CN104706627A - 一种治疗缺血性脑中风的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗缺血性脑中风的药物,其有效成分包括有效剂量为2~15mg/kg的紫檀茋,且其给药途径为口服。本发明的药物的有效成分为紫檀茋,可改善小鼠神经功能缺失,减小脑梗死体积,减轻脑水肿程度;对脑缺血后血脑屏障(BBB)的损伤具有保护作用;对缺血半暗带的神经元具有保护作用;可以降低脑组织内MDA含量,升高SOD的活性,减轻脂质过氧化损伤。
Description
技术领域
本发明属于化学药物技术领域,具体涉及一种治疗缺血性脑中风的药物。
背景技术
脑卒中(脑中风)为脑血管阻塞或破裂引起脑部血流受阻所致病症,分缺血性脑卒中和出血性脑卒中,其中缺血性脑卒中约占脑卒中病例的60~80%。脑卒中不但以高发病率、高死亡率、高致残率危害人民健康,而且在存活下来的占80%的中风患者中,仅有10%左右能完全恢复正常功能,绝大多数患者都留有偏瘫,失语等后遗症,对社会及家庭造成极严重的负担。目前治疗缺血性脑卒中的药物多以溶栓药为主,但存在治疗时间窗过短的问题,一般来说,脑缺血发生后4.5小时内溶栓治疗才有效,因此只有少数病人能在这期间得到治疗,并且存在增加脑内出血的风险。因此,能缓解急性期的脑缺血损伤和减轻随后的永久性脑梗死的救治药物尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷,提供一种治疗缺血性脑中风的药物。
本发明的具体技术方案如下:
一种治疗缺血性脑中风的药物,其有效成分包括有效剂量为2~15mg/kg的紫檀茋,且其给药途径为口服。紫檀茋化学名为3,5-二甲氧基-4’-羟基二苯乙烯,化学式为C16H16O3,分子量为256.3,化学结构式如下:
紫檀茋具有良好的口服生物利用度和较长的血浆半衰期,可透过血脑屏障,并且安全无毒,研究表明动物每天灌胃给予紫檀茋(3000mg/kg)1个月也无明显的局部或者全身的毒性反应。
在本发明的一个优选实施方案中,所述有效剂量为2.5~10mg/kg。
进一步优选的,所述有效剂量为10mg/kg。
一种紫檀茋在制备治疗缺血性脑中风的口服药物中的应用。
在本发明的一个优选实施方案中,所述紫檀茋的有效剂量为2~15mg/kg。
进一步优选的,所述紫檀茋的有效剂量为2.5~10mg/kg。
进一步优选的,所述紫檀茋的有效剂量为10mg/kg。
本发明的有益效果是:
1、本发明的药物的有效成分为紫檀茋,可改善小鼠神经功能缺失,减小脑梗死体积,减轻脑水肿程度;
2、本发明的药物对脑缺血后血脑屏障(BBB)的损伤具有保护作用;
3、本发明的药物对缺血半暗带的神经元具有保护作用;
4、本发明的药物可以降低脑组织内MDA含量,升高SOD的活性,减轻脂质过氧化损伤。
附图说明
图1为本发明实施例1中紫檀茋对小鼠局灶性脑缺血再灌注24h后神经功能缺失Bederson评分(A),转棒实验(B),宽平衡木行走(C),窄平衡木行走(D)的影响结果图(假手术组n=6,其余组n=10)#P<0.05,##P<0.01与假手术组比较;*P<0.05,**P<0.01与溶媒组比较。
图2为本发明实施例1中紫檀茋对小鼠局灶性脑缺血再灌注24h后脑梗死体积(A,B,C),脑水肿程度(D)的影响(假手术组n=6,其余组n=10)##P<0.01,#P<0.05与假手术组比较;**P<0.01与溶媒组比较.图A标尺=5mm。
图3为本发明实施例1中紫檀茋对小鼠局灶性脑缺血再灌注6h后血脑屏障通透性的影响。(假手术组n=6,其余组n=10)*P<0.05,*P<0.05与溶媒组比较。图A标尺=5mm。
图4为本发明实施例1中紫檀茋对脑缺血再灌注后脑皮层缺血半暗带神经元存活的影响。(假手术组n=3,其余组n=6)##P<0.01vs假手术组,*P<0.05,**P<0.01vs溶媒组。图Ac标尺=100μm;图Ai标尺=25μm。
图5为本发明实施例1中紫檀茋对脑缺血再灌注后脑组织内MDA含量(A)和SOD活力(B)的影响。(假手术组n=3,其余组n=6)##P<0.01与假手术组比较;*P<0.05与溶媒组比较。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
1、实验材料与方法
1.1、实验动物和试剂
健康昆明种小鼠,♂,体重25~30g,由厦门大学实验动物中心提供【合格证号:SYXK(闽)2008-0003】。自然光照周期饲养,术前12h禁食,自由饮水。
紫檀茋,购自杭州瑞树生化有限公司。紫檀茋先用Tween80助溶,再用生理盐水稀释,最终溶液为含10%Tween80生理盐水的紫檀茋溶液。
1.2、动物处理方法
实验小鼠随机分为四组,每组6-10只:
①假手术组(Sham组,S),仅手术暴露右侧颈总动脉及颈内动脉,不做缺血处理;
②溶媒组(Vehicle组,V),灌胃给予含10%Tween80生理盐水;
③紫檀茋低剂量组(Pte2.5),再灌同时及再灌后2h灌胃给予紫檀茋2.5mg·kg-1;
④紫檀茋高剂量组(Pte5),再灌同时及再灌后2h灌胃给予紫檀茋10mg·kg-1
1.3、局灶性脑缺血/再灌注模型制备
参照Longa等建立的方法制备小鼠右侧大脑中动脉栓塞模型。小鼠用10%水合氯醛(4mL/kg)腹腔注射麻醉,仰卧固定在手术台上。颈部正中切口,钝性分离颈总动脉,将头端用聚胺酯处理的直径为0.108mm的尼龙丝线经颈总动脉切口插入颈内动脉,微遇阻力时即停止,线栓插入总长度自颈总动脉分叉部记为1.0±0.1cm。缺血1.5h后拔除线栓,即恢复血供。动物术中及术后麻醉清醒前给予保温。动物苏醒后出现对侧肢体运动障碍即为模型制备成功。
1.4、神经功能缺失评分
(1)Bederson评分标准如下:
0分,无神经功能缺失症状;
1分,提尾时,损伤对侧前肢不能伸直;
2分,向损伤对侧推力下降;
3分,同2级行为,伴自发性旋转(自由活动时向瘫痪侧划圈)。
(2)加速转棒实验
测试时将小鼠放在加速转动(4rpm到40rpm)的棒上2min,记录动物在棒上行走的时间(超过2min记为120s),消极的行走视为掉落。测试三次求平均值(每次间隔5-10min)。
(3)平衡木实验
用于评价小鼠在静态器械上的运动协调和整合能力。术前3天开始训练,使其能顺利在平衡木上行走。于脑缺血后相应时间点观察并评分,评分标准为:0分:穿过平衡木,不会跌到;1分:穿过平衡木,且有小于50%的路程出现滑脚现象(即跌到机会小于50%);2分:穿过平衡木,且有大于50%的路程出现滑脚现象(即跌到机会大于50%);3分:能穿多平衡木,但瘫痪侧后肢不能帮助向前移动;4分:不能穿过平衡木,但可坐在平衡木上;5分:将小鼠放在平衡木上会掉下来。
1.5、脑梗死体积及脑水肿程度的测定
采用小鼠脑片TTC染色法。小鼠于再灌注24h后断头取脑,迅速置-18℃冷冻,15min后取出在冰台上由前向后切成2.0mm厚的切片5片,将切片立即置于质量分数为1%的TTC中避光37℃恒温孵育30min。未受损的正常脑组织染色后呈红色,梗死组织不着色而呈白色。而后放入4%的多聚甲醛中避光保存24小时,经数码相机拍照并输入电脑,应用图像处理与分析软件计算脑片梗死区域面积及两侧半球的面积,将每一脑片的梗死面积或半球面积乘以间隔的厚度(2mm),再将各脑片数值相加,得到脑梗死体积及脑半球体积的近似值。用“(损伤侧脑半球体积-非损伤侧脑半球体积)/非损伤侧脑半球体积”来反应脑水肿程度。
1.6、血脑屏障破坏程度的观察和测定
采用伊文思蓝染色法评价脑缺血后血管屏障的破坏程度。再灌后5h尾静脉注射质量浓度为5%的EB(10ml/kg),1h后小鼠给予水合氯醛麻醉后打开胸腔,于右心耳部剪一小口,从左心室插入导管至主动脉,向主动脉内缓慢注入生理盐水,至右心房流出液体变清亮,断头取脑,整脑拍照后置于-20℃冰箱中冷冻15min,切成2.0mm后的冠状切片。未受损的正常脑组织无EB渗透呈白色,梗死侧脑组织血脑屏障受损有大量EB渗透呈蓝色。用数码相机按顺序拍摄染色后的脑片,用图像处理与分析软件计算每一脑片EB渗透面积,将面积求和后乘以切片厚度(2mm)得到EB渗透体积。取出冻存的脑切片,沿大脑中线切开脑片分为左右两片,分别装入已称重的1.5ml离心管后,称重并记录。于装有脑切片的离心管中加入300μlPBS,剪碎组织。用超声组织匀浆机匀浆5次(每次5s)。于脑匀浆中加入300μl饱和三氯醋酸溶液,涡旋30s后,放入4℃冰箱中过夜。10000g、室温下离心15min后,取150μl上层清液于酶标板中。波长620nm下测定紫外吸光度值,在EB标准曲线上读取其对应的浓度值C(μg/ml)。
脑组织中EB含量(μg/g)=C×0.15/脑片重量
1.7、脑组织切片甲苯胺蓝及TUNEL染色
1)脑组织切片的制备
取脑缺血再灌后24h的小鼠,给予水合氯醛麻醉后打开胸腔,于右心耳部剪一小口,从左心室插入导管至主动脉,向主动脉内缓慢注入生理盐水,至右心房流出液体变清亮,两前肢及两肺变白,换4%多聚甲醛液继续灌注,刚开始灌注时小鼠全身剧烈抽动,直至前肢及颈部僵硬,约100ml。灌注速度不能太快,防止液体冲击,改变侧脑室形态。开颅取脑,将取出的大脑置于4%多聚甲醛溶液中固定约12h,固定好的鼠脑变硬。取出脑组织依次浸入10%蔗糖液、20%蔗糖液、30%蔗糖液中直至脑组织下沉。将脑组织放入加有包埋剂的速冻盒中,置于液氮中速冻13s,用冰冻切片机切成10μm冠状切片,置于-80℃保存。
2)组织冰冻切片甲苯胺蓝染色
(1)取脑组织冰冻切片,置于室温平衡30min,0.01M PBS漂洗5minΧ3次;
(2)1%甲苯胺蓝染色40min,置蒸馏水中迅速清洗掉多余染料;
(3)90%酒精中脱色2min,100%酒精中脱色2minΧ2次;
(4)二甲苯中透明2minΧ2次;
(5)中性树胶封片。
3)TUNEL法染色
(1)取脑组织冰冻切片,室温平衡30min,0.01M PBS漂洗5minΧ3次;
(2)新鲜配制3%H2O2室温处理10min。0.01M PBS漂洗2minΧ3次;
(3)标本片加0.01M TBS 1:200新鲜稀释Proteirase K 37℃消化60s,0.01M TBS洗2minΧ3次;
(4)标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer)20μl/片,以保持湿润;
(5)按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl,加入18μl标记缓冲液中,混匀。置样品于湿盒中,37℃标记2h;
(6)0.01M TBS洗2minΧ3次;
(7)用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗体地高辛抗体,置样品于湿盒中,37℃反应45min。0.01M TBS洗2minΧ3次;
(8)用抗体稀释液1:100稀释SABC,37℃反应30min,0.01M TBS洗,5minΧ4次;
(9)DAB显色,水洗;
(10)脱水、透明、封片,显微镜观察。
1.8、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
脑缺血再灌注后24h,取缺血侧脑组织,用冰生理盐水制成10%脑组织匀浆,3000r/min,离心10min,取上清,置于-80℃保存。按照试剂盒说明书分别测定脑组织中MDA含量和SOD活性。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法按操作步骤进行,于532nm处,测定吸光度;SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定,于550nm处测定吸光度。蛋白含量按照考马斯亮蓝法测定。
1.9、统计学分析
数据采用Graphpad Prism 5软件(GraphPad Software Inc,USA)进行统计学分析,组间比较用单因素方差分析,当方差分析差异有显著性时,进一步用q检验作两两比较。
2、结果与分析
2.1紫檀茋对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后行为学的影响
脑缺血再灌注24h后,小鼠出现明显的神经功能缺失症状,主要表现为提尾悬空时的强迫体态-左前肢紧贴躯体向左侧扭转以及运动时的追尾征—向左侧旋转或倾倒。紫檀茋(10mg/kg)能够明显改善小鼠的神经功能缺失,减少Bederson神经功能缺失评分(p<0.05),见图1(A)。
在加速转动的转棒上,脑缺血损伤小鼠不能灵活行走,有的消极的抓住木棒,有的甚至因不能保持身体平衡而滑落,最终溶媒组在转棒上的停留时间较假手术组下降87%,紫檀茋(2.5mg/kg和10mg/kg)均能显著增加小鼠转棒上的停留时间(p<0.05或p<0.01),紫檀茋(10mg/kg)组小鼠在转棒上的停留时间甚至与假手术组相近(p>0.05),见图1(B)。
在平衡木行走实验中,所以假手术组小鼠均能顺利穿过,而溶媒组小鼠有的能穿过平衡木,但损伤侧后肢不能辅助前行,有的不能穿过平衡木,甚至不能在平衡木上停留,直接跌落。溶媒组小鼠的评分明显高于假手术组,分别为(3.5±0.72和0.33±0.33;p<0.05),紫檀茋(10mg/kg)治疗组评分明显低于溶媒组,分别为(0.67±0.2和3.5±0.72,p<0.05),见图1(C)。在较窄平衡木行走实验中,亦表现出相同趋势,图1(D)。
2.2紫檀茋对小鼠脑缺血再灌注后脑梗死体积及水肿程度的影响
缺血再灌注后24h,小鼠缺血侧额顶叶皮层和皮层下区(纹状体、海马等)可见明显的苍白梗死灶,损伤侧脑组织可见明显水肿。与溶媒组相比,紫檀茋(10mg/kg)治疗组能减小79%的梗死体积,显著减少皮层、纹状体部位的梗死灶,见图2(A、B、C)。损伤侧脑体积较对照侧增加18.96%,提示脑损伤侧发生水肿,而紫檀芪(10mg/kg)治疗组与溶媒组相比,水肿程度降低约79.2%,见图2(D)。
2.3紫檀茋对小鼠脑缺血再灌注后BBB通透性的影响
应用EB渗漏法观察脑缺血再灌注后小鼠BBB通透性的变化,结果表明脑缺血再灌注后6h,脑内EB渗漏量明显增大,见图3(A)。紫檀茋(10mg/kg)组明显减少EB的渗漏体积(p<0.05),见图3(B),同时减少EB的百分含量(p<0.05),见图3(C)。说明紫檀茋可减少EB在脑内的渗漏,减轻脑缺血再灌注后BBB的破坏程度。
2.4紫檀茋对缺血后脑皮层缺血半暗带神经元存活的影响
应用甲苯胺蓝染色,我们观察到脑缺血再灌注24h后,大脑皮层缺血半暗带区细胞间隙增大,可见大量深染伴核固缩的变性坏死神经元,正常神经元数目明显减少。紫檀茋可明显增加大脑皮层内正常神经元的密度。应用TUNEL法,我们发现脑缺血损伤后在缺血半暗区存在大量凋亡晚期的细胞,紫檀茋可明显减少凋亡细胞的数目(图4)。
2.5紫檀茋对缺血后脑组织内MDA含量和SOD活力的影响。
脑缺血再灌注24h,脑组织损伤侧脂质过氧化产物MDA含量较假手术组明显增高,抗氧化酶SOD活性降低;给予紫檀茋处理后,脑组织内MDA的含量下降,SOD活力恢复正常(图5),提示紫檀茋具有抗氧化应激损伤的作用。
3、结论
采用本发明的方法,在适宜的时间灌胃给予合适剂量的紫檀茋,可以提高动物对抗急性脑缺血再灌注损伤的能力;本发明有望为临床提供一种急性缺血性脑卒中后减轻再灌注损伤的治疗措施,减轻患者因得不到及时救治而带来的永久性神经功能损伤。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例而已,故不能依此限定本发明实施的范围,即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰,皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (7)
1.一种治疗缺血性脑中风的药物,其特征在于:其有效成分包括有效剂量为2~15mg/kg的紫檀茋,且其给药途径为口服。
2.如权利要求1所述的一种治疗缺血性脑中风的药物,其特征在于:所述有效剂量为2.5~10mg/kg。
3.如权利要求2所述的一种治疗缺血性脑中风的药物,其特征在于:所述有效剂量为10mg/kg。
4.一种紫檀茋在制备治疗缺血性脑中风的口服药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于:所述紫檀茋的有效剂量为2~15mg/kg。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于:所述紫檀茋的有效剂量为2.5~10mg/kg。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于:所述紫檀茋的有效剂量为10mg/kg。
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