KR101929074B1

KR101929074B1 - 프티로스틸벤의 항불안 효과

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Publication number: KR101929074B1
Application number: KR1020137032950A
Authority: KR
Inventors: 아그네스 엠. 리만도; 아비르 엘-아이피; 엠디 알 라힘
Original assignee: 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리 오브 애그리컬쳐; 더 유니버시티 오브 미시시피
Priority date: 2011-05-11
Filing date: 2012-05-10
Publication date: 2018-12-13
Also published as: BR112013028776A2; CA2839309C; EP2706992A2; CA2839309A1; EP2706992A4; HK1194302A1; AU2012253479A1; WO2012154956A2; AU2012253479B2; JP2014514361A; CN103561729A; EP2706992B1; WO2012154956A3; KR20140107112A; CN103561729B; US9439875B2; JP6027607B2; US20160067192A1; JP2017014284A; BR112013028776B1

Abstract

레스베라트롤의 천연 유사체인, 프티로스틸벤은 쥐의 해마 내에서 ERKs의 인산화된 농도를 하향 조절함으로써 항불안-유사 작용을 나타낸다. 프티로스틸벤 (1 - 10㎎/㎏ BW)이 경구 섭식(oral gavage)에 의해 투여된 쥐가 십자형 높은 미로(EPM) 실험에 적용되었다. 프티로스틸벤은 1 및 2 ㎎/㎏의 투여량에서 항불안 작용을 나타냈고, 불안의 중요한 결정 요인인 열린-가지에서의 머문-시간 및 개체수의 증가로 인해 이를 입증했다. 이러한 항불안 작용은 EPM에서의 디아제팜 1 및 2 ㎎/㎏과 견줄만하였다. 닫힌-가지 내의 이동-거리 및 머문-시간의 백분율이 1 및 2 ㎎/㎏의 투여량에서 감소하였다. 5 및 10 ㎎/㎏ 투여량은 어떠한 항불안 효과도 나타내지 않았다. 일반 운동 활성(Locomotor activity)은 모든 투여량에서 영향을 받지 않았다. 웨스턴 블롯 분석법(Western blot analysis)이 상기 EPM 관측 결과를 확증하였다. 프티로스틸벤은 단일 경구 투여 후의 혈청(serum) 및 뇌 조직에서 검출되었고, 상기 화합물이 혈액 뇌관문(blood-brain barrier)을 투과하고, 이로써 이의 항불안 효과를 나타냄을 입증하였다. 레스베라트롤은 어떠한 항불안 효과도 가지지 않았다.

Description

프티로스틸벤의 항불안 효과{ANXIOLYTIC EFFECT OF PTEROSTILBENE}

본 발명은 포도 및 몇몇의 산앵도나무속(Vaccinium) 베리에서 발견되는, 레스베라트롤의 유사체인 프티로스틸벤의 치료 효과량(therapeutically effective amount)을 포함하는 약학 조성물을 투여함으로써 불안을 치료, 완화 또는 방지하기 위한 방법에 관한 것이다.

불안 장애는 사회 구조와 기본적 및 보조적 의학 치료에 있어서 일반적이고, 종종 만성 임상 상태로 전환된다 (Nutt et al. 2002. Int . J. Neuropsychopharmacol. 5:315-325). 불안 장애는 정신 의학 장애의 가장 일반적인 유형이고, 18.1%의 이환수(incidence), 28.8%의 일생 유병률(lifetime prevalence)을 가진다 (Kessler et al. 2005. Arch. Gen. Psychiatry 62: 617-627; Ohayon, M. M. 2006. J. Psychiatr . Res. 40: 475-476). 수 천년 동안 인간에 의해 항-불안 약물이 사용되어 왔다. 벤조디아제핀 약물 그룹은 빠르게 작용하고, 효과적이며, 가장 일반적으로 처방되는 항불안제이다. (Bandelow et al. 2008. World J. Biol. Psychiatry 9:248-312; Baldwin et al. 2005. J. Psychopharmacol. 19:567-596; Rudolph and Mohler. 2006. Curr . Opin . Pharmacol. 6:18-23). 그러나, 이의 장기간 사용은 졸음(sedation), 내성의 발생(development of tolerance), 남용의 경향성(abuse liability), 및 금단 증상(withdrawal symptom)과 같은 부작용에 관련되어 있다 (Nutt et al ., supra; Bandelow et al., supra; Baldwin et al ., supra). 최근, 항우울제의 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(selective serotonin reuptake inhibitor) 그룹이 대부분의 불안 장애에 대한 일선의 치료로서 사용되고 있다. 그러나, 상기 그룹 또한 단점을 가진다. 특히, 치료 작용의 발현이 느리고, 따라서, 항불안 효과가 발생하기 위하여 몇 주의 치료가 필요하다 (Nutt et al ., supra; Bandelow et al., supra; Baldwin et al ., supra). 그러므로, 빠른 치료 작용을 갖지만, 부작용이 전혀 없는 항불안 화합물이 여전히 필요하다.

많은 천연 화합물이 유용한 약학적 수단으로(Furukawa et al. 1993. J. Biol. Chem. 268:26026-26031) 뿐만 아니라, 약물 개발을 위한 잠재적인 치료 리드(lead)(Liu, J. 1993. Trends Pharmacol . Sci. 14:182-188)로 제공되어 왔다. 스틸벤(Stilbene)은 α,β-디페닐에틸렌 코어 구조를 갖는 식물화학물질(phytochemical)의 일종이다. 스틸벤은 포도, 땅콩 및 산앵도나무속의 열매를 포함하는 다수의 관련 식물 속(genera)에서 보고되었다 (Chong et al. 2009. Plant Sci. 177:143-155). 널리 연구된 스틸벤인 레스베라트롤은 많은 생물학적 시스템에서 항-산화제, 소염제(anti-inflammatory), 항암제(chemopreventive), 및 노화방지(anti-aging) 효과를 나타내는 것으로 보고되었다 (Aggarwal et al. 2004. Anticancer Res . 24:2783-2840; Baur and Sinclair. 2006. Nat . Rev . Drug Disco. 5:493-506; Bishayee, A. 2009. Cancer Prev . Res. 2:409-418). 최근에는, 블루베리 및 디어베리와 같은 산앵도나무속의 열매에서 발견되는 레스베라트롤의 천연 유사체인 프티로스틸벤(Rimando et al . 2004. J. Agric . Food Chem . 52:4713-4719) 이 레스베라트롤에서 나타나는 상기 다양한 효과를 지니기 때문에, 많은 주목을 받고 있다. 프티로스틸벤은 진통(analgesic), 항당뇨(antidiabetic), 항산화(antioxidant), 소염(anti-inflammatory), 하이포리피데믹(hypolipidemic), 및 암 화학 예방(cancer chemopreventive)의 특성을 갖는다 (Amarnath Sateesh and Pari. 2006. J. Pharm . Pharmacol. 58:1483-1490; Remsberg et al. 2008. Phytotherapy Res. 22: 169-179; Rimando et al. 2002. J. Agric . Food Chem . 50:3453-3457; Rimando et al. 2005. J. Agric . Food Chem . 53:3403-3407). 프티로스틸벤은 또한 결장암의 발생(Paul et al. 2009. Cancer Prev . Res. 2:650-657, 침투 및 전이(Pan et al . 2009. Carcinogenesis 30:1234-1242), 그리고, 나이든 쥐의 역전 인지적 결함(reversing cognitive deficit) (Joseph et al. 2008. J. Agric . Food Chem . 56:10544-10551)에 있어서 현저한 효과를 가진다. 그러나, 프티로스틸벤의 이러한 항불안의 잠재력은 아직 연구되지 않았다.

스틸벤을 포함하는 많은 천연 화합물은 서로 다른 신호 전달 경로와 관련된 단백질 키나아제, 예를 들어, 유도성 산화질소 합성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS), 시클로옥시게네이즈-2 (cyclooxygenase-2, COX-2), 및 p38 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (p38 mitogen-activated protein kinase, MAPK)와 상호 작용한다 (Paul et al . 2009, supra). MAPK 군의 일원인 세포외 신호조절인산화효소 1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK 1/2)가 뉴런을 포함하는 많은 세포 유형의 전사 조절에 있어서 중요한 역할을 하는 것은 잘 규명되었다 Hetman and Gozdz. 2004. Eur. J. Biochem. 271 :2050-2055). 축적된 증거들은 상기 ERK 신호 전달 경로가 스트레스에 노출되는 것(Gerrits et al. 2006. Neuroscience 142:1293-1302)을 포함하는 다양한 자극 하에 활성화됨을 나타낸다(Davis, R. J. 1993. J. Bioi. Chem. 268:14553-14556; Hetman and Gozdz, supra). 또한, 해마 및 측면 편도에서의 상기 ERK 신호 전달 경로가 불안의 역할을 하는 것으로 추측된다 (Paul et al. 2007. Biol . Psychiatry 61:1049-1061; Tronson et al. 2007. Neuropsychopharmacol. l33:1570-1583). 이러한 견해은 또한, 불안한 동안에 인산화된 ERK의 수준이 현저하게 증가한 결과로 강화된다. 그러므로, 상기 ERK 신호 전달 경로는 불안에 중요한 역할을 할 것이고, 이의 억제가 항불안 효과를 생산할 수 있다 (Ailing et al. 2008. J. Psychiatr . Res. 43:55-63).

따라서, 불안에 있어서 신호 전달 경로의 역할 및 불안을 치료하는 데 사용될 수 있는 물질(agent)에 대한 필요성을 고려하여, 불안의 억제제로서의 프티로스틸벤의 효과를 밝히는 것이 본 발명(work)의 목적이다.

이를 필요로 하는 대상에 있어서, 프티로스틸벤, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염(salt) 또는 이성질체(isomer)의 치료 효과량을 투여함으로써 불안을 치료, 완화 또는 방지하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 일부는 프티로스틸벤을 함유하는 약학 조성물을 포함하는 키트; 및 상기 키트의 사용에 대한 지침(instruction)을 제공한다.

불안 억제제로서 프티로스틸벤의 특성을 연구한 결과, 프티로스틸벤이 항-불안제로 사용될 수 있음이 확인되었다.

도 1은 프티로스틸벤의 화학적 구조를 나타낸다.
도 2A 및 2B는 십자형 높은-미로(EPM) 실험에서의 행동에 기반한 프티로스틸벤의 경구 투여의 효과를 나타낸 것이다. 5분 동안의 상기 EPM 실험 전에, 수컷 스위스 웹스터 쥐(Swiss Webster mice)에게 부형약(vehicle) 또는 프티로스틸벤(1-10㎎/㎏)을 60분 동안 경구 튜브로 주입하였다. 이동 거리의 백분율, 소비 시간의 백분율, 및 열린(도 2A) 및 닫힌(도 2B) 가지의 개체수가, OA 및 EA 각각, 측정되었다. 각 막대(column)는 평균 ± SEM을 나타낸다. 투여량 당 n = 6 - 10이다. 부형약 조절과 비교하여 *p＜0.05, **p＜0.01이다(두네트의 검정(Dunnett's test)에 따른 일원배치분산분석(one-way ANOVA)).
도 3은 십자형 높은-미로 실험에서의 행동에 기반한 디아제팜의 복강내(i.p.) 투여 효과를 나타낸 것이다. 5분 동안의 상기 EPM 실험 전에, 수컷 스위스 웹스터 쥐(Swiss Webster mice)에게 부형약(vehicle) 또는 디아제팜(0.5-2㎎/㎏)을 30분 동안 i.p.에 의해 주입하였다. 이동 거리의 백분율, 소비 시간의 백분율, 및 열린(도 3A) 및 닫힌(도 2B) 가지의 개체수가, OA 및 EA 각각, 측정되었다. 각 막대(column)는 평균 ± SEM을 나타낸다. 투여량 당 n = 6-10이다. 부형약 조절과 비교하여 **p＜0.01이다(두네트의 검정(Dunnett's test)에 따른 일원배치분산분석(one-way ANOVA)).
도 4는 쥐의 일반 운동 활성(locomotor activity)에 기반한 프티로스틸벤의 경구 투여 효과를 나타낸 것이다. 5분 동안의 십자형 높은-미로 실험 전에, 수컷 스위스 웹스터 쥐에게 부형약 또는 프티로스틸벤(1-10㎎/㎏)을 60분 동안 경구 섭식(oral gavage)에 의해 주입하였다. 자발적인 흥분이 챔버 당 가로막힘(interruptions)의 총 수와 관련하여 측정되었다. 각 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다. 투여량 당 n = 8-10이다.
도 5A 및 5B는 해마(hippocampus) 내에서 ERK1/2의 인산화에 대한 프티로스틸벤의 경구 투여 효과를 나타낸 것이다. 도 5A는 EPM 실험 직후에 희생된 쥐에 대해서 인산화된 ERK1/2의 농도에 관한 대표적인 데이터를 나타낸 것이다. 도 5B는 훈련(training) 직후에 희생된 쥐에 대해서 ERK1/2 인산화에 관한 변화의 농도 분석(densitometric analysis)을 나타낸 것이다. 수치값(value)은 적어도 세 마리 동물에 대한 평균 ± SEM으로 표현되었다. 부형약 조절과 비교하여 *p＜0.05, **p＜0.01이다(두네트의 검정(Dunnett's test)에 따른 일원배치분산분석(one-way ANOVA)).
도 6은 해마 내에서 Akt의 인산화에 대한 프티로스틸벤의 경구 투여 효과를 나타낸 것이다. 십자형 높은-미로 실험 직후에 희생된 쥐에 대한 인산화된 ERK1/2의 농도에 관한 대표적인 데이터. 인산화된 Akt(Ser 473)에 특이성을 지닌(specific) 항체와 함께 프로브(probing)한 후에, 블롯(blot)이 항-β-엑틴 항체(anti-β-actin antibody)와 함께 재-프로브(re-probed)되었다.

이러한 발견에 따라, 이를 필요로 하는 대상에 있어서, 프티로스틸벤, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염(salt) 또는 이성질체(isomer)의 치료 효과량을 투여함으로써 불안을 치료, 완화 또는 방지하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

또한, 본 발명의 일부는 프티로스틸벤을 함유하는 약학 조성물을 포함하는 키트; 및 상기 키트의 사용에 대한 지침(instruction)에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기 기재로부터 쉽게 명백해질 것이다.

레스베라트롤과 같이, 다수의 약학적 활성이 프티로스틸벤의 결과로 또한 나타났다. 본 발명(work)은 프티로스틸벤에 대하여 보고된 일련의 건강에 이로운 특성을 증가시킨다; 여기서, 이의 항불안 효과가 최초로 입증된다. 본 연구에 있어서, 상기 프티로스틸벤의 항불안-유사 효과는 기존의 불안 측정 동물 모델(animal model of anxiety)인 십자형 높은-미로 (EPM), 항불안 평가(anxiolysis assessment)에 관한 행동적 모델에 기반하여 조사되었다. 상기 EPM 실험은 새로운 항불안제의 분석에 있어서, 가장 널리 인증된 실험의 하나로 여겨진다 (Pellow et al. 1985. J. Neurosci . Methods 14: 149-167; Hogg, S. 1996. Pharmacol . Biochem . Behav. 54: 21-30). 가장 자주 사용되는 항불안 화합물의 하나인 디아제팜이 본 연구의 양성 조절(positive control)로 사용되었다. 설치류에 의해 나타나는 새로운 환경을 탐험하려는 욕구와 개방된 높은 장소에 대한 불안 사이의 충돌을 고려하여, 상기 EPM은 많은 연구원에 의해 이용되는 불안의 측정 모델(model of anxiety)로서 널리 사용된다 (Pellow et al ., supra; Hogg, supra). 설치류의 정상적인 탐험 행동은 상기 십자형 높은-미로 모델에 있어서, 미로의 닫힌 가지를 선호하는 것으로 나타났고, 불안을 유발하는(anxiety-provoking) 열린 가지에 대한 반감(aversion)이 EPM 모델의 기초원리(basis)이다 (Pellow et al., supra; Ohl, F. 2003. Clin . Neruosci . Res. 3: 233-238). 많은 증거는 항불안 화합물의 투여가 상기 열린 가지에 대한 자연스러운 반감을 감소시키고, 그 탐험을 장려하는 것을 규명했다 (Pellow et al., supra; Hogg, supra).

본 연구에 있어서, 또한, 쥐에게 상기 화합물을 경구 투여한 이후에, 혈장 및 조직의 프티로스틸벤 농도를 확인했다. 혈청의 프티로스틸벤 농도는 투여량에 따라 증가했고, 해마의 프티로스틸벤 농도가 이에 상응하여 증가함이 관찰되었다(실험 5 참고). 단백질 키나아제 조절의 효과를 연구하고, 근본적인 프티로스틸벤 작용의 메커니즘을 설명하기 위하여, 쥐의 해마 내의 인산화된 ERK1/2의 변화가 측정되었다.

프티로스틸벤은 1 및 2 ㎎/㎏의 투여량에서 불안 감소(anxiolysis)를 나타내었다: 중요한 결정 요인이며, 불안과 상관 관계가 있는 것으로 고려되는 열린 가지 내의 머문 시간(PTOA, Permanence Time in Open Arms), 및 열린 가지 내의 개체수(NEOA, Number of Entries in Open Arms)가, 정확히(defined) 낮은 투여량에서 증가되었다 (실시예 2 참고). 프티로스틸벤은 또한, 열린 가지 내의 이동 거리(TDOA, Traveled Distance in Open Arms)의 백분율을 1 및 2 ㎎/㎏ 모두에서 증가시킬 수 있었다. 그러나, 더 높은 투여량(5 및 10 ㎎/㎏)은 어떠한 항불안 효과도 나타내지 않았고; 반대로, 상기 더 높은 투여량은 열린 가지에 대한 반감을 증가시키는 경향성을 보였으며, 즉, 더 높은 투여량은 불안을 유발했다. 프티로스틸벤의 항불안 작용은, 또한, 닫힌 가지 내의 이동 거리(TDEA, Traveled Distance in the Enclosed Arms)의 백분율 및 닫힌 가지 내의 머문 시간(PTEA, Permanence Time in the Enclosed Arms)의 백분율이 1 및 2 ㎎/㎏의 프티로스틸벤의 처리에 의해 감소되는 것을 발견함으로써 더 확증되었다. 또한, 프티로스틸벤의 항불안 작용은 디아제팜과 매우 유사했다. 2 ㎎/㎏의 프티로스틸벤은 2 ㎎/㎏의 디아제팜과, 적어도 상기 EPM에 있어서, 비슷한 효과를 나타내었다. 그러므로, 양성 조절로서 디아제팜의 사용은 EPM 행동적 패러다임에 있어서, 프티로스틸벤의 항불안 잠재력을 더 확인시킨다. NEOA 및 PTOA와는 독립적으로 변화함에 따라 순수한 일반 운동 활성이 측정된 닫힌 가지 내의 개체 수(NEEA, Number of Entries in the Enclosed Arms)는 본 실험에서 사용된 투여량의 범위에 걸쳐 변하지 않았다. 프티로스틸벤의 모체 분자인 레스베라트롤이, 3 및 20 ㎎/㎏의 투여량에서 실험된 경우, 어떠한 항불안 효과도 가지지 않는다는 것에 주목할 가치가 있다 (Patisaul et al. 2009. Hormones and Behavior 55:319-328).

보다 낮은 투여량(1 및 2 ㎎/㎏)에서의 프티로스틸벤의 항불안 작용이 동물의 운동 활동(motor activity)에 있어서, 상기 화합물의 우울 작용(depressive action)의 부차적인 결과가 아니라는 것을 입증하기 위해, 동물의 일반 운동 활성이 측정되었다. 보다 높은 투여량(5 및 10 ㎎/㎏)에서의 항불안 효과의 부재도 운동 장애(motor impairment)에 기인하지 않는다. 그러므로, 어떠한 흥분(stimulant) 또는 우울 작용도 나타나지 않았고, 상기 관측된 항불안 효과가 위양성(false positive)일 가능성은 전혀 없음을 나타낸다.

상기 EPM 및 일반 운동 실험(locomotor test)에 더하여, 우리는 또한, 불안의 역할을 하는 단백질의 발현을 연구함으로써, 상기 관측된 프티로스틸벤의 항불안-유사 작용을 설명할 수 있는 분자적 기질에 주목하였다. 웨스턴 블롯 연구(Western blot study)로 얻어진 결과는, EPM의 항불안 효과가 입증된 상기 낮은 투여량(1 및 2 ㎎/㎏)의 프티로스틸벤이 처리된 동물의 해마 내에서, 인산화된 ERK 1 농도의 현저한(marked) 감소를 보여주었다. 또한, 동일한 투여량에서 해마 내의 ERK 2 인산화 상태에 있어서는 완만한 감소가 관찰되었다. 중요한 것은, 보다 높은 투여량(5 및 10 mg/kg)이 ERK 1/2의 인산화 상태에 어떠한 변화도 야기하지 못하는 것이, EPM에서 관측된 동일한 투여량에서의 상기 화합물의 항불안 효과의 부족에 대응된다는 것이다. 더욱이, 세린/트레오닌-특이성 단백질 키나아제 군(EC 2.7.11.1)의 구성원인 효소에 있어서, Akt 군(Akt1, Akt2, 및 Akt3) 코드의 세가지 유전자 및 분석은 동물의 해마 내에서 인산화된 Akt의 농도에 어떠한 변화도 없음을 보여주었다. 그러므로, 본 결과는 프티로스틸벤의 항불안 작용 및 이것이 쥐의 해마에서 ERK의 작용을 감소시키는 능력 사이의 연관성을 시사한다. 다른 연구들은 프티로스틸벤이 RAW 264.7 세포 내에서 ERK1/2의 활성을 막는 것을 보여주었다 (Pan et al. 2008. J. Agric . Food Chem . 56: 7502-7509). 본 연구는 체내에서(in vivo) 특정 낮은 투여량의 프티로스틸벤이 ERK1/2의 활성을 하향-조절(down-regulate)하는 것을 최초로 입증한다.

최근 보고서는 pERK의 농도가 불안 중에 해마 및 전두엽 피질(prefrontal cortex, PFC)을 포함하는 서로 다른 뇌 영역에서 현저하게 증가하고, 이의 억제가 항불안-유사 작용을 발생시킬 수 있음을 나타낸다 (Ailing et al ., supra; Martinez et al. 2009. Pharmacol . Biochem . Behav. 92:291-296). 이러한 사실은 쥐에게 녹차의 폴리페놀릭 화합물인, 에피갈로카테킨-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate)를 급성 투여(acute administration)한 후에 관측된 항불안-유사 작용과 일치하고(Vignes et al. 2006. Brain Res. 1110:102-115), 상기 화합물은 또한 ERK 1/2의 인산화 상태를 감소시키는 능력을 갖는다 (Chung et al., 2001. FASEB J. 15: 2022-2024; Sah et al. 2004. J. Biol . Chem. 279:12755-12762). 나아가, pERK 1/2의 지속적인 핵 축적이 해로운 결과를 지니는 일로 보고되었다 (Colucci-D'Amato et al . 2002. Bioessays 25:1085-1095). 만성적 스트레스 후에 증가된 pERK1/2의 신호 변환은 변연 구조(limbic structure) 내에 고리화 17β-에스트라디올(cyclic 17β-estradiol)의 투여에 의해 예방되고, 스트레스 재발의 해로운 결과로부터 보호할 수 있다 (Gerrits et al., supra). 더욱 고무적인 것은, MEK 억제제를 사용한 ERK 경로의 억제가, 또한, 다양한 기관의 손상에 대한 치료 효과를 나타낸 것이다 (Otani et al. 2007. J. Clin . Neurosci. 14:42-48).

뇌는 MAP 키나아제의 인산화를 잠재적으로 변화시킬 수 있는, NMDA, GABA와 같은 다양한 수용체 및 이온 통로(ion channel)를 포함한다. NMDA 수용체에 의한 MAP 키나아제의 활성화를 보여주는 연구들은 잘 문서화되어왔다(Xia et al . 1996. J. Neurosci. 16:5425-5436; Orban et al. 1999. Trends Neurosci. 22:38-44). 또한, 연구들은 GABA 수용체 기능의 음성 조절(negative modulator)에 따른 ERK/MAPK 경로를 보여준다(Bell-Horner et al. 2006. J. Neurobiol. 66:1467-1474). NMDA 수용체의 차단 또는 GABA 수용체의 활성화에 의해서 조절되는 ERK1/2 인산화의 감소에 대하여 연구가 진행 중에 있다.

보다 높은 투여량의 프티로스틸벤이 일반 운동 활성을 현저하게 변화시키지 않거나, 현저한 감소를 야기하지 않는 것에 대해서, 누군가는 왜 보다 높은 투여량의 상기 화합물이 상기 EPM 실험에서 어떠한 항불안-유사 작용도 나타내지 못하였는지 이의를 제기할 수 있다. 설치류가 새로운 환경(여기서, EPM이 새로운 환경임)을 탐험할 때, 비록 EPM이 완전한 행동 패러다임이 아니더라도, 작동 기억 장치(working memory buffer)의 용량이, 적어도 일부에서, 작동 상태가 될 수 있다. 동물이 상기 EPM에서 열린 및 닫힌 가지의 위치를 인지하기 위해서는 공간적 지각(Spatial learning)이 또한 중요하고, 이러한 공간적 정보의 인지는 해마의 기능에 의존한다 (Olton and Papas. 1979. Neuropsychologia 17:669-682). 따라서, 최초의 EPM 경험이, 시간이 지남에 따라, 동일한 미로-영역에서의 뒤이은 쥐의 행동을 변화시킬 가능성이 있다. 더욱이, 프티로스틸벤의 높은 투여량(10 mg/kg)이 인지 성능, 특히, 쥐의 공간적 기억력을 향상시킬 수 있다(Joseph et al., supra). 실제로, 본 연구에서 10 mg/kg 투여량의 프티로스틸벤의 농도가 1.1217 ng/해마(표 2)이고, Joseph et al., supra 에 보고된 것과 유사하다는 것이 발견되었다. 그러므로, 높은 투여량(5 및 10 mg/kg)의 프티로스틸벤이 기억 경로(memory pathway)에 작용함과 동시에, 쥐의 작동 기억 장치의 용량을 증가시킬 수 있고, 이로써, 상기 EPM 가지에 대한 최초의 노출 이후에, 스트레스를 유발하는 불쾌한(aversive) 열린 가지로의 탐사 행동이 제한됨을 추측하는 것이 타당하다. 이러한 견해는 높은 투여량의 프티로스틸벤이 보다 낮은 투여량에 비하여, 해마 내의 인산화된 ERKs의 농도를 증가시키고, 증가된 pERK의 농도가 상기 작동 기억 장치를 증진시키는 역할을 할 수 있음을 나타내는 발견에 의해 더욱 강화된다.

본 결과는 블루베리의 성분인 프티로스틸벤이 쥐의 십자형 높은-미로에서 항불안-유사 작용을 나타내는 것을 최초로 입증한다. 또한, 보다 높은 투여량의 프티로스틸벤은 EPM 및 일반 운동 활성 관측 챔버(locomotor activity monitoring chamber)에서, 어떠한 진정 효과(sedating tendency)도 나타내지 않고, 상기 화합물의 유리한 부작용 프로파일(favorable side-effect profile)을 나타낸다. 상기 화합물의 항불안 작용은 동물의 해마 내의 ERK1/2 인산화의 하향 조절에 의해 나타난다. 그러나, 프티로스틸벤이 ERK 인산화를 하향 조절하는 것을 통한 상기 메커니즘을 더 잘 이해하기 위하여 추가적인 연구가 요구된다.

본 발명의 상기 화합물은 결과적으로, 이를 필요로 하는 대상에 있어서, 불안을 치료, 완화 또는 예방하기 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 상기 화합물은 불안 장애, 예를 들어 광장 공포증(agoraphobia)을 수반 또는 수반하지 않는 공황 장애(panic disorder), 공황 장애의 병력이 없는 광장 공포증, 사회 공포증(social phobias)을 포함하는 동물 및 다른 공포증, 강박 장애(obsessive-compulsive disorder), 및 범(generalized) 또는 물질 유도성(substance-induced) 불안 장애; 외상 후(post-traumatic) 및 급성(acute) 스트레스 장애를 포함하는 스트레스 장애; 수면 장애(sleep disorder); 기억 장애(memory disorde); 노이로제(neuroses); 아이들의 경련성 질환(convulsive disorder), 예를 들어 간질(epilepsy), 발작(seizures), 경련(convulsions), 또는 열성 경련(febrile convulsions); 편두통(migraine); 기분 장애(mood disorder); 우울(depressive) 또는 양극성 장애(bipolar disorder), 예를 들어 우울증(depression), 단발성 삽화(single-episode) 또는 재발성 주요 우울증(recurrent major depressive disorder), 기분 부전 장애(dysthymic disorder), 양극성 장애(bipolar disorder), 양극성 I형 및 양극성 Ⅱ형 조증 장애(bipolar I and bipolar II manic disorder), 및 기분 순환 장애(cyclothymic disorder), 정신분열증(schizophrenia)을 포함하는 정신 이상(psychotic disorder); 뇌허혈증(cerebral ischemia)으로부터 야기되는 신경퇴화(neurodegeneration); 주의력 결핍 과잉 행동 장애(attention deficit hyperactivity disorder); 통증 및 통각 수용(pain and nociception), 예를 들어, 신경병증 통증(neuropathic pain); 급성(acute), 지연성(delayed) 및 예기성(anticipatory) 구토(emesis)를 포함하는 구토, 특히, 항암화학요법(chemotherapy) 또는 방사선(radiation)에 의해 유도되는 구토; 멀미(motion sickness), 수술 후 구역질(post-operative nausea) 및 구토(vomiting); 신경성 식용부진증(anorexia nervosa) 및 폭식증(bulimia nervosa)을 포함하는 식이 장애(eating disorder); 월경전 증후군(premenstrual syndrome); 신경통(neuralgia), 예를 들어, 삼차 신경병증(trigeminal neuralgia); 예를 들어, 마비 환자에 있어서 근경련(muscle spasm) 또는 경직(spasticity); 알코올 금단(alcohol withdrawal)을 포함하는 약물 남용 또는 의존; 알츠하이머병(Alzheimer's disease)과 같은 인지 장애(cognitive disorder); 뇌경색(cerebral ischemia), 뇌졸중(stroke), 뇌진탕(head trauma); 이명(tinnitus): 및 예를 들어, 시차 또는 교대제 근무로 고통받는 대상의 일주기성 리듬 장애(disorders of circadian rhythm)의 치료, 방지 또는 완화에 유용한 것으로 생각된다.

프티로스틸벤, 또는 약학적으로 허용 가능한 프티로스틸벤의 염을 함유하는 본 발명에 따른 조성물은 화합물들을 블렌딩(blending) 및 혼합하는 통상적인 절차에 의해 조제될 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 부형제(excipient), 가장 바람직하게는, 약학적 부형제를 더 포함한다. 부형제를 함유하고, 프티로스틸벤을 포함하는 조성물은 당해 기술 분야에서 알려진 절차에 의해 조제될 수 있다. 예를 들어, 프티로스틸벤은 정제(tablet), 캡슐, 분말(powder), 현탁액(suspension), 경구 투여용 용액 및 정맥(intravenous), 피내(intradermal), 근육(intramuscular), 및 피하(subcutaneous) 투여를 포함하는 비경구 투여용 용액, 및 경피 응용(transdermal application)을 위한 패치 상에 적용하기 위한 용액으로, 일반적이고, 통상적인 캐리어, 바인더, 희석액 및 부형제와 함께 만들어질 수 있다.

치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물(chemical compound)은 가공되지 않은(raw) 화합물의 형태로 투여될 수 있는 한편, 선택적으로, 생리학적 허용 가능한 염의 형태인 유효 성분(active ingredient)을, 하나 이상의 보조약(adjuvant), 부형제, 캐리어, 버퍼, 희석액, 및/또는 통상적인 약학 보조제(customary pharmaceutical auxiliaries)와 함께, 약학 조성물에 도입하는 것이 바람직하다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 또는 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 유도체가, 당해 기술 분야에서 알려지고 사용되는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 캐리어, 및, 선택적으로, 다른 치료 및/또는 예방 성분과 함께 포함되는 약학 조성물을 제공한다. 상기 캐리어(들)는 상기 제형의 다른 성분들과 공존할 수 있고, 이의 수용에 있어서 해롭지 않은 측면에서 "허용가능한(acceptable)" 것이어야 한다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 직장(rectal), 기관지(bronchial), 비강(nasal), 폐(pulmonal), 국부(구강(buccal) 및 혀 밑(sub-lingual)을 포함), 경피(transdermal), 질(vaginal) 또는 비경구(피부(cutaneous), 피하(subcutaneous), 근육 내(intramuscular), 복강 내(intraperitoneal), 정맥(intravenous), 동맥(ntraarterial), 대뇌 내tracerebral), 안구 내(intraocular) 주사 또는 투입을 포함) 투여에 적합하거나, 분말 및 액체 에어로졸 투여를 포함하는 흡입(inhalation) 또는 취입(insufflation)에 의해 투여되기 위하여 적합한 형태, 또는 지속적인 방출 시스템(sustained release system)에 의해 투여되기 위하여 적합한 형태일 수 있다. 지속적인 방출 시스템의 적절한 실시예는 본 발명의 화합물을 포함하는 고체 소수성 폴리머의 반투과 매트릭스(semipermeable matrice)를 포함하고, 상기 매트릭스는 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 성형체 형태일 수 있다.

본 발명의 화합물은, 통상적인 보조약, 캐리어, 또는 희석액과 함께, 결과적으로 약학 조성물 및 이의 단위 투여의 형태로 존재할 수 있다. 이러한 형태는 고형분(solid), 및 특정 정제(tablet), 채워진 캡슐, 분말 및 펠릿(pellet) 형태, 및 액체, 특히, 수용성 또는 비수용성 용액, 현탁액, 에멀젼, 엘릭시르제(elixir) 및 이로 채워진 캡슐을 포함하고, 이 모두는 경구용으로 사용되며, 비경구용으로 사용되는 직장 투여용 좌약, 및 무균 주사액(sterile injectable solution)을 포함한다. 상기 약학 조성물 및 이의 단위 투여 형태(unit dosage form)는 추가적인 유효 화합물 또는 성분(principle)을 수반하거나, 수반하지 않는 통상적인 성분을 통상적인 비율로 포함할 수 있고, 상기 단위 투여 제제는 사용되려고 계획된 하루 투여 범위(daily dosage range)에 비례하는, 임의의 적절한 효과량의 유효 성분을 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물은 다양한 경구 및 비경구 투여 형태로 투여될 수 있다. 하기 투여 형태가, 유효 성분에 따라, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다는 것은 당해 기술 분야의 기술자에게 자명할 것이다.

본 발명의 화합물로부터 약학 조성물을 조제함에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 캐리어는 고체 또는 액체일 수 있다. 고체 형태의 제제(preparation)는 분말, 정제, 환약(pill), 캡슐, 카셰(cachet), 좌약, 및 분산 입자를 포함한다. 고체 캐리어는 희석액, 착향료(flavoring agent), 가용화제(solubilizer), 윤활제(lubricant), 서스펜션화제(suspending agent), 바인더, 방부제(preservative), 정제 붕해제(tablet disintegrating agent), 또는 캡슐화제(encapsulating material)로 작용하는 하나 이상의 물질일 수 있다.

분말인 경우, 상기 캐리어는 미세하게 제분된 유효 성분을 수반한 혼합물 내에 있는, 미세하게 제분된(divided) 고체이다. 정제인 경우, 상기 유효 성분은 필요한 바인딩 역량을 가지는 상기 캐리어와 적절한 비율로 혼합되고, 바람직한 모양 및 크기로 압축된다.

상기 분말 및 정제는 바람직하게는, 5 또는 10에서 약 70 퍼센트까지 유효 화합물을 함유한다. 적절한 캐리어는 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 스테아레이트, 탈크(talc), 당(sugar), 락토오즈(lactose), 펙틴(pectin), 덱스트린(dextrin), 녹말(starch), 젤라틴(gelatin), 트래거캔스(tragacanth), 메틸셀룰로오즈(methylcellulose), 소듐 카복시메틸셀룰로오즈(sodium carboxymethylcellulose), 로우 멜팅 왁스(low melting wax), 코코아 버터 등이다. 상기 용어 "제제(preparation)"는 캐리어와 함께 또는 캐리어 없이, 결과적으로 이에 관련된 캐리어에 의해 둘러싸인 상기 유효 성분의 캡슐을 제공하는 캐리어로서 캡슐화 물질을 갖는 상기 유효 화합물의 제형(formulation)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 카셰(cachet) 및 캔디(lozenge)가 포함된다. 정제, 분말, 캡슐, 환약, 카셰, 및 캔디(lozenge)는 경구 투여에 적합한 고체 형태로 사용될 수 있다.

액체형 제제는 용액, 현탁액, 및 에멀젼, 예를 들어, 물 또는 수분 함유-프로필렌 글리콜 용액(water-propylene glycol solution)을 포함한다. 예를 들어, 비경구 주사 액체형 제제는 수용성 폴리에틸렌 글리콜 용액 내의 용액으로 제제화될 수 있다. 본 발명에 따른 화합물은 이와 같이 비경구 투여용(예를 들어, 주사에 의해, 예를 들어, 정맥 주사(bolus injection) 또는 연속 주사(continuous infusion))으로 제제화될 수 있고, 방부제(preservative)가 첨가된 단위 투여 형태의 앰플(ampoule), 사전-충진 주사(pre-filled syringe), 국소 주사(small volume infusion), 또는 다회-투여 컨테이너(multi-dose container)로 존재할 수 있다. 상기 조성물은 현탁액, 용액, 또는 유성(oily) 또는 수용성 부형약 내의 에멀젼으로써 상기 형태를 취할 수 있고, 서스펜션화제, 안정화제, 및/또는 분산제와 같은 제제화 용제(formulation agent)를 함유할 수 있다. 대안으로, 상기 유효 성분은 파우더 형태일 수 있고, 멸균성 고형분(sterile solid)의 무균성 분리(aseptic isolation) 또는 용액의 동결건조(lyophilization)에 의해서 얻어지며, 사용 전에 적절한 부형약, 예를 들어, 멸균 주사용 증류수(sterile, pyrogen-free water)와 함께 구성된다.

경구 용도로 적절한 수용성 용액은 상기 유효 성분을 물에 용해시키고, 적절한 착색제(colorant), 향미(flavor), 안정화제 및 농조화제(thickening agent)를 필요한만큼 추가함으로써 조제될 수 있다. 경구 용도로 적절한 수용성 현탁액은 미세하게 제분된 유효 성분을 점탄성 물질(viscous material), 예를 들어, 천연 또는 합성 껌, 수지(resin), 메틸셀룰로오즈(methylcellulose), 소듐 카복시메틸셀룰로오즈(sodium carboxymethylcellulose), 또는 다른 공지된 서스펜션화제와 함께 분산시킴으로써 만들어질 수 있다.

표피(epidermis)의 국소 투여를 위해서, 본 발명의 상기 화합물은 연고, 크림 또는 로션으로, 또는 경피성 패치(transdermal patch)로 제제화될 수 있다. 연고 및 크림은, 예를 들어, 수용성 또는 유성의 베이스에 적절한 농조화제 및/또는 겔제를 추가함으로써 제제화될 수 있다. 로션은 수용성 또는 유성의 베이스에 의해 제제화될 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 에멀젼화제(emulsifying agent), 안정화제, 분산제, 서스펜션화제, 농조화제, 또는 착색제(coloring agent)를 더 함유할 것이다.

구강 내의 국소 투여용으로 적합한 조성물은, 맛이 나는 베이스, 일반적으로 수크로오즈(sucrose) 및 아카시아 또는 트래거캔스 내에 활성화제(active agent)를 함유하는 캔디(lozenge); 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로오즈 및 아카시아와 같은 비활성 베이스 내에 상기 유효 성분을 함유하는 사탕형 알약(pastille); 및 적절한 액체형 캐리어 내에 상기 유효 성분을 함유하는 구강청결제를 포함한다.

용액 또는 현탁액은 통상적인 방법, 예를 들어, 점적기(dropper), 파이펫(pipette) 또는 스프레이에 의해 직접적으로 비강(nasal cavity)에 적용된다. 상기 조성물은 단일 또는 다중-투여 형태로 제공될 수 있다. 비강 내 투여용 조성물(intranasal composition)을 포함하고, 기도(respiratory tract)에 투여되기로 계획된 조성물에 있어서, 상기 화합물은 일반적으로 작은 입자 크기를 가지고, 예를 들어, 5 마이크론 이하 정도이다. 이러한 입자 크기는 당해 기술 분야에서 알려진 방법, 예를 들어, 미분화(micronization)에 의해 얻어질 수 있다.

상기 약학적 제제는 단위 투여 형태(unit dosage form)인 것이 바람직하다. 이러한 형태에 있어서, 상기 제제는 적절한 양의 상기 유효 성분을 함유하는 단위 투여량(unit dose)으로 세분된다. 상기 단위 투여 형태(unit dosage form)는 포장된 제제일 수 있고, 상기 포장은 포장된 정제(tablet), 캡슐, 및 바이알(vial) 또는 앰플(ampoule) 내의 파우더와 같이 분리된 양의 제제를 함유한다. 또한, 상기 단위 투여 형태는 캡슐, 정제, 카셰, 또는 캔디(lozenge) 그 자체일 수 있고, 혹은 이 중 임의의 것이 적절한 수로 포장된 형태일 수 있다.

경구 투여용으로는 정제, 캡슐 및 캔디(lozenge), 정맥 투여 및 연속 주사용으로는 액체가 바람직한 조성물이다. 비강 또는 기도에 적용하기 위해서는 용액 또는 현탁액이 바람직한 조성물이다. 표피의 국소 투여용으로는 경피성 패치가 바람직하다.

제제화(formulation) 및 투여에 대한 기술의 더 자세한 사항은 Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co., Easton, PA)의 최근 판에서 찾을 수 있다.

본 발명의 다른 태양에서는, 이를 필요로 하는 대상에 있어서, 불안을 치료, 예방, 또는 완화하는 방법이 제공되고, 상기 방법은, 인간 등 이를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 프티로스틸벤의 효과량을 투여하는 것을 포함한다.

치료 효과 투여량(therapeutically effective dose)은 증상 또는 상태를 개선하는 유효 성분의 양을 의미한다. 치료 효능 및 독성, 예를 들어, ED₅₀ 및 LD₅₀은 세포 배양 또는 실험 동물의 표준 약리 절차(standard pharmacological procedure)에 의해 결정된다. 치료 및 독성 효과 사이의 투여량의 비(ratio)가 치료 지수(therapeutic index)이고, LD₅₀/ ED₅₀의 비로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 약학 조성물이 바람직하다.

본 발명에 따라 사용되는 화합물의 투여량(dosage)은 상기 화합물 및 처리 조건에 따라 달라진다. 나이, 제지방 체중(lean body weight), 전체 중량, 체표면적(body surface area)과 치료받는 환자의 임상 조건; 및 치료를 수행하는 임상의(clinician) 또는 전문의(practitioner)의 경험 및 판단이 선택적인 투여에 영향을 주는 요소들 중에 있다. 다른 요소들로는 투여 경로, 환자의 치료 내역, 질병 진행과정(disease process)의 심각성, 및 특정 화합물의 효능이 포함된다. 투여량은 환자에게 허용가능하지 않은 독성을 생산하지 않으면서, 질병의 증상 또는 징후를 개선하기에 충분해야한다. 투여량은 바람직한 치료 효과를 발생시키기 위하여, 본 발명의 특정 상황에 따라 투여의 적정(titration)에 의해 달라질 수 있다.

동물 연구에서 인간 연구로 약물 투여량의 적절한 변환 (인간 등가 용량, HED)은 적합한 체표면적(BSA) 정규화 방법의 사용을 통하여 얻어진다. 동물 및 인간의 투여량 상호관계 (체표면의 제곱 미터 당 밀리그램에 기초함)는 Reagan-Shaw et al. (2007. FASEB J. 22: 659-661)에 기재되어 있다. BSA의 정규화(㎎/㎡)를 통하여 동물 투여량으로부터 인간 투여량으로 투여량을 변환하기 위한 공식은 하기와 같다:

HED (㎎/㎏) = 동물 투여량(㎎/㎏) × (동물 K_m/인간 K_m)

상기 식에서, K_m 인자는, 체중(㎏)을 BSA(㎡)로 나눈 것이고, 동물 연구에서 ㎎/㎏의 투여량을 ㎎/㎡로 변환하기 위해 사용된다. 쥐에 대한 K_m 인자는 3이고, 인간에 대한 K_m 인자는 37이다. 표(표 1, Reagan-Shaw et al., supra)에 FDA 가이드라인에 따른 데이터에 기초한 몇몇의 동물 종에 대해 계산된 K_m 인자가 열거되어 있다.

프티로스틸벤은, 이를 필요로 하는 대상에 있어서, 불안을 치료, 완화, 또는 예방하기에 충분한 양으로 상기 조성물 내에 존재한다. 가장 바람직한 구현예에서, 프티로스틸벤은 상기 조성물 내에, 그 자체로 불안을 치료, 완화, 또는 예방하기에 충분한 양으로 존재한다. 상기 유효 성분은 하루에 하나 또는 몇몇의 투여량으로 투여될 수 있다. 만족스러운 결과가, 특정 경우에, 0.0405 ㎎/㎏ p.o.의 인간 등가 용량(HED)만큼 낮은 투여량, 또는 60㎏의 인간 환자에 대해서 약 3㎎/day p.o.부터 60㎏ 인간 환자에 대해서 약 15㎎/day p.o.까지의 투여량에서, 얻어질 수 있다. 프티로스틸벤이 약 2 시간의 반감기(half-life)를 가지는 점을 고려할 때, 상기 인간 환자에 대한 적절한 범위는 약 10㎎/day p.o. 내지 약 100㎎/day p.o.이 될 수 있다.

인간 환자에 대한 적절한 하루 투여량 범위는 10~100㎎으로 고려되고, 일반적으로, 투여, 투여의 형태, 투여 방향에 따른 지시의 정확한 방식에 의존하며, 관련 대상 및 상기 관련 대상의 체중 및 체표면적, 및 나아가, 담당 의사(physician) 또는 수의사(veterinarian)의 기호 및 경험에 의존한다. 질병의 치료에 있어서 당해 기술 분야에서 알려진 화합물이 조합되어 투여되는 경우, 처방 투여량(dosing regimen)은 감소될 수 있다.

실시예

지금까지 본 발명을 일반적으로 기재하였지만, 동일 내용(the same)이 본 발명을 추가로 기재하기 위하여 명세서에 포함된 특정 구체적인 실시예를 참조로 하여, 더 잘 이해될 것이고, 실시예들이 청구항에 의해 정의되는 본 발병의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1

프티로스틸벤

프티로스틸벤은 전술된 바와 같이 합성되었다(Joseph et al ., supra). 간단히 말하면, 프티로스틸벤은 아세트산무수물(acetic anhydride) 및 트리에틸아민 내에서, 3,5-디메톡시벤즈알데히드(3,5-dimethoxybenzaldehyde) 및 4-히드록시페닐아세틱 엑시드(4-hydroxyphenylacetic acid)의 축합에 의해 합성되었다.

상기 반응 혼합물이 질소 분위기 하에서 가열(150℃)되었고, 이어서 교반되었다. 20 시간 후에, 상기 반응이 중지되었고, 실온으로 냉각되었으며, 응축된 염산(hydrochloric acid)(5 ㎖)이 첨가되었다. 침전물이 형성되었고, 이를 클로로폼 50 ㎖에 용해시키고, 이어서 10%의 수산화 나트륨 수용액으로 추출하였다. 상기 수용성 추출물이 응축된 염산에 의해 pH 1로 산화되었고, 적어도 6시간 동안 교반되어, 중간체 침전물인 α-[(3,5-디메톡시페닐)메틸렌]-4-히드록시-(αZ)-벤젠아세틱 엑시드(α-[(3,5-dimethoxyphenyl)methylene]-4-hydroxy-(αZ)-benzeneacetic acid)를 결과로 나타내었다. 상기 중간체가 1.0 g의 구리와 함께 10 ㎖의 퀴놀린에서 가열(200℃, 6시간, 질소 하에서)되었다. 상기 반응 혼합물은 실온으로 냉각되었고, 여과되었다. 상기 여과를 위하여, 5N 염산(25 ㎖)이 첨가되었고, 1 시간 동안 교반되고, 이어서 크로로폼으로 추출되었다. 불순물이 섞인 프티로스틸벤을 포함하는 상기 클로로폼 추출물이, 실리카 겔 컬럼(silica gel column)과 에틸아세테이트: 헥세인 용매 시스템(15:85에서 100% 에틸아세테이트까지 선형 분석(linear gradient))을 사용하는 수평 HPFC 시스템(Horizon HPFC system) 상에서, 플래시 크로마토그래피(Biotage, Inc., Charlottesville, VA)에 의해 정제되었다. 순수한 프티로스틸벤을 포함하는 분류물(fraction)이 진공 내에 모여서 응축되었다. 프티로스틸벤이 헥세인 내에서 재결정화되었고, 그 구조가 분광학적 데이터(UV, 질량 분석법, 및 핵자기공명 분석법)로부터 확인되었다(도 1).

프리로스틸벤이 1 내지 10 ㎎/㎏ 체중의 투여량에 있어서, 크레모퍼(cremophor), 에탄올, 및 식염수(saline)(1:1:18)의 혼합물에 용해되었다. 10 ㎖/㎏의 부피가 상기 행동기능검사(behavioral test) 1시간 전에 투여되었다.

실시예 2

쥐의 십자형 높은-미로 행동 연구에 있어서 프티로스틸벤의 효과

실험하는 시기에 24~30 gm의 무게이고, 18주 나이의 수컷 스위스 웹스터 쥐(Harlan, IN, USA)가 모든 연구에 사용되었다. 동물들은 5 개의 그룹으로 양육되었고, 음식과 물을 자유식(ad libitum)으로 제공하였으며, 12:12 시간의 낮:밤 사이클 하에 놓여졌다. 모든 쥐는 각각의 처리 그룹에서 임의로 선택되었다. 양육, 관리 및 실험절차는 미시시피 대학의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)에 의해 승인되었고, 실험 동물의 관리 및 사용을 위한 건강 가이드 국립 연구소(National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals)의 규정에 따랐다.

상기 십자형 높은-미로(EPM) 연구에 있어서, 상기 EPM 장치는 공통의 중앙 플랫폼(5 × 5 ㎝)으로부터 확장된 두 개의 열린 가지(30 × 5 ㎝) 및 두 개의 닫힌 가지(5 × 30 ㎝, 벽은 15 ㎝ 높이)로 구성되었다. 상기 구조는 대응되는 가지가 서로 마주보도록 배열된 더하기-기호(plus-sign)의 모양으로 형성되었다. 상기 장치는 지면(floor level) 위로 50 ㎝ 올라와 있다.

동물들(n = 6~10/그룹)은, 프티로스틸벤 또는 디아제팜 처리 전에, 30분 동안 상기 EPM 공간 내에서 적응하였다. 프티로스틸벤이 경구로 주입되는 반면, 디아제팜은 복강 내로 투여(i.p.)되었다. 프티로스틸벤 또는 디아제팜을 각각 경구 섭식(oral gavage) 및 i.p.으로 투여한 후에, 상기 EPM 평가(EPM trial)에 앞서 쥐를 동일한 공간에 각각, 60분 및 30분 동안 머물도록 하였다. 그 후에, 쥐를 개별적으로 상기 장치의 열린 가지와 맞닿는 중앙부에 위치시키고, 5분 동안 자유롭게 탐사하도록 한다. 열린 가지 내의 이동 거리(TDOA), 닫힌 가지 내의 이동 거리(PTEA), 열린 가지 내의 머문 시간(PTOA), 닫힌 가지 내의 머문 시간(PTEA), 열린 가지 내의 개체수(NEOA), 및 닫힌 가지 내의 개체수(NEEA)가 측정되었다; 즉, 열린 및 닫힌 가지 모두의 이동 거리와 머문 시간, 및 열린- 및 닫힌-가지의 개체 수의 백분율이 컴퓨터-지원 비디오 추적 시스템을 사용하여 정량화되었다(San Diego Instruments, CA, USA). 상기 미로는 각 실험 후에, 유리청결제(glass cleaner)로 깨끗하게 닦여지고, 건조되었다. 가지 입구는 쥐의 4개의 발 모두가 상기 가지 내에 있을 때 기록되었다. 상기 열린 가지 내의 소비 시간의 백분율 및 상기 열린 가지의 개체 수가 중요한 결정 요인이자, 순수한 불안의 측정으로 고려된다(Hogg, supra).

여기에서, 최초로, 프티로스틸벤(도 1)이 EPM 내에서 투여-의존성(dose-dependently) 항불안-유사 작용을 나타내는 것을 보여준다. 상기 항불안 작용은 상기 화합물의 1㎎/㎏의 투여량에서 명확하게 나타났고, 2㎎/㎏에서 최대치에 도달했으며, 이어서 5, 및 10㎎/㎏ 투여량에서 감소했다. 대조군(0㎎/㎏)과 비교했을 때, 프티로스틸벤은 항불안-유사 효과와 관련된 모든 파라미터에 있어서 현저하게 증가되었다: % 열린 가지 내의 이동거리(TDOA) [F(4,43) = 3.056, p ＜ 0.05], % 열린 가지 내의 머문 시간 (PTOA) [F(4,43) = 2.657, p ＜ 0.05], 및 열린 가지 내의 개체수(NEOA) [F(4,43) = 4.257, p ＜ 0.01](도 2A). 또한, 프티로스틸벤은, % 닫힌 가지 내의 이동거리(TDEA), % 닫힌 가지 내의 머문 시간(PTEA), 및 닫힌 가지 내의 개체수(NEEA)와 같은 불안에 관련된 닫힌 가지의 파라미터에 있어서, 감소하는 경향을 나타내었다(도 2B). 이와 같이, 최대의 항불안 작용이 2㎎/㎏의 투여량에 의해 얻어졌다. 가장 높은 10㎎/㎏의 투여량은 효과가 없었다.

통상적으로, 가지의 입구 및 출구는 동물이 가지의 문턱을 건넜을 때, 기록된다(Hogg, supra). 본 실험에 있어서, 가지 입구는 쥐의 모든 4 발이 가지 내에 있을 때, 기록되었다. 그러므로, 쥐가 상기 미로의 열린 또는 닫힌 영역이 아닌 중앙의 사각 지대에 있는 것이 가능하다. 본 기록에 있어서, 우리는 상기 중앙의 영역을 상기 열린 및 닫힌 가지와는 구분되는 것으로 취급했고, 이로써 더욱 정교하고, 순수한 항불안 효과의 결과를 산출하였다.

실시예 3

쥐의 자발적 운동 활성(Spontaneous Motor Activity) 행동 연구에 있어서 프티로스틸벤의 효과

자발적 운동 활성을 측정하기 위하여, 성체 스위스 웹스터 쥐 (n = 8-10/그룹)에게, 경구 섭식(oral gavage)에 의해 프티로스틸벤을 투여하였다. 이어서, 각 쥐는 일반 운동 챔버(locomotor chamber)에 놓여지고, 플렉시 유리공간(Plexiglas enclosure) 내에서 30분 동안 적응하였다. 30분의 적응 기간 이후에, 일반 운동 활성(locomotor activity)이 자동활성관측시스템(automated activity monitoring system)을 사용하여, 30분 동안 측정되었다(San Diego Instruments, CA, USA). 총 활성은 챔버 당 16 셀 포토빔(16 cell photobeam) 중단의 총 횟수로 나타났다.

자발적인 운동 활성의 효과를 설명하기 위하여, 우리는 프티로스틸벤을 1 내지 10 ㎎/㎏ 범위의 투여량으로 처리한 후에, 동물의 상기 일반 운동 활성을 측정하였다(도 3). 일원배치분산분석(one-way ANOVA)이 일반 운동 활성에 있어서, 약물 처리의 현저한 효과가 없음을 나타내었다. 사후 비교(Post hoc comparison)는 자발적 운동 활성이 상기 최대치의 항불안 프티로스틸벤 투여량에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여주었다. 가장 높은 투여량도 동물의 일반 운동 활성에 대하여 어떠한 효과로 갖지 않았다.

실시예 4

웨스턴 블롯 분석: 혈액 및 조직

상기 EPM 실험 후에, 혈액 샘플이 각 쥐로부터, 하악 정맥 천자(submandibular vein puncture)에 의해, 헤파린 첨가혈(heparinized blood) 수집 바이알에 채취되었다. 쥐는 이후, 희생되었고 뇌가 빠르게 제거되었다. 이들의 전두엽 피질(PFC) 및 해마가 해부되어 얼음에 꺼내졌고, 즉시 액체 질소에 의해 얼려져, 추가 절차 전까지 -80℃에 저장되었다. 혈액 샘플은 상청액(supernatant)인 혈장(plasma)을 얻기 위하여, 2000 rpm으로 4℃에서, 20분 동안 원심 분리되었다. 상기 혈장 샘플은 사용되기까지 -80℃에서 저장되었다.

쥐의 뇌의 해마의 웨스턴 블롯 분석은 전술된 바(Al Rahim et al. 2009. Biochemistry 48:7713-7721)와 같이, 최소의 개질(minor modification)에 의해 수행되었다. 간략하게는, 얼린 해마가 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼(homogenization buffer)[50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 0.5 mM DTT, 및 버퍼의 ㎖ 당 10 ㎕의 Halt Protease & Phosphates Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific, IL, USA)]에 의해 균질화되었다. 상기 균질화물이 12,000g, 4℃에서 10분 동안 원심분리되었다. 상청액이 수집되었고, 샘플 버퍼로 보충하여, 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 이와 같이 준비된 샘플이 웨스턴 블롯 실험을 위해 준비되었다. 단백질의 균등한 양(30 ㎍)이 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(12%의 겔)에 주입되었고, 블롯된 막(membrane)이 실온에서, 1시간 동안, 탈지 우유 5%를 함유하는 TBST 버퍼에 의해 차단되었다. 상기 막은 항-인산화-ERK(Thr 202/Tyr 204, Cell Signaling Technologies, USA) 항체와 함께 배양되었다. 다른 겔이 동일한 샘플과 함께 작동되었고, 막이 항-베타-엑틴 항체(Cell signaling Technologies, USA)와 함께 배양되었다. 해마에서의 인산화-Akt의 발현 농도는 항-인산화-Akt(Ser 473, Cell signaling Technologies, USA) 항체를 사용하여 확인되었고, 뒤이어 항-β-엑틴 항체(Cell signaling Technologies, USA)에 의해 재-프로브(re-probing)되었다. 결합된 항체가 겨자무과산화효소-연결 항-토끼 항체(horseradish peroxidase-linked anti-rabbit antibody)(Cell Signaling Technologies, USA)로 발견되었고, 벌사독 이미지 시스템(VersaDoc imaging system)(Bio-Rad, USA)을 사용하여 현상되었다. 관련 면역반응성 밴드(relevant immunoreactive band)가 Quantity One 1-D 분석 소프트웨어 (Bio-Rad, USA)를 사용하여 정량화되었다. ERK 활성화를 측정하기 위하여, 인산화-ERK 농도가 β-엑틴의 농도에 대하여 정규화되었다.

pERK의 농도는 불안한 동안에 현저히 증가하고, ERK 신호 변환 경로의 억제가 항불안증세(anxiolysis)를 발생시키는 역할을 할 수 있다는 점(Ailing et al., 2008)을 고려하여, 이후의, 해마의 세포분쇄액(homogenate) 내의 ERK1/2의 인산화 상태를 확인하였다. 웨스턴 블롯 분석은 1 및 2 ㎎/㎏의 프티로스틸벤이 처리된 쥐의 해마 세포분쇄액 내의 ERK1 [F(4,15) = 12.49, p < 0.001] 및 ERK2 [F(4,15) = 3.024, p < 0.05] 모두의 인산화에 있어서, 감소를 나타냈다(도 4, A 및 B). EPM 에서 어떠한 항불안-유사 효과도 나타내지 않았던 5 및 10 ㎎/㎏ 투여량은 ERK의 인산화에 있어서 어떠한 현저한 효과도 나타내지 않았다. 상기 감소가 ERK1 인산화에 있어서, ERK2의 인산화보다 더 더욱 많이 나타난다는 점이, 또한 주목할 가치가 있다. 프티로스틸벤으로 처리된 쥐의 전두엽 피질에서는 ERKs의 인산화에 어떠한 변화도 없었다(데이터에 나타나지 않음).

이러한 효과가, 프티로스틸벤의 중추 작용에 의해 다른 키나아제의 인산화 상태가 무차별적으로 감소한 결과인 것인지 확인하기 위하여, 해마 내의 인산화된 Akt 농도를 측정하였다. ERKs 인산화의 감소가 나타난 것과는 대조적으로, 상기 화합물이 1 내지 10㎎/㎏ 처리된 쥐의 해마에서, Akt의 인산화 상태는 거의 변하지 않는 것이 발견되었다(도 5).

실시예 5

기체 크로마토그래피-질량분석법(Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS)에 의한, 혈장, 해마 및 PFC 내의 프티로스틸벤의 분석

혈장은 -80℃로 유지되었고, 추출(extraction)에 앞서 얼음 상에서 해동되었다. 혈장은 임의의 글루쿠로니드화된 프티로스틸벤(glucuronidated pterostilbene)을 가수분해 하기 위하여, β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)로 처리되었고, 이어서 공지된 절차(Remsberg et al., supra)를 따랐다. 간단하게는, 50 ㎕의 혈장(각 동물로부터의)이 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)로 옮겨지고, 60 ㎕의 β-글루쿠로니다아제 용액(5000 U/㎖ 인산칼륨 버퍼, 75 mM, pH 6.8, 37℃)이 첨가되었다. 상기 혼합물이 볼텍스-믹스(vortex-mix)되었고, 이어서 37℃에서 750 rpm으로 20 시간 동안 흔들면서 배양되었다. 그 후에, 얼음처럼 차가운 HPLC 등급 아세도니트릴이 첨가되었고, 볼텍스-믹스되었고, 5000 rpm으로, 4℃에서 5분 동안 원심분리되었다. 상청액이 수집되고, 질소 기류 하에서 건조되었다. 상기 건조된 상청액이 GC-MS 분석에 사용되었다.

해마의 조직이 추출 시기 전까지 -80℃에서 유지되었다. 2~3마리 동물들로부터의 해마(왼쪽 및 오른쪽)가 엔펜도르프 튜브에 합쳐지고, 하나의 샘플로서 진행되었다. 상기 튜브에 200㎕의 포스페이트 버퍼(0.2 M NaH₂PO₄: 0.2M NaH₂PO₄)가 첨가되었고, 상기 조직이 2분 동안 수동으로 균질화되었다. 100㎕의 부분 표본(aliquot)에, 50㎕의 β-글루쿠로니다아제(5000 U/㎖ 인산칼륨 버퍼)가 첨가되었다. 상기 혼합물이 볼텍스-믹스되었고, 흔들면서(750 rpm) 배양(37℃, 20시간)되었다. 상기 샘플은, 이어서 원심분리(15분, 7000g, 4℃)되었다. 상청액이 수집되고, 에틸 아세테이트(200 ㎕, 두 번)로 분리되었다. 상기 에틸 아세테이트 층이 합쳐지고, 질소 기류 하에서 건조되며, GC-MS 분석에 사용되었다. 전두엽 피질(PFC)의 추출이 해마와 같은 방법으로 수행되었다; 3 마리 동물로부터의 PFC 조직이 합쳐지고, 하나의 샘플로 처리되었다.

상기 질소-건조된 샘플(혈장 및 뇌 조직 추출물)은 N,O-비스[트리메틸실릴]트리플루오로아세트아미드(N,O-bis[trimethylsilyl]trifluoroacetamide) 및 디메틸포름아미드(dimethylformamide)의 1:1 혼합물 30㎕로 처리되었고(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) , 70℃에서 40분 동안 가열되었다. 상기 변 형된 샘플이, J&W DB-5 불꽃이온화검출기(capillary column)(0.25㎜ 내부 직경, 0.25㎛ 필름 두께, 및 30m 길이; Agilent Technologies, Foster City, CA)가 장착된 JEOL GCMate II 장치(JEOL USA Inc., Peabody, MA)를 사용하여, 프티로스틸벤의 농도에 관해 분석되었다. 상기 GC 온도 프로그램은: 초기 190℃이었고, 20℃/분의 속도로 240℃까지 증가되었고, 2.5℃/분의 속도로 280℃까지 증가되었고, 이어서 마지막으로 30℃/분의 속도로 300℃까지 증가되었으며, 0.5분 동안 이 온도를 유지하였다. 캐리어 기체는 1㎖/분의 속도로 흐르는 초고순도의 헬륨이었다. 주입구(injection port), GC-MS의 인터페이스, 및 이온화 챔버는 각각 250, 230, 및 230℃로 유지되었다. 주입 부피는 2㎕ (비분할 주입)이었다. 상기 질량 분석은 양성의, 선택된 이온 관측 모드(m/z 328, 313, 및 297)에서 얻어졌고; 전자 충격은 70 eV였다. GC-MS 분석도 동일하였다. 프티로스틸벤의 지속 시간은 10.2분이었다. 프티로스틸벤의 정량화는 사전에 구조 및 순도가 특정된 프티로스틸벤의 합성 샘플의 외부 표준을 사용하여 이루어졌다.

상기 혈장의 프티로스틸벤 농도는 1㎎/㎏의 투여량에서 10.08±6.67 ng/㎖로 밝혀졌고, 투여량에 대응하여 10㎎/㎏의 투여량에서는 130.26±40.25로 증가되었다(표 1). 상기 해마 조직의 프티로스틸벤 농도는 1㎎/㎏의 투여량에서 감지가능하였으나, 정량화의 한계(0.0840 ng)보다 낮았다. 2, 5, 및 10㎎/㎏의 투여량에서는, 농도가 정량화 가능하였고, 0.2627 - 1.1217 ng/해마의 범위였다(표 2). 모든 투여량에 대하여, 전두엽 피질의 조직에서는 오직 미량의 프티로스틸벤(정량화 불가능한)이 발견되었다.

표 1. 혈장의 프티로스틸벤의 농도

표 2. 해마의 프티로스틸벤의 농도

^a1㎎/㎏의 투여량에서, 프티로스틸벤 농도는 정량화의 한계보다 낮음(0.0840 ng).

^b샘플은 2-3 마리 동물의 해마 조직이 합쳐져 구성됨.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별적인 간행물 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참조로써 통합되도록 지시된 바와 같이 본 명세서에서 참조로써 통합된다.

전술한 상세한 설명은 단지 예시의 방법으로 기재되었고, 이의 변형 및 수정이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.

Claims

프티로스틸벤의 치료적으로 효과적인 양(therapeutically effective amount)을 포함하며,
이때 치료적 항불안 효과는 프티로스틸벤의 상기 치료적으로 효과적인 양의 단일 투여 후 발생하고, 그리고 상기 치료적 항불안 효과는 양성 항불안 대조군인 디아제팜의 치료적 항불안 효과에 비교할 만하고, 진정제 부작용들에서 상당히 자유로운, 그것을 필요로 하는 대상에게서 불안의 치료, 완화, 또는 예방을 위한, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 대상이 재난 사건(catastrophic event), 환경의 변화, 또는 여정(travel)과 같은 상태에 기인한 불안(anxiety)으로부터 고통받는 포유류인
약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 대상이 수면 장애, 비만 또는 우울증과 같은 상태에 기인한 불안으로부터 고통받는 인간인
약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 대상이 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅 톤 무도병, 당뇨, 암과 같은 질병의 부작용인 불안으로부터 고통받는 인간인
약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 양(amount)은 상기 포유류의 체중(body weight) 및 체표면적(body surface area)에 기반한 총량인
약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 양(amount)은 총량이 10 ㎎/day 내지 100 ㎎/day인
약학적 조성물.
삭제
삭제
제1항에 따른 프티로스틸벤의 효과적인 양(effective amount)을 함유하는 조성물; 및 상기 조성물을 포함하는 컨테이너(container)를 포함하여, 불안을 치료, 완화, 또는 예방하기 위한 키트(kit).
프티로스틸벤의 치료적으로 효과적인 양(therapeutically effective amount)을 포함하며,
이때 치료적 항불안 효과는 프티로스틸벤의 상기 치료적으로 효과적인 양의 단일 투여 후 발생하고, 그리고 상기 치료적 항불안 효과는 양성 항불안 대조군인 디아제팜의 치료적 항불안 효과에 비교할 만하고, 진정제 부작용들에서 상당히 자유로운, 그것을 필요로 하는 대상에게서 불안의 완화, 또는 예방을 위한, 기능식품의(nutraceutical) 조성물.
제10항에 있어서,
상기 대상이 재난 사건(catastrophic event), 환경의 변화, 또는 여정(travel)과 같은 상태에 기인한 불안(anxiety)으로부터 고통받는 포유류인
기능식품의 조성물.
제10항에 있어서,
상기 대상이 수면 장애, 비만 또는 우울증과 같은 상태에 기인한 불안으로부터 고통받는 인간인
기능식품의 조성물.
제10항에 있어서,
상기 대상이 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅 톤 무도병, 당뇨, 암과 같은 질병의 부작용인 불안으로부터 고통받는 인간인
기능식품의 조성물.
제10항에 있어서,
상기 양(amount)은 상기 포유류의 체중(body weight) 및 체표면적(body surface area)에 기반한 총량인
기능식품의 조성물.
제14항에 있어서,
상기 양(amount)은 총량이 10 ㎎/day 내지 100 ㎎/day인
기능식품의 조성물.
제10항에 있어서,
상기 기능식품의 조성물은 음식(food) 또는 음료(beverage), 또는 음식 또는 음료의 보충 조성물(supplement composition)인
기능식품의 조성물.
제16항에 있어서,
상기 양(amount)이 10 ㎎/day 내지 100 ㎎/day으로 존재하는
기능식품의 조성물.