JP6406865B2 - 濃度測定方法 - Google Patents
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は、イソラポンチゲニンおよびラポンチゲニンの濃度測定方法に関する。
ピセアタンノールは、スチルベン類の化合物であって、例えば、トケイソウ科トケイソウ属（Passiflora）の果物であるパッションフルーツの種子に含まれており、シミ、ソバカス、日焼けなどによる色素沈着の原因となるメラニンの生成を抑制する効果があることが報告されている（特許文献１を参照）。
ピセアタンノールの体内での代謝は、これまで解明されていないが、ピセアタンノールが投与されると、グルクロン酸抱合され、尿中に排出されることがあきらかになっている（非特許文献１を参照）。
Roupe, K. A.et al., Pharmacokinetics of selected stilbenes: rhapontigenin, piceatannol and pinosylvin in rats. J. Pharm. Pharmacol. 2006, 58, 1443-1450.
本発明は、イソラポンチゲニンおよびラポンチゲニンの新規な濃度測定方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、ピセアタンノールの体内での代謝を解明しようと、鋭意努力した結果、ピセアタンノールを投与すると、血中のイソラポンチゲニンの濃度および尿中のイソラポンチゲニンおよびラポンチゲニンの濃度が増加すること、そして血液を加水分解酵素で処理すると、ラポンチゲニンが検出されることを見出し、本発明にいたった。
本発明の一実施形態は、イソラポンチゲニン（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）またはラポンチゲニン（３，３'，５-トリヒドロキシ-４'-メトキシ-trans-スチルベン）の濃度測定方法であって、ピセアタンノールを摂取した動物から採取した尿において、イソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンの濃度を測定する工程を含む。
本発明の他の実施形態は、イソラポンチゲニン（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）の濃度測定方法であって、ピセアタンノールを摂取した動物から採取した血液、血漿または血清において、イソラポンチゲニンの濃度を測定する工程を含む。
本発明の他の実施形態は、イソラポンチゲニン（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）またはラポンチゲニン（３，３'，５-トリヒドロキシ-４'-メトキシ-trans-スチルベン）の濃度測定方法であって、ピセアタンノールを摂取した動物から採取した尿において、加水分解後にイソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンの濃度を測定する工程を含む方法。
本発明の他の実施形態は、イソラポンチゲニン（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）またはラポンチゲニン（３，３'，５-トリヒドロキシ-４'-メトキシ-trans-スチルベン）の濃度測定方法であって、ピセアタンノールを摂取した動物から採取した血液、血漿、または血清において、加水分解後にイソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンの濃度を測定する工程を含む。
本発明のさらなる実施形態は、ピセアタンノール摂取を検出するためのバイオマーカーであって、イソラポンチゲニンおよびラポンチゲニンである、バイオマーカーである。
本発明によって、イソラポンチゲニンおよびラポンチゲニンの新規な濃度測定方法を提供することができるようになった。
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
本発明の一実施態様は、イソラポンチゲニン（Isorhapontigenin）（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）またはラポンチゲニン（Rhapontigenin）（３，３'，５-トリヒドロキシ-４'-メトキシ-trans-スチルベン）の濃度測定方法であって、ピセアタンノール（Piceatannol）を摂取した動物から採取した尿において、イソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンの濃度を測定する工程を含む。また、本発明の他の実施態様は、イソラポンチゲニン（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）の濃度測定方法であって、ピセアタンノールを摂取した動物から採取した血液、血漿または血清において、イソラポンチゲニンの濃度を測定する工程を含む。各化合物は、以下の構造式で表される。
摂取するピセアタンノールの形状は特に限定されず、パッションフルーツ種子やテンニンカなどの食品に含まれていてもよく、薬剤の形状でもよい。また純度も特に限定されず、ピセアタンノール含有物そのものでもよく、精製されたピセアタンノールであってもよい。本来、ピセアタンノールを含まないものに、ピセアタンノールを添加してもよい。
ピセアタンノールを摂取した動物は、ピセアタンノールからイソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンへの代謝系を有している動物であればよく、例えばラット、マウス、ヒトなどが例示できる。摂取方法も特に限定されず、全身投与または局所投与など外的に投与されても、自ら摂取してもよい。また、経口経路、非経口経路のいずれによっても摂取でき、非経口経路としては、静脈内投与、動脈内投与、皮下、皮内、筋肉内などへの投与、経粘膜投与または経皮投与などが例示できる。
動物個体がピセアタンノールを摂取した後、その個体から血液または尿を採取し、血液中あるいは尿中のイソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンの濃度を測定する。その際、血液や尿には安定化剤の添加や加水分解による脱抱合などの前処理をしてもよい。また、血液からは血漿または血清を採取して、その中のイソラポンチゲニンの濃度を測定してもよい。
イソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンの濃度の測定方法は特に限定されないが、例えばＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）やＬＣ-ＭＳ（高速液体クロマトグラフ質量分析法）などが例示できる。なお、測定の際に、必要があれば測定サンプルからイソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンを抽出してもよく、その抽出方法は特に限定されないが、有機溶媒を用いたタンパク質変性沈殿法や溶媒抽出法、固相抽出法などが例示できる。投与後、測定までの時間は特に限定されないが、代謝時間を考慮に入れると、２４時間以内であればよく、１６時間以内が好ましく、８時間以内がより好ましく、４時間以内がさらに好ましく、２時間以内がさらに好ましく、１時間以内がさらに好ましく、３０分以内がさらに好ましい。
このように、尿中のイソラポンチゲニンおよびラポンチゲニン、血液中のイソラポンチゲニンは、ピセアタンノール摂取を検出するためのバイオマーカーになる。
３６匹の８週令の雄Sprague-Dawleyラットを麻酔し、頸静脈にカテーテルを埋め込んだ。全体を６匹ずつ６群に分け、１週間の回復期間後、一晩絶食させ、各群に対し異なる量のピセアタンノールまたはレスベラトロールを投与した。ピセアタンノール及びレスベラトロールは、９０、１８０、または３６０μｍｏｌ／ｋｇ体重の量を直接胃に投与した。そして、各ラットの頸静脈に埋め込んだカテーテルから、投与前と、投与後１５、３０分、１、２、４、８時間に０．４ｍＬ採血した。そして、代謝ケージに入れて、通常通り給餌し、２４時間で再度０．４ｍＬの採血を行った。また、ピセアタンノールおよびレスベラトロール投与後２４時間に亘って、尿を採取した。なお、得られた血漿及び尿には、１０分の１量の安定化剤（０．４％ アスコルビン酸／０．０２％ ＥＤＴＡ／８０ ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム、ｐＨ ３．６）を添加し、分析まで−３０℃で保存した。
血漿及び尿サンプルは、アセトニトリルを用いて除タンパクした後、Prominence HPLC システム（株式会社島津製作所社製）を用いて分析を行った。また、β−グルクロニダーゼとスルファターゼを用いて加水分解した後にアセトニトリルを用いて除タンパクした血漿及び尿サンプルについても、同様にＨＰＬＣを用いて分析を行った。なお、ＨＰＬＣは、以下の条件で行った。
カラム：Mightysil RP-18 GP ODS column
（径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、関東化学株式会社製）
ガードカラム：Mightysil RP-18 GP guard column
（径４．６ｍｍ、長さ５ｍｍ、関東化学株式会社製）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）リン酸／水
移動相Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）リン酸／アセトニトリル
溶出条件：０−２分 １４％ Ｂ；２−３０分 １４−３０％ Ｂ
流速：１ｍＬ／分
検出波長：３２０ｎｍ
図１に、ラットに３６０μｍｏｌ／ｋｇ体重のピセアタンノールを投与する前と投与後３０分で採取した血漿の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。投与前（Ａ）は、ピークは検出されないが、ピセアタンノール投与後３０分（Ｂ）では、ピセアタンノール、イソラポンチゲニン、及び複数のピセアタンノール代謝物のピークが検出され、ピセアタンノール投与後３０分のサンプルを加水分解した場合（Ｃ）、ピセアタンノールとイソランポンチゲニンに加えて、ラポンチゲニンのピークが新たに現れる。一方、レスベラトロール投与後３０分（Ｄ）、及びレスベラトロール投与後３０分のサンプルを加水分解した場合（Ｅ）では、レスベラトロールのピークが検出されるが、ピセアタンノール、イソラポンチゲニン、及びラポンチゲニンのピークは検出されない。
（径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、関東化学株式会社製）
ガードカラム：Mightysil RP-18 GP guard column
（径４．６ｍｍ、長さ５ｍｍ、関東化学株式会社製）
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溶出条件：０−２分 １４％ Ｂ；２−３０分 １４−３０％ Ｂ
流速：１ｍＬ／分
検出波長：３２０ｎｍ
図１に、ラットに３６０μｍｏｌ／ｋｇ体重のピセアタンノールを投与する前と投与後３０分で採取した血漿の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。投与前（Ａ）は、ピークは検出されないが、ピセアタンノール投与後３０分（Ｂ）では、ピセアタンノール、イソラポンチゲニン、及び複数のピセアタンノール代謝物のピークが検出され、ピセアタンノール投与後３０分のサンプルを加水分解した場合（Ｃ）、ピセアタンノールとイソランポンチゲニンに加えて、ラポンチゲニンのピークが新たに現れる。一方、レスベラトロール投与後３０分（Ｄ）、及びレスベラトロール投与後３０分のサンプルを加水分解した場合（Ｅ）では、レスベラトロールのピークが検出されるが、ピセアタンノール、イソラポンチゲニン、及びラポンチゲニンのピークは検出されない。
尿についても同様に、図２に、ラットに３６０μｍｏｌ／ｋｇ体重のピセアタンノール投与後に採取した場合の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ピセアタンノール投与後（Ａ）及びピセアタンノール投与後のサンプルを加水分解した場合（Ｂ）のいずれにおいても、ピセアタンノール、イソラポンチゲニン、及びラポンチゲニンのピークが検出される。一方、レスベラトロール投与後（Ｃ）及びレスベラトロール投与後のサンプルを加水分解した場合（Ｄ）では、レスベラトロールのピークが検出されるが、ピセアタンノール、イソラポンチゲニン、及びラポンチゲニンのピークは検出されない。
尿中に検出されたイソラポンチゲニンおよびラポンチゲニンのピーク成分を分画し、Prominence UFLC システム（株式会社島津製作所社製）に接続した質量分析計で解析した。質量分析は、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析用イオン源を搭載した3200 QTRAP（登録商標） system (AB SCIEX社)を用いて行った。エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）は、以下の条件で行い、プロダクトイオンをフルスキャンモードで検出した。
カーテンガス圧：４０ｐｓｉ
ネブライザーガス圧：５０ｐｓｉ
ターボガス圧：８０ｐｓｉ
イオン源温度：６００℃
イオンスプレー電圧：−４．５ｋＶ
イオン化電圧（デクラスタリングポテンシャル）：−４０Ｖ
衝突エネルギー（Collision Energy）：−３０Ｖ
以上のようにして、ラットにピセアタンノールを投与した時に、尿中に現れる代謝物を解析した。その結果、尿中のイソラポンチゲニンのピーク成分のマススペクトル(m/z ２５７)はイソラポンチゲニン標準製品と一致し、尿中のラポンチゲニンのピーク成分のマススペクトル(m/z ２５７)はラポンチゲニン標準製品と一致し、ピセアタンノールを投与したラットの尿中にイソラポンチゲニンおよびラポンチゲニンが検出されることが確認できた。
ネブライザーガス圧：５０ｐｓｉ
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イオン化電圧（デクラスタリングポテンシャル）：−４０Ｖ
衝突エネルギー（Collision Energy）：−３０Ｖ
以上のようにして、ラットにピセアタンノールを投与した時に、尿中に現れる代謝物を解析した。その結果、尿中のイソラポンチゲニンのピーク成分のマススペクトル(m/z ２５７)はイソラポンチゲニン標準製品と一致し、尿中のラポンチゲニンのピーク成分のマススペクトル(m/z ２５７)はラポンチゲニン標準製品と一致し、ピセアタンノールを投与したラットの尿中にイソラポンチゲニンおよびラポンチゲニンが検出されることが確認できた。
図３に、ピセアタンノール、イソラポンチゲニン、ラポンチゲニンについて、ピセアタンノールを異なる量で投与した時の血漿を加水分解して得られた血漿中濃度‐時間曲線下面積（ＡＵＣ；Ａ）及び尿を加水分解して得られた２４時間尿中排泄量（Ｂ）を示す。
図３に示すように、尿中においても血漿中においても、ピセアタンノール、イソラポンチゲニン、ラポンチゲニンが投与量依存的に検出された。なお、血漿中に検出される場合は、ピセアタンノール投与後１５分で、検出可能であった。
このように、ピセアタンノールを摂取した動物から採取した尿及び血液において、イソラポンチゲニンおよびラポンチゲニンの量が投与量依存的に増加する。
Claims (5)
- イソラポンチゲニン（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）またはラポンチゲニン（３，３'，５-トリヒドロキシ-４'-メトキシ-trans-スチルベン）の濃度測定方法であって、
ピセアタンノールを摂取した動物から採取した尿において、イソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンの濃度を測定する工程を含む方法。 - イソラポンチゲニン（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）の濃度測定方法であって、
ピセアタンノールを摂取した動物から採取した血液、血漿または血清において、イソラポンチゲニンの濃度を測定する工程を含む方法。 - イソラポンチゲニン（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）またはラポンチゲニン（３，３'，５-トリヒドロキシ-４'-メトキシ-trans-スチルベン）の濃度測定方法であって、
ピセアタンノールを摂取した動物から採取した尿を加水分解処理する工程と、
前記加水分解処理した尿におけるイソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンの濃度を測定する工程と、を含む方法。 - イソラポンチゲニン（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）またはラポンチゲニン（３，３'，５-トリヒドロキシ-４'-メトキシ-trans-スチルベン）の濃度測定方法であって、
ピセアタンノールを摂取した動物から採取した血液、血漿、または血清を加水分解処理する工程と、
前記加水分解処理した血液、血漿、または血清におけるイソラポンチゲニンまたはラポンチゲニンの濃度を測定する工程と、を含む方法。 - ピセアタンノール摂取を検出するためのバイオマーカーであって、
イソラポンチゲニンおよびラポンチゲニンである、バイオマーカー。
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