BG61625B1 - Определяне съдържанието на синдекан в биологични материаликато тъкани и телесни течности за установяване на злокачественитрансформации на клетки - Google Patents

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до областта на биологията, по-специално онкобиологията, и до методите за откриване на тъкани в предшестващ стадий на злокачествено израждане или на тъкани със злокачествени тумори, от една страна, чрез определяне на загубата на синдекан в тъканите и, от друга страна, чрез определяне на появяването на синдекан в човешки телесни течности посредством методи, при които за определянето могат да се използват проби от синдеканови специфични течности, антитела и с ДНК.

Състояние на техниката

Молекулите на клетъчната повърхност, които функционират в специфични взаимодействия между клетъчната повърхност и междуклетъчното вещество /ЕСМ/, се наричат рецептори на междуклетъчното вещество. Разпознаването на междуклетъчното вещество от тези рецептори играе важна роля за регулирането на формата на клетката, пролиферацията и диференциацията и затова има решаващ резултат за нормално развитие на органите и поддържането на тьканния строеж. Известните междуклетъчни рецептори включват например семейство от трансмембранни гликопротеинови рецептори, които си поделят обикновените структурни и функционални характерни свойства и се наричат интегрини /1 /. Гликопротеинът 67 - kDa, който се свързва с веригата на ламинин BI /2/ и протеогликани на клетъчната повърхност /PG/ в зависимост от глюкозаминогликановия състав /например хепарансулфат/, може да взаимодейства с редица молекули на междуклетъчното вещество /3/. Адхезията, разпространяването, пролиферацията и диференциацията на клетките всички са основани на тесни контакти между клетъчната повърхност и обкръжаващото междуклетъчно вещество. Селективното използване на взаимодействието между лиганда и рецептор може да създаде in vivo разнообразие от специфичните взаимодействия между клетка и междуклетъчно вещество, необходими за развитието на органите /4/. Известно е, че трансформацията изменя отговора на клетките към меж5 дуклетьчното вещество /5/, при което е възможно да са настъпили промени в експресията на рецепторите на междуклетъчното вещество чрез злокачествени клетки /6,7/. Тези промени до голяма степен са непознати, но могат да имат 10 основна роля за резултата от болестотворното поведение на различни клетъчни типове.

Протеогликанът на клетъчната повърхност на миши епителни клетки от млечна жлеза се състои от липофилен мембранен домен /8/и от 15 външен домен за взаимодействие с междуклетъчното вещество, съдържащ хепарансулфатни и хондроитинсулфатни вериги /9/. При клониране на сДНК на миши и човешки синдекани се потвърдиха тези функционални домени върху 20 сърцевинния протеин и този протеогликан /PG/ е наречен синдекан /10,11/. Външният домен на синдекана се разпознава чрез mAb 281-2 / моноклонално антитяло 281-2//12,13/ и той се свързва с висок афинитет към колагенови влак25 на Тип I, III и V /14/ и с по-нисък афинитет към С-терминален хепаринсвързващ домен на фибронектина /15/, тромбоспондина /16/ и тенсацина /17 - под печат/. Лигандното свързване съдейства за присъединяването на мембранния 30 домен към богатия на актин цитоскелет /18/. Епителните клетки, обаче, могат също да отслоят външния домен от клетъчната повърхност чрез протеолитично разцепване на сърцевинния протеин, който разделя външния домен от мем35 бранния домен /19,20/. Следователно синдеканът може да свързва епителния цитоскелет с междуклетъчното вещество, но също така разхлабва епителната връзка с междуклетъчното вещество. Чрез тези връзки синдеканът може да посредни40 чи за организацията на междуклетъчното вещество в клетъчната организация и да повлияе на поведението на клетките. Тъй като синдеканът взаимодейства главно с компонентите на стромата като колагеновите влакна, и фибронектин, 45 синдеканът може да функционира като комуникатор между епителните и мезенхимните тъкани. Този тип връзка е критична за нормалната епителна диференциация и образуването на органи.

Експресията на синдекан през време на 50 развитието и образуването на органи следва по-скоро морфогенетични, отколко хистологични граници /21/. една особеност, която също обезпечава активна роля на синдекана като рецептор на междуклетъчното вещество през време на развитието. Синдеканът е локализиран главно върху различни епителни клетки /22/, но може също така да бъде намерен и върху повърхността на плазмоцитите /23/ Синдеканът се локализира и към кондензиращ се мезенхим близо до прорастващия епител през време на образуването на органи I1AI. Установено е, че експресията му в мезенхима е регулирана чрез епителния контакт в зъб /25/ и в метанефричен бъбрек /26/. И в двата типа тъкани експресията му може да бъде свързана по пространство и време с морфогенезиса на тези органи.

Същност на изобретението

Една от задачите на изобретението е да се осигури метод за откриване на тъкани в предшестващ стадий на злокачествено израждане или на тъкани със злокачествени тумори чрез определяне на загубата на синдекан в тъканите.

Друга цел на изобретението е да се осигури метод за откриването на тъкани в предшестващ стадий на злокачествено израждане или на тъкани със злокачествени тумори чрез определяне на появяването на синдекан в телесните течности.

Друга цел на изобретението е да се осигури метод, който е особено подходящ за откриването на тъкани в предшестващ стадий на злокачествено израждане или на тъкани със злокачествени тумори в хора.

Друга цел на изобретението е да се осигури биохимичен, имунохистологичен или молекулярно-биологичен метод за определяне експресията на синдекан или съдържанието на синдекан в тъкани или телесни течности, за откриване на злокачествените или предшестващите стадии на злокачествени трансформации на клетки.

Друга цел на изобретението е да се създаде метод за откриване на хиперпластични промени на клетки. Цел на изобретението е също създаването на метод за установяване на предполагаеми хиперпластични промени в клетки.

Друга цел на изобретението е да се осигури метод за установяване на предполагаеми морфологични промени в клетки.

Цел на изобретението е да се осигури метод за количествена оценка на синдекан в тъкани или телесни течности, за да се изработи индикаторна стойност.

В по-широк план изобретението включва метод за установяване на потенциална вредна трансформация на клетки в даден организъм, като методът включва индикатор за определяне съдържанието на синдекан в проба от биологичен материал от организма и сравняване на определяне индикатор за съдържание на синдекан с контролен индикатор за съдържание на синдекан от контролен биологичен материал, за предпочитане материал от същия тип.

Методът съгласно изобретението може да бъде осъществен по множество начини, включващи биохимични, имунохистологични или молекулярнобиологични методи. Въпреки че методът е приложим за установяване на вредна трансформация, като злокачествено състояние или предшестващ стадий на злокачествено състояние в едно широко разнообразие от организми, той е особено приложим за установяване на вредна трансформация в клетки, особено в човешки клетки. Трансформации, които могат да бъдат установени, включват предшестващ стадий на злокачествени трансформации и злокачествени трансформации, включително хиперпластични и морфологични изменения.

Доказване на наличието или липсата на синдекан може да бъде извършено върху различни биологични материали от организма, като клетки, тъкани и телесни течности, включително и особено за човешки биологични материали, серум, плазма, урина, гръбначномозъчна течност или други тъканни екстракти. Определянето на синдекановото съдържание в биологични материали може да бъде извършено чрез използването на различни начини, включително на специфични за синдекан лиганди или биохимични детерминанти, специфични за синдекан антитела, с противоположни и РНК или сДНК за синдекан или олигинуклеотиди.

Допълнителни особености, цели и предимства на настоящото изобретение ще бъдат по-пълно изяснени от подробно обсъждане на следващото описание на предоставеното изобретение, заедно с придружаващите чертежи.

Описание на приложените фигури

Фигура 1А представлява графика на съдържанието на синдекан в клетъчната повърхност във функция от времето, като показва загу- 5 бата на синдекан в епителни клетки от миша млечна жлеза, трансформирани чрез взаимодействие с тестостерон.

Фигура 1В е графичка на експресията на иРНК, кодираща синдекана, във функция от вре- 10 мето, и показва загубата на синдекан в епителни клетки от миша млечна жлеза, трансформирани чрез въздействие с тестостерон;

Фигурите от 2А до 2D представляват снимки на срезове на биологичен материал от 15 кожа на мишка, показващи напредването на експресията на синдекана след излагане на материала на въздействието на ултравиолетова светлина;

Фигура ЗА представлява снимка, показ- 20 ваща суспензии на миши епителни клетки от млечна жлеза, отгледани в монослоеве, като един слой е трансформиран с ras-онкоген;

Фигура ЗВ е графика на съдържанието на синдекан в клетъчната повърхност за моно- 25 слоевете от фиг.ЗА.

Описание на предпочитаните вариантни за осъществяване на изобретението

Изобретението се основава на резултатите от изследванията, които показват, че откриването на присъствието на синдекан е ценен диагностичен критерий за оценка на злокачествения характер на биологични материали като 35 епителни клетки. Дадени са примери за три различни видове експериментални начини за индуциране на трансформация /хормонална индукция, раздразване с УВ-светлина и онкогенна индукция/ и във всеки от тях беше пока- 40 зана очевидна загуба на синдекан. Доказване на загубата на синдекан е ценно също така и в други процеси, водещи до трансформация, като образуване на тумори, и следователно изобретението не се ограничава само до посоченото 45 по-горе. Например, откриването на синдекан може да даде ценна информация, също така за някои пролиферативни стадии на тъкани, например на кожа, бъбрек, мозък, бял дроб, пикочен мехур, които по-късно могат да се превър- 50 нат в стадии на по-злокачествено израждане. Тези така наречени предшестващи стадии на злокачествено израждане, които често са наблюдавани като дисплазии, показват различни нива на синдекан, което е необходима информация, за да се оцени сериозността на заболяването, за да се осигури подходящо лечение. Важна област за откриване присъствието на синдекан е също така в циркулиращите плазматични клетки. Затова техния анализ чрез предоставения метод, който използва специфични за синдекан антитела, например FACS-анализ / fluorescent activated cell sorter /поточна цитометрия/ осигурява ценна информация за патофизиологичното състояние на пациент с лимфома, миелома, левкемия или друг пролиферативен стадий на хематопоетичните /кръвотворните/ клетки.

Известно е, че синдекан се отделя и от клетъчната повърхност /27/ и това може да бъде така при някои заболявания. Загубата на синдекан от клетъчните повърхности може да доведе до появата му в телесните течности. По тази причина съгласно изобретението от диагностична полза е да се измерят количествата на синдекан в серум, плазма, урина, гръбначномозъчна течност или други тъканни екстракти, за да се определи до каква степен в изследваните тъкани е настъпило разрушаване на тъканта и изчезване на нормалната клетъчна морфология.

Както е посочено по-горе, синдеканът е протеогликан на клетъчната повърхност, състоящ се от ковалентно свързани глюкозаминогликанови /GAG/ вериги и включен в мембраната сърцевинен протеин /28/. Известно е, че глюкозаминогликановите вериги на синдекана принадлежат към групите на хепарансулфата и хондроитинсулфата /29/ и не са ограничени към синдекан. Сърцевинният протеин на синдекана е уникален и определя тази молекула като член на няколко подобни протеогликани на клетъчната повърхност /30/. Миши синдекан първоначално се изолира и обикновено се определя с моноклонално антитяло 2812 /МпАЬ 281-2/ срещу сърцевинния протеин на синдекан /31/.

За да се обясни допълнително изобретението, експресията на синдекан се анализира във връзка с индукцията на злокачествено изроден фенотип в три различни независими биологични модела, всеки от които е получен в резултат на злокачествена трансформация на епителни клетки. Във всички тези модели за губата па синдеканова експресии сс наблюдава едновременно със злокачествената трансформация. Тези резултати са представени накратко в следващите модели за илюстриране на изобретението.

В първия модел се използва туморна клетъчна линия от миша млечна жлеза Shionogi 115 /S115/. Такива клетки осигуряват отличен модел за изследвания на трансформирания фенотип, тъй кат отговарят /реагират/ на андрогени чрез повишаване скоростта на растеж /32/ и чрез изменение от епителна до фибробластна морфология /33/. В присъствието на андроген клетките прилепват хлабаво към субстрата и придобиват способност да растат в суспензия без закрепавне към междуклетъчното вещество, докато в отсъствието на андроген те прилепват плътно към междуклетъчното вещество и не могат да растат изобщо в суспензия /34/. Базата за морфологичната промяна и самостоятелността при закрепване е до голяма степен непозната, въпреки че няколко механизма, включващи промени в организацията на цитоскелета /35/ и в паракринните механизми, са известни от литературата /36/.

Клетки S 115, обработени с тестостерон, показват силно, зависимо от RGDS-, свързване към фибронектин /FN/, по никакво свързване към домена на FN, свършващ хепарин, като по този начин показват, че те експресират молекули, подобни на интегрина. Вместо това клетки S 115, отгледани без нестостерон, показват епителна морфология и свързване към хепаринсвързващия домен на фибронектина, което означава промяна на експресията на синдекан в клетки S 115, третирани с хормон. В клетки S 115, третирани с хормон, се понижават количествата на външния домен на синдекана, свързващ се с междуклетъчното вещество, определени количествено чрез радиоимуноанализ и чрез Westernblot, и на иРНК, кодираща синдекана /2.6 кЬ/. Добавянето на антиандроген ципротеронацетат към хранителната среда пречи на влиянието на тестостерона върху иРНК, кодираща синдекана. Така инактивирането на синдекановия ген и последвалото потискане на експресията на синдекан е свързано с променените адхезионни свойства, изчезването на епителния фенотип и, от друга страна - с появяването на подобен на трансформиран фенотип в клетки S 115, третирани с хормон.

Един пример ог посочените резултати е представен на фигури 1А и 1В. Фигура 1А е сравнително графично представяне на съдържанието на синдекан в клетъчната повърхност във функция от времето, илюстрираща загубата на синдекан в миши епителни клетки от млечна жлеза /S115/, трансформирани чрез излагане на въздействието на тестостерон и фигура 1В е сравнително графично представяне на иРНК експресията на иРНК, кодираща синдекана, във функция от времето, поясняваща загубата на синдекан в миши епителни клетки от млечна жлеза, трансформирани чрез излагане на въздействието на тестостерон. Тези изображения показват злокачественото поведение и загубата на експресия на синдекан, което е очевидно в протеина на фигура 1А и нивото на иРНК на фигура 1В след въздействието /на хормон/.

Следователно добавянето на андроген към култури S 115 води до потискане на синдекановата експресия, поради инактивирането на синдекановия ген. Това потискане тясно корелира с постигането на независимост на прилепване и със загубата на епителен фенотип и следователно е една от причините за поведението на клетки S 115, подобно на трансформираните, в присъствието на андроген.

Във втори модел се изследва имунореактивността за синдекан в неокосмена /hr/hr/ мишка, изложена на въздействието на UV-В и UV-В’ облъчване. Наблюдава се положително оцветяване на повърхността на нормални епидермални клетки, както и дермалните абортивни /недоразвити/ косменофоликулярни кисти, характерни за тази миша линия. Ранната реакция към У В-облъчването, показваща хиперпластичен епидермис с лека клетъчна атипичност, също е положителна, въпреки пониженото оцветяване на епидермалните клетъчни повърхности. Проби със силна дисплазия показват слабо оцветяване в зърнестия /грануларния/ клетъчен слой, докато базалния клетъчен слой е негативен. В папиломи и в солитарната кератоакантома имунореактивност за синдекан се наблюдава в доброкачествени хиперпластични епидерамални клетки, както и в пролифериращите епидермални клетки на роговите кисти.

Злокачествената трансформация, изразена като образуване на карциноми и саркоми на клетките на плоския епител, неизменно е свързана със запбата на оцветяване на синдскана. Тези резултати са съвместими с предишните данни за понижена експресия на синдекан, свързана със злокачествена трансформация на култивираните епителни клетки, но също така подсказват за важната роля на синдекана за поддържането на нормален тъканен строеж и ход на диференциацията на кожата.

На фигурите 2А до 2D са показани примери за тези оцветявания. Тези фигури представляват снимки на срезове на биологичен материал от кожа на мишка, показващи напредването на синдеканова експресия след излагането на материала на въздействието на УВсветлина. Та фигура 2А е показан материал от нормална кожа, а на фигурите 2В и 2С са илюстрирани различни стадии на хиперплазия. Срезът, показан на фигура 2С, свидетелства за хистология на някакво злокачествено израждане. Тези фигури показват хиперплазия в предшестващ стадий на злокачествено израждане, предизвикана от постепенна загуба на синдеканова експресия, вследствие на УВ облъчване.

Установено е, че епителни клетки in vivo, поставени в нормалното им обкръжение, загубват синдекановата експресия по време на процеса на злокачествена трансформация, което отново показва, че синдекановата експресия е необходима за нормалната клетъчна морфология и за целостта на тъканта, но също така и че загубата на синдеканова експресия може да корелира със значимостта на дисплазията и злокачественото израждане на епителните клетки.

В третия модел е използвана линия от епителни клетки на миша млечна жлеза с пренесен c-Ha-ras ген, съдържащ точкова мутация. Един ген c-Ha-ras е под промотор MMTV-LTR в тези клетки NIG-8 ras и по този начин експресията му може да се регулира чрез дексаметазона /37/. Когато тези клетки експресират ген c-Ha-ras, те образуват огнища върху блюдото за клетъчно култивиране и колонии в суспензията. Клетките NOG-8 ras, култивирани върху блюдо за клетъчно култивиране, експресират синдекан в еднакви количества с нормалните клетки в състояние на непълно сливане (subconfluency state). Обаче, експресията на синдекан е значително понижена, когато тези клетки показват трансформационен фенотип, т.е. поява на огнища върху плаката или клетките, прорастват като колонии в суспензия. Обаче при тези различни начини на клетъчно култивиране количествата на синдекановата иРНК остават на същото ниво. По този начин регулирането на синдекана на клетъчната повърхност е организирано посттранскрипционно в тези клетки. Тези резултати показват, че е обикновено явление експресията на синдекан да се понижава по време на трансформацията, но начинът, по който е регулирана в различните клетки, би могъл да варира от един трансформиран клетъчен тип до друг.

Пример за онкогенно редуциране загубата на синдеканова експресия е показан на фигурите ЗА и ЗВ.

Фигура ЗА е снимка, показваща суспензия на епителни клетки от миша млечна жлеза, култивирани в монослоеве, като един слой е трансформиран с ras-онкоген, а фигура ЗВ е графично изображение на съдържанието на синдекан в клетъчна повърхност на монослоевете, показани на фигура ЗА. Експресията на синдекана е определена количествено във всяка от епителните клетки, култивирани в монослоеве а,Ь,с и г, и след ras-индукция - в суспензия d. Установява се, че синдеканът е изчезнал от мишите епителни клетки, трансформирани с ras-онкоген.

Следователно онкогенно индуцираната злокачествена трансформация също така води до загубата на синдекан от повърхността на епителните клетки, което показва, че загубата на синдекан е обикновена характерна черта на злокачествената трансформация и че определянето на тази загуба е ценно диагностично средство за определянето на наличието и размера на трансформации от рамков тип.

Има три предпочитани начина, по които да се определя съдържанието на синдекан по метода съгласно изобретението, а те са: биохимичен, имунохимичен и молекулярнобиологичен. Първият е основан на биохимичната оценка на синдекан, който може да бъде част от сърцевинния протеин или ковалентносвързаните вериги GAG. Показано е, че синдеканът може да даде специфични вериги GAG, които могат да осигурят специфични взаимодействия за синдекана /38,39/. Поради това синдеканът може да бъде открит чрез осигуряване на специфична за синдекан лиганда. Обаче, други осъществими методи използват специфични за синдекан антитела и сДНК, описани по-долу.

С клонирането на човешки синдекан / 40/ или изолирането му от тъкан от човек, като клетъчната линия НВ-100 от човешка млечна жлеза /41/, е възможно да се получават антитела срещу човешки синдекан. Това може да се постигне чрез имунизиране на животни за получаване на поликлонални или моноклонални антитела или клетки in vitro за получаване на моноклонални антитела с изолиран незасегнат човешки синдекан, части от него, синтетични пептиди или слети протеини, предвидени чрез клон но човешката сДНК. В практиката на представеното изобретение за определяне на съдържанието на синдекан могат да бъдат използвани общоприети методи на молекулярната биология, микробиологията, рекомбинантната ДНК и имунологията и такива методи са напълно обяснени в литературата. /например /43/. Като се използват човешки специфични антитела за синдекан, синдекановата експресия в тъканите може да бъде изследвана с класическите имунохистологични методи, както е показано в модела, илюстриран на фигури от 2А до 2D. В тях, специфичното разпознаване е обезпечено чрез първото антитяло /поликлонално или моноклонално/, но при системата за вторично определяне може да се използват флуоресциращи, ензимни или други конюгирани вторични антитела. В резултат на това се получава инумохистологично оцветяване на тъканния срез за патологично изследване. Тъкани могат също да бъдат екстрахирани например с урея и неутрален детрегент за освобождаването на синдекан за анализа Western biotting /43,44/. По този метод, който се основава на използването на катойонни твърди фази, количественото определяне на синдекан може да бъде осъществено, като се използва за стандарт изолиран синдекан. Този метод може да бъде приложен също така и за телесни течности. С тези пробои чрез определена моларна концентрация на синдекана се установят стандартни стойности за съдържание на синдекан в различни телесни течности ,като серум, плазма, урина, гръбначномозъчна течност и т.н. Нормалното появяване на количества синдекан може след това да бъде установено чрез използване на стойности от здрави доброволци и сравняване на тези стойности със стойностите на лица с различни заболявания или болестни състояния.

Промените на синдскановата експресия /отделянето на синдекан/ може също да бъде определено чрез използване на синдеканова сДНК. Въпреки че синдеканът между отделните видове е добре запазен, структурните разлики на нуклеотидното ниво са до голяма степен достатъчни, за да се избегне използването на миши синдекан при определянето на човешка синдеканова иРНК. Новата на иРНК на даден генен продукт могат да бъдат определени въз основа на специфичното взаимодействие на същите видове нуклеотидни вериги с противоположна последователност, кодиращи синдекана. Това може да бъде осъществено чрез използването на метода in situ за тъканните проби, анализ за защита на иРНК за изолирана РНК или полимеризация, насочена от праймър /primer-directed polymerization/ на синдеканови специфични нуклеотидни вериги. Всички тези методи са напълно обяснени в литературата, например в споменатите преди това “Current Protocols in Molecular Biology”/.

Специфични методи съгласно изобретението са представени в следващите примери. Примерите са представени за илюстрация и не го ограничават.

Примери за конкретно изпълнение

Пример 1. Локализация на синдекан в трансформирани епителни клетки.

Клетки от линия Shionogi S115 от миши тумор на млечната жлеза се култивират по установената практика в DMEM /среда на Eagle, модифицирана по Dulbecco /,допълнена с 5 % топлинноинактивиран фетален телешки серум /i-FCS/, пируват 1 тМ, глутамин 1 тМ, пеницилин 100 lU/ml, стрептомицин 100 gg/ml и тестостерон 10 пМ. За изследвания, включващи хормонна обработка, се използва хранителна среда, допълнена с фетален телешки серум, обработен с декстранов въглен /DCFCS/ с или без, 10 пМ тестостерон и/или 1 μΜ ципротеронацетат. За опитите се посяват клетки при плътност 10,000 клетки за cm² върху блюда за тъканни култури по Nunc. За преброяването на клетките, те се лизират в 10 тМ Hepes, 1.5 тМ MgCl₂, съдържащ Zaboglobin (Coulter Electronics,Ltd.) и отделените ядра се суспендират в изотон (Coulter) и накрая се преброяват на клетъчен брояч на Coulter.

Клетки S 115 се оцветяват на четвъртия ден от цялостната култура, както е посочено в литературата /45/. Протеогликанът на клетъчната повърхност - синдекан е имунолокализиран с моноклонално антитяло 281-2 на плъх срещу сърцевинния протеин на протеогликана /46/ и тези оцветявания се контролират чрез използване на друго lgG2a моноклонално антитяло Mel - 14, специфично за самонасочващия се лимфоцитен рецептор /47/. Определянето на имобилизираните антитела от плъх се извършва със заешки антиплъхов FITCконюгат.

Пример 2. Определяне на променена синдеканова експресия при трансформация на епителни клетки, индуцирана с хормон.

За количественото определяне на синдекан върху клетъчни повърхности на клетки S115 клетъчните монослоеве се промиват няколко пъти с леден PBS и външният домен на молекулата се отделя с говежди панкреатичен трипсин / Sigma, Type III; 20 pg/ml/ чрез 10-минутно инкубиране върху лед, както е описано в /49/. След инактивирането на трипсина чрез трипсинов инхибитор 100 pg/ml клетките се центрофугират, супернатантата се отделя за количествено определяне на външния домен и клетките се суспендират в изотон за преброяването им. Моноклоналното антитяло 281-2 се обработва с радиоактивен йод чрез метод на окисление с хлорамин - Т /50/ до специфична активност 14 х 10⁶ cpm/pg. Супернатантите от клетки 2 х 10³ и пречистен контролен синдекан от клетки NMuMG са положени върху катионна мембрана /Zeta-Pr-obe, BioRad/B апарат minifolslot (Schleicher & Schuell),описан в литературата /51/. Мембраната се отстранява от slot - апарата и се инкубира за 1 Н при стайна температура в PBS с добавяне на 10% FCS, за да се блокира мембраната. След това тя се инкубира за една нощ при +4°С в PBS, съдържащ 281-2, белязани с йод 125 /10,000 cpm/ml/. След промиване на филтъра пет пъти с PBS той се експонира на филм Kodak X-Omat за онагледяване на връзката 281-2. За количественото определяне на всеки прорез се извършва анализ с лазерен денситометър LKB Ultroscan XL enhanced laser densitometer и сравнен c известно количество синдекан от клетки NMuMG.

Външните домени на клетки S115, освободени от трипсина, се утаяват и фракционират с етанол върху гел SDS-PAGE с градиент /4-10%/ /52/. След електрофореза се трансформират проби върху Zeta-Probe membrane с използване на electroblotting 2005 Transphor apparatus (LKB), описан в литературата /53,54/ и мембраната се излага на въздействието на антитела 281-2, белязани с йод 125, както е описано по-горе. Отново за сравнение може да бъде използван синдекан, изолират от външния домен на клетки NMuMG.

Пример III. Определяне на изменената генна експресия на синдекан в трансформирани епителни клетки. Цялото количество РНК се изолира чрез 4М гуанидинизотиоцианат и се утаява с CsCl, както е описано в литературата /55/. Аликвотни части от РНК по 15 pg се фракционират върху формалдехид агарозен гел /1%/ и се пренасят на Gene Screen Plus membrane. При условия, определени от производителя на мембраната (New England Nuclear), се извършва хибридизация с multi-prime (Amersham) белязан инсерт на РМ-4 сДНК проба за синдекан /56/. Имобилизираната проба се визуализира чрез експониране на мембраната на филм Kodak X-Omat при 70°С и количественото определяне на 2.6 kb иРНК се извършва с денситометричен анализ, описан погоре. Експресията на синдеканова иРНК се съпоставя с рибозомна РНК, описано в литературата /57/. Специфичността на потискане на синдекан по-нататък се изследва чрез проучване на същите проби за глицералдехид 3-фосфатдехидрогеназа /GAPDH/ на плъхове /58/ и миши алфаактин /59/.

Хибридизацията in situ на сРНК за парафинови срезове се извършва съгласно метода, описан в лит.източник /60/. 535 bp Sac I Κρη I, фрагмент от частичния клон на сДНК за миши синдекан /РМ-4/ /61/, се субклонира /62/ във вектора на riboprobe pGEM-4z / Promega, Madison, WI). Клонираният плазмид, съдържащ инсърта, се линеаризира с ензими Eco RI или Hind III и се получават копия, в правилна или противоположна посока, от комплементарни вериги, съответно с полимерази Т7 или SP6, в присъствието на 35_S-UTP / Amersham, Willshire,/. Максималната дължина на копията се намалява до <200 Ьр чрез алкална хидролиза и фракциите с най-висока специфична активност се събират, утаяват, и разтварят в хибридизационен буфер. Предварително обработените проби върху микроскопски стъкла се хибридизират за една нощ при

50⁽’С и методите за отстраняване на неспецифичните връзки на пробата /включваща много строги промивки и обработка с рибонуклеаза А/ и автографирането се осъществяват, както е описано в литературата /63/.

Пример 4. Определяне на изменената синдеканова експресия в тъканни срезове, произхождащи от тумори. Предизвикват се тумори в светло пигментирана неокосмена мъжка мишка от линията hr/hr СЗН/Tif (Bomholdgaard, Denmark) чрез подлагане на животните на облъчване с УВ-А и УВ-В, както е описано в литературата /64/. По време на периода на наблюдение 12 месеца, се появяват общо 83 папиломи, 2 кератоакантома, 4 сквамоцелуларни карцинома, една комбинирана карциносаркома и 11 саркоми, при повишено образуване на тумори, свързващо се с интензивно УВ-А облъчване /582 J/cm²/ плюс интензивно УВ-В облъчване /действащо еритермално= ЕЕ//1,0 J/cm²/ плюс интензивно УВ-В облъчване /ЕЕ//0.08 J/cm²/ /67 срещу 28 тумора/. Вземат се проби от всички макроскопски наблюдавани тумори, както и от нормално изглеждащата кожа, изложена на УВ-облъчване. Част от пробите се фиксират в 10% формалин, съдържащ буфер, поставени в парафин, срязани и рутинно оцветени с хематоксилин и еозин. Остатъците от пробите се замразяват в азот и се срязват. Уврежданията се класират съгласно стандартните хистопатологични критерии. В някои случаи за визуализиране на базалните мембрани се използва оцветяване с перйодна киселина - Шиф /PAS/, както и багрилата на Herovic, Weigert, трихромно - на Masson и на Gomfri за колагенови типове, а също и други багрила и електронномикроскопски анализ, когато е необходимо.

За имунохистохимично локализиране на синдекан се използва моноклонално антитяло 281-2 на плъх, това антитяло е специфично за външния домен на сърцевинния протеин на миши синдекан /18/. За да се определи имобилизираното антитяло 291-2, се използва авидинбиотин-пероксидазният метод, както е описан в литературата /65/. След депарафиране на рехидратиране на тьканните срезове, се блокира ендогенната пероксидазна активност чрез инкубиране на микроскопските стъкла с проби в 100% метанол, съдържащ 3% водороден преокис, за 30 min. След това срезовете се инкубират с 2% нормален кози серум (Vector

Laboratories Inc. Burlingame, СА) в трисбуферсн физиологичен разтвор, pH 7.4 /TBS/ за 30 min при стайна температура /RT/ за свеждане да минимум на неспецифичното оцветяване. Срезовете се покриват с първото антитяло 281-2 при концентрация на протеин 2 pg/ml в 1% /тегло/обем// BSA-TBS и се инкубират за една нощ при 4°С. След това микроспосктите стъкла с пробите се инкубират с обратен с биотин кози противоплъхов IgG / Jackson’s Immunoresearch Laboratories, Inc. West Baltimore, Pennsylvania/ при разреждане 1:1000 в 1 % BSA-TBS за 30 min при стайна температура и накрая с авидинбиотинпероксидазен комплекс (Vectastain kit, Vector Laoratories, Burlingame, СА) за 30 min при стайна температура. След промивки пероксидазната активност демонстрира чрез инкубиране на микроскопските стъкла с проби с 0,5 mg/ml 3,3' -диаминобензидин тетрахидрохлорид (DAB, Polysciences, Inc., Northampton, England) в TBS, съдържащ 0,68 mg/ml имидазол и 0.01 % водороден перокис за 5 min на тъмно. Микроскопските стъкла с проби допълнително леко се оцветяват с хематоксилин на Mayer и се включват в среда Depex Mounting BDH Limited Pool, Ehgland). Между всеки стадий микроскопските стъкла с проби се промиват три пъти с трисбуферен физиологичен разтвор /TBS/. За контролни срезове се използва нормален IgG от плъх (Sigma, St,Louis, Мо) при 2pg/ml. няколко замразени среза от всеки туморен тип също се оцветяват и имат за резултат идентична имунореактивност, както тази на поставените в парафин тъканни срезове. Промените в концентрацията на първите антитела и времето за инкубиране не променят значително вида на оцветяването.

Пример 5. Определяне на изменената експресия на синдекан по време на трансформация, индуцирана с ras-онкоген. Клетките NOG-8 представляват субклон на линия от нормални епителни клетки на миша млечна жлеза, ras-клетките NMuMG и NOG-8 са линия на клетките NOG-8, която е била пренесена с плазмид, съдържащ глюкокортикоиден индуцируем MMTV-LTR промотор, свързая с ген сHa-ras, съдържащ точкова мутация. Клетките се отглеждат в хранителна среда RPMI-1640 (Gobco), с прибавен 5% фетален телешки серум, обработен с декстранов въглен (DCCFCS), глутамин, пеницилин (100IU/ml) и стрептомицин (lOOpg/ml). В тези клетки експресията па ген c-Ha-ras може да бъде максимално индуцирана чрез добавяне на 1 μΜ дексамстазон (Sigma) към средата за клетъчно култивиране. Обработването с DCC се използва за отстраняване на допълнителните стероиди от серума, които могат да повлияят на експресията на пренесения ген. Когато се изследват суспензионните култури, бактериологичните блюда се покриват с 1 % arap (Sigma) в RPMI1640, за да се предотврати възможната адхезия на клетките към субстрата. Клетките се посяват при плътност lxlO⁵ /ml. Броят на клетките се определя след обработване с трипсин. Преработването се извършва с брояч Coulter (Coulter Electronics, Hialeah). PM-4 е проба на сДНК за синдекан, първоначално клонирана от Saenbers и сътрудници /66/. Тя проявява две ивици от 2.6 kb и 3.4 kb от нормални клетки на миша млечна жлеза.

За приготвяне на РНК блюдата с клетъчни култури се промиват два пъти с леден фосфатнобуферен физиологичен разтвор /PBS/ и след това се разтварят в 4М буфер GIT/4M гуанидинизотиоцианат в 5 тМ натриев цитрат /рН 7.0/, 0.1 М β-меркаптоетанол и 0.5% Nлаирилсаркозин/. Екстракцията на цялото количество РНК се извършва чрез центрофугиране при плътностен градиент от CsCl, както е описано в литературата /67/. За анализ чрез Northern blot пробите от РНК се разделят чрез електрофореза в 1 % формалдехидагарозен гел. Тези гелове се нанасят върху хибридизационна мембрана GeneScreen. Предварително филтрираните се хибридизират в 1 М NaCl, 1% натриевдодецилеулфат, 10% декстрансулфат, 5 х разтвор на Denhardt, 100 pg/ml ДНК от сперматозоид на сьомга, 50% формамид при 42°С. За хибридизацията се добавят проби multiprime-labeled рМ-4 или BS-9. Използва се изотоп Р32 (Amersham). Филтрите се промиват при 65°С за проба РМ-4 и при 60°С за проба BS-9 в 2 х SSC,1% натриев додецилсулфат и се автографират на филм Kodak XOmat или рентгенов филм на фирмата Fuji.

За количествено определяне на експресията на синдекан в клетъчната повърхност, клетките върху блюдата с култури се промиват три пъти с леден PBS. След това блюдата се инкубират в 0.5 mM K-EDTA /К-етилендиаминтетраоцетна киселина/ в PBS за 10 min при + 4°С. Към крайната концентрация се добавя 20 pg/ml трипсин (Sigma, Т-8128) и се инкубира за 10 min при +4°С. Трипсинът освобождава външния домен на синдекана в средата /68/. След това клетките се изстръгват със стъклена пръчка с гумен накрайник или колониите се суспендират и към крайната концентрация се добавя 100gg/ml трипсинов инхибитор (Sigma, Т-9128). Клетките се центрофугират /5 min.lOOx g/, супернатантата се събира и клетките се преброяват с Coulter Counter. Клетките в суспензията се събират в епруветка и колониите се отстраняват да се утаят за 5 min с последващо отстраняване на супернатантата, подобно на културите в блюдата на Петри. Колониите се промиват 3 пъти с леден PBS и се обработват с трипсин.

Подходящото количество супернатанта, което отговаря на 2x1ο⁵ клетки, се нанася върху катионно найлонова мембрана Zeta-Probe, Bio-Rad. Мембраната предварително се инкубира в инкубационен буфер /10% фетален телешки серум, 1 тМ натриев азид, PBS/ за един час при стайна температура. Радиоактивно белязано /метод Chloramine - Т/ МпаЬ 281-2/ моноклонално антитяло /69/, което разпознава външния домен на синдекана, се добавя към крайната концентрация от 10.000 CMP/ml и се инкубира за една нощ при +4°С. Филтрите се промиват с PBS за 10 min при стайна температура. Промиването се повтаря 10 пъти, след това филтрите се автографират върху рентгенов филм. Автографът се анализира с денситометър GelScan XL ultroscan densitometer (LKB) и програмен продукт GelScan SL software (LKB) и се стандартизира c изолиран външен домен /70/.

Предимствата на изобретението се състоят в това, че с него се доказват вредните трансформации чрез определяне на синдекановата експресия и съдържанието на синдекан, например в тъканите и в телесните течности. Методът може да бъде осъществен биохимично, имунохистохимично и молекулярнобиологично, като се използват специфични за синдекан лиганди, антитела /поликлонални или моноклонални/ и сДНК. по метода се съсредоточава вниманието по-специално върху злокачествените промени на епителните клетки, които показват силна склонност към експресия на синдекан по време на процеса на злокачествените трансформации. Анализът за синдеканова експресия при хиперплазия съ що е включен, поради важността му за преценяване на сериозността на този предшестващ стадий на злокачествено изграждане. Анализът за експресия на синдекан е особено полезен при класификацията на различни пролиферативни стадии на дисплазии, предшестващи злокачественото изграждане.

Claims (18)

1. Патентни претенции

   1. Метод за откриване на злокачественото изменение и състояние, предшестващо злокачествено изменение в човешки клетки, характеризиращ се с това, че се определя съдържанието на синдекан в клетките, присъстващ в първа течна или тъканна проба от човек, за която се предполага, че съдържа клетки със злокачествено новообразувание, клетки от предшестващия стадий на злокачествено израждане, хиперпластични клетки или клетки с морфологично изменение в сравнение с нормалното им състояние, като определеното съдържание на синдекан от първия етап се сравнява със съдържанието на синдекан, определено от втора проба клетки от биологичен материал, които са от същия тип течност или тъкан, като тези от първата проба, но са нормални или по-малко трансформирани от клетките от първата проба; след което се определя присъствието на злокачествените или предшестващите стадии на злокачествени изменения въз основа на присъствието на по-малко синдекан в първата проба, в сравнение с втората проба от биологичен материал.
2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че изменението е злокачествена трансформация.
3. 3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че изменението е трансформация, предшестваща стадия на злокачествено израждане.
4. 4. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че изменението е хиперплазия.
5. 5. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че изменението е морфологично изменение.
6. 6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че съдържанието на синдекан в първата проба е определено чрез анализ на съдържанието на синдеканов протеиен.
7. 7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че съдържанието на синдеканов протеин се определя чрез използването на антитяло, което разпознава синдекановия протеин.
8. 8. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че съдържанието на синдекан в първата проба се определя чрез анализ на съдържанието на синдеканова иРНК.
9. 9. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че съдържанието на синдекан в първата проба се определя чрез метод, с който се анализира количеството на външния домен на синдекана в пробата.
10. 10. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че външният домен на синдекана от първата проба се освобождава от повърхността на клетката, преди да се анализира.
11. 11. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се използва човешко специфично за синдекан антитяло, за да се анализира съдържанието на синдекан в първата проба.
12. 12. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се използва човешка противоположна синдеканова иРНК, за да се анализира съдържанието на синдеканова иРНК в първата проба.
13. 13. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се използва противоположен синдеканов олигонуклеотид, за да се анализира съдържанието на синдеканова иРНК в първата проба.
14. 14. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че биологичният материал е телесна течност.
15. 15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че телесната течност е плазма.
16. 16. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че телесната течност е серум.
17. 17. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че телесната течност е урина.
18. 18. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че телесната течност е гръбначномозъчна течност.