FI104347B - Menetelmä biologisen materiaalin, kuten kudosten ja kehonesteiden syndekaanimäärän määrittämiseksi solujen pahanlaatuisen transformaation todentamiseksi - Google Patents

Description

1 104347

MENETELMÄ BIOLOGISEN MATERIAALIN, KUTEN KUDOSTEN JA KEHONESTEIDEN, SYNDEKAANIMÄÄRÄN MÄÄRITTÄMISEKSI SOLUJEN PAHANLAATUISEN TRANSFORMAATION TODENTAMISEKSI

Esillä oleva keksintö liittyy yleisesti biologian alaan kuten syöpäbiologiaan, 5 ja eritysesti menetelmiin malignin tai premalignin kudoksen tunnistamiseksi, siten että eräässä keksinnön käyttömuodossa määritetään syndekaanin häviäminen ihmisen kudoksista ja kehonesteistä, jossa menetelmässä voidaan määrittämisessä hyväksikäyttää syndekaaniile spesifisiä tunnistimia, vasta-aineita ja cDNA koettimia.

10 Solujen pintamolekyylejä, jotka toimivat määrätyissä solun pinnan ja ekstrasellulaarisen matriksin (ECM) välisissä vuorovaikutuksissa, kutsutaan väliainereseptoreiksi. Näiden reseptoreiden kyky tunnistaa väliaine on tärkeä solun muodon säätelyssä, jakaantumisessa ja erilaistumisessa, ja tämä on siten kriittinen tapahtuma elinten normaalissa kehityksessä ja kudosarkkitehtuurin 15 ylläpidossa. Tunnettuja väliainereseptoreita ovat mm. transmembraanisten glykoproteiinien muodostama perhe, joilla on yhteiset rakenteelliset ja toiminnalliset ominaisuudet ja joita kutsutaan integriineiksi (Hynes, R. (1987) Cell 48: 549-554), eräs 67 kDa glykoproteiini, joka sitoutuu lamiinin B1 -ketjuun (Graf et ai. (1987) Cell 48: 65: 989-996) sekä solun pintaproteoglykaanit (PG), jotka 20 riippuen glykosaminoglykaani koostumuksestaan (esim. heparaanisulfaatti), voivat sitoutua monien väliainemolekyylien kanssa (Jalkanen, M. (1987) Med. Biol. 65: 41-47).

Solujen adheesio, levittäytyminen, jakaantuminen ja erilaistuminen perustuu solupinnan ja ympäröivän ekstrasellulaarisen matriksin (ECM) läheiseen 25 kontaktiin. Ligandi-reseptori-interaktioiden selektiivinen käyttö voi olla perustana jn vivo esiintyvien spesifisten solu-matriksi interaktioiden moninaisuudella, jota tarvitaan elinten kehityksessä (Ekblom et ai. (1986) Ann. Rev. Cell Biol. 2:27-47). Transformaation tiedetään muuttavan solujen ECM vastetta (Liotta, L. (1986) •«

Cancer Res. 46:1-7), mikä viittaa siihen, että malignisoluissa voi esiintyä 30 muutoksia matriksireseptoreiden ilmentymisessä (Plantefaber and Hynes (1989) Cell 56: 281-290; Cheresh et ai. (1989) Cell 57: 59-69). Nämä muutokset ovat suurimmalta osaltaan tuntemattomia, mutta niillä voi olla tärkeä osuus erilaisten solutyyppien malignin käyttäytymisen muokkautumisessa.

2 104347

Hiiren maitorauhasepiteelisolujen pintaproteoglykaani muodostuu iipofiilisesta membraanikohdasta (Rapraeger and Bernfield (1983) J. Biol. Chem. 258: 3632-3636; (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109) ja matriksin kanssa vaikuttavasta ektodomeenista, johon sisältyy sekä heparaanisulfaatti ja 5 kondroitiinisulfaattiketjuja (Rapraeger et ai. (1985) J. Biol. Chem. 260:11046-11052). Äskettäin suoritettu hiiren ja ihmisen syndekaanin cDNA-kloonaus on varmistanut että nämä toiminnalliset kohdat esiintyvät ydinproteiinissa ja tämä PG on kutsuttu syndekaaniksi (Saunders et ai. (1989) J. Cell Biol. 108:1547-1556;

Mali et ai. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889). Syndekaanin ektodomeeni 1 o tunnistaa monoklonaalinen vasta-aine MAb 281-2 (Jalkanen et ai. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984; Jalkanen et ai. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096). Ektodomeeni sitoutuu korkealla affiniteetilla kollageenin tyyppi I, III ja V fibrilleihin (Koda et ai. (1985) J. Biol. Chem. 260: 8157-8162) sekä alhaisemmalla affiniteetilla fibronektiinin hepariinia sitovaan kohtaan C-terminaalissa (Saunders and Bernfield 1 5 (1988) J. Cell Biol. 106: 423-430), trombospondiiniin (Sun et ai. (1989) J. Biol.

Chem. 264: 2885-2889) ja tenaskiiniin (Salmivirta et ai. (1991) J. Biol. Chem.

> 266:17866-17873). Ligandiin sitoutuminen edistää membraanikohdan liittymistä aktriinirikkaaseen tukirankaan (Rapraeger et ai. (1986) J. Cell Biol. 103: 2683-2696). Solut voivat kuitenkin irroittaa ektodomeenin solun pinnalta ydinproteiinin 2 o protetolyyttisen pilkkoutumisen avulla, jolloin ektodomeeni erottuu membraanidomeenista (Jalkanen et ai. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096; Weitzhandler et ai. (1988) J. Biol. Chem. 263: 6949-6952). Tästä syystä syndekaani voi yhdistää epiteelin tukirangan väliaineeseen, mutta myös heikentää • : epiteelin sitoutumisen siihen. Näiden yhteyksien avulla syndekaani voi välittää 2 5: matriksin organisaation solun organsaatioon ja siten vaikuttaa solujen : käyttäytymiseen. Koska syndekaani pääosiltaan vaikuttaa strooman osiin, kuten kollageenifibrillehin ja fibronektiiniin, syndekaanilla voi olla välittäjän rooli !. ’. epiteeliaalisen ja mesekymaalisen kudoksen välillä. Tämänkaltainen kommunikaatio on kriittinen epiteelin normaalissa erilaistumisprosessissa ja 30" elinten muodostumisessa.

;**: Syndekaanin ilmentyminen kehityksen aikana ja elinten mudostuessa liittyy .-‘.‘.enemmän morfogeneettiseen kuin histologiseen tapahtumaan (Thesleff et ai.

• (1988) Dev. Biol. 189: 565-572), ominaisuus, joka myös tukee sitä, että ’·* 'syndekaanilla on aktiivinen rooli matriksireseptorina kehityksen aikana.

3 5...:Syndekaania on lokalisoitu pääosin erilaisilla epiteelisoluilla (Hayashi et ai. (1987) : :':J. Histochem. Cytochem. 35:1079-1088), mutta sitä voidaan myös löytää ....jplasmasolujen pinnalta (Sanderson and Bernfield (1988) Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 85: 9562-9566). Syndekaania esiintyy myös kondensoituvassa 3 104347 mesenkymissä orastavan epiteelin läheisyydessä elinten muodostumisen aikana (Thesleff et ai. (1988) Dev. Biol. 189:565-572). Syndekaanin ilmentyminen mesenkyymissä on osoitettu epiteeliyhteyden säätelemäksi sekä hammaskudoksessa (Vainio et ai. (1988) ja metanefrisessä munuaisessa (Vainio 5 et ai. (1989), ja kummassakin kudoksessa sen ilmentyminen korreloituu sekä paikallisesti että ajallisesti näiden elinten morfogeneesiin.

YHTEENVETO KEKSINNÖSTÄ

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä malignien tai premalignien muutosten detektoimiseksi ihmisen soluista. Keksinnön menetelmälle on 10 tunnusomaista se, että (a) määritetään ensimmäisessä ihmisestä peräisin olevassa neste- tai kudosnäytteessä esiintyvien solujen syndekaanin määrä, jolloin kyseinen ensimmäinen näyte on otettu nesteestä tai kudoksesta, jonka epäillään sisältävän maligneja soluja, premaligneja soluja, hyperplastisia soluja tai soluja joissa on 15 morfologisia muutoksia niiden normaalitilaan nähden, (b) vertaillaan kohdassa (a) määritetty syndekaanimäärä toisesta biologisesta näytteestä saatuihin syndekaanitasoihin, jolloin kyseinen toinen biologinen näyte on samaa neste- tai kudostyyppiä kuin yllä mainittu ensimmäinen biologinen materiaali, mutta jolloin kyseinen toinen näyte on otettu solunäytteestä, 20 jonka solut ovat normaaleja tai vähemmän transformoituja kuin kohdassa (a) käytetyt solut, ja (c) määritetään kyseisten malignien tai permalignien muutosten läsnäolo ensimmäisen näytteen toiseen biologiseen näytteeseen nähden pienemmän : syndekaanin määrän perusteella.

25 Lyhyesti, keksintö koskee menetelmää ihmisen mahdollisesti kohtalokkaan solutransformaation tunnistamiseksi. Menetelmä koostuu ihmisestä peräisin olevan biologisen materiaalin syndekaanisisällön indikaattorin määrittämisestä ja tämän arvon vertaamisesta edullisesti samantyyppisen biologisen * referenssimateriaalin syndekaanin referenssi-indikaattoriin.

30 Esitetty menetelmä voidaan suorittaa monella eri tavalla, esim.

biokemiallisia, immunohistologisia ja molekyylibiologisia menetelmiä hyväksikäyttäen. Vaikka menetelmää voidaan käyttää kohtalokkaiden transformaatioiden kuten malignien tai premalignien tilojen tunnistamiseksi erilaisissa organismeissa, se on erityisen käyttökelpoinen kohtalokkaiden solutransformaatioiden 4 104347 tunnistamiseksi. Tunnistettavia transformaatioita ovat mm. premalignit ja malignit transformaatiot, kuten hyperplasiat ja morfologiset muutokset.

Syndekaanimäärän tai syndekaanin puuttuminen voidaan määrittää ihmisen erilaisista biologisista materiaaleista, kuten soluista, kudoksista ja kehonesteistä, 5 erityisesti seerumista, plasmasta, virtsasta, selkäydinnesteestä tai muista kudoseritteistä. Biologisen materiaalin syndekaanimäärä voidaan määrittää käyttäen erilaisia välineitä, kuten syndekaanispesifisiä ligandeja tai biokemiallisia determinantteja, syndekaanispesifisiä vasta-aineita ja syndekaanin antisensi-RNAta tai cDNAta tai oligonukleotideja.

10 Esillä olevan keksinnön muut piirteet, kohteet ja edut ilmenevät tarkemmin seuraavan keksinnön kuvauksen tarkastelussa yhdessä esitettyjen kuvien kanssa.

LYHYT SELOSTUS KUVISTA

Kuva 1A esittää graafisesti solupinnan syndekaanisisältöä verrattuna aikaan, joka kuvaa syndekaanin häviämistä hiiren testosteronin avulla 15 transformoidusta maitorauhasen epiteelisoluista.

Kuva 1B esittää graafisesti syndekaanin lähetti-RNAn ilmentymistä ajan suhteen, joka kuvaa syndekaanin häviämistä hiiren testosteronin avulla transformoidusta maitorauhasen epiteelisoluista.

Kuvat 2A - 2D ovat kuvia hiiren biologisen ihomateriaalin ohutleikkeistä, 20 jossa syndekaanin ilmentymisen muuttuminen näkyy sen jälkeen kun materiaali on altistettu UV-säteilytykselle.

• 5 104347

Kuva 3A ion kuva hiiren monolayerissä kasvatetuista maitorauhasen epiteelisolususpensiosta, jossa yksi kerros on transformoitu ras-onkogeenin avulla.

Kuva 3B esittää graafisesti Kuvassa 3A esitetyn monolayerin soiupinnan syndekaanimäärää.

5 EDULLISTEN KÄYTTÖMUOTOJEN TARKEMPI KUVAUS

Esillä oleva keksintö perustuu osittain siihen, että syndekaanin määrittäminen on arvokas diagnostinen kriteeri biologisen materiaalin, kuten epiteelisolujen, maligniteetin arvioinnissa. Tässä annetaan kolme esimerkkiä kokeellisen transformaation induktiosta (hormonaalinen induktio, UV-ärsytys ja 1 o onkogeeni-induktio), ja jokaisessa osoitetaan esiintyvän syndekaanin häviämistä. Syndekaanin häviämisen tunnistaminen on arvokasta myös muissa transformaatioon johtavissa mekanismeissa, kuten tuumorin muodostumisessa, ja siksi esillä oleva keksintö ei rajoitu vain näihin kuvattuihin menetelmiin. Syndekaanin määrittäminen voi antaa arvokasta tietoa myös kudosten , (kuten 1 5 ihon, munuaisen, aivojen, keuhkojen ja virtsarakon), monissa proliferatiivisissa vaiheissa, jotka myöhemmin voivat muuttua enemmän maligniksi vaiheeksi. Nämä niin sanotut premalignit vaiheet näkyvät usein dysplasioina, ja niissä ilmentyy vaihtelevia määriä syndekaania, mikä tieto tarvitaan taudin vakavuuden arvioimiseksi, jotta sopiva terapeuttinen hoito voidaan määrittää. On myös tärkeää 2 o määrittää syndekaanin määrä kiertävissä plasmasoluissa. Siksi näiden solujen analysointi esillä olevan menetelmän avulla, käyttäen syndekaanispesifisiä vasta-aineita, kuten FACS-analyysi (Fluorescent Activated Cell Sorter), antaa arvokasta , ; tietoa lymfomaa, myelomaa, leukemiaa tai muuta proliferatiivista hematopoieettista - soluvaihetta potevan potilaan patofysioloisesta tilasta.

2 5Syndekaanin tiedetään myös irtoavan solun pinnalta (Jalkanen et ai. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096), ja eräissä sairaustiloissa syndekaanin häviäminen solun pinnalta saattaa johtaa sen esiintymiseen kehonesteissä. Siksi esillä olevan keksinnön mukaisesti syndekaanin määrän määrittäminen seerumista, plasmasta, ]··/·. virtsasta, selkäydinnesteestä tai muista nestenäytteistä on diagnostisesti arvokasta 3 o', määrittääkseen kuinka suuressa määrin tutkitussa kudoksessa on tapahtunut :kudosvahinkoa ja normaalin solumorfologian häviämistä.

Kuten aikaisemmin mainittiin, syndekaani on solun pintaproteoglykaani, joka : : -muodostuu kovalentisti sidotuista glykosiamiiniglykaaniketjuista (GAG) sekä .. '"'-’membraaniin sijoittuvasta ydinproteiinista (Saunders et ai. (1989) J. Cell Biol. 108, 6 104347 1547-1556). Syndekaanin GAG-ketjut tiedetään kuuluvan heparaanisulfaatti- ja kondroitiinisulfaattiryhmiin (Rapraeger et ai. (1985) J. Biol. Chem. 260:11046-11052), ja ne eivät rajoitu vain syndekaaniin. Syndekaanin ydinproteiini on ainutlaatuinen ja määrittää molekyylin erääksi useista samankaltaisista solun 5 pintaproteoglyykaaneista (Mali et ai. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889). Hiiren syndekaani eristettiin ensimmäisenä ja sitä tunnistetaan yhä käyttäen syndekaanin ydinproteiinia tunnistavaa monoklonaalista vasta-ainetta (MAb 281-2) (Jalkanen et ai. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984).

Esillä olevan keksinnön tarkempana selityksenä analysoitiin syndekaanin 1 o ilmentymistä malignin fenotyypin induktion yhteydessä kolmessa itsenäisessä biologisessa mallissa, joissa kaikissa aikaansaadaan epiteelisolujen maligni transformaatio. Kaikissa näissä malleissa todettiin syndekaanin häivämistä yhtaikaisesti malignin transformaation kanssa. Nämä tulokset esitetään alla lyhyesti esillä olevan keksinnön kuvaamiseksi seuraavissa malleissa.

15 Ensimmäisessä mallissa käytettiin hiiren rintasyöpäsolulinjaa Shionogi 115 » (S115). Nämä solut ovat hyvä malli transformoidun fenotyypin tutkimuksissa, koska ne reagoivat androgeeneihin lisääntyvällä kasvunopeudella (King et ai. (1976) J. Steroid Biochem. 7: 869-873) ja muuttumalla epiteliaalisesta morfologiasta fibroblastiseksi (Yates and King (1981) Cancer Res. 41: 258-262).

2 o Androgeenin läsnäollessa solut kiinnittyvät kevyesti substraattiin ja niillä on kyky kasvaa suspensiossa ilman ankkuroivaa matriksia, kun ne androgeenin puuttuessa kiinnittyvät tiukasti matriksiin eivätkä kasva suspensiossa lainkaan (Yates and King (1981) Cancer Res. 41: 258-262). Morfologisen muutoksen ja : ankkurointi-riippumattomuuden tausta on suurelti tuntematon, vaikka useita : mekanismeja, kuten muutoksia tukirangan organisaatiossa (Couchman et ai.

* ·;(1981) Cancer Res. 41: 263-269) ja parakriinimekanismeissa (Darbre and King :·.·. (1988) In Breast cancer: Cellular and Molecular Biology, ed. M.E. Lippman and *·:·. R.B. Dickson, Academic Publishers, pp 307-341) onkin esitetty.

Testosteronilla käsitellyt S115 solut osoittivat vahvaa RGDS-riippuvaa β·0\: sitoutumista fibronektiiniin, mutta eivät sitoutumista fibronektiinin hepariinin sitoutumiskohtaan, mikä osoittaa että ne ilmentävät integriinin kaltaisia .1.^ molekyylejä. Toisaalta ilman testosteronia kasvatetut S115 solut osoittivat epiteliaalista morfologiaa ja sitoutuivat fibronektiinin hepariinin sitoutumiskohtaan, mikä osoittaa että hormonilla käsitellyissä S115 soluissa syndekaanin 3f5* · ilmentyminen on muuttunut. Sekä matriksiin sitoutuneet syndekaanin ·:··: ektodomainin määrä radioimmunotestillä ja Western-blot menetelmällä määritettynä, että syndekaanin lähetti-RNAn (2.6 kb) määrä aleni 7 104347 hormonikäsitellyissä S115-soluissa. Antiandrogeenin, kyproteroniasetaatin, lisäämisellä kasvatusalustaan oli vastakkainen vaikutus syndekaanin lähetti-RNAhan verrattuna testosteroniin. Täten syndekaanigeenin inaktivaatio ja siitä johtuva syndekaanin ilmentymisen suppressio liittyy muuttuneisiin adhesio-5 ominaisuuksiin, epiteliaalisen fenotyypin häviämiseen ja, toisaalta, transformoidun fenotyypin ilmaantumiseen hormoni-käsitellyissä S115 soluissa.

Esimerkki yllä mainituista tuloksista esitetään Kuvissa 1A ja 1B. Kuva 1A on vertaileva graafinen esitys solun pinnan syndekaanimäärästä aikaan nähden, joka kuvaa syndekaanin häviämistä testosteronikäsittelyllä transformoiduissa hiiren 1 o maitorauhasepiteelisoluista (S115) ja Kuva 1B on vertaileva graafinen esitys syndekaanin lähetti-RNAn ekspressiosta aikaan nähden, joka kuvaa syndekaanin häviämistä testosteronikäsittelyllä transformoiduista hiiren maitorauhasepiteelisoluista. Nämä kuvat osoittavat malignia käyttäytymistä ja syndekaanin ilmentymisen häviämistä osoittamalla proteiinin tasoa Kuvassa 1A ja l-RNAn tasoa 1 5 Kuvassa 1B käsittelyn jälkeen.

' Yllä olevasta selviää, että androgeenin lisääminen S115 viljelmiin johtaa syndekaanin ilmentymisen suppressioon inaktivoimalla syndekaanigeeniä. Tämä suppressio korreloituu läheisesti solujen ankkurointiriippumattomuuteen ja epiteliaalisen fenotyypin häviämiseen, ja on täten eräs syy S115-solujen 2 o transformaation kaltaiseen käyttäytymiseen androgeenin läsnäollessa.

Toisessa mallissa tutkittiin immunoreaktiiviisuutta syndekaania vastaan ": karvattomassa hiiressä (hr/hr), jota säteilytettiin UV-A ja UV-B säteilyllä. Positiivista " i värjäytymistä todettiin epidermaalisten normaalisolujen pinnalla sekä tälle : : hiirikannalle tyypillisissä dermaalisissa abortiivisissa hiusfollikkelikystoissa.

. Aikainen UV-säteilyreaktio, hyperplastinen, hieman atyyppinen epidermis : - . osoittautui myös positiiviseksi, vaikkakin värjäytyminen oli heikompi ; ·. epidermaalisolujen pinnoilla. Vahvaa dysplasiaa osoittavat näytteet värjäytyivät heikosti granulaarisolukerroksessa, kun taas basaalisolukerros oli negatiivinen.

, . Papilloomissa ja ainoassa keratoakantomassa esiintyi immunoreaktiivisuutta 4 · 3.ύ ·* syndekaanille benigneissä hyperplastisissa epidermaalisoluissa sekä • * · :sarveiskystojen proliferoituvissa epidermaalisoluissa. Malignia transformaatiota ; esiintyi skvamoosisolukarsinoomina sekä karsinomina ja liittyi aina .•••.syndekaanivärjäytymisen häviämiseen. Nämä tulokset täsmäävät aikaisempiin tuloksiin että syndekaanin ilmentyminen vähenee malignissa transformaatiossa 3 5·: : viljellyissä epiteelisoluissa, mutta osoittaa myös syndekaanin omaavan tärkeän a ‘:'*:roolin normaalin kudos rakenteen ylläpidossa sekä ihon erilaistumiskaaressa.

8 104347

Esimerkkejä näistä värjäyksistä esitetään Kuvissa 2A · 2D. Nämä kuvat ovat valokuvia hiiren biologisen ihomateriaalin ohutleikkeistä, joissa syndekaanin ilmentymisen kehitys näkyy materiaalin UV-säteilytyksen jälkeen. Kuva 2A esittää normaalia ihomateriaalia ja Kuvat 2B ja 2C osoittaa erilaisia hyperplasiavaiheita, 5 joissa Kuvassa 2C esiintyy malignia histologiaa. Nämä kuvat näyttävät että UV· säteilytyksellä indusoidussa premalignissa hyperplasiassa syndekaanin ilmentyminen asteittain häviää.

Yllä esitetystä käy ilmi, että epiteelisoluissa in vivo ja normaalissa ympäristössään syndekaanin ilmentyminen häviää malignin transformaatio- 1 o tapahtuman aikana, mikä taas osoittaa että syndekaanin ilmentyminen on tarpeellinen normaalin solumorfologian ja kudosintegriteetin kannalta, mutta myös sen, että syndekaanin ilmentymisen häviäminen voidaan korreloida epiteelisolujen dysplasian ja maligniteetin vakavuuteen.

Kolmannessa mallissa käytettiin pistemutatoidulla c-Ha-ras geenillä 1 5 trasfektoitua hiiren maitorauhasepiteelisolulinjaa. Näissä NOG-8 ras soluissa c-' Ha-ras geeni on MMTV-LTR promoottorin alla ja tämän ekspressio voidaan täten säädellä deksmetasonin avulla (Ciardiallo et ai. (1989). Kun nämä solut ekspressoivat c-Ha-ras geeniä ne muodostavat fokuksia soluviljelymaljoiila ja pesäkkeitä suspensiossa. Soluviljelymaljoiila viljellyt NAG-8 ras solut ilmensivät 2 o syndekaania samassa määrin kuin normaalisolut subkonfluentissa vaiheessa.

Mutta syndekaanin ilmentyminen väheni huomattavasti kun nämä solut osoittivat . transformoitua fenotyyppiä, so. kun maljoilla oli fokuksia tai kun solut kasvoivat ‘ pesäkkeinä suspensiossa. Kuitenkin syndekaanin l-RNA tasot pysyivät samalla ' tasolla näissä viljelmissä. Täten solupinnan syndekaanin säätely on 2 5 : posttranskriptionaalisesti organisoitu näissä soluissa. Nämä tulokset osoittavat, '.: että syndekaanin ilmentymisen vähentyminen transformaation aikana on yleinen ilmiö, mutta säätelytapa eri soluissa voi vaihdella transformaatiotyypistä toiseen.

Esimerkkinä onkogeeni-indusoidusta syndekaanin ilmentymisen , . häviämisestä esitetään Kuvat 3A ja 3B.

• « · itiY: Kuva 3A on valokuva, joka esittää hiiren monolayereina kasvatettuja .j.maitorauhasepiteelisolususpensioita, joissa yksi kerros on transformoitu ras-onkogeenillä, ja Kuva 3B on graafinen esitys Kuvassa 3A esitetyn monolayerin ‘•••‘solupinnan syndekaanimäärästä. Syndekaanin ilmentyminen kvantitoitiin : : :jokaisesta kasvatetusta epiteelisolulayerista a, b, c ja f, sekä ras-induktion jälkeen 3 5:·*!suspensiosta d. On ilmeistä, että syndekaani häviää ras-onkogeeni- transformoiduista hiiren epiteelisoluista.

9 104347

Yllä esitetystä ilmenee, että onkogeeni-indusoitu maligni transformaatio johtaa myös syndekaanin häviämiseen epiteelisolujen pinnalta, mikä osoittaa syndekaanin häivämisen olevan yleinen piirre malignissa transformaatiossa, ja että tämän häviämisen tunnistaminen on arvokas diagnostinen väline syövän 5 kaltaisten transformaatioiden ja näiden vakavuuden määrittämisessä.

On olemassa kolme edullista tapaa keksinnön mukaisesti määrittää syndekaanin määrää, so. biokemiallisesti, immunokemiallisesti ja molekyylibiologisesti. Ensimmäinen perustuu syndekaanin biokemialliseen tunnistamiseen, joka voi olla osa ydinproteiinista tai kovalentisti sidotuista GAG-1 o ketjuista. On osoitettu, että syndekaani voi sisältää spesifisiä GAG-ketjuja, jotka voivat mahdollistaa spesifisiä interaktioita syndekaanin kanssa (Elenius et ai.

(1990) J. Biom. Chem. 265:17837-17943; Salmivirta et ai (1991). J. Biom. Chem. 266: in press). Täten syndekaania voidaan tunnistaa käyttämällä syndekaanispesifisiä ligandeja. Muita käyttökelpoisia menetelmiä, joissa 1 5 käytetään syndekaanispesifisiä vasta-aineita ja cDNAta kuvataan alla.

> Ihmisen syndekaanin kloonaus (Mali et ai. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884- 6889) tai sen eristäminen ihmislähteistä, kuten ihmisen maitorauhassolulinjasta HBL-100 (Elenius et ai. (1990) J. Biol. Chem. 265:17837-17843) mahdollistavat ihmisen syndekaania tunnistavien vasta-aineen tuottamisen. Tämä voidaan 2 0 suorittaa immunisoimalla eläimiä polykloonalisten ja monoklonaalisten vasta- aineiden tuottamiseksi, tai tuottamalla monoklonaalisia vasta-aineita soluissa in . vitro, käyttäen eristettyä kokonaista ihmisen syndekaania, sen fragmentteja, ” synteettisiä peptidejä, tai fuusioproteiineilla, joita voidaan tuottaa ihmisen cDNA-’ kloonin avulla. Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan 2,5' i käyttää konventionaalisia molekyylibiologisia, mikrobiologisia, yhdistelmä-DNA ja • «· t ‘: immunologisia menetelmiä määritettäessä syndekaanin määrää ja tällaisia i'V menetelmiä on kuvattu kirjallisuudessa. Katso esimerkiksi Current Protocols in :T: Immunology (1990), Greene Publishing Associates ja John Wiley & Sons, Inc.

Käyttäen ihmisen syndekaania tunnistavia spesifisiä vasta-aineita, ah · ' syndekaanin ilmentymistä voidaan tutkia klassisten immunohistologisten : menetelmien avulla, esim. kuten Kuvissa 2A - 2D esitetyssä mallissa osoitetaan.

Näissä spesifinen tunnistus saavutetaan käyttäen primaarista vasta-ainetta . *. (polyklonaalista tai monoklonaalista), mutta sekundaaridetektiosysteemi voi ,*** käyttää hyväkseen fluoresoivaa entsyymiä tai muita konjugoituja sekundaarisia • * » 3 6: | vasta-aineita. Tulokseksi saadaan kudosleikkeen immunohistologinen värjäytyminen patologista tutkimusta varten. Kudokset voidaan myös uuttaa, esim.

• · urean ja neutraalin detergentin avulla, jolloin syndekaani vapautuu Westen-blot 10 104347 tutkimusta tai dot/slot testiä varten (Jalkanen et ai. (1985) J. Cell Biol. 105:976-985; Jalkanen et ai. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096). Tässä menetelmässä, joka perustuu kationisten kiintokantajien käyttöön, syndekaanin kvantitaatio voidaan suorittaa käyttäen eristettyä syndekaania standardina. Tätä menetelmää voidaan 5 myös käyttää kehonesteiden tutkimiseen. Näitä näytteitä tutkittaessa käytetään syndekaania molaarisessa konsentraatiossa eri kehonesteiden, kuten seerumin plasman, virtsan, selkäydinnesteen, jne., syndekaanimäärän standardiarvojen määrittämiseksi. Syndekaanimäärän normaaliarvo voidaan täten määrittää käyttäen terveistä vapaaehtoisista saatuja arvoja ja vertaamalla näitä arvoja 1 0 erilaisia sairauksia ja tauteja potevista henkilöistä saatuihin arvoihin.

Muutokset syndekaanin ilmentymisessä voidaan myös detektoida käyttämällä syndekaani-cDNAta kuten ihmisen syndekaani-cDNAta. Vaikka syndekaani onkin hyvin konservoitu eri lajeissa nukleotiditason rakenteelliset erot ovat riittävän suuret estääkseen hiiren syndekaanin käytön ihmisen syndekaanin 1 5 lähetti-RNAn detektiossa. Yleensä tietyn geenituotteen lähetti-RNA tasot voidaan määrittää saman nukleotidiketjun eri säikeiden spesifisen interaktion perusteella, ja tässä tapauksessa syndekaanin eri säikeiden perusteella. Tämä voidaan saavuttaa käyttämällä in situ menetelmiä kudosnäytteille, lähetti-RNAn suojaustestillä eristetylle RNAIIe tai syndekaanispesifisten nukleotidiketjujen 20 aiukeohjatun polymerisaation avulla. Kaikki nämä menetelmät on hyvin kuvattu kirjallisuudessa, kuten edellä mainitussa julkaisussa Current Protocols in Molecular Biology.

Seuraavissa esimerkeissä esitetään esillä olevan keksinnön mukaisia spesifisiä menetelmiä. On ymmärrettävä, että esimerkit annetaan tarkoituksella 2 5' - kuvaamaan keksintöä, eivätkä ne rajoita edellä kuvattua keksintöä näihin esimerkkeihin.

.r. ESIMEBKKLI

Syndekaanin lokalisaatio transformoiduissa epiteelisoluissa

* I

,·. Hiiren maitorauhastuumorin kantasoluja, Shionogi S115, viljeltiin ?<>' rutiininomaisesti DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) mediumissa, johon : oli lisätty 5% lämmöllä inaktivoitua fetaalivasikan seerumia (i-FCS), pyruvaattia (1mM)., glutamiinia (1mM), penisilliiniä (100 iU/ml), streptomysiiniä (100 pg/ml) ja testosteronia (10nM). Hormonikäsittelyä sisältävissä kokeissa kasvumediumiin lisättiin 4% dekstraani-hiili-käsiteltyä fetaalivasikan seerumia (DC-FCS) 10 nM 3;5 testorestonin ja/tai 1μΜ kyproteroniasetaatin kanssa tai ilman tätä lisäystä. Kokeita 11 104347 varten solut jaettiin tiheydellä 10,000 solua/cm2 Nunc kudosviljelymaljoille. Solulaskentaa varten solut hajotettiin Zabogloubuliinia (Coulter Electronics, Ltd.) sisältävääni 0 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2 ja vapautuneet tumat suspensoitiin isotoniseen liuokseen (Coulter) ja laskettiin lopuksi Coulter solulaskijassa.

5 S115 solut värjättiin neljäntenä viljelypäivänä kokonaisina kuten on kuvattu julkaisussa Jalkanen et ai. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984. Solun pintaproteoglykaani, syndekaani, immunolokalisoitiin rotan monoklonaalisella vasta-aineella 281-2, joka tunnistaa proteoglykaanin ydinproteiinia (Jalkanen et ai. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984) ja nämä värjäykset kontrolloitiin käyttäen toista 1 o lgG2a monoklonaalista vasta-ainetta Me1-14, joka tunnistaa lymfosyyttien kiinnitysreseptoria (Gallatin et ai. (1981) Nature 304: 30-34). Immobidsoitujen rotan vasta-aineiden tunnistus suoritettiin käyttäen kanin anti-rotta FITC-konjugaattia (Janssen Biochimica).

ESIMERKKI H

n 1 5 Svndekaanin ilmentymisen muuttuminen hormoni-indusoidussa epiteelisolun transformaatiossa

Syndekaanin kvantitoimiseksi S115 solujen pinnalla yksikerroksiset solukerrokset pestiin useamman kerran kylmällä PBS:llä ja molekyylin ektodomeeni vapautettiin käyttäen naudan haiman trypsiiniä (Sigma, Type III; 20 2 0 μς/ιηΙ) inkuboimalla 10 min jäällä kuten julkaisussa Rapraeger ja Bernfield (1983) .... J. Biol. Chem. 258: 3632-3636; (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109 on kuvattu.

. Trypsiini-inaktivaation jälkeen (100 pg/ml) solut sentrifugoitiin, supernatantti otettiin ] talteen ektodomeenin kvantitaatiota varten ja solut suspendoitiin Isotoniin .·'; '· solulaskentaa varten. Monoklonaalinen vasta-aine 281-1 radiojoditettiin 25 kloramiini-T-oksidaatiomenetelmällä (Stähli et ai. (1983) Meth. Enzymol. 92: 242-i 253) spesifiseen aktiivisuuteen 14.1 x 106cpm^g. Testiä varten supernatantit 2 x : : :105 solusta ja puhdistettu kontrollisyndekaani NMuMG soluista siirrettiin kationiselle nailonmembraanille (Zeta-Probe, BioRad) mini-fold slot-laitteessa :·.·. (Schleicher & Schuell) kuten aikaisemmin on kuvattu julkaisussa Jalkanen et ai.

:3pj*. (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096. Membraani irrotettiin slot-laitteesta ja inkuboitiin 1 tunti huoneenlämmössä PBS:ssä, jossa oli 125l-leimattua 281-2 * (10,000 cpm/ml). Pestiin viisi kertaa PBS-puskurilla, jonka jälkeen membraani • · valotettiin Kodak X-Omat filmille. Kvantitaationa jokainen täplä analysoitiin LKB : . ·. Ultroscan XL enhanced laser-densitometrillä ja tulokset verrattiin tunnettuihin NMuMG-soluista peräisin oleviin syndekaanimääriin.

• · • 12 104347

Trypsiinillä vapautetut ektodomeenit S115 soluista presipitoitiin etanolilla ja fraktiotiin SDS-PAGE gradienttigeelillä (4-10%) (0'Farrell (1975) J. Biol. Chem.

250: 4007-4021). Elektroforeesin jälkeen näytteet siirrettiin Zeta-Probe-membraanille käyttäen elektroblottauslaitetta 2005 Transphor (IKB) kuten 5 aikaisemmin kuvattu julkaisuissa Jalkanen et ai. (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984 ja Rapraeger et ai. (1985) J. Biol. Chem. 260:11046-11052, ja membraani valotettiin 1251-leimatulla 281-2 vasta-aineella kuten yllä kuvattiin. Tässäkin käytettiin eristettyä NMuMG soluista peräisin olevaa syndekaanin ektodomeenia vertailuna.

io ESIMERKKI III

Svndekaanigeenin muuttuneen ilmentymisen detektio transformoiduissa epiteelisoluissa

Totaali-RNA eristettiin käyttäen 4M guanidiini-isotiosyanaattia ja CsCI-pelletointia kuten julkaisussa Chirgwin et ai. (1979) Biochem. 18: 5294-5299) on ' 1 5 kuvattu. RNA fraktiotiin 15 μ9'.η eriin formaldehydiagaroosigeelillä (1%) ja siirrettiin Gene Screen Plus membraanille. Käyttäen membraanin valmistajan (New England Nuclear) ehdottamia olosuhteita hybridisoitiin multi-prime (Amersham) leimatulla PM-4 cDNA insertin syndekaanikoettimella (Saunders et ai. (1989) J.

Cell Biol. 108: 1547-1556). Immobilisoitu koetin visualisoitiin valottamalla 2 0 membraani Kodak X-Omatic filmille 70°C:ssa ja 2,6 kb lähetti-RNA kvantitoitiin ylläkuvatun densiometrisen analyysin avulla. Syndekaanin lähetti-RNAn ••’ilmentyminen korreloitiin ribosomaaliseen RNAhan kuten julkaisussa Denis et ai.

, i (1988) Nucl. Acid Res. 16: 2354-2359 kuvattiin. Syndekaanin suppression . . : spesifisyys tutkittiin vielä koettamalla samat näytteet rotan glyseraldehydi-3- 2 5.\fosfaattidehydrogenaasilla (GAPDH) (Fort et ai. (1985) Nucl. Acid. Res. 13:1431- 1442) ja hiiren alfa-aktiinilla (Minty et ai. (1981) J. Biol. Chem. 256: 1008-1014).

« * ·.· ; cRNA in situ hybridisaatio paraffiinileikkeillä suoritettiin julkaisussa

Wilkinson et ai. (1989) Developm. 105: 131-136 kuvatulla menetelmällä.

;'-’:Osittaisesta hiiren syndekaanin cDNA-kloonista (PM-4) peräisin oleva 535 bp Sac I • « » 3 Q1 *'·- Kpn fragmentti (Saunders et ai. (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556) subkloonattiin riboprobe pGEM-4Z vektoriin (Promega, Madison, Wl) (Vainio et ai.

I * · .! .*(1991) Development, submitted). Kloonattu, insertiä sisältävä plasmidi ‘...iinearisoitiin Eco Rl tai Hind III entsyymillä ja anti-sense ja sense säikeiden : ; * ;transkriptit tuotettiin vastinsäikeistä käyttäen T7 tai SP6 polymeraasia 35S-UTP •« · · 3 5:. :(Amersham, Willshire, UK). Transkription maksimipituus säädettiin <200 « emäsparin pituisiksi alkalisella hydrolyysilla ja korkeimman aktiivisuuden omaavat 13 104347 fraktiot kerättiin, presipitoitiin ja solubilisoitiin hybridisaatiopuskurissa. Esikäsitellyt levyt hybridisoitiin yli yön 50°C:ssa ja poistettiin epäspesifisesti sitoutunut koetin (käyttäen high stringency pesuja ja ribonukleaasi A käsittelyä) sekä suoritettiin autoradiografia kuten aikaisemmin on kuvattu julkaisussa Wilkinson et ai. (1989) 5 Development 105: 131-136.

ESIMERKKI JY

Svndekaanin ilmentymisen muutosten detektio tuumoreista peräisin olevista

Kuctosl0ikk9i$ta

Tuumorit tuotettiin vaaleasti pigmentoiduissa karvattomissa hiiren uroksissa

1 o (lajike hr/hr C3H/Tif; Bomholdgaard, Tanska) altistamalla eläimet UV-A ja UV-B

säiteilylle kuten julkaisussa Taive et ai. (1990) Photodermatol. Photoimmunol. Photomed 7:109-115 on kuvattu. Kahdentoista kuukauden tarkastusjakson aikana ilmeni yhteensä 83 papillomaa, 2 keratokantomaa, 4 skvamosolukarsinomaa, yksi yhdistetty karsinosarkoma ja 11 sarkomaa, sekä kohonnut tuumorimuodostuminen N 1 5 yhdistetyllä korkealla UV-A (582 J/cm2) ja korkealla UV-B (erythemally effective -EE) (1.0 J/cm2) sekä korkealla UV-B (EE) (0.8 J/cm2) (78 versus 28 tuumoria). Näytteet otetiin kaikista karkeasti tunnistettavista tuumoreista sekä normaalilta näyttävästä UV-säteilytetystä ihosta. Osa näytteistä fiksattiin 10% puskuroidussa formaliinissa, peitettiin paraffiiniin, leikattiin ja rutiinivärjättiin hematoksyliinilla ja 2 0 eosiinilla. Loput näytteistä pakastettiin typpeen ja leikattiin. Leesiot luokiteltiin tavanomaisten histopatologisten kriteerien mukaisesti. Joissakin tapauksissa ' : käytettiin jaksottaista hapanta Schiff-värjäystä (PAS) visualisoidakseen • basaalimembraanit sekä Herovic, Weigert, Massonin trichrom ja Gomori-värjäystä ; ; kollageenityypitystä varten, sekä muita värjäysmenetelmiä ja tarvittaessa t 1 1 ?5'.\ elektronimikroskopiointia • 1 . *

Syndekaanin immunohistologista lokalisaatiota varten käytettiin rotan v : monoklonaalista vasta-ainetta, 281-2. Tämä vasta-aine on spesifinen hiiren syndekaanin ydinproteiinin ektodomeenille. Immobilisoidun 281-2 detektoinnissa Γ Λ käytettiin avidiinibiotiini-immunoperoksidaasimenetelmää, joka on kuvattu Y:julkaisussa Hsu et ai. (1981) J. Histochem. Cytochem. 29: 577-580. Kudosleikkeet ., deparaffinoitiin ja rehydroitiin, jonka jälkeen endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus • » •’’blokattiin inkuboimalla levyt 30 min 100% metanolissa, jossa oli 3% ’’..^vetyperoksidia. Tämän jälkeen leikkeet inkuboitiin 2%:ssa vuohen normaali-: :‘:seerumissa (Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA) Tris-puskuroidussa 3 5; ••fysiologisessa suolaliuoksessa, pH 7,4 (TBS) 30 min huoneenlämmössä ·: epäspesifisen värjäytymisen minimoimiseksi. Leikkeet peitettiin primaarivasta- 104347 aineella 281-2 proteiinikonsentraation ollessa 2pg/ml 1%:ssa (p/t) BSA-TBS ja inkuboitiin yli yön 4°C:ssa. Levyt inkuboitiin tämän jälkeen biotinyloidulla vuohen anti-rotta IgGillä (Jackson,s Immunoresearch Laboratories, Inc. West Baltimore, Pennsylvania) 1:1000 laimennoksessa 1%:ssa GSA-TBS 30 min 5 huoneenlämmössä, ja lopuksi avidiinibiotiiniperoksidaasikompleksilla (Vectastain kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA) 30 min huoneenlämmössä. Pesujen jälkeen peroksidaasiaktiivisuus osoitettiin inkuboimalla levyt 0.5 mg/ml 3,3’-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (DAB, Polysciences, Inc., Northampton,

England) TBS.ssä, jossa oli 0.68 mg/ml imidatsolia ja 0.01 % vetyperoksidia 5 min 1 o pimeässä. Levyt vastavärjättiin kevyesti Mayerin hematoksyliinilla ja kiinnitettiin Depex Mounting alustassa (BDH Limited Pool, England). Kaikkien vaiheiden välissä levyt pestiin kolme kertaa Tris-puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (TBS). Kontrollileikkeilla käytettiin 2μg/ml normaalia rotan lgG:tä (Sigma, St. Louis, MO). Muutama pakastettu leike jokaisesta tuumorilajista värjättiin myöskin, ja 1 5 näissä oli identtinen immunoreaktiivisuus verrattuna paraffiinipeitettyihin kudosleikkeisiin. Muutokset primaarivasta-aineen konsentraatiossa ja ' inkubointiajoissa eivät muuttaneet värjäyskuvioita huomattavasti.

ESIMERKKI V

Muuttuneen svndekaanin ilmentymisen detektio ras-onkogeenilla indusoidussa 20 transformaatiossa NOG-8 soluista on olemassa normaalin hiiren rintarauhasepiteelisolulinjan ...: subklooni, NMuMG, ja NOG-8 ras solut ovat NOG-8 solulinja, jota on transfektoitu . pistemutatoituun c-Ha-ras-geeniin linkattua, glukokortikoidilla indusoitavaa, MMTV-. LTR promoottoria sisältävällä plasmidilla. Solut kasvatettiin RPMI-1640 2 F / soluviljelyalustalla (Gibco), johon oli lisätty 5% dekstraanihiili-käsiteltyä : ·' fetaalivasikan seerumia (DCC_FCS), glutamiinia, penisilliiniä (100 lU/ml) ja : streptomysiiniä (100 pg/ml). Näissä soluissa c-Ha-ras-geenin ilmentyminen •S · voidaan indusoida maksimaalisesti lisäämällä 1μΜ deksametasonia (Sigma) soluvlljelyalustaan. DCC-käsittely käytettiin ylimääräisten steroidien eliminointia •.aio·’: varten seerumista, jotka voisivat vaikuttaa transfektoidun geenin ilmentymistä, .·;·. Suspensioviljelyä varten käytettiin bakteriologisia 1 %:lla agarilla peitettyjä RPMI-1640 maljoja (Sigma) estääkseen mahdollisen solu-substraatti-adheesion. Solut ’·* * viljeltiin tiheyteen 1 x 105/ml. Solumäärä määritettiin trypsinoinnin jälkeen käyttäen ’·...’ Coulter laskijaa (Coulter Electronics, Hialeah, FL). PM-4 on syndekaanin cDNA-3j5:*: koetin, jonka on alunperin kloonannut Saunders et ai. (1989) J. Cell Biol. 108: ....: 1547-1556. Tämä koetin tunnistaa kahta 2.6 kb ja 3.4 kb fragmenttia hiiren normaalista maitorauhassoluista.

is 104347 RNA-preparaatteja varten soluviljelymaljat pestiin kaksi kertaa jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja solubilisoitiin tämän jälkeen 4M GIT-puskurissa (4M guanidiini-isotiosyanaattia 5mM natriumsitraatissa (pH 7.0), 0.1 M β-merkaptoetanolissa ja 0.5% N-laurylisarkosiinissa). Totaali-RNA-uutto 5 suoritettiin CsCI gradienttisentrifugaatiossa kuten Chirgwin et ai. (1979) Biochem.

18: 5294-5299 ovat kuvanneet. Northern-blot analyysia varten näytteet erotettiin 1% formaldehydi-agaroosigeelielektroforeesin avulla. Tämä geeli blotattiin Gene Screen hybridisaatiomembraanille. Filtterit esihybridisoitiin 1M NaCI, 1% natriumdodesyylisulfaattia, 10% dekstraanisulfaattia, 5 x Denhardtin liuosta, 100 1 0 μς/πιΙ lohen sperman DNAta, 50% formamidia sisältävässä liuoksessa 42°C:ssa. Hybridisaatiossa lisättiin multiprime-leimattua PM-4 tai BS-9 koettimia. Käytettiin 32P-isotooppia (Amersham). Rltterit pestiin 65°C:ssa PM-4:ää käytettäessä ja 60°C:ssa BS-9:ää käytettäessä 1% natriumdodesyylisulfaattia sisältävässä 2 x SSC.ssä ja autoradiografia suoritettiin Kodak X-Omat tai Fuiji X-ray filmillä.

1 5 Solupinnan syndekaanin ilmentymisen kvantitointia varten viljelymaljoilla v olevat solut pestiin 3 kertaa jääkylmällä PBS:llä. Maljat inkuboitiin 0.5 mM K- EDTA:ta sisältävässä PBS:ssä 10 min +4°C:ssa. Trypsiiniä (Sigma, T-8128) lisättiin loppukonsentraatiossa 20 μς/ιηΙ ja inkuboitiin 10 min +4°C:ssa. Trypsiini irroittaa syndekaanin ektodomeenin alustaan (Rapraeger & Bernfield (1985) J.

2 0 Biol. Chem. 260: 4103-4109). Tämän jälkeen solut irroitettiin kumipoliisilla tai pesäkkeet suspendoitiin ja trypsiini-inhibiittoria (Sigma, T-9128) lisättiin lopulliseen konsentraatioon 100 μς/ηιΙ. Solut sentrifugoitiin (5 min, 100xg), supernatantti , kerättiin putkeen talteen ja pesäkkeiden annettiin sedimentoitua 5 min, jonka ' jälkeen supernatantti poistettiin kuten petrimaljaviljelyssä. Pesäkkeet pestiin 3 2 5' ' kertaa jääkylmällä PBS:llä ja käsiteltiin trypsiinillä.

• ·

Sopiva, 2x105 soluja vastaava, määrä supernatanttia blotattiin kationiselle ’-.‘.nailonmembraanille (Zeta Probe, Bio-Rad). Membraani preinkuboitiin inkubaatiopuskurissa (10% vasikan fetaaliseerumia, 1mM natriumatsidia, PBS) ’·* tunnin ajan huoneenlämmössä. Inkubaatiopuskuriin lisättiin radioaktiivisesti 3 0 < (kloramiini-T-menetelmällä) leimattua MnAb 281-2 (Jalkanen et ai. (1987) J. Cell : VBiol. 105: 3087-3096), joka tunnistaa syndekaanin ektodomeenin, lopullisessa :konsentraatiossa 10.000 cpm/ml ja inkuboitiin yli yön +4°C:ssa. Filtteri pestiin ;-:\PBS:llä 10 min huoneenlämpötilassa. Pesu toistettiin 10 kertaa, jonka jälkeen .’••.filtteri autoradiografoitiin röntgenfilmille. Autograaffi analysoitiin GeIScan XL • « 3 5*·' ultroscan densitometrilla (LKB) ja GeIScan SL 2400 ohjelmalla (LKB), ja istardisoitiin käyttäen eristettyä ektodomainia (Jalkanen et ai. (1987) J. Cell Biol.

*:’*Μ05: 3087-3096).

16 104347

Yhteenvetona esillä oleva keksintö on hyödyllinen tunnistettaessa mahdollisesti haitallisia transformaatioita määrittämällä syndekaanin ilmentymistä ja määrää, esimerkiksi kudostasolla ja erilaisissa kehonesteissä. Menetelmää voidaan suorittaa biokemiallisesti, immunohistokemiallisesti ja 5 molekyylibiologisesti, käyttäen esimerkiksi syndekaanispesifisiä ligandeja, vasta-aineita (polyklonaalisia tai monoklonaalisia) ja cDNAta. Menetelmän eräs kohde on epiteelisolujen malignit muutokset, jossa esiintyy voimakas syndekaanin ilmentymisen väheneminen malignin transformaatioprosessin aikana.

Syndekaanin ilmentymisen analysointi hyperplasiassa on myös keksinnön 1 o kohteena, koska tällä on arvoa arvioitaessa tämän premalignin vaiheen vakavuutta. Syndekaanin ilmentymisen analysointi on erityisen hyödyllistä erilaisten dysplasian premalignien proliferatiivisten vaiheiden luokituksessa.

• » « • · • · · I · · « « »

Claims (18)

104347

1. Menetelmä malignien tai premalignien muutosten detektoimiseksi ihmisen soluista, tunnettu siitä, että (a) määritetään ensimmäisessä ihmisestä peräisin olevassa neste- tai 5 kudosnäytteessä esiintyvien solujen syndekaanin määrä, jolloin kyseinen ensimmäinen näyte on otettu nesteestä tai kudoksesta, jonka epäillään sisältävän maligneja soluja, premaligneja soluja, hyperplastisia soluja tai soluja joissa on morfologisia muutoksia niiden normaalitilaan nähden, (b) vertaillaan kohdassa (a) määritetty syndekaanimäärä toisesta biologisesta 10 näytteestä saatuihin syndekaanitasoihin, jolloin kyseinen toinen biologinen näyte on samaa neste- tai kudostyyppiä kuin yllä mainittu ensimmäinen biologinen materiaali, mutta jolloin kyseinen toinen näyte on otettu solunäytteestä, jonka solut ovat normaaleja tai vähemmän transformoituja kuin kohdassa (a) käytetyt solut, ja (c) määritetään kyseisten malignien tai permalignien muutosten läsnäolo 15 ensimmäisen näytteen toiseen biologiseen näytteeseen nähden pienemmän syndekaanin määrän perusteella.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siltä, että kyseinen muutos on maligni transformaatio. 20

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen muutos on premaligni transformaatio.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 25 kyseinen muutos on hyperplasia.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen muutos on morfologinen muutos. *: 30

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisen näytteen syndekaanimäärä määritetään syndekaanin proteiinitasoa määrittämällä.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 35 syndekaanin proteiinitaso määritetään käyttäen syndekaaniproteiinia tunnistavaa vasta-ainetta. 104347

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisen näytteen syndekaanimäärä määritetään syndekaanin lähetti-RNA-tasoa määrittämällä. 5

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisen näytteen syndekaanimäärä määritetään käyttäen testiä, jolla määritetään kyseisen näytteen syndekaanin ektodomeenin määrää.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisen näytteen syndekaanin ektodomeeni irrotetaan solun pinnalta ennen määrittämistä.

11. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 15 kyseisessä menetelmässä käytetään ihmisen syndekaanille spesifistä vasta- ainetta ensimmäisen näytteen syndekaanin määrittämiseksi.

12. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseisessä menetelmässä käytetään ihmisen syndekaanin anti-sense lähetti-

20 RNAta ensimmäisen näytteen syndekaanin lähetti-RNA-määrän määrittämiseksi.

13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseisessä menetelmässä käytetään syndekaanin anti-sense oligonukleotidia ensimmäisen näytteen syndekaanin lähetti-RNA-määrän määrittämiseksi. 25

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologinen materiaali on kehoneste.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 30 kehoneste on plasmaa.

16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kehoneste on seerumia.

17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kehoneste on virtsaa.

18. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kehoneste on selkäydinnestettä. 104347