KR0162670B1 - 세포의 악성 전형을 나타내기 위한 조직 및 체액과 같은 생물학적 물질에서의 신데칸 내용물의 검출 - Google Patents

세포의 악성 전형을 나타내기 위한 조직 및 체액과 같은 생물학적 물질에서의 신데칸 내용물의 검출 Download PDF

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마르쿠 타파니 잘카넨
피르조 리나 킬리키 인키
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마르쿠 잘카넨
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Abstract

본 발명은 유기체의 세포의 잠재적으로 해로운 전형을 검출하는 방법이다. 본 발명은 유기체의 생물학적 물질의 시료로부터 신데칸 내용물 지시값을 결정하고, 그 결정된 신데칸 내용물 지시값을 동일한 유형의 표준 생물학적 물질로부터의 표준 신데칸 내용물 지시값과 비교하는 것으로 이루어진다.

Description

[발명의 명칭]
세포의 악성 전형(轉形)을 나타내기 위한 조직 및 체액과 같은 생물학적 물질에서의 신데칸(syndecan)내용물의 검출
[도면의 간단한 설명]
제1a도는 테스토스테론(testosterone)에 노출시킴에 의해 전형된(transformed) 생쥐 유방 상피 세포(mouce mammary epithelial cells)에서 신데칸 손실(loss)을 설명하는, 시간에 대한 세포 표면 신데칸 내용물의 그래피이고,
제1b도는 테스토스테론에 노출시킴에 의해 전형된 생쥐 유방 상피 세포에서 신데칸 손실(loss)을 설명하는, 시간에 대한 신데칸 mRNA 발현(expression)의 그래프이고,
제2a도 내지 제2d도는 UV에 노출된 후 신데칸 발현의 진행(progression)을 보여주는 생쥐의 생물학적 피부 물질 절편(section)의 사진이며,
제3a도는 ras-종양유전자(ras-oncogene)에 의해 전형된 하나의 층(one layer)을 갖는, 단층(monolayers)배양된 생쥐의 유방 상피 세포의 부유액들(suspensions)을 보여주는 사진이며,
제3b도는 제3a도에서 보여진 단층들에서 세포 표면 신데칸 내용물의 그래프이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 일반적으로 암생물학(cancer biology)같은 생물학의 분야에 관한 것으로, 특히, 신데칸에 특이적(specific) 액(liquid), 항체(antibody) 및 cDNA 소식자(probe)를 사용하는 공정으로써 한편으로는 조직(tissue)에서 신데칸 손실이 검출(detection)에 의해, 다른 한편으로는 인간 체액(body fluid)에서 신데칸의 출현(appearance)의 검출에 의해 전악성(premal ignant) 또는 악성(mal ignant)조직을 검출하는 방법에 관한 것이다.
세포 표면과 세포외 기질(extracellular matrix ; ECM) 사이에서 특이적 상호작용(interaction)의 기능을 하는 세포 표면 분자는 기질 수용기(matrix recepteors)로 불린다. 이 수용기들에 의한 기질의 인지(recognition)는 세포 형태(shape), 증식(profiferation) 및 분화(differentiation)의 조절(regulatioin)에 중요한 역할을 하며, 따라서 기관들(organs)의 정상적인 발육(noraml development) 및 조직 구성의 유지(maintenance of tissue architecture)에 중대한 사건(critical event)이다. 알려진 기질 수용기는 예들 들어, 공통적인 구조 및 기능 특징을 공유하며 인티그린(integrins)이라 불리는 막전이 당단백(transmembrance glycoprotein) 수용기군(Hynes, R. (1987) Cell 48 : 549-554), 라미닌 B1-사슬(laminin B1-chain)에 결합하는 67-kDa 당단백(Graf et al. (1987) Cell 48 : 65:989-996) 및, 글리코사미노글리칸 조성(glycosaminoglycan composition)(예를 들어, 헤파란 셀페이트(heparan sulfate)에 의존하여, 다양한 기질 분자들과 상호작용할 수 있는 세포 표면 단백다당체들(proteoglycans;PG)(Jalkanen, M. (1987) Med. Biol. 65:41-47)을 포함한다.
세포 유착(adhesion), 확산(spreading), 증식 및 분화는 무도 세포 표면과 주위의 세포외 기질(ECM) 사이의 밀접한 접촉(close contact)에 기초한다. 배위자-수용기 상호작용(ligand-receptor interaction)의 선택적 사용(selective usage)은 생체 내에서 (in vivo)기관들의 발육에 필요한 특이적인 세표-기질 상호작용의 다양성(diversity)을 유발한다(Ekblom et al. (1986) Ann. Rev. Cell Biol. 2: 24-47). 전형(trasformation)은 ECM에 대한 세포의 반응을 변경시키는 것으로 알려지며(Liotta, L. (1986) CAncer Res. 46: 1-7), 이것은 악성 세포에 의해 기질 수용기의 표현(expression)에서 변화가 생긴다고 제시한다(Plantefaber and Hynes (1989) Cell 56: 281-290; Cheresh et al. (1989) Cell 57:59-69). 이러한 변화들은 알려지지 않는 부분이 많으나, 다양한 세포 유형의 악성 행위(malignant behavior)의 결과(outcome)에 기본적인 역할을 갖는다.
생쥐 유방 상피 세포의 세포 표면 단백다당체는 호지성 막 영역(lipophilic membrance domain)(Rapraeger and Bernfield (1983) J. Biol. Chem. 258: 3632-3636; (1985)J. Biol. Chem. 260:4103-4109) 및, 헤파란 셀페이트 및 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate) 사슬(Rapraeger et al. (1985) J. Biol. Chem 260:11046-11052)을 둘다 포함하는 기질 상호작용 외영역(matrix interacting ectodomain)으로 이루어진다. 최근 생쥐 및 인간 신데칸의 cDNA-클로닝(colning)으로 코어 단백질(core protein)에서 이러한 기능 영역을 확인하였으며, 이 PG는 신데칸으로 명명되었다(Saunders et al. (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556; Mali et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889). 신데칸의 외영역은 mAb 281-2에 의해 인지되며(Jalkanen et al. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984; Jalkanen et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096), 그것은 유형(type) Ⅰ, Ⅲ 및 Ⅴ교질 원섬유(Collagen fibrils)(Kode et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 8157-8162)에 높은 친화도(high affinity)로, 그리고 피브로넥틴(firbronectioin)(Saunders and Bernfield (1988) J.Cell Biol. 106: 423-430), 트롬보스폰딘(thrombospondin)(Sun et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 2885-2889) 및 테나스신(tenascin)(Salmivirta et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: in press)의 C-말단 헤파린 결합 영역(C-tetminal heparin binding domain)에 낮은 친화도(low affinity)로 결합한다. 배위 결합(ligand dinding)은 다액틴(actin-rich) 세포체질(cytoskeleton)에 대한 막 영역(membrance domain)의 결합(association)을 촉진하다(Rapraeger et al. (1986) J. Cell Biol. 103: 2683-2696). 상피세포는 그러나 또한 막 영역으로부터 외영역을 구분하는 코어 단백질의 단백질가수분해 절단(proteolytic cleavage)에 의해 세포 표면으로부터 외영역을 박리(剝離;shed)시킨다(Jalkanen et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096; Weitzhandler et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 6949-6952). 그러므로 신데칸은 기질에 상피 세포체질(epithelial cytoskeleton)을 결합시킬(link) 수 있을 뿐만 아니라, 기질과의 상피 결합을 풀(loosen) 수도 있다. 이러한 결합(associatioin)으로, 신데칸은 기질 기구(matrix organization)를 세포 기구(cellular organization)로 매개하며(mediate), 세포의 행위(behavior)에 영향을 미친다. 신데칸은 주로 교질 원섬유 및 피브로넥틴과 같은 지질(支質; stromal)성분과 상효작용하기 때문에, 신데칸은 상피와 간엽 조직(mesenchymal tissue) 사이의 전달자(communicatior)로서 기능한다. 이런 유형의 전달은 정상의 상피 분화(epithelial differentiatioin) 및 기관 형성(organ fortmation)에 중대한 일이다.
발육 및 기관 형성 동안 신데칸의 표현은 조직학적 범주(histological boundary)라기 보다는 형태발생학적(morphogenetic)범주를 따르므로, 또한 발육하는 동안 기질 수용기로서의 신데칸에 활성 기능을 원조하는 특징으로 갖는다(Thesleff et al. (1988) Dev. Biol. 189: 565-572), 신데칸은 주로 다양한 상피 세포에 위치하나(Hayashi et al. (1987) J. Histochem. Cytochem. 35: 1079-1088), 또한 형질 세포(plasma cell)의 표면에서도 발견될 수 있다(Sanderson and Bernfield (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9562-9566). 신데칸은 또한 기관 형성을 하는 동안 출아 상피(budding epithelium) 바로 옆의 응축 간엽(condensating mesenchyme)에 배치된다(Thesleff et al. (1988) Dev. Biol. 189: 565-572). 간엽에서 그것의 표현은 이(tooth)(Vainio et al.(1988) 및 후신(metanephric kidney)(Vainio et al. (1989))둘다에서 상피 접촉(epithelial contact)에 의해 조절되는 것으로 보이며, 양 조직에서 그것의 표현은 공간적으로 및 일시적으로 이들 기관의 형태발생(morphogenesis)에 상관한다(cnorrelate).
[발명의 요약]
따라서 본 발명의 목적은 조직으로부터 신데칸의 손실의 검출에 의해서 전약성 또는 악성 조직의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목저은 체액에서 신데칸의 출현의 검출에 의해 전악성 또는 악성 조직의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 더한 목저은 인간에 있어서 악성 또는 전악성 조직의 검출을 위해 특히 적합한 방법을 제공하는 것이다.
또한 볼 발명의 또다른 목적은 세포의 악성 또는 전악성 전형을 검출하기 위한 조직 또는 체액에서 신데칸의 발현(expression)또는 신데칸의 내용물을 검출하는, 생화학적, 면역조직학적(immunohistological) 또는 분자생물학적(molecular biological) 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 더한 목적은 세포에서 과형성 변화(hyperplastic change)를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 세포에서 예정된(proposed)과형성 변화를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 세포에서 예정된 형태학적 변화를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 지시값(indicator value)을 산정하기 위하여 조직 또는 체액에서 신데칸의 정량(quantitation)방법을 제공하는 것이다.
간단히, 개괄적인 측면에서 있어서 본 발명은 유기체(organism)로부터의 생물학적 물질의 시료(sample)로부터 신데칸 내용물의 지시값을 결정하는 것 및, 결정된 신데칸 내용물의 지시값을 바람직하게는 같은 유형의 물질인 생물학적 표준 물질(reference biological material)로부터의 표준 신데칸 내용물의 지시값과 비교하는 것을 포함하여, 유기체 세포의 잠재적으로 해로운(potentially detrimental)전형을 검출하는 방법을 포함하는 것이다.
본 방법은 생화학적, 면역조직학적 또는 분자생물학적 유형의 방법을 포함하는 다양한 방식으로 이루어질수 있다. 본 방법은 아주 다양한 유기체에서 악성 또는 전악성 상태와 같은 해로운 전형을 검출하는데 적용할 수 있는 한편, 특히 세포, 특히 인간세포에서 해로운 전형을 검출하는데 적합한다. 검출될 수 있는 전형은 과형성적(hyperplastic) 및 형태학적 변화를 포함하는 전악성 및 악성 전형을 포함한다.
신데칸의 존재함이나 그것의 결핍(lack)의 검출은 특히 인간 생물학적 물질, 혈청, 혈장(plasma), 오줌(urine), 척수액(spinal fluid) 또는 다른 조직 추출물을 포함하여, 세포, 조직 및 체액과 같은 유기체의 다양한 생물학적 물질에 대하여 수행된다. 생물학적 물질에서 신데칸 내용물의 검출은 신데칸 특히 배위자(syndecan specific ligand) 또는 생물학적 결정인자(determinant), 신데칸 특이 항체, 및 신데칸 항감작(antisence) mRNA 또는 cDNA 또는 올리고누클레오티드를 포함하는 다양한 수단의 사용으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 더한 특징, 목적 및 장점은 첨부된 도면과 함께 본 발명의 다음 설명의 상세한 기술로부터 명백해질 것이다.
[바람직한 실시예의 상세한 설명]
본 발명은 부분적으로, 신데칸 검출이 상피 세포와 같은 생물학적 물질에서 악성종양의 평가에 대한 가치있는 진단 판정기준(diagnostic criteria)이라는 발견에 근거한다. 전형을 유발하는 서로 다른 세 가지 실험 방법(호르몬 유도, UV-방사 및 종양유전자 유도)에 대한 실시예가 주어지며, 그들 각각에서 신데칸 손실에 분명하였다. 신데칸 손실의 검출은 또한 종양 형성과 같은 전형을 이끄는 다른 기구(mechanism)에도 값진 것이며, 따라서 본 발명은 상기 언급한 것들에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 신데칸 검출은 또한 나중에 더 악성의 단계로 전화될, 조직들(예를 들어, 피부, 신장, 뇌(brain), 폐(lung), 방광(bladder))의 몇몇 증식 단계(prolifetative stage)에서 값 있는 정보를 제공할 수 잇다. 종종 이형성(dysplasias)으로 보이는, 이들 소위 전악성 단계는 다양한 신데칸의 준위(level)를 나타내며, 이것은 적절한 치료학적 처치(therapeutioc traetment)를 제공하기 위하여 질병의 심각성을 평가하는데 필요한 정보이다. 신데칸 검출의 중요한 영역은 또한 순환 형질세포(circulationg plasma cell)이다. 그러므로, FACS-분석(Fluoresecnt activated cell sorter-analysis)과 같은, 신데칸 특이 항체를 사용하는 본 방법에 의한 그것들의 분석은 임파종(lymphoma), 골수종(myeloma), 백혈병(leukemia) 또는 혈액생성(hematopoietic)세포의 다른 증식단계를 갖는 환자의 병리생리학적(pathophysiological)상태에 대한 값진 정보를 제공한다.
신데칸은 또한 세포 표면으로부터 박리되는 것으로 알려지며(Jalkanen et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096), 그것은 어떤 질병에서는, 세포 표면으로부터 신데칸의 손실은 체액에서 그것이 출현하는 결과를 가져올 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따라서, 시료 조직에 있어서 얼마나 많은 조직 파괴(tissue destruction)및 정상 세포 형태의 소실(disappearance)이 일어났는지를 결정하기 위하여 혈청, 혈장, 오줌, 척수액 또는 다른 조직 추출물에서 신데칸 내용물을 측정하는 것은 진단의 가치가 있는 것이다.
앞서서 언급한 바, 신데칸은 공유결합된 글루코사미노글리칸(GAG) 사슬 및 막에 묻힌(membrance embedded)코어 단백질로 이루어진 세포 표면 단백다당체이다(Saunders et al. (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556). 신데칸의 GAG-사슬은 헤파란 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트의 군에 속하는 것으로 알려지며(Raoraeger et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 11046-11052), 그리고 그들은 신데칸에 제한되는 것이 아니다. 신데칸의 코어 단백질은 고유한(unique)것으로, 이 분자를 몇몇 유사한 세포 표면 다백다당체의 일원으로 규정한다(Mail. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889). 쥐과(munine)의 신데칸은 맨 처음으로 동정되었으며, 여전히 통상적으로 신데칸의 코어 단백질에 대한 모노클로날 항체(monoclonal antibody; MnAb 281-2)로 검출하였다(Jalkanen et al. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984).
본 발명을 더 설명하자면, 신데칸 출현은, 각각이 상피 세포의 악성 전형의 결과를 갖는 세 가지의 서로 독립적인 생물학적 표본(model)에서 악성 표현형(phenotype)의 유도(induction)에 관련하여 분석된다. 이들 모든 표본에 있어서, 신데칸 표현의 손실은 동시에 악성 전형과 같이 관찰되었다. 이 결과들은 본 발명의 설명을 위한 다음 표본들에서 간단히 나타난다.
첫째 표본에서는 시오노기 115(S115) 생쥐 유방 종양 세포 계통(Shionogi 115 mouse mammary tumor cell line)이 사용되었다. 그러한 세포들은, 성장비(growth rate)가 증가함에 의해(King et al. (1976) J. Steroid Biochem. 7: 869-873), 그리고 상피로부터 섬유아세포(fibroblastic) 형태로 변호함에 따라(Yates and King (1981) Cancer Res. 41: 258-262) 안드로젠(androgen)에 반응하기 때문에 전형된 표현형(transformed phenotype)의 연구에 탁월한 표본을 제공한다. 안드로젠의 존재 하에, 그 세포들은 원질(substrautum)에 느슨하게 유착하며(anhere), 기질에 고정(anchorage)됨이 없이 현탁액에서 성장하는 능력을 얻으며, 한편, 안드로젠이 없을 때, 그들은 기질에 굳게 유착하며 현탁액에서 전혀 성장하지 않는다(Yages and King (1981) Cancer Res. 41: 285-262). 형태학적 변화 및 고정 독립(anchorage independencey)에 대한 기초(basis)는, 세포체질 기구(cytoskeletal organization)(Couchman et al. (1981) Cancer res. 41: 263-269) 및 분비이상 기구(paracrine mechanism)(Darbre and King(1988) In Breast Cancer: Cellular and Molecular Biology, ed. M. E. Lippman and R. B. Dickson, Academic Publishers, pp 307-341)의 변화를 포함하여, 몇몇 기구(mechanism)가 제안되었음에도 불구하고, 많이 알려지지 않았다.
테스토스테론-처리된 S115 세포는 상피 형태 및 FN의 헤파린-결합 영역에의 결합을 보였으며, 이는 호르몬 처리된 S115 세포는 피브로넥틴(FN)에 강한 RGDS-의존성 결합을 보였으나, FN의 헤파린-결합 영역에는 결합을 나타내지 않았으므로, 그것들이 인티그린-같은(intergrin-like) 분자를 표현한다는 것을 지시하였다. 한편, 테스토스테론 없이 성장한 S115 세포에서 신데칸 발현의 변환(alteration)를 가리킨다. 방사선-면역 검정(radio-immunoassay) 및 웨스턴블롯(Westernbolt)에 의해 정량된 신데칸의 기질-결합 외여역의 양 및 신데칸 mRNA(2.6kb)의 양 모든 호르몬-처리된 S115 세포에서 감소되었다. 배양배지에 항안드로젠 스프로테론 아세테이트(antiandrogen cyproterone acetate)의 첨가는 신데칸 mRNAdp 대한 테스토스테론의 효과와 반대였다. 그러므로, 신데칸 유전자의 불활성화 및 그에 따른 신데칸 발현의 억압(suppression)은 호르몬-처리된 S115 세포에 있어서, 변호된 유착 특성(alteed adhesion properties), 상피 표현형의 사라짐(disapparance of epithelial phenotype) 및 다른 한편, 전형된 것같은 표현형의 출현(appearance of tranformed-like phenotype)에 관련된다.
위의 결과의 실시예는 제1a도 및 1b도에 나타난다. 제1a도는 테스토스테론에 노출함에 의해 전형된 생쥐 유방 상피 세포(S115)에서 신데칸의 손실을 설명하는, 시간에 대한 세포 표면 tlsezks 내용물의 비교 그래프이며, 제1b도는 테스토스테론에 노출함에 의해 전형된 생쥐 유방 상피 세포에서 신데칸 손실을 설명하는, 시간에 대한 신데칸 mRNA 발현의 비교 그래프이다. 이들 도면은 노출후 제1a도의 단백질에서 및 제1b도의 mRNA 준위(level)에서 명백한 악성 행위 및 신데칸 발현의 손실을 부여준다.
위로부터, S115 배양물에의 안드로젠의 첨가는 신데칸 유전자의 불활성화에 의한 신데칸 발현의 억압의 결과를 낳는다. 이 억압은 고정 독립의 획득(acquisition of anchorage independency) 및 상피 표현형의 손실에 밀접하게 상관되며, 그리하여 안드로젠의 존재에서 S115 세포의 전형된 것같은 행위의 결과에 대한 하나의 까닭이 된다.
둘째 표본에서, 신데칸에 대한 면역반응성(immunoreactivity)을 UV-A 및 UV-B 방사에 노출된 털없는(hr/hr) 생쥐에서 연구하였다. 이 생쥐 계통(strain)에 특징적인 피부 퇴행 모낭 낭종(dermal abortive hair follicle cyst)에서 뿐만 아니라 정상의 표피 세포(normal epidermal cells)에서도 양성 염색성(positive staining)이 관찰되었다. 미세한 세포 이형성(atypia;異型成)을 갖는 과형성 표피(hyperplastic epidermis)를 보여주는 UV-방사에 대한 초기 반응은, 표피 세포 표면의 환원 염색(reduced staining)에도 불구하고, 또한 양성이었다. 심한 이형성(異型成)(severe dysplasia)의 표본(specimen)은 과립 세포층(granular cell layer)에서 약한 염색성을 나타낸 한편, 기저 세포층(basal cell layer)은 음성(negetive)이었다. 유두종(papillomas) 및 발바닥 각피극세포중(sole keratoacanthoma)에서, 신데칸에 대한 면역반응성은, 뿔 낭포(horn cyst)의 증식 중인 표피 세포에서 뿐만 아니라 양성 과형성 표피 세포(benign hyperplastic epidermal cells)에서도 관찰되었다. 편평 상피 세포 암 및 육종(squamous cell carcinomal and sarooma)의 형성으로 나타나는 악성 전형은 신데칸 염색성의 손실과 한결같이 연결되어 있다. 이러한 결과는 배양된 상피 세포의 악성 전형과 관련된 신데칸의 감소 발현(redeuced expression)의 앞서의 발견과 일치할 뿐만 아니라, 피부의 정상 조직 구성(normal tissue architecture) 및 분화 양식(differentiation pattern)의 유지에 있어서 신데칸의 중요한 역할을 시사한다.
이러한 염색(staining)의 실시예들은 제2a도 내지 제2d도에서 보여진다. 이 도면들은 UV-광성에 그 물질들이 노출된 다음의 신데칸 발현의 진행을 보여주는 생쥐 생물 학적 피부 물질 절편의 사진 설명이다. 제2a도는 정상 피부 물질을 보여주며, 제2b도 및 2c도는 과형성의 다른 단계를 설명하는데, 제2c도에서 보여주는 부분은 얼마간의 악성 조직을 보여준다. 이들 도며는 UV 방사에 의해 유도된 전악성 과형성이 점차로 신데칸 발현을 읽어가는 것을 보여준다.
위로부터, 생체내에서 정상적인 환경에 있는 상피 세포가 악성 전형의 과정에서 신데칸 발현이 감소되고, 이는 또다시, 신데칸 발현이 정상 세포 형태 및 조직 통합성(tissue integrity)에 필요할 뿐만 아니라, 신데칸 발현의 손실이 상피 세포의 이형성(dysplasia) 및 악성의 정도(seriousness)에 상관이 있을 수 있다는 것을 가리키는 것이 명백하다.
셋째 표본에서는, 1점 돌연변이된 c-Ha-ras 유전자 침투된(a point mutated c-Ha-ras gene transfected) 생쥐 유방 상피 세포 계통을 사용하였다. c-Ha-ras 유전자는 이 NOG-8 ras 세포에서 MMTV-LTR 촉진자(promorer)에 따르므로, 그것의 발현은 덱사메타손(dexamethasone)에 의해 조절될 수 있다(Ciarodiallo et al. (1989)). 이 세포들이 c-Ha-ras 유전자를 발현하였을 때, 그들은 세로 배향 접시에 병소(foci)를 형성하고 현탁액에서 집락(colony)를 형성한다. 세포 배양 접시에서 배양된 NOG-8 ras 세포는 준융합 상태(subconfluency state)에서는 정상 세포와 같은 양의 신데칸을 발현한다. 그러나, 신데칸 발현은 이 세포들이 전형 표현형(trasformation phenotype)을 보일 때, 곧, 평판(plate)에 병소가 있거나, 세포가 현탁액에서 집락으로 성장하거나 할 때, 눈에 띄게 감소한다. 그러나, 신데칸 mRNA 준위는 이들 서로 다른 배양에서 동일한 준위로 남는다. 그리하여 세포 표면 신데칸의 조절은 이들 세포에서 전사후에(posttranscriptionally)조직화된다.이러한 결과는 신데칸의 발현이 전형 도안 감소되는 것은 공통적인 현상이지만, 서로 다른 세포에서 그것이 조절되는 방식은 전형되는 세포마다 다양하다는 것을 말한다.
종양유전자-유도 신데칸 발현의 손실의 실시예는 제3a도 및 제3b도에 나타난다.
제3a도는 ras-종양유전자에 의해 전형된 하나의 층을 갖는, 단층들에서 성장된 생쥐 유방 상피 세포의 현탁액들을 보여주는 사진이며, 제3b도는 제3a도에 나타낸 단층들에 대한 세포 표면 신데칸 내용물의 그래프이다. 신데칸 발현은 단층 a, b, c 및 f에서 및, ras-유도후 현탁액 d에서 배양된 각각의 상피 세포에서 정량하였다. 명확하듯이, ras-종양유전자 전형된 생쥐 상피 세포로부터의 신데칸은 손실되었다.
위로부터, 종양유전자-유도 악성 전형은 또한 상피 세포 표면으로부터 신데칸의 손실의 결과를 낳았는데, 이는 신데칸 손실이 악성 전형의 공통된 특징이며, 이 손실의 검출이 암 유형 전형의 결정 및 그들의 진행정도(severity)에 대한 값진 진단 수단(valuable diagnostic tool)이라는 것을 나타낸다. 본 발명의 방법에 따라 신데칸 내용물을 정량하는 세 가지 바람직한 방법, 곧, 생화학적, 면역화학적, 및 분자생물학적 방법이 있다. 첫째것은 신데칸의 생화학적 인지에 근거하는데, 이것은 코어 단백질 곧, 공유결합 GAG-사슬일 수 있다. 신데칸은 신데칸에 특이한 상호작용(interaction)을 제공하는 특이한 GAG-사슬을 보여줄 수 있다는 것이 알려졌다(Elenius et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 17837-17943; Salmivirta et al. (1991) J. Biol.Chem. 266: in press). 그러므로, 신데칸은 신데칸 특이 배위자(syndecan specific ligand)를 제공함에 의해 검출될 수 있다. 그러나, 다른 실행 가능한 방법들은 아래에 기술되는 신데칸 특히 항체 및 cDNA 를 사용한다.
인간 신데칸의 클로닝(Mali et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889) 또는, 인간 유방 세포 계통 HBL-100과 같은 인간 원천(human source)으로부터 그것의 동정(isolation)(Elenius et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 17837-17843)으로써, 인간 신데칸에 대한 항체를 제조하는 것이 가능하다. 이것은 폴리클로날(polyclonal) 또는 모노클로날(monoclonal)항체 생성을 위하여 동물을 면역시키거나, 또는 시험관 내에서(in vitro)인간 c-DNA 클론에 의해 예보된, 동정된 그대로의 인간 신데칸(isolated intact human syndecan), 그것의 분절(fregment), 합성 펩티드(synthetic peptide) 또는 융합 단백질(fusion protein)을 가지고 모노클로날 항체 생성을 위하여 세포를 면역시켜서 수행될 수 있다. 본 발명의 수행에 있어서, 분자 생물학, 미생물학, 제조합 DNA(recombinant DNA) 및 면역학의 통상적인 기술들이 신데칸 내용물을 정량하는데 적용될 수 있으며, 그러한 기술들은 문헌에 자세히 설명되고 있다. 예를 들어, Greene Publishing Associates and John Wiley Sons, Inc. 의 Current Protocols in Immunology (1990)를 보라.
인간 신데칸 특이 항체를 이용하여, 조직에서 신데칸 발현을 예들 들어, 제2a도 내지 제2d도에서 설명되는 표본에서 보여지는 바의 전통적인 면역조직학적 방법으로 연구할 수 있다. 이들에 있어서, 제1항체(primary antibody)(모노클로날 또는 폴리클로날)에 의해 특이적 인지(specilfi recognition)가 제공되며, 그러나 제2검출 체계(secondayr system)는 형광체(fluorescent), 효소 또는 다른 혼성 제2항체(conjugated secondary antibody)를 이용할 수 있다. 그 결과로서, 병리학적 검사(pathological examination)를 위한 조직 절편의 면역조직학적 염색(immunohistological staining)이 얻어진다. 조직은 또한 웨스턴 블로팅 또는 도트/슬롯 어세이(dot/solt assay)를 위한 신데칸의 유리(liberation)를 위하여 예를 들어, 요소(urea) 및 중성 세제(neutral detergent)를 가지고 추출될 수 있다(Jalkanen et al. (1985) J. Cell Biol. 105: 976-985; Jalkanen et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096). 양이온 고체상(cationic solid phase)의 사용에 기초를 둔 이 방법에 있어서, 신데칸의 정량은 동정된(isolated)신데칸을 표준(standard)으로 사용하여 수행될 수 있다. 이 기술은 또한 체액에 대하여도 적용될 수 있다. 이들 시료를 가지고, 혈청 형장, 오줌 척수액 등과 같은 서로 다른 체액에서 신데칸 내용물의 표준값을 정하는데 도움이 될 것이다. 그때 건강한 공혈자(healthy volunteer)의 값을 이용하여 이 값을 다른 질병 또는 다른 질병 또는 상태를 갖는 사람들의 값과 비교함에 의해 정상적인 신데칸 출현량을 정할 수 있다. 신데칸 발현의 변화는 또한 인간 신데칸 cDNA와 같은 신데칸 cDNA를 이용하여 검출 될 수 있다. 종 사이(between species)의 신데칸은 잘 보존됨에도 불구하고 누클레오티드 준위(nucleotide level)에서의 구조적 차이는 인간 신데칸 mRNA의 검출에서 생쥐 신데칸의 사용을 목하게 하기에 충분하다. 일반적으로 주어진 유전자 산물의 mRNA 준위는 동일한 누클레오티드 사슬의 감작 및 항감작(sence and antisence)형태 및, 이건의 경우 신데칸의 그것의 특이적 상호작용에 의거하여 검출될 수 있다. 그것은 조직 시료(tissue sample)에 대한 생체내 방법, 분리된 RNA에 대한 mRNA 보호 시험(protectioi asay) 또는 신데켄 특이 누클레오트디 사슬의 제1-방향성 중합(primer-directed polymerization)을 이용하여 수행될 수 있다. 이들 방법은 앞에서 언급한 Current Protocols in Molecular Biology와 같은 문헌에 잘 설명되어 있다.
본 발명에 따른 특정한 방법이 다음 실시예에서 제시된다. 이 실시예들은 설명을 위한 것이지 전술한 바의 본 발명을 이들 특정한 실시예로 한정코자 하는 것이 아닌다.
[실시예1]
[전형된 상피 세포에서 신데칸의 정위(localization)]
생쥐 유방 종향 시오노기 S115 저장 세포를 5% 열-불활성화된 송아지 태 혈청(heat-inactivated fetal calf serum; i-FCS), 피루베이트(pyruvate; 1ml), 글루타민(1mM), 페네실린(100IU/ml), 스트렙토마이신(100㎍/ml) 및 테스토스테론(10nM)을 가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 일정시간 배양하였다. 호르몬 처리를 동반하는 경우를 검토하기 위해, 4% 덱스트란-처리된(dextran charcoal-treated)송아지 태 혈청을 가한 성장 배지(growth medium)를 10nM 테스토스테론 및 1㎛ 시프로테론 아세테이트가 각각 있거나 없는 경우로 하여 사용하였다. 실험을 위하여, 세포를 Nunc 조직 배양 조직 접시(tissue culture tissue dish)에 10,000cells/㎠의 밀도로 접종하였다. 세포수 계산을 위해, 세포를 자보글로빈(Zaboglobin)(Couter Electronics, Ltd.)을 포함하는 10mM Hepes, 1.5mM MgCl2에 용해시키고, 방출된 핵(released nuclei)을 등장액(Isoton;Coulter)에 현탁시키고, 최종적으로 쿨터 세포 계수기(coulter cell counter)로 산정하였다.
S115 세포는 기술된 바(Jalkanen et al. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984)대로 배양물 그대로 나흘 동안 염색하였다. 세포 표면 단백다당체, 신데칸을 단백다당체의 코어 단백질에 대하여 쥐 모노클로날 항체 281-2로 국소면역(immunolocalize)시키고(Jalkanen et al. (1985) J. Cell Biol. 101:976-984), 이 염색을 임파구 귀소 수용기(lymphocyte homing receptor)에 특이적인, 또다른 IgG2a모노크로날 항체 Mel-14를 사용하여 조절하였다(Gallatin et al. (1981) Nature 304:30-34). 고정된 쥐 항체(immobilized rat antibldy)를 토끼 항-쥐 FITC-접합체(rabbit anti-tat FITC-conjugate)(Janssen Biochimica)로 검출하여다.
[실시예 Ⅱ]
[상피 세포의 호르몬-유도 전형에서 변호된 신데칸 발현의 검출]
S115 세포의 세포 표면에서 신데칸의 정량을 위해, 세포 단층을 찬 PBS로 몇번 씻고, Rapraeger and Bernfield (1983) J. Biol. Chem. 258: 3632-3636; (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109. 에 기술된 바대로, 얼음에서 10분-배양으로 췌장 트립신(bovine pancreatic trypsin; Sigma, Type Ⅲ; 20㎍/ml)으로 분자의 외영역을 방출시켰다. 트립신 억제자(inhibitor)(100㎍/ml)로 트립신을 불활성화시킨 뒤, 세포를 원심 분리하고, 외영역의 정량을 위해 상청액(supernaant)을 취하고, 세포 수를 세기 위하여 세포를 등장액(Isoton)에 현탁시켰다. 모노클로날 항체 281-2를 14.1 × 106cpm/㎍의 비방사능(specific activity)이 되도록 클로라민-T 산화법(chloramine-T oxidation method)(Stahli et al. (1983) Meth. Enzymol. 92: 242-253)에 의해 방사성요오드화시켰다(radioiodinate). 검정(assay)을 위해, 2×105의 세포로부터의 상청액 및 NMuMg 세포로부터의 정제 대조 신데칸(purified control syndecan)을, 일찍이 기술된 바(Jalkanet et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096)에 따라 미세주름-홈 장치(minifold-slot apparatus)에서 양이온성 나일론 막(catinic nylin membrane)(Zeta-Probe, BioRad)위에 부었다(load). 막을 홈 장치로부터 제거하고, 막을 폐쇠하기(block)위하여 10% FCS를 가한 PBS에서 실온에서 1시간 동안 배양시켰다. 다음, 그것을 125I-표시된(125I-labeled) 281-2를 함유하는 PBS에서 +4℃에서 밤새 배양시켰다. 여과기를 PBS로 다섯 번 세척한 후, 그것을 결합된 281-2(bound 281-2)가 현상되도록 Kodak X-Omat film에 노출시켰다. 정량을 위하여, 각 홈(slot)을 LKB Ultroscan XL enhanced laser densitometer(농도계)로 분석하고, NMuMG 세포로부터의 신데칸 양과 비교하였다.
S115 세포로부터의 트립신-방출 외영역을 에탄올 침전시키고, SDS-PAGE gradient (4-10%) gel 에서 분별(fractionation)하였다(//'Farrell (1975) J. Biol. Chem. 250:4007-4021). 전기영동후, 시료를 일찍이 기술된 바에 따라(Jalkanen et al. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984; Rapraeger et al. (1985) J. Biol. Chem 260: 11046-11052)electroboltting 2005 transphor apparatus(LKB)를 사용하여 Zeta-Probe 막위로 전형시키고(tranform), 막을 위에서 기술한 바대로 125I-표지된 281-2에 노출시켰다. 또다시, NMuMG 세포에서 분리된 신데칸 외영역을 비교로 사용할 수 있다.
[실시예 Ⅲ]
[전형된 상피 세포에서 변화된 신데칸 유전자 발현의 검출]
총 RNA를 Chirgwin et al. (1979) Biochem. 18: 5294-5299에 기술된 바에 따라 4M 구아니딘 이소티오시아네이트 및 CsCl-pelleting을 이용하여 분리하였다. 15㎍의 RNA 부분표본(aliquot)을 포름알데히드 아가로스 겔(1%)에서 분별하고, Gene Screen Plus Membrane에 옮겼다. 신데칸에 대한 multi-prime(Amersham) 표지 삽입물(multi-prime labeled insert)과 PM-4 cDNA 소식작의 교잡(hybridization)(Saunders et al. (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556)은 막 생산업자(membrance munufacturer)(New England Nuclear)의 제안 조건 하에서 수행하였다. 막을 Kodak X-Omat film에 70℃에서 노출시켜 고정 소식자(immobilized probe)를 관찰하고, 위에서 기술한 농도계 분석(densitometric analysis)으로 2.6kb mRNA를 정량하였다. 신데칸 mRNA 의 발현은 Denis et al. (1988) Nucl. Acid Res. 16: 2354-2359에 기술된 바와 같이 리보솜 RNA(ribosomal RNA)에 상관되어 있었다. 신데칸 억압의 특이성은 쥐의 글리세랄데히드 3-포스페이트-데히드로게나제(GAPDH)(Fort et al. (1985) Nucl. Acid Res. 13: 1431-1442) 및 생쥐의 알파-액틴(alpha-actin)(Minty et al. (1981) J. Biol. Chem. 256: 1008-1014)식으로 동일 시료들을 소식자검사(probing)하여 더 조사하였다.
파라핀 절편(pataffin section)에 대한 cRNA 생체내 교잡은 Wilkinson et al. (1989) DEvelopm. 105: 131-136의 방법에 따라 수행하였다. 생쥐 신데칸에 대한 부분(partial) cDNA 클론으로부터 535 bp Sac Ⅰ - Kpn I fragment 를 riboprobe pGEM-4Z vector(Promega, Madison, WI)로 서브클로닝(subcloning)시켰다(Vainio et al. (1991) Development, submitted). 삽입물을 함유하는 클로닝된 혈장(cloned plasmid)을 Eco RI 또는 Hind Ⅲ 효소로 직선화하고(linearized ),35S-UTP(Amersham, Willshire, UK)존재하에 T7 또는 SP6로 보족성 사상체(complementary strand)로부터 감작 또는 항감작 전사체(antisence or sence transcripts)를 각각 생성시켰다. 알칼리성 가수분해(alkaline hydrolysis)로 전사체의 최대 길이를 200bps 이하로 작게하고, 최고도의 비방사능(highest specific activity)를 갖는 분절(fraction)을 모아, 침전시키고, 수소화물화 완충액(hydridization buffer)에 용해시켰다. 전처리된 슬라이드(pretreated slide)를 50℃에서 하룻밤 교잡시키고(hybridize), 앞에서 기술한 바대로(Wilkinson et al. (1989) Development 105: 131-136)소식자(probe)의 비특이적 결합을 제어하는 공정(고도의 엄밀한 세척 및 리보누클레아제 A 처리를 포함하여)을 수행하였다.
[실시예 Ⅳ]
[종양으로부터 유래한 조직 절편(tissue section)에서 변화된 신데칸 발현의 검출]
Talve et al. (1990)Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 7: 109-115에 기술된 바에 따라, hr/hr C3H/Tif 계의 밝은 색의 털없는 숫놈 생쥐)Bomholdgaard, Denmark)를 UV-A 및 UV-B 방사를 쪼여 종양을 생성시켰다. 12개월의 관찰기간 동안, 총 유두종(papillomas) 83, 각피극세포종(keratoacanthomas) 2, 편평세포 암(squamocellular carcinomas) 4, 혼합 암육종(combined carcinosarcoma) 1 및 육종(sarcomas) 11이, 고 UV-A(582J/㎠)에 더하여 고 UV-B(홍반 효과;erthemally effective=EE)(1.0J/㎠) 및 고 UV-B(EE)(0.8J/㎠)와 관련하여 종양 형성이 증가하여(종양 78 대 28)발생하였다. 시료는 전체적으로 관찰되는 종양뿐만 아니라 정상적으로 보이는 UV-노출 피부로부터도 취하였다. 표본의 일부를 10% 완충 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 봉매하고(embedded), 얇게 자르고(section), 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 일정시간 염색하였다. 시료의 나머지는 질소에 냉동시키고 얇게 잘랐다. 병변(lesion)을 표준 조직병리학적 판정기준에 따라 분류하였다. 어떤 경우에는 기초막(basement memb.)을 잘 보이게 하기 위해서 PAS 염색법(Periodic acid-Schiff staining) 사용했을 뿐만 아니라, 콜라겐 유형에는 Herovic, Weigert's, Masson's trichrom 및 Gomori's 염색법 및 또다른 염색법 및 필요한 경우 전자현미경 분석을 사용하였다.
신데칸의 면역조직화학적 정위(immunohistochemical localization)를 위하여, 쥐 모노클로날 항체 281-2을 사용하였다. 이 항체는 생쥐 신데칸 외영역(18)의 코어 단백질에 특이성을 갖는다. Hsu et al. (1981) J. Histochem. Cytochem. 29: 577-580에 기재된 바대로, 고정된(immobilized)281-2를 검출하기 위해 아비딘비오딘-면역퍼옥시다제 방법(avidinbiotin-immunoperoxidase technique)을 사용하였다. 조직 절편을 탈파라핀화(deparaffinization)및 재수화(rehydration)시킨 후, 내인성(endogenous) 퍼옥시다제 활성을 슬라이드를 3% 하이드로겐 퍼오가이드를 함유하는 100% 메탄올에서 30분간 배양시켜 차단하였다(block). 다음, 절편들을 비특이성 염색을 최소화하기 위하여, 실온에서 30분 동안 Tris buffered saline, pH 7.4(TBS)에서 정상 산양(goat) 혈청(Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA)으로 배양시켰다. 절편을 1%(w/v) BSA-TBS에서 2㎍/m의 단백질 농도로 하여 제1의 항체 281-2로 씌우고(cover), 4℃에서 하룻밤 배양시켰다. 다음, 슬라이드를 실온에서 30분 동안, 1% BSA-TRS에 1:1000 희석한 비오틴화 산양 항-쥐 IgG(biotinylated goat anti-rat IgG)(Jackson's Immunoresearch Laboratories, Inc. West Baltiomore, Pennsylvania)로 배양하고, 마지막으로 아비딘비오틴-퍼옥시다제 복합체(complex)(Vectastain kit, Vector Laboratorees, Burlingame, CA)로 실온에서 30분간 배양하였다. 세척하고 나서, 슬라이드를 0.68㎎/ml 이미다졸 및 0.01% 하이드로젠 퍼옥사이드를 함유하는 TBS에서 0.5㎎/ml 3,3' - 디아미노벤지딘 테트라히드로클로리드(DAB, Polyscience, Inc., Northamton, England)로 어둠 속에서 5분간 배양함에 의해 퍼옥시다제 활성을 확인하였다(demonstrated). 슬라이드를 Meyer's 헤마톡실린으로 여리게 대비염색(counterstain)하고, Depex Mountion Medium(BDH Limited Pool, England)에 표본고정하였다(mount). 모든 단계의 사이에서, 슬라이드를 TBS으로 세번씩 씻어다. 대조 절편에서는 정상 쥐 IgG(Sigma, St. Louse, MO)을 2㎍/ml로 사용하였다. 또한, 각 종양 유형에서 약간의 냉동 절편을 염색하여, 파라핀 봉매 조직 절편(paraffin embedded tissue section)에서와 동일한 면역반응성의 결과를 낳았다. 제1항체 농도 및 배양 시간은 염색 양상을 중요하게 변화시키지는 않았다.
[실시예 Ⅴ]
[ras-종양유전자-유도 전형의 동안 변화된 신데칸 발현의 검출 ]
NOG-8 세포는 정상 생쥐 유방 상피 세포 계통의 스브클론(subclone)을 나타내며, NMuMG 및 NOG-8 ras 세포는 NOG-8 세포 계통이며, 이 계통은 1점 돌연변이된 (a point mutated)c-Ha-ras 유전자에 연결되는 글루코코르티코이드 유도가능한(glucocorticoid inducible) MMTV-LTR 촉진자를 포함하는 혈장에 감염되어 있다. 세포를 5% 덱스트란카콜-처리된 송아지 태 혈청(DCC-FCS; dextrancharcoal-treated fetal calf serum), 글루타민, 페니실린(100IU/ml) 및 스트렙토마이신(100㎍/ml)를 가한 RPMI-1640 세포 배지(Gibco)에서 성장시켰다. 이 세포들에 이어서, 세포 배양 배지에 1μM 덱사메타손(Sigma)을 가하여 c-Ha-ras 유전자 발현을 최대로 유도할 수 있다. 침투된 유전자의 발현에 영향을 미칠 수있는, 혈청으로 부터 부가의 스테로이드(additional steroid)를 제거하기 위해 DCC-처리를 하였다. 부유 배양(suspension culture)을 위해 세균 접시(bacteriological dish)를 RPMI-1640에 1% 한천(Sigma)으로 씌워서 가능한 세포-기질 유착(cell-substrate adhension)을 막았다. 세포를 1×105세포/ml의 밀도를 접종하였다. 트립신처리(trypsination)후 세포 수를 쿨터 계수기(Coulter Counter; Coulter Electronics, Hialeah, Fl)를 이용하여 정량하였다. PM-4는 Saunders et al. (1989) J. Cell Biol. 108:1547-1556에서 최초로 클로닝된 신데칸에 대한 cDNA 소식자이다. 그것은 정상 생쥐 유방 세포로부터 2.6kb 및 3.4kb의 두개의 띠(band)를 검출한다.
RNA 제조를 위해, 세포 배양 접시를 얼음으로 차게한 인산염 완충액(PBS)으로 두 번 세척하고, 다음, 4M GIT 완충액(5mM 소디움 시트레이트(pH 7.0), 0.1M β-머캅토에탄올 및 0.5% N -레이릴사르코신(layrylsarcosine)에 4M 구아니딘 이소티오시아네이트)에 용해시켰다. Chirgwin et al. (1979) Biochem. 18: 5294-5299에 의해 기술된 바대로 CsCl 밀도 원심분리(density centifugation)하여 총 RNA 를 추출하였다. Northern bolt 분석을 위해, RNA 시료를 1% 포름알데히드-아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 이 겔들을 Gene Screen hybridization membrance 위에 블로팅(blotting)하였다. 여과기를 42℃에서 1M NaCl, 1% 소디움 도데실설페이트(sodium dodecylsulfate), 10% 덱스트란 설페이트, 5 × Denhardt's 용액, 100㎍/ml salmon-sperm DNA, 50% 포름아미드에서 전교잡(prehybridization)하였다. 교잡(hybridization)을 위해, multi-prime labeled PM-4 또는 BS-9 소식자를 가하였다. P32(Amersham) 동위원소(isotope)를 사용하였다. 여과기를 2×SSC 에서 65℃에서 PM-4에 대해 세척하고, 60℃에서 BS-9에 대하여 세척하고, Kodak X-Omat 또는 Fuji X-ray film 에 자동촬영하였다(autograph).
세포 표면 신데칼 발현의 정량을 위해, 배양 접시의 세포를 얼음으로 차게한 PBS 로 세 번 세척하였다. 다음 접시를 4℃에서 10분 동안 PBS 에 0.5mM K-EDTA 에서 배양하였다. 트립신(Sigma, T-8128)을 최종 농도 20㎍/ml가 되도록 가하고 4℃에서 10분간 배양하엿다. 트립신은 신데칸의 외영역을 배지로 방출한다(Rapraeger Bernfield(1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109). 다음으로 세포를 고무관을 씌운 유리젓대(rubber policeman)로 문지르거나(scrape) 집락(colony)을 현탁시키고 트립신 억제자(Sigma, T-9128)를 최종 농도 100㎍/ml로 가하였다. 세포를 원심분리하고(5분간, 100xg), 상청액을 취하고, 세포를 쿨터 계수기로 세었다. 부유액의 세포를 관(tube)으로 수집하고, 집락을 5분간 가라앉도록 하여(sedimentate), 배양 접시 배양물과 유사하게 상청액을 제거하였다. 집락을 얼음으로 차게한 PBS로 세 번 세척하고, 트립신으로 처리하였다.
2×105세포에 상응하는 적당량의 상청액을 양이온성 나일론 막(Zeta Probe, Bio-RAd) 위에 블로딩(blottoing)하였다. 막을 실온에서 1시간 동안, 배양 완충액(incubation buffer)(10% 송아지 태 형청, 1mM 나트륨 아지드(Natrium azide), PBS)에서 전배양하였다. 신데칸의 외영역을 인지하는, 방사능으로 포식된(Chloramine-T method)MnAb 281-2(Jalkanen et al. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096)을 최종 농도 10,000CMP/ml가 되도록 배양 완충액에 가하고, 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 여과기를 실온에서 10분간 PBS로 세척하였다. 세척을 10번 반복한 다음, 여과기를 X-ray film에 자동방사선사진(autoradiograph)을 찍었다. 자동사진(autograph)을 Gelscan XL ultroscan densitometer(LKB) 및 Gelscan SL 2400 software(LKB)로 분석하고, 분리된 외영역(Jalkanen et al. (1987) J. Cell Biol . 105:3087-3096)으로 표준화하였다.
요약하면, 본 발명은 예를 들어, 조직 단위(tissue level) 및 다양한 체액에서 신데칸의 발현 및 내용물을 정량함에 의해 잠재적으로 해로운 전형을 검출하는데 유용하다. 본 방법은 예를 들어, 신데칸 특이성 배위자, 항체(polyclonal or monoclaonal) 및 cDNA 를 이용하여 생화학적으로, 면역조직화학적으로 및 분자생물학적으로 수행될 수 있다. 본 발명의 특이산 초점은 악성 전형의 진행과정 동안 신데칸 발현의 급격한 감소를 나타내는 상피 세포의 악성 변화에 대한 것이다. 과형성에 있어서 신데칸 발현의 분석도 또한 포함되는데, 이러한 전악성 단계의 심각정도를 평가하는데 가치가 있기 때문이다. 신데칸 발현의 분석은 특히 이형성(dysplasia)의 서로 다른 전악성 증식 단계를 분류하는데 유용하다.

Claims (18)

  1. 다음의 단계로 이루어지는, 인간 세포에서 악성 또는 전악성 변화를 검출하는 방법; (a). 악성 세포, 전악성 세포, 과형성 세포 또는 정상 상태에 비해 형태학적 변화가 있는 세포를 갖는 것으로 예견되는 체액 또는 조직으로부터 취한 제1시료인, 인간으로부터의 제1체액 또는 조직 시료에 있는 세포에서 신데칸 내용물의 결정. (b) 단계(a)로부터 결정된 신데칸 내용물을, 제1생물학적 물질의 시료와 같은 유형의 체액 또는 조직이며, 그러나, 단계(a)의 세포보다는 정상이거나 보다 덜 전형된 세포 시료인 제2생물학적 물질의 시료로부터 얻은 신데칸 준위(level)와의 비교 및, (c). 제2생물학적 물질 시료에 비해 제1시료에서 보다 적은 신데칸의 존재에 기초하여 상기 악성 또는 전악성 변화의 결정.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변화가 악성 전형인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 변화가 전악성 전형인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변화가 과형성인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변화가 형태학적 변화인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1시료의 신데칸 내용물을 신데칸 단백질 준위를 평가하여 결정하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 신데칸 단백질 준위를 상기 신데칸 단백질을 인지하는 항체를 사용하여 결정하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제1시료의 신데칸 내용물을 신데칸 mRNA 준위를 평가하여 결정하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제1시료의 신데칸 내용물을 상기 시료에서 신데칸 외영역의 양을 평가하는 공정으로 결정하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1시료의 신데칸 외영역을, 평가하기에 앞서서 상기 세포의 표면으로부터 방출시키는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 제1시료의 신데칸 내용물을 평가히기 위해 인간 신데칸 특이 항체를 이용하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 제1시료의 신데칸 mRNA 내용물을 평가하기 위해 인간 신데칸 항감작 mRNA를 이용하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 제1시료의 신데칸 mRNA 내용물을 평가하기 위하여 신데칸 함감작 올리고누클레오티드를 이용하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 생물학적 물질이 체액인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 체액이 혈장(plasma)인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 체액이 혈청인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 체액이 오줌(urine)인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 체액이 척수액(spinal fluid)인 방법.
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