e a formação do complexo é determinada quer diretamen- te quer indiretamente, por exemplo, tal como descrito acima. Alternativamen- te, os complexos podem ser dissociados da matriz, e o nível de ligação ou atividade de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 determinada usando técnicas padrão. Outras técnicas para a imobilização de polipetídeos em matrizes pode também ser usado nos ensaios de rastreio da presente invenção. Em uma modalidade alternativa, determinando a capacidade do composto teste para modular a atividade de um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ser realizada através da determinação da capacidade do composto teste para modular a atividade de uma molécula que funciona a jusante de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, por exemplo, através da intera- ção com o domínio citoplasmático de Parceiro de ligação de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Por exemplo, os níveis de mensageiros secundários, a atividade da molécula de interagir com um alvo adequado, ou a ligação do interagente para um destino apropriado pode ser determinada como descrito anteriormente.

Os moduladores de expressão de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 podem ser identificados por um método em que a célula é posta em contato com um composto candidato e a expressão de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 mRNA ou polipetídeo na célula é determinada. O nível de expressão de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 mRNA ou polipetídeo na presença do composto candidato é comparado com o nível de expressão de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 mRNA ou polipetídeo na ausência do com- posto candidato. O composto candidato pode depois ser identificado como um modulador de Expressão de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 com base — nestacomparação, se a mudança é estatisticamente significativa. Os polipeptídeos KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 podem ser usa- dos como "proteínas de isca" em um ensaio de dois híbridos ou um ensaio de três híbridos (Vide, por exemplo, Patente U.S.

No. 5.283.317; Zervos e outros (1993) Cell. 72: 223-232,.. Madura e outros (1993) J.

Biol Chem 268: 12046-12054,.. Bartel, e outros (1993) Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi e outros, (1993) Oncogene,. 8: 1693-1696 e WO 94/10300), para identificar outros polipetídeos que se ligam a ou interagem com KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ("proteínas de ligação de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 ", " proteí-

nas de ligação de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ", ou" KIR2DL1, KIR2DL2,

e KIR2DL3-bp ") e estão envolvidos na atividade de KIR2DL1, KIR2DL?2, KIR2DL3. Tais proteínas de ligação de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 tam-

bém são susceptíveis de serem envolvidos na propagação de sinais pelos polipeptídeos de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 ou KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 alvos como, por exemplo, os elementos a jusante de uma via de sinalização mediada por KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3. Alternativamente,

tais polipetídeos de ligação KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 podem ser os inibidores de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3. O sistema de dois híbridos ba- seia-se na natureza modular da maioria dos fatores de transcrição, que con- sistem em separáveis de ligação ao DNA e domínios de ativação.

Resumi- damente, o ensaio utiliza duas construções de DNA diferentes.

Em um cons- tructo, o gene que codifica para um Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e

KIR2DL3 é fundido com um gene que codifica o domínio de ligação ao DNA de um fator de transcrição conhecido (por exemplo, GAL-4). Na outra cons- trução, uma sequência de DNA, a partir de uma biblioteca de sequências de DNA, que codifica um polipetídeo não identificado ("preso" ou "amostra") é fundido com um gene que codifica para o domínio de ativação do fator de transcrição conhecido.

Se a "isca" e os polipeptídeos "presos" são capazes de interagir, in vivo, formando um complexo dependente de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 os domínios de ligação ao DNA e ativação do fator de transcrição são trazidos para perto.

Esta proximidade permite a transcrição de um gene repórter (por exemplo, LacZ), que está operativamente ligado a um local regulador da transcrição que responde ao fator de transcrição.

À expressão do gene repórter pode ser detectada e as colônias de células que contêm o fator de transcrição funcional podem ser isoladas e usadas para obter o gene clonado que codifica o polipetídeo, que interage com a Polipe- tídeo de KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3. Uma combinação de dois ou mais dos ensaios descrito na pre- sente invenção. Por exemplo, um agente modulador pode ser identificado utilizando uma célula ou com base em um ensaio livre de células, e a capa- cidade do agente para modular a atividade de um polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 pode ser confirmada in vivo, por exemplo, em uma animal tal como um modelo animal para a transformação de célula e/ou a tumorigênese.

A presente invenção diz ainda respeito a novos agentes identifi- cados por meio dosensaios de rastreio acima descritos. Um agente identifi- cado como nos métodos descrito na presente invenção em um modelo ani- mal adequado. Por exemplo, um agente identificado como descrito na pre- sente invenção (por exemplo, um agente modulador de KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3, uma molécula de ácido nucleico antissentido de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, um anticorpo específico KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3-, ou parceiro de ligação de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3) pode ser usado em um modelo animal para determinar a eficácia, toxicidade, ou efeitos colaterais do tratamento com um tal agente. Alternativamente, um agente identificado como descrito na presente invenção pode ser usado em um modelo animal para determinar o mecanismo de ação de um tal agente. Além disso, esta presente invenção refere-se a utilizações de novos agentes identificados pelos ensaios de rastreio acima descritos para tratamentos co- mo descrito na presente invenção.

Ensaios de detecção As porções ou fragmentos das sequências de cDNA identifica- das na presente invenção (e as sequências completas de genes correspon- dentes) podem ser usadas de diversas formas como reagentes de polinucle- otídeos. Por exemplo, estas sequências podem ser usadas para: (i) mapear os seus genes respectivos em um cromossoma e, dessa maneira, localizar as regiões de genes associados a doenças genéticas, (ii) identificar um indi- víduo a partir de uma amostra biológica por minuto (tipagem de tecidos); e

(iii) ajudar na identificação forense de uma amostra biológica. Estas aplica- ções estão descritas nas subseções a seguir.

Mapeamento de Cromossoma Uma vez que a sequência (ou uma porção da sequência) de um gene tiver sido isolada, esta sequência pode ser usada para mapear a locali- zação do gene em um cromossoma. Este processo é denominado como mapeamento de cromossomas. Dessa maneira, as porções ou fragmentos de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, as sequências nucleotídicas descritas na presente invenção, podem ser usadas para mapear a localização de genes de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 em um cromossoma. O mapeamento de sequências de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 aos cromossomos é um pri- meira etapa importante na correlação entre essas sequências com genes associados à doença. Resumidamente, os genes de KIR2DL1, KIR2DL?2, KIR2DL3 podem ser mapeados para cromossomas preparando os iniciado- res de CRP (preferencialmente 15-25 pb de comprimento) a partir das se- quências de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 nucleotídicas. A análise por computador das sequências de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 podem ser usadoas para prever os iniciadores que não abrangem mais do que um exo- na no DNA genômico, complicando assim o processo de amplificação. Estes iniciadores podem então ser usados para o rastreio por CRP de híbridos de células somáticas que contenham cromossomas humanos individuais. Ape- nas os híbridos que contenham o gene humano correspondente às sequên- cias de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 irão originar um fragmento amplifi- cado. Os híbridos de células somáticas são preparados por meio da fusão de células somáticas de mamíferos diferentes (por exemplo, células huma- nas e de camundongo). Como híbridos de células humanas e de camundon- go crescem e se dividem, elas perdem gradualmente os cromossomos hu- manos em ordem aleatória, mas mantêm os cromossomos do camundongo. Ao utilizar os meios de comunicação em que as células de camundongo não podem crescer, devido à falta de uma enzima particular, mas as células hu- manas podem, um cromossoma humano que contém o gene que codifica a enzima necessária será retida. Ao utilizar diferentes suportes, painéis de li-

nhas de células híbridas podem ser estabelecidos. Cada linhagem de células de um painel contém um único cromossoma humano ou um pequeno núme- ro de cromossomas humanos, e um conjunto completo de cromossomas de camundongo, permitindo fácil mapeamento de genes de cromossomas hu- manos individuais específicos. D'Eustáquio, e outros (1983) Science 220: 919-924. Híbridos de células somáticas contendo apenas fragmentos de cromossomas humanos podem também ser produzidos usando os cromos- somas humanos com translocações e deleções.

O mapeamento CRP de híbridos de células somáticas é um pro- cedimento rápido para atribuir uma sequência particular a um cromossoma particular. Três ou mais sequências podem ser afetadas por dia utilizando um único termociclador. Usando as sequências de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 de nucleotídeos para projetar os iniciadores oligonucleotídicos, sublocalização pode ser conseguida com painéis de fragmentos a partir de cromossomas específicos. Outras estratégias de mapeamento que podem ser similarmente usadas para mapear um KIR2QDL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 sequência para seu cromossoma incluem a hibridização in situ (descrito em Fan, e outros (1990) Proc Natl. Acad. Sei. EUA 87: 6223-27), pré-triagem com cromossomos classificados pelo fluxo rotulado e pré-seleção por meio da hibridização ao cromossomo de bibliotecas de cDNA específicos.

A hibridização in situ de fluorescência (FISH) de uma sequência de DNA para a propagação cromossômica metafásica pode ainda ser usada para fornecer uma localização cromossômica precisa em um única etapa. As barras de romossoma podem ser feitas utilizando células cuja divisão foi bloqueada em metafase por um produto químico, tais como colcemida, que interrompe o fuso mitótico. Os cromossomas podem ser tratados brevemen- te com tripsina, e depois corados com Giemsa. Um padrão de bandas claras e escuras em cada cromossoma desenvolve, para que os cromossomas possam ser identificados individualmente. A técnica FISH pode ser usada — comuma sequência de DNA tão curta quanto 500 ou 600 bases. No entanto, clones maiores do que 1,000 bases possuem uma maior probabilidade de se ligarem a uma localização cromossômica única com uma intensidade de si-

nal suficiente para uma detecção simples.

Preferencialmente 1.000 bases, e mais preferivelmente 2.000 bases serão suficientes para obter bons resulta- dos em um período de tempo razoável.

Para uma revisão desta técnica, Vide Verma e outros, Human Cromossomes: Manual of basic Tchniques (Perga- mon Press, New York, 1988). Os reagentes para mapeamento de cromos- somas podem ser usados individualmente para marcar um único cromosso- ma ou um único local em que o cromossoma, ou painéis de reagentes po- dem ser usados para a marcação de locais múltiplos e/ou vários cromosso- mas.

Os reagentes correspondem às regiões não codificantes dos genes que,na verdade, são preferidos para fins de mapeamento.

As sequências de codificação são mais susceptíveis de ser conservadas dentro de famílias de genes, aumentando assim a possibilidade de hibridação cruzada durante o mapeamento cromossômico.

Uma vez que uma sequência tenha sido mapeada para uma lo- calização cromossômica precisa, a posição física da sequência no cromos- soma pode ser correlacionada com dados do mapa genético em última aná- lise, a sequenciação completa dos genes de vários indivíduos pode ser reali- zada para confirmar a presença de uma mutação e para distinguir mutações a partir de polimorfismos.

Tipodo tecido As sequências de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 da presente invenção também pode ser usadas para identificar os indivíduos a partir de amostras biológicas.

Além disso, as sequências da presente invenção po- dem ser usadas para fornecer uma técnica alternativa que determina a se- —quênciade DNA base-por-base real de porções selecionadas do genoma de um indivíduo.

Dessa maneira, as Sequências de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 nucleotídicas descritas na presente invenção podem ser usadas para preparar dois iniciadores de CRP da extremidade 5 ' e 3' das sequên- cias.

Estes iniciadores podem então ser usados para amplificar o DNA de umindivíduoe posteriormente sequenciar os mesmos.

Os painéis de sequências de DNA correspondentes a partir de indivíduos, preparados desta forma, podem fornecer identificações individu-

ais únicas, uma vez que cada indivíduo terá um conjunto único de tais se- quências de DNA, devido a diferenças alélicas.

As sequências da presente invenção podem ser usados para obtenção de tais sequências de identifica- ção do indivíduo e do tecido.

As sequências de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 de nucleotídeos da presente invenção representam exclusivamen- te porções do genoma humano.

Variação alélica ocorrem em algum grau, as regiões codificantes dessas sequências e em um maior grau nas regiões não codificantes.

Estima-se que a variação alélica entre os seres humanos indi- viduais ocorre com uma frequência de cerca de uma vez por cada 500 ba- ses.

Cada uma das sequências aqui descrita pode, em algum grau, ser usa- da como um padrão contra o qual o DNA de um indivíduo pode ser compa- rado para fins de identificação.

Porque um número maior de polimorfismos ocorrem nas regiões não-codificadoras, menos sequências são necessárias para diferenciar os indivíduos.

As sequências não-codificantes da SEQ ID NO: 1 0ou4 podem confortavelmente fornecer uma identificação individual positiva com um painel de talvez 10 a 1,000 iniciadores que cada um rendi- mento de sequência não codificante amplificada de 100 bases.

Se as se- quências codificantes previstas, tais como aquelas na SEQ ID NO: 3 ou 6, são usadas, um número mais apropriado de iniciadores para a identificação individual positiva seria de 500 a 2000. Se um painel de reagentes de Sequências de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 nucleotídicas descritas na presente invenção é usado para gerar um banco de dados de identificação único para um indivíduo, es- ses mesmos reagentes podem mais tarde ser usados para identificar o teci- do desse indivíduo.

Utilizando a base de dados de identificação único, a i- dentificação positiva do indivíduo, vivo ou morto, pode ser feita a partir de amostras de tecido extremamente pequenas.

Uso de Sequências de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 em Biolo- gia Forênsica As técnicas de identificação à base de DNA também podem ser usadas em biologia forense.

As sequências da presente invenção podem ser usadas para fornecer reagentes de polinucleotídeo, por exemplo, iniciadores de CRP, orientados para pontos específicos no genoma humano, o que po- de aumentar a fiabilidade das identificações forenses baseadas em DNA, por exemplo, proporcionando outro "marcador de identificação" (ou seja, uma outra sequência de DNA que é única para um indivíduo em particular). Como mencionado acima, as informações da sequência de bases real pode ser usada para a identificação como uma alternativa fiável para padrões forma- dos por meio dos fragmentos de enzima de restrição gerada. Sequências específicas para as regiões não codificadoras da SEQ ID NO: 1 ou 3 são particularmente apropriadas para esta uso, como um maior número de poli- —morfismos ocorrem nas regiões não codificantes, o que torna mais fácil para diferenciar os indivíduos que usam esta técnica. Exemplos de reagentes de polinucleotídeos incluem as sequências de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3de nucleotídeos, ou partes dos mesmos, por exemplo, fragmentos derivados das regiões não codificadoras da SEQ ID NO: 1 ou 3 com um comprimento de pelo menos 20 bases, preferencialmente pelo menos 30 bases. As sequências de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 nucleotídicas des- critas na presente invenção podem ainda ser usados para fornecer reagen- tes de polinucleotídeo, por exemplo, sondas marcadas ou labelable que po- dem ser usadas em, por exemplo, uma técnica de hibridação in situ, para identificar um tecido específico, por exemplo, linfócitos. Isto pode ser muito Útil nos casos em que um patologista forense é apresentado com um tecido de origem desconhecida. Painéis de tal KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 sondas podem ser usadas para identificar o tecido por espécie e/ou tipo de órgão. De um modo semelhante, estes reagentes, por exemplo, os iniciado- res de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ou sondas podem ser usados para a cultura de tecido de tela de contaminação (por exemplo, rastrear a presença de uma mistura de diferentes tipos de células em cultura).

Ensaios Diagnósticos Um método exemplificativo para a detecção da presença ou au- — sência de polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ou ácido nucleico em uma amostra biológica envolve a obtenção de uma amostra biológica a partir de um indivíduo do teste e o contato da amostra biológica com um composto ou um agente capaz de detectar polipetíideo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ou ácido nucleico (por exemplo, MRNA ou DNA genô- mico) que codifica para Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 tal que a presença de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ou ácido

—nucleico que é detectada na amostra biológica.

Um agente preferido para a detecção de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 MRNA ou DNA genômico é uma sonda marcada de ácido nucleico capaz de hibridar com KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 MRNA ou DNA genômico.

A sonda de ácido nucleico pode ser, por exemplo, a KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 3, ou uma porção do mesmo, tal como um oligonucleotídeo de pelo menos 15, 30, 50, 100, 250 ou 500 nucleotídeos de comprimento e suficiente para hibridizar especificamente sob condições rigo- rosas para KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 de MRNA ou de DNA genômico.

Outras sondas adequadas para uso em ensaios de diagnóstico da presente invenção são descrito na presente invenção.

Um agente preferido para a detecção de Polipetídeo de KIR2QDL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 é um anticorpo capaz de se ligar a Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, de prefe- rência um anticorpo com um marcador detectável.

Os anticorpos podem ser policlonais, ou mais de preferência, monoclonais.

Um anticorpo intato, ou um fragmento do mesmo (por exemplo, Fab ou F (ab ') 2) podem ser usados.

O termo "marcado", no que diz respeito à sonda ou anticorpo, destina-se a a- branger a marcação direta da sonda ou anticorpo por acoplamento (isto é, ligante fisicamente) uma substância detectável à sonda ou anticorpo, assim como marcação indireta da sonda ou anticorpo por reatividade com um outro reagente que está diretamente marcado.

Exemplos de marcação indireta incluem detecção de um anticorpo primário, utilizando um anticorpo secun- dário marcado por fluorescência e de fim de rotulagem de uma sonda de DNA com biotina de tal modo que pode ser detectada com estreptavidina marcada com fluorescência.

O termo "amostra biológica" destina-se a incluir tecidos, células e fluidos biológicos, isolado a partir de um indivíduo, bem como tecidos, células e fluidos presentes em um indivíduo.

Isto é, o método de detecção da presente invenção pode ser usado para detectar KIR2DL1,

KIR2DL2, e KIR2DL3 MRNA, polipeptídeo, ou o DNA genômico em uma amostra biológica, in vitro, bem como in vivo.

Por exemplo, as técnicas in vitro para a detecção de MRNA de DP-L2 incluem Northern e hibridações em hibridações in situ.

Nas técnicas in vitro para detecção de Polipetídeo de KIR2DL1,KIR2DL2, e KIR2DL3 incluem ensaios de imunossorção com en- zima ligada (ELISA), Western blots, imunoprecipitações e imunof luorescên- cia.

Nas técnicas in vitro para detecção de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 do DNA genômico incluem as hibridações Southern.

Além disso, técnicas in vivo para a detecção de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 in- cluem a introdução em um indivíduo de um anticorpo anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 marcado.

Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado com um marcador radioativo cuja presença e localização de um objeto pode ser detectadao por meio das técnicas de imagem padrão.

A amostra biológi- ca contém as moléculas de polipetídeos a partir do indivíduo teste.

Alternati- vamente, a amostra biológica pode conter as moléculas de mRNA do indiví- duo do teste ou moléculas de DNA genômico a partir do indivíduo teste.

Uma amostra biolica preferida uma amostra de soro isolada por meios convencio- nais de um indivíduo.

Em uma outra modalidade, os métodos envolvem a obtenção de mais de uma amostra biológica a partir de um indivíduo de con- trolede controle, o contato da amostra de controle com um composto ou a- gente capaz de detectar o Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, MRNA, ou DNA genômico, de forma que a presença de polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, mRNA ou DNA genômico é detectada na amostra biológica, e comparar a presença de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, o MRNA ou o DNA genômico na amostra de controle com a presença de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, MRNA ou DNA genômico na amostra de teste.

A presente invenção também inclui kits para a detecção da pre- sença de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, em uma amostra biológica.

Por exemplo, o kit pode compreender um composto marcado ou agente capaz de detectar a Polipetídeo de KIR2QDL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ou MRNA em uma amostra biológica, meios para determinar a quantidade de KIR2DL1,

KIR2DL2, e KIR2DL3 na amostra, e meios para comparar o quantidade de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 na amostra com um padrão.

O composto ou agente pode ser embalado em um recipiente adequado.

O kit pode compre- ender ainda instruções para uso do kit para detectar Polipetídeo de KIR2DL1,KIR2DL2, e KIR2DL3 ou ácido nucleico.

Ensaios prognósticos Os métodos de diagnóstico descritos na presente invenção po- dem ainda ser usados para identificar os indivíduos com ou em risco de de- senvolver uma doença ou distúrbio associado com KIR2DL1 aberrante ou indesejado, KIR2DL2, e KIR2DL3 expressão ou atividade.

Tal como usado na presente invenção, o termo "aberrante" inclui uma expressão ou atividade de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 que se desvia do tipo selvagem, Expres- são ou atividade de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Expressão ou atividade aberrante inclui a expressão aumentada ou diminuída ou atividade, bem co- mo a expressão ou atividade que não segue o padrão de desenvolvimento tipo selvagem de expressão ou o padrão de expressão subde célula.

Por exemplo, A expressão ou atividade KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 aberrante destina-se a incluir os casos em que uma mutação no Gene de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 faz com que a Gene de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 venha a ser sub-expresso ou sobre-expresso e situações em que tais mutações resultam em um polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 não-funcional ou um polipetídeo que não funciona de uma forma de tipo selvagem, por exemplo, um polipetídeo que não interage com um Parceiro de ligação de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3, ou um que interage comum não-KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 parceiro de ligação.

Tal como usado na presente invenção, o termo "indesejado" inclui um fenômeno inde- sejável envolvido em uma resposta biológica, tais como a ativação de célu- las imunes.

Por exemplo, o termo inclui uma indesejada a expressão ou ati- vidade de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 que é indesejável em um indiví- duo.

Os ensaios descrito na presente invenção, tais como os ensaios de diagntico precedentes ou os ensaios seguintes, podem ser usados para identificar um indivíduo que tem, ou em risco de desenvolver uma doença associada com uma desregulação da atividade KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 de polipetídeo ou ácido nucleico de expressão, tal como uma do- ença autoimune, uma doença de imunodeficiência, uma doença do sistema imunitário, tais como a auto-imunidade, alergia ou doença inflamatória ou câncer.

Dessa maneira, a presente invenção proporciona um método para identificação de uma doença ou distúrbio associado com aberrante ou inde- sejada A expressão ou atividade de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 em que uma amostra de teste é obtida a partir de um indivíduo e Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ou ácido nucleico (por exemplo, MRNA ou DNA genômico) é detectado, em que a presença de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ou ácido nucleico que é diagnosticado em um indivíduo com ou em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio as- sociado com aberrante ou indesejada Expressão de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 ou atividade.

Como usado na presente invenção, uma "amostra de teste" refere-se a uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo de interesse.

Por exemplo, uma amostra teste pode ser um fluido biológico (por exemplo, fluido cerebrospinal ou no soro), amostra de célula, ou tecido.

Além disso, os ensaios de prognósticos descritos na presente invenção podem ser usados para determinar se um indivíduo pode ser ad- ministrado um agente (por exemplo, um agonista, antagonista, polipetídeo, peptídeo, peptidomimético de ácido nucleico, molécula pequena, ou outro candidato o fármaco) para tratar uma doença ou distúrbio associado com KIR2DL1 aberrante ou indesejado, KIR2DL2, e KIR2DL3 expressão ou ativi- dade.

Por exemplo, tais métodos podem ser usados para determinar se um indivíduo pode ser eficazmente tratado com um agente para um distúrbio autoimune, doença de imunodeficiência, câncer do sistema imunitário, ou distúrbio alérgico ou inflamatório.

Dessa maneira, a presente invenção pro- porciona métodos para determinar se um indivíduo pode ser eficazmente tratado com um agente para um distúrbio associado com a expressão ou atividade de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 aberrante ou indesejado de uma amostra de teste que é obtida e Expressão de KIR2DL1, KIR2DL2, e

KIR2DL3 de polipetídeo ou ácido nucleico ou atividade for detectada (por exemplo, em que a abundância de Expressão ou atividade de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 de polipetídeo ou ácido nucleico é diagnóstico de um indivíduo que pode ser administrado ao agente para tratar um distúrbio as- sociado a expressão ou atividade de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 aber- rante ou indesejada). Os métodos da presente invenção também podem ser usados para detectar alterações genéticas em Gene de KIR2DL1, KIR2DL?2, e KIR2DL3, determinando assim se um indivíduo com o gene alterado é o risco de uma doença caracterizada pela desregulação de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 atividade polipetídeo ou expressão de ácido nucleico, tal como uma doença autoimune, uma doença de imunodeficiência, um cân- cer do sistema imunitário, um distúrbio alérgico, ou uma doença inflamatória. Os métodos descritos na presente invenção podem ser realizados, por e- xemplo, por meio do uso de kits de diagnóstico pré-embalados que compre- endem pelo menos um ácido nucleico sonda ou reagente de anticorpo des- crito na presente invenção, que podem ser convenientemente usados, por exemplo, em situações clínicas para diagnosticar os pacientes que exibem sintomas ou história familiar de uma doença ou enfermidade envolvendo um Gene de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Além disso, qualquer tipo de célu- la ou tecido no qual KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 é expresso pode ser usado nos ensaios de prognósticos descritos na presente invenção.

IMUNOENSAIOS Os anticorpos KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 e fragmentos de ligação ao antigênio que se ligam a KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, e podem ser usados em imunoensaios para qualitativa ou quantitativamente detectar e analisar os marcadores em uma amostra. Este método compreende o for- necimento de um anticorpo se liga especificamente a um KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, em contato uma amostra com o anticorpo, e detecção da pre- sença de um complexo do anticorpo ligado ao marcador na amostra. KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 e podem ser detectados e/ou quantificados usando qualquer um de uma série de ensaios bem conhecidos de ligação imunológica. Ensaios úteis incluem, por exemplo, em um ensaio imunológico de enzima (EIA), tais como o ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), um ensaio de Western blot, ou um ensaio de mancha da ranhura. Vide, por exemplo, Patente U.S. Nºs

4.366.241; 4376110; 4.517.288, e 4.837.168. Geralmente, uma amostra ob- tidaa partir de um indivíduo pode ser conctatado com o anticorpo se liga especificamente a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3.

Opcionalmente, o anticorpo pode ser fixado a um suporte sólido para facilitar a lavagem e o isolamento subsequente do complexo, antes de contactar o anticorpo com uma amostra. Exemplos de suportes sólidos in- cluem, mas não estão limitados a vidro ou de plástico, na forma de, por e- xemplo, uma placa de microtitulação, uma vareta, uma grânulo, ou uma mi- croconta. Os anticorpos podem ser ligados a um suporte sólido.

Depois da incubação da amostra com Os anticorpos, a mistura é lavada e o complexo anticorpo-marcador formado pode ser detectado. Isto pode ser conseguido através da incubação da mistura lavada com um rea- gente de detecção. Alternativamente, o marcador na amostra pode ser de- tectada utilizando um ensaio indireto, em que, por exemplo, um segundo anticorpo marcado é usado para a detecção de anticorpos específicos do marcador ligado e/ou em um ensaio de competição ou inibição, em que, por exemplo, um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo distinto do mar- cador são incubados simultaneamente com a mistura.

Ao longo do ensaio, a incubação e/ou etapas de lavagem pode ser necessária depois de cada combinação de reagentes. As etapas de in- cubação podem variar de cerca de 5 segundos a várias horas, de preferên- ciade cerca de 5 minutos até cerca de 24 horas. No entanto, o tempo de incubação dependerá do formato do ensaio, o marcador, o volume de solu- ção, a concentração. Normalmente, os ensaios serão realizados à tempera- tura ambiente, embora possam ser conduzidos ao longo de um intervalo de temperaturas (por exemplo, 10 a 40).

O imunoensaio pode ser usado para determinar um valor de en- saio de um marcador em uma amostra a partir de um indivíduo. Em primeiro lugar, uma quantidade de ensaio de um marcador em uma amostra pode ser detectada usando os métodos de imunoensaio descritos acima na presente invenção. Se um marcador está presente na amostra, o que vai formar um complexo anticorpo-marcador com um anticorpo se liga especificamente o marcador sob condições de incubação adequadas descritas acima. A quan- tidadede um complexo anticorpo-marcador pode, opcionalmente, ser deter- minada por meio da comparação com um padrão. Como observado acima, o valor de ensaio do marcador não precisa ser medida em unidades absolutas, enquanto a unidade de medida pode ser comparada com um valor de con- trole e/ou sinal. Vários imunoensaios são conhecidos na técnica e o Polipetí- deode KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 descrito na presente invenção pode ser usado em tais imunoensaios, incluindo mas não se limitando a RADIOI- MUNOensaio (RIA), ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), imuno- magnética, imunotransferência, Western blot, ensaios de imunoprecipitação, análise imuno-histoquímica e separação de células ativadas por fluorescên- cia(FACS). Vide Wild, (2008) [ed.]] The Immunoassay Handbook [3 Ed.] El- sevier.

MÉTODOS DE RADIOIMUNOLOGIA Os anticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 podem ser u- sados em métodos de radioimagiologia para diagnóstico de câncer, incluindo o câncer dos pâncreas e colorretal, ou monitor a progressão de tumores. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, tomografia de emissão de positrões (PET), tomografia de emissão de fóton único (SPECT). Ambas estas técnicas não são invasivas, e podem ser usadas para detectar e/ou medir uma vasta variedade de casos de tecidos e/ou funções, tais como de- tecção de células cancerígenas, por exemplo. SPECT podem ser usados opcionalmente com dois rótulos simultaneamente. Vide a patente U.S. No.

6.696.686.

APLICAÇÕES E MÉTODOS COMERCIAIS A presente invenção proporciona ainda a produção de anticor- pos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 para alcançar quantidades comer- ciais. Os anticorpos Anti-KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 podem ser produzi- do em larga escala, armazenados, se necessário, e fornecidos aos hospitais,

médicos ou outros estabelecimentos de saúde.

Os métodos de produção, armazenamento e distribuição dos an- ticorpos anti-KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 podem ser produzidos pelos métodos descritos na presente invenção. Após a produção, os anticorpos — Anti-KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 podem ser colhidos, purificados e, op- cionalmente, armazenados antes do tratamento de um paciente. Por exem- plo, quando um paciente apresenta-se com uma indicação, como, por exem- plo, câncer, doenças autoimune, ou condição inflamatória, os anticorpos an- ti-KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 podem ser encomendados e fornecidos em tempo hábil. Por conseguinte, a presente invenção refere-se a métodos de produção de anticorpos KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 a atingir a uma esca- la comercial, as composições Farmacêuticas que compreende Os anticorpos e fragmentos de antigênio de ligação da mesma, que se ligam seletivamente a KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, bem como métodos de fornecer (ou seja, produção, opcionalmente, armazenar e vender) os anticorpos Anti-KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 aos hospitais e médicos. A produção de anticorpos an- ti-KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 pode ser ampliaa para uso comercial.

A presente invenção também proporciona métodos para a reali- zação de uma atividade Farmacêutica que compreende, que estabelece um sistema de distribuição para distribuir a preparação para a venda ou pode incluir o estabelecimento de um grupo de vendas para comercialização da preparação Farmacêutica.

BIBLIOTECA DE ÁCIDOS NUCLEICOS Uma biblioteca variegada de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 e va- riantes podem ser geradas por meio da mutagênese combinatória ao nível do ácido nucleico e é codificada por uma biblioteca de genes variegada. Uma biblioteca variegada de variantes de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 po- de ser produzida por, por exemplo, ligante enzimaticamente uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos em sequências de genes de tal modo que um conjunto degenerado de potenciais sequências de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 expressas como polipetídeos individuais, ou alternativamente, co- mo um conjunto de proteínas de fusão maiores (por exemplo, para exibição em fagos) contendo o conjunto de Sequências de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 das mesmas. Há uma variedade de métodos que podem ser usa- dos para produzir as bibliotecas de potencial de variantes de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 de uma sequência oligonucleotídica degenerada. A sín- tese química de uma sequência genética degenerada pode ser realizada em um sintetizador automático de DNA, e o gene sintético então ligados em um vetor de expressão apropriado. Uso de um conjunto degenerado de genes permite o fornecimento, em uma mistura, de todas sequências que codificam para o conjunto desejado de Sequências de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 potenciais. Métodos para a síntese de oligonucleotídeos degenerados são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura, e outros (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, e outros (1984) Science 198: 1056; lke e outros (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477. Além disso, as bibliotecas de fragmentos de uma sequência de codificação de polipeptídeo KIR2QDL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 podem ser usa- das para gerar uma população variada de fragmentos de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 para rastreio e subsequente seleção de variantes de Polipetídeo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Uma biblioteca de fragmen- tos de sequências de codificação pode ser gerada por meio do tratamento de um fragmento de CRP da cadeia dupla da sequência de codificação de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3 com uma nuclease sob condições em que ocorre apenas nicking cerca de uma vez por cada molécula, desnaturação do DNA da cadeia dupla, o DNA a renaturação formar o DNA da cadeia du- pla que pode incluir sentido/antissentido a partir de pares diferentes produtos cortados, removendo porções da cadeia simples a partir de dúplices refor- madas, por meio do tratamento com nuclease S1, e ligante a biblioteca de fragmentos resultante em um vetor de expressão. Por este método, uma bi- blioteca de expressão pode ser derivada que codifica para Do terminal N, Terminal C e fragmentos internos de vários tamanhos de KIR2DL1, —KIR2DL2,e KIR2DL3 polipeptídicos.

Várias técnicas são conhecidas na técnica para rastreio de pro- dutos de genes de bibliotecas combinatórias realizadas por meio das muta-

ções pontuais ou truncagem, e para o rastreio de bibliotecas de cDNA para produtos de genes com uma propriedade selecionada. Tais técnicas são a- daptáveis para a seleção rápida das bibliotecas de genes gerados por meio da mutagênese combinatória de Polipetíideo de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. As técnicas mais largamente usadas, as quais são passíveis de análise por meio de alta-posto, para o rastreio de grandes bibliotecas de ge- nes incluem normalmente a clonagem da biblioteca de genes em vetores de expressão replicáveis, transformação das células adequadas com a bibliote- ca de vetores resultante, e expressando os genes combinatórios em condi- çõesemas quais a detecção de uma atividade desejada facilita o isolamento do vetor que codifica o gene cujo produto foi detectado. Mutagênese conjun- to recursiva (REM), uma nova técnica que aumenta a frequência de mutan- tes funcionais nas bibliotecas, pode ser usada em combinação com os en- saios de rastreio para identificar as variantes de KIR2DL1, KIR2DL2, e KIR2DL3. Arkin e Youvan (1992) Proc Natl. Acad. Sci. EUA 89: 7811-7815; Delagrave e outros (1993) Protein Eng.. 6 (3): 327-331.

Todas publicações (por exemplo, a literatura não de patentes), patentes, publicação de patentes, publicações e pedidos de patente men- cionadas neste relatório descritivo são indicativos do nível de perícia da- queles que são versados na técnica à qual a presente invenção pertence. Todas estas publicações (por exemplo, a literatura não de patentes), paten- tes, aplicações de patentes, publicações e pedidos de patente são incorpo- rados aqui por meio de referência na mesma extensão como se cada publi- cação, patente, publicação de pedido de patente ou pedido de patente foi especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por meio de referência.

EXEMPLOS A presente invenção agora a ser de uma maneira geral descrita, será mais facilmente compreendida por meio de referência aos exemplos seguintes, que são incluídos apenas para fins de ilustração de certos aspec- tos e modalidades da presente invenção, e não se destinam a limitar a pre- sente invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

FARMACOCINÉTICA EM PACIENTES As concentrações plasmáticas de anticorpos anti-KIR (1-7F9) são determinadas por ELISA, como descrito resumidamente a seguir.

As placas são revestidas com uma solução de revestimento de KIR2DL3 (100ul/cavidade) e incubadas durante a noite a cerca de 4. As placas são então lavadas três vezes com tampão de lavagem, utilizando um lavador de placas automático (400ul/cavidade). O tampão de bloqueio é adi- —cionada (200 ul por cavidade) e as placas são incubadas durante cerca de 2 horas, em um agitador de placas à temperatura ambiente. Depois disso, as placas são mais uma vez lavadas 3 vezes com tampão de lavagem (400ul/cavidade).

Os controles de qualidade padrão e as amostras são adiciona- dasãàs placas (100ul/cavidade) antes de incubação durante aproximadamen- te 2 horas no agitador de placas à temperatura ambiente. Antes da adição de anti-camundongo de IgG4 humana: Solução de trabalho de peroxidase (100ul/cavidade) as placas são lavadas mais três vezes (como acima). As placas são então incubadas novamente durante aproximadamente 2 horas sobre um agitador de placas à temperatura ambiente, após que elas são mais uma vez lavadas.

TMB é adicionada às placas (100ul//cavidade), que são então in- cubadas durante cerca de 30 minutos em um agitador de placas à tempera- tura ambiente. A reação enzimática é terminada com adição de solução de paragem (50yul/cavidade). As absorvâncias são lidas a 450 nm (filtro de refe- rência 650 nm). O limite inferior de quantificação para a presente invenção é de 5,000 ng/mL e o limite de quantificação para a presente invenção é de 110,0 no/ml.

EXEMPLO 2 “ENSAIO DE OCUPAÇÃO DE KIR A ocupação do receptor é avaliada em amostras de sangue total humano por meio da análise de fluorescência de quatro cores. Resumida-

mente, os níveis de receptores KIR2D livres e ligados são avaliados em lin- fócitos T e NK em sangue periférico EDTA anticoagulado. O local do ensaio livre irá avaliar o d KIR2QD esacoplado de coloração com conjugado de PE-1- 7F9, que se liga à molécula de KIR2D. O ensaio local ligada irá avaliar os receptores KIR2D ocupados por 1-7F9 por meio da coloração com um ca- mundongo anti-lgG4 humano do anticorpo monoclonal conjugado com PE, que reconhece o 1-7F9 ligado aos receptores KIR2D. Os ensaios livre e li- gados irão permitir uma avaliação tanto da percentagem positiva de colora- ção, bem como a intensidade da fluorescência [MESF] para 1-7F9-PE ou anti-higG4-PE. As seguintes combinações de anticorpos conjugadas são usadas nos dois ensaios seguintes: Loal de ensaio livre: CD3/1-7F9/CD45/CD56 Limite de Ensaio: CD3/higG4/CD45/CD56. As amostras são analisadas em um Becton Dickinson FACScali- bur utilizando o software CellQuest Becton Dickinson. As células T são defi- nidas como CD45 + CD3 CD3-CD56 + de linfócitos e células NK são defini- das como CDA45 + +. EXEMPLO 3

SEGURANÇA CLÍNICA E AUTORREATIVIDADE Um ensaio de escalonamento de dose única foi realizado em leucemia (AML) idosos mieloide aguda (> 60 anos), que são em primeira remissão completos após a quimioterapia de indução e consolidação, e não elegíveis para transplante de medula óssea. Um modelo padrão 3 3 é apli- cado, e um total de 7 doses foram exploradas: gama de doses de 0,0003 mglkga3 mg/kg. Após a dose, os pacientes foram monitorados quanto à segurança, PK e ocupação de KIR até ocupação de KIR já não era detectá- vel. Um ensaio de extensão também foi conduzido. Pacientes com LMA que haviam completado o julgamento de escalonamento de dose e que ainda estavam em remissão completa pode participar no estudo de exten- são, em que os pacientes foram tratados até 6 vezes em uma base mensal. Os pacientes são tratados com a mesma dose que receberam no ensaio anterior.

Pacientes, materiais e métodos Em ambos os ensaios, os pacientes AML idosos (> 60 anos de idade) em sua primeira remissão completa (CR) e não elegíveis para o transplante foram elegíveis para os estudos. AML foi de acordo com critérios da OMS. (Brunning RD, Matutes E, Harris NL e outros:. Leucemia mieloide aguda: Introdução Jaffe ES, NL Harris, Stein H, e outros Eds: Patologia e Genética de Tumores dos tecidos hematopoiético e linfoide Lyon, França: IARC Press, 2001. Classificação de tumores da Organização Mundial de Saúde, 3,pp 77-80). Remissão remissão completa foi morfológica (CR) defi- nida de acordo com critérios de NCI (Cheson e outros JCO, 21 (24): 4642 a 4649 (2003)), ou com a recuperação de CRI contagem de plaquetas apenas incompleta após 1 ou 2 ciclos de quimioterapia de indução, e pelo menos um, e maximamente 6 ciclos de quimioterapia de consolidação.

Na triagem no estudo de escalonamento de dose, o tempo des- de a última dose de quimioterapia foi de pelo menos 30 dias e não mais de 120 dias. Outros critérios de elegibilidade incluído (mas não limitado a) a expressão de KIR2DL1 e 2/3 nas células NK, ECOG (Oken, e outros Toxici- dade e Critérios de resposta do Grupo de Oncologia Cooperativo Eastern.

AmuJ Clin Oncol 5: 649-655, 1982) Status de O a 2 e recuperação a partir de todas toxicidades dos tratamentos anteriores.

Para o ensaio de extensão, a conclusão do julgamento de esca- lonamento de dose com um perfil de segurança aceitável era um critério de elegibilidade adicional.

Os critérios adicionais incluíram a contagem absoluta de neutró- filas > 1 x 109/L, plaquetas > 80x109/|l, sem sintomas de doença, a recupe- ração da toxicidade aguda de todas terapias antileucêmicas anteriores, a expressão de KIR em células NK de pacientes (capacidade para se ligarem anti-KIR (1-7F9)), sem grande disfunção de órgão relevante, tal como avali- ado pelo investigador e, valores laboratoriais clínicos, como segue: (a) uma creatinina sérica < 2 mg/dl, (b), total de bilirrubina < 1,5 x superior a limite do normal e (c) AST <3x o limite superior do normal.

Desenho do estudo O julgamento de escalonamento de dose foi um escalonamento de dose de segurança multicêntrico, aberto, único e de tolerabilidade de jul- gamento, Sete doses foram exploradas; 0,0003 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg e 3 mg/kg.

A (3 +3) projeto geral foi escolhido para este julgamento.

Cada paciente foi atribuído a uma dose, e monitorizado para a segurança, Farmacocinética e Farmacodinâmica até que não haja ocupação KIR detectável nos pacientes de células NK.

Segu- rança, ocupação de PK e KIR são analisados em uma base contínua, e os dados obtidos durante as primeiras 4 semanas após a administração de ca- da grupo dose geralmente constitui a base da decisão de escalonamento de dose.

O julgamento de extensão foi concebido como uma dose de se- gurança e tolerabilidade multicêntrica, aberta, repetida.

A dose a administrar ao paciente era o mesmo que o paciente recebeu, no ensaio clínico de dose única.

O paciente pode receber seis administrações de 4 semanas de inter- valo, ou seja seis ciclos de administração com uma duração máxima de 6 meses.

Cada ciclo de dosagem consiste em uma visita a dosagem e uma visita de monitoramento de segurança.

Após a última dose, o paciente é mo- nitorizado para a segurança até que não haja ocupação de KIR detectável- nos pacientes de células NK.

A duração deste período de segurança de se- guimento provavelmente depende da dose recebida, e se espera que seja máximo de 24 semanas após a última dose.

Segurança (ou seja, qualquer toxicidade observada) para admi- —nistração Anti-KIR (1-7F9) é avaliada através do Instituto Nacional do Câncer dos EUA dos Critérios de terminologia comum para casos adversos (CTCA- E) versão 3.0. Os parâmetros Farmacocinéticos, Ocupação de KIR, marca- dores de NK e ativação de células T, marcador tumoral de WT-1, a sobrevi- da livre de progressão e a sobrevida global também foram avaliadas.

Resultados O receptor de saturação foi avaliado em ensaio de escalona- mento da dose entre os pacientes que recebem cada um nível de 0,0003 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg e 3 mg/kg. Em resumo, a dose de 0,0003 mg/kg resultou em KIR saturação par- cial (50% de ocupação) durante um período de cerca de 2 horas, a dose de 0,003 mg/kg resultou em uma saturação completa de KIR (90% de ocupa- ção) durante um período inferior a 24 horas; dose de 0,015 mg/kg resultou na completa saturação KIR por um período de menos de 7 dias, a dose de 0,075 mg/kg resultou na completa saturação de KIR por um período de cerca de 7 dias, a dose de 0,3 mg/kg resultou na completa saturação de KIR por um período maior do que 7 dias e menos de 14 dias; dose de 1 mg/kg resul- touna completa saturação KIR por um período de menos de 3 semanas (en- tre cerca de 2 semanas e 3 semanas), a dose de 3 mg/kg resultou em uma saturação completa de KIRpara um período de mais do que 4 semanas. Não há casos adversos relacionados com a autorreatividade (tais como erupções cutâneas e sintomas gastrointestinais), infusão (tais como exantema, prurido, eritema, fadiga, dor de cabeça, febre) ou liberação de citocinas (tais como febre, fadiga, mal-estar, e dor de cabeça) ocorrendo em um grau que levantou quaisquer preocupações de segurança. EXEMPLO 4 EFICÁCIA IN VIVO NA ELIMINAÇÃO EXPLOSÕES CONA EM UM MODE-

LODECAMUNDONGO TRANSGÊNICO A indução de morte mediada in vivo de NK de expressão de CW3 de blastos ConA KIR2DL3 foi avaliada em camundongos transgênicos que receberam anticorpo anti-KIR2DL1, 2 e 3 do 1-7F9. Materiais e Métodos Anticorpos: anti-KIR2DL1, 2 e 3 do anticorpo monoclional total- mente humano 1-7F9 foi gerado por meio da imunização de camundongos com loci de IgG genômicos humanos (Medarex, Inc.), com células BWV5417 estavelmente transfectadas com KIR2DL1, seguido por três imunizações de reforço com a parte extracelular solúvel de KIR2QDL3 produzida em Escheri- chia coli como descrito na WO 2006/003179. Os anticorpos foram testados para a ligação, KIRs solúveis recombinantes por ensaio imunossorvente |i- gado a enzima, e os clones positivos foram testados para a ligação a células

YTS-KIR2DL1 por meio da citometria de fluxo. Hibridomas selecionadas fo- ram subclonadas até que as linhas estáveis foram obtidas. Os camundongos transgênicos: camundongos Rag-/ e camun- dongos KIR2DL3 transgênicos (Tg) foram cruzados para se obter KIR2DL3tg, camundongos Rag-/-. Os camundongos HLA-Cw3 transgênicos foram cruzados com camundongos KBDB-/-, resultando em Cw3tg, camun- dongos KbDb-/-. Os camundongos são descritos em Romagne e outros, (2009) Blood 114:. 2667-2677, bem como na Sola e outros (2009) P.N.A.S. U.S. A. 106 (31): 12879-12884.

Ensaio de rejeição com base na Fluoresecência: os ensaios fo- ram realizados de acordo com os métodos descritos por laboratório K.Karr's (Oberg e outros Eur. J. Immunol (2004) 34: 1646; Johansson, S., e outros J. Exp Med. (2005) 201: 1145). A injeção de células alvo marcadas CFSE (tes- te de células alvo e células alvo singênicos/de controle, razão 1: 1) foi segui- do por meio da análise de diferentes órgãos após 1 ou 2 dias. Células alvo foram recentemente isoladas das células do baço, as células tumorais ou explosões ConA (48h, ConA 2ug/ml).

Resultados O objetivo do experimento foi testar se 1-7F9 induzui a morte NK de explosões ConA cw3 alvo em camundongos KIR2DL3 tg. Resumidamen- te, os camundongos receptores e de células dadoras foram as seguintes: (1) camundongos Destinatário: camundongos KIR2DL3tg B6, KIR2DL3 tg Rag-/ -e C57/BL6. (2) as células dos doadores: (A) as células do baço ingênuas de camundongos KBDB KO, KBDB KO Cw3 TG C57/BL6 camundongos e (B) explosão ConA a partir de camundongos KBDB KO, KBDB KO Cw3 TG, camundongos C57/BL6.

As células do baço e de camundongos C57/BL6 KBDB-/--cw3 tg foram estimuladas durante 2 dias com ConA (2ug/107 células/ml). As células foram marcadas com 0,5 uM (B6) e 3UM (KBDB-/--cw3) de CFSE, mistura- das em uma proporção de 1: 1 e depois injetadas em camundongos B6

KIR2DL3tg anteriormente (ou não) injetadas com 1-7F9 mAb (300ug). O an- ticorpo 1-7F9 foi, dessa maneira, administrado cerca de 6 horas antes da injeção das células) para induzir a lise de células alvo cw3. Anticorpo anti- NK1.1 PK136 (BD Biosciences), 24 horas antes da injeção das células ad- ministrada foi usado como um controle para induzir a depleção de células NK.

Os resultados são mostrados nas Figuras 1A, 1B e 2. As Figuras 1A e 1B examinar percentagem de células marcadas CSFE em 40 horas após a injeção das células. Resultados semelhantes foram obtidos ou célu- las CSFE com marcador em 20 horas após a injeção. A Figura 1A mostra uma diminuição dramática na percentagem de células marcadas em CSFE- KIR2DL3tg B6 CMSP em camundongos quando tratados com o anticorpo 1- 7F9, em comparação com os não tratados KIR2DL3tg camundongos B6 e tratados e não tratados camundongos C57BL6. A Figura 1B mostra uma di- minuição dramática na percentagem de células de baço CSFE rotulados de baço a partir de camundongos B6 KIR2DL3tg quando tratados com o anti- corpo 1-7F9, em comparação com os não tratados KIR2DL3tg camundongos B6 e tratados e não tratados camundongos C57BL6. Figura 2 examina a so- brevivência das células CSFE com marcador de célula relativa em 40 horas apósa injeção das células. A Figura 2 mostra uma diminuição dramática na sobrevivência de KBDB-/ -CW3 blastos ConA em PBMC e no baço de ca- mundongos B6 KIR2DL3tg quando tratados com o anticorpo 1-7F9, em comparação com não tratadas KBDB KO CW3 camundongos tg.

As células NK são geralmente conhecidas por ter mecanismos para garantir a auto-tolerância. Vide Raulet e Vance (2006) Nature Immuno. Rev. 6: 520-531. Em particular, todas células NK expressam um inibidor KIR ou os inibidores de moléculas CD94/NKG2A. O bloqueio de receptores KIR, como observado na corrente de Fase | de ensaios clínicos de anticorpo anti- KIR 1-7F9 em oncologia, indica que o anticorpo não induz em particular a inflamação ou outros auto-imunidade do que a observada para os anticorpos monoclonais em geral. No entanto, não foram realizados estudos sobre o efeito de bloqueio de KIR2DL1, 2 ou 3 sobre a eliminação de células T ativa-

das ou a proliferação in vivo. Os presentes resultados indicam que as células que expressam KIR2DL3-NK são capazes, in vivo, de redução ou eliminação de células T ativadas, que de outro modo teria sido bloqueadas pelo seu |i- gante HLA-CW3, contanto que KIR2DL3 é bloqueado. Por conseguinte, a população de KIR2DL1,2 e/ou de células têm o potencial de eliminar as cé- lulas pró-inflamatórias autólogas ativadas quando KIR são bloqueadas in vivo.

Todas referências, incluindo as publicações, pedidos de paten- tes e patentes aqui citadas, são incorporadas na presente invenção por meio de referência na sua totalidade e na mesma medida como se cada referên- cia fosse específica e individualmente indicadas para ser incorporada por meio de referência e foram descritas na respectiva íntegra aqui (até ao limite máximo permitido por lei), independentemente de qualquer incorporação fornecida separadamente dos documentos particulares feitas neste docu- mento.

A menos que seja especificado de uma outra maneira, todos os valores exatos apresentados na presente invenção são representativos de valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os valores exem- plificativos exatos fornecidos no que diz respeito a um fator ou de medição particular pode ser considerado para fornecer também uma medida corres- pondente aproximada, modificada por "cerca de" se for o caso).

A descrição na presente invenção de qualquer aspecto ou moda- lidade da presente invenção, utilizando termos tais como "que compreende", "tendo", "incluindo" ou "contendo", com referência a um ou mais elementos, destina-se a proporcionar suporte para um aspecto semelhante ou modali- dade da presente invenção, que "consiste em", "consiste essencialmente em", ou "compreende substancialmente" esse elemento ou elementos, a menos que indicado de outra forma ou claramente contrareferido pelo con- texto (por exemplo, uma composição aqui descrita como que compreende um elemento particular deve ser entendida como também descrever um composto desse elemento, a menos que seja especificado de uma outra maneira ou claramente em contradição com o contexto).

Claims (1)

1. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exempli- ficativa (por exemplo, "tal como") proporcionados na presente invenção, pre- tende apenas esclarecer melhor a presente invenção e não constitui uma limitação do âmbito da presente invenção a menos que de outro modo afir- —mado.

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   Tais equivalentes destinam-se a ser englobados por meio das seguintes reivindicações.