KR20150064728A

KR20150064728A - 신체 내 사이클릭 아데노신 일인산의 함량 및 이용률을 증대시키기 위한 의약 조성물 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20150064728A
Application number: KR1020157006515A
Authority: KR
Inventors: 치-광 싱
Original assignee: 치, 유-펜
Priority date: 2012-08-15
Filing date: 2012-08-15
Publication date: 2015-06-11
Also published as: EP2886125A4; JP2015524827A; US20180311297A1; MX2015001766A; AU2016256704B2; AU2012387645A1; RU2625765C2; BR112015003344A2; EP2886125A1; SG11201501020WA; ZA201500961B; CA2881348C; KR101797572B1; EP2886125B1; AU2016256704A1; CA2881348A1; US20150273005A1; NZ705363A; RU2015108387A; PH12015500320A1

Abstract

본 발명은 진세노사이드 Rg1, Rb1 및 Re, 글리시리진산, 글리시레틴산 및 그들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나인 감초 관련 산, 및 주주바 사이클릭 아데노신 일인산(주주바 cAMP)을 포함하는, 체내에서 사이클릭 아데노신 일인산 (cAMP)의 함량 및 이용률을 증대시키기 위한 의약 조성물을 제공한다.

Description

생체 내 cyclic AMP의 함량 및 이용률을 증대시키기 위한 의약 조성물 및 그 제조 방법{PHARMACEUTICAL COMPOSITION INCREASING CYCLIC AMP CONTENT AND AVAILABILITY IN VIVO, AND PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 의약 조성물, 특히 경구용 의약 및 건강 식품에 관한 것이다.

1971년 생리학 또는 의학 분야에서 노벨상을 수상한 과학자인 얼 윌버 서덜랜드 주니어(Earl Wilbur Sutherland Jr.)는 세포 내 사이클릭 아데노신 일인산(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)의 메커니즘을 발견하였다. 1992년 생리학 또는 의학 분야에서 노벨상을 수상한 과학자들인 에드먼드 H. 피셔(Edmond H. Fischer)와 에드윈 G. 크렙스 (Edwin G. Krebs)는 세포 내에서 cAMP → PKA(protein kinase A, cAMP 의존성 단백질 키나아제)의 메커니즘을 추가적으로 발견하였다. 또한, 2000년 생리학 또는 의학 분야에서 노벨상을 수상한 과학자인 에릭 칸델(Eric Kandel)은 세포 내에서 cAMP → PKA → CREB(cAMP response element-binding protein, cAMP 반응 요소-결합 단백질)의 메커니즘을 발견하였다. 인체 내에서 cAMP의 관련 기능들과 생리학 및 의학 사이에는 절대적이고 매우 중대한 관계가 있는 것이 분명하다. 가령, 단기 기억과 장기 기억 형성을 위한 메커니즘이 세포 내 "cAMP → PKA → CREB" 신호경로 (2차 전달자 신호전달경로, second messenger signal transduction pathway)에 달려있다는 것을 에릭 칸델이 발견하고, 그것으로 노벨상을 수상한 이래로, 과학자들은 이러한 결과들이 기억력-증진 의약 개발의 열쇠가 된다고 생각해 왔다. 과학자들은 기억력 증진, 학습 능력 증진, 기억 상실증, 치매, 알츠하이머, 파키슨병 등의 신경병성 질병을 예방 및 치료하고, 더 나아가 유기체 내 감소된 cAMP 함량 및 이용률과 관련된 그 외 질병들(예: 우울증)을 예방 및 치료하기 위해, 뇌 세포에서 cAMP → PKA → CREB 신호전달경로를 빠르게 활성화하는 약을 개발하려는 노력과 시도를 지속해왔다. 그러나, 얼 윌버 서덜랜드 주니어가 생리학 및 의학에서 노벨상을 수상한지 30년이 지나도록, 인체에 장기적으로 사용가능하고, 부작용이 적고, 효과가 높은 약이 시중에 판매되고 있지 않다.

현재 기술에 따르면, 가령 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(selective serotonin reuptake inhibitors, SSRIs), 세로토닌-노르에피네프린 재흡수 억제제(serotonin-norepinephrine reuptake inhibitors, SNRIs), 및 노르에피네프린-도파민 재흡수 억제제(norepinephrine-dopamine reuptake inhibitors, NDRIs) 등 시중에 판매 중인 항우울제들은 우울증 없는 사람들에 비해 1차 전달자 신경전달물질의 농도가 낮은 우울증환자들의 인체에서 5-하이드록시트립타민(5-hydroxytryptamine, 5-HT), 노르에피네프린(norepinephrine, NE), 도파민(dopamine, DA) 등의 1차 전달자 신경전달물질의 재흡수를 억제한다. 1차 전달자 신경전달물질과 수용체와의 조합의 농도가 정상 수준에 도달한 다음에는, 환자들의 세포에서 cAMP를 위한 2차 신호전달자 전달물질이 정상 수준으로 생성되게 할 수 있다. 그러나, 높은 부작용과 낮은 치료 관해율 때문에 항우울제가 바람직하지는 않다. 따라서, 건강한 사람이 기억력 증진을 위해 장기간 우울증 약을 복용한다는 보고는 없었다.

미 국립보건원(National Institutes of Health, NIH)의 국립 정신건강원(National Institute of Mental Health, NIMH)에서는 6년간 2800명이 넘는 우울증 환자들을 대상으로 5 가지 대표적인 SSRI 항우울증 약(Celexa®, Zoloft®, Wellbutrin®, Effexor® 및 Buspar®)에 대한 치료 관해율 연구(STAR*D 연구)에 3천5백만 달러를 사용하였다. 이 연구 보고서에 따르면, 각 항우울제의 치료 관해율은 약 30% 밖에 되지 않았으며, 우울증 증세를 완화하는 데는 평균 6-7주가 소요된다. 또한, 시판 중인 항우울증 약들은 자살율 증가, 두통, 현기증, 어지러움증, 불면증, 과수면, 이명, 갈증, 식욕 부진, 식탐, 체중 증가, 혈압 증가, 소화 불량, 역류성 오심, 구토, 식체, 설사, 변비, 다리 통증, 피부 발진, 머뭇거림, 경련, 다한증, 부종, 성욕 상실, 발기 불능 등의 부작용 수치가 다 다르다. 최근, 프로작(Prozac®)과 같은 항우울제는 심각한 사회 문제가 되었다. 2004년, 미 식약청(Food and Drug Administration, FDA)에서는 제약회사들에게 32 개 주요 시판 중인 항우울제들의 제품 라벨에 부작용과 경고문을 분명히 기재해야 한다는 규정을 의무화했으며, 의료진과 간호사들에게도 이러한 약들이 어린이와 청소년들의 자살률을 증가시킬 수 있다고 강조하였다.

그동안 전 세계 제약업계는, 세포내 낮은 cAMP 수치와 관련된 질병들의 예방 및 치료를 위해, cAMP에 대한 세포내 2차 신호전달자 전달물질들의 생성 및 이용률을 더 빠르게 증대시키기 위한, 1차 전달자 신경전달물질의 수용체에 직접 작용할 수 있는, 부작용이 적고 안전하고 더 효과적인 약을 개발하기 위한 지속적인 노력을 해왔다. 포스포디에스테라아제 4(phosphodiesterase 4, PDE4) 억제제인 롤리프람(Rolipram®)은 수용체후 메커니즘 조절 제재(post-receptor mechanism mediated drug)에 속하는데, 실험 결과에 따르면, 세포에서 생성된 cAMP이 PDE4에 의해 분해되기 때문에 롤리프람은 상당한 항우울 효과가 있는 것으로 나타났다. 즉, PDE4를 억제함으로써 cAMP의 이용률이 증가한다. 그러나, 롤리프람은 심각한 구토 증상 등의 부작용을 유발할 수 있기 때문에 널리 사용되지는 않는다.

본 발명자는 종래 기술의 문제점들을 해결하기 위해, 인삼, 리코리스(liquorice, 감초) 그리고 주주바(jujuba, 대추나무 종) 등 천연 식물을 원료로 사용해 의약 조성물을 개발하였다. 이 의약 조성물은 세포내 cAMP의 수준을 증가시킬 뿐 아니라, PDE4를 억제하여 cAMP의 분해를 감소시키고 cAMP의 이용률을 증대시켜 두뇌 내 DA 및 NE 신경전달물질의 농도를 증대시킨다. 이 의약 조성물은 장기적으로 사용하기에 매우 안전하고, 오랜 기간 약을 복용해야 하는 우울증 환자들에게 적합하며, 세포내 낮은 cAMP 수치 및 DA와 NE 신경전달물질의 결함과 관련된 질병들을 예방하고 치료하는데 적합하다. 그러나, 성장 기간, 원산지, 수확기 및 보존 모드, 기후 변화, 온도, 강수량, 태양 노출 등과 같은 인자들의 차이 때문에, cAMP의 생성 및 이용률을 증대시키는데 필요한 천연 물질 1회분 당 구성 성분의 함량은 다를 수 있다. 따라서, 활성 구성 성분들이 확실할수록, 더 많은 양의 활성 구성 성분들을 제어 및 생성할 수 있어 의약 조성물의 효험과 안전성에 있어 1회분 당 일관성이 유지됨으로써 의약 조성물의 품질 관리(즉, 의약 조성물의 화학성, 제조 및 제어(CMC))가 향상된다. 게다가, 활성 구성 성분들 중에서 진세노사이드(ginsenoside)의 유형이 더 확실해진다면, 수득한 원료의 범주가 공급의 저하 없이 더욱 더 확대될 수 있다. 즉, 인삼의 뿌리, 줄기 및 잎 뿐만 아니라, 다른 식물들(삼칠삼(Panax notoginseng) 및 화기삼(Panax quinquefolius))의 뿌리, 줄기 및 잎들이 포함하고 있는 다양한 종류의 진세노사이드도 사용 가능하다.

따라서, 본 발명자는 의약 조성물의 품질 관리(즉 CMC)를 향상시키고 수득한 원료의 원산지를 확대시키기 위해 최초 연구 결과들을 기반으로 확실하게 정의되는 주요 효과적인 구성 성분들을 더 많이 찾기 위한 지속적인 노력을 기울였다. 본 발명자는 확실하게 정의되는 주요 효과적인 구성 성분들이 더 많이 함유된 의약 조성물을 개발했는데, 여기에는 진세노사이드 Rg1과 Rb1, 글리시리진산(glycyrrhizic acid) 또는 글리시레틴산(glycyrrhetinic acid), 및 주주바(jujuba) cAMP가 함유되어 있고, 여기서 의약 조성물은 다수의 타겟을 갖는 수용체후 메커니즘 조절 제재로서, 진세노사이드 Rg1과 Rb1은 뇌 유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)의 발현을 증진시키기 위한 주요 활성 구성 요소들이다.

그러나, 진세노사이드 Rg1과 Rb1 뿐만 아니라, 식물들(인삼, 삼칠삼, 화기삼등)의 뿌리, 줄기 및 잎에 함유된 다른 종류의 진세노사이드를 사용해 진세노사이드 Rg1과 Rb1의 공급/부족을 해결함으로써 상술한 의약 조성물의 효과를 달성하게 되면, 천연 식물들에 포함된 주요 활성 구성 성분들의 이용률을 더욱더 증대시킬 수 있고 가격도 줄어들게 된다. 또한, 상술한 의약 조성물은 감초-관련 산(glycyrrhiza-related acids)을 포함하기 때문에 구토를 잘 일으키는 환자가 감초(liquorice)를 복용했을 때 구토 증상을 유발할 수 있다. 이는 고대 중국의 의사들이 이미 확인한 사실이다.

따라서, 상술한 종래 기술의 한계점을 다루는 것이 본 발명자의 의도이다.

따라서 본 발명은 생체 내 cAMP의 함량과 이용률을 신속하게 증대시키기 위하여, 진세노사이드(Rg1, Rb1 및 Re), 글리시리진산(glycyrrhizic acid) 및 주주바 cAMP를 포함하는 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 생체 내 cAMP의 함량과 이용률을 신속하게 증대시키기 위한 의약 조성물의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

종래 기술의 문제점을 극복하기 위해, 본 발명은 인체 내 cAMP의 함량과 이용률을 빠르게 증대시키기 위해 진세노사이드(Rg1, Rb1 및 Re), 글리시리진산 (glycyrrhizic acid) 및 주주바(대추) cAMP를 포함하는 의약 조성물을 주요 활성 구성 성분으로 사용하여 인체내 cAMP의 함량과 이용률을 빠르게 증대시킨다. 특히, 본 발명은 제품의 안정적인 품질을 제공하고 BDNF의 발현을 증대시킴으로써 천연 식물 내 주요 활성 구성 성분들의 이용률을 더욱더 증대시키고, 비용을 줄이고, cAMP/PKA/CREB 신호전달경로를 증진시킬 수 있는 주요 활성 구성 성분들의 이용률을 더욱 증대시킬 수 있는 경구용 의약제 또는 건강 식품을 기재하고 있다.

본 발명에 따른 의약 조성물의 개념은 본 발명자의 노력의 결과이다. 종래 기술에서는 진세노사이드 Rg1과 Rb1이 유기체 내 BDNF의 발현을 증대시킬 수 있다는 것을 입증했기 때문에, 진세노사이드 Rg1과 Rb1은 관련 의약제의 주요 활성 구성 성분들을 개발하는데 사용될 수 있다. 그러나, 진세노사이드 Rg1과 Rb1은 현재의 기술로는 인공적으로 합성될 수 없고, 이에 따라 인삼, 삼칠삼, 화기삼 등의 천연 식물의 뿌리, 줄기 및 잎에서 추출해야만 한다. 진세노사이드의 종류만 해도 30 종이 넘기 때문에, 천연 식물에서의 주요 활성 구성 성분들의 이용률을 더 증대시키고 비용을 줄이기 위해 본 발명자는 진세노사이드 Re와 진세노사이드 Rg1 및 Rb1을 통합한 후, 글리시리진산(glycyrrhizic acid) 또는 글리시레틴산 (glycyrrhetinic acid) 및 주주바 cAMP를 결합하여 의약 조성물 조성을 위한 주요 활성 구성 성분들을 형성하였다.

본 발명의 의약 조성물을 정상 랫트들(rats)에게 투여하는 실험을 수차례 실시한 결과, 투여 8시간 후에는, 상기 랫트들의 해마에서 cAMP의 농도를 증대시키고, PKA의 활성을 촉진하고, CREB 인산화의 수치를 증진시키고, PDE의 활동을 억제한다는 것이 증명되었다. 만성 반복적 스트레스 실험 결과, 본 의약 조성물을 투여한 마우스들(mice)에서는 cAMP 농도, PKA 활성, CREB 인산화 및 BDNF 발현이 본 의약 조성물을 투여받지 못한 대조군의 마우스들에 비해 상당히 높게 나타났고, "투여된" 마우스들의 해마에서의 cAMP 및 PKA의 발현, 혈청 내 BDNF의 발현 및 시상하부에서의 모노아민 신경전달물질(가령, 5-HT, NE, DA 등)의 발현 또한 "대조군" 마우스들에 비해 상당히 높았다. 따라서, 본 발명의 조성물은 유기체 내 cAMP의 함량과 이용률을 빠르게 증대시킬 수 있음이 증명되었다.

본 발명의 의약 조성물은 종래에 비해 효과가 좋고, 천연 식물 내 주요 활성 구성 성분들의 이용률을 증대시키고, 비용을 감축하며, 품질 관리(즉, CMC)의 효과적인 수행이 가능하다는 것이 분명하다. 따라서, 본 발명의 의약 조성물은 장기적으로 사용하기에 매우 안전하고, 장기적인 투여가 필요한 우울증 환자들을 치료하기에 적합하며, cAMP 및 BDNF의 낮은 발현 및 뇌에서의 DA 및 NE 신경전달물질 부족 등과 관계된 질병들(환자들의 신체 및 세포 내 cAMP 발현이 낮게 나타나는 기억상실증, 치매, 알츠하이머, 파킨슨병 등의 신경병성 질병 및 건선, 암 등의 질병)을 예방하고 치료하는데 적합하기 때문에 전세계 사람들에게 적합하다. 그러나, 본 의약 조성물에는 감초 관련 산이 포함되기 때문에, 구토에 약한 환자가 리코리스(liquorice, 감초)를 섭취할 경우 구토 증상을 일으킬 수 있다(이는 고대 때부터 전통적인 중국 의사들에 의해 확인된 사실이다). 그러나, 전통적인 중국 의사들은 또한 생강이 훌륭한 구토 방지 식품이라는 사실을 확인하였다. 따라서 종래 기술의 단점을 개선하기 위해 본 발명의 의약 조성물에는 생강 분말 또는 생강 추출물이 첨가되었다.

본 발명은 유기체 내 cAMP의 함량과 이용률을 빠르게 증대시키는 의약 조성물을 제공하는데, 이 의약 조성물은 진세노사이드(Rg1, Rb1 및 Re), 글리시리진 산(glycyrrhizic acid), 주주바 cAMP 등을 포함하는 활성 구성 성분들이 함유된 원재료를 사용해 제조된다.

유기체 내 cAMP의 함량과 이용률을 빠르게 증대시킬 수 있는 본 발명의 명세서와 청구항에 기재된 의약 조성물은 본 발명의 핵심 구성이다. 본 발명이 공개되면, 당업자는 일반적인 기술을 사용해 상술한 약을 개선할 수 있을 것이고, 이는 당업자에게는 정기적인 기술 활동이다. 따라서, 모든 대체안도 본 발명의 보호 범위 안에 포함된다.

본 발명에 따른 의약 조성물은, 세포 내 cAMP/PKA/CREB 신호경로 및 BDNF의 수준을 향상시켜 생체 내 cAMP의 함량 및 이용률을 신속하게 증대시킴으로써, 유기체 및 세포 내 cAMP의 낮은 이용률 및 함량으로 인한 질병들을 예방 및 치료하기 위한 의약품, 건강 식품 또는 영양제로서 제조될 수 있는 장점이 있다.

상술한 본 발명의 목적 및 이점들은 아래의 상세한 설명과 첨부된 도면을 바탕으로 할 때 당업자에게 더 명백해질 것이다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예 1에 따른 의약 조성물의 제조 방법을 도시한 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 실시예 2에 따른 의약 조성물의 제조 방법을 도시한 흐름도이다.
도 3은 본 발명의 바람직한 실시예 3에 따른 의약 조성물의 제조 방법을 도시한 흐름도이다.
도 4는 본 발명의 바람직한 실시예 4에 따른 의약 조성물의 제조 방법을 도시한 흐름도이다.
도 5는 랫트들에게 본 의약 조성물을 투여하고 8시간 후, 상기 랫트들의 해마 내 cAMP 수준를 나타낸 그래프이다.
도 6은 cAMP-의존성 PKA의 활성을 도시한 겔 전기영동법(gel electrophoresis) 사진이다 (왼쪽에서 오른쪽 방향으로: 레인 1-4: 식염수, 레인 5-8: 파록세틴, 레인 9-11: 실시예 1, 레인 12: 양성 대조군, 및 레인 13: 음성 대조군)
도 7은 랫트들에게 본 의약 조성물을 투여하고 8시간 후, 상기 랫트들의 해마 내 cAMP-의존성 PKA의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 랫트들에게 본 의약 조성물을 투여하고 8시간 후, 상기 랫트들의 해마 내 p-CREB의 수준을 나타낸 그래프이다.
도 9는 반복적으로 스트레스를 받은 마우스들의 해마에서, 실시예 1이 cAMP 농도에 미치는 영향을 도시한 결과이다.
도 10은 만성적으로 스트레스를 받은 마우스들의 해마에서, 실시예 1이 PKA 활성에 미치는 영향을 도시한 결과이다.
도 11은 만성적으로 스트레스를 받은 마우스들의 해마에서, 실시예1이 CREB 인산화에 미치는 영향을 도시한 결과이다.
도 12는 만성적으로 스트레스를 받은 마우스들의 해마에서, 실시예1이 BDNF 수준에 미치는 영향을 도시한 결과이다.

이하, 아래의 실시예들을 참조로 본 발명을 더 구체적으로 설명한다. 주지할 사실은, 본 발명의 바람직한 실시예들에 대한 아래의 설명은 단지 도시와 설명을 목적으로 한 것으로, 기재된 형태로만 정확히 제한되거나 국한할 목적으로 사용되지 않는다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 기술 개념은 아래와 같이 구체적으로 기재되었다.

본 발명은 유기체 내 cAMP의 함량과 이용률을 빠르게 증대시키는 의약 조성물에 관한 것으로, 상기 의약 조성물은 진세노사이드(Rg1, Rb1 및 Re), 글리시리진산 및 주주바 사이클릭 아데노신 일인산(주주바 cAMP)을 포함하는 주요 활성 구성 성분들을 이용하여 제조된다.

예 1:

유기체 내 cAMP의 함량과 이용률을 빠르게 증대시키기 위한 본 발명의 의약 조성물은 진세노사이드(Rg1, Rb1 및 Re), 글리시리진산(glycyrrhizic acid) 또는 글리시레틴산(glycyrrhetinic acid), 및 주주바 cAMP를 포함하는 원재료를 사용해 제조된다.

예 2:

유기체 내 cAMP의 함량과 이용률을 빠르게 증대시키기 위한 본 발명의 의약 조성물은 2 내지 26 중량부의 진세노사이드(Rg1, Rb1 및 Re), 3 내지 48 중량부의 글리시리진산(glycyrrhizic acid) 또는 글리시레틴산(glycyrrhetinic acid), 및 0.002 내지 0.5 중량부의 주주바 cAMP를 포함하는 원재료를 사용해 제조된다.

예 3:

유기체 내 cAMP의 함량과 이용률을 빠르게 증대시키기 위한 본 발명의 의약 조성물은 4 내지 13 중량부의 진세노사이드(Rg1, Rb1 및 Re), 5 내지 16 중량부의 글리시리진산(glycyrrhizic acid) 또는 글리시레틴산(glycyrrhetinic acid), 및 0.01 내지 0.1 중량부의 주주바 cAMP를 포함하는 원재료를 사용해 제조된다.

예 4:

본 발명의 의약 조성물은 생강수 추출물을 더 포함한다.

예 5:

본 발명의 의약 조성물은 약리학적으로 수용 가능한 담체 또는 첨가물을 포함할 수 있고, 정제, 캡슐, 분말 등 약학적으로 알려진 경구용 제형으로 제조될 수 있다.

예 6:

본 발명의 의약 조성물은 유기체 내 cAMP의 함량 및 이용률을 빠르게 증대시키기 위한 의약품, 건강 식품, 또는 영양 보조제로서 제조될 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 본 의약 조성물의 제조 방법은 아래와 같다.

방법 1:

인삼, 리코리스(liquorice) 및 주주바(jujuba, 대추)에서 각각 추출한 진세노사이드(Rb1, Rb1, 및 Re), 글리시리진산(또는 글리시레틴산) 및 주주바 cAMP는 유기체 내 cAMP의 함량 및 이용률을 빠르게 증대시키기 위한 본 발명의 의약 조성물로 제조되기 위한 원재료로서 작용한다. 또는, 진세노사이드(Rb1, Rb1 및 Re), 글리시리진산(또는 글리시레틴산) 및 주주바 cAMP를 함유하도록 제조된 원재료는 본 발명의 의약 조성물로서 제조된다.

방법 2:

본 발명의 의약 조성물은 2 내지 26 중량부의 진세노사이드(Rb1, Rb1 및 Re), 3 내지 48 중량부의 글리시리진산(또는 글리시레틴산), 및 0.002 내지 0.5 중량부의 주주바 cAMP를 함유하는 원재료를 이용하여 제조된다.

방법 3:

본 발명의 의약 조성물은 4 내지 13 중량부의 진세노사이드(Rb1, Rb1 및 Re), 5 내지 16 중량부의 글리시리진산(또는 글리시레틴산) 및 0.01 내지 0.1 중량부의 주주바 cAMP를 함유하는 원재료를 이용하여 제조된다.

방법 4:

본 발명의 의약 조성물은 생강수 추출물을 더 포함한다.

방법 5:

방법 6:

본 발명의 유기체 내 cAMP의 함량과 이용률을 빠르게 증대시키기 위한 건강 식품 또는 영양 보조제는 식품 관리 표준 또는 건강 식품 생산/제조 표준에 따라 원재료를 사용해 제조된다.

<바람직한 실시예>

이하, 도면들과 바람직한 실시예들을 바탕으로 본 발명을 설명한다.

실시예 1:

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예 1에 따른 의약 조성물 제조 방법을 도시한 흐름도이다. 도 1에서, 인삼 40kg을 절단한 후, 70% 에탄올 용액으로 열추출하였다. 에탄올 추출물은 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)를 통해 분리 및 정제된 후 건조하여, 270g의 진세노사이드 Rg1+Rb1+Re(약 48.4g의 Rg1, 약 176.9g의 Rb1 및 약 44.7g의 Re)가 함유된 인삼 추출물 1.42kg을 수득하였다(단계 101). 또한, 리코리스 15kg을 절단한 후, 12시간 동안 실온에서 침지 하였다. 침지된 리코리스는 전출(decoction) 및 알코올 침전(sedimentation)을 통해 추출한 후, 농축 및 건조하여 307g의 글리시리진산이 함유된 리코리스 추출물 3.1kg을 수득하였다(단계 102). 또한, 주주바 10kg을 절단하여 실온에서 물에 침지한 후, 침지된 주주바는 전출 및 알코올 침전을 통해 추출하여 주주바 추출물을 수득하고, 수득된 주주바 추출물은 OU-2 및 ME-2 매크로포러스(macroporous) 수지를 순차적으로 사용해 추가적으로 흡수 및 분리한 후, 건조시켰다. 0.752g의 주주바 cAMP가 함유된 주주바 추출물(40g)이 수득되어 본 발명의 의약 조성물을 제조하기 위한 원재료 역할을 한다(단계 103). 그런 다음, 상술한 방법에 의해 수득한 114g의 인삼 추출물, 300g의 리코리스 추출물 및 3.6g의 주주바 cAMP를 분쇄 및 혼합하여 본 발명의 예 1에 따른 (27.4g의 진세노사이드 Rg1+Rb1+Re, 29.7g의 글리시리진산 및 0.067g의 주주바 cAMP가 함유된) 447.6g의 의약 조성물을 수득하였다(단계 104).

실시예 2:

도 2는 본 발명의 바람직한 실시예 2에 따른 의약 조성물의 제조 방법을 도시한 흐름도이다. 도 2에서, 실시예 1에서 수득한 120g의 인삼 추출물(단계 201), 200g의 리코리스 추출물(단계 202) 및 0.5g의 주주바 추출물(단계 203)을 분쇄 및 혼합하여 본 발명의 예 2에 따른 (22.8g의 진세노사이드 Rg1+Rb1+Re, 19.8g의 글리시리진산 및 0.009g의 주주바 cAMP이 함유된) 의약 조성물 320.5g을 수득하였다(단계 204).

실시예 3:

도 3은 본 발명의 바람직한 실시예 3에 다른 의약 조성물의 제조 방법을 도시한 흐름도이다. 도 3에서, 실시예 1에서 수득한 3.6g의 순도 90%의 제조된 진세노사이드 Rg1(단계 301), 3.2g의 순도 90%의 제조된 진세노사이드 Re(단계 302), 15.6g의 순도 90%의 제조된 진세노사이드 Rb1(단계 303), 26g의 순도 96%의 글리시레틴산(단계 304) 및 10g의 주주바 추출물(단계 305)을 분쇄 및 혼합하여 본 발명의 예 3에 따른 (22.4g의 진세노사이드 Rg1+Rb1+Re, 26g의 글리시리진산 및 0.188g의 주주바 cAMP이 함유된) 의약 조성물 58.4g을 수득하였다(단계 306).

실시예 4:

도 4는 본 발명의 바람직한 실시예 4에 따른 의약 조성물 제조 방법을 도시한 흐름도이다. 도 4에서, 실시예 1에서 수득한 본 발명의 예 1에 따른 의약 조성물 100g(단계 401) 및 시중에서 구입 가능한 생강 추출물 35g(단계 402)을 혼합하여 본 발명의 예 4에 따른 의약 조성물 135g을 수득하였다(단계 403).

실험 1: 정상 랫트들에게 실시예 1 의약 조성물을 투여하고 8시간 후 cAMP/PKA/CREB 신호전달경로에 미치는 영향을 알아보기 위한 동물 실험

정상 랫트들에게 실시예 1의 의약 조성물을 위내 투여하고 8시간 후, 그들의 해마를 채취하였다. 해마 내 cAMP 및 인산-CREB(p-CREB) 수치의 변화는 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 사용하여 측정되었고, cAMP-의존성 PKA 활성의 변화는 생물발광 분석법(bioluminescent assay)을 사용하여 측정되었으며, PDE 활성의 변화는 형광법(fluorescence method)을 통해 측정되었다. 실시예 1의 의약 조성물을 투여하고 8시간 후, 분자 약리학적 메커니즘이 나타났는데, 이는 cAMP 농도가 단기간 상승함으로써 cAMP-의존성 PKA 활성이 향상되어, 해마 내 CREB 인산화 수치를 증대시키고 PDE 활성을 억제시켰다. 이 실험 데이터는 오리진 프로 7.5 소프트웨어(Origin Pro 7.5 software)를 사용하여 통계적으로 분석하여 도표로 나타내었다.

1. 실험 재료

1.1 실험 동물: 체중 180 내지 200g의 건강한 수컷 SD 랫트 70 마리를 베이징 바이탈 리버 래보라토리즈(Vital River Laboratories, VRL)에서 구입하였다.

1.2 시약: 양성 대조약: 항우울 파록세틴 하이드로클로라이드(로트 번호: 08030078, 종 메이 티엔진 스미스 클라인 제약회사(Zhong Mei Tianjin Smith Kline pharmaceuticals Co. Ltd.); 파라미터^TM 사이클릭 AMP 어세이 키트(Parameter^TM Cyclic AMP Assay Kit), KGE002(미국 R&D 시스템즈 주식회사(R&D Systems, Inc.)); 듀오세트 IC 인간/마우스/랫트 인산-CREB(Duoset IC Human/Mouse/Rat Phospho-CREB) (S133) ELISA 키트, DYC2510-2(미국 R&D 시스템즈 주식회사); cAMP-의존성 단백질 키나아제 키트의 비방사상 탐지용 펩태그

어세이(PepTag

Assay for Non-Radioactive Detection of cAMP-Dependent Protein Kinase Kit), V5340(미국 프로메가 코포레이션(Promega Corporation); PDE-GLO^TM 포스포디에스테레아제 어세이 키트(PDE-Glo^TM Phosphodiesterase Assay Kit), V1361(미국 프로메가 코포레이션); 피어스^TM BCA 단백질 어세이 키트(Pierce^TM BCA Protein Assay Kit), 23227, (미국 피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology)); cAMP 및 아데노신 등의 표준들은 중국 국립 식약관리국(National Institutes for Food and Drug Control)에서 구입하였다; NaH₂PO4, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, KCl, NaCl, MgCl₂, Tris Base, Tris-HCl은 세포 배양용 생화학 시약으로 미국 시그마(Sigma)에서 구입하였다; E-64, 아프로티닌(aprotinin), 류펩틴(leupeptin), 펩스타틴(pepstatin) A, 페닐메틸술포닐 플로라이드 (phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF), NaF, 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (ethylene glycol tetraacetic acid, EGTA), 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT), NaVO₄, 피로인산나트륨(sodium pyrophosphate), 아가로스(agarose), 글리세롤(glycerol) 등은 고순도급으로 캐나다 바이오베이직 주식회사(BioBasic Inc.)에서 구입하였다; 아세토니트릴(acetonitrile) 및 메탄올(methanol) (HPLC급, 독일 메르크 앤 코 주식회사(Merck & Co., Inc.)); 초순도수 (밀리-Q

순수(純水)); 및 실시예 1의 의약 조성물.

1.3 실험 장비: 플렉스스테이션

(FlexStation

) 3 멀티-모드 마이크로 플레이트 리더(미국 몰리큘러 디바이시즈 코포레이션(Molecular Devices Corp.)); 워터스

(Waters

) 600E 고성능 액체 크로마토그래피(4기 펌프, 온라인 디개서(degasser), 자동샘플러(autosampler), 컬럼 오븐(column oven), 및 UV 탐지기 포함; 미국 워터스 코포레이션(Waters Corp.) 포함); 냉동 원심분리기(미국 백맨 콜터 주식회사(Backmen Coulter, Inc.)); 전자 초음파 균질기(electronic ultrasonic homogenizer) (Ultrasound Technology Inc., U.S.); 전기영동 장치(electrophoresis apparatus) (중국 베이징 리우이 인스트라먼트 팩토리(Beijing Liuyi Instrument Factory)); 겔 이미져(gel imager) (SYN GENE); 초저온 냉동기 (일본 산요 전기 코포레이션 주식회사(SANYO Electric Co., Ltd.)); 및 엠라인 단일-채널 피펫(mLine single-channel pipette) 및 8-채널 피펫(핀란드 Biohit).

2. 투여

3일간의 적응적 급식 후, 랫트들을 무작위로 3개 그룹으로 분류한 뒤, 각각 그룹 A-식염수(saline), 그룹 B-파록세틴(Paroxetine), 및 그룹 C-실시예 1의 라벨을 부착하였다. 파록세틴 하이드로클로라이드 정제를 으깨서 초순수를 사용해 특정 농도의 현탁액으로 만들었고, 랫트 한 마리당 위내 투여량은 5mg/kg였다. 실시예 1의 의약 조성물은 초순수를 사용해 특정 농도의 용액으로 만들었고, 랫트 한 마리당 위내 투여량은 50mg/kg였다. 식염수 그룹의 랫트들에는 동일 용적 0.9%의 식염수를 투여하였다. 모든 랫트들은 투여 전에 무게를 재고 피크르산(picric acid)으로 표시했고, 모든 약은 30분간 37℃의 열로 전처리한 후 투여하였다.

3. 조직 채취

그룹 A, B, C의 실험 랫트들에게 약을 투여하고 8시간 후, 모든 랫트들을 에틸 에테르로 마취한 후 고동맥에서 출혈을 일으킴으로써 희생시켰다. 머리에서 뇌를 제거하여 얼음에 넣고, 해마를 채취하여 세 부분으로 나누었다. 색이 있는 스크류 캡을 갖는 1.5-mL짜리 동결 튜브에 상기 세 부분을 각각 넣은 후, 미리 라벨을 부착하고, 정확한 무게를 재고, 15분간 액체 질소에서 급냉각한 후, 추후 사용을 위해 -80℃의 냉장고에 보관하였다.

4. 표본 측정

4.1 랫트의 해마 내 cAMP 수치 측정: 해마 조직 표본은 해동하여 소량의 식염수로 세척한 후, 키트(kit)에서 제공된 세포 용해 용액을(사용을 위해 농축액을 5배 희석함) 1:20(중량: 부피(g:mL))의 비율로 첨가하였다. 표본을 30초간 전자 초음파 균질기에서 균질하고, 4℃에서 5분간 10000rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 1.5-mL의 색이 있는 에펜도르프(Eppendorf)에 넣은 후, 미리 라벨을 부착하고, 실험을 위해 아이스박스에 보관하였다. 표본은 파라미터^TM 사이클릭 AMP 어세이 ELISA 키트(미국 R&D 시스템즈 주식회사)를 사용해 측정되었다. 표본을 실온에서 서리 제거한 후, 표본 내 cAMP의 수치는 경쟁력 있는 ELISA를 사용해 측정하였다. 표본의 광학 밀도(optical density, OD)는 멀티-모드 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 측정되었고, 표본 내 cAMP의 수치는 표준 곡선에 따라 계산되었다.

4.2 랫트의 해마 내 cAMP-의존성 PKA의 활성의 측정: 해마 조직의 표본을 해동하여 소량의 식염수로 세척한 후, (제조업자의 메뉴얼에 있는 제조법에 따라 제조된) PKA 추출 버퍼(extraction buffer)를 1:10(중량: 부피 (g:mL)) 비율로 첨가하였다. 표본을 30초간 전자 초음파 균질기에서 균질화하고 4℃에서 5분간 1000rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 1.5 -mL의 색이 있는 에펜도르프(Eppendorf)로 옮긴 뒤 미리 라벨을 부착한 후 실험을 위해 아이스박스에 보관하였다. 표본은 cAMP-의존성 단백질 키아나제 키트(미국 프로메가 코포레이션)의 비방사성 탐지용 펩태그®를 사용해 측정하였다. 키트 안의 취급 설명서에 따르면, 기혼합된 시약을 200-μL 의 8-튜브 PCR 튜브들에 첨가한 후 미리 라벨을 부착했고, 각각의 표본 9μL을 해당 튜브에 첨가하였다. 튜브를 흔들고(vortex), 원심분리한 뒤 30분간 반응시킨 후, 효소를 불활성화하기 위해 5분간 98℃에서 PCR 기계에 넣어두었다. 취급 설명서에 따라 양성 대조군 및 음성 대조군을 실험 대상 표본들과 함께 측정하였다. 0.8% 아가로오스(agarose gel)을 준비한 후 효소 불활성화한 각각의 표본을 아가로오스 겔의 구멍에 주입한 다음, 30분간 100V 및 130mA에서 전기 영동을 실시하였다. 전기 영동 버퍼는 50mM Tris-HCI(pH 8.0) 버퍼를 사용하였다. 전기 영동 후, 아가로오스 겔을 장치에서 제거한 후 겔 이미져(gel imager)로 촬영하였다. 아가로오스 겔을 UV 분석기 위에 놓고, 인산화된 펩태그 A1 펩타이드 스팟(PepTag A1 Peptide spots)들을 절단하여 색이 있는 스크류캡을 갖는 1.5-mL 동결 튜브에 넣고 미리 라벨을 부착하였다. 아가로오스 겔에 열을 가하여 녹인 후, 부피가 250μL가 되도록 순수를 첨가하였다. 125μL의 고온 아가로오스를 또 다른 1.5mL의 에펜도르프에 재빨리 옮긴 뒤 미리 라벨을 부착하고, 75μL의 겔 이용률 용액 및 50μL의 빙초산을 첨가하였다. 혼합물을 흔들어(vortext) 혼합한 후, 96-웰(well) 마이크로티터 플레이트(microtiter plate)에 200μL의 혼합물을 첨가하였다. 음성 대조군에서 양성 전극을 향한 아가로오스는 블랭크(blank)였다. 형광분석은 멀티-모드 마이크로 플레이트 리더 상에서 586nm의 여기 파장과 592nm의 방출 파장에서 실시하였다. 표본의 형광 강도는 PKA 활성을 의미한다.

4.3 랫트의 해마 내 p-CREB 수치 측정: 듀오세트 IC 인간/마우스/랫트 인산-CREB (S133) ELISA 키트(DuoSet IC Human/Mouse/Rat Phospho-CREB (S133) ELISA Kit) (미국 R&D 시스템즈 주식회사(R&D Systems, Inc.))를 사용하여 표본들을 측정하였다. 해마 조직 표본을 해동한 후 소량의 식염수로 세척하고, (제조업자의 메뉴얼에서 IC 희석제(Diluent) #6에 따라 제조된) 조직 균질화 용액을 1:20(중량: 부피(g:mL))의 비율로 첨가하였다. 혼합물을 30초간 전자 초음파 균질기에서 균질화한 후, 4℃에서 5분간 10000rpm에서 원심분리하고, 상청액을 1.5-mL의 색이 있는 에펜도르프로 옮긴 뒤, 미리 라벨을 부착하고 실험을 위해 아이스박스에 보관하였다. 표본의 p-CREB 수치는 키트 내 취급 메뉴얼에 따라 샌드위치(sandwich) ELISA를 사용해 측정하였다. 표본의 OD 수치는 멀티-모드 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 측정하였고, 표본 내 p-CREB의 수치는 표준 곡선에 따라 계산하였다.

4.4 랫트의 해마 내 총 단백질 측정: 표본에 포함된 단백질 1 밀리그램 당 p-CREB 단백질의 양을 정확히 계산하기 위해서는 표본 내 총 단백질의 양을 측정하는 것은 중요하다. p-CREB 측정 실험에서 조직을 균질화하고 원심분리한 후 상청액은 PBS로 25번 희석하여 실험 표본을 형성하였다. 피어스^TM BCA 단백질 어세이 키트(Pierce^TM BCA Protein Assay Kit) 내 취급 메뉴얼에 따라, 표본의 OD 수치는 멀티-모드 마이크로 플레이트 리더를 사용해 450nm에서 측정하였고, 소혈청 알부민 (bovine serum albumin, BSA)을 표준용액으로 사용하였다. 표본 내 총 단백질의 양은 표준 곡선에 따라 측정하였다.

4.5 PDE 활성 측정: 랫트의 해마 내 PDE 활성에 대한 실시예 1의 의약 조성물의 영향은 PDE-글로^TM 포스포디에스테라아제 어세이 키트(PDE-Glo^TM Phosphodiesterase Assay Kit) (미국 프로메가 코포레이션(Promega Corporation))를 사용하여 측정하였다.

4.5.1 의료용 용액의 제조: 실시예 1의 의약 조성물은 0.02mg/ml, 0.05mg/ml, 및 0.1mg/ml 농도로 제조하였다.

4.5.2 표본의 제조: 특정 양의 해마 조직을 소량의 식염수로 세척한 후, PDE-글로^TM 반응 버퍼(PDE-GloTM Reaction Buffer) (40mM의 Tris-HCl, 10mM의 MgCl₂, 1mM의 PMSF를 첨가한 0.1mg/ml의 소혈청 알부민(BSA), 2μM/mL의 류펩틴, 2μM/mL의 아프로티닌(aprotinin), 및 2μM/mL의 E-64)를 1:10(중량: 부피(g:mL))의 비율로 첨가하였다. 혼합물을 전자 초음파 균질기를 사용해 균질화하고 4℃에서 5분간 10000rpm에서 원심분리한 후, 획득한 상청액은 효소용액으로 사용하였다.

4.5.3 생물발광 어세이의 프로토콜: 프로토콜은 취급 메뉴얼에 제공된 방법에 따라 실시하였다. 효소 반응액의 경우, 1μL의 의료 용액을 1.5μL의 효소 용액에 첨가하여 총 부피 2.5μL를 형성하였다. 2μmol의 cAMP가 함유된 2.5μL의 기질 용액을 2.5μL의 혼합물에 첨가한 후, 반응 혼합물을 혼합하여 30분간 37℃에서 반응시켰다. 그런 다음, (강력한 PDE 억제제인) 3-이소부틸-ㅣ-메틸크산틴(IBMX)가 함유된 정지 용액(stop solution) 2.5μL를 첨가하여 혼합하였다. 실험 용액 2.5μL을 첨가하여 혼합하고, 반응 혼합물은 20분간 실온에서 반응시켰다. 마지막으로, 발광 시약 10μL를 반응 혼합물에 첨가한 후, 10분간 실온에서 반응시켰다. 멀티-모드 마이크로 플레이트 리더를 사용해 생물발광을 측정하였다.

5. 실험 결과

5.1 랫트의 해마 내 cAMP의 수준: 랫트 해마의 균질액에서의 cAMP 농도는 ELISA 어세이로 측정하였고, 해마 조직에 함유된 cAMP 수치는 측정된 조직 표본의 무게를 cAMP 농도로 나눈 값을 통해 얻었으며, pmol/g 조직으로 나타내었다(도 5 참조).

도 5를 참조로, 실시예 1 그룹의 랫트의 해마 조직 내 cAMP 수치는 식염수 그룹과 파록세틴 그룹에 비해 크게 증가하였다(*P<0.05, n=10).

5.2 랫트의 해마 내 cAMP-의존성 PKA의 활성: 효소 반응 후, 먼저 표본들을 아가로오스 겔 상에서 전기 영동한 다음, 겔 이미져로 현상하여 분석해 보았다.

도 6을 참조로, 인산화된 A1 펩타이드는 음성 전하를 가지며 양성 전극을 향해 이동하는 한편, 비인산화된 A1 펩타이드는 양성 전하를 가지며 음성 전하를 향해 이동한다. 이 두 펩타이드들은 서로 분리되었다. (양성 전극을 향해 이동하는)인산화 A1 펩타이드 스팟의 밝기가 더 강하면, 인산화의 수치 및 cAMP-의존성 PKA의 활성이 더 높다는 것을 의미한다. 도 6에서는 실시예 1 그룹의 스팟의 밝기가 식염수 그룹과 파록세틴 그룹보다 강하다.

아가로오스 겔의 스팟들을 절단하여 녹인 후, 녹은 겔의 부피를 측정하였다. 랫트의 해마 내 cAMP-의존성 PKA의 활성은 형광 어세이를 통해 측정하여, 형광 강도로 나타내었다(도 7 참조).

도 7을 참조로, 투여 8시간 후, 실시예 1 그룹의 랫트의 해마 내 cAMP-의존성 PKA의 활성은 블랭크 대조군 및 파록세틴 그룹에 비해 크게 증가하였다(*P<0.05, n=10).

5.3 랫트의 해마 내 p-CREB이 수준: 랫트의 해마 표본의 균질액의 총 단백질 농도는 BCA 방법을 사용하여 총 단백질 μg 당 p-CREB의 양으로 평가하였다. 그런 다음, 랫트의 해마 표본의 균질액 내 p-CREB 농도는 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정되었고, p-CREB(pg)/총 단백질(μg)은 랫트의 해마 내 p-CREB의 수준을 나타낸다(도 8 데이터 참조).

도 8을 참조로, 투여 8시간 후, 실시예 1 그룹의 랫트의 해마 내 p-CREB 수준은 식염수 그룹 및 파록세틴 그룹에 비해 크게 상승하였다(n=10).

5.4 랫트의 해마 내 PDE 활성에 대한 의약 조성물의 영향: 랫트의 해마 내 PDE의 활성 및 시험관내(in vivo) 투여 후 PDE 활성에 대한 억제는 생물발광 어세이를 사용하여 측정하였다. 발광 강도는 PDE 활성을 나타낸다. 대조군에 비해, 발광 강도가 높으면 PDE 활성이 높은 것을 나타내고, 발광 강도가 낮으면 PDE 활성이 억제되었음을 나타낸다. 측정된 결과에 따르면 실시예 1 그룹의 의약 조성물 (0.5mg/ml)은 블랭크 대조군에 비해 랫트의 해마 내 PDE 활성을 유의적으로 억제하였다(*P<0.05, n=4).

6. 결론

(1) 랫트의 위내에 의약 조성물을 투여하고 8시간 후, 식염수 그룹과 파록세틴 그룹에 비해, 실시예 1 그룹 랫트의 해마 내 cAMP의 수치는 상당히 증가하였고, cAMP-의존성 PKA 활성은 현저히 향상되었으며, p-CREB 수치 또한 증가하였다.

(2) 상기 실험들은 실시예 1에 따른 의약 조성물이 투여 8시간 후 2차 전달자 cAMP 신호경로를 통해 그 약리학적 기능들을 수행할 수 있고, cAMP-PKA-CREB(p-CREB) 경로를 빠르게 촉발할 수 있음을 증명한다(유의적인 차이(*P<0.05)는 식염수 그룹과 파록세틴 그룹의 비교에 의해 수득되었다).

(3) 투여 8시간 후, 양성 대조약, 파록세틴은 cAMP-PKA-CREB(p-CREB) 경로를 촉발할 수 없었다.

(4) 실험 결과는 또한 PDE 활성이 실시예 1의 중간 투여량에 의해 상당히 억제됨을 보여주었다. PDE는 cAMP에 대한 불활성 효소이기 때문에, PDE의 억제는 랫트의 해마 내 cAMP의 수준을 증가하게 할 수 있다.

실험 2: 만성 스트레스 마우스들에게 실시예 1 의약 조성물을 10일간 투여한 후 cAMP / PKA / CREB 신호전달경로 및 BDNF 발현에 미치는 영향에 대한 동물 실험

1. 실시예 1 의약 조성물이 반복적 스트레스를 받은 마우스들의 해마 내 cAMP 농도에 미치는 영향(도 9 참조):

도 9의 결과는 실시예 1의 의약 조성물을 투여받은 마우스들의 해마 내 cAMP 농도가 투여받지 않은 대조군에 비해 상당히 높음을 보여준다(*P<0.05).

2. 반복적으로 스트레스를 받은 마우스들의 해마 내 PKA 활성에 대한 실시예 1 의약 조성물의 효과(도 10 참조):

도 10의 결과는 실시예 1의 의약 조성물을 투여받은 마우스들의 해마 내 PKA 활성이 투여받지 않은 대조군에서보다 현저히 높다는 것을 보여준다(*P<0.05).

3. 실시예 1 의약 조성물이 반복적 스트레스를 받은 마우스들의 해마 내 CREB 인산화에 미치는 영향(도 11 참조):

도 11의 결과는 실시예 1의 의약 조성물을 투여받은 마우스들의 해마 내 CREB 인산화 발현이 투여받지 않은 대조군에 비해 현저히 높다는 것을 보여준다.

4. 반복적으로 스트레스 받은 마우스들의 해마 내 BDNF 발현에 미치는 실시예 1 의약 조성물의 영향(도 12 참조):

도 12의 결과는 실시예 1의 의약 조성물을 투여받은 마우스들의 해마 내 BDNF 발현이 투여받지 않은 대조군에 비해 상당히 높다는 것을 보여준다.

실험 3: 만성적으로 스트레스 받은 랫트들에게 실시예 1의 의약 조성물을 12일간 투여한 후 해마의 cAMP 및 PKA , 혈청 BDNF , 및 시상하부 NE , DA 및 5- HT 의 발현에 미치는 영향에 대한 동물 실험

1. 실시예 1 의약 조성물이 만성적으로 스트레스를 받은 랫트들의 해마 내 cAMP 농도에 미치는 영향(표 1 참조).

그룹별 랫트들의 해마 및 피질 내 cAMP 발현

그룹	표본 크기	투여량 (mg/kg/d)	해마 (pmol/ml)	피질 (pmol/ml)
정상	8	-	72.650±2.9017	67.650±4.0715
대조군	8	-	64.950±7.6459	57.825±5.8004
많은 양의 실시예 1	8	60	69.887±7.2155	66.850±5.0844
중간 양의 실시예 1	8	30	71.400±6.0233	66.975±6.6626
적은 양의 실시예 1	8	15	69.113±5.4286	65.388±8.0920

2. 만성적으로 스트레스 받은 랫트들의 해마 내 PKA 수준에 미치는 실시예 1 의약 조성물의 영향(표 2 참조).

그룹별 랫트들의 해마 내 PKA 수치

그룹	샘플 크기	투여량 (mg/kg/d)	해마 (pmol/ml)
정상	8	-	26.4988±2.75623
대조군	8	-	21.4936±3.01990
많은 양의 실시예 1	8	60	25.8763±3.48088
중간 양의 실시예 1	8	30	25.9150±4.77464
적은 양의 실시예 1	8	15	26.0025±4.87687

3. 만성적으로 스트레스 받은 랫트들의 혈청 BDNF 수준에 대한 실시예 1 의약 조성물의 영향(표 3 참조).

그룹별 랫트들의 혈청 BDNF 수치

그룹	샘플 크기	투여량 (mg/kg/d)	BDNF (pg/ml)
정상	8	-	111.00±45.28
대조군	8	-	72.57±19.49
적은 양의 실시예 1	8	15	102.90±18.70
중간 양의 실시예 1	8	30	110.14±31.64
많은 양의 실시예 1	8	60	91.53±39.93

4. 만성적으로 스트레스 받은 랫트들 시상하부의 모노아민 신경전달물질의 발현에 대한 실시예 1 의약 조성물의 영향(표 4 참조).

그룹별 랫트들의 시상하부 내 모노아민 신경전달물질의 발현

그룹	표본 크기	투여량 (mg/kg/d)	5HT (ng/g wet tissue)	NE (ng/g wet tissue)	DA (ng/g wet tissue)
정상	11	-	1038.03±458.63	4254.74±1334.95	546.04±329.18
대조군	11	-	324.22 ±89.44	2572.61±707.43	229.40±109.74
적은 양의 실시예 1	11	15	990.45±261.38	4128.42±1608.56	477.27±274.74
중간 양의 실시예 1	11	30	857.52±273.55	3822.10±1295.65	473.60±269.23
많은 양의 실시예 1	11	60	857.28±293.29	3566.67±501.30	373.03±141.25

5. 결론

실시예 1의 의약 조성물을 투여받은 랫트들 해마의 cAMP 및 PKA, 혈청 BDNF, 및 시상하부 모노아민 신경전달물질(5-HT, NE 및 DA)의 발현은 투여받지 않은 대조군보다 유의적으로 높았다(*P<0.05).

실험 4: 실시예 1의 항우울 약역학에 대한 동물 실험

1. 동물 행동 실험

본 발명자는 병원성 메커니즘 및 우울증의 임상적 징후들에 따른, 마우스들에 대한 꼬리-걸기(tail-hang) 실험, 랫트들에 대한 강제-수영 실험, 마우스들에 대한 강제-수영 실험, 랫트들에 대한 예측불가 장기 자극 실험, 랫트 등에 대한 후각신경구장애 실험을 포함하는 동물 행동 실험을 실시하였다.

1.1 실시예 1의 의약 조성물을 마우스들에게 20mg/kg/d, 40mg/kg/d 및 80mg/kg/d (랫트들의 경우 15mg/kg/d, 30mg/kg/d 및 60mg/kg/d)를 위내에 1주일간 투여하고 실험적 우울증에 대한 효과를 측정하였다. 여기서, 중간 투여량 그룹 (마우스의 경우 40mg/kg/d, 랫트의 경우 30mg/kg/d)과 양성 대조군(파록세틴)에서는 꼬리-걸린 마우스들, 강제-수영 마우스들, 및 강제-수영 랫트들에 대한 비이동 시간이 상당히 짧았다. 데이터에 따르면 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있는 차이를 보인다(P<0.05>).

1.2 실시예 1의 의약 조성물을, 만성 예측불가한 미약한 스트레스(chronic unpredictable mild stress, CUMS) 모델 랫트들에게 15mg/kg/d, 30mg/kg/d 및 60mg/kg/d를 위내에 21일간 연속으로 투여하였다. 결과에 따르면, 정상 그룹에 비해, CUMS 모델 랫트 그룹의 체중은 서서히 증가하였고, 자당(sucrose) 소비가 상당히 감소하였으며(P<0.01), 수평 이동과 수직 이동이 상당히 감소하였고(P<0.01), 랫트 점핑 시도에서의 오류 횟수가 상당히 증가하였다(P<0.01). 대조군에 비해, 적은 투여량의 실시예 1 그룹과 양성 그룹(파록세틴)의 경우 체중 증가가 상당하였고, 양쪽 그룹 모두 자당 소비도 현저히 증가하였고(P<0.01), 양쪽 그룹 모두 수평 이동과 수직 이동도 상당히 증가했으며(P<0.01), 양쪽 그룹 다 랫트 점핑 시도 시 오류 횟수가 상당히 감소하였다(적은 투여량 그룹 P<0.01, 양성 그룹(파록세틴) P<0.01).

1.3 실시예 1의 의약 조성물을, 후각신경구장애 모델 랫트들에게 15mg/kg/d, 30mg/kg/d 및 60mg/kg/d를 위내 24일간 연속으로 투여하였다. 오픈 필드 박스 실험(open field box test)에서는, 대조군에 비해, 많은 투여량의 실시예 1의 경우, 후각신경구장애에 의한 수평 이동과 수직 이동의 감소를 상당히 개선하였다. 양성 대조군(3mg/kg/d의 파록세틴) 또한 후각신경구장애에 의한 수평 이동 및 수직 이동의 감소를 크게 향상시켰다. 수동적 회피 실험(passive avoidance experiment)에서는, 대조군에 비해 많은 투여량 및 중간 투여량의 실시예 1의 경우, 후각신경구장애에 의한 랫트 연구 및 기억 용량의 감소를 상당히 향상시켰다.

2. 상호작용 모델에 대한 동물 실험

본 발명자는 병원성 메커니즘 및 우울증의 임상적 징후들에 따른, 레서핀(reserpine)-유도 모델 실험(체온 저하, 운동 불능 및 안검하수)을 포함한 동물 행동 실험을 마우스들에게, 세로토닌-유도 머리 흔들기 실험을 마우스들 등에게 실시하였다.

2.1 실시예 1의 의약 조성물을, 마우스들에게 20mg/kg/d, 40mg/kg/d 및 80mg/kg/d (랫트들의 경우 15mg/kg/d, 30mg/kg/d 및 60mg/kg/d)를 위내에 1주일간 투여하였다. 마우스들의 레서핀-유도 체온 저하, 운동 불능 및 안검하수는 실시예 1 의약 조성물에 의해 상당히 억제될 수 있었는데, 이는 실시예 1의 실험적 우울증에 대한 효과가 모노아민 신경전달물질들의 효과와 연관되어 있을 수 있음을 보여준다. 세로토닌-주입 마우스의 머리 흔들기 정도는 상당히 증가되었고, 이는 실시예 1의 항우울 효과가 모노아민 산화 효소(monoamine oxidase, MAO)의 억제와 연관되어 있음을 보여준다. 게다가, 실험 결과, 실시예 1의 의약 조성물이 마우스들의 자가 통제 활동에는 큰 효과가 없다는 것을 보여주기 때문에, 실시예 1 의약 조성물이 중추신경계에는 자극 효과가 없음을 알 수 있다.

3. 주요 항우울 약역학 실험 결과는 다음과 같이 요약된다(표 5 참조).

항우울 약역학 실험 결과 요약

항목	모델/방법	투여량 (mg/kg)	투여 조건 (경로/시간/빈도/효과적인 투여량)	주요 결과
1.1	랫트들에게 강제-수영 실험	60 30 15	경구/7일/하루 2번/15mg/kg (*P<0.05)	랫트들의 강제-수영 실험에서의 누적 비이동 시간을 유의적으로 단축함
1.2	마우스들에게 강제-수영 실험	80 40 20	경구/7일/하루 2번/40mg/kg (**P<0.01)	마우스들의 강제-수영 실험에서의 누적 비이동 시간을 유의적으로 단축함
1.3	마우스들에게 꼬리-걸기 실험	80 40 20	경구/7일/하루 2번/20mg/kg (*P<0.05)	꼬리-걸기 마우스들의 누적 비이동 시간을 유의적으로 단축함
1.4	마우스들에게 자가 통제 활동 실험	80 40 20	경구/7일/하루 2번	마우스들의 자가 통제 활동에 큰 효과 없음
2.1	랫트들에게 예측불가 장기 자극 실험: 체중 측정	60 30 15	경구/7일/하루 1번/15mg/kg (**P<0.01)	예측불가 장기 스트레스를 받은 랫트들의 체중을 유의적으로 증가시킴
2.2	랫트들에게 예측불가 장기 자극 실험: 자당 섭취 측정	60 30 15	경구/7일/하루 1번/15mg/kg (**P<0.01)	예측불가 장기 스트레스를 받은 랫트들의 자당 섭취 감소를 유의적으로 향상시킴
2.3	랫트들에게 예측 불가 장기 자극 실험: 오픈 필드 박스 실험을 통해 모델 랫트들의 자가 통제 활동 측정	60 30 15	경구/7일/하루 1번/15mg/kg (*P<0.05)	예측불가 장기 스트레스를 받은 랫트들의 수평 및 수직 이동 감소를 유의적으로 향상시킴
2.4	랫트들에게 예측 불가 장기 자극 실험: 점핑 실험을 통해 랫트들의 행동 변화 측정	60 30 15	경구/7일/하루 1번/15mg/kg (*P<0.05)	예측불가 장기 스트레스를 받은 랫트들의 점핑 오류 횟수를 유의적으로 감소시킴
2.5	예측불가 장기 자극 모델 랫트의 두뇌 내 모노아민 신경전달물질(NE 및 5-HT 등)의 측정	60 30 15	경구/7일/하루 1번/15mg/kg (**P<0.01)	모델 랫트들의 대뇌 피질 내 NE, 5-HT 및 DA 수치를 유의적으로 증가시킴
3.1	후각신경구장애 실험: 오픈 필드 실험을 통해 마우스들의 자가 통제 활동 측정	60 30 15	경구/7일/하루 1번/30mg/kg (*P<0.05)	후각신경구장애에 의한 랫트들의 수평 및 수직 이동을 유의적으로 향상시킴
3.2	후각신경구장애 실험: 랫트들에 대한 수동적 회피 실험 측정	60 30 15	경구/7일/하루 1번/30mg/kg (*P<0.05)	후각신경구장애에 의한 랫트 연구 및 기억 능력의 감쇠를 유의적으로 향상시킴
4.1	레서핀 모델 실험: 마우스들의 체온 저하	80 40 20	경구/7일/하루 2번/40mg/kg (**P<0.01)	레서핀-유도 체온 저하를 유의적으로 억제함
4.2	레서핀 모델 실험: 마우스들의 운동 불능(인사불성)	80 40 20	경구/7일/하루 2번/40mg/kg (**P<0.01)	레서핀-유도 운동 불능을 유의적으로 억제함
4.3	레서핀 모델 실험: 마우스들의 안검하수	80 40 20	경구/7일/하루 2번/40mg/kg (**P<0.01)	레서핀-유도 안검하수를 유의적으로 억제함
4.4	마우스들에게 세로토닌-유도 머리-흔들기 실험	80 40 20	경구/7일/하루 1번/40mg/kg (**P<0.01)	세로토닌-주입 마우스들의 머리-흔들기 양을 유의적으로 증가시킴
주의: 1. 실시예 1 v.s. 대조군 P<0.05, P<0.01. 2. 양성 대조군: 파록세틴, 마우스들은 3mg/kg/d, 랫트들은 2mg/kg/d (꼬리-걸기 실험은 라벨 "", 그외는 라벨 ""을 나타냄).

4. 결론

실시예 1의 의약 조성물은 우울증에 대하여 유의적인 실험적 효과를 나타낸다.

다양한 실험 결과는 다음과 같다:

(1) 랫트들에게 실시예 1의 의약 조성물을 위내 8 시간 투여한 결과, 식염수 그룹과 파록세틴 그룹에 비해, 해마 cAMP는 상당히 증가하였고, PKA 활성은 유의적으로 향상되었고(*P<0.05), p-CREB 수치 또한 증가했으며, PDE4 활성은 현저히 억제되었다(*P<0.05).

(2) 만성적으로 스트레스를 받은 마우스들에게 10일간 실시예 1의 의약 조성물을 위내 투여한 결과, 반복적인 스트레스로 인해 해마의 cAMP와 PKA의 감소는 상당히 증가하여 마우스들의 해마 내 인산화된 CREB 및 BDNF의 발현을 촉진하였다.

(3) 만성적으로 스트레스를 받은 랫트들에게 실시예 1의 의약 조성물을 위에 21일간 투여한 결과, 반복적인 스트레스로 인한 해마 내 cAMP 및 PKA의 감소는 유의적으로 증가하여 혈청 BDNF, 시상하부 NE 및 5-HT 등을 포함한 모노아민 신경전달물질의 발현을 촉진하는 한편 GSC는 하향 조절되었다.

(4) 실시예 1의 의약 조성물은 우울증에 대하여 유의적인 실험적 효과를 나타내었다.

생체 내에서 cAMP의 함량과 이용률을 빠르게 증대시키기 위한 본 발명의 의약 조성물의 출원 범위는 다음과 같다.

1. 생체 내에서 cAMP의 함량과 이용률을 빠르게 증대시키기 위한 본 발명의 의약 조성물은 약학적으로 수용 가능한 첨가물을 포함할 수 있다.

2. 생체 체내에서 cAMP의 함량과 이용률을 빠르게 증대시키기 위한 본 발명의 의약 조성물은 분말, 캡슐, 정제 등의 알려진 제형으로 제조될 수 있다.

3. 생체 내에서 cAMP의 함량과 이용률을 빠르게 증대시키기 위한 본 발명의 의약 조성물은 유기체 및 세포 내 cAMP의 낮은 이용률 및 수준으로 인한 질병들을 예방 및 치료하고, BDNF의 수준을 향상시키고, 세포 내 cAMP/PKA/CREB 신호경로를 향상시키고, DA, NE 및 5-HT를 포함하는 신경전달물질들의 수준을 향상시키고, 기억력을 향상시키기 위한 의약품, 건강 식품, 또는 영양제로서 제조될 수 있다.

추가적인 실시예들은 다음과 같다.

실시예 1. 신체 내 사이클릭 아데노신 일인산의 함량과 이용률을 증대시키기 위한 의약 조성물로, 진세노사이드 Rg1, Rb1 및 Re을 포함하는 제1 주요 구성 성분; 글리시리진산, 글리시레틴산 및 그들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나인 감초 관련 산을 포함하는 제2 주요 구성 성분; 주주바 사이클릭 아데노신 일인산을 포함하는 제3 주요 구성 성분을 포함한다.

실시예 2. 실시예 1에 따른 의약 조성물로, 2 내지 26 중량부의 진세노사이드 Rg1 및 Rb1, 3 내지 48 중량부의 감초 관련 산, 및 0.002 내지 0.5 중량부의 주주바 사이클릭 아데노신 일인산을 포함한다.

실시예 3. 실시예 1 또는 실시예 2에 따른 의약 조성물로, 4 내지 13 중량부의 진세노사이드 Rg1 및 Rb1, 5 내지 16 중량부의 감초 관련 산, 및 0.01 내지 0.1 중량부의 주주바 사이클릭 아데노신 일인산을 포함한다.

실시예 4. 실시예 1 내지 실시예 3 중 하나에 따른 의약 조성물로, 약학적으로 수용 가능한 담체, 첨가물 또는 그들의 조합을 포함한다.

실시예 5. 실시예 1 내지 실시예 4 중 어느 하나에 따른 의약 조성물로, 정제, 캡슐, 분말, 알약(pill), 더스트(dust), 용액, 마이크로캡슐, 현탁액, 에멀젼, 입자, 점적 환제(dropping pill), 롤 및 약학적으로 경구 투여가 가능한 정량으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 제형을 포함한다.

실시예 6. 실시예 1 내지 실시예 5 중 하나에 따른 의약 조성물로, 신체 및 세포 내 cAMP의 낮은 이용률 및 함량으로 인한 질병들을 예방 및 치료하고, BDNF의 수준을 향상시키고, 세포 내 cAMP/PKA/CREB 신호경로를 향상시키고, DA, NE 및 5-HT를 포함하는 신경전달물질들의 함량을 증가시키고, 기억력을 향상시키기 위한 의약품, 건강 식품, 또는 영양제로서 제조될 수 있다.

실시예 7. 실시예 1 내지 실시예 6에 따른 의약 조성물로, 생강, 생강 추출물 또는 그들의 조합으로부터 선택된 하나인 제4 주요 구성 성분을 더 포함한다.

실시예 8. 신체 내 사이클릭 아데노신 일인산의 이용률을 증대시키기 위한 의약 조성물로, 진세노사이드 Rg1, Rb1 및 Re을 포함하는 제1 주요 구성 성분; 글리시리진산, 글리시레틴산 및 그 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나인 감초 관련 산을 포함하는 제2 주요 구성 성분; 및 주주바 사이클릭 아데노신 일인산을 포함하는 제3 주요 구성 성분을 포함한다.

실시예 9. 신체 내 사이클릭 아데노신 일인산의 함량을 증대시키기 위한 의약 조성물 제조 방법으로, 상기 의약 조성물 제조를 위해, 진세노사이드 Rg1, Rb1 및 Re을 포함하는 제1 주요 구성 성분을 제공하는 단계; 글리시리진산, 글리시레틴산 및 그들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나인 감초 관련 산을 포함하는 제2 구성 성분을 제공하는 단계; 주주바 사이클릭 아데노신 일인산을 포함하는 제3 주요 구성 성분을 제공하는 단계를 포함한다.

발명의 범위와 기술적 사상에서 벗어나지 않는 한도 내에서 다양한 변경이 가능하다. 그러므로 본 발명의 범위는 상술한 실시예에 국한되어 정해져서는 안되며 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 발명의 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

생체 내 cAMP의 함량 및 이용률을 신속하게 증대시키기 위한 본 발명의 의약 조성물은 약학적으로 수용 가능한 첨가물을 포함할 수 있다.

또한, 생체 내 cAMP의 함량 및 이용률을 신속하게 증대시키기 위한 본 발명의 의약 조성물은 분말, 캡슐 또는 정제 등의 알려진 제형으로 제조될 수 있다.

또한. 생체 내 cAMP의 함량 및 이용률을 신속하게 증대시키기 위한 본 발명의 의약 조성물은 유기체 및 세포 내 cAMP의 낮은 이용률 및 함량으로 인한 질병들을 예방 및 치료하고, BDNF의 수준을 향상시키며, 세포 내 cAMP/PKA/CREB 신호경로를 향상시키고, DA, NE 및 5-HT를 포함하는 신경전달물질들의 함량을 향상시키고 또는 기억력을 향상시키기 위한 의약품, 건강 식품 또는 영양제로서 제조될 수 있다.

Claims

체내에서 사이클릭 아데노신 일인산의 함량 및 이용률을 증대시키기 위한 의약 조성물로,
진세노사이드 Rg1, Rb1 및 Re를 포함하는 제1 주요 구성 성분;
글리시리진산, 글리시레틴산 및 그들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나인 감초 관련 산을 포함하는 제2 구성 성분; 및
주주바 사이클릭 아데노신 일인산을 포함하는 제3 주요 구성 성분을 포함하는 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 의약 조성물은 2 내지 26 중량부의 진세노사이드 Rg1 및 Rb1, 3 내지 48 중량부의 감초 관련 산, 및 0.002 내지 0.5 중량부의 주주바 사이클릭 아데노신 일인산을 포함하는 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 의약 조성물은 4 내지 13 중량부의 진세노사이드 Rg1 및 Rb1, 5 내지 16 중량부의 감초 관련 산, 및 0.01 내지 0.1 중량부의 주주바 사이클릭 아데노신 일인산을 포함하는 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 의약 조성물은 약학적으로 수용 가능한 담체, 첨가물 또는 그들의 조합을 포함하는 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 의약 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 알약, 더스트, 용액, 마이크로캡슐, 현탁액, 에멀젼, 입자, 점적 환제, 롤 및 약학적으로 경구 투여가 가능한 정량으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 제형인 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 의약 조성물은 신체 및 세포 내 cAMP의 낮은 이용률 및 함량을 예방 및 치료하고, 세포 내 cAMP/PKA/CREB 신호경로를 향상시키고, BDNF의 발현을 향상시키고, DA, NE 및 5-HT 신경전달물질들의 함량을 증대시키고, 또는 기억력을 향상시키기 위한 의약품, 건강 식품, 또는 영양제로서 제조되는 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 의약 조성물은 생강, 생강 추출물, 또는 그들의 조합으로부터 선택된 하나인 제4 주요 구성 성분을 더 포함하는 의약 조성물.
신체 내 사이클릭 아데노신 일인산의 이용률을 증대시키기 위한 의약 조성물로,
진세노사이드 Rg1, Rb1 및 Re를 포함하는 제1 주요 구성 성분;
글리시리진산, 글리시레틴산 및 그들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나인 감초 관련 산을 포함하는 제2 구성 성분; 및
주주바 사이클릭 아데노신 일인산을 포함하는 제3 주요 구성 성분을 포함하는 의약 조성물.
신체 내 사이클릭 아데노신 일인산의 함량을 증대시키기 위한 의약 조성물 제조 방법으로,
진세노사이드 Rg1, Rb1 및 Re를 포함하는 제1 주요 구성 성분을 제공하는 단계;
글리시리진산, 글리시레틴산 및 그들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나인 감초 관련 산을 포함하는 제2 구성 성분을 제공하는 단계; 및
주주바 사이클릭 아데노신 일인산을 포함하는 제3 주요 구성 성분을 제공하는 단계를 포함하는 의약 조성물 제조 방법.