JP6027607B2

JP6027607B2 - プテロスチルベンの抗不安効果

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Description

本発明は、ブドウ類および一部のスノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）ベリー類にみられるレスベラトロールの類似体であるプテロスチルベンを治療有効量含む医薬組成物を投与することにより不安を治療、軽減または予防する方法に関する。

関連技術の説明
不安障害は社会環境や一次および二次医療でよくみられ、慢性の臨床状態に至る場合が多い（Ｎｕｔｔら，２００２．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３１５−３２５）。不安障害は精神障害のうちで最もよくみられる種類の障害であり、その発症率は１８．１％、生涯有病率は２８．８％である（Ｋｅｓｓｌｅｒら，２００５．Ａｒｃｈ．Ｇｅｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ６２：６１７−６２７；Ｏｈａｙｏｎ，Ｍ．Ｍ．２００６．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．Ｒｅｓ．４０：４７５−４７６）。抗不安薬は数千年にわたりヒトによって使用されてきている。ベンゾジアゼピン群の薬物は即効性で効果が高く、最もよく処方される抗不安薬である（Ｂａｎｄｅｌｏｗら，２００８．ＷｏｒｌｄＪ．Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ９：２４８−３１２；Ｂａｌｄｗｉｎら，２００５．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９：５６７−５９６；ＲｕｄｏｌｐｈおよびＭｏｈｌｅｒ．２００６．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６：１８−２３）。しかし長期間使用すると、鎮静、耐性の発現、乱用傾向および離脱症状などの副作用を連想されている（Ｎｕｔｔら，上記；Ｂａｎｄｅｌｏｗら，上記；Ｂａｌｄｗｉｎら，上記）。現在、ほとんどの不安障害には一次治療として選択的セロトニン再取り込み阻害物質群の抗うつ薬が使用されている。しかし、このグループにも欠点がある。特に治療効果の発現に時間がかかるため、抗不安効果がみられるまで数週間の治療が必要となる（Ｎｕｔｔら，上記；Ｂａｎｄｅｌｏｗら，上記；Ｂａｌｄｗｉｎら，上記）。したがって、治療効果が迅速に発現し有害作用のない抗不安化合物が依然必要とされている。

これまで多数の天然化合物から有用な薬理学的手段（Ｆｕｒｕｋａｗａら，１９９３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２６０２６−２６０３１）のほか創薬のための潜在的な治療薬リード（Ｌｉｕ，Ｊ．１９９３．ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１４：１８２−１８８）が得られている。スチルベンはα，β−ジフェニルエチレンコア構造を有する植物性化学物質のグループである。ブドウ類、ピーナッツ類およびスノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）ベリー類を含めた類縁関係のない多数の属の植物でスチルベンが報告されている（Ｃｈｏｎｇら，２００９．ＰｌａｎｔＳｃｉ．１７７：１４３−１５５）。レスベラトロールは広く研究されているスチルベンであり、数多くの生体系で抗酸化作用、抗炎症作用、化学予防作用および抗老化作用を示すことが報告されている（Ａｇｇａｒｗａｌら，２００４．ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ．２４：２７８３−２８４０；ＢａｕｒおよびＳｉｎｃｌａｉｒ．２００６．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏ．５：４９３−５０６；Ｂｉｓｈａｙｅｅ，Ａ．２００９．ＣａｎｃｅｒＰｒｅｖ．Ｒｅｓ．２：４０９−４１８）。最近、ブルーベリーやディアベリーなどの一部のスノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）ベリー類にみられる天然のレスベラトロール類似体プテロスチルベン（Ｒｉｍａｎｄｏら，２００４．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．５２：４７１３−４７１９）が、レスベラトロールにみられるような様々な作用があるとして大いに注目を集めている。プテロスチルベンには鎮痛性、抗糖尿病性、抗酸化性、抗炎症性、脂質低下性および癌化学予防性がある（ＡｍａｒｎａｔｈＳａｔｅｅｓｈおよびＰａｒｉ，２００６．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８：１４８３−１４９０；Ｒｅｍｓｂｅｒｇら，２００８．ＰｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙＲｅｓ．２２：１６９−１７９；Ｒｉｍａｎｄｏら，２００２．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．５０：３４５３−３４５７；Ｒｉｍａｎｄｏら，２００５．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．５３：３４０３−３４０７）。プテロスチルベンはほかにも、結腸癌の発現（Ｐａｕｌら，２００９．ＣａｎｃｅｒＰｒｅｖ．Ｒｅｓ．２：６５０−６５７）、浸潤および転移（Ｐａｎら，２００９．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ３０：１２３４−１２４２）に対して、また高齢ラットの認知障害の改善（Ｊｏｓｅｐｈら，２００８．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．５６：１０５４４−１０５５１）において、有意な効果を示す。しかし、プテロスチルベンの抗不安性は未だ検討されていない。

スチルベンを含めた多くの天然化合物が、異なるシグナル伝達経路に関与する誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）およびｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）などのタンパク質キナーゼと相互作用する（Ｐａｕｌら，２００９，上記）。ＭＡＰＫファミリーのメンバーであり、細胞外シグナルにより調節されるキナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）は、ニューロンを含めた多くの細胞型の転写調節に重要な役割を果たすことが明らかにされている（ＨｅｔｍａｎおよびＧｏｚｄｚ，２００４．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：２０５０−２０５５）。ＥＲＫシグナル伝達経路がストレスへの曝露（Ｇｅｒｒｉｔｓら，２００６．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１４２：１２９３−１３０２）を含めた様々な刺激下で活性化される（Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｊ．１９９３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４５５３−１４５５６；ＨｅｔｍａｎａｎｄＧｏｚｄｚ，ｓｕｐｒａ）ことを示す証拠が集まりつつある。さらに、海馬および外側扁桃体のＥＲＫシグナル伝達経路が不安に何らかの役割を果たすと考えられている（Ｐａｕｌら，２００７．Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ６１：１０４９−１０６１；Ｔｒｏｎｓｏｎら，２００７．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．ｌ３３：１５７０−１５８３）。この考えは、不安時にリン酸化ＥＲＫの濃度が有意に上昇したという知見によって一層強固なものとなる。したがって、ＥＲＫシグナル伝達経路が不安において重要な役割を果たしている可能性が考えられ、それを阻害すれば抗不安効果が得られる可能性がある（Ａｉｌｉｎｇら，２００８．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．Ｒｅｓ．４３：５５−６３）。

そこで、不安におけるシグナル伝達経路の役割と、不安の治療に使用できる薬剤の必要性とを考慮し、不安の阻害剤としてのプテロスチルベンの効果を明らかにすることを本研究の目的とした。

本発明者らは、不安の阻害剤としてのプテロスチルベンの特性を検討し、プテロスチルベンが抗不安剤として使用可能であることを明らかにした。

この発見に基づき、本発明の１つの目的は、治療有効量のプテロスチルベン、その薬学的に許容される塩またはその異性体を投与することにより、必要とする対象の不安を治療、軽減または予防する方法を提供することである。

このほか本発明の一部は、プテロスチルベンを含有する医薬組成物を含むキットおよびその使用のための指示である。

以下の記載から本発明の他の目的および利点が容易にわかるであろう。

プテロスチルベンの化学構造を示す図である。高架式十字迷路（ＥＰＭ）試験での行動に対するプテロスチルベン経口投与の効果を示す図である。ＥＰＭで５分間試験を実施する６０分前、雄性ＳｗｉｓｓＷｅｂｓｔｅｒマウスに溶媒を注射によりまたはプテロスチルベン（１〜１０ｍｇ／ｋｇ）を強制経口投与により投与した。開放アーム（図２Ａ）および閉鎖アーム（図２Ｂ）（それぞれＯＡおよびＥＡ）での移動距離の百分率および滞在時間の百分率ならびに各アームへの侵入回数を測定した。各カラムは平均±ＳＥＭを表す。１つの用量当たりｎ＝６〜１０。溶媒対照との比較で^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１（一元配置ＡＮＯＶＡの後にＤｕｎｎｅｔｔ検定）。高架式十字迷路試験での行動に対するジアゼパム腹腔内（ｉ．ｐ）投与の効果を示す図である。ＥＰＭで５分間試験を実施する３０分前、雄性ＳｗｉｓｓＷｅｂｓｔｅｒマウスに溶媒またはジアゼパム（０．５〜２ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．投与した。開放アーム（図３Ａ）および閉鎖アーム（図２Ｂ）（それぞれＯＡおよびＥＡ）での移動距離の百分率および滞在時間の百分率ならびに各アームへの侵入回数を測定した。各カラムは平均±ＳＥＭを表す。１つの用量当たりｎ＝６〜１０。溶媒対照との比較で^**ｐ＜０．０１（一元配置ＡＮＯＶＡの後にＤｕｎｎｅｔｔ検定）。マウス自発運動量に対するプテロスチルベン経口投与の効果を示す図である。高架式十字迷路で５分間試験を実施する６０分前、雄性ＳｗｉｓｓＷｅｂｓｔｅｒマウスに溶媒を注射によりまたはプテロスチルベン（１〜１０ｍｇ／ｋｇ）を強制経口投与により投与した。１チャンバ当たりの遮断の総数で自発運動量を評価した。各カラムは平均±ＳＥＭを表す。１つの用量当たりｎ＝８〜１０。海馬のＥＲＫ１／２リン酸化に対するプテロスチルベン経口投与の効果を示す図である。図５Ａは、ＥＰＭ試験直後に屠殺したマウスのリン酸化ＥＲＫ１／２濃度に関する代表的なデータを示す。図５Ｂは、訓練直後に屠殺したマウスのＥＲＫ１／２リン酸化の変化に関する濃度測定分析の結果を示す。数値は少なくとも３個体の平均±ＳＥＭとして表されている。溶媒対照との比較で^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１（一元配置ＡＮＯＶＡの後にＤｕｎｎｅｔｔ検定）。海馬のＡｋｔリン酸化に対するプテロスチルベン経口投与の効果を示す図である。高架式十字迷路試験直後に屠殺したマウスのリン酸化ＥＲＫ１／２濃度に関する代表的なデータである。リン酸化Ａｋｔに特異的な抗体（Ｓｅｒ４７３）で検出を実施した後、抗β−アクチン抗体でブロットの再検出を実施した。

発明の詳細な説明
レスベラトロールと同様に、プテロスチルベンには数多くの薬理活性がある。本発明者らによる本研究は、プテロスチルベンに関して報告されている一連の健康上有益な特性を加えるものであり、ここで本発明者らは、プテロスチルベンの抗不安効果を初めて明らかにする。本研究では、典型的な不安の動物モデル、すなわち不安寛解評価の行動モデルである高架式十字迷路（ＥＰＭ）によりプテロスチルベンの抗不安薬様効果を検討した。ＥＰＭ試験は、新規な抗不安薬を評価するのに最も広く有効性が認められている試験の１つであると考えられている（Ｐｅｌｌｏｗら，１９８５．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１４：１４９−１６７；Ｈｏｇｇ，Ｓ．１９９６．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．５４：２１−３０）。本研究では、最もよく用いられる抗不安化合物であるジアゼパムを陽性対照として用いた。ＥＰＭは、げっ歯類が新奇環境を探索する意欲と高く開けた場所に対する不安との間で葛藤を示すことを考慮したものであり、多くの研究者に採用され、広く用いられている不安のモデルである（Ｐｅｌｌｏｗら，上記；Ｈｏｇｇ，上記）。高架式十字迷路モデルにおける通常のげっ歯類の探索行動は迷路の閉鎖アームの方を好んで選択するものであり、不安を誘発する開放アームを嫌悪することがＥＰＭモデルの基礎であると提唱されている（Ｐｅｌｌｏｗら，上記；Ｏｈｌ，Ｆ．２００３．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｒｕｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３：２３３−２３８）。抗不安化合物の投与により開放アームに対する自然な嫌悪が減少し、開放アームの探索が促進されるという証拠が数多く得られている（Ｐｅｌｌｏｗら，上記；Ｈｏｇｇ，上記）。

本発明者らの研究ではほかにも、化合物をマウスに経口投与した後の血漿および組織中のプテロスチルベン濃度を決定した。血清中のプテロスチルベン濃度が用量とともに上昇し、それに対応して海馬のプテロスチルベン濃度の上昇が観察された（実験５を参照）。さらにタンパク質キナーゼ調節に対する効果を検討し、プテロスチルベン作用の基礎となる機序を明らかにすることを目的として、マウス海馬のリン酸化ＥＲＫ１／２の変化を測定した。

プテロスチルベンは１ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇの用量で不安寛解作用を示した。すなわち、重要な決定因子であり、不安と相関があると考えられる開放アームでの滞在時間（ＰＴＯＡ）のパーセントおよび開放アームへの侵入回数（ＮＥＯＡ）が、定められた低用量において増加した（実施例２を参照）。またプテロスチルベンは、１ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇの両用量で開放アームでの移動距離（ＴＤＯＡ）のパーセントを増加させることができた。しかし、高用量（５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）では抗不安効果は全くみられず、逆に高用量では開放アームに対する嫌悪が増加する傾向がみられた、すなわち、高用量では不安がみられた。ほかにも１ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇのプテロスチルベンによる治療時に閉鎖アームでの移動距離（ＴＤＥＡ）のパーセントおよび閉鎖アームでの滞在時間（ＰＴＥＡ）のパーセントが減少したという結果により、プテロスチルベン抗不安作用がさらに裏付けられた。また、プテロスチルベンの抗不安作用はジアゼパムのものときわめて類似していた。２ｍｇ／ｋｇのプテロスチルベンは、少なくともＥＰＭでは２ｍｇ／ｋｇのジアゼパムと同等の効果を示した。したがって、ジアゼパムを陽性対照として使用することにより、ＥＰＭ行動パラダイムにおけるプテロスチルベンの抗不安薬としての可能性が確認される。ＮＥＯＡおよびＰＴＯＡと関係なく変化し、自発運動量のより純粋な尺度となる閉鎖アームへの侵入回数（ＮＥＥＡ）は、この実験で使用した用量の全範囲にわたって変化することはなかった。プテロスチルベンの親分子であるレスベラトロールは３ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの用量で試験したところ、抗不安効果を全く示さなかったことに言及しておく価値がある（Ｐａｔｉｓａｕｌら，２００９．ＨｏｒｍｏｎｅｓａｎｄＢｅｈａｖｉｏｒ５５：３１９−３２８）。

動物の自発運動量を評価して、低用量（１ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ）でのプテロスチルベンの抗不安作用が動物の運動活性に対する化合物の抑制作用の二次的結果でないことを示した。同様に高用量（５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）で抗不安効果がみられないのは運動障害によるものではなかった。したがって、いかなる刺激作用および抑制作用も記録されず、このことは、観察された抗不安効果が偽陽性である可能性がきわめて低いことを示唆している。

本発明者らはＥＰＭおよび自発運動試験に加え、不安に何らかの役割を果たしているタンパク質の発現を調べることにより、観察されたプテロスチルベンの抗不安薬様作用を説明し得る分子基質に焦点を当てた。ウエスタンブロット試験で得られた結果から、ＥＰＭで抗不安効果を示した低用量（１ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ）のプテロスチルベンで処置したマウスの海馬ではリン酸化ＥＲＫ１濃度が著明に減少することがわかった。同用量ではこのほか、ＥＲＫ２のリン酸化状態のわずかな減少が観察された。高用量（５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）ではＥＲＫ１／２のリン酸化状態を変化させることができなかったという結果が、同用量でＥＰＭにおいて化合物の抗不安効果が観察されなかったという結果と一致しているのは重要なことである。さらに、Ａｋｔファミリー（Ａｋｔ１、Ａｋｔ２およびＡｋｔ３）の３つの遺伝子がセリン／トレオニン特異的タンパク質キナーゼファミリー（ＥＣ２．７．１１．１）のメンバーである酵素をコードしているが、本発明者らの分析では、マウス海馬にリン酸化Ａｋｔの濃度の変化は全くみられなかった。したがって、本発明者らの結果は、プテロスチルベンの抗不安作用とそれがマウス海馬のＥＲＫ活性を減少させる能力との間には相関関係があることを示唆している。他の研究では、プテロスチルベンがＲＡＷ２６４．７細胞内でのＥＲＫ１／２の活性化を阻止することが示されている（Ｐａｎら，２００８．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．５６：７５０２−７５０９）。本発明者らの研究は、特定の低用量のプテロスチルベンがＥＲＫ１／２の活性化をダウンレギュレートすることを初めてｉｎｖｉｖｏで示したものである。

不安時には海馬および前頭前皮質（ＰＦＣ）を含めた脳の様々な領域のｐＥＲＫ濃度が上昇し、それを阻害すれば抗不安薬様作用が得られる可能性があることを示す最近の報告がある（Ａｉｌｉｎｇら，上記；Ｍａｒｔｉｎｅｚら，２００９．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．９２：２９１−２９６）。この事実は、緑茶ポリフェノール化合物であるエピガロカテキン−３−ガラートをマウスに急性投与した後に抗不安薬様作用が観察されたこと（Ｖｉｇｎｅｓら，２００６．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１１１０：１０２−１１５）、さらにこの化合物がＥＲＫ１／２のリン酸化状態を減少させることができるという事実（Ｃｈｕｎｇら，２００１．ＦＡＳＥＢＪ．１５：２０２２−２０２４；Ｓａｈら，２００４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１２７５５−１２７６２）に一致する。さらに、ｐＥＲＫ１／２の持続的な核内蓄積が、有害な結果をもたらす事象として記載されたことが報告されている（Ｃｏｌｕｃｃｉ−Ｄ’Ａｍａｔｏら，２００２．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ２５：１０８５−１０９５）。辺縁系構造に環状１７β−エストラジオールを投与することにより慢性ストレス後のｐＥＲＫ１／２シグナル伝達の増加が阻止されたという報告があるが、これは同薬剤の投与が反復するストレスの有害な結果を防ぐものと考えられる（Ｇｅｒｒｉｔｓら，上記）。さらに有望なことに、ＭＥＫ阻害物質を用いてＥＲＫ経路を阻害することによっても、様々な器官の損傷に対する治療効果が得られている（Ｏｔａｎｉら，２００７．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：４２−４８）。

脳内にはＭＡＰキナーゼのリン酸化を変化させ得るＮＭＤＡ、ＧＡＢＡのような受容体およびイオンチャネルが各種存在する。ＮＭＤＡ受容体によるＭＡＰキナーゼの活性化を示した研究がよく報告されている（Ｘｉａら，１９９６．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：５４２５−５４３６；Ｏｒｂａｎら，１９９９．ＴｒｅｎｄｓＮｅｕｒｏｓｃｉ．２２：３８−４４）。ほかにもＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路をＧＡＢＡ受容体機能の負のモジュレーターとして意味付ける研究もある（Ｂｅｌｌ−Ｈｏｒｎｅｒら，２００６．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６６：１４６７−１４７４）。ＥＲＫ１／２リン酸化の減少がＮＭＤＡ受容体の遮断またはＧＡＢＡ受容体の活性化により仲介されるかどうかは、本発明者らの現在進行中の研究の対象となっている。

高用量のプテロスチルベンが自発運動量を有意に変化させることも、有意な減少をもたらすこともなかったことを考えると、ＥＰＭ試験で高用量の化合物が抗不安薬様作用を示さなかった理由に関する議論が生じるであろう。ＥＰＭが純粋に行動パラダイムであるというわけではないが、げっ歯類が新奇環境（ここでは新奇環境をＥＰＭとする）を探索するとき、少なくとも部分的には作業記憶バッファーの容量が関与してくる。動物がＥＰＭの開放アームおよび閉鎖アームの位置を認識するには、ほかにも空間学習が重要であり、その空間情報の取得は海馬の機能に依存する（ＯｌｔｏｎおよびＰａｐａｓ．１９７９．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉａ１７：６６９−６８２）。したがって、最初のＥＰＭ実験により、同じ迷路のセッションでのその後のマウスの行動が時間とともに修正された可能性がある。また高用量のプテロスチルベン（１０ｍｇ／ｋｇ）がラットの認知能力、特に空間記憶を向上させた可能性も考えられる（Ｊｏｓｅｐｈら，上記）。実際、本発明者らの研究では、用量１０ｍｇ／ｋｇでのプテロスチルベン濃度が１．１２１７ｎｇ／海馬（表２）であるという結果が得られており、この値はＪｏｓｅｐｈら（上記）により報告されているものとほぼ同じある。したがって、高用量（５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）のプテロスチルベンが記憶経路にも同時に作用し、マウスの作業記憶バッファーの容量を増加させることにより、最初にＥＰＭのアームを経験しただけでも、ストレスを誘発し嫌悪される開放アームに対するマウスの探索行動を制限させたのであろうと推測するのが妥当である。この考えは、増加されたｐＥＲＫ濃度が作業記憶バッファーの増大に何らかの役割を果たした可能性を示唆する、高用量のプテロスチルベンの方が低用量のプテロスチルベンよりも海馬のリン酸化ＥＲＫ濃度を上昇させたという知見により、一層強固なものとなる。

本発明者らが得た結果は、ブルーベリーの１成分であるプテロスチルベンが、マウスを用いた高架式十字迷路で抗不安薬様作用を示すことを初めて実証したものである。また、高用量のプテロスチルベンではＥＰＭおよび自発運動量監視室における鎮静傾向は全くみられず、このことは、この化合物の副作用プロファイルが好ましいものであること示唆している。この化合物の抗不安作用は、動物海馬のＥＲＫ１／２リン酸化のダウンレギュレーションを伴うものであった。しかし、プテロスチルベンがＥＲＫリン酸化をダウンレギュレートする機序をさらに理解するためには、今後も研究が必要であろう。

したがって、本発明の化合物は、必要とする対象の不安を治療、軽減または予防するのに有用である。特定の実施形態では、本発明の化合物は、不安障害、例えば広場恐怖症の有無を問わないパニック障害、パニック障害の病歴がみられない広場恐怖症、動物その他に対する恐怖症（社会恐怖症を含む）、強迫性障害および全般的なまたは物質による不安障害など；外傷後ストレス障害および急性ストレス障害を含めたストレス障害；睡眠障害；記憶障害；神経症；痙攣性疾患、例えば癲癇、発作、痙攣または小児の熱性痙攣；片頭痛；気分障害；抑うつ障害または双極性障害、例えばうつ病、単一エピソード大うつ病性障害または反復性大うつ病性障害、気分変調性障害、双極性障害、双極性Ｉ型躁病、双極性ＩＩ型躁病および循環病、統合失調症を含めた精神病性障害；脳虚血により生じる神経変性；注意欠陥多動障害；疼痛および侵害受容、例えば神経障害性疼痛；急性、遅延性および先行性の嘔吐を含めた嘔吐、特に化学療法または放射線療法により誘発される嘔吐；動揺病、手術後の術後悪心嘔吐；神経性食欲不振症および神経性大食症を含めた摂食障害；月経前症候群；神経痛、例えば三叉神経痛；（例えば対麻痺患者の）筋肉の攣縮または痙攣；アルコール離脱症状を含めた物質乱用または物質依存症による影響；アルツハイマー病などの認知障害；脳虚血、脳卒中、頭部外傷；耳鳴：ならびに（例えば、時差ぼけまたは交代勤務による影響を受けた対象の）概日リズムの障害の治療、予防または軽減に有用であると考えられる。

本発明によるプテロスチルベンまたはプテロスチルベンの薬学的に許容される塩を含有する組成物を、化合物を配合および混合する従来の方法により調製することができる。このほか組成物は、好ましくは賦形剤を、最も好ましくは医薬品賦形剤を含む。賦形剤を含有しプテロスチルベンを組み込んだ組成物を、当該技術分野で公知の方法により調製することができる。例えば、プテロスチルベンを一般的な従来の担体、結合剤、希釈剤および賦形剤とともに、経口投与のための錠剤、カプセル剤、散剤、懸濁剤、液剤ならびに静脈内投与、真皮内投与、筋肉内投与および皮下投与を含めた非経口投与のための液剤に、また普通で伝統的な担体、バインダー、希釈液及び賦形剤を持つ経皮適用するためのパッチに塗布する液剤に製剤化することができる。

治療で使用する本発明の化合物を未加工の化合物の形態で投与してもよいが、活性成分を、任意選択で生理的に許容される塩の形態で、１つ以上の補助剤、賦形剤、担体、緩衝剤、希釈剤および／または他の通常の医薬品助剤とともに医薬組成物に導入するのが好ましい。

好ましい実施形態では、本発明は、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を１つ以上の薬学的に許容される担体ならびに任意選択で当該技術分野で公知であり使用されている他の治療成分および／または予防成分とともに含む、医薬組成物を提供する。担体（１つまたは複数）は、製剤の他の成分との適合性があり、かつ製剤の被投与者に対して無害であるという意味で「許容される」ものでなければならない。

本発明の医薬組成物は、経口、経直腸、経気管支、経鼻、経肺、局所（バッカルおよび舌下）、経皮、経膣もしくは非経口（皮膚、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、脳内、眼内への注射もしくは注入を含む）の各投与に適した医薬組成物または散剤および液体エアロゾル投与を含めた吸入もしくは吹送による投与に適した医薬組成物または徐放システムによる投与に適した医薬組成物であり得る。徐放システムの適切な例としては、本発明の化合物を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このようなマトリックスは成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態であり得る。

したがって、本発明の化合物を従来の補助剤、担体または希釈剤とともに、医薬組成物およびその単位用量の形態にし得る。このような形態としては、固体、特に錠剤、充填カプセル剤、粉末およびペレットの形態ならびに液体、特に経口使用のための水溶液もしくは非水溶液、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤およびそれを充填したカプセル剤または経直腸投与のための坐剤および非経口使用のための滅菌注射用液剤が挙げられる。このような医薬組成物およびその単位投与剤形は従来の成分を従来の割合で、追加の活性な化合物もしくは成分の有無に関係なく含むものであり得、またこのような単位投与剤形は、採用を意図する１日用量範囲に応じて任意の適切な有効量の活性成分を含有し得る。

本発明の化合物を様々な経口および非経口剤形で投与することができる。当業者には、以下に挙げる剤形が活性成分として本発明の化合物または本発明の化合物の薬学的に許容される塩を含み得ることが明らかであろう。

本発明の化合物から医薬組成物を調製するにあたって、薬学的に許容される担体は固体または液体であり得る。固体形態の製剤としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤および分散性顆粒剤が挙げられる。固体担体は、希釈剤、着香剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤または封入材料としても働き得る１つ以上の物質であり得る。

散剤では、担体は微粉化した固体であり、微粉化した活性成分と混合された状態にある。錠剤では、活性成分は必要な結合能を有する担体と適切な割合で混合されて、所望の形状および大きさに圧縮されている。

散剤および錠剤は、活性化合物を５または１０％〜約７０％含有するのが好ましい。適切な担体としては、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ロウ、カカオ脂などが挙げられる。「製剤」という用語は、活性成分を担体としての封入材料とともに製剤化し、活性成分が担体を含むか含まないかに関係なく担体に取り囲まれ、担体を伴ったカプセルにしたものを包含するものとする。同様にカシェ剤およびトローチ剤も包含される。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤およびトローチ剤を経口投与に適した固体形態として用いることができる。

液体製剤としては、液剤、懸濁剤および乳剤、例えば水または水−プロピレングリコール液剤が挙げられる。例えば、非経口注射用液体製剤をポリエチレングリコール水溶液の液剤として製剤化することができる。したがって、本発明による化合物を非経口投与（例えば注射、例えばボーラス注射または持続注入によるもの）用に製剤化してよく、またアンプル、予め充填されたシリンジ、少量の注入液の単位用量形態または保存剤を添加した複数用量容器で提供してよい。組成物は、油性溶媒または水性溶媒中の懸濁剤、液剤または乳剤などの形態であってよく、また懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤用物質を含有してよい。あるいは、活性成分は、滅菌固体の無菌単離または溶液の凍結乾燥により得られ、使用前に適切な溶媒、例えば滅菌無発熱物質水を用いて構成される粉末形態であり得る。

活性成分を水に溶かし、必要に応じて適切な着色剤、香味剤、安定化剤および増粘剤を加えることにより、経口使用に適した水溶液を調製することができる。微粉化した活性成分を粘稠性材料、例えば天然もしくは合成のゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたは他のよく知られた懸濁化剤などとともに水に分散させることにより、経口使用に適した水性懸濁液を作製することができる。

表皮への局所投与には、本発明の化合物を軟膏剤、クリーム剤もしくはローション剤または経皮パッチとして製剤化し得る。軟膏剤およびクリーム剤を、例えば、水性または油性の基剤に適切な増粘剤および／またはゲル化剤を添加して製剤化し得る。ローション剤は水性または油性の基剤を用いて製剤化され得るが、一般には、１つ以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤または着色剤も含有する。

口腔内への局所投与に適した組成物としては、風味を付けた基剤、通常はショ糖とアラビアゴムまたはトラガント中に活性物質を含むトローチ剤；ゼラチンとグリセリンまたはショ糖とアラビアゴムなどの不活性な基剤中に活性成分を含む香錠剤；ならびに適切な液体担体中に活性成分を含む口腔洗浄剤が挙げられる。

液剤または懸濁剤は、従来の手段により、例えばドロッパ、ピペットまたはスプレーを用いて鼻腔に直接適用される。組成物は単一用量または複数用量の形態で提供され得る。鼻腔内組成物を含めた気道に投与するための組成物では、化合物は一般に、粒子径が、例えば約５ミクロン以下の小さいものとなる。このような粒子径は当該技術分野で公知の手段、例えば微粒子化により得られる。

医薬製剤は単位投与剤形であることが好ましい。このような形態では、製剤が適切な量の活性成分を含有する単位用量に分割されている。単位投与剤形は、各包装に個別の分量の製剤が含まれるように包装された製剤、例えば包装された錠剤、カプセル剤およびバイアルまたはアンプルに入った散剤などであり得る。また単位投与剤形はカプセル剤、錠剤、カシェ剤またはトローチ剤であってもよく、あるいは単位投与剤は適当な数の包装形態の上記のいずれかであってもよい。

経口投与用の錠剤、カプセル剤およびトローチ剤ならびに静脈内投与および持続注入用の液剤は好ましい組成物である。鼻腔または気道に適用する液剤または懸濁剤は好ましい組成物である。表皮に局所投与するための経皮パッチは好ましいものである。

Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＭａａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎ社、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）の最新版に製剤化および投与の技術がさらに詳細に記載されている。

別の態様では、本発明は、必要とする対象の不安を治療、予防または軽減する方法を提供し、この方法は、ヒトを含めたこのような対象に有効量の本発明のプテロスチルベンを投与することを含む。

治療有効量は、症状または状態を改善する活性成分の量を指す。治療効果および毒性、例えばＥＤ₅₀およびＬＤ₅₀は、細胞培養物または実験動物を用いた標準的な薬理学的方法により決定され得る。治療効果と毒性作用の用量比が治療指数であり、ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀の比で表され得る。大きい治療指数を示す医薬組成物が好ましい。

本発明に従って使用される化合物の用量は化合物および治療される状態によって異なる。年齢、除脂肪体重、全体重、体表面積および受療患者の臨床状態；ならびに治療を実施する臨床医または開業医の経験および判断が用量の選択に影響を及ぼす因子である。他の因子としては、投与経路、患者の既往歴、疾患過程の重症度および特定の化合物の効力が挙げられる。用量は、許容されない毒性を患者に惹き起こすことなく、治療の対象となる疾患の症状および徴候を改善するのに十分な量であるべきである。用量を本発明の特定の状況になるまで用量漸増により変化させて、所望の治療効果をもたらし得る。

体表面積（ＢＳＡ）による正規化法を用いることにより、動物試験から得られた薬物用量がヒト試験のもの（ヒト等価用量、ＨＥＤ）へ適切に換算される。動物用量とヒト用量の間の相互関係（体表１平方メートル当たりのミリグラム数に基づくもの）がＲｅａｇａｎ−Ｓｈａｗらにより記載されている（２００７．ＦＡＳＥＢＪ．２２：６５９−６６１）。ＢＳＡ（ｍｇ／ｍ²）への正規化により用量を動物用量からヒト用量に変換するための式は、
ＨＥＤ＝動物用量（ｍｇ／ｋｇ）×動物Ｋ_m／ヒトＫ_m
であり、上式中、体重（ｋｇ）をＢＳＡ（ｍ²）で除した係数Ｋ_mは、動物試験で用いる用量ｍｇ／ｋｇをｍｇ／ｍ²に換算するために用いられる。動物の係数Ｋ_mは３であり、ヒトの係数Ｋ_mは３７である。ＦＤＡガイドラインのデータに基づき数種類の動物種で計算された係数Ｋ_mが表（表１、Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗら，上記）に挙げられている。

プテロスチルベンは、必要とする対象の不安を治療、軽減または予防するのに十分な量で組成物中に存在する。最も好ましい実施形態では、プテロスチルベンは、それのみで不安を治療、軽減または予防するのに十分な量で組成物中に存在する。活性成分を１日当たり１用量または複数用量で投与する。ある場合には、最小０．０４０５ｍｇ／ｋｇ（経口）のヒト等価用量（ＨＥＤ）で、あるいは６０ｋｇのヒト患者に約３ｍｇ／日（経口）〜約１５ｍｇ／日（経口）の用量で十分な結果を得ることができる。プテロスチルベンの半減期が約２時間であることを考慮に入れると、前記ヒト患者では適切な範囲を約１０ｍｇ／日（経口）〜約１００ｍｇ／日（経口）とすることができる。

現時点で、ヒト患者では適切な用量の範囲が、通常と同じく、正確な投与様式や投与時の形態、投与の対象となる適応症、投与する対象および投与する対象の体重と体表面積、さらには担当する医師または獣医の選好と経験に応じて１日１０〜１００ｍｇになると考えられる。疾患を治療するための当該技術分野で公知の化合物と併用して投与する場合、投与レジメンを減らしてよい。
実施例

ここまで本発明を概略的に説明してきたが、特定の具体例を参照することにより本発明がさらに理解されるであろう。ただし、これらの具体例は本発明を詳細に説明するために記載されるものであり、請求項により定められる本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１
プテロスチルベン
既に記載されている通りにプテロスチルベンを合成した（Ｊｏｓｅｐｈら，上記）。簡潔に述べれば、３，５−ジメトキシベンズアルデヒドと４−ヒドロキシフェニル酢酸を無水酢酸／トリエチルアミン中で濃縮することによりプテロスチルベンを合成した。反応混合物を窒素雰囲気下で加熱し（１５０℃）、攪拌し続けた。２０時間後、反応を停止させて室温まで冷却し、濃塩酸（５ｍＬ）を加えた。沈殿が形成されると、これをクロロホルム５０ｍＬに溶かしてから１０％水酸化ナトリウム水溶液で抽出した。水性抽出物を濃塩酸でｐＨ１に酸性化し、少なくとも６時間攪拌した後、中間生成物であるα−［（３，５−ジメトキシフェニル）メチレン］−４−ヒドロキシ−（αＺ）−ベンゼン酢酸の沈殿を得た。この中間生成物をキノリン１０ｍＬ中、銅１．０ｇとともに加熱した（２００℃、６時間、窒素下）。反応混合物を室温まで冷却し、ろ過した。ろ液に５Ｎ塩酸（２５ｍＬ）を加え、１時間加熱した後、クロロホルムで抽出した。不純物を含んだプテロスチルベンを含有するクロロホルム抽出物を、ＨＰＦＣシステム（Ｂｉｏｔａｇｅ社、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ）でシリカゲルカラムおよび酢酸エチル：ヘキサンの溶媒系（１５：８５〜１００％酢酸エチルの直線勾配）を用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。純粋なプテロスチルベンを含有する画分を合わせて真空下で濃縮した。プテロスチルベンをヘキサン中で再結晶させ、その構造を分光分析データ（ＵＶ、質量分析法および核磁気共鳴分光測定法）（図１）から確認した。

プテロスチルベンを用量が１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重となるようにクレモフォールとエタノールと生理食塩水（１：１：１８）の混合物に溶かした。行動試験の１時間前に体積１０ｍＬ／ｋｇを経口投与した。

実施例２
マウスを用いた高架式十字迷路行動試験におけるプテロスチルベンの効果
試験時の体重が２４〜３０ｇの８週齢雄性ＳｗｉｓｓＷｅｂｓｔｅｒマウス（Ｈａｒｌａｎ社、ＩＮ、ＵＳＡ）を全試験に用いた。動物を５匹ずつのグループで飼育し、食餌および水を自由摂取させ、１日１２時間：１２時間の光周期の下で維持した。全マウスを無作為に選択して各処置群に割り付けた。飼育、取扱いおよび実験の方法は、ミシシッピ大学の動物管理使用委員会（ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）に承認され、米国国立衛生研究所の「実験動物の管理と使用に関する指針」（ＧｕｉｄｅｆｏｒＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓ）の規定を遵守するものであった。

高架式十字迷路（ＥＰＭ）試験では、ＥＰＭ装置は共通の中央プラットフォーム（５×５ｃｍ）から伸びる２本の開放アーム（３０×５ｃｍ）と２本の閉鎖アーム（３０×５ｃｍ、壁の高さ１５ｃｍ）で構成されていた。その配置は、互いに反対側に置かれた同様のアームによりプラスの記号の形状をなすものであった。装置は床上５０ｃｍの高さに設置された。

プテロスチルベンまたはジアゼパムによる処置前、動物（ｎ＝６〜１０／グループ）をＥＰＭの部屋で３０分間馴化させた。プテロスチルベンは経口投与し、ジアゼパムは腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。それぞれ強制経口投与およびｉ．ｐ．によるプテロスチルベンまたはジアゼパムの投与が完了した後、ＥＰＭ試験の前にマウスを同じ部屋にそれぞれ６０分間および３０分間滞在させた。その後、装置の中央にマウスを１匹ずつ開放アームの方に向けて置き、５分間自由に探索させた。開放アームでの移動距離（ＴＤＯＡ）、閉鎖アームでの移動距離（ＴＤＥＡ）；開放アームでの滞在時間（ＰＴＯＡ）、閉鎖アームでの滞在時間（ＰＴＥＡ）、開放アームへの侵入回数（ＮＥＯＡ）および閉鎖アームへの侵入回数（ＮＥＥＡ）を測定した。すなわち、開放アームおよび閉鎖アーム両方での移動距離およびそこに滞在した時間の百分率ならびに開放アームおよび閉鎖アームへの侵入回数を、コンピュータによるビデオ追跡システム（ＳａｎＤｉｅｇｏＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて定量化した。各試験後、迷路をガラス洗浄剤できれいに拭いてから乾燥させた。マウスの肢が４本ともアーム内に入ったときにアームへの侵入を記録した。開放アームに滞在した時間の百分率および開放アームへの侵入回数は、不安の重要な決定因子および純粋な尺度であると考えられる（Ｈｏｇｇ，上記）。

ここで本発明者らは、プテロスチルベン（図１）がＥＰＭにおいて用量依存的に抗不安薬様作用を示したことを初めて示す。抗不安作用は用量１ｍｇ／ｋｇの化合物で現れ、２ｍｇ／ｋｇで最大に達した後、用量が５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで減少した。対照（０ｍｇ／ｋｇ）と比較したところ、プテロスチルベンでは抗不安薬様作用と相関する全パラメーターに有意な増加が認められた：開放アームでの移動距離（ＴＤＯＡ）（％）［（４，４３）＝３．０５６、ｐ＜０．０５］、開放アームでの滞在時間（ＰＴＯＡ）（％）［Ｆ（４，４３）＝２．６５７、ｐ＜０．０５］および開放アームへの侵入回数（ＮＥＯＡ）［Ｆ（４，４３）＝４．２５７、ｐ＜０．０１］（図２Ａ）。プテロスチルベンではこのほか、閉鎖アームでの移動距離（ＴＤＥＡ）（％）、閉鎖アームでの滞在時間（ＰＴＥＡ）（％）および閉鎖アームへの侵入回数（ＮＥＥＡ）のような不安と相関する閉鎖アームのパラメーターに減少傾向が認められた（図２Ｂ）。したがって、２ｍｇ／ｋｇの用量で最大の抗不安作用が得られたことになる。最大用量１０ｍｇ／ｋｇでは効果は認められなかった。

従来の方法では、動物がアームへの入口を横切ったときにアームへの出入りをカウントする（Ｈｏｇｇ，上記）。本発明者らの実験では、マウスの肢が４本ともアーム内に入ったときにアームへの侵入を記録した。したがって、マウスが迷路の開放区間でも閉鎖区間でもない中央の四角いゾーンにいることが可能となる。本発明者らが記録する際には、中央のゾーンを開放アームおよび閉鎖アームの両方から分離されているものと見なしたため、純粋な抗不安効果をより正確に示す結果が得られた。

実施例３
マウスを用いた自発運動量行動試験におけるプテロスチルベンの効果
自発運動量を測定するために、成体ＳｗｉｓｓＷｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝８〜１０／グループ）にプテロスチルベンを強制経口投与により投与した。次いで、各マウスを運動チャンバ内に置き、プレキシガラスの囲いに３０分間馴化させた。３０分間の馴化時間の後、自動活動監視システム（ＳａｎＤｉｅｇｏＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて自発運動量を３０分間の測定した。１チャンバ当たり１６セルの光線を遮断した総数で運動量を表した。

自発運動量に対する効果を明らかにするため、本発明者らは、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量でプテロスチルベンによる処置を実施した後、マウスの自発運動量を測定した（図３）。一元配置ＡＮＯＶＡ分析では、自発運動量に対する薬物処置の有意な効果は示されなかった。事後比較では、自発運動量が最大抗不安薬量のプテロスチルベンによる影響を受けないことが示された。最大用量でもマウスの自発運動量に対する効果は全く認められなかった。

実施例４
ウエスタンブロット分析：血液および組織
ＥＰＭセッション後、顎下静脈穿刺により各マウスからヘパリン処置した採血バイアルに血液検体を採取した。次いでマウスを屠殺し、迅速に脳を摘出した。氷上で脳の前頭前皮質（ＰＦＣ）と海馬を切り取って、直ちに液体窒素中で凍結させ、次の処理まで−８０℃で保管した。血液検体を４℃、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、血漿を上清として得た。この血漿試料を使用時まで−８０℃で保管した。

マウス脳の海馬のウエスタンブロット分析を、既に記載されている方法（ＡｌＲａｈｉｍら，２００９．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４８：７７１３−７７２１）にわずかな修正を加えて実施した。簡潔に述べれば、凍結した海馬を氷冷ホモジナイゼーション緩衝液［５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、０．５ｍＭＤＴＴおよび緩衝液１ｍＬ当たり１０μｌのＨａｌｔＰｒｏｔｅａｓｅ＆ＰｈｏｓｐｈａｔｅｓＩｎｈｉｂｉｔｏｒＣｏｃｋｔａｉｌ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＩＬ、ＵＳＡ）］中でホモジナイズした。ホモジネートを４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を収集して試料緩衝液を加え、９５℃で５分間煮沸した。このようにして、調製試料をウエスタンブロット実験用に準備した。等量のタンパク質（３０μｇ）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル１２％）にかけ、ブロットした膜を室温で１時間、脱脂乳５％を含有するＴＢＳＴ緩衝液中でブロックした。次いで、膜を抗ホスホ−ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＵＳＡ）抗体とインキュベートした。別のゲルで同じ試料を泳動し、膜を抗β−アクチン抗体（ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＵＳＡ）とインキュベートした。抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３、ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＵＳＡ）抗体を用い、次いで抗β−アクチン抗体（ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＵＳＡ）で再検出を実施することにより、海馬のホスホ−Ａｋｔの発現レベルを確認した。結合した抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体（ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＵＳＡ）で検出し、ＶｅｒｓａＤｏｃイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ＵＳＡ）を用いて撮像した。ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ１−ＤＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ＵＳＡ）を用いて関連する免疫反応性のバンドを定量化した。ＥＲＫ活性化を評価するため、ホスホ−ＥＲＫ濃度をβ−アクチン濃度に正規化した。

不安時にｐＥＲＫの濃度が有意に増加すること、およびＥＲＫシグナル伝達経路の阻害が不安寛解の導入に何らかの役割を果たしている可能性があること（Ａｉｌｉｎｇら，２００８）を考慮し、次に、海馬から得たホモジネート中のＥＲＫ１／２のリン酸化状態を明らかにした。ウエスタンブロット分析では、１ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇのプテロスチルベンで処置したマウスの海馬ホモジネート中のＥＲＫ１［Ｆ（４，１５）＝１２．４９、ｐ＜０．００１］およびＥＲＫ２［Ｆ（４，１５）＝３．０２４、ｐ＜０．０５］はともにリン酸化が減少していることがわかった（図４Ａおよび４Ｂ）。ＥＰＭで抗不安薬様作用が全くみられなかった５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量では、ＥＲＫのリン酸化に対する有意な効果は認められなかった。また、ＥＲＫ１リン酸化の減少の方がＥＲＫ２リン酸化の減少よりもはるかに著明であったことも言及に値する。プテロスチルベン処置マウスの前頭前皮質にはＥＲＫリン酸化の有意な変化は認められなかった（データ不掲載）。

上で述べた効果がプテロスチルベンの中枢作用による他のキナーゼのリン酸化状態の無差別な減少の結果であるのかを明らかにするため、海馬のリン酸化Ａｋｔ濃度を測定した。ＥＲＫのリン酸化が著明に減少したのとは対照的に、１〜１０ｍｇ／ｋｇの化合物で処置したマウスの海馬にＡｋｔのリン酸化状態の変化はほとんどみられなかった（図５）。

実施例５
ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）による血漿、海馬およびＰＦＣ中のプテロスチルベンの分析
血漿を−８０℃で保管し、抽出前に氷上で解凍した。公開されている方法に従って、血漿をβ−グルクロニダーゼで処理して、グルクロン酸抱合されたプテロスチルベンをすべて加水分解した（Ｒｅｍｓｂｅｒｇら，上記）。簡潔に述べれば、血漿（各個体から得られたもの）５０μＬをエッペンドルフチューブに移し、β−グルクロニダーゼ溶液（５０００Ｕ／ｍＬリン酸カリウム緩衝液、７５ｍＭ、３７℃でｐＨ６．８）６０μＬを加えた。混合物をボルテックスで混ぜ合わせ後、７５０ｒｐｍで２０時間、振盪しながら３７℃でインキュベートした。そののち、氷冷したＨＰＬＣグレードのアセトニトリルを加えてボルテックスで混ぜ合わせ、４℃、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を収集し、窒素流下で乾燥させた。乾燥した上清をＧＣ−ＭＳ分析に用いた。

海馬組織を抽出時まで−８０℃で保管した。２〜３個体の海馬（左右）を合わせてエッペンドルフチューブに入れ、１つの試料として処理した。このチューブにリン酸緩衝液（０．２ＭＮａＨ₂ＰＯ₄：０．２ＭＮａ₂ＨＰＯ₄）２００μＬを加え、組織を２分間、手動でホモジナイズした。アリコート１００μｌにβ−グルクロニダーゼ（５０００Ｕ／ｍＬリン酸カリウム緩衝液）５０μＬを加えた。混合物をボルテックスで混ぜ合わせ、振盪（７５０ｒｐｍ）しながらインキュベートした（３７℃で２０時間）。次いで、試料を遠心分離した（４℃、７０００ｇで１５分間）。上清を収集し、酢酸エチルで分配した（２００μＬ、２回）。酢酸エチル層を合わせて窒素流下で乾燥させ、ＧＣ−ＭＳ分析に用いた。海馬と同じ方法で前頭前皮質（ＰＦＣ）の抽出を実施し、３個体のＰＦＣ組織を合わせ、１つの試料として処理した。

窒素乾燥させた試料（血漿および脳組織の抽出物）をＮ，Ｏ−ビス［トリメチルシリル］トリフルオロアセトアミドとジメチルホルムアミドの１：１混合物（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）３０μＬで処理し、７０℃で４０分間加熱した。Ｊ＆ＷＤＢ−５キャピラリーカラム（内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍおよび長さ３０ｍ；ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を装着したＪＥＯＬＧＣＭａｔｅＩＩＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＪＥＯＬＵＳＡ社、Ｐｅａｂｏｄｙ、ＭＡ）を用いて、誘導体化された試料のプテロスチルベン濃度を分析した。ＧＣの温度プログラムは、１９０℃で開始し、２０℃／分の速度で２４０℃まで上昇させ、次いで２．５℃／分で２８０℃まで上昇させ、最後に３０℃／分の速度で３００℃まで上昇させてから、この温度で０．５分間保持するものであった。キャリヤガスは流速１ｍＬ／分の超高純度ヘリウムであった。注入口、ＧＣ−ＭＳ接続部およびイオン化チャンバをそれぞれ２５０℃、２３０℃および２３０℃に保った。注入体積は２μＬであった（スプリットレス注入）。選択陽イオンモニタリングモード（ｍ／ｚ３２８、３１３および２９７）；電子衝撃７０ｅＶで質量スペクトルを得た。ＧＣ−ＭＳ分析を二重反復で実施した。プテロスチルベンの保持時間は１０．２分であった。既に構造と純度が特徴付けられているプテロスチルベンの合成試料の外部標準を用いて、プテロスチルベンを定量した。

用量１ｍｇ／ｋｇでのプテロスチルベンの血漿中濃度は１０．０８±６．６７ｎｇ／ｍＬであり、用量に応じて増加し、１０ｍｇ／ｋｇでは１３０．２６±４０．２５ｎｇ／ｍＬに達することがわかった（表１）。用量１ｍｇ／ｋｇでの海馬組織のプテロスチルベン濃度は検出可能であったが、定量下限未満であった（０．０８４０ｎｇ）。２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量での濃度は定量可能であり、０．２６２７〜１．１２１７ｎｇ／海馬であった（表２）。前頭前皮質組織では投与したいずれの用量でも、ごくわずかな濃度のプテロスチルベン（定量不可能）が検出された。

本明細書で言及されている刊行物および特許はすべて、各刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的に個別に明示された場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれるものとする。

上述の詳細な説明は単に説明を目的としたものであり、本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく、そこに修正および変形を施し得ることが理解される。

Claims

必要とする対象の不安を治療、軽減または予防するための、プテロスチルベンを含む医薬組成物または機能性食品組成物（nutraceutical composition）。
前記対象が、悲惨な出来事、環境の変化及び旅行からなる群から選ばれる条件による不安に苦しむ哺乳動物である、請求項１に記載の医薬組成物又は機能性食品組成物。
前記対象が睡眠障害、肥満症及びうつ病からなる群から選ばれる状態による不安に苦しむヒトである、請求項１に記載の医薬組成物又は機能性食品組成物。
前記対象がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、糖尿病および癌からなる群から選ばれる疾患の副作用としての不安に苦しむヒトである、請求項１に記載の医薬組成物又は機能性食品組成物。
前記組成物が、治療有効量のプテロスチルベンを含有し、前記量が前記哺乳動物の体重および体表面積に基づく総量である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物又は機能性食品組成物。
前記量が１０ｍｇ／日〜１００ｍｇ／日の総量である、請求項５に記載の医薬組成物又は機能性食品組成物。
前記機能性食品組成物が食品もしくは飲料または食品もしくは飲料の補助組成物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物又は機能性食品組成物。
前記量が１０ｍｇ／日〜１００ｍｇ／日の量で存在する、請求項７に記載の医薬組成物又は機能性食品組成物。
不安を治療、軽減または予防するためのキットであって、請求項１に記載の有効量のプテロスチルベンを含む組成物と、前記組成物を収納する容器と含むキット。
不安を治療、軽減または予防するための医薬組成物または機能性食品組成物を製造するためのプテロスチルベンの使用。