BG97950A - Определяне съдържанието на синдекан в биологични материали, като тъкани и телесни течности за установяване на злокачествени трансформации на клетки - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до метод за откриване на потенциално вредна трансформация на клетки в даденорганизъм. По него се определя съдържанието на синдекан в проба от биологичен материал от организмаи се сравняват данните с еталон за съдържанието насиндекан в еталонен биологичен материал от същия тип.

Description

Настоящото изобретение ое отнася до областта на биологията, като раковата биология и по-точно-отнася се до методите за откриване на тъкани в предщестдув&ц стадий на злокачествено израждане или на тъкани със злокачествени тжори, от една страна - чтез опте а деляне на загубта на синдекан в тъканите и от друга стоана * чрез определяне иа появяването на оивдекан в човешки телесни течности с методи, при които за определянето могат да ое използуват проби от синдеканови специфични течности, антитела и ц ДЖ /циклична ДЖ/.

Молекулите на клетъчната повърхност, които функционират в специфични взаимодействия между клетъчната повърхност и междуклетъчното вещество /ЕСИ/ ое наричат рецептори на междуклетъчното вещество. Познаването на междуклетъчното вещество чоез тези рецептори игпае важа роля за регулирането на формата на клетката, проли* ферацията и диференциацията и затова има решаващ резултат за нормалното развитие на органите и поддържането на тъканния стпоеж. известните междуклетъчни рецептори включват, например, семейство от тоансмембранни глюкопоотеинови рецептори, които ои поделят обикновените структурни и функционални характерни свойства и ое наричат интегрини/1/.Глюкопротеинът 67 - шм ,който се свъозва с веригата ламинин BI /2/ и ппотеогликани на клетъчната повърхност / W, който в зависимост от глюкозамияогликановия състав /например хепарзнсулфат/мске да взаимодейотвува с редица молекули на междуклетъчното вещество /З/.лдхезилта /слепването/, разпространяването, пролифеоацията и диференцияцията на клетките всички са основани на тесни контакти между клетъчната повърхност и обкръжаващото междуклетъчно вещество.Селективното използуване·

- 2 наевзаимодействи·»© мввду лиганда и рецептор може да създаде in ▼1т^)азнообразието на специфичните взаимодействия между клетка и междуклетъчно вещество, необходамо за развитието на органите /4/. Известно е, че трансформацията изменя реакцията на клетките към междуклетъчното вещество /5/, навеждайки на мисълта, че може да са настъпили промени в изявата на рецепторите на междуклетъчното вещество чрез злокачествени клетки /6/, /7/* Тези промени до голяма степен са непознати, но могат да имат основна роля за резултата от болестотворното поведение на различни клетъчни типове.

Протеогликанът на клетъчната повърхност на миши епителни клетки от млечна жлеза се състои от липофилви мембранен домен /8/ и от външен домен взаимодействуващ с междуклетъчното вещество, съдържащ хепарансулфатни и хондроитинсулфатни вериги /9/. Наскоро клониране на цДНК на миши и човешки синдекани потвърди тези функционални домени върху сърцевинния протеин и този протеогликан /Р6/ беше наречен синдекан /10/, /11/. Външният домен на синдекана се разпознава чрез аАЪ 281-2 /моноклонално антитяло 281-2/ /12/,/13/ и той се свързва с висок афинитет към колагенови влакна Тип I, IIX и V /14/ и с по-нисък афинитет към С-терминален хепаринсвързващ домен на фибронектина /15/ тромбоспонданна /16/ и тенасцина /17 - под печат/. Лигандното свързване съдействува за присъединяването на мембранния домен към богатия на актин цитоскелет./18/. Епителните клетки,обвие, могат също да отслоят външния домен от клетъчната повърхност чрез протеолитично разцепване на сърцевинния протеин, който разделя външния домен от мембранния домен /19/,/20/. Следователно, синдеканът може да свързва епителния цитоскелет с междуклетъчното вещество, но също така разхлабва епителната връзка с междуклетъчното вещество. Чрез тези връзки синдеканът

- 3 жожа ца посредничи за ооганизадаята на междуклетъчното вещество в клетъчната организация и да повлияе на поведението на клетките. Тъй като оиндеканът главно взаилодвйствува със компонентите на ст рамата /съединителната тъкан/ кат© колагеновите влакна, синдеканът може да фдопдеашра като ксцуникатор между епителните и мезеи химните тъкани. Този тип в зъзна е кштичча за нормалната епителна диференциация и образуването на опганж.

Експресията /изявата/ на синдекан през време на развитието и образуването на оогани следва по-скооо морфогенетични, отколиото хистологични граници /21/, една особеност, която също обезпечава активна ооля на сивдекана като оецептоп на междуклетъчното вещество ппез вземе на развитието. Синдекан е бил локализиран главно въ{ ху различни епителни клетки /22/ но може, също така, да бъде намазан и върху повърхността на ШЕвзмадатите /23/. Сйндекан се локализира и към ямдавадо се мезенхим близо до прорастващия епител през време на образуването на озгани/24/. Показано е, че изявата /експресията/ цу в мезнхима е регулирана чрез епителния контакт в зъб /25/ и в метанефричен бъбрек /26/. И в двата типа тъкани експресията цу може да бъде свързана по пространство и вземе с мор· фогенезиса на тези озгани, каши ашшш на соцШиШ на шшш

Следователно, една от целите на предоставеното изобретение е да осигури метод за откриване на тъкани в ппедшествуващ стадий на злокачествено израждане или на тъкани оъс злокачествени тумори чрз определяне на загубата на синдекан в тъканите*

Друга цел на настоящото изобретение е да осигури метод за от е диването на тъкани в предшеструващ стадий на злокачествено израждане или на тъкани със злокачествени тумори чрез определяне на появяването на оиндекан в телесните течности.

Допълнителна цел на настоящото изобретение е да осигури метод, който е особено подходящ за откриването на тъкани в предават вувац стадий на злощадо^вено изоазщане или на тъкани със злокачествени тумоои в хора.

оц·» Друга, цел на настоящото изобпетение е да осигури би ах мичен, имунохистологичен или малекуляпноби алогичен метод, за да се определи изявата /експресията/ на сивдекан или съдържанието на оиндекан в тъкани или телесни течности, за да се определяг/за да се установя^ злокачествените или предшествуваните стадии на злока чеотвени трансформации на клетки.

Една по-далечна цел на настоящото изобретение е да обезпечи метод за установяване на хипетпластичтги промени на клетки.

Допълнителна цел на настоящото изобретение е да осигури метод за установяване на предполагаемите хипеппластични промени в клетки.

И още една друга цел на настоящото изобретение е да осигури метод за установяване на предполагаемите морфологични писмени в клетки.

Също така цел на настоящото изобретение е да осигури метод за количествена оценка на сивдекан в тъкани или телесни течности, за да се изработи индикаторна стойност.

Накратко, в по-яиооките му аспекти, настоящото изобпетение включва летсщ за установяване на потенциална воедна трансформация на клетки в даден организъм, методът включващ индикатор, απρι делящ съдържанието на оиндекан ст проба ст биологичен материал с организма и сравняване на определения индикатор за съдържание на оиндекан с еталонен индикатор за съдържание на оиндекан от еталонен биологичен материал, за предпочитане - материал от същи тип.

I

Предоставения метод може да бъде осъществен по множество начини, включващи биохимични, имунохистологични или молекуляенобиологични видове методи· Въпреки, че методът е положим еа установяване на вредна трансформация, като злокачествено състояние или предшествуван стадий на злокачествено състояние в едно широко разнообразие от организми, той е особено приложим за установяване на вредна трансформация в клетки, особено в човешки клетки· Трансформации, които иогат да бъдат установени включват предаествуващ стадий на злокачествени трансформации и злокачествени трансформации, включително хипетпластични и морфологични изменения· чоказване на наличието или липсата на синдекан може да бъде извършено върху различни биологични материали на организма, като клетки, тъкани и телесни течности, включително и особено за човешки биологични материали, серум, плазма, урина, гръбначномозъчна течност или други тъканни екстракти· Определянето на сияцекановото съдържание в биологични материали може да бъде извършено чрез използуването на различни начини, включително на синдеканови сп

чни лиганди или биохимични детерминанти, синдеканови специфични антитела и иРНК-и /информационни Ж/ или ц Ж-и /цикличн» да/ или олигонуклеотиди с обсатна последователност, кодиращи син декана.

допълнителни особености, цели и предимства на настоящото изобретение ще бъдат по-пълно и^снени от подробно обсъждане на следващото описание на предоставеното изобретение, заедно с придружа* вадите чептежи.

4iWU НА Ч&МЙШ» чертежите, фигураU е графично изображение на съдържанието на синдекан в клетъчната псвъжноот спрямо веенето, илюстрираща загубата на синдекан в епителни клетки от миша млечна жлеза, трай сформирани чоез въедействие е тестостеооя.

- б Фигура IB е графично изображение на експресия на иРНК, кодираща синдекана, опрямо времето, илюстрираща загубата на оиндекан в епителни клетки от миша млечна жлеза, тоанофоомизани чзез въз* действие о тестостврон.

Фигурите от 2А до 2 ® оа илюстрации на снимки на зреем от биологичен материал от кода на мишка , показващи напредвай ио на експресията на синдекана след излагане на материала на въздейства ето на ултравиолетова слетлииа.

Фигура ЗА е илюстрация на снимка, показваща суспензии на миши епителни клетки от млечна жлеза, отгледани в монослоеве с един •_w.. слой, трансформиран чоез вае - онкоген, и

Фигура ЗВ е графични изображения на съдържанието яа син декан в клетъчната повърхност за моноолоевете, показани на Фигура ЗА.

НЦдНЛлЮ 0Ш1ДУШ nA нНчЦдЮЧяГшШг. ЯВШгМ ЗА UUbdlbUl'BrtbAiii» ?1А

Настоящото изобретение ое основава на резултатите от изследванията, че откриване присъствието на синдекан е ценен диагностичен критерий за оценка на злокачествения характер на биологични матепиали,като епителни клетки. Дадени са примеси за три различни шедме експериментални намини, за да се предизвика /индуципа/ трансформация /хормонална индукция, раздразваме с УВ-оветлина и онкогеяна индукция/,и във всеки от тях беше показана очевидна згуба на синдекан. доказване на загуба на синдекан е ценна също τι жа и в други механизми, водещи до трансформация, като обрязване на тумори, и следователно настоялото изобретение не е ограничено само до посоченото по-горе. Лапсимео, откриването на син декан мо х.е да даде ценна инфолиация, също така, в няколко пполифесативни стадии на тъкани /например на кода, бъбрек, мозък, бял .дроб,пикочен мехур/, които по-късно могат да се ппевъ нат в стадии на по-злод

- 7 червено израждане. Тези така народени предшествуващи стадии на злокачествено израадане, които често оа наблюдавани като дисплазии, показват различни нива на оиедекая, което е необходима информация да ое оцени сериозността на заболяването, за да ое осигури подходящо лечение. Водна област за доказваме на присъствието на оиндекан е също така в циркулиращите плазматични клетки .Затова техния анализ чрез предоставения метод, който използува синдеканови специфични антитела, като например ₽АС - анализ / cart аоШшШ оШ1 ©orfcor //поточна цитометдея-бел.поев./ осигурява ценна информацифа патофизиологичното състояние на пациент £ с липома, миелома, левкемия лли друг псолифасативен стадий на хематопоетичните /кръвотворните/ клетки.

Известно е, че оиндекач се отделя и от клетъчната повърхност /27/ и това може да бъде така иде някои заболявания, Загубата на синдекан от клетъчните повърхности може да доведе до появата в телесните течности. По тази п дечица, според настоящото изобретение, от диагностична полза е да се измерят количествата на синдекан в серум, плазма, у дена, гръбначномозъчна течност или други тъкачни екстракти, за да се определи до каква степен в изследваните тъкани е настъпило разрушаване на тъканта и изчезва* С не на нормалната клетъчна мо фология.

Както беше споменато преди това»сичцеквнът е протеогликан на клетъчната повърхност, състоящ се от ковалентно свързани гяокозаминогликанови /£А£/ ведеги и включен в подбраната съпцевинан протеин /28/· Известно е, че глюкозаминогликановите вериги на синдекана принадлежат към групите на хепаоансулфата и хондроитинсулфата /29/ и не оа ограничени към синдекан· Съпцевинния поотеик на синдекана е уникален и определя тази молекула като член на няколко подобни протеогликани на клетъчната повърхност /30/. Алпи синдекан беше първоначално изолиран и обикнато опре* 3 — делен е моиоклонално антитяло 281*2 / >ШЬ 281-2/, в сравнение със същввинния протеин на син декан /31/»

За да ое обясни допълнително настожцсто изобретение, експресията /халвата/ на оиндекан беше анализирана във връзка е индукцията на злокачествено изроден фенотип в три различни независими биологични модела, всеки от тях получен в резултат на злокачествена трансформация на епителни клетки. Във зсички тези модели загубата на сицдеианова експресия беше наблюдавана едновременно със злокачествената трансформация. Тези резултати оа представени накратко в следващите модели заилюотшране на предоставеното изобретение.

В първия модел беше използувана тумоона клетъчна линия от миша млечна жлеза manogi 116 / 8115/. Такива клетки осигуряват отличен модел за изследвания на траяофотирания фенотип, тъй като отговарят /реагират/ на андрогени чоез повишаване скоооо та на растежа /32/ и чшз изменение от епителна до фибробластна морфология /33/. 3 присъствието на андроген клетките прилепват хлабаво към субстпата и пшдобиват способност да растат в суспензия без закрепване /фикоация/ към междуклетъчното вещество, докато в отсъствието на андроген те прилепват плътно към междуклетъчното вещество и не могат да растат изобщо в суспензия /34/. Базата за морфологичната пзамяна и самостоятелността при закрепване q до голяма степен иепозиата, въпреки няколко механизми, включващи промени в отгачизцяята на цитоокелета /35/ и в щфвкринните механизми, които са били предложени/36/ ·

Клетките 3115, обработени о тестостеоон показаха силно, зависимо от 8&BS* овъпзване към фибронектин /^®/, но никакво свързване към домена на свързващ хепарин, като по този начин показаха, че те извличащамолекули, подобни на интегоина. Вместо то- 9 ва, клетки ® 115, отгледани без тестостесоч показаха епителна морфология и свързване къл хепатиновьчзаащия домен на фибпонектича, означаваща посмяна на ппоявяването /експоеоията/ на синдекан в клетки S 115, третирани с хошон, В клетки s 115, третирани е хоомон ое понижиха количествата на въздиша домен на синдекана,овъ1 зващ се с междуклетъчното вещество,впоеделени количествено чрез оациоимуноачализ и чрез Weefeeroblot и на яРЖ, кодираща синце· кана /2.5 Ш /· добавянето на антиандрогешщпратеооиацетат към хранителната среда попречи на влиянието на тестостепона върху иРЖ, к оди пада син,декан а. Така, инактиви нането на сиицекановия ген и последвалото потискане на екоппесия /ппоява/ на синдекан е свъпзано с пременените адхезионни свойства, изчезването на епителния фено· тип и от друга стр«а · с появяването на подобен га тпанофопмипа! фенопш в клетки ³ 115, тпетиоа ни с хормон.

адин ппимер от горепосочените резултати е п подставен на гури 1А и 1В. Фищура 1А е сравнително графично представяне на съдържанието на синдекан в клетъчната повърхност спрямо в семето,илю отоираща загубата на синдекан в миши епителни клетки от млечна жл за / ©115/, тпансфоомипани чрез излагане на въздействието на тестостеоон и Фигура 1В е спавнително гоафично поедставяне на и Ж експресията /изявата/ на иНЖ, кодираща синдекана,еппямо времето, илюстрираща загубата на синдекан в миши епителни клетки от млечна жлеза, трансформирани чпез излаган© на въздействието на теотостеоон.Тези изобпажения показват злокачественото поведение и загубата на експресия на синдекан, което е очевидно в ппотайна на фигупя 1А и нивото на и№ на Фигура 1В след въздействието /на хормон От гореспоменатото е ясно, че добавянето на ачцроген към кул тури s 115 води до потискане синдеканодата екептеоия /ппоявяванет на сиддекан/, дължадо се на инактивиоане на синдекановия ген. Това потискане тясно корелира с постиганата на независимост към прилепване /фиксация/ и със загубата на епителен фенотип и следо10 ватвлно θ една от п жчичите за поведението на клетки S115, подобно на трансформираните, в птжсъствието на андроган.

Във втория модел беше изследвана и^нооеактижостта за оиндекан в яеокоомена / ЬжДг / мишка, изложена на въздействието на W-8 и W-®- облъчване, ьеше наблюдавано положително оцветяване на повърхността на нотмзлни епицеомаяни клетки, както и дермалните абортивни /недоразвити/ кооменоЬоликуляши кисти, характерни за тази миша линия» Ранната зеакция към УВ-облъчването, показваца хипераластичен епидермис с лека клетъчна атипичност също беше положителна, въпреки пониженото /оедуцираното/ оцветяване на епидермал w ните клетъчни повърхности. Ьоби със силна дисплазия показаха слабо оцветяване в зърнестия /гпанулаония/ клетъчен слой, докато базалчия клетъчен слой беше негативен /че беше оцшзтен-бел.поев./.

В папиломи и в солитарната кератоакантома, ицунореактивност за син декан беше наблюдавана в доброкачествени хипет ластични епидеркал* ни клетки, както и в поолиферисадите епицепмални клетки на роговите кисти»

Злокачествената тсаясфоомация, из пазена като образуване на карцияоми и саркоми на клетките на плоския епител беше неизменно свътзача със загубата на оцветяване на синдекана. Тези резултати са съвместими о предишните данни за понижена експресия /поява/ на оиадекан, свързана със злокачествена тзанофошация на култивираните епителни клетки, но също така подсказват за важна редя на синдекана за поддържането на метален тъкачен строеж и ход на дифередциацията на кожата.

На Фигури 24 до 2 В ва показани псимеси за тези оцветявания. Тези фигури са илйотрации на снимки на спази от биологичен материал от кожа на мишка, показващи напредването на синдеканова експоеоия след излагането на материала на въздействие на У В- светлина, Фиtypa 24 показва жтешо от чоомапна кажа и Фигуои 2В и 2 С илюс1 дарат различни евдии на хштешлазия, сзвзът кшгазан на Фигура 2С, свидетелствувац за хистология на някакво злокачествено израждане* Тези фигури показват хипорплазля в поедшествуващ стадий иа злокачествено израждане , лоздозикана от постепенна загуба на оинцеканова експресия, вследствие на УВ-облъчвано.

От горепосоченото е очевидно, че епителни клетки In тХтои поставени в н©знайното им обк тьжечие загубват синдекансва_та екопое** сия през време на процеса на злокачествена тмнсфотмация, което отново показва* че синдекановата екоппесия е необходима за нозмалнат клетъчна морфология и за целостта на тъканта, но също така и че за губата на синдеканова експресия може да корелира със значимостта на дисплазията и злокачественото израждан® на епителните клетки.

В третия модел беше използувана линия от епителни клетки на миша млечна жлеза с поенеоен с*Н«в» ще ген, съдържащ точкова мутация. £дин ген с-На-шв ® под поомотор кжма в тези клетки ПШ-8 »ав^{й п0 този} начин експресията му може да ое регулира чрез декоаматазояа /37/, Когато тези клетки проявиха ген c-Ha-mq-re образуваха огнища въпку блюдото за клетъчно култивиране и колонии в суспензията, клетките jscs-β хае култивирани въпху блЬдо за клетъчно култивиране екопоеоираха /отделиха/ сиедекан в еднакви количества с ноомалните клетки в състояние на непълно сливане (otiboon* tluency stateXP6a4e, експресията на синдекан беше значително пониже на, когато тези клетки показаха тзансротмациочеи фенотип,т.е.

върху плаката или клетките,вюшедаки като колонии в суспензия,имаше огнища, обаче при тези различни култивирания количествата на синдекансвата иРЖ останаха на същото ниво. По този начин регулиранзто на синцекаиа на клетъчната повърхност е организирано след транскрипцията в тези клетки. Тези резлтати показват, че обикновено явление е експресията иа синдекан да се понижава през време на тоанофо-шация, но начинът по който е рехулирана в различните клетки би могъл да валира от един тоанафо жиадн клетъчен тип към друг.

Пшмео за онкоганно редуцирана загуба иа аиндеканова експресия е показан на фигура ЗА и ЗВ.

Фигура ЗА е илюстрация на снимка, показваща суспензия на опи* тежи клетки от миша млечна жлеза, култивирани в монослоеве о едих слой трансформиран чоез шо-eneogme ,а фигура ЗВ е графично изображение на съдържанието на синдокап в клетъчна повърхност за монослоевете, показани на фигуоа ЗА. Експресията на синдекан беше определена количествено във всяка от епителните клетки, култивирани в монослоеве а,Ъ ,с иЖ и следад-индукция в суспензия &· Както се вижда, синдеканът е изчезнал от мишите епителни клетки, тоансформиаани с те- онкогоч.

©т споменатото по-горе е ясно, че онкогенно индуци паната зло качествена трансформация също така води до загубата на синдекан от повърхността на епителните клетки, което показва, че загубата на синдекан е обикновена характерна честа иа злокачествената трансформация и че определянето на тази загуба е ценно диагностично средство за определянето на тоанофопмации от паков тип и тежкия им характер.

Има таи предпочитани начини, по които да оо определя съдържанието на синдекан в съответствие с метода на настоящото изобре* тение, а те са. биохимичен, ицунохишчеи и мелекулятгобиологичен. довият е основан на биохимичната оценка на синцекан, който може да бъде част от съцевинния поотеин или ковалентносвъпзанитз вешги GAG. ^оказано е, че синдекжж може ца даде специфични вериги GAG, които могат т,а осигурят специфични взаимодействия за оиидекаиа /38//39/, Лопади това симдекакът може да бъде отяоит чрез осигуряване на специфична синдекздова лиганда. Обаче, други осъществими методи изполдужт оиядзканови специфични антитела и цДЖ-и , описа!;и по-долу.

С «допираното на човешки синдекан /40/ или изолираното му от чов&ша мзтсчниед,като клетъчната линия НВ -100 от човешка млечна жлеза /41/ е възможно да ое подучат антитела срещу човешки оинцекан* Това може да co постигне ч:юз имунизиране на животни за получаване на подаклонални или моноклонални антитела или клетки за поучавано на моноклоналяи антитела с изолиоан незасегнат синнекая, части от него, синтетични поптиди или слети протеини , прв; видени чрез клон на човешката ц Ж. В практиката на представеното изобретение аа определяне на съдържанието на синдекан могат да бъдат използувани общоприети методи на молекулярната биология, микробиологията, рекомбинантната Ж и имунологията и такива методи ο ι напълно обяснени в литературата. Виж, например , /43/. Като се използуват човешки ждекяяовя специфични антитела, синцекаяовата експресия в тъканите може да бъде изследвана с класическите ицунакистологични методи, както е показано в модела, илюстпи· пан на фигури от 2а цо 2 D. В тях, специфичното разпознаване е обезпечено чооз първото антитяло /поликлонално или мочоклоналнс/, £ но Π Λ1 системата за вторично определяне може да се използуват фдуооесцисащи, ензимни или други чиЬтови вторични антитела. В резултат на това ое подучава имуясхистояогично оцветяване на тъкаяния с рез за патологично изследване. Тъкани могат сщо за бъдат екстрахи рани, например, с уроя /капбамид/ и поутоалан детергеит за освобождаването на оиндекач за анализа Meet оса blotting иди dot/slot /43//44/. По този метод, който ое основава на използуването на катйонни твърди фази, количественото определяне на синдекач може да о

бъде осъществено като ое използува за стандарт излипая синдекан. Този метод може да бъде приложен също така и за телесни течности.

G тези пооби, една молаана концентрация иа синдекаяа ще по- 14 μογηθ да се установят стандартни стойности за съдържание на син де кан в различни телесни течности, като серум, плазма, урина, гръбначномозъчна течност и т,ч. Нормалното появяване на количества синдекан може след това да бъде установено чрез използуване на стойности от здрави доброволци и сравняване на тези стойности със стойностите на лица с различни заболявания или болестни състояния Промените на синдекановата експресия /отделянето на син декан може също да бъде определено чрез използуване на синдеканова цЖК Въпреки, че синдзканът между отделните видове е добре запазен, структурните разлики на ^{укле отиди от о ниво са до голяма степен до· Q статъчни, за да се избегне използуването на миши синдекан при опо<

делянето на човешка синдеканова иРНК. Общо взето, нивата на иЖК на даден генен продукт могат да бъдат определени въз основа на специфичното взаимодействие на същите видове нуклеотидни вериги с обратна последователност, кодиоащи синдекана. Това може да бъде осъществено чрез използуването на метод in situзатъканните проби, анализ за защита на иРНК за изолирала РЖ или полимеризация, насочена от 'праймьр * / priuer-directed polyserizaticn/ на синдеканови специфични нуклеотидни вериги· Всички тези методи са напълно обяснени в литературата, като напримео в споменатите преди това Текущи протоколи в молекулярната биология / Current Protocole In

Molecular Biology/»

Специфични методи, съгласно настоящото изобретение са предотг вени в следващите п:хшеж. Трябва да се Разбере, че примерите оа дадени за целите на илюстриране и ограничават изобретението, каете това беше споменато по-рано.

ЦНШьР 1

Н«Ид

Клетки от линия Shianogi 3115 ^{от №шй} тумор ^на млечната жлеза бяха култивирани по установената практика в ШЕМ /среда на Еас1е»мсдифицирана по ^^есео ц допълнена е 5% топлинноинакти ви жч феталея телешки сепуч / 1-P0S /, пируват /1 яИ /, rjqrra* мия /< аМ /₁ пеницилин /100 Ιϋ/al /, стжптомифн / 100yug/al / и тестоотепоя /ш шЛ За изследвания, вкледващи хопмоииа обработка боше използувана хаашттелнп спеца, допълнена с фатален телеокн серум, обработен с цекстпанов аъглон /ЖМГОК / с или без ДОпИ те стостеоон и/или 1 циппотеаснапетат. За опитите бяха посяти клетки при плътност 10,000 клетки за см въоху бледа за тъкания култури по Ме, оа преброяването на клетките, те бяха разтворени в 10 ш Норов, 1.3 Ш HgCl₂ съдържащ Zabcelcbln (Ш1ст

МосФгсс1се,1»М)и отделените ядра бяха суспендирани в изотон (вшйк Ш) и накоая * преброени на клетъчен бооич на Coaltet#

Клетки S 115 бяха оцветени на четвъртия ден от цялостната култура, както беше описано /45/. протеогликанът на клетъчната повърхност · сичдекан, беше ицунедодализиран с моноклонална анти тяло 281-2 на плъх срещу съ цзтгл-пия протеин ча пзотеогликаяа /46/ и тези оцветявания бяха контролирани чрез използуване на дру го XgG2a монооояшшо антитяло ЙШ - 14, специфично за о-ъмдаассчва.ция се лимфоцитен нецептоо /47/. Определянето на ииобилизиоаните /обездвижените/ антитела от плъх беше извършено със заешка антиплъсова ИТС~кон»гат?..

аЛ1Ь/ XI

Опоеделше яа променена синдекачова експресия при тоаноФормация на зпителт! клетки,, индуцирана с хормон,, За количественото опродолтае на син декан върху клетъчни повърхности на клетки ®115< клетъчните лоноолоеве бяха поолити няколко пъти с леден РВЗи вън/мия домен на молекулата беше отделен е волски панкреатичен тпипсин / каем» ЗД® ХИ|Я>ЛвЛа / чрез 10-минутно инкубиране въжу лед, както о описано в /49/, След инактивирайето на тпипсина чрез таил сян ое инхибитоо /100 ΛβΛΰΖ, озтките бяха цвнтрофугигжш, оупеоиедедтата беше отделена за количествено определя* не на външния домен и клетките бяха суспендирани в изотоп за преброяването им» ^оноклоналното антитяло 282-2 беше обработено с радиоактивен йод чрез метод на окисление с хлооамин - Т /50/ до специфична активност 2 х 10 ^cpm/^tg. Супезнатантите от клетки 2 х 1<Я и пречистен контролен синдекан от клетки mkui-ig бяха сложени въпху катйонна мембзана /Zeta-Probе,BioRad/fe апарат minifol Biot (Schleicher & Schueii), описан по-зано /51/. Мембраната беше отстранена от slot-апарата и иниубизача за 1 час при стайна температура в pbs с добавяне на 10* pcs ,за да се блокита ме\?б_;~аяата. След тежа тя беше инкубирана за една нощ при * 4°C в BBS, съдържащ 231-2, белязани с йод 125 /ю,ооо сри/mi/. След пре миване на филтъра пет пъти с pbs той беше експониран на фиш ко dak х-Omat за онагледяване на втьзката 231-2. За количественото определяне, яа всеки п озез беше извъ таен анализ с лазе рен денсиТОМеТЪр LKB Ultroscan XL enhanced laser densitometer И соавнен Ο известно количество синдекан от клетки

Външните домени на клетки SH5, освободени от тшпсича, бяха утаени и ф акциониааш а етанол въску гел sds-pags gradient /4-1(М/ /52/. След електрофореза бяха тоансфол®нани пзоби въгху Zeta-Probe membrane 0 ИЗПОЛЗуване на electroblotting 2005 Transph or apparatus (из), описан по-зано /53//54/ и мембраната бе® изловена на въздействие на 281-2, белязани с йод 125, както е описано по-го е. отново за равнение може да бъде използуван синдекан, изолиран от външния домен на клетки вж*

Ш ипоеделя-яе на изменената генна екешжсия на синдекан έ тзансфоширани епителни клетки, цялото количество ЖК беше изолирано е помощта на 4М гуанидичизотиоциачат и гранулиране на CsCl, ошоано в /55/» Аликвотш части от ЖК от 15^ts бяха фракциояирали въпку фориаддохидагарсзеи гол /14/ и поенеоени на Gene Screen plus membrane, π._χί условия., предложени от прсизведителя на мембраната _;<я.еи England 1ие1еаг)баже извъпвена хибридизация С multi-prime (Amersham) беЛЯЗЯО ВКЛЮЧение Яа РЙ-4 ц $К ПООба за оиндекан /56/ · Имобилизипаната проба беше визуализирана чрез експояипяче на мшбоччата на филм Kodak x-Omat пад 70¾ и количественото определяне яя 2.6 kb иРНК боде извъпшодо о денситомети чен анализ, описан по-горе. Експпесията на еиндеканова иРНК беше съпоставена с шбозаша 1М, описано в /57/. Опецифичноотта на потискана на сиздекан беше но-нататък изследва’*» чоез проучване на садите пзоби за глицералдедид З-фосфат цеди дрогоназ a /gapm / hi плъхозе/за/ и миш аафа-актин /59/.

Хибаддизацилта in situ на цН1К за пасафинови среди беше извършена съгласно метода в /60/. 535bp Sac I - Κρη I , фрагмент от паофадиин /частичния/ клон па ц№ за миши оиндекан /йМ/ /61/ беше субЕлои·' ач /52/ във вектора на riboprob е pGEM-4z / Promega, Madison, WI /. КлОЧИранИЯТ ЛЛаЗМИЦ, ОЪДЬрХаЦ ВКЛИЧМИ·* то, беше доведен в линеен зид с ензими Есо RI или Hind П1и бяха получени колим в тадена или противоположна посока от ко&шлемен* тгади веадги, съответно с погшмерази Т7 иж SP6 в присъствието На ^S-UTP /Amer sham, Will shir е,/* =;'ШОИМаЛЧаТЯ ТЗЛЖИЯа Ha КОПИЯта боде намалена до<2001?р /ьр« чифтове основи - бел.поев./ ο алкална хидролиза и фракциите с най-висока специфична активност беда събрани, утаени и разтворени в хибшдизационен буфер, ^редваадтелчо об^абстените проби върху микооскопски стъкла беда хиб* ридазижш за една нед пад 50¾ _й методита за отстранявай· на неспи^фпчяита връзки яа тадбвти /ькя^вадл ляогс строги промивки и об заоотка е рнбонуоеаза .V и автографиранато беда осъществени както е описано преди това /63/.

- 13 .

ДРдмЕ? .U

.....

Qg*W-ag.OHgx.taaw ©*.. ТУМОШ Елха подучени тумори в светло пигментирзна неокосмеяа шка мишка от линията й»Д^ 03В/Ш б^еаМ,Ийвшйфоез подлагане на кин отпити «а облъчване е У В-А и ^В-В,ямю е описано в /64/ · През време на периода на набадение 12 месеца, се появиха общо 83 папиломи, 2 иератоахаитож, 4 сива· моделулалчи карцижжи, з.даа комбинирана карциносажома и 11 саркоми при повишено образуване на тумори, свързващо се с интензивно УВ· А. облъчване / 582 / плюс интензивно У О-В облъчване / дайот· вувацо ернтемалнс · W / J/ca^ плюс интензивно /В-В облъчван* /ЕЕ/ 0*8 </<Шг / /73 срещу 28 тумо(»а/« .инха взета проби от всички маклоскодски наблюдами тумори, както и от ло-иадне изглеждащата кожа, изложена на /8-облъчзаче. Част от пвобите бяха фиксирани в W фосмалин, сдаокащ буфер, поставени в пажЬин, пазрззани и лутижо оцветени с хематоксилин и еозин, остатъкът от пообите бях 3'шраззни в азот и пазпязаии. «Увпеждачията бяха класи/ани съгласи стандартните хистопатологични «спите тия· В някои случаи за визуали зяпаче /онагледяване/ ча базалните мембоаш* беше използувано оцве тчваче о походна киселина - Шиф /PAg /, както и бягоилата на H®corio,w^eert, тжхромно - ла^ц^ и за колагенови типове, а също и други баг;ша и одектг№нномикт>о<жопски анализ, когато беше необхоцшо.

За имунаьитоомично локализиране; на синдекан беше използува но монсклонажо антитяло 281-2 на плъх· Това аятитял© е специфичю за пъчшчуг дежгн съ^звиччич тюгв«»и на миши синдекан /18/, За да се ог .адвжз игоб^лизигачотс антитяло 231-2, беше използува аслдачбиотин-пе_;>окси.дааниг. и^кто з зттса^!·’ η /55/· влзд деи 4жидряж шне на тяказниги срозя, беше блокирана ендогенната перокоидазна активност ч\-*ез иикубичаяе ла микроскоп19 ските

ΜίΜϊβ’Ι пернорв три· прл стъкла с в 19'г гц?т^яап, еъдъжиц 3^ водороден за 30 //'гут'·, .,;гр; тоза цраги-тс? бжа ^ияубич/аяи с 2^ чози езда (Vector Loboratorlce Inc, BwUngaae, СА) оперен (фивиавогичен тазтвоч, ри 7.4 / SSBS / за 30 минути стайна температура / В® / за овекдане до минимум на неспецифичното оцветяване. йпезите биха покрити с първото антитяло 281-2 при невцентрация на ппотеин Sytg/Hl в 13 /тегло/об>м// ISA и инвубипали за една чол п~и 4°С, След това шк зоскопоките стъкла с ппобите бяха ишг/би'нни е обработен η биотин кози поотивоплъхов

1G& / Лижеш, е laaonoreoeooh Lab «stories, Inc. west Baltiaore, iWmeylwoAA ппи разоежцане It 1000 в 1> BSA-23S яа 30 минути πα стайна температура и накрая с азиданбиотинле юкси пазен (Veotactaln Ut> ΤβΛ« вЙЙЛКИИ ^0А> за 30 минути ппи стайна темпе^тура. След промивки пероксидазната активност монетни лая а члез лжгуби мяе на мик-оокоаските стъкла с 0Л ag/ai 3,3* комплекс беше цепроби 0 * .дааминобен»! динтетзаодрахлорид (»ΑΒ>>β1τβ·Ι· сес,1пс., »®rtoap8<®tWtod ) θ OS, съдьртащ 0.68 дазой и 0.01¾ водороден пеоокис за 5 минути шк тъмно. Микроскопските стъкла о пооби бяха хоимхгтзлио леко сшотсш « хммвмам· (ВШ Waited жш на ледои в срзда Itoptat Мс«вШЛМ®едУ-воемй· стадии микроскопските стъкла с проби б:ка тзсмити трг пъти с тоиобуфервн фи-зиалогичен пазтвор / BBS/, За конт родни онези беше ивпоюувана носмална гагюсова IgS (81фвв»М«&омА·· Мс) пш 2/с@/яКяхолко замзазени соеви от всеки тумооея тип също бяха оцветени, имаврт за резултат идентична и^норвактивиоот както поставените в парафин тъкажи срези. Премените в концентрацията на първите антитела и времето а а иякубиранс не промениха значително вида на оцветявай·· то.

- 20 ’Миг

ПЯ1МЕР V

Определяне на изменената синдеканова експресия през време на трансформация, индуцирана с газ- онкоген. Клетките N0G-8 представляват субклон на линия от нормални епителни клетки на миша млечна жлеза, газ -клетките NMuMG и IT0G-8 са линия на клетките: IT0G-8, която е била пренесена с плазмид, съдържащ глюкокорти коиден индуцируем MMTV-LTR промотор свързан с геи е-На-т® съдържащ точкова мутация · Клетките бяха отгледани в хранителна среда НЖЕ-4б40 (Gibco), допълнена с 5% фетален телешки серум, обработен с декстранов въглен (DCC-FCS), глутамин, пеницилин (100 IU/ml) и стрептомицин (100/c.g/ml). В тези клетки експресията на ген c-Ha-ras може да бвде максимално индуцирана чрез добавяне на 1 дМ дексаметазон (Sigma)към средата за клетъчно култивиране. Обработването с DCC беше използувано за отстраняване на допълнителните стероиди от серума, които могат да повлияят на експресията на пренесения ген. За суспензионните култури, бактерислогичните блюда бяха покрити с 1% arap (Sigma) в RPMI-164O, за да се предотврати възможната адхезия на клетките към субстрата. Клетките бяха посяти при плътност 1x10 /ml. Броят на клетките беше определен след обработване с трипсин. ПреброяваFl нето беше извършено с брояч Coulter (Coulter Electronics,Hialeah,, PM-4 е проба на цДЖ за синдекан,първоначално клонирана от Saunders и сътрудници /66/. Тя проявява две ивици /зони/ от 2.6 kb и 3.41сЬот нормални клетки на миша млечна жлеза.

За приготвяне на. РНК, блюдата /плаките/ е клетъчни култури бяха промити два пъти с леден фосфатнобуферен физиологичен разтвор / ebs / и след това разтворени в 4М буфер GIT /4М гуанидинизс тиоцианат в 5 ши натриев цитрат /рН 7.0/, 0.1 М ^-меркаптоетанол и 0.5/° Н - леирилсаркозин/. Екстракцията на цялото количе ство РНК беше извършена чрез центрофугиране върху плътностен

- 21 градиент от СеСХ^акто е описано в /67/. За анализ чрез Northern blot пробите от ΈΚ бяха разделени чрез електрофореза в 1% формалдехидагарозен гел. Тези голове бяха нанесени върху хибридизационна мембрана GeneScreen.Филтрите бяха предвари телно хибридизирани в 1 М ВаС1,1% натриевдодецилрулфат, 10 % декстрансулфат, 5 х разтвор на Deaahardt, 100уи.</а1 ДОК от спер матов сид на сьомга, 50ί< формзмид при 42¾. За хибридизацията бяха добавени проби ealtifpMe-labeled Ж*4 или В3-9. Беше използуван изотоп Р32 (Авегейаа) · Филтрите бяха промити при 65¾ за проба РМ-4 и при 60°С за проба В3-9 в 2 х SSCj£ натриев додецилсулфат и автографирани на филм ^Koda^ X-Oaat _ияи рентгенов филм на фирмата FuU·

За количествено определяне на експресията на синдекан в клетъчната повърхност, клетките върху блюдата с култури бяха прс мити три пъти о леден Z®s. / След това блюдата бях* инкубирани в 0.5аМК-ЕВТА /К-етиленциаминтетраоцетна киселина/ в EBS за 10 минути при + 4%. Към вмямт* концентрация беше добавен 20/ g/al трипсин (Sigma, Т-8128) и инкубиран за 10 минути при + 4¾. Трипсинът освобождава външния домен на синдекана в средата /68/, След това клетките бяха изстъргани със стъклена пръчка с гумен накрайник или колониите бяха суспендирани и към готовата концентрация беше добавен 100/ g/и! трипсинов инхибитор (sigma,т-9128)· Клетките бяха центрофугирани /5 мин. 100х g/, супернатантата беше събрана и клетките бяха преброени с Coulter Counter· Клетките в суспензиятя бяха събрани в епруветка и колониите бяха оставени да се утаят за 5 минути с последващо отстраняване на супернатантата, подобно на културите в блюдата на Петри. Колониите бяха промити 3 пъти с леден ®3и обработени с трипсин.

Подходящото количество супернатанта, което отговаря на

§ ixlO клетки беше нанесено върху катйснна найлонова мембрана Ш-РгоЬе^1о-ваО>^ембраната беше предварително инкубипана в инкубационен буфер /10$ фатален телешки оерум, 1^ иодриев !

за един час при стайна температура· Радиоактивнобелязано /метоц Chloramine - т / ппАЪ 281-2 /манокланално антитяло-бел. поев./ /69/, което разпознава външния домен на синцекана, беше s бавено в тотоваел кснцентра^я при 10*000 СМРЛ1 и инщубираио за една нощ при + 4¾. Филтрите бяха промити о pbsIO минути при стайна температура. ^осмиването беше повторено 10 пъти, олед това филтрите бяха одтографирани върху рентгенов филмДвтографът беше анализиран с ценситометър GelScan XL ultroscan densitometei (LKB) и Програмен Продукт GelScan SL software (Ю) И OT3Hцартизиран o изолиран външен домен /70/.

В резюме, настоящото изобретение е полезно за доказване на вредните трансформации чрез определяне на синдекановата експресия и съдържанието на синдекан, например, в тъканите и в раз· личните телесни течности. Методът моке да бъде осъществен биохимично, имуиохистсгсимично и молекуляпнобиологично, като ое използуват специфичните синдеканови лиганди. антитела /поликлснал ни или моноклонални/ и ц‘Ж. Методът съсредоточава специално вниманието върху злокачествените посмени на епителните клетки, които показват силна склонност към екоп сесия на сивдекан през вземе на процеса на злокачествените трансформации* Анализът за синдеканова експресия при хипетплазия също е вклшен, посади важността щу за преценяване на сериозността на този ппедаеетвуващ стадий на злокачествено израждане. Анализът за експресия на сиидекам е особено полезен при класификацията на различни пг «фермия» ©raw на дисплазии, предаествуващи злокачествен от<

израждане.

Claims (17)

1· Метод за откриване на злокачественото и поедшеотвуващото злокачествено изменение в човешки клетки, състоящ ое от следните операции:

/а/ определяне на съдържанието на синдекан в клетките, пписъотвуващ в първата течна или тъканна проба от човек, характери· зяращ се е това, че тази първа проба е взета от течност или тъкан, за които се предполага, че притежават клетки оъо злокачествено новосбразувание, клетки от предшествуващия стадий на злокачествено израждане, хипесп ластични клетки или клетки о морфологично изменение в сравнение о нормалното им състояние;

ду сравняване на определеното съдържание на синдекан от операция /а/ оъо съдържанията на синдекан, подучен от втопа проба от биологичен материал, втората проба от биологичния материал е от същия тип течност или тъкан като пъовата псоба от биологичния материал, но втоаата проба е от клетки, които са нормални или по-малко трансформирани от клетките на операция /а/;

и /с/ определяне на присъствието на злокачествените или преди шеств.уващите стадии на злокачествени изменения въз основа на присъствието :на по-малко синдекан в първата ппоба, в сравнение с втората ппоба от биологичен материал.

2. ‘йетоц, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че изменението е злокачествена трансформация·

3· Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се о това, _чв изменението е трансформация, предшествувана стадия на злокачествено израждане·

4, Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с тава, че изменението е хиперплазия.

5. Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че изменението е морфологично изменение·

6. Метод, съгласно претенция 1, харалтеризи оащ ое с това, че съдържанието на синдзкан в пъпвата псоба е определено чоез анали» на съдържанието на сичдекаиов протеин.

7. Метод, оъглаоно претенция 6, характеризиращ се о това, че съдържанието на синцеканов протеин се определя чрез използуването на антитяло, което разпознава синцекановия протеин,

8. Метод, съгласно ппетеиция 1, характеризиращ се з това, че съдържанието на синдекан в първата проба се опоеделя чрез анализ на съдържанието на син декан ова иРНК.

9. Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че * съдържанието на син декан в пъовата проба се определя чрез метод, w

е който се анализира количеството на външния домен на оиндекана в пробата,

10. Метод, съгласно претенция 9, характеризиращ ое е това, че външният домен на оиндекана на пъовата пооба се освобождава от повърхността на клетката преди да се анализира,

11. Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се използува човешко синдекаисво специфично антитяло, за да се анализира съдържанието на синдекан в първата посба.

12. Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ ое с това, че ое използува човешка синдеканова иГЖ с обпатна посока, за да се анализира съдържанието на син декан ова иРЖ в първата псоба.

18· Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се е това, че се използува синдеканав олигснуклеотиц с обратна посока, за да се анализира съдържанието на синдекан ова иРНК в пъовата проба.

14. йтод, съгласно претенция 1, характеризиращ се е това, че биологичният материал е телесна течност.

15. Метод, съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, чс телесната течност е плазма.

16. Метод, съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че телесната течност е серум.

17. Метод, съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че телесната течност е ушна.

18. Метод, съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че телесната течност е гръбначномозъчна течност·