JP3103377B2 - 細胞の悪性形質転換の指摘のための組織および体液のような生物学的材料におけるシンデカン量の検出 - Google Patents
細胞の悪性形質転換の指摘のための組織および体液のような生物学的材料におけるシンデカン量の検出Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、概して癌生物学のような生物学の分野に関
する。さらに詳しくは、シンデカン（syndecan）に特異
的なリキッド、抗体およびcDNAプローブを検出に用いう
る手順を用いて、１つは組織中のシンデカン減少の検出
によって、いま１つはヒト体液中でのシンデカンの出現
の検出によって前悪性の、または悪性の組織を検出する
ための方法に関する。
する。さらに詳しくは、シンデカン（syndecan）に特異
的なリキッド、抗体およびcDNAプローブを検出に用いう
る手順を用いて、１つは組織中のシンデカン減少の検出
によって、いま１つはヒト体液中でのシンデカンの出現
の検出によって前悪性の、または悪性の組織を検出する
ための方法に関する。
細胞表面と細胞外マトリックス（ECM）とのあいだの
特異的な相互作用において機能を果たす細胞表面分子
は、マトリックス受容体と呼ばれる。これらの受容体に
よるマトリックスの認識は、細胞の形態、増殖および分
化の調節において重要な役割を果たし、それゆえに器官
の正常な発生や組織構造の維持においては重大な現象で
ある。既知のマトリックス受容体には、たとえば共通の
構造的かつ機能的特徴を有し、インデグリンと呼ばれ
（ハインス、アール（Hynes,R）、（1987）セル（Cel
l）48巻、549〜554頁）ラミニンのB1−鎖に結合する67
キロダルトンの糖タンパク質（グラフ（Graf）ら、（19
87）セル、48巻、65号、989〜996頁）である膜貫通糖タ
ンパク質受容体およびグリコサミノグルカン組成（たと
えばヘパラン硫酸）に依存して種々のマトリックス分子
と相互作用しうる（ヤルカネン、エム（Jalkanen,
M.）、（1987）メディカル バイオロジー（Med.Bio
l.）65巻、41〜47頁）細胞表面プロテオグリカン（PG）
のファミリーが含まれる。細胞の接着、伸展、増殖およ
び分化は、すべて細胞表面とその周囲の細胞外マトリッ
クス（ECM）との緊密な接触に基づく。リガンドと受容
体の相互作用を選択的に利用することにより、器官の発
生に必要な特異的な細胞−マトリックス間相互作用の多
様性が生体内で引きおこされるのかもしれない（エクブ
ロム（Ekblom）ら、（1986）アニュアル レビュー オ
ブ セル バイオロジー（Ann.Rev.Cell Biol.）２
巻、27〜47頁）。形質転換は、細胞のECMに対する応答
を変化させることが知られており（リオッタ、エル（Li
otta,L.）、（1986）キャンサー リサーチ（Cancer R
es.）46巻、１〜７頁）、悪性細胞によりマトリックス
受容体の発現において変化が生じうることが示唆されて
いる（プランテファバー（Plantefaber）およびハイン
ス（1989）セル、56巻、281〜290頁；チュレシュ（Cher
esh）ら、（1989）セル、57巻、59〜69頁）。これらの
変化は大部分未知であるが、種々のタイプの細胞の悪性
のふるまいの結果において基礎的な役割を果たしている
のかもしれない。
特異的な相互作用において機能を果たす細胞表面分子
は、マトリックス受容体と呼ばれる。これらの受容体に
よるマトリックスの認識は、細胞の形態、増殖および分
化の調節において重要な役割を果たし、それゆえに器官
の正常な発生や組織構造の維持においては重大な現象で
ある。既知のマトリックス受容体には、たとえば共通の
構造的かつ機能的特徴を有し、インデグリンと呼ばれ
（ハインス、アール（Hynes,R）、（1987）セル（Cel
l）48巻、549〜554頁）ラミニンのB1−鎖に結合する67
キロダルトンの糖タンパク質（グラフ（Graf）ら、（19
87）セル、48巻、65号、989〜996頁）である膜貫通糖タ
ンパク質受容体およびグリコサミノグルカン組成（たと
えばヘパラン硫酸）に依存して種々のマトリックス分子
と相互作用しうる（ヤルカネン、エム（Jalkanen,
M.）、（1987）メディカル バイオロジー（Med.Bio
l.）65巻、41〜47頁）細胞表面プロテオグリカン（PG）
のファミリーが含まれる。細胞の接着、伸展、増殖およ
び分化は、すべて細胞表面とその周囲の細胞外マトリッ
クス（ECM）との緊密な接触に基づく。リガンドと受容
体の相互作用を選択的に利用することにより、器官の発
生に必要な特異的な細胞−マトリックス間相互作用の多
様性が生体内で引きおこされるのかもしれない（エクブ
ロム（Ekblom）ら、（1986）アニュアル レビュー オ
ブ セル バイオロジー（Ann.Rev.Cell Biol.）２
巻、27〜47頁）。形質転換は、細胞のECMに対する応答
を変化させることが知られており（リオッタ、エル（Li
otta,L.）、（1986）キャンサー リサーチ（Cancer R
es.）46巻、１〜７頁）、悪性細胞によりマトリックス
受容体の発現において変化が生じうることが示唆されて
いる（プランテファバー（Plantefaber）およびハイン
ス（1989）セル、56巻、281〜290頁；チュレシュ（Cher
esh）ら、（1989）セル、57巻、59〜69頁）。これらの
変化は大部分未知であるが、種々のタイプの細胞の悪性
のふるまいの結果において基礎的な役割を果たしている
のかもしれない。
マウス乳房上皮細胞（mouse mammary epithelial
cells）の細胞表面プロテオグルカンは親油性膜ドメイ
ン（ラプラージャー（Rapraeger）およびバーンフィー
ルド（Bernfield）（1983）ザ ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）258巻、3
632〜3636頁；（1985）同上260巻、4103〜4109頁）とヘ
パラン硫酸およびコンドロイチン硫酸鎖の両者を有する
マトリックス結合エクトドメイン（ectodomein）（ラプ
ラージャーら、（1985）J.Biol.Chem.260巻、11046〜11
052頁）とからなる。最近のマウスおよびヒトのシンデ
カンのcDNA−クローニングにより、コアタンパク質上の
これらの機能性ドメインが確認され、このPGがシンデカ
ンと名付けられた（サウンダース（Saunders）ら、（19
89）ジャーナル オブ セル バイオロジー（J.Cell
Biol.）108巻、1547〜1556頁；マリ（Mali）ら、（199
0）J.Biol.Chem.265巻、6884〜6889頁）。シンデカンの
エクトドメインはmAb281−２により認識され（ヤルカネ
ンら（1985）J.Cell Biol.101巻、976〜984頁；同上（1
987）105巻3087〜3096頁）、Ｉ、IIIおよびＶ型コラー
ゲン繊維と高い親和性をもって結合し（コダ（Koda）
ら、（1985）J.Biol.Chem.260巻、8157〜8162頁）、フ
ィブロネクチンのＣ末端ヘパリン結合ドメイン（サウン
ダースおよびバーンフィールド（1988）J.Cell Biol.10
6巻、423〜430頁）、スロンボスポンジン（サン（Sun）
ら（1989）J.Biol.Chem.264巻、2885〜2889頁）および
テネイシン（サルミバータ（Salmivirta）ら（1991）J.
Biol.Chem.266巻、印刷中）と、より低い親和性をもっ
て結合する。リガンドの結合が、アクチンに富んだ細胞
骨格への膜ドメインの会合を促進する（ラプラージャー
ら（1986）J.Cell Biol.103巻、2683〜2696頁）。しか
しながら、膜ドメインからエクトドメインを分離させる
コアタンパク質のタンパク溶解性切断によって、上皮細
胞は、細胞表面からエクトドメインを遊離することもで
きる（ヤルカネンら、（1987）J.Cell Biol.105巻、308
7〜3096頁、ワルツハンドラー（Weitzhandler）ら（198
8）J.Biol.Chem.263巻、6949〜6952頁）。それゆえ、シ
ンデカンは上皮細胞骨格をマトリックスへと連結するこ
ともできるし、マトリックスとの上皮細胞を会合を離す
こともできる。これらの会合によって、シンデカンはマ
トリックス体（organization）を細胞体へと仲介し、細
胞のふるまいに影響を与えることができる。シンデカン
はおもにコラーゲン繊維やフィブロネクチンのような間
質性成分と相互作用するので、上皮組織と間葉組織との
間のコミュニケーターとして機能するのかもしれない。
このタイプのコミュニケーションが、正常な上皮の分化
や器官の形成のために重要である。
cells）の細胞表面プロテオグルカンは親油性膜ドメイ
ン（ラプラージャー（Rapraeger）およびバーンフィー
ルド（Bernfield）（1983）ザ ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）258巻、3
632〜3636頁；（1985）同上260巻、4103〜4109頁）とヘ
パラン硫酸およびコンドロイチン硫酸鎖の両者を有する
マトリックス結合エクトドメイン（ectodomein）（ラプ
ラージャーら、（1985）J.Biol.Chem.260巻、11046〜11
052頁）とからなる。最近のマウスおよびヒトのシンデ
カンのcDNA−クローニングにより、コアタンパク質上の
これらの機能性ドメインが確認され、このPGがシンデカ
ンと名付けられた（サウンダース（Saunders）ら、（19
89）ジャーナル オブ セル バイオロジー（J.Cell
Biol.）108巻、1547〜1556頁；マリ（Mali）ら、（199
0）J.Biol.Chem.265巻、6884〜6889頁）。シンデカンの
エクトドメインはmAb281−２により認識され（ヤルカネ
ンら（1985）J.Cell Biol.101巻、976〜984頁；同上（1
987）105巻3087〜3096頁）、Ｉ、IIIおよびＶ型コラー
ゲン繊維と高い親和性をもって結合し（コダ（Koda）
ら、（1985）J.Biol.Chem.260巻、8157〜8162頁）、フ
ィブロネクチンのＣ末端ヘパリン結合ドメイン（サウン
ダースおよびバーンフィールド（1988）J.Cell Biol.10
6巻、423〜430頁）、スロンボスポンジン（サン（Sun）
ら（1989）J.Biol.Chem.264巻、2885〜2889頁）および
テネイシン（サルミバータ（Salmivirta）ら（1991）J.
Biol.Chem.266巻、印刷中）と、より低い親和性をもっ
て結合する。リガンドの結合が、アクチンに富んだ細胞
骨格への膜ドメインの会合を促進する（ラプラージャー
ら（1986）J.Cell Biol.103巻、2683〜2696頁）。しか
しながら、膜ドメインからエクトドメインを分離させる
コアタンパク質のタンパク溶解性切断によって、上皮細
胞は、細胞表面からエクトドメインを遊離することもで
きる（ヤルカネンら、（1987）J.Cell Biol.105巻、308
7〜3096頁、ワルツハンドラー（Weitzhandler）ら（198
8）J.Biol.Chem.263巻、6949〜6952頁）。それゆえ、シ
ンデカンは上皮細胞骨格をマトリックスへと連結するこ
ともできるし、マトリックスとの上皮細胞を会合を離す
こともできる。これらの会合によって、シンデカンはマ
トリックス体（organization）を細胞体へと仲介し、細
胞のふるまいに影響を与えることができる。シンデカン
はおもにコラーゲン繊維やフィブロネクチンのような間
質性成分と相互作用するので、上皮組織と間葉組織との
間のコミュニケーターとして機能するのかもしれない。
このタイプのコミュニケーションが、正常な上皮の分化
や器官の形成のために重要である。
発生および器官形成に際するシンデカンの発現は、組
織学的というよりむしろ形態形成的な境界に続き（ゼス
レフ（Thesleff）ら、（1988）ディベロップメンタル
バイオロジー（Dev.Biol.）189巻、565〜572頁）、この
特徴もまた発生に際し、シンデカンがマトリックス受容
体として活発な役割を果たすことを支持するものであ
る。シンデカンはおもに種々の上皮細胞に局在している
（ハヤシ（Hayashi）ら、（1987）ジャーナル オブ
ヒストケミストリー アンド サイトケミストリー（J.
Histochem.Cytochem.）35巻、1079〜1088頁）が、形質
細胞表面上にも見出される（サンダーソン（Sanderso
n）およびバーンフィールド（1988）プロシーディング
オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス
オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）85巻、9562〜9566頁）。シ
ンデカンはまた、器官形成中に、上皮の萌芽につづく間
葉の凝縮にも集中する（ゼスレフら（1988）Dev.Biol.1
89巻、565〜572頁）。間葉における、シンデカンの発現
が上皮の接触によって調節されていることが、歯におい
ても（バイニオ（Vainio）ら（1988））後腎においても
（バイニオら（1989））示されており、両組織において
この発現が、空間的にも時間的にもこれらの器官の形態
形成と関連している可能性がある。
織学的というよりむしろ形態形成的な境界に続き（ゼス
レフ（Thesleff）ら、（1988）ディベロップメンタル
バイオロジー（Dev.Biol.）189巻、565〜572頁）、この
特徴もまた発生に際し、シンデカンがマトリックス受容
体として活発な役割を果たすことを支持するものであ
る。シンデカンはおもに種々の上皮細胞に局在している
（ハヤシ（Hayashi）ら、（1987）ジャーナル オブ
ヒストケミストリー アンド サイトケミストリー（J.
Histochem.Cytochem.）35巻、1079〜1088頁）が、形質
細胞表面上にも見出される（サンダーソン（Sanderso
n）およびバーンフィールド（1988）プロシーディング
オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス
オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）85巻、9562〜9566頁）。シ
ンデカンはまた、器官形成中に、上皮の萌芽につづく間
葉の凝縮にも集中する（ゼスレフら（1988）Dev.Biol.1
89巻、565〜572頁）。間葉における、シンデカンの発現
が上皮の接触によって調節されていることが、歯におい
ても（バイニオ（Vainio）ら（1988））後腎においても
（バイニオら（1989））示されており、両組織において
この発現が、空間的にも時間的にもこれらの器官の形態
形成と関連している可能性がある。
発明の概要 本発明の目的は、組織からのシンデカン減少の検出に
より、前悪性、もしくは悪性の組織を検出する方法を提
供することである。
より、前悪性、もしくは悪性の組織を検出する方法を提
供することである。
本発明のもう１つの目的は、体液におけるシンデカン
の出現を検出することにより、前悪性、もしくは悪性の
組織を検出する方法を提供することである。
の出現を検出することにより、前悪性、もしくは悪性の
組織を検出する方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ヒトにおける悪性もしくは
前悪性の組織の検出にとくに適用しうる方法を提供する
ことである。
前悪性の組織の検出にとくに適用しうる方法を提供する
ことである。
本発明のさらに別の目的は、細胞の悪性もしくは前悪
性の形質転換を検出するために、組織または体液中のシ
ンデカンの発現またはシンデカン量を検出する生化学
的、免疫組織学的または分子生物学的方法を提供するこ
とである。
性の形質転換を検出するために、組織または体液中のシ
ンデカンの発現またはシンデカン量を検出する生化学
的、免疫組織学的または分子生物学的方法を提供するこ
とである。
本発明のさらなる目的は、細胞の過形成変化を検出す
る方法を提供することである。
る方法を提供することである。
本発明の別の目的は、細胞の特定の過形成変化を検出
する方法を提供することである。
する方法を提供することである。
本発明のさらにもう１つの目的は、細胞の特定の形態
学的変化を検出する方法を提供することである。
学的変化を検出する方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、指標となる値を作り出すた
めに組織または体液中のシンデカンを定量する方法を提
供することである。
めに組織または体液中のシンデカンを定量する方法を提
供することである。
要約すると、本発明は、より広い見地では、生物から
の生物学的材料のサンプルからシンデカン量の指標を測
定し、好ましくは同じタイプの材料である、対照となる
生物学的材料からの対照のシンデカン量の指標と、測定
したシンデカン量の指標とを比較することからなる、生
物の細胞の潜在的に有害な形質転換を検出する方法を包
含する。
の生物学的材料のサンプルからシンデカン量の指標を測
定し、好ましくは同じタイプの材料である、対照となる
生物学的材料からの対照のシンデカン量の指標と、測定
したシンデカン量の指標とを比較することからなる、生
物の細胞の潜在的に有害な形質転換を検出する方法を包
含する。
本方法は、生化学的、免疫組織学的または分子生物学
的なタイプの方法を含んだ種々の手法で行なわれてよ
い。本方法は多岐にわたる生物で、たとえば悪性もしく
は前悪性状態のような有害な形質転換を検出するのに適
用できるが、細胞、とくにヒトの細胞における有害な形
質転換を検出するためにとくに適用しうる。検出されう
る形質転換は、過形成変化および形態学的変化を含んだ
前悪性および悪性の形質転換を含む。
的なタイプの方法を含んだ種々の手法で行なわれてよ
い。本方法は多岐にわたる生物で、たとえば悪性もしく
は前悪性状態のような有害な形質転換を検出するのに適
用できるが、細胞、とくにヒトの細胞における有害な形
質転換を検出するためにとくに適用しうる。検出されう
る形質転換は、過形成変化および形態学的変化を含んだ
前悪性および悪性の形質転換を含む。
シンデカンの存在もしくは減少の検出は、たとえば細
胞、組織および体液のような、とくにヒトの生物学的材
料としては血清、血漿、尿、脊髄液またはほかの組織抽
出物を含む、生物の種々の生物学的材料について行なわ
れてよい。生物学的材料中のシンデカン量の検出は、シ
ンデカンに特異的なリガンドもしくは生化学的決定因
子、シンデカンに特異的な抗体およびシンデカンのアン
チセンスmRNAもしくはcDNAもしくはオリゴヌクレオチド
を含む種々の手段を用いて行なうことができる。
胞、組織および体液のような、とくにヒトの生物学的材
料としては血清、血漿、尿、脊髄液またはほかの組織抽
出物を含む、生物の種々の生物学的材料について行なわ
れてよい。生物学的材料中のシンデカン量の検出は、シ
ンデカンに特異的なリガンドもしくは生化学的決定因
子、シンデカンに特異的な抗体およびシンデカンのアン
チセンスmRNAもしくはcDNAもしくはオリゴヌクレオチド
を含む種々の手段を用いて行なうことができる。
本発明のさらなる特徴、目的および利点は、下記の本
発明の説明を添付の図面とともに詳しく考慮すれば、よ
り充分に明らかになるであろう。
発明の説明を添付の図面とともに詳しく考慮すれば、よ
り充分に明らかになるであろう。
図面の簡単な説明 図面において、 図1Aは、テストステロンにさらすことにより形質転換
させたマウス乳房上皮細胞におけるシンデカンの減少を
示す、時間対細胞表面のシンデカン量を表わすグラフで
ある。
させたマウス乳房上皮細胞におけるシンデカンの減少を
示す、時間対細胞表面のシンデカン量を表わすグラフで
ある。
図1Bは、テストステロンにさらすことにより形質転換
させたマウス乳房上皮細胞におけるシンデカンの減少を
示す、時間対シンデカンのmRNA発現を表わすグラフであ
る。
させたマウス乳房上皮細胞におけるシンデカンの減少を
示す、時間対シンデカンのmRNA発現を表わすグラフであ
る。
図2Aから図2Dは、マウスの生物学的皮膚材料を紫外線
にさらしたのちのシンデカン発現の経過を示す、試料の
切片の写真である。
にさらしたのちのシンデカン発現の経過を示す、試料の
切片の写真である。
図3Aは、単層で培養したマウス乳房上皮細胞を懸濁し
たものの写真を示す。そのうち１層はras−オンコジン
により形質転換したものである。
たものの写真を示す。そのうち１層はras−オンコジン
により形質転換したものである。
図3Bは、図3Aに示した単層の細胞表面のシンデカン量
を示すグラフである。
を示すグラフである。
好適な実施態様の詳細な説明 本発明は、部分的には、シンデカンの検出が、上皮細
胞のような生物学的材料における悪性度の評価にとって
価値のある診断の基準であるという発見に基づく。実施
例では、形質転換を誘導するために３種の異なる種類の
実験方法（ホルモン性の誘導、紫外線刺激およびオンコ
ジン誘導）を用いるが、いずれのばあいにおいても、シ
ンデカンの減少が明らかであることが示された。シンデ
カンの減少を検出することは、腫瘍形成のような、形質
転換に至る他の機構においても価値を有するので、それ
ゆえ本発明は前記のもののにみ限定されない。シンデカ
ンの検出は、たとえば組織（たとえば皮膚、腎臓、脳、
肺、膀胱）の種々の増殖段階で、あとになってより悪性
の状態へと変化するかもしれないものに関する価値ある
情報を提供しうる。これらのいわゆる前悪性段階は、し
ばしば異形成として表われるが、種々のレベルのシンデ
カンを発現し、これは適切な治療処理を提供するために
疾病の重篤さを評価するのに必要な情報である。シンデ
カン検出の重要な領域は、循環している形質細胞にもあ
る。それゆえに、たとえば、FACS−分析（螢光活性化セ
ルソーター）のような、シンデカン特異抗体を用いる本
法による分析は、リンパ腫、骨髄腫、白血病患者の病態
生理学的状態またはほかの造血細胞の増殖段階に関する
評価ある情報を提供する。
胞のような生物学的材料における悪性度の評価にとって
価値のある診断の基準であるという発見に基づく。実施
例では、形質転換を誘導するために３種の異なる種類の
実験方法（ホルモン性の誘導、紫外線刺激およびオンコ
ジン誘導）を用いるが、いずれのばあいにおいても、シ
ンデカンの減少が明らかであることが示された。シンデ
カンの減少を検出することは、腫瘍形成のような、形質
転換に至る他の機構においても価値を有するので、それ
ゆえ本発明は前記のもののにみ限定されない。シンデカ
ンの検出は、たとえば組織（たとえば皮膚、腎臓、脳、
肺、膀胱）の種々の増殖段階で、あとになってより悪性
の状態へと変化するかもしれないものに関する価値ある
情報を提供しうる。これらのいわゆる前悪性段階は、し
ばしば異形成として表われるが、種々のレベルのシンデ
カンを発現し、これは適切な治療処理を提供するために
疾病の重篤さを評価するのに必要な情報である。シンデ
カン検出の重要な領域は、循環している形質細胞にもあ
る。それゆえに、たとえば、FACS−分析（螢光活性化セ
ルソーター）のような、シンデカン特異抗体を用いる本
法による分析は、リンパ腫、骨髄腫、白血病患者の病態
生理学的状態またはほかの造血細胞の増殖段階に関する
評価ある情報を提供する。
シンデカンはまた、細胞表面から遊離することも知ら
れており（ヤルカネンら、（1987）J.Cell Biol.105
巻、3087〜3096頁）、ある疾病においては細胞表面から
シンデカンの減少の結果として体液中にそれが出現する
かもしれない。それゆえに、本発明にしたがって、研究
された組織において組織破壊や正常な細胞形態の消失が
どのくらい起きているかを決定するために血清、血漿、
尿、脊髄液またはほかの組織の抽出物中のシンデカン量
を測定することが、診断的な評価を有する。
れており（ヤルカネンら、（1987）J.Cell Biol.105
巻、3087〜3096頁）、ある疾病においては細胞表面から
シンデカンの減少の結果として体液中にそれが出現する
かもしれない。それゆえに、本発明にしたがって、研究
された組織において組織破壊や正常な細胞形態の消失が
どのくらい起きているかを決定するために血清、血漿、
尿、脊髄液またはほかの組織の抽出物中のシンデカン量
を測定することが、診断的な評価を有する。
前記したように、シンデカンは、共有結合したグリコ
サミノグルカン（GAG）鎖と膜に埋もれたコアタンパク
質とからなる細胞表面プロテオグルカンである（サウン
ダースら（1989）J.Cell Biol.108巻、1547〜1556
頁）。シンデカンのGAG鎖は、ヘペラン硫酸とコンドロ
イチン硫酸のグループに属することが知られているが
（ラプラージャーら（1985）J.Biol.Chem.260巻、11046
〜11052頁）、それらはシンデカンに限らない。シンデ
カンのコアタンパク質は、独特のものであり、それによ
りこの分子は、いくつかの類似の細胞表面プロテオグル
カンのメンバーとして、定義される（マリら（1990）J.
Biol.Chem.265巻、6884−6889頁）。マウスのシンデカ
ンが最初に単離され、今なお一般にシンデカンのコアタ
ンパク質に対するモノクローナル抗体（MnAb281−２）
を用いて、シンデカンの検出がなされている（ヤルカネ
ンら（1985）J.Cell Biol.101巻、976〜984頁）。
サミノグルカン（GAG）鎖と膜に埋もれたコアタンパク
質とからなる細胞表面プロテオグルカンである（サウン
ダースら（1989）J.Cell Biol.108巻、1547〜1556
頁）。シンデカンのGAG鎖は、ヘペラン硫酸とコンドロ
イチン硫酸のグループに属することが知られているが
（ラプラージャーら（1985）J.Biol.Chem.260巻、11046
〜11052頁）、それらはシンデカンに限らない。シンデ
カンのコアタンパク質は、独特のものであり、それによ
りこの分子は、いくつかの類似の細胞表面プロテオグル
カンのメンバーとして、定義される（マリら（1990）J.
Biol.Chem.265巻、6884−6889頁）。マウスのシンデカ
ンが最初に単離され、今なお一般にシンデカンのコアタ
ンパク質に対するモノクローナル抗体（MnAb281−２）
を用いて、シンデカンの検出がなされている（ヤルカネ
ンら（1985）J.Cell Biol.101巻、976〜984頁）。
本発明をさらに説明するために、それぞれすべてが結
果的に上皮細胞の悪性形質転換をおこすような、３つの
相異なる独立した生物学的モデルにおける悪性の表現型
誘導に関連して、シンデカンの発現を分析した。これら
のモデルのすべてにおいて、シンデカン発現の減少が、
悪性形質転換と同調して観察された。これらの結果は、
本発明を表わすための下記のモデルにおいて簡単に示さ
れている。
果的に上皮細胞の悪性形質転換をおこすような、３つの
相異なる独立した生物学的モデルにおける悪性の表現型
誘導に関連して、シンデカンの発現を分析した。これら
のモデルのすべてにおいて、シンデカン発現の減少が、
悪性形質転換と同調して観察された。これらの結果は、
本発明を表わすための下記のモデルにおいて簡単に示さ
れている。
第１のモデルでは、シオノギ（Shionogi）115（S11
5）マウス乳癌細胞株を用いた。このような細胞は、増
殖率の増大（キング（King）ら（1976）ジャーナル オ
ブ ステロイド バイオケミストリー（J.Steroid Bioc
hem.）、７巻、869〜873頁）、および上皮から繊維芽へ
の形態変化（ヤテス（Yates）およびキング（1981）Can
cer Res.41巻、258〜262頁）というアンドロゲンに対す
る反応を呈するので、形質転換した表現型を研究するた
めのすぐれたモデルを提供する。アンドロゲン存在下で
は、細胞は基層にゆるく接着しており、浮遊状態でマト
リックスへの足場（anchorage）なしでも増殖する能力
を獲得しているが、一方アンドロゲンのないばあいで
は、細胞はマトリックスに強固に接着し、浮遊状態では
まったく増殖しない（ヤテスおよびキング（1981）Canc
er Res.41巻、258〜262頁）。形質学的変化および足場
非依存性の原理は大部分未知であるが、細胞骨格の形成
における変化（コークマン（Couchman）ら（1981）Canc
er Res.41巻、263〜269頁）と傍分泌（paracrine）機構
における変化（ダーブル（Darbre）およびキング（198
8）ブレスト キャンサー：セルラー アンド モレキ
ュラー バイオロジー（Breast cancer:Cellular and M
olecular Biology）編集エム イー リップマン（M.E.
Lippman）およびアール ビー ディックソン（R.B.Dic
kson）、アカデミック パブリッシャーズ（Academic P
ublishers）、307〜341頁）を含むいくつもの機構が、
提案されている。
5）マウス乳癌細胞株を用いた。このような細胞は、増
殖率の増大（キング（King）ら（1976）ジャーナル オ
ブ ステロイド バイオケミストリー（J.Steroid Bioc
hem.）、７巻、869〜873頁）、および上皮から繊維芽へ
の形態変化（ヤテス（Yates）およびキング（1981）Can
cer Res.41巻、258〜262頁）というアンドロゲンに対す
る反応を呈するので、形質転換した表現型を研究するた
めのすぐれたモデルを提供する。アンドロゲン存在下で
は、細胞は基層にゆるく接着しており、浮遊状態でマト
リックスへの足場（anchorage）なしでも増殖する能力
を獲得しているが、一方アンドロゲンのないばあいで
は、細胞はマトリックスに強固に接着し、浮遊状態では
まったく増殖しない（ヤテスおよびキング（1981）Canc
er Res.41巻、258〜262頁）。形質学的変化および足場
非依存性の原理は大部分未知であるが、細胞骨格の形成
における変化（コークマン（Couchman）ら（1981）Canc
er Res.41巻、263〜269頁）と傍分泌（paracrine）機構
における変化（ダーブル（Darbre）およびキング（198
8）ブレスト キャンサー：セルラー アンド モレキ
ュラー バイオロジー（Breast cancer:Cellular and M
olecular Biology）編集エム イー リップマン（M.E.
Lippman）およびアール ビー ディックソン（R.B.Dic
kson）、アカデミック パブリッシャーズ（Academic P
ublishers）、307〜341頁）を含むいくつもの機構が、
提案されている。
テストステロン処理をしたS115細胞は、フィブロネク
チン（FN）に対する強いRGDS−依存性の結合を示した
が、FNのヘパリン結合ドメインには結合しないので、こ
のことからインテグリン様分子を発現していることが示
された。一方、テストステロン非依存下にて生長させた
C115細胞は、上皮の形態とFNのヘパリン結合ドメインへ
の結合能を示し、これらの結果からホルモン処理をした
S115細胞でシンデカンの発現が変化することが示唆され
た。ホルモン処理をしたS115細胞ではラジオ−イムノア
ッセイおよびウェスタンブロットにより定量したシンデ
カンのマトリックス結合エクトドメインの量も、シンデ
カンのmRNA（2.6キロベース）の量も、いずれも低下し
ていた。抗アンドロゲン剤の酢酸シプロテロンを培地に
添加すると、シンデカンmRNAに対するテストステロンの
効果を妨害した。このように、シンデカン遺伝子の不活
性化とその結果として起こるシンデカンの発現の抑制
は、ホルモン処理したS115細胞における接着特性の変化
や上皮表現型の消失または他方で形質転換様表現型の出
現に関連している。
チン（FN）に対する強いRGDS−依存性の結合を示した
が、FNのヘパリン結合ドメインには結合しないので、こ
のことからインテグリン様分子を発現していることが示
された。一方、テストステロン非依存下にて生長させた
C115細胞は、上皮の形態とFNのヘパリン結合ドメインへ
の結合能を示し、これらの結果からホルモン処理をした
S115細胞でシンデカンの発現が変化することが示唆され
た。ホルモン処理をしたS115細胞ではラジオ−イムノア
ッセイおよびウェスタンブロットにより定量したシンデ
カンのマトリックス結合エクトドメインの量も、シンデ
カンのmRNA（2.6キロベース）の量も、いずれも低下し
ていた。抗アンドロゲン剤の酢酸シプロテロンを培地に
添加すると、シンデカンmRNAに対するテストステロンの
効果を妨害した。このように、シンデカン遺伝子の不活
性化とその結果として起こるシンデカンの発現の抑制
は、ホルモン処理したS115細胞における接着特性の変化
や上皮表現型の消失または他方で形質転換様表現型の出
現に関連している。
前記の結果の例を図1Aおよび1Bに示す。図1Aは、テス
トステロンにさらすことにより形質転換させたマウス乳
房上皮細胞（S115）におけるシンデカンの減少を示す、
時間対細胞表面のシンデカン量を表わす比較のグラフで
あり、図1Bは、テストステロンにさらすことにより形質
転換させたマウス乳房上皮細胞におけるシンデカンの減
少を示す、時間対シンデカンmRNA発現を表わす比較のグ
ラフである。これらのグラフから、図1Aにおけるタンパ
ク質および図1BにおけるmRNAのレベルから明らかなよう
に、テストステロンにさらしたのちの、悪性化とシンデ
カン発現の減少が示される。
トステロンにさらすことにより形質転換させたマウス乳
房上皮細胞（S115）におけるシンデカンの減少を示す、
時間対細胞表面のシンデカン量を表わす比較のグラフで
あり、図1Bは、テストステロンにさらすことにより形質
転換させたマウス乳房上皮細胞におけるシンデカンの減
少を示す、時間対シンデカンmRNA発現を表わす比較のグ
ラフである。これらのグラフから、図1Aにおけるタンパ
ク質および図1BにおけるmRNAのレベルから明らかなよう
に、テストステロンにさらしたのちの、悪性化とシンデ
カン発現の減少が示される。
前記のことから、S115培養系へアンドロゲンを添加す
ると、シンデカン遺伝子が不活性化することによりシン
デカン発現が抑制される。この抑制は、足場非依存性の
獲得および上皮表現型の喪失に密接に関連しており、し
かるに、この抑制が、アンドロゲン存在下でのS115細胞
の系質転換様のふるまいという結果に対する理由の１つ
である。
ると、シンデカン遺伝子が不活性化することによりシン
デカン発現が抑制される。この抑制は、足場非依存性の
獲得および上皮表現型の喪失に密接に関連しており、し
かるに、この抑制が、アンドロゲン存在下でのS115細胞
の系質転換様のふるまいという結果に対する理由の１つ
である。
２番目のモデルでは、UV−ＡおよびUV−Ｂ照射にさら
されたヘアレス（hr/hr）マウスにおいて、シンデカン
に対する免疫反応性を調べた。このマウスの系統で特徴
的な皮膚の不全型毛包嚢中はもちろん正常表皮細胞表面
も陽性に染色されることが観察された。わずかな細胞の
異型性をともなう表皮の過形成を呈する紫外線照射に対
する早期反応もまた陽性であったが、表皮細胞表面の染
色は低下していた。著しい異形成をともなう検体では、
顆粒細胞層で弱い染色を示し、一方基底層は陰性であっ
た。乳頭腫および孤立型角化棘細胞腫においては、角嚢
（horn cyst）の増殖表皮細胞においてはもちろん、良
性の過形成表皮細胞においてシンデカンに対する免疫反
応性が観察された。扁平上皮癌および肉腫形成として発
現される悪性形質転換は、一様にシンデカン染色の減少
をともなっていた。これらの結果は、前記の培養上皮細
胞の悪性形質転換にともなうシンデカンの発現の減少の
発見と一致しているが、また、皮膚の正常な組織構造の
維持や、分化パターンにおける、シンデカンの重要な役
割も示唆する。
されたヘアレス（hr/hr）マウスにおいて、シンデカン
に対する免疫反応性を調べた。このマウスの系統で特徴
的な皮膚の不全型毛包嚢中はもちろん正常表皮細胞表面
も陽性に染色されることが観察された。わずかな細胞の
異型性をともなう表皮の過形成を呈する紫外線照射に対
する早期反応もまた陽性であったが、表皮細胞表面の染
色は低下していた。著しい異形成をともなう検体では、
顆粒細胞層で弱い染色を示し、一方基底層は陰性であっ
た。乳頭腫および孤立型角化棘細胞腫においては、角嚢
（horn cyst）の増殖表皮細胞においてはもちろん、良
性の過形成表皮細胞においてシンデカンに対する免疫反
応性が観察された。扁平上皮癌および肉腫形成として発
現される悪性形質転換は、一様にシンデカン染色の減少
をともなっていた。これらの結果は、前記の培養上皮細
胞の悪性形質転換にともなうシンデカンの発現の減少の
発見と一致しているが、また、皮膚の正常な組織構造の
維持や、分化パターンにおける、シンデカンの重要な役
割も示唆する。
これらの染色の実施例を図2Aから2Dに示す。これらの
図は、紫外線照射後のシンデカン発現の経過を示すマウ
スの生物学的皮膚材料の切片の写真を表わす。図2Aは、
正常の皮膚材料を示し、図2Bおよび2Cは、過形成の異な
る段階を示し、図2Cに示す切片はある程度の悪性の組織
学を呈する。これらの図は、紫外線照射によって誘導さ
れた前悪性の過形成が、徐々にシンデカン発現を減少さ
せることを示している。
図は、紫外線照射後のシンデカン発現の経過を示すマウ
スの生物学的皮膚材料の切片の写真を表わす。図2Aは、
正常の皮膚材料を示し、図2Bおよび2Cは、過形成の異な
る段階を示し、図2Cに示す切片はある程度の悪性の組織
学を呈する。これらの図は、紫外線照射によって誘導さ
れた前悪性の過形成が、徐々にシンデカン発現を減少さ
せることを示している。
前記の結果から、生体内およびそれらの正常な環境へ
埋め込まれた上皮細胞では、悪性形質転換の過程におい
てシンデカン発現が減少していくことが明らかであり、
ふたたびシンデカン発現が正常の細胞形態と組織の完全
性（integrity）に必要であること、さらにはシンデカ
ン発現の減少が、上皮細胞の異形成および悪性の重篤さ
に関連しうることもまた示された。
埋め込まれた上皮細胞では、悪性形質転換の過程におい
てシンデカン発現が減少していくことが明らかであり、
ふたたびシンデカン発現が正常の細胞形態と組織の完全
性（integrity）に必要であること、さらにはシンデカ
ン発現の減少が、上皮細胞の異形成および悪性の重篤さ
に関連しうることもまた示された。
３番目のモデルでは、点突然変異させたｃ−Ha−ras
遺伝子をトランスフェクトしたマウス乳房上皮細胞株を
用いた。これらのNOG−8ras細胞においてｃ−Ha−ras遺
伝子はMMTV−LTRプロモーターの下流にあり、したがっ
てその発現をデキサメサゾンによって調節することがで
きる（シアージアロ（Ciardiallo）ら（1989））。これ
らの細胞がｃ−Ha−ras遺伝子を発現すると、細胞培養
ディッシュ上ではフォーカスを、浮遊系ではコロニーを
形成した。細胞培養ディッシュ上で培養したNOG−8ras
細胞は、サブコンフルエントの状態では正常細胞と等し
い量のシンデカンを発現した。しかしながら、これらの
細胞が形質転換の表現型を示すと、すなわちプレート上
にフォーカスが存在するかもしくは浮遊系でコロニーと
して成長すると、シンデカンの発現は顕著に減少した。
しかしながら、シンデカンmRNAのレベルは、これらの異
なる培養段階で同じままであった。このように、これら
の細胞では細胞表面のシンデカンの調節は転写後に行な
われている。これらの結果により、シンデカンの発現が
形質転換の際に減少するのは共通の現象であるが、異な
る細胞でそれが調節される方法は、形質転換した細胞の
タイプごとに異なる可能性があることが示される。
遺伝子をトランスフェクトしたマウス乳房上皮細胞株を
用いた。これらのNOG−8ras細胞においてｃ−Ha−ras遺
伝子はMMTV−LTRプロモーターの下流にあり、したがっ
てその発現をデキサメサゾンによって調節することがで
きる（シアージアロ（Ciardiallo）ら（1989））。これ
らの細胞がｃ−Ha−ras遺伝子を発現すると、細胞培養
ディッシュ上ではフォーカスを、浮遊系ではコロニーを
形成した。細胞培養ディッシュ上で培養したNOG−8ras
細胞は、サブコンフルエントの状態では正常細胞と等し
い量のシンデカンを発現した。しかしながら、これらの
細胞が形質転換の表現型を示すと、すなわちプレート上
にフォーカスが存在するかもしくは浮遊系でコロニーと
して成長すると、シンデカンの発現は顕著に減少した。
しかしながら、シンデカンmRNAのレベルは、これらの異
なる培養段階で同じままであった。このように、これら
の細胞では細胞表面のシンデカンの調節は転写後に行な
われている。これらの結果により、シンデカンの発現が
形質転換の際に減少するのは共通の現象であるが、異な
る細胞でそれが調節される方法は、形質転換した細胞の
タイプごとに異なる可能性があることが示される。
図3Aおよび図3Bに、オンコジンで誘導したシンデカン
発現の減少の実施例を示す。
発現の減少の実施例を示す。
図3Aは、単層で培養したマウス乳房上皮細胞を懸濁し
たものを示す写真であり、そのうち１層はras−オンコ
ジンによって形質転換したものである。図3Bは、図3Aに
示した単層の細胞表面のシンデカン量を示すグラフであ
る。単層a,b,cおよびｆならびにras−誘導後の浮遊系ｄ
にて培養した各上皮細胞についてシンデカンの発現を定
量した。図から明らかなように、シンデカンはras−オ
ンコジンで形質転換したマウス上皮細胞において減少す
る。
たものを示す写真であり、そのうち１層はras−オンコ
ジンによって形質転換したものである。図3Bは、図3Aに
示した単層の細胞表面のシンデカン量を示すグラフであ
る。単層a,b,cおよびｆならびにras−誘導後の浮遊系ｄ
にて培養した各上皮細胞についてシンデカンの発現を定
量した。図から明らかなように、シンデカンはras−オ
ンコジンで形質転換したマウス上皮細胞において減少す
る。
前記の結果から、オンコジンで誘導した悪性形質転換
もまた上皮細胞の表面からのシンデカンの減少を引きお
こし、シンデカンの減少が悪性形質転換の共通の現象で
あって、この減少を検出することが癌タイプの形質転換
ならびにその重篤さを決定するための価値ある診断手段
であることが示された。
もまた上皮細胞の表面からのシンデカンの減少を引きお
こし、シンデカンの減少が悪性形質転換の共通の現象で
あって、この減少を検出することが癌タイプの形質転換
ならびにその重篤さを決定するための価値ある診断手段
であることが示された。
本発明の方法にしたがってシンデカン量を測定するの
に３つの好適な手法がある。すなわち、生化学的、免疫
化学的、および分子生物学的手法である。第１は、シン
デカンの生化学的認識にもとづくものであり、認識され
るのはコアタンパク質の一部もしくは共有結合したGAG
−鎖であってよい。シンデカンは特異的なGAG−鎖を有
し、そのGAG鎖によってシンデカンは特異的な相互作用
が可能となっている（エレニウス（Elenius）ら（199
0）J.Biol.Chem.265巻、17837〜17943頁；サルミバータ
ら（1991）J.Biol.Chem.266巻、印刷中）。それゆえ、
シンデカンはシンデカン特異的なリガンドを供給するこ
とによって検出しうる。しかしながら、ほかの適切な方
法では、下記のようにシンデカン特異的な抗体およびcD
NAを用いる。
に３つの好適な手法がある。すなわち、生化学的、免疫
化学的、および分子生物学的手法である。第１は、シン
デカンの生化学的認識にもとづくものであり、認識され
るのはコアタンパク質の一部もしくは共有結合したGAG
−鎖であってよい。シンデカンは特異的なGAG−鎖を有
し、そのGAG鎖によってシンデカンは特異的な相互作用
が可能となっている（エレニウス（Elenius）ら（199
0）J.Biol.Chem.265巻、17837〜17943頁；サルミバータ
ら（1991）J.Biol.Chem.266巻、印刷中）。それゆえ、
シンデカンはシンデカン特異的なリガンドを供給するこ
とによって検出しうる。しかしながら、ほかの適切な方
法では、下記のようにシンデカン特異的な抗体およびcD
NAを用いる。
ヒトシンデカンのクローニングを行ない（マリら（19
90）J.Biol.Chem.265巻、6884〜6889頁）またはヒト乳
房細胞株HBL−100（エレニウスら（1990）J.Biol.Chem.
265巻、17837〜17843頁）のようなヒト由来の材料から
のシンデカンの単離を行なって、ヒトシンデカンに対す
る抗体を作成することが可能である。これは、単離した
完全なヒトシンデカン、その断片、ヒトcDNAクローンか
ら予想される合成ペプチドもしくは融合タンパク質を用
いてポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を作成
するため、または試験管内でモノクローナル抗体を作成
する細胞のために動物を免疫することによりなしとげる
ことができる。本発明の実施においては、シンデカン量
の測定の際に分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび
免疫学の通常の技術を用いてもよく、このような技術
は、文献に充分に説明されている。たとえば、カレント
プロトコールズ イン イムノロジー（Current Prot
ocols in Immunology）（1990）、グリーン パブリッ
シング アソシエーツ アンド ジョン ウィレイ ア
ンド サンズ社（Greene Publishing Associates and J
ohn Wiliy ＆ Sons,Inc.）を参照のこと。
90）J.Biol.Chem.265巻、6884〜6889頁）またはヒト乳
房細胞株HBL−100（エレニウスら（1990）J.Biol.Chem.
265巻、17837〜17843頁）のようなヒト由来の材料から
のシンデカンの単離を行なって、ヒトシンデカンに対す
る抗体を作成することが可能である。これは、単離した
完全なヒトシンデカン、その断片、ヒトcDNAクローンか
ら予想される合成ペプチドもしくは融合タンパク質を用
いてポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を作成
するため、または試験管内でモノクローナル抗体を作成
する細胞のために動物を免疫することによりなしとげる
ことができる。本発明の実施においては、シンデカン量
の測定の際に分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび
免疫学の通常の技術を用いてもよく、このような技術
は、文献に充分に説明されている。たとえば、カレント
プロトコールズ イン イムノロジー（Current Prot
ocols in Immunology）（1990）、グリーン パブリッ
シング アソシエーツ アンド ジョン ウィレイ ア
ンド サンズ社（Greene Publishing Associates and J
ohn Wiliy ＆ Sons,Inc.）を参照のこと。
ヒトシンデカン特異抗体を用いて、組織中のシンデカ
ン発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて、たとえ
ば図2Aから2Dに表わしたモデルに示すように研究しう
る。これらにおいては、一次抗体（ポリクローナルもし
くはモノクローナル）により特異的な認識が行なわれる
が、二次検出のシステムは螢光、酵素またはほかの複合
二次抗体を用いることができる。結果として、病理学的
検査のための組織切片の免疫組織学的染色がえられる。
たとえばウェスタンブロットもしくはドット／スロット
分析のためにシンデカンを遊離させるのに尿素や中性界
面活性剤を用いて、組織を抽出することも可能である
（ヤルカネンら（1985）J.Cell Biol.105巻、976〜985
頁；ヤルカネンら（1987）J.Cell Biol.105巻、3087〜3
096頁）。この、陽イオン性固相の使用にもとづく技術
では、単離したシンデカンを標準として用いてシンデカ
ンの定量を行なうことができる。この技術は体液にも適
用可能である。体液サンプルでは、シンデカンのモル濃
度が、異なる体液、たとえば血清、血漿、尿、脊髄液な
どのシンデカン量の標準値を設定する助けとなりうる。
正常のシンデカン量の発現は、健常のボランティアから
の値を用い、さらにこれらの値を異なる疾病もしくは状
態にある人々との値と比較して設定することができる。
ン発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて、たとえ
ば図2Aから2Dに表わしたモデルに示すように研究しう
る。これらにおいては、一次抗体（ポリクローナルもし
くはモノクローナル）により特異的な認識が行なわれる
が、二次検出のシステムは螢光、酵素またはほかの複合
二次抗体を用いることができる。結果として、病理学的
検査のための組織切片の免疫組織学的染色がえられる。
たとえばウェスタンブロットもしくはドット／スロット
分析のためにシンデカンを遊離させるのに尿素や中性界
面活性剤を用いて、組織を抽出することも可能である
（ヤルカネンら（1985）J.Cell Biol.105巻、976〜985
頁；ヤルカネンら（1987）J.Cell Biol.105巻、3087〜3
096頁）。この、陽イオン性固相の使用にもとづく技術
では、単離したシンデカンを標準として用いてシンデカ
ンの定量を行なうことができる。この技術は体液にも適
用可能である。体液サンプルでは、シンデカンのモル濃
度が、異なる体液、たとえば血清、血漿、尿、脊髄液な
どのシンデカン量の標準値を設定する助けとなりうる。
正常のシンデカン量の発現は、健常のボランティアから
の値を用い、さらにこれらの値を異なる疾病もしくは状
態にある人々との値と比較して設定することができる。
シンデカン発現の変化は、たとえばヒトシンデカンcD
NAのようなシンデカンcDNAを用いることで検出すること
も可能である。種間でシンデカンはよく保存されている
が、ヌクレオチドレベルでの構造的な差異は、ヒトシン
デカンのmRNAを検出する際にマウスシンデカンを用いる
ことができない程度に大きいものである。通例、ある遺
伝子産物のmRNAレベルは、同じヌクレオチド鎖のセンス
形態とアンチセンス形態の特異的相互作用（このばあい
は、シンデカンのセンス鎖とアンチセンス鎖の特異的相
互作用）にもとづいて検出することができる。そのよう
な検出は、組織サンプルにはin situ法を用いて、単離
したRNAにはmRNA保護分析（mRNA protection assay）を
用いて、またはシンデカン特異的なヌクレオチド鎖のプ
ライマーで方向づけた複製（primer−directed polymer
izastion）によって、行なうことができる。これらの技
術はすべて、前記のカレンド プロトコールス イン
モレキュラー バイオロジーのような文献に詳説されて
いる。
NAのようなシンデカンcDNAを用いることで検出すること
も可能である。種間でシンデカンはよく保存されている
が、ヌクレオチドレベルでの構造的な差異は、ヒトシン
デカンのmRNAを検出する際にマウスシンデカンを用いる
ことができない程度に大きいものである。通例、ある遺
伝子産物のmRNAレベルは、同じヌクレオチド鎖のセンス
形態とアンチセンス形態の特異的相互作用（このばあい
は、シンデカンのセンス鎖とアンチセンス鎖の特異的相
互作用）にもとづいて検出することができる。そのよう
な検出は、組織サンプルにはin situ法を用いて、単離
したRNAにはmRNA保護分析（mRNA protection assay）を
用いて、またはシンデカン特異的なヌクレオチド鎖のプ
ライマーで方向づけた複製（primer−directed polymer
izastion）によって、行なうことができる。これらの技
術はすべて、前記のカレンド プロトコールス イン
モレキュラー バイオロジーのような文献に詳説されて
いる。
本発明の特定の方法を下記の実施例に示す。実施例は
例示の目的でなされたものであって、前記の本発明をこ
れらの特定の実施例のみに限定するものではない。
例示の目的でなされたものであって、前記の本発明をこ
れらの特定の実施例のみに限定するものではない。
実施例Ｉ 形質転換した上皮細胞におけるシンデカンの定位 マウス乳癌シオノギS115ストック細胞を、５％熱不活
性化した牛胎児血清（ｉ−FCS）、ピルビン酸塩（1m
M）、グルタミン（1mM）、ペニシリン（100IU/ml）スト
レプトマイシン（100μg/ml）およびテストステロン（1
0nM）を含むDMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）中で
きまりきったやり方で培養した。ホルモン処理を含む研
究では、４％デキストラン炭処理した牛胎児血漿（DC−
FCS）を含む成育培地を10nMテストステロンおよび／ま
たは１μＭ酢酸シプロテロンを添加してまたは非添加で
用いた。実験用に細胞をヌンク（Nunc）組織培養組織デ
ッシュに1cm2あたり10,000個の細胞密度でまいた。細胞
数計測は、細胞をザボグロビン（Zaboglobin）（コール
ター エレクトロニクス社（Coulter Electronics,Lt
d.）製）を含む10mMヘペス、1.5mM塩化マグネシウム中
に溶解し、遊離した核をイソトン（Isoton）（コールタ
ー社製）に懸濁して最後にコールター細胞数計測器で計
数した。
性化した牛胎児血清（ｉ−FCS）、ピルビン酸塩（1m
M）、グルタミン（1mM）、ペニシリン（100IU/ml）スト
レプトマイシン（100μg/ml）およびテストステロン（1
0nM）を含むDMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）中で
きまりきったやり方で培養した。ホルモン処理を含む研
究では、４％デキストラン炭処理した牛胎児血漿（DC−
FCS）を含む成育培地を10nMテストステロンおよび／ま
たは１μＭ酢酸シプロテロンを添加してまたは非添加で
用いた。実験用に細胞をヌンク（Nunc）組織培養組織デ
ッシュに1cm2あたり10,000個の細胞密度でまいた。細胞
数計測は、細胞をザボグロビン（Zaboglobin）（コール
ター エレクトロニクス社（Coulter Electronics,Lt
d.）製）を含む10mMヘペス、1.5mM塩化マグネシウム中
に溶解し、遊離した核をイソトン（Isoton）（コールタ
ー社製）に懸濁して最後にコールター細胞数計測器で計
数した。
S115細胞を（ヤルカネンら（1985）J.Cell Biol.101
巻、976〜984頁）に述べたように培養４日目にインタク
トな形で染色した。プロテオグリカンのコアタンパク質
に対するラットモノクローナル抗体281−２（ヤルカネ
ンら（1985）J.Cell Biol.101巻、976〜984頁）を用い
て、細胞表面のプロテオグリカン、シンデカンの免疫的
定位を行なったが、これらの染色はリンパ球ホーミング
受容体に特異的な別のIgG2aモノクローナル抗体Mel−14
（ギャラチン（Gallatin）ら（1981）ネイチャー（Natu
re）304巻、30〜34頁）を用いて、制御した。固定化さ
れたラット抗体の検出は、ウサギ抗−ラットFITC−複合
物（ジャンセン バイオキミカ（Janssen Biochimica）
社製）を用いて行なった。
巻、976〜984頁）に述べたように培養４日目にインタク
トな形で染色した。プロテオグリカンのコアタンパク質
に対するラットモノクローナル抗体281−２（ヤルカネ
ンら（1985）J.Cell Biol.101巻、976〜984頁）を用い
て、細胞表面のプロテオグリカン、シンデカンの免疫的
定位を行なったが、これらの染色はリンパ球ホーミング
受容体に特異的な別のIgG2aモノクローナル抗体Mel−14
（ギャラチン（Gallatin）ら（1981）ネイチャー（Natu
re）304巻、30〜34頁）を用いて、制御した。固定化さ
れたラット抗体の検出は、ウサギ抗−ラットFITC−複合
物（ジャンセン バイオキミカ（Janssen Biochimica）
社製）を用いて行なった。
実施例II 上皮細胞のホルモン誘導した形質転換における変化した
シンデカン発現の検出。
シンデカン発現の検出。
S115細胞の表面上のシンデカン定量のため、細胞の単
層を冷PBSで数回洗浄し、シンデカン分子のエクトドメ
インを、ラプラージャーおよびバーンフィールド（198
3）J.Biol.Chem.258巻、3632〜3636頁；（1985）J.Bio
l.Chem.260巻、4103〜4109頁に示されるように、牛膵臓
のトリプシン（シグマ（Sigma）社製、タイプIII;20μg
/ml）を用い氷上で10分間インキュベートして遊離させ
た。トリプシンインヒビター（100μg/ml）でトリプシ
ンを不活性化したのち、細胞を遠心し、エクトドメイン
定量のために上清を回収し、細胞は細胞数計測のために
イソトンに懸濁した。モノクローナル抗体281−２は、
クロラミン−Ｔ酸化法（ステーリ（Sthli）ら（198
3）メソッド イン エンザイモロジー（Meth.Enzymo
l.）92巻、242〜253頁）により、比活性14.1×106cpm/
μｇの放射性ヨウ素化物とした。分析には、２×105個
の細胞からの上清とNMuMG細胞から精製した対照のシン
デカンを先に述べたように（ヤルカネンら（1987）J.Ce
ll Biol.105巻、3087〜3096頁）ミニフォルド−スロッ
ト装置（シュライヒャー アンド シュエル（Schleich
er ＆ Schuell）社製）中で陽イオン性ナイロン膜（ゼ
ータ−プローブ（Zeta−Probe）、バイオラッド（BioRa
d）社製）に載せて行なった。スロット装置から膜をは
ずし、膜のブロッキングのため10％FCSを含むPBS中、室
温にて１時間インキュベートした。そののち125I−標識
した281−２（10,000cpm/ml）を含むPBS中、＋４℃にて
一晩インキュベートした。PBSで膜を５回洗浄したの
ち、結合した281−２を可視化するためコダック Ｘ−
オーマット（Kodak X−Omat）フィルムに感光させた。
定量のため各スロットをLKBウルトラスキャン XL強化
レーザー密度計で分析し、既知量のNMuMG細胞からのシ
ンデカンと比較した。
層を冷PBSで数回洗浄し、シンデカン分子のエクトドメ
インを、ラプラージャーおよびバーンフィールド（198
3）J.Biol.Chem.258巻、3632〜3636頁；（1985）J.Bio
l.Chem.260巻、4103〜4109頁に示されるように、牛膵臓
のトリプシン（シグマ（Sigma）社製、タイプIII;20μg
/ml）を用い氷上で10分間インキュベートして遊離させ
た。トリプシンインヒビター（100μg/ml）でトリプシ
ンを不活性化したのち、細胞を遠心し、エクトドメイン
定量のために上清を回収し、細胞は細胞数計測のために
イソトンに懸濁した。モノクローナル抗体281−２は、
クロラミン−Ｔ酸化法（ステーリ（Sthli）ら（198
3）メソッド イン エンザイモロジー（Meth.Enzymo
l.）92巻、242〜253頁）により、比活性14.1×106cpm/
μｇの放射性ヨウ素化物とした。分析には、２×105個
の細胞からの上清とNMuMG細胞から精製した対照のシン
デカンを先に述べたように（ヤルカネンら（1987）J.Ce
ll Biol.105巻、3087〜3096頁）ミニフォルド−スロッ
ト装置（シュライヒャー アンド シュエル（Schleich
er ＆ Schuell）社製）中で陽イオン性ナイロン膜（ゼ
ータ−プローブ（Zeta−Probe）、バイオラッド（BioRa
d）社製）に載せて行なった。スロット装置から膜をは
ずし、膜のブロッキングのため10％FCSを含むPBS中、室
温にて１時間インキュベートした。そののち125I−標識
した281−２（10,000cpm/ml）を含むPBS中、＋４℃にて
一晩インキュベートした。PBSで膜を５回洗浄したの
ち、結合した281−２を可視化するためコダック Ｘ−
オーマット（Kodak X−Omat）フィルムに感光させた。
定量のため各スロットをLKBウルトラスキャン XL強化
レーザー密度計で分析し、既知量のNMuMG細胞からのシ
ンデカンと比較した。
S115細胞からトリプシンで遊離させたエクトドメイン
を、エタノール沈殿ののち、SDS−PAGE濃度勾配（４〜1
0％）ゲル（オーファレル（Ｏ′Farrell）（1975）J.Bi
ol.Chem.250巻、4007〜4021頁）上で分画した。電気泳
動ののち、先に述べたように（ヤルカネンら（1985）J.
Cell Biol.101巻、976〜984頁；ラプラージャーら（198
5）J.Biol.Chem.260巻、11046〜11052頁）、エレクトロ
ブロッティング2005トランスフォー（Transphor）装置
（エル ケー ビー（LKB）社製）を用いてゼータプロ
ーブ膜にサンプルを転写し、その膜を前記と同様に125I
−標識した281−２にさらした。ここでも、NMuMG細胞よ
り単離したシンデカンのエクトドメインを対照として用
いることができる。
を、エタノール沈殿ののち、SDS−PAGE濃度勾配（４〜1
0％）ゲル（オーファレル（Ｏ′Farrell）（1975）J.Bi
ol.Chem.250巻、4007〜4021頁）上で分画した。電気泳
動ののち、先に述べたように（ヤルカネンら（1985）J.
Cell Biol.101巻、976〜984頁；ラプラージャーら（198
5）J.Biol.Chem.260巻、11046〜11052頁）、エレクトロ
ブロッティング2005トランスフォー（Transphor）装置
（エル ケー ビー（LKB）社製）を用いてゼータプロ
ーブ膜にサンプルを転写し、その膜を前記と同様に125I
−標識した281−２にさらした。ここでも、NMuMG細胞よ
り単離したシンデカンのエクトドメインを対照として用
いることができる。
実施例III 形質転換した上皮細胞における変化したシンデカン遺伝
子発現の検出 チャーウィン（Chirgwin）ら（1979）バイオケミスト
リー（Biochem.）18巻、5294〜5299頁の方法にしたがっ
て、4Mグアニジン イソチオシアネートおよび塩化セシ
ウム−ペレッティングを用いて総RNAを単離した。その
うち15μｇのRNAをホルムアルデヒドアガロースゲル
（１％）で分画し、ジーン スクリーン プラス（Gene
Screen Plus）膜に転写した。シンデカンに対するPM−
4cDNAプローブ（サウンダースら（1989）J.Cell Biol.1
08巻、1547〜1556頁）のマルチ−プライム（multi−pri
me）（アマーシャム（Amersham）社製）標識したインサ
ートとのハイブリダイゼーションを該膜の製造業者（ニ
ュー イングランド ヌクレアー（New England Nuclea
r）社）が提案する条件下で行なった。膜をコダック
Ｘ−オーマットフィルムに70℃にて感光させることによ
り固定化したプローブを可視化し、前記の密度計分析に
よって2.6キロベースのmRNAの定量を行なった。シンデ
カンのmRNAの発現は、デニス（Denis）ら（1988）ヌク
レイック アシッド リサーチ（Nucl.Acid Res.）16
巻、2354〜2359頁に述べられているように、リボソーマ
ルRNAと関連していた。さらに、シンデカンの抑制の特
異性を調べるために、グリセルアルデヒド３−ホスフェ
ート−デヒドロゲナーゼ（GAPDH）（フォート（Fort）
ら（1985）Nucl.Acid Res.13巻、1431〜1442頁）および
マウス α−アクチン（ミンティ（Minty）ら（1981）
J.Biol.Chem.256巻、1008〜1014頁）とに対するプロー
ブを同じサンプルに用いた。
子発現の検出 チャーウィン（Chirgwin）ら（1979）バイオケミスト
リー（Biochem.）18巻、5294〜5299頁の方法にしたがっ
て、4Mグアニジン イソチオシアネートおよび塩化セシ
ウム−ペレッティングを用いて総RNAを単離した。その
うち15μｇのRNAをホルムアルデヒドアガロースゲル
（１％）で分画し、ジーン スクリーン プラス（Gene
Screen Plus）膜に転写した。シンデカンに対するPM−
4cDNAプローブ（サウンダースら（1989）J.Cell Biol.1
08巻、1547〜1556頁）のマルチ−プライム（multi−pri
me）（アマーシャム（Amersham）社製）標識したインサ
ートとのハイブリダイゼーションを該膜の製造業者（ニ
ュー イングランド ヌクレアー（New England Nuclea
r）社）が提案する条件下で行なった。膜をコダック
Ｘ−オーマットフィルムに70℃にて感光させることによ
り固定化したプローブを可視化し、前記の密度計分析に
よって2.6キロベースのmRNAの定量を行なった。シンデ
カンのmRNAの発現は、デニス（Denis）ら（1988）ヌク
レイック アシッド リサーチ（Nucl.Acid Res.）16
巻、2354〜2359頁に述べられているように、リボソーマ
ルRNAと関連していた。さらに、シンデカンの抑制の特
異性を調べるために、グリセルアルデヒド３−ホスフェ
ート−デヒドロゲナーゼ（GAPDH）（フォート（Fort）
ら（1985）Nucl.Acid Res.13巻、1431〜1442頁）および
マウス α−アクチン（ミンティ（Minty）ら（1981）
J.Biol.Chem.256巻、1008〜1014頁）とに対するプロー
ブを同じサンプルに用いた。
ウィルキンソン（Wilkinson）ら（1989）ディベロッ
プメント（Developm.）105巻、131〜136頁に示された方
法にしたがって、パラフィン切片に対してcRNA in situ
ハイブリダイゼーションを行なった。マウスのシンデカ
ンの部分cDNAクローン（PM−４）（サウンダースら（19
89）J.Cell Biol.108巻、1547〜1556頁）からの、535bp
のSac I−Kpn I断片をリボプローブpGEM−4Zベクター
（プロメガ（Promega）社製、マディソン、WI）中にサ
ブクローン化した（バイニオら、（1991）ディベロップ
メント、投稿中）。該インサートを含むクローン化した
プラスミドをEco R IまたはHind III酵素で直鎖とし、
35S−UTP（アマーシャム社製、ウィルシャー（Willshir
e）、英国）の存在下でT7またはSP6ポリメラーゼを用い
て相補的なDNA鎖からそれぞれアンチセンスまたはセン
スの転写物を作成した。アルカリ加水分解によって、転
写物の最大鎖長を200bp未満に減じ、比活性がもっとも
高い画分を集め、沈殿させ、ハイブリダイゼーション緩
衝液中で可溶化した。前処置したスライドを50℃で１晩
ハイブリダイズさせ、以前に述べたように（ウィルキン
ソンら（1989）ディベロップメント105巻、131〜136
頁）、プローブの非特異的結合を除去し（高ストリンジ
ェンシー洗浄およびリボヌクレアーゼＡ処置を含む）、
オートラジオグラフィーを行なった。
プメント（Developm.）105巻、131〜136頁に示された方
法にしたがって、パラフィン切片に対してcRNA in situ
ハイブリダイゼーションを行なった。マウスのシンデカ
ンの部分cDNAクローン（PM−４）（サウンダースら（19
89）J.Cell Biol.108巻、1547〜1556頁）からの、535bp
のSac I−Kpn I断片をリボプローブpGEM−4Zベクター
（プロメガ（Promega）社製、マディソン、WI）中にサ
ブクローン化した（バイニオら、（1991）ディベロップ
メント、投稿中）。該インサートを含むクローン化した
プラスミドをEco R IまたはHind III酵素で直鎖とし、
35S−UTP（アマーシャム社製、ウィルシャー（Willshir
e）、英国）の存在下でT7またはSP6ポリメラーゼを用い
て相補的なDNA鎖からそれぞれアンチセンスまたはセン
スの転写物を作成した。アルカリ加水分解によって、転
写物の最大鎖長を200bp未満に減じ、比活性がもっとも
高い画分を集め、沈殿させ、ハイブリダイゼーション緩
衝液中で可溶化した。前処置したスライドを50℃で１晩
ハイブリダイズさせ、以前に述べたように（ウィルキン
ソンら（1989）ディベロップメント105巻、131〜136
頁）、プローブの非特異的結合を除去し（高ストリンジ
ェンシー洗浄およびリボヌクレアーゼＡ処置を含む）、
オートラジオグラフィーを行なった。
実施例IV 腫瘍由来の組織切片における変化したシンデカン発現の
検出。
検出。
タルベ（Talve）ら（1990）フォトダーマトロジー
フォトイムノロジー アンド フォトメディシン（Phot
odermatol.Photoimmunol.Photomed.）７巻、109〜115頁
の方法で動物をUV−ＡおよびUV−Ｂ照射に付すことによ
り、光で色素沈着したhr/hr C3H/Tif系のヘアレス雄性
マウス（ボムホルドガード（Bomholdgaard、デンマーク
（Denmark））に、腫瘍を形成させた。観察期間12ケ月
のあいだで、合計83例の乳頭腫、２例の角化棘細胞腫、
４例の扁平細胞性癌腫（１例は癌肉腫との合併症）なら
びに11例の肉腫が生じ、高UV−Ａ（582ジュール/cm2）
プラス高UV−Ｂ（紅斑形成に有効（erythemally effect
ive）＝EE）（1.0ジュールcm2）プラス高UV−Ｂ（EE）
（0.8ジュール/cm2）に関連して、腫瘍形成が増大した
（28に対して78の癌）。顕著に観察しうる腫瘍からも正
常に見える紫外線照射の皮膚からもサンプルを取った。
標本の一部は、10％の緩衝能を付与したホルマリン中、
パラフィンンに埋め込み、切片として、きまりきった方
法でヘマトキシリンおよびエオシン染色を行なった。標
本ののこりは、チッソ中で凍結し、切片とした。領域
は、標準の組織病理学的基準にしたがって分類した。基
底膜を可視化するばあいにはペリオディック アシッド
−シッフ（Periodic acid−Schiff）染色（PAS）を、コ
ラーゲンの種々のタイプを染色するばあいには、ヘロビ
ック（Herovic）、ウェイガーツ（Weigert's）メイソン
ズ トリクロム（Masson's trichrom）およびゴモリズ
（Gomori's）染色も、また必要に応じてほかの染色法や
電子顕微鏡分析も行なった。
フォトイムノロジー アンド フォトメディシン（Phot
odermatol.Photoimmunol.Photomed.）７巻、109〜115頁
の方法で動物をUV−ＡおよびUV−Ｂ照射に付すことによ
り、光で色素沈着したhr/hr C3H/Tif系のヘアレス雄性
マウス（ボムホルドガード（Bomholdgaard、デンマーク
（Denmark））に、腫瘍を形成させた。観察期間12ケ月
のあいだで、合計83例の乳頭腫、２例の角化棘細胞腫、
４例の扁平細胞性癌腫（１例は癌肉腫との合併症）なら
びに11例の肉腫が生じ、高UV−Ａ（582ジュール/cm2）
プラス高UV−Ｂ（紅斑形成に有効（erythemally effect
ive）＝EE）（1.0ジュールcm2）プラス高UV−Ｂ（EE）
（0.8ジュール/cm2）に関連して、腫瘍形成が増大した
（28に対して78の癌）。顕著に観察しうる腫瘍からも正
常に見える紫外線照射の皮膚からもサンプルを取った。
標本の一部は、10％の緩衝能を付与したホルマリン中、
パラフィンンに埋め込み、切片として、きまりきった方
法でヘマトキシリンおよびエオシン染色を行なった。標
本ののこりは、チッソ中で凍結し、切片とした。領域
は、標準の組織病理学的基準にしたがって分類した。基
底膜を可視化するばあいにはペリオディック アシッド
−シッフ（Periodic acid−Schiff）染色（PAS）を、コ
ラーゲンの種々のタイプを染色するばあいには、ヘロビ
ック（Herovic）、ウェイガーツ（Weigert's）メイソン
ズ トリクロム（Masson's trichrom）およびゴモリズ
（Gomori's）染色も、また必要に応じてほかの染色法や
電子顕微鏡分析も行なった。
シンデカンの免疫組織化学的な定位のためにラットモ
ノクローナル抗体281−２を用いた。この抗体は、マウ
スシンデカンのエクトドメイン（18）のコアタンパク質
に特異的である。スー（Hsu）ら（1981）ジャーナル
オブ ヒストケミストリー アンド サイトケミストリ
ー（J.Histochem.Cytochem.）29巻、577〜580頁に記載
のように、固定された281−２を検出するためにアビジ
ンビオチンイムノペルオキシダーゼ法を用いた。組織切
片を脱パラフィン化および再水化（rehydration）した
のち、スライドを３％過酸化水素を含む100％メタノー
ル中で30分間インキュベートして内在性のペルオキシダ
ーゼ活性をブロックした。そののち非特異的染色を最小
にするためにトリス緩衝性生理食塩水pH7.4（TBS）中、
２％の正常ヤギ血清（ベクター ラボラトリーズ社（Ve
ctor Laboratories Inc.）製、バーリンゲイム（Burlin
game）カリフォルニア）と30分間室温にて該切片をイン
キュベートした。その切片を１％（重量／容量）BSA−T
BS中２μg/mlのタンパク質濃度の一次抗体281−２でお
おい、一晩４℃にてインキュベートした。そののちスラ
イドを１％BSA−TBS中1:1000の希釈率のビオチン化した
ヤギ抗ラットIgG（ジャクソンズ イムノリサーチ ラ
ボラトリーズ社（Jackson's Immunoresearch Laborato
ries,Inc.）製、西バルチモア、ペンシルバニア）と室
温にて30分間インキュベートし、最後にアビジンビオチ
ン−ペルオキシダーゼ複合体（ベクタスタイン キット
（Vectastain kit）、ベクター ラボラトリーズ社製、
バーリンゲイム、カリフォルニア）と室温で30分インキ
ュベートした。洗浄ののち、暗所で0.68mg/mlイミダゾ
ールおよび0.01％過酸化水素を含む0.5mg/ml 3,3′−ジ
アミノベンチジン４塩酸塩（DAB、ポリサイエンス社（P
olysciences,Inc.）製ノースハンプトン、英国を含むTB
S溶液と５分間インキュベートしてペルオキシダーゼ活
性を調べた。スライドをメイヤーズ（Mayer's）へマト
キシリンを用いて軽く対比染色し、デペックス マウン
ティング（Depex Mounting）培地（ビー ディー エイ
チ リミテッド プール（BDH Limited Pool）社製、英
国）に載置した。すべての工程と工程とのあいだで、ト
リス緩衝性生理食塩水（TBS）でスライドを３回洗浄し
た。対照の切片には、定常ラットIgG（シグマ社製、セ
ントルイス、ミズーリ）を２μg/mlで用いた。各腫瘍の
タイプのいくつかの凍結切片もまた、染色を行ない、パ
ラフィンにうめ込んだ組織切片と同一の免疫反応性を示
す結果をえた。一次抗体の濃度およびインキュベーショ
ン時間の変更では染色パターンは有意に変化しなかっ
た。
ノクローナル抗体281−２を用いた。この抗体は、マウ
スシンデカンのエクトドメイン（18）のコアタンパク質
に特異的である。スー（Hsu）ら（1981）ジャーナル
オブ ヒストケミストリー アンド サイトケミストリ
ー（J.Histochem.Cytochem.）29巻、577〜580頁に記載
のように、固定された281−２を検出するためにアビジ
ンビオチンイムノペルオキシダーゼ法を用いた。組織切
片を脱パラフィン化および再水化（rehydration）した
のち、スライドを３％過酸化水素を含む100％メタノー
ル中で30分間インキュベートして内在性のペルオキシダ
ーゼ活性をブロックした。そののち非特異的染色を最小
にするためにトリス緩衝性生理食塩水pH7.4（TBS）中、
２％の正常ヤギ血清（ベクター ラボラトリーズ社（Ve
ctor Laboratories Inc.）製、バーリンゲイム（Burlin
game）カリフォルニア）と30分間室温にて該切片をイン
キュベートした。その切片を１％（重量／容量）BSA−T
BS中２μg/mlのタンパク質濃度の一次抗体281−２でお
おい、一晩４℃にてインキュベートした。そののちスラ
イドを１％BSA−TBS中1:1000の希釈率のビオチン化した
ヤギ抗ラットIgG（ジャクソンズ イムノリサーチ ラ
ボラトリーズ社（Jackson's Immunoresearch Laborato
ries,Inc.）製、西バルチモア、ペンシルバニア）と室
温にて30分間インキュベートし、最後にアビジンビオチ
ン−ペルオキシダーゼ複合体（ベクタスタイン キット
（Vectastain kit）、ベクター ラボラトリーズ社製、
バーリンゲイム、カリフォルニア）と室温で30分インキ
ュベートした。洗浄ののち、暗所で0.68mg/mlイミダゾ
ールおよび0.01％過酸化水素を含む0.5mg/ml 3,3′−ジ
アミノベンチジン４塩酸塩（DAB、ポリサイエンス社（P
olysciences,Inc.）製ノースハンプトン、英国を含むTB
S溶液と５分間インキュベートしてペルオキシダーゼ活
性を調べた。スライドをメイヤーズ（Mayer's）へマト
キシリンを用いて軽く対比染色し、デペックス マウン
ティング（Depex Mounting）培地（ビー ディー エイ
チ リミテッド プール（BDH Limited Pool）社製、英
国）に載置した。すべての工程と工程とのあいだで、ト
リス緩衝性生理食塩水（TBS）でスライドを３回洗浄し
た。対照の切片には、定常ラットIgG（シグマ社製、セ
ントルイス、ミズーリ）を２μg/mlで用いた。各腫瘍の
タイプのいくつかの凍結切片もまた、染色を行ない、パ
ラフィンにうめ込んだ組織切片と同一の免疫反応性を示
す結果をえた。一次抗体の濃度およびインキュベーショ
ン時間の変更では染色パターンは有意に変化しなかっ
た。
実施例Ｖ ras−オンコジンで誘導した形質転換における変化した
シンデカン発現の検出。
シンデカン発現の検出。
NOG−８細胞は、正常マウス乳房上皮細胞株のサブク
ローンを表わし、NMuMGおよびNOG−8ras細胞はNOG−８
細胞の１系統であって、点変異したｃ−Ha−ras遺伝子
に連結したグルココルチコイドで誘導可能なMMTV−LTR
プロモーターを含むプラスミドをトランスフェクトした
ものである。細胞は、デキストラン炭処理した牛胎児血
清（DCC−FCS）５％、グルタミン、ペニシリン（100IU/
ml）およびストレプトマイシン（100μg/ml）を含むRPM
I−1640細胞培養培地（ギブコ（Gibco）社製）中で生育
した。これらの細胞で、細胞培養培地に１μＭデキサメ
サゾン（シグマ社製）を添加することによりｃ−Ha−ra
s遺伝子の発現を最高に誘導することができた。DCC−処
理は、トランスフェクトした遺伝子の発現に影響を与え
るかもしれない余分のステロイドを血清から除去するた
めに行なった。浮遊培養のために、可能な細胞−基層接
着を妨げるために、１％アガー（シグマ社製）RPMI−16
40溶液で微生物用ディッシュをおおった。細胞は、１×
105/mlの密度で播種した。細胞数は、トリプシン処置の
のち、コールターカウンター（コールターエレクトロニ
クス社製、ヒアレー（Hialeah）、フロリダ）を用いて
計測した。PM−４は、サウンダースら（1989）J.Cell B
iol.108巻、1547〜1556頁により最初にクローン化され
たシンデカンに対するcDNAプローブである。これは、正
常マウス乳房細胞から2.6キロベースと3.4キロベースの
２つのバンドを検出する。
ローンを表わし、NMuMGおよびNOG−8ras細胞はNOG−８
細胞の１系統であって、点変異したｃ−Ha−ras遺伝子
に連結したグルココルチコイドで誘導可能なMMTV−LTR
プロモーターを含むプラスミドをトランスフェクトした
ものである。細胞は、デキストラン炭処理した牛胎児血
清（DCC−FCS）５％、グルタミン、ペニシリン（100IU/
ml）およびストレプトマイシン（100μg/ml）を含むRPM
I−1640細胞培養培地（ギブコ（Gibco）社製）中で生育
した。これらの細胞で、細胞培養培地に１μＭデキサメ
サゾン（シグマ社製）を添加することによりｃ−Ha−ra
s遺伝子の発現を最高に誘導することができた。DCC−処
理は、トランスフェクトした遺伝子の発現に影響を与え
るかもしれない余分のステロイドを血清から除去するた
めに行なった。浮遊培養のために、可能な細胞−基層接
着を妨げるために、１％アガー（シグマ社製）RPMI−16
40溶液で微生物用ディッシュをおおった。細胞は、１×
105/mlの密度で播種した。細胞数は、トリプシン処置の
のち、コールターカウンター（コールターエレクトロニ
クス社製、ヒアレー（Hialeah）、フロリダ）を用いて
計測した。PM−４は、サウンダースら（1989）J.Cell B
iol.108巻、1547〜1556頁により最初にクローン化され
たシンデカンに対するcDNAプローブである。これは、正
常マウス乳房細胞から2.6キロベースと3.4キロベースの
２つのバンドを検出する。
RNA分離のため、細胞培養ディッシュは氷冷リン酸緩
衝性生理食塩水（PBS）を用いて２度洗浄し、そのの
ち、4MGIT緩衝液（5mMクエン酸ナトリウム（pH7.0）、
0.1Mβ−メルカプトエタノールおよび0.5％Ｎ−ライリ
ルサルコシン中4Mグアニジン イソチオシアネート）中
で可溶化した。総RNA抽出物は、チャーグウィンら（（1
979）Biochem.18巻、5294〜5299頁）の示す方法で、塩
化セシウム密度遠心分離法により調製した。ノーザンブ
ロット分析のため、RNAサンプルを１％ホルムアルデヒ
ド−アガロースゲル電気泳動により分離した。これらの
ゲルをジーンスクリーンハイブリダイゼーション膜にブ
ロットした。フィルターは、1M塩化ナトリウム、１％ド
デシル硫酸ナトリウム、10％デキストラン硫酸、５×デ
ンハルト（Denhardt's）溶液、100μg/mlサケ精子DNA、
50％ホルムアルデヒド中、42℃にてプレハイブリダイズ
しておいた。ハイブリダイゼーションには、マルチプラ
イム標識したPM−４またはBS−９プローブを添加した。
P32（アマーシャム社製）同位体を用いた。フィルター
は、２×SSC、１％ドデシル硫酸ナトリウム中でPM−４
のばあい65℃にて、BS−９のばあい60℃にて洗浄し、コ
ダックＸ−オーマットもしくはフジＸ線フィルムでオー
トラジオグラフィーを行なった。
衝性生理食塩水（PBS）を用いて２度洗浄し、そのの
ち、4MGIT緩衝液（5mMクエン酸ナトリウム（pH7.0）、
0.1Mβ−メルカプトエタノールおよび0.5％Ｎ−ライリ
ルサルコシン中4Mグアニジン イソチオシアネート）中
で可溶化した。総RNA抽出物は、チャーグウィンら（（1
979）Biochem.18巻、5294〜5299頁）の示す方法で、塩
化セシウム密度遠心分離法により調製した。ノーザンブ
ロット分析のため、RNAサンプルを１％ホルムアルデヒ
ド−アガロースゲル電気泳動により分離した。これらの
ゲルをジーンスクリーンハイブリダイゼーション膜にブ
ロットした。フィルターは、1M塩化ナトリウム、１％ド
デシル硫酸ナトリウム、10％デキストラン硫酸、５×デ
ンハルト（Denhardt's）溶液、100μg/mlサケ精子DNA、
50％ホルムアルデヒド中、42℃にてプレハイブリダイズ
しておいた。ハイブリダイゼーションには、マルチプラ
イム標識したPM−４またはBS−９プローブを添加した。
P32（アマーシャム社製）同位体を用いた。フィルター
は、２×SSC、１％ドデシル硫酸ナトリウム中でPM−４
のばあい65℃にて、BS−９のばあい60℃にて洗浄し、コ
ダックＸ−オーマットもしくはフジＸ線フィルムでオー
トラジオグラフィーを行なった。
細胞表面のシンデカン発現の定量のため、培養ディッ
シュ上の細胞を氷冷したPBSを用いて３回洗浄した。そ
ののち、0.5mM Ｋ−EDTAを含むPBS中10分間、＋４℃に
てディッシュをインキュベートした。トリプシン（シグ
マ社製、Ｔ−8128）を最終濃度20μg/mlとなるように加
えて、＋４℃にて10分間インキュベートした。トリプシ
ンは、シンデカンのエクトドメインを培地中に遊離させ
る（ラプラージャーおよびバーンフィールド（1985）J.
Biol.Chem.260巻、4103〜4109頁）。そののち細胞をゴ
ムポリスマンでかき取り、またはコロニーを懸濁して、
トリプシンインヒビター（シグマ社製、Ｔ−9128）を最
終濃度が100μg/mlとなるように添加した。細胞を遠心
し（５分、100×ｇ）、上清は集めて、細胞はコールタ
ーカウンターで計数した。浮遊状態の細胞はチューブに
集め、コロニーは５分間で沈殿させ、そののちペトリデ
ィッシュでの培養と同じ様に上清を除去した。コロニー
は氷冷したPBSで３回洗浄し、トリプシン処置した。
シュ上の細胞を氷冷したPBSを用いて３回洗浄した。そ
ののち、0.5mM Ｋ−EDTAを含むPBS中10分間、＋４℃に
てディッシュをインキュベートした。トリプシン（シグ
マ社製、Ｔ−8128）を最終濃度20μg/mlとなるように加
えて、＋４℃にて10分間インキュベートした。トリプシ
ンは、シンデカンのエクトドメインを培地中に遊離させ
る（ラプラージャーおよびバーンフィールド（1985）J.
Biol.Chem.260巻、4103〜4109頁）。そののち細胞をゴ
ムポリスマンでかき取り、またはコロニーを懸濁して、
トリプシンインヒビター（シグマ社製、Ｔ−9128）を最
終濃度が100μg/mlとなるように添加した。細胞を遠心
し（５分、100×ｇ）、上清は集めて、細胞はコールタ
ーカウンターで計数した。浮遊状態の細胞はチューブに
集め、コロニーは５分間で沈殿させ、そののちペトリデ
ィッシュでの培養と同じ様に上清を除去した。コロニー
は氷冷したPBSで３回洗浄し、トリプシン処置した。
２×105個の細胞に対応する適量の上清を陽イオン性
ナイロン膜（ゼータプローブ、バイオラッド社製）にブ
ロットした。膜はインキュベーション緩衝液（10％牛胎
児血清、1mMアジ化ナトリウム、PBS）中で室温にて１時
間、プレインキュベートしておいた。放射活性で標識し
た（クロラミン−Ｔ法）シンデカンのエクトドメインを
認識するMnAb281−２（ヤルカネンら（1987）J.Cell Bi
ol.105巻、3087〜3096頁）を最終濃度が10000CMP/mlと
なるようにインキュベーション緩衝液に加え、＋４℃で
一晩インキュベートした。そのフィルターをPBSで10分
間室温にて洗浄した。洗浄を10回くり返し、そののちフ
ィルターをＸ線フィルム上オートラジオグラフィーにか
けた。オートラジオグラフは、ゲルスキャン（Gelsca
n）XLウルトロスキャン密度計（エル ケー ビー社
製）とゲルスキャンSL2400ソフトウェア（エル ケー
ビー社製）により分析し、単離したエクトドメンを用い
て標定した（ヤルカネンら（1987）J.Cell Biol.105
巻、3087〜3096頁）。
ナイロン膜（ゼータプローブ、バイオラッド社製）にブ
ロットした。膜はインキュベーション緩衝液（10％牛胎
児血清、1mMアジ化ナトリウム、PBS）中で室温にて１時
間、プレインキュベートしておいた。放射活性で標識し
た（クロラミン−Ｔ法）シンデカンのエクトドメインを
認識するMnAb281−２（ヤルカネンら（1987）J.Cell Bi
ol.105巻、3087〜3096頁）を最終濃度が10000CMP/mlと
なるようにインキュベーション緩衝液に加え、＋４℃で
一晩インキュベートした。そのフィルターをPBSで10分
間室温にて洗浄した。洗浄を10回くり返し、そののちフ
ィルターをＸ線フィルム上オートラジオグラフィーにか
けた。オートラジオグラフは、ゲルスキャン（Gelsca
n）XLウルトロスキャン密度計（エル ケー ビー社
製）とゲルスキャンSL2400ソフトウェア（エル ケー
ビー社製）により分析し、単離したエクトドメンを用い
て標定した（ヤルカネンら（1987）J.Cell Biol.105
巻、3087〜3096頁）。
要約すると、本発明は、シンデカンの、たとえば組織
レベルや種々の体液中の発現や量を決定することによっ
て、潜在的に有害な形質転換を検出するのに有用であ
る。本方法は、生化学的、免疫組織化学的および分子生
物学的に、たとえばシンデカンに特異的なリガント、抗
体（ポリクローナルもしくはモノクローナル）およびcD
NAを用いて行なわれるとよい。本方法でとくに焦点とな
るのは、悪性形質転換の過程のあいだにシンデカン発現
の顕著な低下が認められる、上皮細胞の悪性変化であ
る。過形成におけるシンデカン発現の分析もまた含まれ
るが、これは、本法がこの前悪性段階の重篤さの評価に
おいて価値を有するためである。シンデカン発現の分析
は、相異なる異形成の前悪性増殖段階の分類においてと
くに有用である。
レベルや種々の体液中の発現や量を決定することによっ
て、潜在的に有害な形質転換を検出するのに有用であ
る。本方法は、生化学的、免疫組織化学的および分子生
物学的に、たとえばシンデカンに特異的なリガント、抗
体（ポリクローナルもしくはモノクローナル）およびcD
NAを用いて行なわれるとよい。本方法でとくに焦点とな
るのは、悪性形質転換の過程のあいだにシンデカン発現
の顕著な低下が認められる、上皮細胞の悪性変化であ
る。過形成におけるシンデカン発現の分析もまた含まれ
るが、これは、本法がこの前悪性段階の重篤さの評価に
おいて価値を有するためである。シンデカン発現の分析
は、相異なる異形成の前悪性増殖段階の分類においてと
くに有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キルヤバイネン、ヤルッコ フィンランド共和国、エスエフ−20520 ツルク、シルッカランカツ ４ セー 50 (72)発明者 レッペ、シルパ マリアンネ フィンランド共和国、エスエフ−20540 ツルク、クルマランカツ ４ (72)発明者 マリ、サカリ マルック フィンランド共和国、エスエフ−20510 ツルク、ヨ−キュレ ６ デー ６ (56)参考文献 Ｊ．ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．, ｓｕｐｐｌｅ 13Ｂ，（1989）ｐ52 Ｄ 317 Ｊ．ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．, ｓｕｐｐｌｅ 14Ａ，（1990）ｐ153 Ａ113 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/574
Claims (18)
- 【請求項１】（ａ）悪性細胞、前悪性細胞、過形成細胞
もしくは正常の状態に比較して形態学的に変化している
細胞を有することが疑われる体液または組織から採取さ
れた、ヒトからの第一の体液または組織サンプル中に存
在する細胞内のシンデカン量を測定すること； （ｂ）工程（ａ）で測定されたシンデカン量を、第一の
生物学的材料のサンプルと同じタイプの体液もしくは組
織に由来し、正常もしくは工程（ａ）の細胞ほど形質転
換されていない細胞のサンプルからの生物学的材料のサ
ンプルである第二の生物学的材料のサンプルからえられ
るシンデカンのレベルと比較すること；および （ｃ）生物学的材料の第一サンプルを第二サンプルと比
較して含まれるシンデカンの量が少ないことにもとづい
て悪性もしくは前悪性変化の存在を決定することを含ん
でなる、ヒト細胞における悪性もしくは前悪性の変化を
検出するための方法。 - 【請求項２】前記変化が、悪性形質転換である請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】前記変化が、前悪性形質転換である請求項
１記載の方法。 - 【請求項４】前記変化が、過形成である請求項１記載の
方法。 - 【請求項５】前記変化が、形態学的変化である請求項１
記載の方法。 - 【請求項６】第一サンプルのシンデカン量が、シンデカ
ンタンパク質レベルを定量することにより測定される請
求項１記載方法。 - 【請求項７】シンデカンタンパク質レベルが、シンデカ
ンタンパク質を認識する抗体を用いて測定される請求項
６記載の方法。 - 【請求項８】第一サンプルのシンデカン量が、シンデカ
ンmRNAレベルを分析することにより測定される請求項１
記載の方法。 - 【請求項９】第一サンプルのシンデカン量が、前記サン
プル中のシンデカンエクトドメイン量を分析する工程に
より測定される請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】第一サンプルの前記シンデカンエクトド
メインが、分析前に前記細胞の表面から遊離される請求
項９記載の方法。 - 【請求項１１】第一サンプルのシンデカン量を定量する
ためにヒトシンデカン特異抗体を用いる請求項１記載の
方法。 - 【請求項１２】第一サンプルのシンデカンmRNA量を定量
するためにヒトシンデカンアンチセンスmRNAを用いる請
求項１記載の方法。 - 【請求項１３】第一サンプルのシンデカンmRNA量を定量
するためにシンデカンアンチセンスオリゴヌクレオチド
を用いる請求項１記載の方法。 - 【請求項１４】生物学的材料が、体液である請求項１記
載の方法。 - 【請求項１５】体液が、血漿である請求項14記載の方
法。 - 【請求項１６】体液が、血清である請求項14記載の方
法。 - 【請求項１７】体液が、尿である請求項14記載の方法。
- 【請求項１８】体液が、脊髄液である請求項14記載の方
法。
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|---|---|---|---|
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| US72133091A | 1991-07-01 | 1991-07-01 | |
| US721,330 | 1991-07-01 | ||
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP04501685A Expired - Fee Related JP3103377B2 (ja) | 1991-01-15 | 1991-12-19 | 細胞の悪性形質転換の指摘のための組織および体液のような生物学的材料におけるシンデカン量の検出 |
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| EP (2) | EP0816851A3 (ja) |
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| WO (1) | WO1992013274A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA92271B (ja) |
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| US5726058A (en) * | 1992-12-01 | 1998-03-10 | Jalkanen; Markku | Syndecan stimulation of cellular differentiation |
| US6017727A (en) * | 1994-03-07 | 2000-01-25 | Biotie Therapies Ltd. | Syndecan enhancer element and syndecan stimulation of cellular differentiation |
| US5851993A (en) * | 1994-06-13 | 1998-12-22 | Biotie Therapies Ltd. | Suppression of tumor cell growth by syndecan-1 ectodomain |
| GB9519490D0 (en) * | 1995-09-25 | 1995-11-29 | Melvin William T | Use of a cytochrome P450 enzyme in tumour cells as a marker and target |
| US6385546B1 (en) | 1996-11-15 | 2002-05-07 | Rutgers, The University Of New Jersey | Stabilizing and destabilizing proteins |
| KR20010022812A (ko) * | 1997-08-12 | 2001-03-26 | 리드 비.브이. | 인자의 변형능력을 측정하는 방법 |
| CA2346264A1 (en) * | 1998-10-16 | 2000-04-27 | Regents Of The University Of California | Glypicans for the detection and treatment of human carcinoma |
| US6998232B1 (en) * | 1999-09-27 | 2006-02-14 | Quark Biotech, Inc. | Methods of diagnosing bladder cancer |
| WO2001077682A1 (fr) * | 2000-04-10 | 2001-10-18 | Institut Bioorganicheskoi Khimii Imeni Akademikov M.M. Shemyakina I Ju. A. Ovchinnikova Rossiisskoi Akademii Nauk | Anticorps diriges contre le facteur hldf, procedes de fabrication correspondants, peptides avec des capacites antigeniques et a hydrolyse hk et procede de diagnostic de l'etat anaplasique de cellules humaines |
| AU2002338431A1 (en) * | 2001-04-04 | 2002-11-05 | Quark Biotech, Inc. | Sequence characteristics of bladder cancer |
| KR100694804B1 (ko) * | 2005-05-18 | 2007-03-14 | 아주대학교산학협력단 | 작은 헤어핀 ｒｎａ 분자를 포함하는 자궁 내막암 치료또는 예방용 조성물 및 그를 이용한 자궁 내막암 치료 또는예방 방법 |
| US8347890B2 (en) * | 2006-06-19 | 2013-01-08 | Insono Therapeutics, Inc. | Automated tissue retention system |
| WO2009105624A2 (en) * | 2008-02-21 | 2009-08-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Simultaneous delivery of receptors and/or co-receptors for growth factor stability and activity |
| GB0803272D0 (en) * | 2008-02-22 | 2008-04-02 | Smith & Nephew | Ultrasound and tissue repair |
Family Cites Families (7)
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|---|---|---|---|---|
| DE3511199A1 (de) * | 1985-03-28 | 1986-10-02 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur immunologischen bestimmung von heparansulfat-proteoglykan, verfahren zur herstellung bzw. reinigung von dafuer geeignetem heparansulfat-proteoglykan aus basalmembran-haltigen geweben |
| US4859581A (en) * | 1986-03-10 | 1989-08-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Endoglycosidase assay |
| US4945086A (en) * | 1988-05-03 | 1990-07-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Smooth muscle cell growth inhibitor |
| JPH02156898A (ja) * | 1988-12-08 | 1990-06-15 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 抗低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンモノクローン抗体、それを産生するハイブリドーマおよびこのモノクローン抗体を用いる低密度型ヘパラン硫酸プロテオグリカンの検出方法 |
| WO1990007712A1 (de) * | 1988-12-23 | 1990-07-12 | Bissendorf Peptide Gmbh | Antigen, assoziiert mit degenerativen erscheinungen des zentralen nervensystems (zns), dagegen gerichtete antikörper sowie verfahren zur diagnose von dysfunktionen des zns |
| WO1990012033A1 (en) * | 1989-03-29 | 1990-10-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Construction and use of synthetic constructs encoding syndecan |
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-
1991
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Non-Patent Citations (2)
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