BR112013028776B1

BR112013028776B1 - Pteroestilbeno para uso no alívio ou prevenção da ansiedade

Info

Publication number: BR112013028776B1
Application number: BR112013028776-4A
Authority: BR
Inventors: Agnes M. Rimando; Abir El-Aify; Md Al Rahim
Original assignee: The United States of America, as represented by the Secretary of Agricuture; University Of Mississipi
Priority date: 2011-05-11
Filing date: 2012-05-10
Publication date: 2022-04-19
Also published as: JP2017014284A; WO2012154956A2; US9439875B2; AU2012253479A1; KR101929074B1; EP2706992A4; CN103561729A; AU2012253479B2; JP6027607B2; JP2014514361A; EP2706992A2; BR112013028776A2; CA2839309C; EP2706992B1; WO2012154956A3; HK1194302A1; CA2839309A1; US20160067192A1; KR20140107112A; CN103561729B

Abstract

KIT, E, USO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA OU NUTRACÊUTICA. Pteroestilbeno, um análogo natural de resveratrol, mostra ação tipo ansiolítica por infrarregulação de níveis fosforilados de ERKs no hipocampo de camundongos. Camundongos administrados com pteroestilbeno (1 a 10 mg/kg de BW (peso corporal)) por gavagem oral foram submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado (EPM). Pteroestilbeno manisfestou atividade ansiolítica em doses de 1 e 2 mg/kg, demonstrada pelo aumento da porcentagem de tempo de permanência e do número de entradas em braços abertos, determinantes críticos para ansiedade. Esta atividade ansiolítica foi comparável a diazepam a 1 e 2 mg/kg no EPM. A porcentagem de distância percorrida e tempo de permanência nos braços fechados diminuiu com doses de 1 e 2 mg/kg. As doses de 5 e 10 mg/kg não mostraram qualquer efeito ansiolítico. A atividade locomotora não foi afetada em todas as doses. A análise Western blot confirmou as observações de EPM; Pteroestilbeno foi detectado no soro e tecido do cérebro, após uma única administração oral, demonstrando que o composto atravessa a barreira hematoencefálica e, assim, exerce seu efeito ansiolítico. Resveratrol não teve qualquer efeito ansiolítico.

Description

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Campo da Invenção

[001] Esta invenção se refere a um método para tratar, aliviar ou prevenir ansiedade pela administração de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pteroestilbeno, um análogo de resveratrol, encontrado nas uvas e algumas bagas Vaccinium. Descrição da Técnica Relevante

[002] Os distúrbios de ansiedade são comuns em ambientes comunitários e de assistência médica primária e secundária, e muitas vezes se tornam condições clínicas crônicas (Nutt et al., 2002. Int. J. Neuropsychopharmacol. 5:315-325). Os distúrbios de ansiedade são o tipo mais comum de distúrbios psiquiátricos, com uma incidência de 18,1% e uma prevalência de 28,8% (Kessler et al. 2005. Arch. Gen. Psychiatry 82: 617627: Ohayon, M. M. 2006. J. Psychiatr. Res. 40: 475-476). Os fármacos antiansiolíticos têm sido usados pelos seres humanos há milhares de anos. Os fármacos do grupo dos benzodiazepínicos são de ação rápida, eficazes e os ansiolíticos mais comumente prescritos (Bandelow et al. 2008. World J. Biol. Psychiatry 9:248-312; Baldwin et al. 2005. J. Psychopharmacol. 19:567-596; Rudolph and Mohler. 2006. Curr. Opin. Pharmacol. 6:18-23). No entanto, o seu uso em longo prazo está associado a efeitos secundários tais como a sedação, desenvolvimento de tolerância, a possibilidade de abuso e sintomas de abstinência (Nutt et al., supra; Bandelow et al., supra: Baldwin et al., supra). Atualmente, um grupo de antidepressivos do inibidor seletivo da recaptação de serotonina é usado como um tratamento de primeira linha para a maioria dos distúrbios de ansiedade. No entanto, este grupo também tem inconvenientes. Em particular, há um inicio lento da ação terapêutica, assim, várias semanas de tratamento são necessárias para os efeitos ansiolíticos ocorrerem (Nutt et al., supra; Bandelow et al., supra; Baldwin et al., supra). Portanto, ainda existe uma necessidade de compostos ansiolíticos que tenham rápida ação terapêutica, mas sejam desprovidos de efeitos indesejáveis.

[003] Um grande número de compostos naturais tem proporcionado não só ferramentas farmacológicas úteis (Furukawa et al. 1993. J. Biol. Chem. 268:26026-26031), mas também os terapêuticos potenciais levam ao desenvolvimento de fármacos (Liu, J. 1993. Trends Pharmacol. Sci. 14:182-188). Os estilbenos são um grupo de fitoquímicos tendo uma estrutura de núcleo α,β-difeniletileno. Os estilbenos têm sido relatados em um grande número de gêneros de plantas independentes incluindo uvas, amendoins, e bagas Vaccinlum (Chong et al. De 2009. Plant Sci. 177:143-155). Resveratrol, um estilbeno amplamente estudado, tem sido relatado como exercendo efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios, quimiopreventivos, e de antienvelhecimento de uma série de sistemas biológicos (Aggarwal et al. 2004. Anticancer Res. 24:2783-2840; Baur e Sinclair. 2006. Nat Rev. Drug Disco, 5:493-506; Bishayee, A. 2009. Cancer Prev. Res. 2:409-418). Recentemente, o pteroestilbeno, um análogo natural de resveratrol, encontrado em algumas bagas Vaccinium como mirtilos e amoras (deerberries) (Rimando et al. 2004. J. Agric. Food Chem. 52:4713-4719) tem recebido muita atenção por ter efeitos diversos, como aqueles mostrados para resveratrol. Os pteroestilbenos têm propriedades analgésicas, antidiabéticas, antioxidantes, anti- inflamatórias, hipolipemiante e quimiopreventivas de câncer (Amamath Sateesh e Pari. 2006. J. Pharm. Pharmacol. 58: 1483-1490; Remsberg et al. 2008. Phytotherapy Res. 22: 169-179; Rimando et al. 2002. J. Agric. Food Chem. 50:3453-3457; Rimando et al. 2005. J. Agric. Food Chem. 53:3403-3407). Pteroestilbenos também tem efeito significativo no desenvolvimento de câncer de cólon (Paul et al. 2009. Cancer Prev. Res. 2:650-657), invasão e metástase (Pan et al. 2009. Carcinogenesis 30: 1234-1242), e na reversão de déficits cognitivos em ratos envelhecidos (Joseph et al. 2008, J. Agric. Food Chem. 58: 10544-10551). No entanto, o potencial ansiolítico dos pteroestilbenos ainda não foi investigado.

[004] Muitos dos compostos naturais, incluindo os estilbenos, interagem com proteínas quinases envolvidas em diferentes vias de sinalização, tais como óxido nítrico sintase induzível (iNOS), ciclo- oxigenase-2 (COX-2), e proteína quinase ativada por mitogênio p38 (MAPK) (Paul et al. 2.009, supra). Está bem estabelecido que a quinase reguladora de sinal extracelular 1/2 (ERK 1/2), um membro da família de MAPK, desempenha um papel importante na regulação da transcrição, em muitos tipos de células, incluindo neurônios (Hetman e Gozdz. 2004. Eur. J. Biochem. 271:2050-2055). A evindência de acúmulo indica que a via de sinalização de ERK é ativada sob vários estímulos (Davis, R. J. 1993. J. Biol. Chem. 268: 14553-14556; Hetman e Gozdz, supra), incluindo a exposição ao estresse (Gerrits et al. 2006. Neuroscience 142:1293-1302). Além disso, especula-se que a via de sinalização de ERK no hipocampo e na amígdala lateral desempenha um papel importante na ansiedade (Paul et al. 2007. Biol. Psychiatry 61:1049-1061; Tronson et al. 2007. Neuropsychopharmacol 133: 1570-1583). Esta noção é ainda reforçada pelas verificações de que os níveis de ERK fosforilado aumentaram significativamente durante ansiedade. Portanto, a via de transdução de sinal de ERK pode desempenhar um papel importante na ansiedade e sua inibição pode produzir efeitos ansiolíticos (Ailing et al. 2008. J. Psychiatr. Res. 43:55-63).

[005] Assim, tendo em conta o papel das vias de sinalização na ansiedade e a necessidade de agentes que podem ser usados para tratar a ansiedade, o objetivo do presente trabalho foi o de determinar os efeitos dos pteroestilbenos como um inibidor da ansiedade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Foi investigada a propriedade de pteroestilbenos como um inibidor da ansiedade e determinaram que os pteroestilbenos podem ser usados como um agente antiansiedade.

[007] De acordo com esta verificação, é um objetivo da invenção fornecer um método para tratar, aliviar ou prevenir a ansiedade em um sujeito com necessidade do mesmo, administrando uma dose terapeuticamente eficaz de Pteroestilbeno, sais farmaceuticamente aceitáveis ou isômeros dos mesmos.

[008] Também faz parte da presente invenção um kit compreendendo uma composição farmacêutica contendo pteroestilbeno, e instruções para uso do kit.

[009] Outros objetos e vantagens da presente invenção irão tornar-se prontamente aparentes a partir da descrição que segue.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] A Figura 1 mostra a estrutura química do pteroestilbeno.

[0011] As Figuras 2A e 2B mostram o efeito da administração oral de pteroestilbeno sobre o comportamento no teste do labirinto em cruz elevado (EPM). Camundongos Swiss Webster do sexo masculino foram injetados com veículo ou pteroestilbeno (1-10 mg/kg) por gavagem oral, 60 minutos antes do teste em EPM durante 5 min. A porcentagem da distância percorrida, a porcentagem de tempo gasto e o número de entradas nos braços abertos (Fig. 2A) e fechados (Fig. 2B), OA e EA, respectivamente, foram medidos. Cada coluna representa a média ± SEM n = 6-10 por dose. *p<0,05, **p <0,01 comparado com o controle de veículo (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Dunnett).

[0012] A Figura 3 representa o efeito da administração intraperitoneal (i.p.) do diazepam sobre o comportamento no teste do labirinto em cruz elevado. Camundongos Swiss Webster do sexo masculino foram injetados com veículo ou diazepam (0,5-2 mg/kg) por via i.p. 30 min antes de testar em EPM durante 5 min. A porcentagem de distância percorrida, porcentagem de tempo gasto e o número de entradas nos braços abertos (Figura 3A) e fechados (Fig.2B), OA e EA, respectivamente, foram medidos. Cada coluna representa a média ± SEM. n = 6-10 por dose. **p <0,01 comparado com o controle de veículo (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Dunnett).

[0013] A Figura 4 representa o efeito da administração oral de pteroestilbeno sobre a atividade locomotora do camundongo. Camundongos Swiss Webster do sexo masculino foram injetados com veículo ou pteroestilbeno (1-10 mg/kg) por gavagem oral, 60 minutos antes do teste do labirinto em cruz elevado durante 5 min. A atividade espontânea foi avaliada em termos do número total de interrupções por câmara. Cada coluna representa a média ± SEM. n = 8-10 por dose.

[0014] As Figuras 5A e 5B representam o efeito da administração oral de pteroestilbeno sobre a fosforilação de ERK1/2 no hipocampo. A FIG. 5A mostra dados representativos sobre níveis ERK1/2 fosforilado de camundongos sacrificados imediatamente após o teste EPM. A FIG. 5B mostra a análise de densitometria das mudanças na fosforilação de ERK 1/2 para os camundongos sacrificados imediatamente após o treinamento. Os valores são expressos como a média ± SEM de pelo menos três animais. *p<0,05, **p<0,01 comparado com o controle de veículo (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Dunnett).

[0015] A Figura 6 representa o efeito da administração oral de pteroestilbeno na fosforilação da Akt no hipocampo. Dados representativos sobre níveis de ERK1/2 fosforilada para camundongos sacrificados imediatamente após o teste do labirinto em cruz elevado. Após sondagem com o anticorpo específico para Akt fosforilada (Ser 473), os blots foram sondados novamente com anticorpo anti-β-actina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0016] Como resveratrol, uma multiplicidade de atividades farmacológicas também tem sido atribuída a pteroestilbeno. Nosso trabalho atual contribui para a cadeia de propriedades benéficas para saúde relatadas para pteroestilbeno; aqui, demonstramos os seus efeitos ansiolíticos, pela primeira vez. No presente estudo, o efeito semelhante a ansiolítico de pteroestilbeno foi investigado no modelo animal clássico de ansiedade, o labirinto em cruz elevado (EPM), um modelo comportamental para avaliação da ansiólise. O teste de EPM é considerado um dos testes mais amplamente validados para ensaiar novos agentes ansiolíticos (Pellow et al. 1985 J. Neurosci Methods 14: 149-167; Hogg, S. 1996 Pharmacol Biochem. Behav., 54: 21-30). O diazepam, um dos compostos mais frequentemente usados ansiolíticos foi usado como um controle positivo no estudo. Dado o conflito exibido pelos roedores entre o impulso de explorar um novo ambiente e o medo de um lugar elevado aberto, o EPM é um modelo de ansiedade amplamente usado empregado por um grande número de investigadores (Peliow et al., supra,. Hogg, supra). Foi proposto que o comportamento exploratório normal dos roedores é a favor dos braços fechados do labirinto no modelo de labirinto em cruz elevado, e que a aversão para os braços abertos provocando ansiedade é a base do modelo de EPM (Pellow et al. supra; Ohl, F. 2003 Clin. Neruosci. Res. 3: 233-238). Um grande conjunto de provas estabeleceu que a administração de compostos ansiolíticos reduz a aversão natural para os braços abertos e promove a sua exploração (Pellow et al, supra; Hogg, supra).

[0017] Nos nossos estudos, também determinados os níveis de plasma e tecido de pteroestilbeno após a administração oral do composto a camundongos. Os níveis séricos de pteroestilbeno aumentaram com a dose e foram observados aumentos correspondentes nos níveis de pteroestilbeno no hipocampal (ver Experimento 5). As alterações de ERK1/2 fosforilada no hipocampo de camundongos foram medidas com o objetivo de estudar ainda os efeitos sobre a regulação da proteína quinase e elucidar os mecanismos de ação subjacentes de pteroestilbeno.

[0018] O pteroestilbeno manifestou ansiólise em 1 e 2 mg/kg doses: a porcentagem de Permanece Time in Open Arms (PTOA) (Tempo de Permanência nos Braços Abertos), e o Number of Entries in Open Arms (NEOA) (Número de Entradas nos Braços Abertos), que são determinantes críticos e considerados como correlacionados com a ansiedade, foram aumentados em baixas doses definidas (ver Exemplo 2). O pteroestilbeno também foi capaz de aumentar a porcentagem de Traveled Distance in Open Arms (TDOA) (Distância Percorrida nos Braços Abertos) de ambas as doses de 1 e 2 mg/kg. No entanto, as doses mais elevadas (5 e 10 mg/kg) não apresentaram qualquer efeito ansiolítico, e contrariamente, as doses mais elevadas tinham tendência para aumentar a aversão aos braços abertos, ou seja, as doses mais elevadas eram ansiogênicas. A atividade ansiolítica de Pteroestilbeno foi ainda corroborada com as verificações de que a porcentagem de Traveled Distance in the Enclosed Arms (TDEA) (Distância Percorrida nos Braços Fechados) e a porcentagem de Permanece Time in the Enclosed Arms (PTEA) (Tempo de Permanência nos Braços Fechados) também diminuiu após o tratamento com 1 e 2 mg/kg de pteroestilbeno. Além disso, a atividade ansiolítica do pteroestilbeno foi muito semelhante a do diazepam. A dose de 2 mg/kg de pteroestilbeno mostrou efeitos comparáveis a 2 mg/kg de diazepam, pelo menos, no EPM. O uso de diazepam como um controle positivo, assim, confirma ainda o potencial ansiolítico do pteroestilbeno no paradigma comportamental de EPM. O Number of Entries in the Enclosed Arms (NEEA) (Número de Entradas nos Braços Fechados), sendo uma medida mais pura de atividade locomotora, pois se altera independentemente de NEOA e PTOA, permaneceu inalterada em toda a faixa de dose usada neste experimento. Vale ressaltar que o resveratrol, a molécula de origem do pteroestilbeno, não tem qualquer efeito ansiolítico, testado em doses de 3 e 20 mg/kg (Patisaul et al. 2009. Hormones and Behavior 55:319-328).

[0019] A atividade locomotora dos animais foi avaliada para demonstrar que a atividade ansiolítica do pteroestilbeno em doses menores (1 e 2 mg/kg) não foi uma consequência secundária da ação depressiva do composto sobre a atividade motora dos animais. A ausência de efeito ansiolítico nas doses mais elevadas (5 e 10 mg/kg) também não foi devido à incapacidade motora. Portanto, nenhuma ação estimulante ou depressiva foi registrada, o que sugere que é muito pouco provável que os efeitos observados sejam ansiolíticos falsos positivos.

[0020] Além do EPM e os testes de locomoção, também focamos em suportes moleculares que poderiam explicar a ação ansiolítica observada de pteroestilbeno por estudar a expressão de proteínas que têm um papel importante na ansiedade. Os resultados obtidos em estudos de Western blot mostraram uma redução marcada dos níveis de ERK1 fosforilada no hipocampo de animais tratados com estas doses baixas (1 e 2 mg/kg) de pteroestilbeno que demonstraram efeitos ansiolíticos em EPM. Também foi observada uma ligeira diminuição no estado de fosforilação de ERK2 no hipocampo nas mesmas doses. Importantemente, a incapacidade das doses mais elevadas (5 e 10 mg/kg) para provocar qualquer alteração no estado de fosforilação de ERK 1/2 é consistente com a ausência de efeito ansiolítico do composto observada e EPM nas mesmas doses. Além disso, três genes na família de Akt (Akt1, Akt2 e Akt3) codificam enzimas que são membros da família de proteína cinase específica de serina/treonina (EC 2.7.11.1) e a análise mostrou que não houve nenhuma alteração nos níveis de Akt fosforilada no hipocampo de animais. Portanto, nossos resultados sugerem uma correlação entre a ação ansiolítica de pteroestilbeno e sua capacidade de diminuir a atividade de ERK no hipocampo de camundongos. Outros estudos têm mostrado que o pteroestilbeno bloqueia a ativação de ERK1/2 em células RAW 264.7 (Pan et al. 2008. J. Agric. Food. Chem. 56: 7502-7509). O presente estudo vai primeiramente demonstrar in vivo que determinadas doses baixas de pteroestilbeno infrarregulam a ativação de ERK1/2.

[0021] Os relatos recentes indicam que os níveis de pERK em diferentes regiões do cérebro, incluindo o hipocampo e no córtex pré-frontal (PFC), aumenta significativamente durante a ansiedade e a sua inibição pode produzir ações ansiolíticas (Ailing et al, supra; Martínez et al 2009. Pharmacol. Biochem. Behav. 92:291-296). Este fato está de acordo com a atividade semelhante a ansiolítica observada do composto polifenólico de chá verde epigailocatequin-3-galato, após administração aguda em camundongos (Vignes et al. 2006. Brain Res. 1110:102-115), e que este composto também tem a capacidade de diminuir o estado de fosforilação de ERK1/2 (Chung et al., 2001 FASEB J. 15: 2022-2024; Sah et al. 2004 J. Biol. Chem. 279:1275512762). Além disso, foi relatado que o acúmulo nuclear sustentado de pERK1/2 foi descrito como um evento com consequências danosas (Colucci- D'Amato et al. 2002 Bioessays 25:1085-1095). A transdução de sinal pERK1/2 aumentada após o estresse crônico foi impedida pela cíclica administração de estradiol-17β em estruturas límbicas, que pode proteger contra as consequências danosas do estresse recorrente (Gerrits et al., supra). Mais encorajador, a inibição da via ERK utilizando inibidores de MEK também mostrou efeitos terapêuticos contra danos de vários órgãos (Otani et al. 2007. J. Clin. Neurosci. 14:42-48).

[0022] O cérebro contém uma variedade de receptores do tipo NMDA, GABA e os canais de íons que podem potencialmente alterar a fosforilação da quinase MAP. Os estudos que mostram a ativação da quinase MAP por receptores NMDA foram bem documentados (Xia et al. 1996. J. Neurosci. 16:5425-5436; Orban et al. 1999. Trends Neurosci. 22:38-44). Além disso, estudos implicaram a via ERK/MAPK, como um modulador negativo da função do receptor de GABA (Bell-Horner et al. 2006. J. Neurobiol. 66:1467-1474). Se a diminuição da fosforilação de ERK1/2 é mediada por meio do bloqueio dos receptores de NMDA ou ativação dos receptores de GABA, é um assunto da nossa investigação em curso.

[0023] Dado que o pteroestilbeno em doses mais elevadas não alterou significativamente a atividade locomotora ou provocou uma redução significativa, pode-se argumentar porque o composto em doses mais elevadas não apresenta qualquer ação semelhante à ansiolítica no teste de EPM. Quando um roedor explora um novo ambiente (EPM sendo o novo ambiente aqui) a capacidade de acúmulo de memória de trabalho pode entrar em jogo, pelo menos em parte, apesar de EPM não ser puramente um paradigma comportamental. A aprendizagem espacial também é importante para os animais para reconhecerem a localização de braços abertos e fechados no EPM, e a aquisição de informação espacial é dependente da função do hipocampo (Olton e Papas. 1979. Neuropsychologia 17:669-682). Assim, existe uma possibilidade de que a experiência de EPM inicial possa modificar o comportamento subsequente dos camundongos nas mesmas sessões de labirinto em relação ao tempo. Além disso, a dose elevada de pteroestilbeno (10 mg/kg) pode melhorar o desempenho cognitivo, especialmente da memória espacial em ratos (Joseph et al. Supra). De fato, verificou-se no presente estudo que na dose de 10 mg/kg, o nível de pteroestilbeno foi 1,1217 ng/hipocampo (Tabela 2), semelhante ao relatado por (Joseph et al. supra). Portanto, é razoável especular que o pteroestilbeno em altas doses (5 e 10 mg/kg), agindo simultaneamente em vias de memória, pode ter a capacidade de acúmulo de memória de trabalho dos camundongos aumentada, limitando assim o seu comportamento exploratório para os braços abertos aversivos, que provocam estresse após sua exposição muito inicial aos braços no EPM. Esta noção é ainda reforçada pelas verificações que os pteroestilbenos em altas doses aumentaram o nível de ERKs fosforilada no hipocampo, em comparação com as doses menores sugerindo que os níveis de pERK melhorados podem ter desempenhado um papel no aumento do acúmulo de memória de trabalho.

[0024] Os resultados demonstraram, pela primeira vez, que os pteroestilbenos, um constituinte de mirtilos, mostrou ação semelhante à ansiolítica no labirinto em cruz elevado em camundongos. Além disso, altas doses de pteroestilbenos não mostram qualquer tendência sedativa em EPM e câmaras de monitoramento de atividade locomotora, sugerindo perfil de efeitos colaterais favorável do composto. A atividade ansiolítica do composto foi acompanhada pela infrarregulação de fosforilação de ERK1/2 no hipocampo dos animais. No entanto, estudos futuros seriam necessários para compreender melhor os mecanismos através dos quais os pteroestilbenos infrarregulam a fosforilação de ERK.

[0025] Os compostos da presente invenção são, portanto, usados para tratar, aliviar ou prevenir a ansiedade em um sujeito com necessidade dos mesmos. Em uma modalidade especial, os compostos da invenção são considerados úteis para o tratamento, prevenção ou alívio de distúrbios de ansiedade, como distúrbio do pânico com ou sem agorafobia, agorafobia sem história de distúrbio do pânico, fobia animal e outras fobias, incluindo fobias sociais, distúrbio obsessivo-compulsivo, e distúrbios de ansiedade generalizados ou induzidos por substância; distúrbios de estresse, incluindo distúrbio pós-traumático agudo e estresse; distúrbios do sono; distúrbio de memória; neuroses; distúrbios convulsivos, por exemplo, epilepsia, vestigens, convulsões ou convulsões febris em crianças; enxaqueca, distúrbios de humor; distúrbios depressivos ou bipolares, por exemplo, depressão, distúrbio depressivo recorrente maior ou de episódios únicos, distúrbio distímico, distúrbio bipolar, distúrbios maníacos bipolar I e bipolar II e distúrbio ciclotímico, distúrbios psicóticos, incluindo esquizofrenia; neurodegeneração decorrente de isquemia cerebral; distúrbio de hiperatividade de déficit de atenção; dor e nocicepção, por exemplo, dor neuropática; emese, incluindo emese aguda, emese retardada e antecipada, em particular, emese induzida por quimioterapia ou radioterapia: enjoo, náusea e vómito pós-operatório; distúrbios alimentares incluindo anorexia nervosa e bulimia nervosa; síndrome pré-menstrual, nevralgia, por exemplo, neuralgia trigeminal, espasmo ou espasticidade muscular, por exemplo, em pacientes paraplégicos; efeitos de abuso ou dependência de substâncias, incluindo a abstinência do álcool; distúrbios cognitivos, tais como doença de Alzheimer; isquemia cerebral, acidente vascular cerebral, traumatismo craniano; zumbido e distúrbios do ritmo circadiano, por exemplo, em sujeitos que sofrem os efeitos de descompensação horária (jet lag) ou de trabalho em turnos.

[0026] Uma composição de acordo com a presente invenção contendo pteroestilbeno, ou um sal farmaceuticamente aceitável de pteroestilbeno pode ser preparada por processos convencionais ou combinação e mistura de compostos. Preferencialmente, a composição também inclui um excipiente, mais preferencialmente um excipiente farmacêutico. As composições que contêm um excipiente e incorporam o pteroestilbeno podem ser preparadas por procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, o pteroestilbeno pode ser formulado em comprimidos, cápsulas, pós, suspensões, soluções para administração oral e soluções para administração parentérica, incluindo administração por via intravenosa, intradérmica, intramuscular e subcutânea, e em soluções para aplicação sobre pensos para aplicação transdérmica com carreadores, ligantes, diluentes e excipientes comuns e convencionais.

[0027] Embora um composto químico da invenção para uso na terapia possa ser administrado sob a forma de composto químico bruto, é preferido introduzir o ingrediente ativo, opcionalmente na forma de um sal fisiologicamente aceitável, em uma composição farmacêutica junto com um ou mais adjuvantes excipientes, carreadores, tampões, diluentes e/ou outros auxiliares farmacêuticos de costume.

[0028] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo o composto químico da invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou um derivado, em conjunto com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos e/ou profiláticos, conhecidos e usados na técnica. O(s) carreador(es) deve(m) ser “aceitável(is)” no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e não prejudiciais ao recepto do mesmo.

[0029] As composições farmacêuticas da invenção podem ser as adequadas para administração oral, retal, brônquica, nasal, pulmonar, tópica (incluindo bucal e sublingual), administração transdérmica, vaginal ou parentérica (incluindo a injeção ou infusão cutânea, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, intracerebral, intraocular), ou que estão em uma forma adequada para administração por inalação ou insuflação, incluindo a administração de aerossóis pós e líquidos, ou por sistemas de liberação sustentada. Exemplos adequados de sistemas de liberação controlada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o composto da invenção, cujas matrizes podem ser na forma de artigos formatados, por exemplo, filmes ou microcápsulas.

[0030] O composto químico da invenção, juntamente com um adjuvante, carreador ou diluente, convencional podem, assim, ser colocados na forma de composições farmacêuticas e suas dosagens unitárias. Essas formas incluem sólidos e, em particular, comprimidos, cápsulas preenchidas, formas em pó e de péletes, e líquidos, em soluções aquosas ou não aquosas, em particular, suspensões, emulsões, elixires e cápsulas preenchidas com os mesmos, todos para uso oral, supositórios para administração retal e soluções injetáveis estéreis para uso parenteral. Tais composições farmacêuticas e formas de dosagem unitária dos mesmos podem compreender ingredientes convencionais em proporções convencionais, com ou sem compostos ou princípios ativos adicionais, e tais formas de dosagem unitária podem conter qualquer quantidade eficaz adequada do ingrediente ativo comensurável com a faixa de dosagem diária destinada a ser empregada.

[0031] O composto químico da presente invenção pode ser administrado em uma ampla variedade de formas de dosagem oral e parentérica. Será óbvio para os versados na técnica que as seguintes formas de dosagem podem compreender como componente ativo quer um composto químico da invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável de um composto químico da invenção.

[0032] Para a preparação de composições farmacêuticas a partir de um composto químico da presente invenção, os carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser sólidos ou líquidos. As preparações de forma sólida incluem pós, comprimidos, pílulas, cápsulas, trosciscos, supositórios, e grânulos dispersíveis. Um carreador sólido pode ser uma ou mais substâncias que podem também atuar como diluentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubrificantes, agentes de suspensão, ligantes, conservantes, agentes de desintegração de comprimidos, ou um material encapsulante.

[0033] Nos pós, o carreador é um sólido finamente dividido que está em uma mistura com o componente ativo finamente dividido. Em comprimidos, o componente ativo é misturado com o carreador tendo a capacidade de ligação necessária em proporções adequadas, e compactado na forma e no tamanho desejados.

[0034] Os pós e os comprimidos contêm preferencialmente de cinco ou dez a cerca de setenta por cento do composto ativo. Os carreadores adequados são carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, açúcar, lactose, pectina, dextrina, amido, gelatina, tragacanto, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, uma cera de baixo ponto de fusão, manteiga de cacau, e semelhantes. O termo “preparação” destina-se a incluir a formulação do composto ativo com material encapsulante como carreador fornecendo uma cápsula na qual o componente ativo, com ou sem carreadores, está rodeado por um carreador, que está assim em associação com o mesmo. Do mesmo modo, os trosciscos e pastilhas estão incluídos. Os comprimidos, pós, cápsulas, pílulas, trosciscos e pastilhas podem ser usados como formas sólidas adequadas para administração oral.

[0035] As preparações líquidas incluem soluções, suspensões e emulsões, por exemplo, água ou soluções de água-propilenoglicol. Por exemplo, as preparações líquidas para injeção parentérica podem ser formuladas como soluções em solução aquosa de polietilenoglicol. O composto químico de acordo com a presente invenção pode assim ser formulado para administração parentérica (por exemplo, por injeção, por exemplo, injeção em bolus ou infusão contínua) e pode ser apresentado na forma de dose unitária em ampolas, seringas pré-cheias, infusão de pequeno volume ou em recipientes de múltiplas doses, com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas tais como suspensões, soluções, ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação, tais como suspensões, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó, obtido por isolamento asséptico de sólido estéril ou por liofilização a partir da solução, para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água isenta de pirogênio estéril, antes do uso.

[0036] As soluções aquosas adequadas para uso oral podem ser preparadas dissolvendo o componente ativo em água e adicionando corantes, aromatizantes, estabilizantes e agentes espessantes, como desejado. As suspensões aquosas adequadas para uso oral podem ser feitas por dispersão do componente ativo finamente dividido em água com material viscoso, tal como gomas naturais ou sintéticas, resinas, metilcelulose, carboximetilcelulose, ou outros agentes de suspensão bem conhecidos.

[0037] Para a administração tópica à epiderme, o composto químico da invenção pode ser formulado como pomadas, cremes ou loções, ou como um penso transdérmico. As pomadas e os cremes podem, por exemplo, ser formulados com uma base aquosa ou oleosa com a adição de agentes espessantes e/ou gelificantes adequados. As loções podem ser formuladas com uma base aquosa ou oleosa e, em geral, também contêm um ou mais agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensão, agentes espessantes ou agentes corantes.

[0038] As composições adequadas para administração tópica oral incluem pastilhas compreendendo o agente ativo em uma base aromatizada, geralmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia, e colutórios compreendendo o ingrediente ativo em um carreador líquido adequado.

[0039] As soluções ou suspensões são aplicadas directamente na cavidade nasal por meios convencionais, por exemplo, com um conta-gotas, pipeta ou spray. As composições podem ser fornecidas na forma simples ou de múltiplas doses. Em composições destinadas à administração ao trato respiratório, incluindo composições intranasais, o composto terá geralmente um pequeno tamanho de partícula, por exemplo, da ordem de 5 mícrons ou menos. Tal tamanho de partícula pode ser obtido por meios conhecidos na técnica, por exemplo, por micronização.

[0040] As preparações farmacêuticas estão, preferencialmente, em formas de dosagem unitárias. Em tal forma, a preparação é subdividida em doses unitárias contendo quantidades apropriadas do componente ativo. A forma de dosagem unitária pode ser uma preparação embalada, a embalagem contendo quantidades discretas da preparação, tais como comprimidos embalados, cápsulas, e pós em frascos ou ampolas. Além disso, a forma de dosagem unitária pode ser uma cápsula, comprimido, troscisco, ou pastilha propriamente dita, ou pode ser o número apropriado de qualquer destes na forma embalada.

[0041] Os comprimidos, cápsulas e pastilhas para administração oral e os líquidos para administração intravenosa e infusão contínua são as composições preferidas. As soluções ou suspensões para aplicação na cavidade nasal ou ao trato respiratório são as composições preferidas. Os pensos transdérmicos são os preferidos para a administração tópica à epiderme.

[0042] Outros detalhes sobre as técnicas para formulação e administração podem ser encontrados na última edição de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA).

[0043] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento, prevenção ou alívio de ansiedade em um sujeito que necessita do mesmo, e cujo método compreende a administração a tal sujeito, incluindo um humano, em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de pteroestilbeno da invenção.

[0044] Uma dose terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de ingrediente ativo, que melhora os sintomas ou condição. A eficácia e toxicidade terapêuticas, por exemplo, ED50 e LD50, podem ser determinadas por procedimentos farmacológicos padrões em culturas de células ou animais experimentais. A razão de doses entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa pela razão de LD50/ED50. As composições farmacêuticas que exibem índices terapêuticos grandes são preferidas.

[0045] A dosagem dos compostos usados de acordo com a invenção varia dependendo do composto e da doença a ser tratada. A idade, o peso corporal magro, peso total, a área de superfície corporal e a condição clínica do paciente receptor; e a experiência e o julgamento do médico ou profissional que administra a terapia estão entre os fatores que afetam a dosagem selecionada. Outros fatores incluem a rota de administração, a história médica do paciente, a gravidade do processo da doença e a potência do composto particular. A dose deve ser suficiente para melhorar os sintomas ou sinais da doença tratada, sem produzir toxicidade inaceitável para o paciente. A dosagem pode ser variada por titulação da dosagem para circunstâncias particulares da presente invenção para produzir o efeito terapêutico desejado.

[0046] A conversão apropriada de doses de fármacos de estudos em animais para estudos em humanos (dose equivalente humana, HED) é obtida através do uso do método de normalização da área de superfície corporal (BSA). A inter-relação das dosagens para animais e humanos (com base em miligramas por metro quadrado de superfície corporal) é descrita por Reagan- Shaw et al. (2007 FASEB J. 22: 659-661). A fórmula para a tradução de dose a partir da dose animal para dose humana através da normalização para BSA (mg/m2) é: HED (mg/kg) = Dose animal (mg/kg) multiplicada por Km Animal/km Humano

[0047] onde o fator Km, peso corporal (kg) dividido pela BSA (m2), é usado para converter a dose em mg/kg usada na estudo animal para um mg/m2. O fator Km para camundongo é 3 e o fator Km para o ser humano é 37. Uma tabela (Tabela 1, Reagan- Shaw et al. supra) lista fatores Km calculados para as diversas espécies de animais com base em dados de Orientações do FDA.

[0048] O pteroestilbeno está presente na composição em uma quantidade suficiente para tratar, aliviar ou prevenir a ansiedade em um sujeito com necessidade do mesmo. Em uma modalidade mais preferida, o pteroestilbeno está presente na composição em uma quantidade suficiente para tratar, aliviar ou prevenir a ansiedade, por si só. O ingrediente ativo pode ser administrado em uma ou várias doses por dia. Um resultado satisfatório pode, em certos casos, ser obtido a uma dosagem tão baixa quanto a dose equivalente humana (HED) de 0,0405 mg/kg p.o. ou uma dose de cerca de 3 mg/dia p.o. para um paciente humano de 60 kg para uma dose de cerca de 15 mg/dia p.o. para um paciente humano de 60 kg. Dado que o pteroestilbeno tem uma meia vida de aproximadamente 2 horas, uma faixa aproximada pode ser de cerca de 10 mg/dia p.o. a cerca de 100 mg/dia p.o. para o referido paciente humano.

[0049] Atualmente é contemplado que faixas de dosagem adequadas sejam de 10-100 mg por dia para pacientes humanos, dependendo do habitual do modo exato de administração, forma em que é administrado, indicação para a qual a administração é dirigida, do sujeito envolvido e o peso do corpo e a área de superfície do corpo do sujeito envolvido, e ainda da preferência e experiência do médico ou veterinário responsável. Quando administrados em combinação com compostos conhecidos na técnica para o tratamento das doenças, a posologia pode ser reduzida.

EXEMPLOS

[0050] Tendo agora geralmente descrito esta invenção, o mesmo será mais compreendido por referência a certos exemplos específicos, que são aqui incluídos apenas para ilustrar ainda mais a invenção e não se destinam a limitar o escopo da invenção tal como definido pelas reivindicações.

EXEMPLO 1 Pteroestilbeno

[0051] O pteroestilbeno foi sintetizado como anteriormente descrito (Joseph et al., supra). Resumidamente, o pteroestilbeno foi sintetizado por condensação de 3,5- dimetoxibenzaldeído e ácido 4-hidroxifenilacético em anidrido acético e trietilamina. A mistura de reação foi aquecida (150°C) sob uma atmosfera de nitrogênio e agitou-se continuamente. Após 20 h, a reação foi interrompida e resfriada até à temperatura ambiente, e o ácido clorídrico concentrado (5 mL) foi adicionado. Um precipitado formou-se, e este foi dissolvido em 50 mL de clorofórmio e depois se extraiu com hidróxido de sódio aquoso a 10%. O extrato aquoso foi acidificado a pH 1 com ácido clorídrico concentrado e agitou-se durante pelo menos 6 h, o que resultou na precipitação do produto intermediário, o ácido α-[(3,5- dimetoxifenil)metileno]-4-hidroxi-(αZ) benzenoacético. Este produto intermediário foi aquecido com 1,0 g de cobre em 10 mL de quinolina (200°C, 6 h, sob nitrogênio). A mistura de reação foi resfriada até à temperatura ambiente e filtrada. Ao filtrado adicionou-se ácido clorídrico 5 N (25 mL), que foi agitado durante 1 h e, em seguida, extraído com clorofórmio. O extrato de clorofórmio contendo pteroestilbeno impuro foi purificado por cromatografia flash em um sistema Horizon HPFC (Biotage, Inc., Charlottesville, VA), utilizando uma coluna de sílica gel e o sistema de solvente de acetato etila:hexano (gradiente linear a partir de 15:85 a 100% de acetato de etila). As frações contendo pteroestilbeno puro foram combinadas e concentradas em vácuo. O pteroestilbeno foi recristalizado em hexano, e a sua estrutura foi confirmada a partir dos seus dados espectroscópicos (UV, espectrometria de massa, e espectroscopia de ressonância magnética nuclear) (Fig. 1).

[0052] O pteroestilbeno foi dissolvido em uma mistura de Cremophor, etanol, e salina (1:1:18) em doses compreendidas entre 1 e 10 mg/kg de peso corporal. Um volume de 10 mL/kg foi administrado por via oral 1 hora antes dos testes comportamentais.

EXEMPLO 2 Efeito de Pteroestilbeno em Estudo Comportamental do Labirinto em Cruz Elevado de Murino

[0053] Camundongos Swiss Webster do sexo masculino com oito semanas de idade (Harlan, IN, EUA) pesando 24-30 g no momento do teste foram usados para todos os estudos. Os animais foram alojados em grupos de cinco, foram fornecidos com alimentos e água ad libitum, e mantidos sob um ciclo 12:12 h de dia:luz. Todos os camundongos foram selecionados aleatoriamente para cada grupo de tratamento. Os procedimentos de alojamento, manuseio e experimentais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) da Universidade de Mississippi e aderidos às normas do National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals.

[0054] Para o estudo do labirinto em cruz elevado (EPM), o aparelho de EPM consistia em dois braços abertos (30 x 5 cm) e dois braços fechados (30 x 5 cm, paredes de 15 cm de altura) que se estendem a partir de uma plataforma central comum (5 x 5 cm). A configuração formou a forma de um sinal de cruz com braços comparáveis dispostos em frente um do outro. O aparelho foi elevado a 50 cm acima do nível do solo.

[0055] Os animais (n=6-10/grupo) foram aclimatizados por 30 minutos na sala de EPM antes do tratamento de pteroestilbeno ou diazepam. Embora o pteroestilbeno tenha sido administrado por via oral, o diazepam foi administrado intraperitonealmente. Após a conclusão da pteroestilbeno ou administração de diazepam por gavagem oral e i.p., respectivamente, os camundongos foram deixados ficar na mesma sala por 60 min e 30 min, respectivamente, antes do teste de EPM. Em seguida, os camundongos foram colocados individualmente no centro do aparelho de frente para um braço aberto, e deixados explorar livremente durante 5 min. A Traveled Distance in Open Arms (TDOA) (Distância Percorrida nos Braços Abertos), Traveled Distance in the Enclosed Arms (TDEA) (Distância Percorrida nos Braços Fechados); Permanece Time in Open Arms (PTOA) (Tempo de Permanência nos Braços Abertos); Permanece Time in the Enclosed Arms (PTEA) (Tempo de Permanência nos Braços Fechados); Number of Entries in Open Arms (NEOA) (Número de Entradas nos Braços Abertos) e Number of Entries in the Enclosed Arms (NEEA) (Número de Entradas nos Braços Fechados) foram medidos, isto é, a porcentagem da distância percorrida e o tempo gasto nos braços abertos e fechados, bem como o número de entradas de braço abertos e fechados foram quantificados utilizando um sistema de monitoramento de vídeo assistido por computador (San Diego Instruments, CA, EUA). O labirinto foi limpo com limpador de vidro e seco após cada teste. Uma entrada de braço foi registrada quando todas as quatro patas do camundongo estavam no braço. A porcentagem do tempo gasto nos braços abertos, bem como o número de entradas nos braços abertos, é considerada determinantes críticos, e medidas puras de ansiedade (Hogg, supra).

[0056] Aqui, pela primeira vez, mostramos que pteroestilbeno (Fig. 1) dependente da dose, exibiu ação semelhante à ansiolítica em EPM. A ação ansiolítica foi aparente a 1 mg/kg de dose do composto, atingiu o máximo em 2 mg/kg, e depois diminuiu para doses de 5, e 10 mg/kg. Quando comparado com o controle (0 mg/kg), pteroestilbeno aumentou significativamente todos os parâmetros correlacionados com efeitos semelhantes à ansiolíticos, como: % de distância percorrida nos braços abertos (TDOA) [F (4,43) = 3,056, p<0,05], % de tempo de permanência nos braços abertos (PTOA) [F (4,43) = 2,657, p <0,05], e número de entradas nos braços abertos (NEOA) [F (4,43) = 4,257, p<0,01] (Fig. 2A). Além disso, pteroestilbeno mostrou uma tendência de diminuição dos parâmetros nos braços fechados que são correlacionados com a ansiedade como % da distância percorrida nos braços fechados (TDEA), % do tempo de permanência nos braços fechados (PTEA), e o número de entradas nos braços fechados (NEEA) (Fig. 2B). Assim, a atividade ansiolítica máxima foi obtida com a dose de 2 mg/kg. A dose mais elevada de 10 mg/kg não foi eficaz.

[0057] Tradicionalmente, as entradas e saídas de braço são contadas quando um animal atravessa o limiar de um braço (Hogg, supra). Nas nossas experiências, uma entrada de braço foi registrada quando todas as quatro patas do camundongo estavam no braço. É, por conseguinte, possível que os camundongos estejam na zona quadrada central, que não é nem as seções de abertura nem as seções fechadas do labirinto. Em nossos registros, considerou-se a zona central sendo separada de ambos os braços abertos e fechados, e assim, produzindo resultados que são mais precisos e indicativos de efeito ansiolítico verdadeiro.

EXEMPLO 3 Efeito de Pteroestilbeno no Estudo Comportamental da Atividade Motora Espontânea de Murino

[0058] Para medir a atividade motora espontânea, camundongos Swiss Webster adultos (n = 8-10/grupo) foram administrados com Pteroestilbeno por gavagem oral. Cada camundongo foi então colocado na câmara locomotora e aclimatado no recinto de Plexiglas durante 30 minutos. Após o período de 30 minutos de aclimatação, a atividade locomotora foi medida durante 30 minutos utilizando um sistema de monitoramento da atividade automatizado (San Diego Instruments, CA, EUA). A atividade total foi expressa como o número total de interrupções de 16 ceil fotofeixes de células por câmara.

[0059] Para ilustrar o efeito sobre a atividade motora espontânea, medimos a atividade locomotora dos animais após o tratamento com pteroestilbeno com doses variando entre l e 10 mg/kg (Fig. 3). ANOVA de uma via não indicou nenhum efeito significativo do tratamento medicamentoso sobre a atividade locomotora. A comparação post-hoc mostrou que a atividade motora espontânea não foi afetada pela dose ansiolítica máxima de pteroestilbeno. A dose mais elevada, também não tem qualquer efeito sobre a atividade locomotora dos animais.

EXEMPLO 4 Análise de Western Blot: Sangue e Tecido

[0060] Após a sessão de EPM, as amostras de sangue foram colhidas de cada camundongo por punção da veia submandibular em frascos de coleta de sangue heparinizados. Os camundongos foram então sacrificados e os cérebros rapidamente removidos. O córtex pré-frontal (CPF) e o hipocampo foram dissecados em gelo, e imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80°C até posterior processamento. As amostras de sangue foram centrifugadas a 2000 rpm a 4°C durante 20 minutos para obter o plasma como sobrenadante. As amostras de plasma foram armazenadas a - 80°C até serem usadas.

[0061] A análise de Western blot de hipocampo do cérebro do camundongo foi realizada como descrito anteriormente (Al Rahim et al. 2009. Biochemistry 48:7713-7721), com modificações menores. Resumidamente, hipocampos congelados foram homogeneizados em tampão de homogeneização gelado [Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, NP-40 a 1%, DTT a 0,5 mM e 10 μl de Halt Protease & Phosphates Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific, IL, EUA) por mL de tampão]. O homogeneizado foi centrifugado a 12.000 a 4°C durante 10 min. O sobrenadante foi recolhido, suplementado com tampão de amostra e fervido a 95°C durante 5 min. A amostra preparada estava, assim, pronta para os experimentos de Western blot. Uma quantidade igual de proteína (30 μg) foi submetida a eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (géis a 12%), e a membrana de blot foi bloqueada em tampão TBST contendo 5% de leite desnatado durante 1 h à temperatura ambiente. A membrana foi então incubada com o anticorpo anti-phospho-ERK (Thr 202/Tyr 204, Cell Signaling Technologies, EUA). O outro gel foi executado com a mesma amostra, e a membrana foi incubada com anticorpo anti-beta-actina (Cell Signaling Technologies, EUA). O nível de expressão de fosfo-Akt no hipocampo foi verificado utilizando o anticorpo anti-phospho-AKT (Ser 473, Cell Signaling Technologies, EUA), seguido por nova sondagem com o anticorpo anti-β-actina (Cell Signaling Technologies, EUA). Os anticorpos ligados foram detectados com anticorpo anticoelho ligado a peroxidase de rábano (Cell Signaling Technologies, EUA) e desenvolvidos utilizando o sistema de imagens VersaDoc (Bio-Rad, EUA). As bandas imunorreativas relevantes foram quantificadas utilizando o software de análise Quantity One 1-D (Bio-Rad, EUA). Para avaliar a ativação de ERK, os níveis de fosfo-ERK foram normalizados ao de β-ctina.

[0062] Tendo em conta que os níveis de pERK aumentaram de forma significativa durante a ansiedade, e que a inibição da via de transdução de sinal de ERK pode desempenhar um papel na produção de ansiolíse (Ailing et al., 2008), a próxima etapa determinou o estado de fosforilação de ERK1/2 em homogenatos do hipocampo. A análise de Western blot revelou uma diminuição tanto na fosforilação de ERK1 [F(4,15) = 12,49, p<0,001] quanto na de ERK2 [F(4,15) = 3,024, p<0,05] em homogeneizados de hipocampo de camundongos tratados com 1 e 2 mg/kg de pteroestilbeno (Fig. 4, A e B). As doses de 5 e 10 mg/kg, que não mostrou qualquer efeito ansiolítico em EPM não apresentaram efeitos significativos sobre a fosforilação de ERKs. Também vale a pena mencionar que a diminuição da fosforilação de ERK1 foi muito mais acentuada do que a de ERK2. Não houve mudança significativa na fosforilação de ERKs no córtex pré-frontal de camundongos tratados com pteroestilbeno (dados não mostrados).

[0063] Para determinar se estes efeitos foram um resultado de uma redução indiscriminada no estado fosforilado de outras quinases pelas ações centrais de pteroestilbeno, mediu-se o nível de Akt fosforilada no hipocampo. Em contraste com a redução acentuada de fosforilação de ERKs, o estado de fosforilação de Akt foi verificado quase inalterado no hipocampo de camundongos tratados com o composto que varia de 1 a 10 mg/kg (Fig. 5),

EXEMPLO 5 Análise do Pteroestilbeno no Plasma e no Hipocampo e PFC por Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massa (GC-MS)

[0064] Os plasmas foram mantidos a -80°C e descongelados em gelo antes da extração. Os plasmas foram tratados com β-glucuronidase, para hidrolisar qualquer pteroestilbeno glucuronidado, seguindo procedimentos publicados (Remsberg et al. supra). Resumidamente, 50 μl de plasma (de cada animal) foram transferidos para um tubo Eppendorf, e 60 μl de solução d β- glucuronidase (tampão de fosfato de potássio de 5000 U/mL, 75 mM, pH 6,8 a 37°C) foi adicionado. A mistura foi misturada em vórtice, em seguida, incubadas a 37°C, agitando a 750 rpm durante 20 horas. Posteriormente, acetonitrila de grau de HPLC gelada foi adicionada, misturada em vórtice e centrifugada durante 5 min a 5000 rpm, 4°C. O sobrenadante foi recolhido, e seco sob uma corrente de nitrogênio. O sobrenadante seco foi usado para análise por GC-MS.

[0065] Os tecidos do hipocampo foram mantidos a ~ 80°C até o momento da extração. O hipocampo (esquerda e direita) de 2-3 animais foi combinado em um tubo Eppendorf, e processado como uma amostra. Ao tubo foram adicionados 200 μL de tampão fosfato (NaH2PO4 0,2 M:Na2HPO4 0,2 M, e os tecidos foram homogeneizados manualmente durante 2 minutos). Para aliquotas de 100 μl, 50 μL de β-glucuronidase (5000 U/mL de tampão de fosfato de potássio) foram adicionados. A mistura foi misturada em vórtice, e incubou-se (37°C, 20 horas), com agitação (750 rpm). As amostras foram então centrifugadas (15 min, 7000g, 4°C). O sobrenadante foi recolhido e dividido com acetato de etila (200 μL, duas vezes). As camadas de acetato de etila foram coletadas, secas sob uma corrente de nitrogênio, e usadas para a análise de GC-MS. A extração do córtex pré-frontal (PFC) foi realizada da mesma maneira que o hipocampo, tecidos de PFC de três animais foram combinados e tratados como uma amostra.

[0066] As amostras secas em nitrogênio (extratos de tecido de plasma e cérebro) foram tratadas com 30 μL uma mistura de 1:1 N,O- bis[trimetilsilil]trifluoroacetamida e dimetilformamida (Pierce Biotechnology, inc., Rockford, IL), e aquecidas a 70°C durante 40 min. As amostras derivatizadas foram analisadas para os níveis de pteroestilbeno utilizando um instrumento JEOL GCMate II (JEOL EUA inc., Peabody, MA), equipado com uma coluna capilar J&W DB-5 (0,25 mm de diâmetro interno, 0,25 μm de espessura de filme e 30 m de comprimento; Agilent Technologies, Foster City, CA). O programa de temperatura de GC foi: inicial de 190°C, aumentou para 240°C a uma taxa de 20°C/min, aumentou para 280°C a uma taxa de 2,5°C/min, em seguida, finalmente, aumentou para 300°C à taxa de 30°C/min e mantida a esta temperatura durante 0,5 min. O gás carreador foi hélio de ultra-alta pureza, a 1 mL/min de taxa de fluxo. A porta de injeção, interface de GC-MS, e a câmara de ionização foram mantidas a 250, 230, e 230°C, respectivamente. O volume de injeção foi de 2 μl (injeção sem divisão). O espectro de massa foi adquirido no modo de monitoramento iônico selecionado positivo (m/z 328, 313, e 297); impacto de elétrons de 70 eV. As análises de GC-MS foram em duplicatas. O tempo de retenção do pteroestilbeno foi de 10,2 min. A quantificação de pteroestilbenos foi feita utilizando um padrão externo de uma amostra sintética de pteroestilbeno previamente caracterizada para a estrutura e pureza.

[0067] O nível plasmático de pteroestilbeno a 1 mg/kg de dose foi verificado como sendo 10,08± 6,67 ng/mL, e aumentou correspondentemente com a dose alcançando 130,26±40,25 ng/mL a 10 mg/kg (Tabela 1). O nível de pteroestilbeno nos tecidos do hipocampo a 1 mg/kg de dose foram detectáveis, mas abaixo do limite de quantificação (0,0840 ng). Nas doses de 2, 5 e 10 mg/kg, os níveis eram quantificáveis e variaram de 0,2627-1,1217 ng/hipocampo (Tabela 2). Apenas níveis traços de pteroestilbenos (não quantificáveis) foram verificados nos tecidos do córtex pré-frontal para todas as doses administradas. Tabela 1. Níveis de pteroestilbeno no plasma

Tabela 2. Níveis de pteroestilbeno no hipocampo

aNa dose de 1 mg/kg, os níveis pteroestilbeno ficaram abaixo do limite de quantificação (0,0840 ng). bUma amostra consiste em tecidos do hipocampo combinados de 2-3 animais.

[0068] Todas as publicações e patentes mencionadas neste relatório descritivo são aqui incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação ou patente fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

[0069] Entende-se que a descrição detalhada anterior é dada apenas a título de ilustração e que modificações e variações podem ser feitas na mesma, sem se distanciar do espírito e do escopo da invenção.

Claims

1. Uso de uma composição farmacêutica ou nutracêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pteroestilbeno, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para tratar, aliviar, ou prevenir ansiedade em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que um efeito ansiolítico terapêutico resulta após uma única administração da dita quantidade terapeuticamente eficaz de pterostilbeno e o dito efeito ansiolítico terapêutico comparável ao efeito ansiolítico terapêutico de Diazepam, um controle ansiolítico positivo, e é substancialmente isento de efeitos colaterais sedativos.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero sofrendo de ansiedade devido a condições tais como evento catastrófico, uma mudança em ambiente, ou deslocamento.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano sofrendo de ansiedade devido a condições tais como distúrbios do sono, obesidade, ou depressão.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano sofrendo de ansiedade como um efeito colateral de uma doença, tal como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, coreia de Huntington, diabetes e câncer.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade eficaz é uma quantidade total com base no peso total e a área da superfície do corpo do indivíduo.

6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a quantidade eficaz é uma quantidade total de cerca de 10 mg/dia a cerca de 100 mg/dia.

7. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição nutracêutica é um alimento ou bebida ou uma composição de suplemento para um alimento ou bebida.

8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a quantidade eficaz está presente em uma quantidade de cerca de 10mg/dia a cerca de 100 mg/dia.