PL168188B1 - Sposób wykrywania zmian zlosliwych i przedzlosliwych w komórkach ludzkich PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wykrywania zm ian zlosliwych i przedzlosliwych w komórkach ludzkich, w których w stanie niezlosliwym przez ekspresje tworzy sie syndekan, znamienny tym, ze oznacza sie zawartosc syndekanu jako bialka lub mRNA dla syndekanu w kom órkach znajdujacych sie w pierwszej próbce plynu ustrojowego lub tkanki z danego organizmu, pobranej z plynu lub tkanki podejrzanych o wystepowanie komórek zlosliwych, przedzlos- liwych, hiperplastycznych lub komórek ze zmianami morfologicznymi w stosunku do stanu normalnego, oznaczona zawartosc syndekanu lub mRNA porównuje sie z poziomami syn- dekanu lub mRNA otrzymanymi dla drugiej próbki materialu biologicznego, która zostala pobrana z plynu lub tkanki tego samego typu co pierwsza próbka materialu biologicznego, ale w której wystepuja komórki normalne lub mniej stransformowane niz komórki w pier- wszej próbce i obecnosc wymienionych zmian komórek okresla sie na podstawie mniejszej zawartosci syndekanu lub mRNA w pierwszej próbce pobranej z tkanki lub wiekszej za- wartosci syndekanu lub mRNA w pierwszej próbce pobranej z plynu ustrojowego w po- równaniu z zawartoscia w drugiej próbce odpowiednio tkanki lub plynu ustrojowego jako materialu biologicznego. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania zmian złośliwych i przedzłośliwych w komórkach ludzkich.

Wynalazek dotyczy ogólnie dziedziny biologii, takiej jak biologia nowotworów, a dokładniej metod wykrywania stanów przedzłośliwych i złośliwych tkanek, w jednym aspekcie przez wykrywanie utraty syndekanu przez tkanki, a w drugim przez wykrywanie pojawiania się syndekanu w ludzkich płynach ustrojowych sposobami, w których do wykrywania mogą być użyte płyny swoiste dla syndekanu, przeciwciała i sondy cDNA.

168 188

Cząsteczki na powierzchni komórek, które działają w swoistych interakcjach między powierzchnią komórek i pozakomórkową matrix (ECM), nazywa się receptorami matrix. Rozpoznawanie matrix przez te receptory odgrywa ważną rolę w regulacji kształtu komórki, proliferacji i różnicowania i stąd jest zjawiskiem kluczowym w prawidłowym rozwoju narządów i utrzymaniu architektury tkanek. Znane receptory matrix obejmują, na przykład, grupę transmembranowych receptorów glikoproteinowych, które mają wspólne cechy strukturalne i funkcjonalne i nazywane są integrynami [Hynes R. (1987) Cell 48: 549-554], glikoproteinę 67-kDa, która wiąże się z łańcuchem B1 laminin [Graf i in. (1987), Cell 48: 989-996] i proteoglikany powierzchni komórki (PG), które zależnie od składu glikozaminoglikanu (na przykład siarczan heparanu) mogą wchodzić w interakcje z różnymi cząsteczkami matrix [Jalkanen M.(1987) Med. Biol. 65: 41-47]. Adhezja, rozprzestrzenianie się, proliferacja i różnicowanie komórek zalezą od ścisłych kontaktów między powierzchnią komórki i otaczającą mata (ECM). Selektywne wykorzystanie interakcji ligand-receptor może in vivo prowadzić do różnorodnych swoistych interakcji komórek i macierzy, potrzebnych w rozwoju narządów (Ekblom i in. (1986) Ann. Rev. Cell Biol. 2: 27-47], Wiadomo, że transformacja zmienia odpowiedź komórki na ECM [Liotta L. (1986) Cancer Res. 46: 1-7], co sugeruje że zmiany w ekspresji receptorów macierzy w komórkach złośliwych mogą mieć miejsce [Plantefaber i Hynes (1989) Cell 56: 281-290, Cheresh i in. (1989) Cell 57: 59-69]. Zmiany te są w większości nieznane, ale mogą mieć fundamentalne znaczenie dla wyniku złośliwego zachowania się komórek różnych typów.

Proteoglikan na powierzchni komórek nabłonkowych sutka myszy składa się z regionu (domeny) błony lipofilowej [Rapraeger i Bernfield (1983) J. Biol. Chem. 258: 3632-3636, (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109] oraz oddziaływującej na matrix ektodomeny (ektoregionu) zawierającej łańcuchy zarówno siarczanu heparanu jak i siarczanu chondroityny [Repraeger i in. (1985) J Biol. Chem. 260: 11046-11052], Najnowsze klonowanie cDNA syndekanów myszy i człowieka potwierdziło istnienie tych regionów (domen) funkcjonalnych na białku rdzeniowym i ten PG został nazwany syndekanem [Saunders i in. (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556, Mali i in. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889]. Ektodomena syndekanu jest rozpoznawana przez mAb 281-2 [Jalkanen i in. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984, Jalkanen i in. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096] i wiąże się z dużym powinowactwem z włóknami kolagenowymi typu I, III i V [Koda i in. (1985) J. Biol. Chem. 260: 8157-8162] i z mniejszym powinowactwem z C-końcową domeną fibronektyny wiążącą heparynę [Saunders i Bernfield (1988) J. Cell Biol. 106: 423-430], trombospondyny [Sun i in. (1989) J. Biol. Chem. 264: 2885-2889] i tenascyny [Salmivirta i in. (1991) J. Biol. Chem. 266: w druku]. Wiązanie liganda ułatwia związek regionu (domeny) błony z bogatym w aktynę zrębem komórki [Rapraeger i in. (1986) J. Cell Biol. 103: 2683-2696]. Jednak komórki nabłonkowe mogą także wydzielać ektodomenę przez rozpad proteolityczny białka rdzenia, które oddziela ektodomenę od domeny błony [Jalkanen i in. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096, Weitzhandler i in. (1988) J. Biol. Chem. 263: 6949-6952]. Dlatego syndekan może wiązać zrąb komórek nabłonkowych z matrix ale także rozluźniać związek nabłonka z matrix. Poprzez te związki syndekan może pośredniczyć w organizacji matrix w kierunku organizacji komórkowej i wpływać na zachowanie się komórek. Ponieważ syndekan oddziaływuje głównie ze składnikami zrębu jak włókna kolagenowe i fibronektyna, może on działać jako łącznik między tkanką nabłonkową i mezenchymalną. Ten rodzaj komunikacji jest ważny dla prawidłowego różnicowania się nabłonka i tworzenia narządów.

Ekspresja syndekanu podczas rozwoju i tworzenia narządów podlega ograniczeniom raczej morfogenetycznym niż histologicznym [Theseff i in. (1988) Dev. Biol. 189: 565-572], co również przemawia za czynną rolą syndekanu jako receptora matrix podczas rozwoju. Syndekan zlokalizowano głównie na różnych komórkach nabłonkowych [Hayashi i in. (1987) J. Histochem. Cytochem. 35: 1079-1088], ale można go znaleźć także na powierzchni komórek plazmatycznych [Sandereon i Bernfield (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9562-9566]. Syndekan lokalizuje się także w kondensującej się mezenchymie, obok pączkującego nabłonka podczas tworzenia się narządów [Thesleff i in. (1988) Dev. Biol. 189: 565-572]. Stwier4

168 188 dzono, ze jego ekspresja w mezenchymie jest regulowana przez kontakt nabłonka zarówno w zrębie [Vainio i in. (1988)], jak i w nerce właściwej [Vainio i in. (1989)] i w obu tkankach jego ekspresja może być skorelowana w przestrzeni i czasie z morfogenezą tych narządów.

Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wykrywania stanów przedzłośliwych i złośliwych w komórkach ludzkich.

Stwierdzono, że w komórkach w stanie potencjalnie szkodliwej transformacji złośliwej lub przedzłośliwej, następuje zahamowanie ekspresji genu syndekanu, a w konsekwencji w tkankach jest mniejsza zawartość tego białka w porównaniu z jego poziomem w komórkach zdrowych. Ponadto stwierdzono, że w stanie chorobowym syndekan jest wyrzucany z powierzchni komórek i pojawia się w płynach ustrojowych. W sposobie według wynalazku wykorzystano tę obserwację w celu wykrycia złośliwej lub przedzłośliwej transformacji komórek.

Taka metoda nie była znana dotychczas w stanie techniki. Zmiany komórek tego typu, np. komórek rakowych, są zwykle wykrywane przez badanie histologiczne. Metoda według wynalazku nie opiera się na ocenie wizualnej, która zawsze jest, w mniejszym lub większym stopniu, oceną subiektywną.

Sposób według wynalazku polega na tym, że oznacza się zawartość syndekanu jako białka lub mRNA dla syndekanu w komórkach znajdujących się w pierwszej próbce płynu ustrojowego lub tkanki z danego organizmu, pobranej z płynu lub tkanki podejrzanych o występowanie komórek złośliwych, przedzłośliwych, hiperplastycznych lub komórek ze zmianami morfologicznymi w stosunku do stanu normalnego, oznaczoną zawartość syndekanu lub mRNA porównuje się z poziomami syndekanu lub mRNA otrzymanymi dla drugiej próbki materiału biologicznego, która została pobrana z płynu lub tkanki tego samego typu co pierwsza próbka materiału biologicznego, ale w której występują komórki normalne lub mniej stransformowane niż komórki w pierwszej próbce i obecność wymienionych zmian komórek określa się na podstawie mniejszej zawartości syndekanu lub mRNA w pierwszej próbce pobranej z tkanki lub większej zawartości syndekanu lub mRNA w pierwszej próbce pobranej z płynu ustrojowego w porównaniu z zawartością w drugiej próbce odpowiednio tkanki lub płynu ustrojowego jako materiału biologicznego.

Omawiany sposób można przeprowadzić kilkoma metodami, w tym metodami biochemicznymi, immunohistologicznymi lub metodami biologii molekularnej. Metoda nadaje się do wykrywania szkodliwej transformacji, takiej jak stan przedzłośliwy lub złośliwy, w całym szeregu organizmów, szczególnie jednak nadaje się do wykrywania szkodliwej transformacji komórek ludzkich. Transformacje, które można wykryć obejmują stany przedzłośliwe i złośliwe, w tym zmiany hiperplastyczne i morfologiczne.

Poziom syndekanu-białka można oznaczać wykorzystując obecność przeciwciała dla syndekanu w próbce materiału biologicznego. Można tez oznaczać ilość ektodomeny syndekanu, którą w pierwszej próbce uwalnia się z powierzchni komórki przed oznaczeniem. Do oznaczania poziomu syndekanu w pierwszej próbce wykorzystuje się zwłaszcza przeciwciało swoiste dla syndekanu ludzkiego. Poziom syndekanu w pierwszej próbce można też określać poprzez zawartość mRNA dla syndekanu w tej próbce wykorzystując ludzki antysensowny mRNA dla syndekanu lub ludzki antysensowny oligonukleotyd syndekanu.

Wykrywanie obecności lub braku obecności syndekanu można przeprowadzić na różnych materiałach biologicznych, takich jak komórki, tkanki i płyny ustrojowe, obejmujące zwłaszcza surowicę, osocze, mocz, płyn rdzeniowy i na wyciągach z innych tkanek.

Dalsze cechy, cele i zalety obecnego wynalazku staną się bardziej wyraźne przy dokładnym rozważeniu następującego opisu wynalazku, wraz z załączonymi rysunkami.

Figura 1A przedstawia graficznie zawartość syndekanu na powierzchni komórek wobec czasu, ilustrując ubytek syndekanu w komórkach nabłonkowych sutka myszy transformowanych działaniem testosteronu.

Figura 1B przedstawia graficznie ekspresję mRNA syndekanu wobec czasu, ilustrując ubytek syndekanu w komórkach nabłonkowych sutka myszy transformowanych działaniem testosteronu.

168 188

Figury 2A do 2D przedstawiają zdjęcia skrawków mysiego materiału biologicznego skóry - na których widać postęp ekspresji syndekanu po ekspozycji materiału na światło UV.

Figura 3A przedstawia zdjęcie zawiesin komórek nabłonkowych sutka myszy, hodowanych w pojedynczych warstwach, z jedną warstwą transformowaną onkogenem ras.

Figura 3B jest graficzną ilustracją zawartości syndekanu na powierzchni komórek dla pojedynczych warstw pokazanych na fig. 3A.

Obecny wynalazek opiera się w części na danych, które świadczą, że wykrywanie syndekanu jest cennym kryterium diagnostycznym dla określania stanu złośliwego w materiale biologicznym takim jak komórki nabłonkowe. Podano przykłady trzech doświadczalnych sposobów indukcji transformacji (indukcja hormonalna, drażnienie UV i indukcja onkogenem) i w każdym z nich wykazano wyraźny ubytek syndekanu. Wykrywanie ubytku syndekanu jest cenne także w innych procesach prowadzących do transformacji, takich jak powstawanie nowotworów, dlatego też obecny wynalazek nie ogranicza się do procesów wymienionych wyżej. Na przykład wykrywanie syndekanu może dostarczyć cennej informacji także w niektórych stanach proliferacyjnych tkanek (na przykład skóry, nerki, mózgu, płuca, pęcherza), które później mogą się przekształcić w stadia bardziej złośliwe. Tak zwane stadia przedzłośliwe, które często obserwuje się jako dysplazje, wykazują różne poziomy syndekanu, co jest informacją potrzebną do oznaczenia ciężkości choroby i ustalenia właściwego leczenia. Ważnym materiałem do wykrywania syndekanu są również krążące komórki plazmatyczne. Ich analiza omawianą metodą, w której stosuje się swoiste przeciwciała dla syndekanu, taka jak analiza FACS (fluorescent activated cell sorter) dostarcza cennej informacji co do stanu patofizjologicznego pacjenta z chłoniakiem, szpiczakiem, białaczką i innymi stanami proliferacyjnymi komórek hematopeotycznych.

Wiadomo, ze syndekan jest uwalniany z powierzchni komórek [Jalkanen i in. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096] i być może w niektórych chorobach ubytek syndekanu z powierzchni komórek powoduje jego pojawianie się w płynach ustrojowych. Zgodnie więc z obecnym wynalazkiem cenne diagnostycznie jest mierzenie ilości syndekanu w surowicy, osoczu, moczu, płynie mózgowo-rdzeniowym i innych wyciągach z tkanek, celem określenia stopnia destrukcji tkanek i zaniku prawidłowej morfologii komórek w badanych tkankach.

Jak wspomniano uprzednio, syndekan jest to proteoglikan powierzchni komórkowej, złozony z kowalencyjnie związanych łańcuchów glikozaminoglikanu (GAG) i złączonego z błoną białka rdzeniowego [Saunders i in. (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556]. Łańcuchy GAG syndekanu należą do grupy siarczanu heparanu i siarczanu chondroityny [Rapraeger i in. (1985) J. Biol. Chem. 260: 11046-11052] i nie są ograniczone do syndekanu. Białko rdzeniowe syndekanu jest jedyne w swoim rodzaju i określa tę cząsteczkę jako należącą do kilku podobnych proteoglikanów powierzchni komórki [Mall i in. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889]. Syndekan mysi został pierwotnie izolowany i nadal jest zwykle wykrywany przy pomocy monoklonalnego przeciwciała (MnAb 281-2) przeciw białku rdzeniowemu syndekanu [Jalkanen i in. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984],

Dla dalszego wyjaśnienia obecnego wynalazku, ekspresję syndekanu analizowano w stosunku do indukcji złośliwego fenotypu na trzech różnych niezależnych modelach biologicznych, z których każdy dawał w wyniku złośliwą transformację komórek nabłonkowych. We wszystkich tych modelach obserwowano ubytek ekspresji syndekanu równoczesny ze złośliwą transformacją. Wyniki są krótko przedstawione w następujących modelach, dla ilustracji obecnego wynalazku.

W pierwszym modelu zastosowano linię komórek raka sutka myszy, Shionogi 115 (SI 15). Te komórki są doskonałym modelem do badań nad transformacją fenotypu, ponieważ odpowiadają zwiększoną szybkością wzrostu na androgeny [King i in. (1976) J. Steroid Biochem. 7: 869-873] i przy tym zmieniają morfologię z nabłonkowej na fibroblastyczną [Yates i King (1981) Cancer Res. 41: 258-262], W obecności androgenu komórki przylegają luźno do podłoża i nabywają zdolność do wzrostu w zawiesinie, bez przyczepiania się do matrix, podczas gdy bez androgenu przylegają ściśle do podłoża i nie rosną w zawiesinie [Yates i King (1981) Cancer Res. 41: 258-262] Podstawa zmian morfologicznych i niezależności przyczepiania się

168 188 jest w większości nieznana, chociaż zaproponowano kilka mechanizmów, w tym zmiany w organizacji zrębu komórkowego [Couchman i in. (1981) Cancer Res. 41: 263-269] i w mechanizmach parakrynowych [Darbre i King (1988) w Rak sutka; Breast cancer: Cellular and Molecular Biology, wyd. M. E. Lippman i R. B. Dickson, Academic Publishers, str. 307-341],

Komórki S115 traktowane testosteronem wykazały silne, zależne od RGDS wiązanie z fibronektyną (FN), ale nie wiązały się z wiążącą heparynę domeną FN, co wskazuje na ekspresję cząsteczek podobnych do integryny. Natomiast komórki S115 hodowane bez testosteronu wykazywały morfologię nabłonkową i wiązanie z wiążącą heparynę domeną FN, co wskazuje na zmianę ekspresji syndekanu w komórkach S115 traktowanych hormonem. Zarówno ilość wiążącej się z matrix ektodomeny syndekanu, oznaczanej ilościowo testem radioimmunologicznym i Westemblot, jak i mRNA syndekanu (2,6 kb) zmniejszyły się w komórkach S115 traktowanych hormonem. Dodatek antyandrogenu - octanu cyproteronu - do podłoża hodowlanego znosił wpływ testosteronu na mRNA syndekanu. Tak więc inaktywacja genu syndekanu i następujące w wyniku hamowanie ekspresji syndekanu jest związane ze zmienionymi własnościami adhezji, zanikiem fenotypu nabłonkowego, a z drugiej strony z pojawieniem się fenotypu przypominającego transformowany w komórkach S115 traktowanych hormonem.

Przykład powyższych wyników jest przedstawiony na fig. 1A i 1B. Fig. 1A przedstawia porównawczo graficznie zawartość syndekanu na powierzchni komórki wobec czasu, ilustrując ubytek syndekanu w komórkach nabłonkowych sutka myszy (S115) transformowanych przez traktowanie testosteronem. Fig. 1B przedstawia porównawczo graficznie ekspresję mRNA syndekanu, ilustrując ubytek syndekanu w komórkach nabłonkowych sutka myszy transformowanych działaniem testosteronu. Obrazy te pokazują złośliwe zachowanie się i utratę ekspresji syndekanu, co jest widoczne w poziomie białka na fig. 1A i w poziomie mRNA na fig. 1B po ekspozycji.

Z powyższego widać, ze dodatek androgenu do hodowli S115 daje w wyniku hamowanie ekspresji syndekanu wskutek inaktywacji genu syndekanu. To hamowanie ściśle wiąże się z nabyciem niezależności przyczepiania się i z utratą fenotypu nabłonkowego, stąd też jest jedną z przyczyn wystąpienia zachowania się podobnego do transformowanego komórek S115 w obecności androgenu.

W drugim modelu badano immunoreaktywność syndekanu u nagich myszy (hr/hr) wystawionych na promieniowanie UV-A i UV-B. Dodatnie barwienie obserwowano na powierzchni prawidłowych komórek naskórka, jak również w torbielach poronnych torebek włosowych skóry charakterystycznych dla myszy tego szczepu. Wczesna reakcja na promienie UV, wykazująca przerost naskórka z niewielką atypią komórkową, była również dodatnia chociaż barwienie powierzchni komórek naskórka było zredukowane. Próbki z ciężką dysplazją wykazały słabe barwienie w warstwie ziarnistej komórek, natomiast warstwa podstawowa komórek była ujemna. W brodawczakach i rogowiaku kolczysto-komórkowym stopy immunoreakcja na syndekan występowała w łagodnych hiperplastycznych komórkach naskórka a także w proliferujących komórkach naskórkowych torbieli rogowych. Złośliwa transformacja wyrażona jako powstawanie raków i mięsaków z komórek łuskowatych była jednakowo związana z utratą barwienia syndekanu. Wyniki te są zgodne z uprzednio stwierdzoną zredukowaną ekspresją syndekanu związaną z transformacją złośliwą hodowanych komórek nabłonkowych, ale sugerują również ważną rolę syndekanu w utrzymaniu normalnej architektury tkanek i w obrazie różnicowania skóry.

Przykłady tych barwień są pokazane na fig. 2A do 2D. Są to zdjęcia skrawków materiału biologicznego skóry myszy, pokazujące postęp ekspresji syndekanu po ekspozycji na światło UV. Na fig. 2A widać prawidłowy materiał skóry, fig. 2B i 2C pokazują różne stadia hiperplazji, skrawek na fig. 2C wykazuje pewien stopień złośliwej histologii. Obrazy te wykazują jak hiperplazja indukowana promieniowaniem UV stopniowo traci ekspresję syndekanu.

Z powyższego widać, ze komórki nabłonkowe in vivo i otoczone swoim normalnym środowiskiem tracą ekspresję syndekanu w procesie złośliwej transformacji, co znów wskazuje, że ekspresja syndekanu jest niezbędna dla prawidłowej morfologii komórek i integralności

168 188 tkanek, ale także, że utrata dyspersji syndekanu może być skorelowana z ciężkością dysplazji i złośliwości komórek nabłonkowych.

W trzecim modelu użyto linii komórek nabłonkowych sutka myszy po transfekcji punktowo zmutowanym genem c-Ha-ras. W tych komórkach NOG-8 gen c-Ha-ras jest pod kontrolą promotora MMTV-LTR i stąd jego ekspresja może podlegać regulacji deksametazonem [Ciardiallo i in. (1989)]. Gdy dochodzi do ekspresji genu c-Ha-ras w tych komórkach, tworzą one ogniska w jednolitej warstwie w hodowli oraz kolonie w zawiesinie. W komórkach NOG-8 ras hodowanych w jednolitej warstwie ekspresja syndekanu zachodziła w takich samych ilościach jak w normalnych komórkach w warstwie niepełnej. Jednak ekspresja syndekanu była znacznie zredukowana gdy komórki wykazywały fenotyp transformacyjny, to jest w warstwie występowały ogniska lub komórki rosły w skupieniach w zawiesinie. Jednakże poziom mRNA syndekanu był taki sam w tych różnych hodowlach. Zatem w tych komórkach syndekan powierzchni komórki jest regulowany po transkrypcji. Wyniki te wskazują, że jest zjawiskiem powszechnym, ze ekspresja syndekanu jest zredukowana podczas transformacji, ale sposób regulacji w różnych komórkach może być różny w różnych typach transformowanych komórek.

Przykład indukowanej onkogenem utraty ekspresji syndekanu jest przedstawiony na fig. 3A i 3B.

Figura 3A przedstawia zdjęcie zawiesin komórek nabłonkowych sutka myszy hodowanych w jednolitych warstwach, przy czym jedna warstwa została stransformowana onkogenem ras, a fig. 3 przedstawia graficznie zawartość syndekanu powierzchniowego w pojedynczych warstwach pokazanych na fig. 3A. Ekspresja syndekanu była oznaczana ilościowo w każdej pojedynczej warstwie komórek nabłonkowych a, b, c i f oraz po indukcji ras w zawiesinie d. Jak widać, syndekan zanika w komórkach nabłonkowych myszy transformowanych onkogenem ras.

Jak z powyższego wynika, złośliwa transformacja indukowana onkogenem dała w wyniku także utratę syndekanu z powierzchni komórek nabłonkowych, co wskazuje, ze zanik syndekanu jest powszechną cechą złośliwej transformacji i że wykrywanie tego zaniku jest cennym narzędziem diagnostycznym dla określenia transformacji typu nowotworowego i ich ciężkości.

Są trzy wybrane sposoby oznaczania zawartości syndekanu zgodnie z obecnym wynalazkiem, to jest metody biochemii, immunochemii i biologii molekularnej. Pierwsza jest oparta na rozpoznaniu syndekanu, który może być częścią białka rdzeniowego albo kowalencyjnie związanych łańcuchów GAG. Stwierdzono, ze syndekan może wykazywać swoiste łańcuchy GAG, które mogą odpowiadać za specyficzne interakcje syndekanu [Elenius i in. (1990) J. Biol. Chem. 265: 17837-17943, Salmivirta i in. (1991) J. Biol. Chem. 266: w druku]. Zatem syndekan można wykrywać przez dostarczenie liganda swoistego dla syndekanu. Inne odpowiednie metody polegają na użyciu swoistych dla syndekanu przeciwciał i cDNA jak opisano niżej.

Przy pomocy klonowania ludzkiego syndekanu [Mali i in. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889] lub jego izolacji z materiału ludzkiego, jak linia komórek sutka człowieka HBL-100 [Elenius i in. (1990) J. Biol. Chem. 265: 17837-17843] można otrzymać przeciwciała przeciw syndekanowi człowieka. Można to osiągnąć przez uodpornienie zwierząt dla wytworzenia przeciwciał poliklonalnych albo monoklonalnych, albo używając komórek in vitro celem produkcji przeciwciał monoklonalnych z izolowanym natywnym syndekanem ludzkim, jego fragmentami, syntetycznymi peptydami albo białkami fuzji przewidzianymi przez ludzki klon cDNA. W praktyce omawianego wynalazku do oznaczania zawartości syndekanu można użyć konwencjonalnych technik biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinacji DNA i immunologii i te techniki są w pełni opisane w literaturze. Patrz na przykład Current Protocols in Immunology (1990), Greene Publishing Associates oraz John Wiley and Sons, Inc.

Używając swoistych przeciwciał dla syndekanu ludzkiego można badać ekspresję syndekanu w tkankach klasycznymi metodami immunohistologicznymi, na przykład tak jak jest to pokazane na modelu przedstawionym na fig. 2A do 2D. Swoiste rozpoznanie zapewnia

168 188 przeciwciało pierwszej warstwy (poliklonalne lub monoklonalne), a w układzie detekcji można użyć przeciwciało drugiej warstwy koniugowane fluorescencyjnie, enzymatycznie lub inaczej W wyniku otrzymuje się barwienie immunohistochemiczne skrawka tkanki do badania patologicznego. Tkanki można także ekstrahować, na przykład mocznikiem i obojętnym detergentem, celem uwolnienia syndekanu do Western blotting albo badania dot/slot [Jalkanen i in (1985) J. Cell Biol. 105. 976-985, Jalkanen i in. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096]. W tej technice, która jest oparta na zastosowaniu stałych faz kationowych, syndekan może być oznaczony ilościowo przy użyciu izolowanego syndekanu jako standardu. Można także tę technikę zastosować do płynów ustrojowych. Z tymi próbkami molowe stężenie syndekanu będzie pomocne w ustaleniu standardowych wartości zawartości syndekanu w różnych płynach ustrojowych, jak surowica, osocze, mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy itd. Prawidłowe pojawienie się syndekanu można ustalić używając wartości uzyskanych u zdrowych ochotników i porównując je z wartościami u osób z różnymi stanami lub chorobami.

Zmiany w ekspresji syndekanu można wykrywać także przy użyciu cDNA syndekanu, takiego jak ludzki cDNA syndekanu. Chociaż syndekan między gatunkami jest dobrze zachowany, różnice strukturalne na poziomie nukleotydów są na tyle duże, że uniemożliwiają użycie mysiego syndekanu do wykrywania mRNA syndekanu ludzkiego. Ogólnie poziomy mRNA dla danego produktu genu można wykryć na podstawie swoistej interakcji postaci normalnej i nonsensownej tych samych łańcuchów nukleotydowych, w tym przypadku dla syndekanu. Można to osiągnąć używając techniki próbek tkankowych in situ, badania protekcji mRNA z izolowanym RNA albo ukierunkowanej przez primer polimeryzacji łańcuchów nukleotydowych swoistych dla syndekanu. Wszystkie te techniki są w pełni objaśnione w literaturze, na przykład w wyżej wspomnianych Current Protocols in Molecular Biology.

Swoiste metody zgodnie z obecnym wynalazkiem są przedstawione w niżej podanych przykładach. Należy rozumieć, ze przykłady są podane dla ilustracji i nie ograniczają wynalazku, tak jak został on uprzednio opisany, do tych szczególnych przykładów.

Przykład I. Lokalizacja syndekanu w transformowanych komórkach nabłonkowych.

Komórki mysiego guza sutka Shionogi S115 z hodowli zapasowej hodowano rutynowo w DMEM (Eagle podłoże w modyfikacji Dulbecco) uzupełnionym 5% inaktywowanej cieplnie płodowej surowicy cielęcej (i-FCS), 1 mM pirogronianu, 1 mM glutaminy, 100 jedn/ml penicyliny, 100 pg/ml streptomycyny i 10 nM testosteronu. Do badań obejmujących traktowanie hormonem podłoże wzrostowe uzupełniano 4% płodowej surowicy cielęcej traktowanej dextranem i węglem aktywnym (DC-FCS) oraz używano lub nie 10 nM testosteronu i/lub 1 pM octanu cyproteronu. Do doświadczeń wysiewano komórki o gęstości 10 000 na cm² na płytkach Nunc do hodowli tkanek. Do liczenia komórki poddawano lizie w 10 mM HEPES, zaboglobin zawierającą 1,5 mM MgCL (Coulter Electronics Ltd) i uwolnione jądra zawieszano w Isoton (Coulter) i liczono w liczniku komórek Coulter.

Komórki S115 niczym nie traktowane barwiono czwartego dnia hodowli, jak opisano [Jalkanen i in. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984], Proteoglikan powierzchni komórkowej syndekan - lokalizowano immunologicznie szczurzym przeciwciałem monoklonalnym 281-2 przeciw białku rdzeniowemu proteoglikanu [Jalkanen i in. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984] i barwienie to kontrolowano innym przeciwciałem monoklonalnym Me 1-14 (IgG2a) swoistym dla umiejscowionego receptora limfocytów [Gallatin i in. (1981) Nature 304: 30-34], Detekcję unieruchomionych szczurzych przeciwciał wykonywano króliczym koniugatem FITC anty szczur (Janssen Biochimica).

Przykład II. Wykrywanie zmienionej ekspresji syndekanu w indukowanej hormonem transformacji komórek nabłonkowych.

Do ilościowego oznaczania syndekanu na powierzchni komórek S115, pojedyncze warstwy komórek przemywano kilkakrotnie zimnym PBS i ektodomenę cząsteczki uwalniano trypsynąz trzustki bydlęcej (Sigma, typ III, 20 pg/ml) przez 10 minutową inkubację na lodzie według Rapreager i Bernfield (1983) J. Biol. Chem. 258: 3632-3636, (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109 Po inaktywacji trypsyny inhibitorem (100 pg/ml) komórki wirowano, nadsącz zebrano do ilościowego oznaczenia ektodomeny, a komórki zawieszono w Isoton do li168 188 czenia. Monoklonalne przeciwciało 281-2 znakowano jodem radioaktywnym metodą utleniania chloraminą T [Stahli i in. (1983) Meth. Enzymol. 92: 242-253] do aktywności właściwej 14,1 x 10⁶imp/min/pg. Do badania nadsącz z 2 x 10⁵ komórek oraz oczyszczony syndekan kontrolny nakładano na kationową błonę nylonową (Zeta-Probe, BioRad) w aparacie minifold-slot (Schleicher i Schuell) jak opisano wcześniej [Jalkanen i in. J. Cell Biol. 105: 3087-3096 (L987)]. Błonę zdejmowano z aparatu slot i inkubowano 1 godzinę w temperaturze pokojowej w PBS uzupełnionym 10% FCS dla zablokowania błony. Następnie inkubowano ją przez noc w 4°C w PBS zawierającym 281-2 znakowane ^l25J (10 000 cpm/ml). Po pięciokrotnym przemyciu filtra PBS, eksponowano go filmem Kodak X Omat celem uwidocznienia związanego 281-2. Dla ilościowego oznaczenia każdy slot analizowano densytometrem laserowym LKB Ultroscan XL i porównywano ze znaną ilością syndekanu z komórek NMuMG.

Ektodomeny uwolnione trypsyną z komórek S115 strącono etanolem i frakcjonowano w gradiencie 4-10% SDS-PAGE [O’Farrell (1975) J. Biol. Chem. 250: 4007-4021]. Po elektroforezie próbki przeniesiono na błonę Zeta-Probe i zastosowano aparat Electroblotting 2005 Transphor (LKB) jak opisano wcześniej [Jalkanen i in. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984, Rapraeger i in. (1985) J. Biol. Chem. 260: 11046-11052], błonę poddano działaniu 281-2 znakowanego ^l25J jak opisano wyżej. Dla porównania można użyć izolowaną ektodomenę syndekanu.

Przykład III. Wykrywanie zmienionej ekspresji genu syndekanu w transformowanych komórkach nabłonkowych.

Całkowity RNA izolowano przy użyciu izotiocyjanianu guanidyny 4M i wirowania w CsCl, jak opisali Chirgwin i in. (1979) Biochem. 18: 5294-5299. Porcje RNA po 15 pg frakcjonowano na żelu agarozowym z formaldehydem (1%) i przenoszono na błonę Gene Screen Plus. Hybrydyzację z sondą cDNA ze znakowanym multi-prime (Amersham) insertem PM-4 dla syndekanu [Saunders i in. (1989) J. Celi Biol . 108 : 1547-1556] przeprowadzono w warunkach podanych przez producenta błony (New England Nuclear). Unieruchomioną sondę uwidoczniono przez ekspozycję z filmem Kodak X Omat w 70°C i 2,6 kb mRNA oznaczono ilościowo analizą densytometryczną jak opisano wyżej. Ekspresja mRNA syndekanu była skorelowana z rybosomalnym RNA zgodnie z opisem Denis i in. (1988) Nucl. Acid Res. 16: 2354-2359. Swoistość supresji syndekanu badano dalej testując niektóre próbki z dehydrogenazą 3-fosforanową gliceraldehydu (GAPDH) [Fort i in. (1985) Nucl. Acid Res. 13: 1431-1442] i alfa-aktynąmysią [Minty i in. (1981) J. Biol. Chem. 256: 1008-1014].

Hybrydyzację cRNA in situ na skrawkach parafinowych przeprowadzono metodą Wilkinsona i in. (1989) Developm. 105: 131-136. Fragment 535 bp Sac I-Kpn I z częściowego klonu cDNA dla mysiego syndekanu (PM-4) [Saunders i in. (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556] subklonowano [Vainio i in. (1991) Development, oddano do druku] do wektora pGEM-4Z rybosondy (Promega, Madison, WI). Klonowany plazmid zawierający insercję przeprowadzono w postać liniową enzymami Eco RI lub Hind III i na niciach komplementarnych wytworzono nonsensowne i sensowne transkrypty, przy pomocy polimeraz T7 lub SP6 w obecności ³⁵S-UTP (Amersham, Willshire, Anglia). Maksymalną długość transkryptów zredukowano do < 200 bp hydrolizą zasadową i frakcje o najwyższej aktywności właściwej zebrano, wytrącono i rozpuszczono w buforze hybrydyzacyjnym. Przygotowane skrawki hybrydyzywano przez noc w 50°C i sposobami opisanymi wcześniej [Wilkinson i in. (1985) Development 105: 131-136] usunięto nieswoiste wiązanie (bardzo dokładne płukanie i traktowanie rybonukleazą A) i wykonano autoradiografię.

Przykład IV. Wykrywanie zmienionej ekspresji syndekanu w skrawkach tkanek pobranych z nowotworów.

Guzy wytworzono u lekko pigmentowanych nagich myszy samców szczepu hr/hr C3H/Tif (Bomholdgaard, Dania) przez napromienienie zwierząt UV-A i UV-B według Talve i in. (1990) Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 7: 109-115. W okresie obserwacji 12 miesięcy wystąpiło ogółem 83 brodawczaki, 2 rogowiaki kolczastokomórkowe, 4 raki płaskokomórkowe, jeden mieszany rakomięsak i 1 mięsaków, przy czym zwiększone tworzenie się guzów było związane z wysoką dawką UV-A (582 J/cm²) plus wysoka UV-B (efektywna

168 188 w wywoływaniu rumienia - EE) (1,0 J/cm²) plus wysoka UV-B (EE) (0,8 J/cm²) (78 wobec 28 nowotworów). Pobrano próbki ze wszystkich guzów widocznych gołym okiem oraz wyglądającej prawidłowo skóry po ekspozycji na UV. Część próbek utrwalono w 10% buforowanej formalinie, zatopiono w parafinie i sporządzono skrawki do rutynowego barwienia hematoksyliną-eozyną. Pozostałe próbki zamrozono w azocie i krojono skrawki. Zmiany klasyfikowano według standardowych kryteriów histopatologicznych. W niektórych przypadkach stosowano również barwienie kwasem nadjodowym - odczynnikiem Schiffa (PAS) dla uwidocznienia błon podstawnych oraz barwienie Herovic, Weigert, Masson trichrom i Gomori na typy kolagenu, a także inne barwienia i mikroskopię elektronową w razie potrzeby.

Celem immunohistochemicznej lokalizacji syndekanu użyto szczurze przeciwciało monoklonalne 281-2. Przeciwciało to jest swoiste dla białka rdzeniowego ektodomeny syndekanu myszy (18). Zastosowano technikę awidyna-biotyna-immunoperoksydaza do wykrycia unieruchomionego 281-2 według Hsu i in. (1981) J. Histochem. Cytochem. 29: 577-580). Po odparafinowaniu i uwodnieniu skrawków tkanki, aktywność endogennej peroksydazy blokowano przez inkubację skrawków 100% metanolu zawierającym 3% nadtlenku wodoru przez 30 minut. Skrawki następnie inkubowano z 2% normalną surowicą kozią (Vector Laboratories Inc. Burlinghame CA) w soli buforowanej Tris, pH 7,4 (TBS) przez 30 min. w temperaturze pokojowej (RT) aby zminimalizować nieswoiste barwienie. Na skrawki nakładano przeciwciało pierwszej warstwy 281-2, w stężeniu białka 2 pg/ml w 1% (wag/obj) BSA-TBS i inkubowano przez noc w 4°C. Skrawki następnie inkubowano z biotynową kozią IgG anty szczur (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. West Baltimore, Pensylvania) w rozcieńczeniu 14 000 w 1% BSA-TBS przez 30 minut w RT i na koniec z kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza (Vectastain kit, Vector Laboratories, Burlinghame, CA) przez 30 minut w RT. Po przemyciu aktywność peroksydazy wykazywano przez inkubację skrawków przez 5 minut w ciemności z 0,5 mg/ml tetrahydrochlorku 3,3’-diaminobenzydyny (DAB, Polysciences Inc. Nothampton, Anglia) w TBS zawierającym 0,68 mg/ml imidazolu i 0,01% nadtlenku wodoru. Skrawki podbarwiano lekko hematoksyliną wg Mayera i montowano w Depex Mounting płynie (BDH Limited Pool, Anglia). Między wszystkimi etapami skrawki trzykrotnie przemywano buforowanym roztworem soli (TBS). Na skrawkach kontrolnych stosowano normalną szczurzą IgG (Sigma, St. Louis, MO) w stężeniu 2 pg/ml. Kilka skrawków mrożonych z każdego typu guza również barwiono i obserwowano identyczną immunoreaktywność jak w parafinowych skrawkach tkankowych. Zmiany w stężeniu przeciwciała pierwszej warstwy i czasu inkubacji nie zmieniały w sposób istotny obrazu barwienia.

Przykład V. Wykrywanie zmienionej ekspresji syndekanu podczas transformacji indukowanej onkogenem ras.

Komórki NOG-8 przedstawiają subklon linii komórek nabłonkowych normalnego sutka myszy NMuMG, a NOG-8 ras jest linią komórek NOG-8 po transfekcji plazmidem zawierającym dający się indukować glukokortykoidem promotor NMTV-LTR związany z punktowo zmutowanym genem c-Ha-ras. Komórki hodowano w podłożu hodowlanym RPMI-1640 (Gibco) uzupełnionym 5% płodowej surowicy cielęcej traktowanej dekstranem i węglem aktywnym (DCC-FCS), glutaminą, penicyliną (100 jedn/ml) i streptomycyną (100 pg/ml). W tych komórkach ekspresja genu c-Ha-ras może być indukowana maksymalnie przez dodanie do podłoża hodowlanego 1 pM deksametazonu (Sigma). Traktowanie DCC miało na celu eliminację z surowicy dodatkowych sterydów, które mogłyby wpływać na ekspresję transfekowanego genu. Do hodowli w zawiesinie płytki bakteriologiczne pokrywano warstwą 1% agaru (Sigma) w RPMI-1640 aby zapobiec możliwej adhezji komórek do podłoża. Komórki wysiewano z zawiesiny o gęstości 1 x 10⁵/ml. Liczbę komórek oznaczano po trypsynowaniu licznikiem Coulter (Coulter Electronics, Hieleah, FL). PM-4 jest odcinkiem cDNA dla syndekanu, wyklonowanym po raz pierwszy przez Saunders i in. (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556. Wykrywa on dwa prążki 2, 6 i 3, 4 kb w normalnych komórkach sutka myszy.

Do preparatyki RNA płytki z hodowlą komórek dwukrotnie płukano zimnym lodowatym roztworem soli buforowanym fosforanami (PBS) i następnie komórki rozpuszczano w 4 M buforze GIT [4 M izotiocyjanian guanidyny w 5 mM cytrynianie sodu (pH 7,0)], 0,1 M

168 188 betamerkaptoetanolu i 0,5% N-laurylosarkozynie. Całkowity RNA ekstrahowano przez wirowanie w gradiencie CsCl według Chirgwin i in. (1979) Biochem. 18: 5294-5299. Do analizy Northern blot próbki RNA rozdzielano elektroforezą w 1%o zelu agarozowym z formaldehydem. Próbki zelu nakładano na błonę hybrydyzacyjną GeneScreen. Filtry opracowywano wstępnie w 1 M NaCl, 1%o siarczanu dodecylu, 10% siarczanu dekstranu, 5 x roztworze Denhardta, 100 μg/ml DNA z mlecza śledzi, 50% formamidu, w 42°C. Do hybrydyzacji dodawano znakowane multiprime odcinki PM-4 lub BS-9. Używano izotopu P³²(Amersham). Filtry płukano w 65°C dla PM-4 i w 60°C dla BS-9 w 2 x sSc i 1% siarczanie laurowo-sodowym i autoradiografowano na filmie rentgenowskim Kodak X-Omat lub Fuji.

Do ilościowego oznaczania ekspresji syndekanu powierzchniowego komórki, hodowlę komórek na płytce przemywano trzykrotnie lodowatym PBS. Następnie płytki inkubowano 10 minut w 4°C z 0,5 mM K-EDTA w PBS. Dodano trypsynę (Sigma, T-8128) do końcowego stężenia 20 pg/ml i inkubowano 10 minut w 4°C. Trypsyna uwalnia do płynu hodowlanego ektodomenę syndekanu [Rapraeger i Bernfield (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109], Komórki zdrapano gumową skrobaczką albo zawieszono kolonie i dodano inhibitora trypsyny (Sigma, T-9128) do końcowego stężenia 100 (ig/ml. Komórki odwirowano (5 min, 100 x g), nadsącz zebrano, a komórki liczono w liczniku Coulter. Komórki w zawiesinie zebrano do probówki i odstawiono na 5 minut celem sedymentacji skupień komórek. Płyn z nad osadu, podobny do zawiesiny komórek hodowanych na płytkach Petriego zebrano, a skupienia komórek przemywano 3 razy lodowatym PBS i traktowano trypsyną.

Odpowiednia ilość nadsączu, odpowiadająca 2 x 10⁵ komórek, została nałożona na kationową błonę nylonową (Zeta Probe, Bio-Rad). Błonę inkubowano wstępnie w buforze inkubacyjnym (10% płodowej surowicy cielęcej, 1 mM azydek sodu, PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Radioaktywnie znakowane (metoda z chloraminą T) MnAb 281-2 [Jalkanen i in. (1987) J. Celi Biol. 105: 3087-3096], które rozpoznaje ektodomenę syndekanu, dodano do buforu inkubacyjnego do końcowego stężenia 10 000 cpm/ml i inkubowano przez noc w 4°C. Filtr płukano PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Płukanie powtórzono 10 razy, następnie filtr autoradiografowano na filmie rentgenowskim. Autoradiogramy analizowano densytometrem skaningowym GelScan XL (LKB) z przystawką GelScan SL 2400 (LKB), i standaryzowano przy użyciu izolowanej ektodomeny [Jalkanen i in. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096].

Podsumowując, obecny wynalazek jest przydatny w wykrywaniu potencjalnie szkodliwych transformacji, przez oznaczanie ekspresji syndekanu i jego zawartości, na przykład na poziomie tkanek i w różnych płynach ustrojowych. Sposób można wykonać metodami biochemii, immunohistochemii i biologii molekularnej, używając na przykład swoistych ligandów syndekanu, przeciwciał (poliklonalnych i monoklonalnych) i cDNA. Specjalną uwagę w tym wynalazku poświęcono złośliwym zmianom komórek nabłonkowych, które wykazują silny spadek ekspresji syndekanu w procesie złośliwej transformacji. Analiza ekspresji syndekanu obejmuje także hiperplazję, ze względu na jej wartość w określaniu w jakim stopniu to stadium przedzłośliwe jest poważne. Analiza ekspresji syndekanu jest szczególnie przydatna w klasyfikacji różnych przedzłośliwych stadiów dysplazji.

168 188

FIG. 2C

FIG. 2D

168 188 •W tW

U \O e

o

C .c u

N

Ł,

OJ •H

O a

ra c

c ra dd

OJ

Ό

C >, ω

a b c d f figura 3A

Figura 3B

168 188

Syndekan na powierzchni komórki

C ra

Ό

czas czas

Figura 1A Figura 1B

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz Cena l ,50 zł

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wykrywania zmian złośliwych i przedzłośliwych w komórkach ludzkich, w których w stanie niezłośliwym przez ekspresję tworzy się syndekan, znamienny tym, ze oznacza się zawartość syndekanu jako białka lub mRNA dla syndekanu w komórkach znajdujących się w pierwszej próbce płynu ustrojowego lub tkanki z danego organizmu, pobranej z płynu lub tkanki podejrzanych o występowanie komórek złośliwych, przedzłośliwych, hiperplastycznych lub komórek ze zmianami morfologicznymi w stosunku do stanu normalnego, oznaczoną zawartość syndekanu lub mRNA porównuje się z poziomami syndekanu lub mRNA otrzymanymi dla drugiej próbki materiału biologicznego, która została pobrana z płynu lub tkanki tego samego typu co pierwsza próbka materiału biologicznego, ale w której występują komórki normalne lub mniej stransformowane niż komórki w pierwszej próbce i obecność wymienionych zmian komórek określa się na podstawie mniejszej zawartości syndekanu lub mRNA w pierwszej próbce pobranej z tkanki lub większej zawartości syndekanu lub mRNA w pierwszej próbce pobranej z płynu ustrojowego w porównaniu z zawartością w drugiej próbce odpowiednio tkanki lub płynu ustrojowego jako materiału biologicznego.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że syndekan jako białko oznacza się przez obecność przeciwciała dla syndekanu.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zawartość syndekanu w pierwszej próbce określa się przez oznaczenie ilości ektodomen syndekanu w tej próbce.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, ze ektodomenę syndekanu w pierwszej próbce uwalnia się z powierzchni komórki przed oznaczeniem.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze zawartość syndekanu w pierwszej próbce oznacza się wykorzystując przeciwciało swoiste dla syndekanu ludzkiego.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zawartość mRNA dla syndekanu w pierwszej próbce oznacza się wykorzystując ludzki antysensowny mRNA dla syndekanu.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze zawartość mRNA dla syndekanu w pierwszej próbce oznacza się wykorzystując ludzki antysensowny oligonukleotyd dla syndekanu.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze jako materiał biologiczny stosuje się płyn ustrojowy.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako płyn ustrojowy stosuje się osocze.
10. 10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako płyn ustrojowy stosuje się surowicę.
11. 11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako płyn ustrojowy stosuje się mocz.
12. 12. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, ze jako płyn ustrojowy stosuje się płyn rdzeniowy.