NO314604B1 - Deteksjon av syndekaninnholdet i biologisk materiale så som vevs- og kroppsv¶sker for angivelse av malign transformasjon av celler - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår generelt området biologi såsom cancerbiologi, og angår nærmere bestemt fremgangsmåter til deteksjon av premalign eller malign tilstand i humane celler som uttrykker syndekan i en ikke-malign tilstand.

Celleoverflatemolekyler som fungerer i spesifikke interaksjoner mellom celleoverflaten og den ekstracellulære matriks (ECM) kalles matriksreseptorer.. Gjenkjennelsen av matriks ved disse reseptorer spiller en viktig rolle i reguleringen av celleform, proliferering og differensiering og er derfor en kritisk hendelse i den normale utvikling av organer og opprettholdelse av vevsarkitektur. Kjente matriksreseptorer innbefatter f.eks. en familie av transmembranglykoprotein-reseptorer som deler felles strukturelle og funksjonelle egenskaper og kalles integriner (Hynes, R. (1987) Cell 48: 549-554), et 67-kDa glykoprotein som binder til laminin Bl-kjede (Graf et al. (1987) Cell 48: 65: 989-996) og celleoverflate-proteoglykaner (PG) som, avhengig av glykosaminglykan-sammensetningeh (f.eks. heparansulfat) kan reagere med en rekke forskjellige matriksmolekyler (Jalkanen, M. (1987) Med. Biol. 65: 41 -47).

Celleadhesjon, spredning, proliferasjon og differensiering er alle basert på nære kontakter mellom celleoverflaten og den omgivende ekstracellulære matriks (ECM). Den selektive bruk av ligand-reseptor-interaksjon kan in vivo skape den mangfoldighet av spesifikke celle-matriks-interaksjoner som er nødvendig for utviklingen av organer (Ekblom et al. (1986) Ann. Rev. Cell Biol. 2: 27-47). Det er kjent at transformasjonen kan endre cellenes respons på ECM (Liotta, L. (1986) Cancer Res. 46: 1-7), hvilket antyder at forandringene i ekspresjonen av matriksreseptorer ved maligne celler kan intreffe (Plantefaber and Hynes (1989) Cell 56: 281-290; Cheresh et al. (1989) Cell 57: 59-69). Disse forandringer er stort sett ukjente, men kan ha en grunnleggende rolle i utfallet av malign oppførsel av forskjellige celler.

Celleoverflate-proteoglykanet i melkekjertel-epitelceller fra mus består av et lipofilt membrandoméne (Rapraeger and Bernfield (1983) J. Biol. Chem. 258: 3632-3636;

(1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109) og av et matriks-interreagerende ektodoméne inneholdende både heparansulfat- og kondroitinsulfat-kjeder (Rapraeger et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 11046-11052). I den senere tid har cDNA-kloning av mus- og menneskesyndekaner bekreftet disse funksjonelle domener på kjerneproteinet og dette PG er blitt betegnet syndekan (Saunders et al.

(1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556; Mali et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889). Ektodoménet av syndekan gjenkjennes ved mAb 281-2 (Jalkanen et al.

(1985) J. Cell Biol. 101: 976-984; Jalkanen et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096) og det binder med høy affinitet til Type 1, III og V kollagenfibriler (Koda et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 8157-8162) og med lavere affinitet til C-terminal heparinbindingsdoménet av fibronectin (Saunders and Bernfield (1988) J. Cell Biol. 106: 423-430), trombospondin (Sun et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 2885-2889) og tenacin (Salmivirta et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: under trykning). Ligandbindingen fremmer assosiasjonen av membrandoménet til aktinrikt cytoskeleton (Rapraeger et al. (1986) J. Cell Biol. 103: 2683-2696). Epitelcellene kan imidlertid også avgi ektodoménet fra celleoverflaten ved en proteolytisk spalting av kjerneproteinet som skiller ektodoménet fra membrandoménet (Jalkanen et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096; Weitzhandler et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 6949-6952). Derfor kan syndekanet koble epitelcytoskelettet til matriksen men også løsne den epitele forbindelse med matriksen. Ved disse tilknytninger kan syndekan formidle matriksorganisasjon til celleorganisasjon og påvirke cellenes oppførsel. Fordi syndekan hovedsakelig ikke interreagerer med stromale komponenter såsom kollagenfibriller og fibronectin kan syndekan fungere som en kommunikator mellom epitel- og mesenkymvev. Denne type kommunikasjon er kritisk for normal epiteldifferensiering og organdannelse.

Ekspresjonen av syndekan under utvikling og organdannelse følger morfogenetiske snarere enn histologiske grenser (Thesleff et al. (1988) Dev. Biol. 189: 565-572), et trekk som også underbygger en aktiv rolle for syndekan som en matriksreseptor under utviklingen. Syndekan er blitt lokalisert hovedsakelig på forskjellige epitelceller (Hayashi et al. (1987) J. Histochem. Cytochem. 35: 1079-1088) men kan også finnes på overflaten av plasmaceller (Sanderson and Bernfield (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85: 9562-9566). Syndekan lokaliseres også til kondenserende mensenkym like ved siden av knoppskytende epitelium under organdannelse (Thesleff et al. (1988) Dev. Biol. 189: 565-572). Dets ekspresjon i mesenkymet er blitt vist å styres ved epitelkontakt både i tenner (Vainio et al. (1988)) og i metanefrin nyre (Vainio et al. (1989)), og i begge vev kan dets ekspresjon korreleres både i rom og tid til morfogenesen av disse organer.

Det er derfor en hensikt med oppfinnelsen å skaffe en fremgangsmåte til deteksjon av premalignt eller malignt vev ved deteksjon av syndekantap fra vevene.

Det er en annen hensikt med oppfinnelsen å skaffe en fremgangsmåte til deteksjon av premalignt eller malignt vev ved deteksjon av forekomsten av syndekan i kroppsvæsker.

Det er en ytterligere hensikt med oppfinnelsen å skaffe en fremgangsmåte som spesielt lar seg tilpasse for deteksjonen av malignt eller premalignt vev hos mennesker.

Det er nok en hensikt med oppfinnelsen å skaffe en biokjemisk, immunhistologisk eller molekylærbiologisk metode til deteksjon av syndekanekspresjon eller syndekaninnhold i vev eller kroppsvæsker for å påvise maligne eller premaligne transformasjoner av celler.

Det er en ytterligere hensikt med oppfinnelsen å skaffe en fremgangsmåte til deteksjon av hyperplastiske forandringer i celler.

Det er en ytterligere hensikt med oppfinnelsen å skaffe en fremgangsmåte til. deteksjon av foreslåtte hyperplasiske forandringer i celler.

Det er videre en hensikt med oppfinnelsen å skaffe en fremgangsmåte til deteksjon av foreslåtte morfologiske forandringer i celler.

Det er også en hensikt med oppfinnelsen å skaffe en fremgangsmåte til kvantifisering av syndekan i vev eller kroppsvæsker for å produsere en indikatorverdi.

Kort sagt omfatter oppfinnelsen i sitt videre omfang en fremgangsmåte til deteksjon av en potensielt skadelig transformasjon av celler hos en organisme, idet fremgangsmåten omfatter å bestemme syndikaninnhold-indikatoren fra en prøve av biologisk materiale fra organismen og sammenligne den bestemte syndikaninnhold-indikator med en referanse syndikaninnhold-indikator fra et biologisk referansemateriale, fortrinnsvis et materiale av samme type.

Disse hensikter er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan utføres på en rekke forskjellige måter innbefattet biokjemiske, immunhistologiske eller molekylærbiologiske typer metoder. Skjønt fremgangsmåten er anvendbar til deteksjon av en skadelig transformasjon såsom en malign eller premalign tilstand i en rekke forskjellige organismer, er den spesielt tilpasset deteksjon av en skadelig transformasjon i celler, særlig i menneskeceller. Transformasjoner som kan påvises omfatter premaligne og maligne transformasjoner innbefattet hyperplastiske og morfologiske forandringer.

Deteksjonen av nærværet eller fraværet av syndekan kan utføres på forskjellige biologiske materialer hos organismen, såsom celler, vev og kroppsvæsker innbefattet spesielt for humane biologiske materialer, serum, plasma, urin, spinalvæske eller andre vevsekstrakter. Deteksjon av syndekaninnholdet i biologiske materialer kan oppnås ved bruk av en rekke forskjellige metoder innbefattet syndekanspesifikke ligander eller biokjemiske determinanter, syndekanspesifikke antistoffer og syndekanantisens-mRNA'er eller -cDNA'er eller - oligonukleotider.

Ytterligere trekk, hensikter og fordeler med oppfinnelsen vil fremgå mer fullstendig fra en detaljert gjennomgåelse av den følgende beskrivelse av oppfinnelsen når den sammenholdes med de ledsagende tegninger.

På tegningene er:

Fig. 1A en grafisk representasjon av celleoverflate-syndekaninnholdet som funksjon av tiden som viser syndekantapet i melkekjertel-epitelceller fra mus transformert ved at de utsettes for testosteron. Fig. IB er en grafisk fremstilling av syndekan-mRNA-ekspresjon som funksjon av tiden som viser syndekantapet i melkekjertel-epitelceller hos mus transformert ved at de utsettes for testosteron. Fig. 2A til og med 2D er fotografier av seksjoner av biologisk hudmateriale fra mus som viser progresjonen av syndekanekspresjon etter at materialet er blitt utsatt for UV-lys. Fig. 3A er et fotografi som viser suspensjoner av melkekjertel-epitelceller fra mus dyrket i monolag med ett lag transformert med ras-onkagen, og Fig. 3B er en grafisk representasjon av celleoverflate-syndekaninnholdet for de monolag som er vist på fig. 3A.

Den foreliggende oppfinnelse er basert, delvis, på de oppdagelser at syndekandeteksjon er et verdifult diagnostisk kriterium for bestemmelse av ondartetheten i biologiske materialer såsom epitelceller. Eksempler er gitt for tre forskjellige slag eksperimentelle metoder for å innføre transformasjon (hormonell innføring, UV-irritasjon og onkogen innføring) og i hvert av dem ble syndekantapet vist å være tydelig. Deteksjon av syndekantap er verdifult også i andre mekanismer som fører til en transformasjon såsom dannelse av tumorer, og følgelig er oppfinnelsen ikke begrenset bare til de ovenfor angitte metoder. Syndekandeteksjon kan f.eks. skaffe verdifull informasjon også på forskjellige proliferative stadier av vev (f.eks. hud, nyre, hjerne, lunge, blære) som senere kan gå over til et mer ondartet stadium. Disse såkalte premaligne stadier som ofte ses som dysplasier uttrykker forskjellige nivåer av syndekan som er informasjon, hvilket er nødvendig for å anslå hvor alvorlig sykdommen er for således å skaffe riktig terapeutisk behandling. Et viktig område for syndekandeteksjon ligger også i sirkulerende plasmaceller. Følgelig skaffer deres analyse ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som anvender syndikanspesifikke antistoffer, såsom FACS-analyse (fluorescerende aktivert cellesorteringsapparat), verdifull informasjon angående den patofysiologiske tilstand for en pasient med lymfom, myelom, leukemi eller andre proliferative stadier av hematopoietiske celler.

Det er også kjent at syndekan avgis fra celleoverflaten (Jalkanen et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096), og det kan være at i visse sykdommer kan tapet av syndekan fra celleoverflater føre til forekomst av dette i kroppsvæske. Følgelig er det i henhold til den foreliggende oppfinnelse av diagnostisk verdi å måle syndekanmengder i serum, plasma, urin, spinalvæske eller andre vevsekstrakter for å bestemme hvor mye vevsødeleggelse og forsvinning av normal cellemorfologi som har funnet sted i de undersøkte vev.

Som tidligere nevnt er syndekan et celleoverflate-proteoglykan som består av

kovalent koblede glykosaminoglykan-kjeder (GAG) og et membTaninnleiret kjemeprotein (Saunders et al. (1989) J. Cell Biol. 108, 1547-1556). GAG-kjeder av syndekan er kjent å tilhøre grupper av heparansulfat og kondroitinsulfat (Rapraeger et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 11046-11052) og de er ikke begrenset til syndekan. Kjerneproteinet i syndekan er unikt og definerer dette molekyl som et medlem av en rekke lignende celleoverflate-proteoglykaner (Mali et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889). Mus-syndekan ble opprinnelig isolert og blir fortsatt vanligvis detektert med et monoklonalt antistoff (MnAb 281 -2) mot kjerneproteinet av syndekan (Jalkanen et al. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984).

For ytterligere å forklare oppfinnelsen ble syndekanekspresjon analysert i relasjon

til innføringen av malign fenotype i tre forskjellige uavhengige biologiske modeller, som hver førte til malign transformasjon av epitel celler. I alle disse modeller ble tapet av syndekanekspresjon observert samtidig med malign transformasjon. Disse resultater er kort presentert i de følgende modeller for å belyse oppfinnelsen.

I den første modell ble en Shionogi 115 (Sl 15) tumorcellelinje fra

musemelkekjertel anvendt. Slike celler skaffer en utmerket modell for undersøkelser av den transformerte fenotype fordi de reagerer på androgener ved økende veksthastighet (King et al. (1976) J. Steroid Biochem. 7: 869-873) og ved forandring fra epitel til fibroblastisk morfologi (Yates and King (1981) Cancer Res.

.41: 258-262). 1 nærvær av et androgen fester cellene seg løst til et substrat og antar

en evne til å vokse i suspensjon uten forankring til matriksen, mens i fravær av androgen fester de seg fast til matriksen og vokser i det hele tatt ikke i suspensjon (Yates and King (1981) Cancer Res. 41: 258-262). Grunnlaget for deri morfologiske forandring og for uavhengighet med hensyn til forankring er stort sett ukjent, skjønt en rekke mekanismer innbefattet forandringer i cytoskeletal organisasjon (Couchman et al. (1981) Cancer Res. 41: 263-269) og i parakrinmekanismer (Darbre and King (1988) In Breast cancer: Cellular and Molecular Biology; ed. M.E.

Lippman and R.B. Dickson, Academic Publishers, pp 307-341) er blitt foreslått.

Testosteronbehandlede Sl 15-celler viste sterk RGDS-avhengig binding til

fibronektin (FN), men ingen binding til det heparinbindende doméne av FN, hvilket indikerte at de eksprimerte integrinlignende molekyler. Isteden oppviste S115-celler som var dyrket uten testosteron epitelmorfologi og binding til det heparinbindende doméne av FN, hvilket indikerte en forandring av syndekanekspresjon i hormonbehandlede Sil 5-celler. Både mengdene av matriksbindende ektodoméne av syndekan, når den ble kvantifisert ved radioimmunanalyse og ved Westernblot, og

av syndekan-mRNA (2,6 kb) avtok i hormonbehandlede Sl 15-celler. Tilsetningen av antiandrogent cyproteronacetat til dyrkningsmedium motarbeidet virkningen av testosteron på syndekan-mRNA. Således er inaktiveringen av syndekangen og den etterfølgende undertrykkelse av syndekanekspresjon relatert til de endrede festeegenskaper, forsvinningen av epitelfenotype og på den annen side forekomsten av transformertlignende fenotype i hormonbehandlede S115-celler.

Et eksempel på de ovenfor angitte resultater er vist på fig. IA og IB. Fig. IA er en for sammenligning grafisk representasjon av celleoverflate-syndekaninnholdet som funksjon av tiden som viser syndekantapet i brystkjertel-epitelceller hos mus (Sl 15) transformert ved utsettelse for testosteron, og fig. 1B er en for sammenligning grafisk representasjon av syndekan-mRNA-ekspresjon som funksjon av tid som viser syndekantapet i epitelceller hos mus transformert ved utsettelse for testosteron. Disse representasjoner viser malign oppførsel og tap av syndekanekspresjon som er åpenbar i proteinet på fig. IA og mRNA-nivå på fig. IB etter eksponeringen.

Det som er angitt ovenfor viser at tilsetningen av androgen til Sl 15-kulturer fører til undertrykkelsen av syndekanekspresjon på grunn av inaktiveringen av syndekangenet. Denne undertrykkelse korrelerer nært med tilegnelsen av forankringsuavhengighet og tapet av epitelfenotype, og er således en av grunnene til transformertlignende oppførsel av Sl 15-cellene i nærvær av androgen.

I den annen modell ble immunreaktivitet for syndekan undersøkt hos hårløse (hr/hr) mus utsatt for UV-A- og UV-B-bestråling. Positiv farging ble observert på overflaten av normale epidermislceller såvel som i de dermale abortive hårsekkcyster som er karakteristiske for denne musestamme. Tidlig reaksjon på UV-bestråling som viste hyperplastisk epidermi med lett cellulær atypia var også positiv, skjønt redusert farging av epidermale celleoverflater. Prøver med alvorlig dysplasia viste svak farging i det granulære cellelag mens det basale cellelag var negativt. I papilomer og i det eneste keratoacantom ble immunreaktivitet for syndekan observert i godartede hyperplastiske epidermale celler såvel som i de prolifilerende epidermale celler av horncystene. Malign transformasjon uttrykt som dannelsen av skvamøse celle-karsinomer og -sarkomer var ensartet forbundet med tap av syndekanfarging. Disse resultater er i overensstemmelse med de tidligere resultater med redusert ekspresjon av syndekan i forbindelse med malign transformasjon av dyrkede epitelceller, men antyder også en viktig rolle for syndekan i opprettholdelsen av normal vevsarkitektur og differensieringsmønster i huden.

Eksempler på disse farginger er vist på fig. 2A til og med 2D. Disse figurer er illustrasjoner av fotografier av biologisk hudmateriale fra mus som viser progresjonen av syndekanekspresjon etter at materialet er blitt utsatt for UV-lys. Fig. 2A viser normalt hudmateriale og fig. 2B og 2C viser forskjellige stadier av hyperplasia, idet den seksjon som er vist på fig. 2C indikerer noe malign histologi. Disse figurer viser at premalign hyperplasia indusert ved UV-bestråling gradvis mister syndekanekspresjon.

Fra det som er angitt ovenfor er det åpenbart at epitelceller in vivo og innleiret i sine vanlige omgivelser mister syndekanekspresjon i løpet av prosessen med malign transformasjon, hvilket igjen indikerer at syndekanekspresjon er nødvendig for den normale cellemorfologi og vevsintegritet, men også at tapet av syndekanekspresjon kan korreleres til alvorligheten i dysplasia og ondartethet av epitelceller.

I den tredje modell ble et punktmutert c-HA-ras gen transfektert melkekjertel-epitelcellelinje fra mus anvendt. Et c-Ha-ras gen er under MMTV-LTR promoter i disse NOG-8-ras celler og således kan dets ekspresjon reguleres ved deksametason (Ciardiallo et al. (1989)). Når disse celler uttrykte c-HA-ras genet dannet de foki på cellekultur-skåler og kolonier i suspensjon. NOG-8-ras celler dyrket på cellekultur-skåler uttrykte syndekan i like store mengder med normale celler i en tilstand av subkonfluens. Syndekanekspresjonen var imidlertid betydelig redusert når disse celler oppviste transformasjonsfenotype, dvs. der var foki på plate eller celler vokste som kolonier i suspensjon. Syndekan-mRNA-nivåene forble imidlertid på det samme nivå i disse forskjellige dyrkinger. Således er styringen av overflatesyndekan organisert posttranskripsjonelt i disse celler. Disse resultater indikerer at det er et vanlig fenomen at ekspresjon av syndekan reduseres i løpet av transformasjon, men måten som den reguleres på i forskjellige celler kan variere fra en transformert celletype til en annen.

Et eksempel på onkogenindusert tap av syndekanekspresjon er vist på.fig. 3A og 3B.

Fig. 3A er en illustrasjon av et fotografi som viser suspensjoner av brystkjertel-epitelceller fra mus dyrket i monolag, idet ett lag er blitt transformert ved ras-onkagen, og fig. 3B er en grafisk representasjon av celleoverflatesyndekah-innhold for de monolag som er vist på fig. 3A. Syndekanekspresjon ble kvantifisert i hver av de epitelceller som ble dyrket i monolag a, b, c og f etter ras-induksjon i suspensjon d. Som det fremgår blir syndekan avgitt fra de ras-onkogen transformerte mus-epitelceller.

Fra det som er angitt ovenfor førte onkogen-indusert ondartet transformasjon også til tap av syndekan fra overflaten av epitelceller, hvilket indikerer at syndekantap er et vanlig trekk ved malign transformasjon og at deteksjonen av dette tap er et verdifullt diagnostisk verktøy for bestemmelsen av krefttypetransformasjoner og deres alvorlighet.

Der er tre foretrukne måter til å bestemme syndikaninnholdet i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Dvs. biokjemisk, immunkjemisk og molekylærbiologisk. Den første er basert på den biokjemiske gjenkjennelse av syndekan som kan være en del av kjerneproteinet eller kovalent bundne GAG-kjeder. Det er vist at syndekan kan oppvise spesielle GAG-kjeder som kan gi spesifikke interaksjoner for syndekan (Elenius et al. (1990) J. Biom. Chem. 265: 17837-17943; Salmivirta et al. (1991). J. Biom. Chem. 266: under trykning). Følgelig kan syndekan detekteres ved at der skaffes en syndekanspesifikk ligand. Andre egnede metoder som anvender syndekanspesifikke antistoffer og cDNA'er er imidlertid beskrevet nedenfor.

Med kloningen av humant syndekan (Mali et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889) eller dets isolering fra humane kilder såsom human brystkjertel-cellelinje HBL-100 (Elenius et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 17837-17843), er det mulig å fremstille antistoffer mot humant syndekan. Dette kan oppnås ved immunisering av dyr for polyklonal eller monoklonal antistoffproduksjon eller celler in vitra for monoklonal antistoffproduksjon med isolert intakt humant syndekan, dets fragmenter, syntetiske peptider eller fusjonsproteiner predikert ved den humane cDNA-klon. Ved utførelsen av oppfinnelsen kan vanlige teknikker for molekylærbiologi, mikrobiologi, rekombinant-DNA og immunologi anvendes til bestemmelse av syndekaninnholdet og slike teknikker er forklart fullstendig i litteraturen. Se f.eks. Current Protocols in Immunology (1990) av Green Publishing Associates og John Wiley & Sons, Inc.

Ved bruk av humane syndekanspesifikke antistoffer kan syndekanekspresjon i vev undersøkes med klassiske immunhistologiske metoder, f.eks. slik det er vist i den modell som er illustrert på fig. 2A til og med 2D. På disse blir spesifikk gjenkjennelse skaffet av det primære antistoff (polyklonalt eller monoklonal!), men det sekundære deteksjonssystem kan anvende fluorescerende enzym eller andre konjugerte sekundære antistoffer. Som et resultat oppnås en immunhistologisk farging av vevsseksjon for patologisk undersøkelse. Vev kan også ekstraheres, f.eks. med urea og nøytral detergent, for frigjøringen av syndekan for westernblotting eller punkt/åpning-analyse (dot/slot assay) (Jalkanen et al. (1985) J. Cell Biol. 105: 976-985; Jalkanen et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096). Ved denne teknikk som er basert på bruken av kationiske faststoffaser kan kvantifisering av syndekan oppnås ved bruk av isolert syndekan som en standard. Denne teknikk kan også anvendes for kroppsvæsker. Ved disse prøver vil en molar konsentrasjon av syndekan hjelpe til å sette standardverdier av syndekaninnhold for forskjellige kroppsvæsker såsom serum, plasma, urin, spinalvæske etc. Den normale forekomst av syndekanmengder kan deretter settes ved bruk av verdier fra friske frivillige og sammenligning av disse med verdier fra personer med forskjellige sykdommer eller tilstander.

Forandringer i syndekanekspresjon kan også detekteres ved bruk av synd ek an-cDNA, såsom human syndekan-cDNA. Skjønt syndekan arter imellom er godt konservert, er strukturforskjellene på nukleotidnivået store nok til å hindre bruken av musesyndekan i deteksjonen av humansyndekan-mRNA. Generelt kan mRNA-nivåer for et gitt genprodukt detekteres basert på den spesifikke interaksjon av sense- og antisense-former av samme nukleotidkjeder, og i dette tilfelle for syndekan. Dette kan oppnås ved bruk av in situ-teknikk for vevsprøver, mRNA-beskyttelsesanalyse for isolert RNA eller primerdirigert polymerisasjon av syndekanspesifikke nukleotidkjeder. Alle disse teknikker er fullt ut forklart i litteraturen, såsom den tidligere nevnte Current Protocols in Molecular Biology.

Spesifikke metoder i henhold til oppfinnelsen er presentert i de følgende eksempler. Det skal forstås at eksemplene er gitt for illustrasjonsformål og ikke begrenser oppfinnelsen.

EKSEMPEL I

Lokalisering av syndekan i transformerte epitelceller. Melkekjertel-tumorceller Shinogi Sl 15 fra mus som utgangsceller, ble rutinemessig dyrket i DMEM (Dulbecco's modifiserte Eagle's medium) supplert med 5 % varmeinaktivert kalvefosterserum (i-FCS), pyruvat (1 mM), glutamin (1 mM), penicillin (100 IU/ml), streptomycin (100 ug/ml) og testosteron (10 nM). For undersøkelser som omfattet hormonbehandling ble vekstmedium supplert med 4 % dekstran trekullbehandlet kalvefosterserum (DC-FCS) anvendt med eller uten 10 nM testosteron og/eller 1 uM cyproteronacetat. For forsøkene ble celler platet med en tetthet på 10000 celler/cm^ på Nunc-vevskultur vevsskåler. For celletelling ble celler lysert i 10 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2 inneholdende Zaboglobin (Coulter Electronics, Ltd.) og de kjerner som ble frigjort ble suspendert i Isoton (Coulter) og til slutt tellet på et Coulter-celletellingsapparat.

Sl 15-cellene ble farget på den fjerde dag med kulturen intakt som beskrevet (Jalkanen et al. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984). Celleoverflate-proteoglykan, syndekan, ble immunlokalisert med et rotte-monoklonalt antistoff 281-2 mot kjerneproteinet av proteoglykanet (Jalkanen et al. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984)

og disse farginger ble kontrollert ved bruk av et annet IgG2a monoklonalt antistoff

- Mel-14, spesifikt for lymfocyttsøkende reseptor (Gallatin et al. (1981) Nature 304: 30-34). Deteksjon av immobiliserte rotte-antistoffer ble gjort ved kanin anti-rotte FITC-konjugat (Janssen Biochimica).

EKSEMPEL II

Deteksjon av endret s<y>ndekanekspresjon i hormonindusert transformasjon av epitelceller. For kvantetisering av syndekan på celleoverflater av Sl 15-celler ble cellemonolag vasket flere ganger med kaldt PBS og ektodoménet av molekylet ble frigjort med bukspyttkjerteltrypsin fra storfe (Sigma, Type III; 20 ug/ml) ved 10 min-inkubasjon på is som beskrevet av Rapraeger og Bernfield (1983) J. Biol. Chem. 258: 3632-3636; (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109. Etter trypsin-inaktivering ved trypsininhibitor (100 ug/ml) ble celler sentrifugert, supernatant utvunnet for ektodoménkvantifisering og celler suspendert i Isoton for celletelling. Monoklonal! antistoff 281-2 ble radiojodert ved kloramin-T oksidasjonsmetoden (Ståhli et al. (1983) Meth. Enzymol. 92: 242-253) til en spesifikk aktivitet på 14,1 x 10^ cpm/jig. For analysen ble supernatanter fra 2 x 10^ celler og en renset sammenligningsprøve syndekan fra NMuMG-celler lastet på kationisk nylonmembran (Zeta-Probe. BioRad) i et minifold-slisse (minifold-slot) apparat (Schleicher & Schuell) som beskrevet tidligere (Jalkanan et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096). Membranen ble fjernet fra slisse-apparatet og inkubert i 1 time ved værelsetemperatur i PBS supplert med 10 % FCS for å blokkere membranen. Deretter ble den inkubert over natten ved +4 C i PBS inneholdende 1251-merket 281-2 (10000 cpm/ml). Etter vasking av filteret fem ganger med PBS, ble det eksponert på Kodak X-Omat film for å synliggjøre det bundne 281-2. For kvantifisering ble hver slisse analysert ved LKB Ultroscan XL forbedret laserden-sitometer og sammenlignet med kjent mengde syndekan fra NMuMG-celler.

Trypsinfrigjorte ektodomener fra Sl 15-celler ble etanolutfelt og fraksjonert på SDS-PAGE gradient (4-10 %) gel (0'Farrell (1975) J. Biol. Chem. 250: 4007-4021). Etter elektroforese ble prøver transformert på Zeta-Probe membran ved bruk av elektroblotting 2005 Transphor-apparat (LKB) som beskrevet tidligere (Jalkanen et al. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984); Rapraeger et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 11046-11052) og membranen ble utsatt for 1251-merket 281-2 som beskrevet ovenfor. Igjen kan isolert syndekanektodoméne fra NMuMG-celler anvendes for sammenligning.

EKSEMPEL III

Deteksjon av endret svndekangenekspresion i transformerte epitelceller. Samlet RNA ble isolert ved bruk av 4M guanidinisotiocyanat og CsCl-pellettering som beskrevet av Chirgwin et al. ((1979) Biochem. 18: 5294-5299). RNA-porsjoner på 15 ug ble fraksjonert på formaldehyd-agarosegel (1 %) og overført til Gene Screen Plus membrane. Hybridisering med multi-prime (Amersham) merkede innskudd av PM-4 cDNA-probe for syndekan (Saunders et al. (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556) ble utført under betingelser foreslått av membranprodusenten (New England Nuclear). lmmobilisert probe ble gjort synlig ved eksponering av membranen på

Kodak X-Omat film ved 70 C og kvantifisering av 2,6 kb mRNA ble utført ved densitometrisk analyse beskrevet ovenfor. Ekspresjonen av syndekan mRNA ble korrellert til ribosomal RNA som beskrevet av Denis et al. (1988) Nucl. Acid Res. 16: 2354-2359. Spesifisiteten av syndekanundertrykkelse ble ytterligere undersøkt ved probing av de samme prøver for rate-glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenase

(GAPDH) (Fort et al. (1985) Nucl. Acid. Res. 13: 1431-1442) og alfa-aktin fra mus (Minty et al. (1981) J. Biol. Chem. 256: 1008-1014).

cRNA in situ hybridiseringen for parafinseksjoner ble utført i henhold til fremgangsmåten ifølge Wilkinson et al. (1989) Developm. 105: 131-136. Et 535 bp Sac I - Kpn I fragment fra den partielle cDNA-klon for mus-syndekan (PM-4)

(Saunders et al (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556) ble subklonet (Vainio et al.

(1991) Development, submitted) inn i en riboprobe pGEM-4Z vektor (Promega, Madison, WI). Det klonede plasmid inneholdende innskuddet ble linearisert med Eco RI eller Hind III enzymer og antisens- eller sens-transkripsjoner ble produsert fra komplementære tråder med henholdsvis T7- eller SP6-polymeraser i nærvær av <35>S-UTP (Amersham, Willshire, UK). Den maksimale lengde av transkripsjonene ble redusert til <200 bp med alkalisk hydrolyse og fraksjoner med den høyeste spesifikke aktivitet ble samlet opp, utfelt og oppløseliggjort i hybridiseringsbuffer. Forbehandlede glassplater (slides) ble hybridisert over natten ved 50 C og fremgangsmåtene for å fjerne uspesifikk binding av proben (innbefattet vaskinger med høy stringens og ribonuklease-A-behandling) og autoradiografi ble utført som beskrevet tidligere (Wilkinson et al. (1989) Development 105: 131-136).

EKSEMPEL IV

Deteksjon av endret syndekanekspresjon i vevsseksioner som fås fra tumorer. Tumorer ble produsert i svakt fargede hårløse hanmus av hr/hr C3H/Tif-stammen (Bomholdgaard, Denmark) ved at dyrene ble underkastet UV-A- og UV-B-bestråling som beskrevet av Talve et al. ((1990) Photodermatol. Photoimmunol. Photomed 7: 109-115). Under observasjonsperioden på 12 måneder forekom alt i alt 83 papillomer, 2 keratoacanthomer, 4 skvamocellulære carcinomer, et kombinert carcinosarkom og 11 sarkomer, med øket tumordannelse assosiert med høy UV-A (582 J/cm<2>) pluss høy UV-B (erythemalt effektivt = EE) (1,0 J/cm<2>) pluss høy UV-B (EE) (0,8 J/cm<2>) (78 kontra 28 tumorer). Prøver ble tatt fra. alle tumorer observerbare med det blotte øye såvel som normalt utseende UV-eksponert hud. En porsjon av prøvene ble fiksert i 10 % buffret formalin innleiret i parafin, seksjonert og på rutinemessig måte farget med hematoksylin og eosin. Resten av eksemplene ble frosset i nitrogen og seksjonert. Skadene ble klassifisert i henhold til standard histopatologiske kriterier. Periodisk syre/schiff-farging (PAS) ble også brukt i noen tilfeller for synliggjøring av de underste (basement) membraner såvel som Herovic, Weigerts, Massons trikrom og Gomoris farginger for kollagentyper såvel som andre farginger og elektromikroskopisk analyse etter behov.

For immunhistokjemisk lokalisering av syndekan ble et rotte-monoklonalt antistoff 281-2 anvendt. Dette antistoffer spesifikt for kjerneproteinet av mus-syndekan ektodoméne (18). Avidinbiotin-immunperoksidase-teknikken ble brukt for å detektere immobilisert 281-2 som beskrevet av Hsu et al ((1981) J. Histochem. Cytochem. 29: 577-580). Etter avparafinisering og rehydrering av vevsseksjonene ble den endogene peroksidaseaktivitet blokkert ved at glassplatene ble inkubert i 100 % metanol inneholdende 3 % hydrogenperoksid i 30 min. Seksjonene ble deretter inkubert med 2 % normalt geiteserum (Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA) i Tris-buffret saline, pH 7,4 (TBS) i 30 min ved værelsetemperatur for å bringe på et minimum ikke-spesifikk farging. Seksjonene ble dekket med det primære antistoff 281-2 ved en proteinkonsentrasjon på 2 ug/ml i 1 % (w/v) BSA-TBS og inkubert over natten ved 4 C. Glassplatene ble deretter inkubert med biotinylert geit-antirotté IgG (Jackson's Immunoresearch Laboratories, Inc. West Baltimore, Pennsylvania) ved 1:1000 fortynning i 1 % BSA-TBS i 30 min ved værelsetemperatur og til slutt med avidinbiotin-peroksidase-kompleks (Vectastain kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA) i 30 min ved værelsetemperatur. Etter vaskinger ble peroksidaseaktiviteten vist ved inkubering av glassplatene med 0,5 mg/ml 3,3'-diaminobenzidin-tetrahydroklorid (DAB, Polysciences, Inc., Northampton, England) i TBS inneholdende 0,68 mg/ml imidazol og 0,01 % hydrogenperoksid i 5 min i mørke. Glassplatene ble motfarget noe med Mayer's hematoksylin og montert Depex Mounting-medium (BDH Limited Pool, England). Mellom alle trinn ble glassplatene vasket tre ganger med Tris-buffret saline (TBS). For sammenligningsseksjoner ble normal rotte IgG (Sigma, St. Louis, MO) anvendt ved 2 ug/ml. Noen få frosne seksjoner for hver tumortype ble også farget, hvilket førte til en immunreaktivitet identisk med den i de parafininnleirede vevsseksjoner. Endringer i den primære antistoffkonsentrasjon og inkubasjonstidene forandret ikke i nevneverdig grad fargingsmønsteret.

EKSEMPEL V

Deteksjon av endret s<y>ndekanekspresjon i løpet av ras- onkoeen- indusert transformasjon. NOG-8 celler er en subklon av en normal melkekjertel-epitelcellelinje fra mus, NMuMG og NOG-8 ras-celler er en linje av NOG-8 celler som er blitt transinfisert med et plasmid inneholdende en glukokortikoid-induserbar MMTV-LTR-promotor koblet til en punktmutert c-Ha-ras gen. Celler ble dyrket i RPMI-1640 celledyrkingsmedium (Gibco) supplert med 5 % dekstrantrekull-behandlet kalvefosterserum (DCC-FCS), glutamin, penecillin (100IU/ml) og streptomycin (100 ug/ml). I disse celler kan c-Ha-ras genekspresjon bli maksimalt indusert ved tilsetning av 1 uM deksametason (Sigma) til celledyrkingsmedier. DCC-behandling ble anvendt til å eliminere ytterligere steroider fra serum, hvilket kunne virke inn på ekspresjonen av det transinfiserte gen. For suspensjonskulturer ble bakterieskåler dekket med 1 % agar (Sigma) i RPMI-1640 for å hindre mulig cellesubstrat-adhesjon. Celler ble podet med en tetthet på 1 x lO^/ml. Celleantallet ble bestemt etter trypsinering ved bruk av et Coulter telleapparat (Coulter Electronics, Hialeah, FL). PM-4 er en cDNA-probe for syndekan opprinnelig klonet av Saunders et al. (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556. Den detekterer to bånd på 2,6 kb og 3,4 kb fra normale melkekjertelceller hos mus.

For RNA-preparering ble cellekultur skål er vasket to ganger med iskald fosfatbuffret saline (PBS) og deretter oppløseliggjort i 4 M GIT buffer (4M guanidinisotiosyanat i 5 mM natriumcitrat (pH 7,0), 0,1 M B-merkaptoetanol og 0,5 % N-larylsarkosin). Samlet RNA-ekstraksjon ble utført ved CsCl-densitetssentrifugering som beskrevet av Chirgwin et al. (1979) Biochem. 18: 5294-5299. For northernblot-analyse ble RNA-prøver separert ved 1 % formaldehyd-agarose-gelelektroforese. Disse geler ble blottet på GeneScreen-hybridiseringsmembran. Filteret ble prehybridisert i 1 M NaCl, 1 % natriumdodecylsulfat, 10 % dekstransulfat, 5 x Denhardts oppløsning, 100 ug/ml laksesperm-DNA, 50 % formamid ved 42 C. For hybridisering ble multiprim-merkede PM-4 eller BS-9 prober tilsatt. P32 (Amersham) isotop ble anvendt. Filterene ble vasket ved 65 C for PM-4 og ved 60 C for BS-9 i 2 x SSC, 1 % natriumdodecylsulfat og autografert på Kodak X-Omat eller Fuji røntgenfilm.

For kvantifisering av celleoverflate-syndekanekspresjon ble celler på dyrkingsskåler vasket tre ganger med iskaldt PBS. Deretter ble skålene inkubert i 0,5 mM K-EDTA i PBS i 10 min ved +4 C. Trypsin (Sigma, T-8128) ble tilsatt inntil en endelig konsentrasjon på 20 ug/ml og inkubert i 10 min ved +4 C. Trypsin frigjør ektodoménet av syndekan inn i medium (Rapraeger & Bernfield (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109). Deretter ble cellene skrapet med en gummislikkepott eller kolonier ble suspendert og trypsininhibitor (Sigma, T-9128) ble tilsatt inntil en endelig konsentrasjon på 100 ug/ml. Cellene ble sentrifugert (5 min 100 x g), supernatant ble samlet opp og celler ble telt med et Coulter telleapparat. Celler i suspensjon ble samlet opp i et reagensrør og kolonier ble tillatt å sedimentere i 5 min etter fjerning av supernatant på samme måte som petriskål-kulturer. Kolonier ble vasket tre ganger med iskaldt PBS og behandlet med trypsin.

Den riktige mengde supernatant som svarer til 2 x 10^ celler ble blottet på kationisk nylonmenmbran (Zeta Probe, Bio-Rad). Membranen ble preinkubert i inkubasjonsbuffer (10 % Fetal Calf Serum, 1 mM natriumazid, PBS) 1 h ved værelsetemperatur. Radioaktivt merket (kloramin-T-metode) MnAb 281-2 (Jalkanen et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096) som gjenkjenner ektodoménet av syndekan, ble satt til inkubasjonsbuffer til en endelig konsentrasjon på 10000 CMP/ml og inkubert over natten ved +4 C. Filteret ble vasket med PBS i 10 min ved værelsestemperatur. Vaskingen ble gjentatt 10 ganger, deretter ble filteret autoradiografert på røntgenfilm. Autografiet ble. analysert ved GelScan XL ultroskan densitometer (LKB) og GelScan SL 2400 programvare (LKB) og standardisert med isolert ektodomén (Jalkanen et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096).

Som en oppsummering kan det sies at den foreliggende oppfinnelse er nyttig til deteksjon av potensielt skadelige transformasjoner ved bestemmelse av syndekanekspresjon og -innhold på, f.eks., vevsnivå og i forskjellige kroppsvæsker. Fremgangsmåten kan utføres biokjemisk, immunohistokjemisk og molekulærbiologisk ved bruk av f.eks. syndekanspesifikke ligander, antistoffer (polyklonale eller monoklonale) og cDNA. Et spesielt fokus for metoden er på maligne forandringer av epitelceller som viser sterk reduksjon i syndekanekspresjon i løpet av prosessen av malign transformasjon. Analysen av syndekanekspresjon i hyperplasia er også innbefattet på grunn av dens verdi i bestemmelsen av alvorligheten av dette premaligne trinn. Analysene av syndekanekspresjon er særlig nyttige i klassifiseringen av forskjellige premaligne proliferative stadier av dysplasier.

Claims (16)

1. Fremgangsmåte til å detektere en malign eller pre-malign tilstand i humane celler som uttrykker syndekan i en ikke-malign tilstand, karakterisert ved at den omfatter; a) å assaye mengden av syndekanprotein eller mRNA i nevnte humane celler; og b) å detektere nevnte maligne eller pre-maligne tilstand ved å detektere et fravær av nevnte syndekanprotein eller mRNA i nevnte humane celler.

2. Fremgangsmåte til å detektere en malign eller pre-malign tilstand i humane celler som uttrykker syndekan i en ikke-malign tilstand, karakterisert ved at den omfatter; a) å assaye mengden av syndekanprotein eller mRNA i nevnte humane celler; b) å sammenligne nevnte mengde av syndekanprotein eller mRNA med mengden av syndekanprotein eller mRNA i en referanse ikke-malign prøve av samme celletype; og c) å detektere nevnte maligne eller pre-maligne tilstand ved å detektere en relativ reduksjon av nevnte syndekanprotein eller mRNA i nevnte humane celler sammenlignet med den i nevnte referanse.

3. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte humane celler er epitelceller.

4. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte humane celler er tumorceller.

5. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte humane celler er plasmaceller

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at nevnte plasmaceller er oppnådd fra en pasient med lymfom, my el om eller leukemi.

7. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte maligne eller pre-maligne tilstand er bestemt på basis av mengden av nevnte syndekanprotein.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at mengden av syndekanprotein er bestemt ved å bruke syndekanspesifikke antistoffer.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at mengden av syndekanprotein er bestemt ved immunohistologisk farging.

10. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte deteksjon av nevnte maligne eller pre-maligne tilstand er basert på mengden av nevnte syndekan mRNA.

11. Fremgangsmåte til å detektere en malign eller pre-malign forandring i humane celler som uttrykker syndekan i en ikke-malign tilstand, karakterisert ved at den omfatter; a) å assaye mengden av syndekanprotein i en kroppsvæske og; b) å detektere nevnte maligne eller pre-maligne forandring i nevnte celle ved å detektere tilsynekomst av syndekan.i nevnte kroppsvæske.

12. Fremgangsmåte til å detektere en malign eller pre-malign forandring i humane celler som uttrykker syndekan i en ikke-malign tilstand, karakterisert ved at den omfatter; a) å assaye mengden av syndekanprotein i en kroppsvæske; b) å sammenligne nevnte mengde av syndekanprotein med mengden av syndekanprotein i en referanseprøve av samme kroppsvæske fra en ikke-malign kilde; og c) å detektere nevnte maligne eller pre-maligne forandring ved å detektere en relativ økning av nevnte syndekanprotein i nevnte kroppsvæske sammenlignet med den i nevnte referanse.

13. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 11 eller 12, karakterisert ved at nevnte kroppsvæske er valgt fra gruppen som består av serum, plasma, urin eller spinalvæske.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at nevnte væske er et serum eller plasma.

15. Fremgangsmåte som angitt i ett av kravene 11 eller 12. karakterisert ved at mengden av syndekanprotein er bestemt ved å bruken syndekanspesifikke antistoffer.

16. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 11 eller 12, karakterisert ved at mengden av syndekanprotein er bestemt med FACS-analyse, Western blotting eller dot/slot assay.